方法及び使用
本発明は、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＢＫアルファ、ＰＢＫデルタ又はｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップとを含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法に関する。本発明はまた、ＰＢＫ阻害剤の一定の使用、特定の使用のためのＰＢＫ阻害剤、及びキットにも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ，phosphatidyl inositol-3-kinase）阻害剤の新たな使用に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の誘発のための新たな方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞，regulatory T cell）は、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下でエフェクターＴ細胞によって引き起こされる自己免疫病及び免疫病態を予防するのに不可欠である。エフェクターＴ細胞を抑止すること（自己免疫病及び免疫病態を抑えること）又は免疫応答（たとえば腫瘍に対する）を高めることを目的とした免疫介入は、Ｔｒｅｇ細胞及びエフェクターＴ細胞の間のバランスを変化させるアプローチを必要とする。現在のアプローチは、時間がかかり、非効率的であり、生物学的な供給源から精製された生理活性ペプチドの使用に依存する又は先在するＴｒｅｇ細胞の増大に依存する。
【０００３】
転写調節因子Ｆｏｘｐ３、細胞内タンパク質、及び転写調節因子のフォークヘッド／ウィングドヘリックスファミリーのメンバーの発現は、Ｔｒｅｇ細胞の特徴である。
【０００４】
生理活性ペプチドＴＧＦベータを用いるＴ細胞の処理は、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現を誘発することで知られている（Chen et al., 2003 J. Exp. Med. vol 198, pp1875-1886）。
【０００５】
ある種のインビボ免疫化プロトコールは、Ｔ細胞受容体トランスジェニックＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発することが報告された（Kretschmer et al., 2005 Nature Immunol. vol 6 p1219）。このアプローチは、抗原に対する特異性及び標的Ｔ細胞のＭＨＣ拘束性の両方についての知識を必要とし、したがって、その結果、免疫化に使用される抗原は選択することができる。この条件は、Ｔ細胞がトランスジェニックＴ細胞受容体を保有する、人工的な実験系によって満たされる。この条件は自然発生の自己免疫性疾患を満たさないといったことがこのアプローチに関する課題となる。
【０００６】
ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）は、Ｆｏｘｐ３を発現する、先在するＴｒｅｇ細胞の増大を操作するために使用されてきた（Zheng et al., 2003 Immunity vol 19 p503; Battaglia et al., 2005 Blood vol 105 p4743）。しかしながら、そのような処理は、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現を誘発しないことが示され、これは課題となる。たとえば、Battagliaら（同書）は、「ラパマイシンを曝露したＴ細胞培養物中の・・・ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒ細胞の存在は、ＣＤ２５ Ｔ細胞からのＣＤ２５ Ｔｒ細胞のデノボ誘発又は培養の初めに、限られた量で既に存在する（つまり、１０％のＣＤ４ ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞がナイーブ脾臓中に普通見出される）、自然発生のＣＤ４ ＣＤ２５ ＦｏｘＰ３ Ｔｒ細胞サブセットの選択的な増大のいずれかによるものであるかもしれない。この疑問を検討するために、ＣＤ２５ Ｔｒ細胞を除去したＣＤ４ Ｔ細胞を、ラパマイシンの存在下又は非存在下で３週間培養した。ＣＤ４ Ｔ細胞とは対照的に（図３Ａ）、ラパマイシンの存在下で活性化されたＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ細胞は、インビトロでの細胞増殖を抑制しなかったＴ細胞の集団を生じさせた（図４Ａ）。したがって、ＦｏｘＰ３発現は、ＣＤ４ ＣＤ２５ラパマイシン処理Ｔ細胞中でではなくラパマイシンに曝露されたＣＤ４ Ｔ細胞中で増強された（図４Ｂ）」と述べている。そのうえ、用いられるプロトコールは、数週間にわたる、複数回のインビトロ刺激に依存し、これは、非常に大きな労働力を要する欠点を有する。Ｔｒｅｇ細胞数に対するラパマイシンの負の効果もまた当技術分野で報告された。ラパマイシンは、合成化合物ではなく、したがって、不純物の課題及び／若しくは変化又は製剤の課題から影響を受け得る。
【０００７】
したがって、先行技術による技術は、典型的に、既にＦｏｘｐ３を発現している細胞中でのＦｏｘｐ３発現を増強することができる既存のＴｒｅｇの刺激若しくは活性化を介して作用している又は非Ｔｒｅｇのブロッキングに基づき、集団中でのＴｒｅｇの増大／選択若しくは過剰発現をもたらす。これらの結果は、上記に言及されるようなラパマイシン処理と同じである。他の例は、Ｆｏｘｐ３発現の既に存在するレベルを典型的に増強するＴＧＦベータの使用である。そのようなアプローチは、デノボＦｏｘｐ３発現／デノボＴｒｅｇをもたらさない。
【０００８】
ＰＩ３Ｋアイソザイムｐ１１０デルタの遺伝子ターゲティングは、胸腺中でのＴｒｅｇ細胞数の増加をもたらすが、末梢リンパ系器官中でのＴｒｅｇ細胞数の減少をもたらす。これには炎症性腸疾患が伴い、これは、Ｔｒｅｇ細胞の欠損に関連づけられることが多い。ＰＩ３Ｋシグナル伝達及びＦｏｘｐ３発現の間の関係に関する明確な結論はこれらの研究から引き出すことはできない。
【０００９】
ＰＩ３Ｋアイソザイムｐ１１０ガンマの阻害剤は、Ｔｒｅｇ細胞とは別個のメカニズムに基づいた自己免疫性疾患の治療についての評価中である。
【００１０】
国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレットは、エフェクターＴ細胞又は調節性Ｔ細胞と優先的に関連する分子及びそれらの使用の方法を開示する。この文献は、集団レベルについての研究を示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、この文献の７６ページ及び図２３Ａに記載されている。Ｆｏｘｐ３発現に対する効果（たとえあったとしても、高用量の、この文献による阻害剤は、おそらく細胞毒性であり、低用量ではほぼ間違いなく有意な効果を示さない）は、Ｆｏｘｐ３発現細胞の増大又はＦｏｘｐ３発現細胞中でのＦｏｘｐ３の発現の増強によるものであるように思われる。国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレットの教示にデノボＦｏｘｐ３発現の証拠はない。この文献の根本的な方針は、免疫系のバランスを傾けるような、たとえば全般的に自己免疫病を低下させようとする又は全般的に応答を増強しようとする試みにある。新たなＴｒｅｇを作製するための教示も示唆もない。それらの方法は、せいぜい、休止細胞（ＰＢＬ）が、同時に、活性化され（ＣＤ３／ＣＤ２８）、阻害される（ＬＹ２９４００２）こと、つまり、同時の活性化及び刺激を教示するものである。他の先行技術による研究（たとえばBattaglia（同書））と共通して及び発明者ら自身の研究と共通して、そのような処理は、デノボＦｏｘｐ３発現／デノボＴｒｅｇを生じない。
【００１１】
米国特許出願公開第２００４／００７２７６６号は、細胞内シグナル伝達を操作することによってＴ細胞応答を調整するための方法を開示する。この文献に開示される方法は、刺激物質及び阻害剤を一緒に、つまり一度に又は同時に添加することを含む。デノボＦｏｘｐ３発現はこのアプローチでは生じない。
【００１２】
Foeyら（Arthritis Res 2002 vol 4 pp64-70）は、サイトカインに刺激されたＴ細胞が、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びｐ７０Ｓ６Ｋに依存する、マクロファージによるＩＬ−１０の産生を誘発するといったこと並びに関節リウマチのその密接な関係を開示する。これは、Ｔ細胞の存在下でのマクロファージに関する研究に関する。Ｔ細胞は、接触の前及び後の効果を分けるために固定された。したがって、細胞は固定されており、ＰＩ３Ｋ阻害剤がこれらの方法で添加される場合、細胞はもはや生きていない。したがって、デノボＦｏｘｐ３発現は、これらの方法によってもたらされない。
【００１３】
Breslinらは、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２が協力して、Ｔ細胞増殖を阻害することを開示する。この例は、他の研究と共通して、増殖などのようなそれらの生態の側面を研究するために、Ｔ細胞を阻害剤に曝露することを含む。阻害剤は、刺激の前に、典型的に、刺激の少なくとも３０分前に添加される。次いで、細胞数又は他のパラメーターが検査される。デノボＦｏｘｐ３発現はそのような技術によって生じない。
【００１４】
米国特許出願公開第２００５／０２６１３１７号は、ヒトＰＩ３Ｋデルタの阻害剤を開示する。この文献は、単に、ある種の好中球、Ｂ細胞、及びある種のエキソサイトーシス細胞について検査するものであり、Ｔ細胞又はＴｒｅｇと関係がない。示されるデータは、単に、開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤が関係のある機能を実際にブロックするといったことを検証することを目的とする。
【００１５】
米国特許出願公開第２００４／０１２６７８１号は、ＣＤ２８媒介性の同時刺激シグナルの阻害によって免疫媒介性の流産を予防する方法を開示する。これらの方法は、可溶性のリガンドを用いるＣＤ２８のブロッキングを含む。可溶性のリガンドを用いるＣＤ２８のブロッキングはＴ細胞の刺激／活性化と明らかに相互に排他的である。
【００１６】
本発明は、先行技術と関連する（１又は複数の）課題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００７２７６６号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２６１３１７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０１２６７８１号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Chen et al., 2003 J. Exp. Med. vol 198, pp1875-1886
【非特許文献２】Kretschmer et al., 2005 Nature Immunol. vol 6 p1219
【非特許文献３】Zheng et al., 2003 Immunity vol 19 p503
【非特許文献４】Battaglia et al., 2005 Blood vol 105 p4743
【非特許文献５】Arthritis Res 2002 vol 4 pp64-70
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
Ｆｏｘｐ３発現は、調節性Ｔ細胞の機能と関連している。一定の状況では、Ｆｏｘｐ３発現は、調節性Ｔ細胞の機能を誘発するのに必要であり、且つ十分であることが示された。実際に、Ｆｏｘｐ３発現は、ある環境では、Ｔ細胞の他の亜集団と比較した、調節性Ｔ細胞の指標又はそれを確認するものとして見なされてきた。先行技術では、Ｆｏｘｐ３発現を薬理学的に誘発する唯一知られている方法は、生理活性ペプチドＴＧＦβを用いてＴ細胞の集団を処理することによるものであった。
【００２０】
本発明者らは、驚いたことに、Ｆｏｘｐ３発現の誘発のための新たな技術を発見した。この新たな方法は、Ｆｏｘｐ３発現を誘発することが以前に示されていないＰＩ３−Ｋ阻害剤の使用を含む。
【００２１】
本発明者らの重大な発見は、標的細胞に対する処理のタイミングに関連するものである。具体的には、発明者らは、阻害剤（ＰＩ３Ｋ阻害剤など）が、細胞を刺激した後にのみ細胞に添加されなければならないといったことを見出した。したがって、阻害剤を細胞と接触させる前に、刺激／活性化ステップの後にインキュベーションしなければならない又は時間的な猶予を設けなければならない。活性化と同時の又は活性化の前の、阻害剤の添加はデノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。したがって、阻害剤は、刺激／活性化の後に添加されるべきであるといったことは本発明の重大な教示となる。これらの重要なタイミングは、下記に、より詳細に説明される。
【００２２】
一定のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲを阻害することが示されたが、Ｆｏｘｐ３発現を誘発するようにそれらが作用する証拠はない。そのうえ、ラパマイシン（ｍＴＯＲに作用する）は、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を選択的に増大させることができることが示されたが、そのような技術を使用するデノボＦｏｘｐ３発現のいかなる誘発の実証もなかった。したがって、ある種のＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｔ細胞中でのデノボＦｏｘｐ３発現の誘発及びＴｒｅｇの機能を直接もたらし得るといった、本発明者らによってなされた発見は、驚くべき、意義深い進歩である。
【００２３】
本発明は、これらの驚くべき発見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、第１の態様では、本発明は、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法を提供する。
【００２５】
他の態様では、本発明は、あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含み、前記阻害が、刺激の１０〜２２時間後に開始される方法に関する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、１又は複数の調節性Ｔ細胞を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップであって、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始されるステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法に関する。
【００２７】
適切には、前記阻害が、刺激の約１７〜１９時間後に開始される。
【００２８】
適切には、前記阻害が、刺激の約１８時間後に開始される。
【００２９】
適切には、シグナル伝達ステップを阻害するステップは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む。
【００３０】
適切には、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップは、前記細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する。
【００３１】
適切には、前記方法は、シグナル伝達を阻害する時間までに前記刺激を中止するステップをさらに含む。
【００３２】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法に関する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＣＤ８−Ｔ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法に関する。
【００３４】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法に関する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を用いて処理するステップを含む方法を提供する。ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン（シロリムス）若しくはＲＡＤ００１（エベロリムス）等のその類似体、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＡＰ２３５７３、又はＰＩ１０３等の混合ｍ−ＴＯＲ／ｐ１１０アルファ阻害剤等の、あらゆる知られているｍ−ＴＯＲ阻害剤であってもよい。好ましくは、前記ｍ−ＴＯＲ阻害剤はラパマイシンである。
【００３６】
刺激は、本明細書に記載されるように、Ｔｒｅｇ産生に向けて、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲ阻害剤の作用に感受性にする、あらゆる適した方法によるものであってもよい。好ましくは、Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体の刺激によるものである。いくつかの実施形態では、この刺激は、持続的な又は永続的な刺激であってもよく、これは、ＰＩ３Ｋ阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲ阻害剤の作用時に刺激が必ずしも中止されないことを意味する。好ましくは、刺激されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体を介して刺激されたＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体刺激の中止が後続する前記ＴＣＲ受容体の刺激によるものである。他の実施形態では、刺激は、ＣＤ３を介するものであってもよい。いずれの場合も、好ましくは、ＣＤ２８などのような同時刺激受容体もまた刺激される。好ましくは、ＣＤ２８は、ＴＣＲ受容体（１又は複数）又はＣＤ３受容体（１又は複数）の刺激と同時に刺激される。好ましい実施形態では、刺激は、好ましくはＴＣＲ及びＣＤ３を介する刺激の中止が後続する、ＴＣＲ及び／又はＣＤ３並びにＣＤ２８の同時の刺激を介するものである。刺激の中止は、シグナルの単純な除去を指してもよい又は阻害剤（１又は複数）の添加時の、ＣＤ３／ＣＤ２８の同時刺激のブロッキングなどのような、より積極的な方法を指してもよい。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態は、たとえば実施例の部に説明されるように、シグナル遮断ステップをさらに含んでいてもよい。
【００３８】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、（iii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介する及び／又はｍ−ＴＯＲを介する及び／又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。好ましくは、ステップ（ii）は、前記刺激を中止するステップを含む。
【００３９】
前記Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体の刺激を介する又はＣＤ３及びＣＤ２８などのような同時刺激受容体を介するものであってもよい。好ましくは、刺激は、Ｔ細胞受容体を介する前記刺激の中止が後続する、Ｔ細胞受容体を介するものである。
【００４０】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（ｉｖ）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法を提供する。好ましくは、ステップ（iii）は、前記刺激を中止するステップを含む。
【００４１】
好ましくは、前記Ｔ細胞を刺激するステップは、前記Ｔ細胞を、抗ＴＣＲ抗体又は抗ＣＤ３抗体と接触させるステップを含む。好ましくは、前記Ｔ細胞を刺激するステップは、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体と接触させるステップ、好ましくは、前記Ｔ細胞を、抗ＴＣＲ抗体又は抗ＣＤ３抗体と、さらに抗ＣＤ２８抗体と同時に接触させるステップをさらに含む。そのような抗体の提示の形態は操作者が選択することができ、たとえば、これは、プレートに結合した抗体を使用して又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体などのような抗体でコーティングしたビーズを使用することによって、又は操作者に知られている提示の他の方法によって達成することができる。
【００４２】
他の実施形態では、刺激は、特異的なペプチド抗原と接触させた抗原提示細胞などのような抗原提示細胞との、末梢Ｔ細胞などのような標的細胞の接触によるものであってもよい。これらの実施形態では、他の刺激形態を含む実施形態と同様、前記刺激は、永続的又は持続的であってもよく、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に刺激が中止されないことを意味し得る。他の実施形態では、刺激は、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に中止してもよく、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時の前に中止してもよく、適切には、刺激は、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に中止してもよい。
【００４３】
他の態様では、本発明は、あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含む方法を提供する。
【００４４】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、Ｔ細胞を刺激するステップと、前記刺激を中止するステップと、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。好ましくは、前記方法は、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞を刺激することによって、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発するステップと、Ｔ細胞受容体を介して前記刺激を中止するステップと、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。
【００４５】
他の態様では、本発明は、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む、上記に記載されるような方法を提供する。好ましくは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップは前記細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含む。好ましくは、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する。
【００４６】
ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップが、ｍ−ＴＯＲを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む場合、好ましくは、ｍ−ＴＯＲを介するシグナル伝達を阻害するステップは、前記細胞をラパマイシンと接触させるステップを含む。
【００４７】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用を提供する。
【００４８】
他の態様では、本発明は、Ｆｏｘｐ３発現の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用を提供する。
【００４９】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用を提供する。
【００５０】
好ましくは、調節性Ｔ細胞の欠損症は自己免疫障害又は免疫病態である。好ましくは、前記欠損症は、関節リウマチ若しくは糖尿病、好ましくはＩ型糖尿病、大腸炎、又はＴｒｅｇ細胞の存在が好ましい予後を示すリンパ増殖性障害、好ましくはＢ細胞リンパ腫である。
【００５１】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤を提供する。
【００５２】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤を提供する。
【００５３】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのｍ−ＴＯＲ阻害剤を提供する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＡｋｔ阻害剤を提供する。
【００５５】
他の態様では、本発明は、ＴＣＲ刺激剤並びにＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲの阻害剤及び／又はＡｋｔの阻害剤を含むキットを提供する。
【００５６】
他の態様では、本発明は、前記ＴＣＲ刺激剤が抗ＴＣＲ又は抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８を含む、上記に記載されるようなキットを提供する。好ましくは、抗ＴＣＲ作用物質／抗ＣＤ３作用物質／抗ＣＤ２８作用物質は、それぞれ、ＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ２８の抗体である。
【００５７】
他の態様では、本発明は、ラパマイシン等のｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、上記に記載されるようなキットを提供する。ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、本発明のキットのＴＣＲ刺激剤／ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用によって産生されたＦｏｘｐ３を発現するＴ細胞の増大に有利に使用することができる。そのうえ、ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、有利には、Ｆｏｘｐ３誘発の効率を増加させてもよい。
【００５８】
他の態様では、本発明は、Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、上記に記載されるようなキットを提供する。
【００５９】
最も好ましい実施形態では、阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。好ましくは、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２を含み、好ましくは、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩＫ−９０（アルファ／ｍ−ＴＯＲ）、ＰＩ−１０３（アルファ／ガンマ）、又はＹＭ−０２４（アルファ／デルタ）などのようなクラスＩＡ ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。
【００６０】
好ましい態様
適切には、Ｆｏｘｐ３が誘発されることになる細胞（標的細胞）の出発集団は、先在するＴｒｅｇが除去される。適切には、細胞の出発集団は、ＣＤ２５＋細胞が除去される。細胞の集団が１％未満のＴｒｅｇを含む場合、本発明者らは、それを、Ｔｒｅｇが除去されたもの又は事実上Ｔｒｅｇがないものと見なす。適切には、細胞の出発集団はＴｒｅｇを含まない。適切には、本発明の方法は、そのような除去のさらなるステップを含み、適切には、そのようなステップは刺激の前に実行される。
【００６１】
適切には、Ｆｏｘｐ３が誘発されることになる細胞（標的細胞）の出発集団はナイーブＴ細胞で豊富である。適切には、出発集団は、ＣＤ６２Ｌ細胞で豊富であり且つ／又はＣＤ４５Ｒｂ細胞で豊富である。適切には、出発集団は、ＣＤ６２Ｌ細胞で豊富であり且つＣＤ４５Ｒｂ細胞で豊富である。適切には、本発明の方法は、そのような豊富化のさらなるステップを含み、適切には、そのようなステップは刺激の前に実行される。
【００６２】
細胞の活性化及び阻害が経時的に分離されるのは本発明の重要な特徴である。同時の活性化及び阻害は、デノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。適切には、活性化及び阻害は、本発明に従って同時に行われない。これは先行技術にあり、デノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。たとえば、本明細書の図１Ｃに関して、「０」時点は、先行技術の処理を示す−これは、刺激／活性化及び阻害剤の添加の間の０時間を表わす、つまり阻害剤は、活性化／刺激と同時に添加される。この処理は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発で無効であることが非常に明らかである。対照的に、刺激及び阻害の間に猶予又はインキュベーションを含む本発明による処理は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発にとって有効である。これは、なお存在する活性化剤と共に阻害剤を添加することができないことを意味しないが、活性化が阻害に先行しなければならないこと又は阻害が活性化の後に起こらなければならないことを意味する。分離の時間は非常に重要になり得、当技術分野に対する重大な寄与となる。活性化及び阻害の間の時間は、本明細書に教示されるように、特定の用途（複数可）のために具体的に選んでよい。例示的なタイミングは、阻害剤処理が、活性化の約１２〜１８時間後に、適切には、活性化の約１８時間の後に、適用される場合である。これは、下記により詳細に説明される。
【００６３】
適切には、本発明の方法は、細胞の増大を必要とすることなく、Ｆｏｘｐ３を誘発するために適用される。
【００６４】
望まれる特異性の細胞がＴｒｅｇに変換されるかもしれないといったことは本発明の利点となる。本明細書に説明される多くの利点を提供するのはこの能力である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＴＣＲシグナル遮断が、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤との相乗作用で、新たに活性化されたＴ細胞によるＦｏｘｐ３発現を誘発することを示す図である。ａ）ナイーブＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ Ｔ細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、ＴＣＲ抗体の存在下（ＴＣＲシグナル伝達の継続）又はＴＣＲ抗体の非存在下（ＴＣＲシグナル遮断）でさらに２日間培養した。Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、ａ）と同様、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、１８時間後に、示す条件に移した。Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現は２日後に、細胞内染色によって評価した。ＣＦＳＥプロファイルをＦｏｘｐ３−細胞及びＦｏｘｐ３＋細胞について示す。ｃ）Ｆｏｘｐ３誘発は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化の１８時間後に最も有効となる。
【図２】ＴＣＲシグナル伝達が、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でｍＴＯＲ活性をコントロールすることを示す図である。ａ）１時間若しくは１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて又は抗ＣＤ２８のみを用いて１時間（ＴＣＲシグナル伝達なし）ナイーブＬＮ Ｔ細胞を刺激した。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化は、細胞内染色及びフローサイトメトリーを使用して単一細胞レベルで決定した。ｂ）ナイーブＬＮ細胞をａ）と同様活性化した。１８時間後、ラパマイシン（２５ｎＭ）若しくはＬｙ２９４００２（１０μＭ）をさらなる１時間の間、添加し、又は細胞を、抗ＴＣＲの非存在下で示す時間の間、培養した。ｐＳ６レベルをａ）と同様決定した。
【図３】ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発は安定しており、調節性機能の獲得をもたらすことを示す図である。ａ）Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬｙ２９４００２によってナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で誘発され、ある期間にわたってモニターした。細胞は、ＩＬ−２の存在下で７日ごとに再刺激した。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を１８時間活性化し、さらに２日間、抗ＴＣＲを用いて（コントロール、＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）又は抗ＴＣＲを用いずにラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で（Ｆｏｘｐ３誘発、２８％ Ｆｏｘｐ３＋）培養した。段階的な数のＦｏｘｐ３誘発細胞又はコントロール細胞を、ＡＰＣ及び可溶性抗ＣＤ３の存在下で、新鮮で、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加し、細胞分裂に対する効果（ＣＦＳＥプロファイル）を４８時間後に記録した。
【図４】インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現を示す図である。ａ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、示されるように、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２のｉ．ｐ．と共に又はそれらを伴わずに、１８時間後に、同一遺伝子の免疫適格性宿主にｉ．ｖ．で移入した。内在性（ＣＦＳＥ−）ＣＤ４＋脾臓細胞及び移入した（ＣＦＳＥ＋、挿入図は、はるかに多くのイベントを示す）ＣＤ４＋脾臓細胞によるＦｏｘｐ３タンパク質の発現を２日後に細胞内染色によって評価した。ｂ）１８時間又は４８時間での１１回の移入実験の概要
【図５】Ｆｏｘｐ３誘発でのｐ１１０アイソザイムの特異な関与を示す図である。ナイーブＬＮ細胞を図１と同様活性化し、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を１８時間後に添加した。使用した濃度での各阻害剤のｐ１１０アイソフォーム特異性を示す（左パネル）。ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージ（本実験で１４％）を、ＰＩ３−Ｋ阻害剤の正味の効果（各散布図中の赤色のΔ値）を示すために減算した。細胞は、細胞分裂をモニターするために、活性化に先立ってＣＦＳＥを用いて標識化した（左パネル）。各阻害剤について、Ｓ６リボソームタンパク質リン酸化を、９０分後に細胞内染色によって決定した。ｐＳ６＋細胞のパーセンテージを示す（黒色、平均値±ＳＤ、ＴＧＸ−１１５のｎ＝１以外はｎ＝３〜５、右パネル）。Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージは、ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージを減算した後のものを示す（赤色、平均値±ＳＤ、ｎ＝４〜１２）。インビトロで決定したＩＣ５０値（Camps et al., 2005;Knight et al., 2006）を関係のある酵素について示す（右パネル）。
【図６】ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発はＴＧＦβとは無関係であることを示す図である。ａ）ナイーブＬＮ Ｔ細胞は、１８時間、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で活性化し、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）（９０分間、レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（９０分間、レーン２）、又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２（９０分間、レーン３若しくは８時間、レーン４）に細胞を曝露した後に、全細胞抽出物を、ＳＤＳゲル電気泳動及びウエスタンブロッティングにかけた。引き続いて、ブロットを、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）及び抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。ｂ）ａ）と同様活性化したナイーブＬＮ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ＴＧＦβ及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤をグラフの下に示されるように添加した。Ｆｏｘｐ３発現細胞のパーセンテージを２４〜４８時間後に決定した。培養物に、中和抗ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３μｇ／ｍｌ）又はＳｍａｄキナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ、２０μＭ）を追加した。ＴＣＲシグナルを取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３発現（９．２±５．６％、ｎ＝６）を減算した。コントロール培養物に正規化した、抗ＴＧＦβ（濃い灰色のバー）又はＳＢ４３１５４２（薄い灰色のバー）の存在下でのＦｏｘｐ３発現を示す（１００％、黒色のバー；ＴＧＦβ ２２．３±７．０％、ｎ＝９；ＰＩＫ９０ ３６．０±１２．９％、ｎ＝７；ＰＩ−１０３ ３５．１±３．８％、ｎ＝８；Ｌｙ２９４００２ ２１．５±４．０％、ｎ＝４、及びラパマイシン ２８．６±９．０％、ｎ＝４）。ＮＤ：実施せず。
【図７】ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤が、新たに活性化されたＴ細胞によるＦｏｘｐ３発現を誘発することを示す図である。ａ）ナイーブＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ Ｔ細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び可溶性抗ＣＤ２８を用いて刺激し、ＴＣＲ抗体を用いて（ＴＣＲシグナル伝達の継続）又はＴＣＲ抗体を用いずに（ＴＣＲシグナル遮断）さらに２日間培養した。Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、ａ）と同様、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、１８時間後に、示す条件に移した。Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現は２日後に、細胞内染色によって評価した。細胞の回収率は、投入した細胞の６７〜１０８％であった。ＣＦＳＥプロファイルをＦｏｘｐ３−細胞及びＦｏｘｐ３＋細胞について示す。ｃ）ナイーブＬＮ ＣＤ４ Ｔ細胞は、示す時間の間、ａ）と同様活性化し、その後、細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２に曝露した。Ｆｏｘｐ３発現細胞のパーセンテージは２日後に決定した（２回の実験の平均値）。ｄ）Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬＹ２９４００２によってナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で誘発された。細胞は、ＩＬ−２の存在下で毎週再刺激し、Ｆｏｘｐ３発現をモニターした。自然Ｔｒｅｇ細胞を比較のために示す。ｅ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を１８時間活性化し、さらに２日間、抗ＴＣＲを用いて（コントロール、＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）又は抗ＴＣＲを用いずにラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で（Ｆｏｘｐ３誘発、２８％ Ｆｏｘｐ３＋）培養した。段階的な数のＦｏｘｐ３誘発細胞又はコントロール細胞を、ＡＰＣ及び可溶性抗ＣＤ３の存在下で、新鮮で、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加し、細胞分裂に対する効果を４８時間後に記録した（ＣＦＳＥプロファイル）。ｆ）ナイーブＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を、同一遺伝子の、Ｒａｇ欠損レシピエントに静脈内に移入し、新たにエクスビボに単離した、ＴＣＲ活性化の継続と共にコントロール条件下で活性化した、又はＴＣＲシグナルを取り除き、１８時間後にラパマイシン及びＬＹ２９４００２を用いて処理した。大腸炎スコアを８週後に決定した。ｇ）ＣＤ４単一陽性、ＣＤ２５陰性胸腺細胞を活性化し、ＴＣＲシグナルを中止し、ラパマイシン／ＬＹ２９４００２を１８時間後に添加し、Ｆｏｘｐ３発現をｂ）と同様２日後に分析した。
【図８】Ｆｏｘｐ３誘発でのｐ１１０アイソザイムの特異な関与を示す図である。ａ）ナイーブＬＮ細胞を図１と同様活性化し、ＰＩ３Ｋ阻害剤を１８時間後に添加した。使用した濃度での各阻害剤のｐ１１０アイソフォーム特異性を、Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージと一緒に示す。ｂ）ｐＳ６＋細胞のパーセンテージは９０分間の時点で細胞内染色によって決定した（黒色、平均値±ＳＤ、ＴＧＸ−１１５のｎ＝１以外はｎ＝３〜５、右パネル）。ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞を超えるＦｏｘｐ３＋細胞の増加が示される（赤色、平均値±ＳＤ、ｎ＝４〜１２）。インビトロで決定したＩＣ５０値を関係のある酵素について示す。
【図９】ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達によるＦｏｘｐ３誘発はＴＧＦβとは無関係であることを示す図である。ａ）ナイーブＬＮ Ｔ細胞は、１８時間、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で活性化し、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）（９０分間、レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（９０分間、レーン２）、又はＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬｙ２９４００２（９０分間、レーン３若しくは８時間、レーン４）に細胞を曝露した後に、全細胞抽出物を、ＳＤＳゲル電気泳動及びイムノブロッティングにかけた。ブロットを、切り離し、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）及び抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。ｂ）ａ）と同様活性化したナイーブＬＮ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ＴＧＦβ及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を示されるように添加した。培養物に、中和抗ＴＧＦβ（３μｇ／ｍｌ）又はＳｍａｄキナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２（２０μＭ）を追加した。２日後に決定し、且つ抗ＴＧＦβ及びＳＢ４３１５４２を用いないコントロール培養物に正規化した、抗ＴＧＦβ（濃い灰色のバー）又はＳＢ４３１５４２（薄い灰色のバー）の存在下でのＦｏｘｐ３発現を示す（黒色のバー；ＴＧＦβ ２２．３±７．０％、ｎ＝９；ＰＩＫ９０ ３６．０±１２．９％、ｎ＝７；ＰＩ−１０３ ３５．１±３．８％、ｎ＝８；ＬＹ２９４００２ ２１．５±４．０％、ｎ＝４、及びラパマイシン ２８．６±９．０％、ｎ＝４）。ＮＤ：実施せず。ＴＣＲシグナルを取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３発現（９．２±５．６％、ｎ＝６）を減算した。
【図１０】新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中のＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔネットワークに対するＴＣＲシグナル伝達の影響を示す図である。ａ）１時間若しくは１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて又は抗ＣＤ２８のみを用いて１時間（ＴＣＲシグナル伝達なし））ナイーブＬＮ ＣＤ４ Ｔ細胞を刺激した。Ｓ６リン酸化は、細胞内染色及びフローサイトメトリーによって決定した。ｂ）ナイーブＬＮ細胞をａ）と同様活性化した。１８時間後、ラパマイシン（２５ｎＭ）若しくはＬｙ２９４００２（１０μＭ）をさらなる１時間の間、添加し、又は細胞を、抗ＴＣＲの非存在下で示す時間の間、培養した。ｐＳ６レベルをａ）と同様決定した。ｃ）イムノブロッティングにより、ｂ）の単一細胞レベルで検出した、ＴＣＲシグナル遮断及びラパマイシンに応じて減退するｐＳ６を確認した。ＴＧＦβもまたｐＳ６を低下させた。ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）は、Ｔ細胞活性化の１８時間後にではなく１時間後に目に見えたが、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＴＧＦβに応じて再び現われた。ｄ）ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の経路モデル。ＰＩ３ＫはＰＤＫ１を介してＡｋｔを活性化し、ＡｋｔはＴＳＣ１／２を阻害し、Ａｋｔは、ｍＴＯＲを活性化し、４ＥＢＰ／ｅＩＦ４Ｅを介して翻訳の阻害を軽減し、Ｓ６Ｋ１／ｅＩＦ４Ｅを介してリボソームの活性を刺激する。ｅ）ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸のネットワークモデルは、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２を区別する。ｍＴＯＲＣ１依存性のＳ６Ｋ１活性は、ＩＲＳ１を介してＰＩ３ＫによるｍＴＯＲＣ２の活性化をブロックする。Ａｋｔ活性は、ＰＤＫ１（Ｔ３０８）及びｍＴＯＲＣ２（Ｓ４７３）の両方に依存する（Jacinto et al., 2006;Sabatini, 2006）。ｆ）Ａｋｔｉ１／２によるＡｋｔの阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発する。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を活性化し、Ｆｏｘｐ３発現を図１と同様評価した。
【図１１】インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現を示す図である。ａ）ＴＣＲシグナル遮断を模倣するために、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を活性化し、次いで、腹腔内のラパマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＬＹ２９４００２（１５ｍｇ／ｋｇ）と共に又はそれらを伴わずに、同一遺伝子の、完全免疫適格性宿主に静脈内に移入した（レシピエント当たり２〜４×１０６細胞）。内在性ＣＤ４脾臓細胞（ＣＦＳＥ−）及び移入した（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４脾臓細胞によるＦｏｘｐ３発現を２日後にアッセイした。５．３±４．６％（ｎ＝１１）で、回収したＦｏｘｐ３＋細胞の度数は、もとの接種物（１．５±１．１％）のＦｏｘｐ３＋細胞の度数よりも３倍高かった。細胞移入に、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２のｉ．ｐ．を伴った場合、Ｆｏｘｐ３＋細胞の度数はさらに増加したが、内在性（ＣＦＳＥ−）Ｔ細胞中のＦｏｘｐ３発現は変化せず、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞ではなく通常の細胞に対する選択的な毒性を実証した。ｂ）１１回の移入実験の概要。Ｆｏｘｐ３発現細胞の増加が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞の選択的な回収又はＦｏｘｐ３誘発によるものであるかどうかを検討するために、発明者らは、ＴＣＲ遮断がもはや効率的ではなくなる時間である、活性化の４８時間後に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を移入し、インビトロでＦｏｘｐ３発現を誘発した（図１ｃを参照されたい）。これらの条件下で、１．３±０．５％のＣＦＳＥ＋細胞が移入後にＦｏｘｐ３を発現し（ｎ＝４）、１．６±０．３％のＣＦＳＥ＋細胞が、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２の存在下で移入後にＦｏｘｐ３を発現した（ｎ＝３）。
【図１２】ＴＣＲリガンドの有用性が継続した状態でのＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発を示す図である。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｌ、４μｌ／１０６細胞）を用いて活性化した。示すＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を、ビーズを除去することなく、１８時間の時点で添加し（１μＭ）、Ｆｏｘｐ３発現を２日後に評価した。
【図１３】生理学的ＴＣＲリガンド及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３誘発を示す図である。Ｒａｇ１欠損Ｈ２ｂＴＣＲトランスジェニックマウス由来のＣＤ４ ＬＮ細胞を、ＣＦＳＥを用いて標識化し、示す濃度のハトシトクロムＣペプチド８１〜１０４を用いてあらかじめ負荷した、ＢＭに由来するＢ１０．ＢＲ（Ｈ２ｋ）抗原提示細胞と共に培養した。ＰＩＫ９０（１μＭ）を、抗原提示細胞又は抗原ペプチドを除去することなく、１８時間後に添加した。Ｆｏｘｐ３発現を２日後に分析した。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
多細胞生物の特殊化した細胞型は、遺伝子発現の特異的なパターンによって定義される。造血幹細胞からそれらの分化の間に、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、それらの発生的な潜在力のかなりの制限を受けるが、多くの選択肢、すなわち、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、またＴｒｅｇの余地がそれらに残されている。Ｔｈ系統の選出は、特異的な病原体に対する有効な免疫応答にとって重要であるが、エフェクター機能及び調節性機能の間のバランスは、過度の免疫病態及び自己免疫病を回避しながら免疫適格を保証するのに重大である。自然調節性Ｔ細胞は、特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現によって特徴づけられ、Ｆｏｘｐ３の持続的な発現は、調節性Ｔ細胞の機能にとって必要であり、且つ十分である。Ｔｒｅｇは、胸腺中で「自然に」発生し、ナイーブ末梢ＣＤ４ Ｔ細胞から発生し得る。発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３発現及び調節性Ｔ細胞の機能を誘発するシグナルを同定する。発明者らは、新たに活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルが取り除かれた場合にＦｏｘｐ３発現が誘発されることを開示する。この状況では、Ｆｏｘｐ３誘発は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の阻害剤によって選択的に強化され、Ｔｒｅｇ分化の古典的な誘発物質であるＴＧＦベータとは無関係であるように思われる。
【００６７】
特に、本発明は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくはＰＩ３Ｋ阻害剤の使用を提供し、これは、ＴＣＲシグナル遮断と相乗作用を示して、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３を誘発する。
【００６８】
ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、エフェクター細胞又は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）になるためのそれらの潜在力を明らかにする。エフェクターは免疫応答を媒介し、Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞のバランスを取り、ホメオスタシスを維持し、免疫病態を予防する。発明者らは、Ｔｒｅｇの特徴となる転写因子であるＦｏｘｐ３の安定した誘発のための新規な方法を記載するが、これは、新たに活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルが取り除かれ、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害剤、好ましくはＰＩ３Ｋの小分子阻害剤によって強化された場合に引き起こされる。クラスＩ ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットの選択的阻害は、Ｆｏｘｐ３の調節因子として、ｐ１１０ガンマ又はｐ１１０ベータではなく、ｐ１１０アルファ及びｐ１１０デルタを同定する。Ｆｏｘｐ３誘発は、外因性のＴＧＦベータとは無関係であり、中和ＴＧＦベータ抗体及びＳｍａｄシグナル伝達の薬理学的アンタゴニストに抵抗性である。これらの開示は、新たなアプローチが調節性Ｔ細胞分化を操作することを可能にする。
【００６９】
デノボＦｏｘｐ３発現が誘発されるといったことが本発明の利点であることに注目されたい。これは、現在までに示された最高の効果が、既にＦｏｘｐ３を発現しているＴ細胞の増大であった先行技術での状態と対比される。目下Ｆｏｘｐ３を発現していない細胞中でＦｏｘｐ３発現を活発に誘発する可能性は、本発明の意義深い利点である。
【００７０】
本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の小分子阻害剤が、Ｔｒｅｇ細胞系統の特徴となる転写因子であるＦｏｘｐ３のデノボ発現を速やかに且つ効率的に誘発することを示す。これは、新たな治療上のアプローチが、自己免疫性疾患の予防及び治療などのような、Ｔｒｅｇ細胞のデノボ産生が望ましい臨床状況に適用されることを可能にする。関節リウマチ及びＩ型糖尿病などのようなこれらの疾患の多くは、非常に臨床的に重要である。したがって、本発明の産業上の用途及び有用性はこれらの意義深い医療への用途から生じる。
【００７１】
ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）
ＰＩ３−Ｋのファミリーは、多数の異なる個々のアイソザイムを有する酵素のファミリーである。広範囲の態様では、本発明は、Ｆｏｘｐ３発現の誘発での、ＰＩ３−Ｋ阻害剤、好ましくはクラスＩ ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用に関する。しかしながら、クラスＩＢ ＰＩ３Ｋガンマの阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発しないということ及びＰＩ３−Ｋγは調節性Ｔ細胞を介して作用しないということが発明者自身らのデータから明らかである。この観察は、ＰＩ３−Ｋγが調整性の効果を有し得るといったことを述べる、先行技術の教示と対照的である。しかしながら、本明細書に開示されるように、事実上、ＰＩ３−Ｋγは、調節性Ｔ細胞中での作用によるその効果を発揮しておらず、したがって、ＰＩ３−Ｋγの阻害又は阻害剤は本発明から明確に放棄される。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及は、ＰＩ３−Ｋベータに対して特異的ではないクラスＩＡ ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及として解釈されるべきである。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及は、ＰＩ３−Ｋγ活性を阻害するように作用するあらゆる化合物を指さないように解釈されるべきである。
【００７２】
化合物がＰＩ３−Ｋγ活性などのような特定のＰＩ３Ｋ活性を阻害するように作用するかどうかは容易に決定されるかもしれない。たとえば、ＰＩ３−Ｋγの阻害を決定してもよい１つの方法は実施例で説明される。さらに、本明細書又は先行技術に記載される方法によって試験することによって、化合物が、ＰＩ３−Ｋγ特異的阻害剤又はＰＩ３−Ｋγ選択的阻害剤などのようなＰＩ３Ｋアイソフォーム特異的阻害剤又はＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤かどうかを決定してもよい。標準的な試験では、キナーゼを生成し、異なる濃度の阻害剤及び試験しているキナーゼによってリン酸化することができる適した試験基質を用いる滴定実験で、阻害剤を用いてインビトロでキナーゼを試験する。そのうえ、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、典型的に、メーカー／サプライヤーによって又は所望の化合物と関係がある文献中でそれらの特異性に関して特徴づけられる。
【００７３】
ＰＩ３−Ｋへの言及は、ＰＩ３−Ｋのファミリー、好ましくは、クラスＩ ＰＩ３Ｋのファミリー、好ましくは、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋのファミリー、好ましくは、ガンマを除く、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋのファミリー、最も好ましくは、ＰＩ３−Ｋα、ＰＩ３−Ｋβ、ＰＩ３−Ｋδからなる群から選択されるクラスＩＡ ＰＩ３−Ｋに関するものとして解釈されるべきである。
【００７４】
ＰＩ３−Ｋβが、Ｆｏｘｐ３誘発で、限られた役割を有する又は役割を有していないことが本明細書でさらに開示される。したがって、好ましくは、ＰＩ３−ＫはＰＩ３−Ｋβではなく、好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋβに対して特異的ではない又は選択的ではない。
【００７５】
具体的には、発明者らは、ＰＩ３−Ｋα又はＰＩ３−Ｋδの阻害が特に有利であることを示す。したがって、好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋαに対して特異的な又は選択的な阻害剤である。他の好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋδに対して選択的な又は特異的な阻害剤である。
【００７６】
標的細胞
Ｆｏｘｐ３発現を生成することが望まれる標的細胞は任意の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、造血性の細胞であり、好ましくは、細胞は、Ｔ細胞系統の細胞であり、好ましくは、細胞は、胸腺細胞又はリンパ球であり、好ましくは、細胞は、成熟Ｔ細胞の亜集団を含む、末梢リンパ球（たとえば末梢血リンパ球）などのような、リンパ球の集団である。好ましくは、標的細胞は、Ｔ細胞、好ましくは成熟ナイーブＴ細胞である。細胞が胸腺細胞である場合、好ましくは、使用される技術は、末梢Ｔ細胞と同じ技術である。
【００７７】
好ましくは、標的細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞ではない。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化及びＰＩ３Ｋ阻害の後にＦｏｘｐ３を発現しない。適切には、標的細胞（複数可）はＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない。適切には、標的細胞（複数可）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されている又は本質的にＣＤ８＋Ｔ細胞がない。適切には、標的細胞はナイーブＴ細胞である。
【００７８】
好ましくは、標的細胞は、トランスジェニック細胞ではない。トランスジェニック細胞は遺伝的に不安定となり得る。トランスジェニック細胞は、対象へのそれらの再導入を企図する場合、調節性の課題となりやすい。好ましくは、標的細胞は、所望の対象からあらかじめ収集された自然発生の細胞である。
【００７９】
処理される細胞が標的細胞の亜集団（Ｔ細胞）を含むのみである場合、たとえば、処理が末梢リンパ球に対して行われる場合、明らかに、用語「標的細胞」は、処理されている細胞の全集団の中のＴ細胞を指すと適宜解釈されなければならない。言いかえれば、本発明を実施する際に、事実上、それらの細胞の亜集団のみが標的細胞である場合、Ｆｏｘｐ３発現を誘発するように細胞の集団を処理することが望ましいかもしれない。たとえば、末梢リンパ球の集団はＢ細胞、Ｔ細胞、及び他の細胞を含んでいてもよい。便宜上、末梢リンパ球の全集団を処理してもよいが、もちろん、それらの一部分のみ（つまりＴ細胞）が事実上、標的細胞となることが熟練の読者によって十分に理解されるであろう。目的は典型的にＴｒｅｇを産生することであるので、標的細胞は非Ｔｒｅｇ細胞となるであろう。好ましくは、標的細胞は、本発明の処理（１又は複数）の前にＦｏｘｐ３を発現しないＴ細胞である。
【００８０】
調節性Ｔ細胞を産生する方法
広範囲の態様では、本発明は、１又は複数のＴ細胞の集団を採取し、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いてそれらを処理し、調節性Ｔ細胞を得ることに関する。
【００８１】
もう少し詳細には、好ましくは、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ，T cell receptor）又はシグナル伝達タンパク質のＴＣＲ関連ＣＤ３複合体を介して刺激される。実際に、ＴＣＲシグナルは、その関連タンパク質を介して事実上伝達される。したがって、ＴＣＲを介して刺激するために、実在するＴＣＲ自体を標的とすること（たとえば抗原特異的ＴＣＲターゲティング）又はＣＤ３（たとえばＴＣＲ関連タンパク質（１又は複数））が可能である。次いで、この刺激は好ましくは中止される。この刺激の中止に続いて、細胞は、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いて処理される。ＰＩ３−Ｋ阻害剤とのインキュベーションに続いて、調節性Ｔ細胞が得られる。具体的には、ＰＩ３−Ｋ阻害剤の処理はＦｏｘｐ３発現を誘発し、これは、調節性Ｔ細胞になる運命又は調節性Ｔ細胞への分化をもたらす。
【００８２】
この効果をもたらすための例証となる方法は実施例で提供される。
【００８３】
ＴＣＲ刺激に関するタイミングは、効果を改善するために有利に操作することができる。好ましくは、Ｔ細胞は、それらがＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いて処理される場合、少し前に活性化されている。活性化は、Ｔ細胞受容体を介する刺激を指す。「少し前の」によって、直前の２日以内の刺激又は活性化が意味される。
【００８４】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理が活性化の４８時間以内に適用される場合、最高の結果が得られる。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の３〜４７時間以内に、好ましくは、刺激の４７時間以内に、好ましくは、刺激の３０時間以内に、好ましくは、刺激から約１８時間で、好ましくは、刺激から１８時間で提供される。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の少なくとも３時間後に、好ましくは、刺激の少なくとも４時間後に、好ましくは、刺激の９時間を超える時間の後に、好ましくは、刺激の少なくとも１０時間後に、好ましくは、刺激の約１８時間後に、好ましくは 刺激の１８時間後に提供される。これらのタイミングの技術的な利益はＦｏｘｐ３誘発の最適化及び／又は最大化である。
【００８５】
好ましくは、刺激からの時間は、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達の中止からの時間である。
【００８６】
好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激から３〜４７時間の範囲で、好ましくは、刺激から４〜４７時間の範囲で、好ましくは、刺激から４〜３０時間の範囲で、好ましくは、刺激から１０〜３０時間の範囲で、好ましくは、刺激から１２〜２５時間の範囲で、好ましくは、刺激から１５〜２５時間の範囲で、好ましくは、刺激から１７〜１９時間の範囲で、好ましくは、刺激から約１８時間で、好ましくは、刺激から１８時間で提供される。これらのタイミングの技術的な利益はＦｏｘｐ３誘発の最適化及び／又は最大化である。
【００８７】
最も好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の１０〜２２時間後の時間に、好ましくは、刺激の１２〜２０時間後の時間に、好ましくは、刺激の１２〜１８時間後の時間に、好ましくは、刺激の１７〜１９時間後の時間に、好ましくは、刺激の約１８時間後に、好ましくは、刺激の１８時間後に提供される。これは、優れたＦｏｘｐ３誘発という利点を有する。実際に、これらのタイミングの技術的な利益は、実施例の部で、たとえば図１Ｃに関して示される。
【００８８】
調節性Ｔ細胞
調節性Ｔ細胞（時にＴｒｅｇと呼ばれる）は健常な免疫系の重要な構成要素である。調節性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞を抑えること及び自己免疫性疾患の主要な要因となり得る「自己認識」の予防に関与する。
【００８９】
調節性Ｔ細胞は、当技術分野で知られている、多数の承認されているバイオマーカーを有する。これらは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、及びＦｏｘｐ３＋を含む。特に、本発明によれば、調節性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３発現（Ｆｏｘｐ３＋）を示さなければならない。
【００９０】
調節性Ｔ細胞は、好ましくは、調節性機能を示さなければならない。調節性機能の表示は、当技術分野で知られている任意の適した方法によって決定してもよい。特に、そのような試験の例は、実施例の部で説明される。具体的には、図３に例示される試験は、調節性Ｔ細胞の機能についての標準的なインビトロ試験として見なされる。
【００９１】
インビボで、調節性Ｔ細胞は、それらの生存及び／又はそれらの調節性機能の維持のために、ＩＬ−２、ＴＧＦベータ、又はＩＬ−９（肥満細胞に由来するＩＬ−９など）などのような付加的な因子を必要とすると広く考えられている。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、前記リンホカインとそれらのＴ細胞を接触させることに加えた、Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発に関し、前記リンホカインと接触させることは、肥満細胞などのような、前記リンホカインを生成する細胞と接触させることによって達成し得る。本実施形態では、前記リンホカインを生成する細胞（たとえば肥満細胞）は、処理されている対象中にインビボで提供することができる。ＰＩ３ＫＰ１１０δノックアウト動物は、肥満細胞依存性の応答を有しておらず、Ｔｒｅｇ機能の低下を示すことに注目されたい。
【００９２】
ＰＩ３Ｋ／ｍ−ＴＯＲ／Ａｋｔ阻害剤
本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ、好ましくはクラスＩ ＰＩ３Ｋ、好ましくはクラスＩＡ ＰＩ３Ｋを阻害することができる任意の１つ又は複数の化合物であってもよい。特に、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、生体高分子であってもよく又は小有機化合物若しくは小無機化合物であってもよい。好ましくは、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、小有機化合物、好ましくは合成化合物である。
【００９３】
いくつかの小分子ＰＩ３Ｋ阻害剤は臨床上の使用のための評価の下にあり、これらは本発明の好ましい阻害剤である。ＰＩ３Ｋのいくつかの小分子阻害剤は臨床上の使用のために承認されており、これらは本発明のより好ましい阻害剤である。
【００９４】
もちろん、いくつかのＰＩ３−Ｋ阻害剤は１つを超えるアイソザイムに作用してもよい。ＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｆｏｘｐ３発現の誘発を直接引き起こさないと発明者らが開示する、ＰＩ３−Ｋサブタイプの１つに作用する場合、これは、そのＰＩ３−Ｋ阻害剤を本発明から除外するものではない。本明細書で使用されるようなＰＩ３−Ｋ阻害剤の重要な特徴は、そのＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｆｏｘｐ３発現の誘発にとって重要であるとして開示されるＰＩ３−Ｋアイソザイムの１つを阻害するように作用することである。したがって、本発明によるＰＩ３−Ｋ阻害剤は、好ましくは、ＰＩ３−Ｋα及び／又はＰＩ３−Ｋδの作用を阻害する活性を示さなければならない。そのような阻害剤がまた、ＰＩ３−Ｋβ又はＰＩ３−Ｋγなどのような異なるＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する副次的な効果をも有する場合、そのような阻害剤は、本発明から除外されるものと見なされるべきでない。しかしながら、明らかに、投与を単純化し、且つ不要な多面効果又は副作用を回避するために、可能な限り特異的な効果を有するＰＩ３−Ｋ阻害剤を選ぶことが好ましい。したがって、好ましくは、本発明のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、所与のＰＩ３−Ｋアイソザイムに対して特異的である。好ましくは、本発明のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋα及び／又はＰＩ３−Ｋδに対して特異的である。好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋαに対して特異的である。好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋδに対して特異的である。ＰＩ３−Ｋα及びＰＩ３−Ｋδの両方の活性を低下させる阻害剤は特に好ましく、最も好ましいのは、ＰＩ３−Ｋα及びＰＩ３−Ｋδの活性を低下させるが、ＰＩ３−Ｋγ及び／又はＰＩ３−Ｋβなどのような他のアイソザイムの活性を低下させない阻害剤である。
【００９５】
これらの阻害剤は、Ｆｏｘｐ３の調節で有力に活性であるので、最も好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋアルファ又はＰＩ３−Ｋデルタに対して特異的であり、好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋアルファ及びＰＩ３−Ｋデルタに対して特異的である。
【００９６】
最も好ましいのは、臨床上の使用のために承認され、且つＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害するＰＩ３Ｋ阻害剤である。さらに好ましいのは、ＰＩ３−Ｋγ及び／又はＰＩ３−Ｋβなどのような他のアイソザイムの活性をも低下をさせないような阻害剤である。
【００９７】
先行技術で使用されてきたような、生物学的な供給源から精製された生理活性ペプチド（たとえばＴＧＦベータ）とは対照的に、ＰＩ３Ｋの小分子阻害剤は、合成的に生成することができ、且つ優れた薬理学的特性を有する（インスリン及び経口糖尿病薬の間の違いと似ている）。個々のＰＩ３Ｋアイソザイムに対する選択性を有する化合物などのような合成ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物の使用は、生理活性ペプチドの副作用を最小限にする又は排除することができるといった技術的な利点を提供する。
【００９８】
新世代のＰＩ３−Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられており、幅広い範囲の他のキナーゼよりも優先的に、ＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する選択性を有することが示された（Knight et al., 2006 Cell vol 125 pp733-747）。選択的なクラスＩＡ ＰＩ３Ｋ阻害剤は本発明の好ましい阻害剤である。好ましい阻害剤は、実施例の部で示され、最も好ましいのは、実施例の部のアルファＰＩ３Ｋ阻害剤及びデルタＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００９９】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、及びＰＩＫ−９０などのような合成化合物を含む。好ましいｍ−ＴＯＲ阻害剤は、上記及び実施例の部に開示される。最も好ましいのはラパマイシンである。
【０１００】
プロテインキナーゼＢ又はＡｋｔ（ＰＫＢ／Ａｋｔ−便宜上、これを単に「Ａｋｔ」と本明細書で呼ぶ）は、セリン／トレオニンキナーゼであり、これは、哺乳動物では、ＰＫＢアルファ（Ａｋｔ１）、ＰＫＢベータ（Ａｋｔ２）、及びＰＫＢガンマ（Ａｋｔ３）として知られている３つの高度に相同的なメンバーを含む。Ａｋｔ阻害剤は、アロステリック阻害剤Ａｋｔｉ−１／２を含む。
【０１０１】
ラパマイシン
ｍ−ＴＯＲシグナル伝達の阻害（つまりラパマイシン処理）は、先行技術で、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの増大に寄与することが示されたが、ラパマイシンによるＦｏｘｐ３の誘発の教示はない。その発明者らは、当技術分野の、ｍ−ＴＯＲ阻害及びＦｏｘｐ３誘発の間のあらゆる関連に気づいていない。実際に、本発明者らは、生物学的に関係のある飢餓／栄養源の除去を使用して、この分野を調査し、ｍ−ＴＯＲ活性の低下を誘発した。これらのシグナルは、ｍ−ＴＯＲ活性の低下の実証としてｐＳ６を消失させることが示されたが、Ｆｏｘｐ３の誘発をもたらさない。その系の、この簡潔にして要を得た精査は、本発明の方法が、Ｆｏｘｐ３の誘発への新たなアプローチを提供することを示し、ｍ−ＴＯＲシグナル伝達を介して作用して、Ｆｏｘｐ３＋細胞の増大をもたらす先行技術のアプローチは、事実上、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現及びＴｒｅｇの分化を誘発しないことをさらに示す。
【０１０２】
ラパマイシンはＰＩ３Ｋ阻害剤ではない。たとえば、「試験したどのプロテインキナーゼも、細胞ベースのアッセイで、ｍＴｏｒを阻害するのに必要とされる濃度よりも１０〜２０倍高い濃度である１マイクロＭのラパマイシンによって有意に阻害されなかった（Ｂｉｏｃｈ． Ｊ． ３５１：９５−１０５， ２０００）」ことが当技術分野で実証されており、これは、阻害剤の特異性についての標準的な作業である。
【０１０３】
組合せ
Ｆｏｘｐ３発現が本発明によって誘発されると、本明細書で教示される方法を、それらの細胞の増大を促進する方法と組み合わせることは有利であるかもしれない。したがって、好ましい実施形態では、好ましくは、Ｆｏｘｐ３発現が誘発された調節性Ｔ細胞は続いて増大させられる。好ましくは、これは、ラパマイシン処理によって達成される。特に、これは、Battaglia et al 2005 Blood Volume 105 page 4743と同様達成することができる。
【０１０４】
さらなる用途
本発明は、自己免疫性疾患の予防及び／又は治療などのような、Ｔｒｅｇ細胞のデノボ産生が望ましい臨床状況での広範囲の用途を見出す。
【０１０５】
ｍ−ＴＯＲ阻害は、インビトロの調節性機能の維持にとって重要であるかもしれない。
【０１０６】
本発明は、特異的な抗原に対する調節性Ｔ細胞の誘発での用途を見出す。本実施形態では、抗原は最初に選択され、次いで、Ｆｏｘｐ３誘発は、その特異的な抗原に応答することができるＴ細胞中で起こる。
【０１０７】
調節性Ｔ細胞は免疫系をコントロールする。特に、それらは、Ｔエフェクター細胞を抑える。調節性Ｔ細胞の欠損症は、関節リウマチなどのような自己免疫疾患と関連する。したがって、調節性Ｔ細胞を作製することによって、典型的に、本明細書に開示されるようにＦｏｘｐ３発現を誘発することによって、そのような免疫損傷を妨げる、予防する、又は低下させることができる。
【０１０８】
本発明は、有利には、インビトロでの調節性Ｔ細胞の産生に適用することができる。先行技術では、これは、ＴＧＦβを用いる処理によって達成された。本発明は、この方法に対する好都合な代替物を提供する。そのうえ、本発明は、生理活性ＴＧＦβペプチドへの曝露を回避する利点を提供する。
【０１０９】
特に、本発明は、調節性Ｔ細胞のエクスビボ産生での用途を見出す。本実施形態では、Ｔ細胞の集団は患者から採取される。次いで、これらは、調節性Ｔ細胞を誘発するために、本発明の方法に従って処理される。次いで、これらの調節性Ｔ細胞は、治療効果を提供するためにその患者に再導入することができる。
【０１１０】
本発明は、免疫抑制での用途を見出す。特に、免疫抑制は、臓器移植又は移植片対宿主病に続いて適用することができる。
【０１１１】
本発明はまた、一般に自己免疫性疾患での用途をも見出す。特に、本発明は、胃炎、甲状腺炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症、又は他の自己免疫性疾患などのような自己免疫性疾患での用途を見出す。
【０１１２】
そのうえ、本発明は、同種移植片拒絶反応及び関節リウマチ又はコラーゲン誘発性の関節炎などのような関節炎の例の抑制での用途を見出す。さらに、本発明は、本明細書に説明されるように、ある種の癌、具体的には、それら自体、Ｂ細胞悪性腫瘍（たとえば白血病、リンパ腫など）などのようなリンパ球からなるそれらの癌を撲滅する際の用途を見出す。
【０１１３】
他の実施形態では、好ましくは、本発明の方法はインビトロでのものである。好ましくは、本発明の方法は、ヒト又は動物の体を含まない。
【０１１４】
適切には、Ｆｏｘｐ３発現の誘発への言及は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発を意味することが理解されるべきである。適切には、既存のＦｏｘｐ３発現の増強又は既にＦｏｘｐ３を発現する細胞の増大は、本発明の一部ではない。適切には、本発明は、本発明の処理／方法の前にＦｏｘｐ３を発現していなかった細胞（複数可）中でのＦｏｘｐ３発現の生成に関する。理論によって拘束されることなく、Ｆｏｘｐ３の発現は、適切な標的細胞からのＴｒｅｇ産生にとって必要であり且つ十分である。したがって、細胞のインキュベーションは、本発明に従ってデノボでのＦｏｘｐ３発現を引き起こし、Ｔｒｅｇ産生をもたらす。
【０１１５】
本発明のある態様は、以下の番号が付けられた項に関して理解され得る。
【０１１６】
１．調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法。
【０１１７】
２．調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０１１８】
３．調節性Ｔ細胞（複数可）を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと、
（ｖ）上述の対象に上述のＴ細胞を再導入するステップと
を含む方法。
【０１１９】
４．あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含む方法。
【０１２０】
５．Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iii）ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０１２１】
６．上述のＴ細胞を刺激するステップが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して上述のＴ細胞を刺激するステップを含む、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
７．ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップが、上述の細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する項１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１２３】
８．調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発でのＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【０１２４】
９．Ｆｏｘｐ３発現の誘発でのＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【０１２５】
１０．調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用。
【０１２６】
１１．調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤。
【０１２７】
１２．調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤。
【０１２８】
１３．（ｉ）ＴＣＲ刺激剤と、
（ii）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤と
を含むキット。
【０１２９】
１４．上述のＴＣＲ刺激剤が抗ＴＣＲ抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、前記１３に記載のキット。
【０１３０】
１５．ｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、前記１３又は１４に記載のキット。
【０１３１】
１６．上述のｍ−ＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、前記１５に記載のキット。
【０１３２】
１７．Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、前記１３〜１６のいずれかに記載のキット。
【０１３３】
１８．上述のＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２を含む、前記１〜７のいずれかに記載の方法、前記８〜１０のいずれかに記載の使用、及び前記１１若しくは項１２に記載の阻害剤又は前記１３〜１７のいずれかに記載のキット。
【０１３４】
本発明を実施例によってこれから記載する。これらの実施例は、例証となるように意図され、添付された請求項を限定するようには意図されない。
［実施例］
【０１３５】
材料及び方法
マウス系統、細胞選別、及び培養。動物についての作業はＡｎｉｍａｌｓ （Scientific Procedures） Ａｃｔ、ＵＫに従って実行した。リンパ節（ＬＮ）細胞は、染色し、分析し、記載されるようにフローサイトメトリーによって選別した（Cobb et al 2005 J. Exp. Med. 201: 1367-1373）。Ｆｏｘｐ３タンパク質についての細胞内染色は、メーカーによって助言されるように行った（eBiosciences．Com）。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化ステータスは、eBioscience社製Ｆｏｘｐ３染色キット及び抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はＩｇＧ−Ｃｙ５（Jackson ImmunoResearch）を使用して、抗ｐＳ６ Ｓｅｒ２３５／２３６（Cellsignaling cat.no.2211、http://www.cellsignal.com）を使用して決定した。Ｆｏｘｐ３発現の誘発について、選別したＬＮ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＴＣＲβ（Ｈ５７、Pharmingen、２００ｎｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ、Pharmingen）と共に１〜３×１０６／ｍｌで培養した。１８時間後、細胞は、ＴＣＲ刺激の継続のために所定の位置に放置したか示す添加剤と共に、コーティングされていないウェルに移動させた。
【０１３６】
調節性機能を評価するために、示すように培養したＣＤ４ Ｔ細胞を、１×１０５ＣＦＳＥ標識化全ＬＮ細胞又は５×１０４ＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれか及び１×１０５マイトマイシンＣ処理（２５μｇ／ｍｌ、２０分間、３７℃）Ｔ細胞除去脾細胞を含む丸底ウェル中に、示す濃度の抗ＣＤ３（２Ｃ１１、Pharmingen）と共に滴定した。ＣＤ４ Ｔ細胞ＣＦＳＥプロファイルは４８〜７２時間後に記録した。
【０１３７】
養子移入実験。インビボで、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ ＬＮ Ｔ細胞をＣＦＳＥを用いて標識化し、上記のように１８時間活性化し、未治療の同一遺伝子のレシピエント（レシピエント当たり２〜４×１０６細胞）の中にｉ．ｖ．で移入した。ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は示すようにｉ．ｐ．で与えた。脾細胞は、４８時間後に、ＣＤ４及びＦｏｘｐ３について染色した。Ｆｏｘｐ３発現は、内在性（ＣＦＳＥ−）ＣＤ４＋細胞及び移入した（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４＋細胞について決定した。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット。全ＲＮＡは、ＲＮＡｂｅｅ（Tel−Test、Friendswood、ＴＸ）を使用して単離し、逆転写した。リアルタイムＰＣＲ分析は、（Cobb et al 2005 同書）に記載されるように、Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）ＤＮＡエンジンで実行し（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．；７２℃でのプレートリードと共に、１５分間９５℃、その後、１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び３０秒間７２℃の４０サイクル）、Ｙｗｈａｚ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）及びユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｌ３（Ube2L3,ubiquitin conjugating enzyme E2L3）の相乗平均に正規化した。プライマー配列 （５’〜３’）
Ｙｗｈａｚフォワード：ＣＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴ
Ｙｗｈａｚリバース：ＴＣＴＧＧＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧ
Ｕｂｃフォワード：ＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡ
Ｕｂｃリバース：ＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡ
Ｆｏｘｐ３フォワード：ＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧ
Ｆｏｘｐ３リバース：ＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴ
【実施例１】
【０１３９】
ＴＣＲシグナルの中止は、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を誘発する。
ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ（Ｈ５７）及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、次いで、ＴＣＲ抗体でコーティングされていないプレートに（それらのもとの培地中に）移した。４８時間後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、継続的なＴＣＲシグナル伝達に曝露されたコントロールと比較して、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞中でＦｏｘｐ３ ＲＮＡのレベルが上昇したことを示した（図１ａ）。細胞内染色は、ＴＣＲシグナルを取り除いた、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞のかなりの画分でのＦｏｘｐ３タンパク質の発現を示した（１０．８±７．６％ ｎ＝３０）（図１ｂ）が、ＴＣＲ抗体と接触させたままの細胞中では発現を示さなかった（１．０±０．８％ ｎ＝２１）。
【実施例２】
【０１４０】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害は、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を促進する。
Ｆｏｘｐ３の誘発に関係のあるシグナル伝達経路を同定するために、発明者らは、シグナル伝達経路の活性化剤及び阻害剤をスクリーニングした。これらは、ＮＦＡＴの核移行をブロックする、カルシニューリンの阻害剤（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ及びＦＫ−５０６）、関係のあるマイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ，mitogen activated kinase、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ／ｐ３８及び上流キナーゼを含む）の活性化剤及び阻害剤、ＰＫＣアイソザイム、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３，glycogen synthase kinase-3）、低酸素誘発因子（ＨＩＦ−１，hypoxia inducible factor）、Ｎｏｔｃｈ（γ−セクレターゼ阻害剤 Ｌ−６８５４５８を使用）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ，bone morphogenetic protein、ＴＧＦβの類縁体である）の広範囲の阻害剤並びに偽基質を含んだ。これらのうちのどれも、ＴＣＲシグナル遮断によって引き起こされるＦｏｘｐ３の発現を検出可能に増強しなかった。対照的に、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの阻害剤はＦｏｘｐ３誘発を著しく強化した。免疫抑制性マクロライド抗生物質であるラパマイシンは２４〜４８時間内に細胞の２６．８±１４．４％でＦｏｘｐ３の発現を誘発した（ｎ＝３０、図１ｂ）。同様に、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬｙ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎはＦｏｘｐ３を誘発した（Ｌｙ２９４００２については２６．９±１１．４％、ｎ＝２５、図１ｂ及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎについては１７．３±５．３％、ｎ＝３）。コントロール化合物Ｌｙ３０３５１１（２−ピペラジニル−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）はＬｙ２９４００２に構造上、非常に類似しているが、モルホリン環中の単一の原子の置換のためにＰＩ３−Ｋを阻害しない。Ｌｙ３０３５１１は、発明者らの系でのＦｏｘｐ３発現に影響を与えなかった（６．６±３．０％、ｎ＝７）。細胞分裂が起こる前の、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化の１８時間後にＴＣＲシグナル遮断と組み合わせて使用した場合に、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は最大に有効となった（下記参照）。ＴＣＲシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤がＦｏｘｐ３を誘発するために必要とされ、同時刺激は、Ｆｏｘｐ３誘発の効率を著しく増強した（ＴＣＲシグナル中止については３％から９％、ＴＧＦβについては７％から４６％、ラパマイシンについては１０％から２５％、及びＬｙ２９４００２については４％から４４％、２回の実験の平均。ポジティブコントロールとして、ＴＧＦβは、継続的なＴＣＲシグナル伝達を取り除いた細胞の４６．０±１５．１％でＦｏｘｐ３を誘発した（ｎ＝３０、図１ｂ）。Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数の増加が先在するＦｏｘｐ３＋細胞の選択的な増大によるものかどうかを検討するために、発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化に先立って、ＣＦＳＥを用いてそれらを標識化した。細胞分裂は、活性化後の１８時間までに起こらなかった、その時点で、細胞を示す培養条件に置いた（図１ｂ）。２４時間後に、投入細胞の６７〜１０８％が回収された。Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数を実質的に増強するにもかかわらず、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は、細胞分裂の数のわずかな低下をもたらした。これは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤に応じたＦｏｘｐ３発現細胞の度数の増加の説明としての選択的な増大を除外するものである。
【０１４１】
ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲの阻害は、後の時点で及び細胞分裂が起こると、Ｆｏｘｐ３を誘発するのにそれほど有効ではなかった（図１ｃ）。
【実施例３】
【０１４２】
ＴＣＲシグナル伝達は、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でｍＴＯＲ活性をコントロールする。
ＴＣＲシグナル伝達、ＴＣＲシグナル中止、並びにラパマイシン及びＬｙ２９４００２を用いる処理に応じるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の活性をモニターするために、発明者らは、ｍＴＯＲによって直接調節されるｐ７０ Ｓ６キナーゼの標的である、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（ｐＳ６）のレベルを分析した。ｐＳ６の細胞内染色は、単一細胞レベルで、抗ＣＤ２８と組み合わせたＴＣＲシグナル伝達（プレートに結合したＨ５７、３００ｎｇ／ｍｌ）が、大多数のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で高レベルのＳ６リン酸化を誘発したことを示した（図２ａ）。抗ＣＤ２８単独では、効果はなかった（図２ａ、上部のパネル）。Ｓ６リン酸化は、継続的なＴＣＲシグナル伝達の存在下では持続したが、ラパマイシン（２５ｎＭ）又はＬｙ２９４００２（１０μｇ／ｍｌ）によって１時間以内に完全に除去された（図２ｂ）。プレートに結合したＨ５７及び抗ＣＤ２８を用いて１８時間、活性化したナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除くと、ｐＳ６は、より徐々にではあるが減退した（図２ｂ）。よって、Ｆｏｘｐ３誘発は、Ｓ６リン酸化を低下させる操作に応じて起こる。しかしながら、重要なことには、Ｓ６リン酸化の低下はＦｏｘｐ３誘発にとって十分ではない。特に、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞の栄養源の遮断によるｍＴＯＲ阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発しない。
【実施例４】
【０１４３】
ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発は安定しており、調節性機能の獲得をもたらす。
上記に記載されるように、Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤に応じて２４〜４８時間以内に誘発された。調節性機能を有していないＦｏｘｐ３の一時的なアップレギュレーションがヒトＣＤ４ Ｔ細胞で記載されているので、発明者らは、次に、Ｆｏｘｐ３発現の安定性及びＦｏｘｐ３誘発細胞の機能的適格性を検査した。Ｆｏｘｐ３は、誘発の７日後までに強く発現し、Ｆｏｘｐ３は、ＩＬ−２中での数回の再刺激を通して安定して維持されたので、発現は、有糸分裂的に遺伝性であった（図３ａ）。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３の誘発が調節性Ｔ細胞の機能をもたらすかどうかを評価するために、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を活性化し、ＴＣＲシグナルを取り除き、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で培養した。段階的な数の、結果として生じる集団（細胞内染色により２８％ Ｆｏｘｐ３＋）を、新鮮な、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加した、またその集団は、細胞分裂プロファイルによって評価されるように、可溶性抗ＣＤ３（２Ｃ１１、１μｇ／ｍｌ）に対するそれらの反応を効率的にブロックした（図３ｂ、上部のパネル）。対照的に、コントロール細胞（＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）は、ＣＦＳＥ標識化レスポンダー細胞の抗ＣＤ３誘発性の分裂をブロックしなかった（図３ｂ、下部のパネル）。
【０１４４】
発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞がＴ細胞欠損レシピエントに移入された場合に誘導される、大腸炎を防御する能力を、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３誘発が付与するかどうかを試験するために、大腸炎のＴ細胞移入モデル（Powrie et al., 1993）を使用した。（Powrie et al., 1993）
【実施例５】
【０１４５】
インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現
発明者らは、次に、Ｆｏｘｐ３が、インビボで、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によって誘発されるかどうかを検討した。ＴＣＲシグナル遮断を模倣するために、発明者らは、同一遺伝子の完全免疫適格性宿主の尾の静脈に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を注射し、活性化した。２日後に、発明者らは、内在性ＣＤ４脾臓細胞（ＣＦＳＥ−）及び移入された（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４脾臓細胞によるＦｏｘｐ３発現を評価した（図４ａ）。５．３±４．６％（ｎ＝１１）で、回収したＦｏｘｐ３＋細胞の度数は、もとの接種物に含有されるＦｏｘｐ３＋細胞の度数（１．５±１．１％、図４ｂに要約）よりも３倍高かった。ＣＦＳＥ標識化活性化Ｔ細胞のｉ．ｖ．移入に、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２のｉ．ｐ．注射が伴った場合、２日後に回収されたＦｏｘｐ３発現細胞の度数は約１０％までさらに増加した（図４）。対照的に、内在性（ＣＦＳＥ−）Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の度数は変わらないままであり、阻害剤が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞ではなく、通常の細胞に対して選択的に毒性であった可能性を除外した（図４）。我々は、次に、Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数の上昇が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞の選択的な回収率又はＦｏｘｐ３の誘発によるものであるかどうかを検討した。発明者らは、ＴＣＲ遮断がインビトロでＦｏｘｐ３発現をもはや効率的に誘発しなくなる時間である、活性化の４８時間後に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を移入した（図１ｃを参照されたい）。これらの条件下で、わずか１．３±０．５％のＣＦＳＥ＋細胞が移入後にＦｏｘｐ３を発現し（ｎ＝４）、１．６±０．３％のＣＦＳＥ＋細胞が、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で移入後にＦｏｘｐ３を発現した（ｎ＝３、図４ｂ）。
【０１４６】
よって、ＴＣＲシグナル遮断は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ軸の阻害との相乗作用で、新たに活性化されたＴ細胞にＦｏｘｐ３発現を起こしやすくし、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達が、インビトロ及びインビボで、新たに活性化されたＴ細胞中のＦｏｘｐ３誘発にアンタゴナイズすることを示す。
【実施例６】
【０１４７】
選択的なＰＩ３−Ｋ阻害剤は、Ｆｏｘｐ３の調節での、ｐ１１０アイソザイムの間の階層性を明らかにする。
新世代のＰＩ３−Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられており、幅広い範囲の他のキナーゼよりも優先的に、ＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する選択性を有することが示された（Camps et al., Nat Med. 2005, 11:936-943;Knight et al., 2006 同書）。発明者らは、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０アイソザイムの役割を、発明者らのＴ細胞分化アッセイにそれらを滴定することによって精査するためにこれらの化合物を利用した。これらの実験で、ＣＦＳＥ標識化は活性化及び生存率の基準として細胞周期進行を評価するために使用し、Ｆｏｘｐ３の誘発は、Ｓ６リン酸化（図５ｂ）と共に、単一細胞レベル（図５ａ、ｂ）でアッセイした。
【０１４８】
ｐ１１０β及びｐ１１０γはＦｏｘｐ３発現に検出可能に影響を与えない。ＴＧＸ１１５は１０μＭでＦｏｘｐ３発現にわずかな影響を及ぼした。ＴＧＸ１１５はｐ１１０β及びｐ１１０δの両方を阻害する。ＴＧＸ１１５がｐ１１０βを選択的に阻害する０．１μＭでは、ＴＧＸ１１５はＦｏｘｐ３発現に影響を与えず、ｐ１１０βは、この状況で、Ｆｏｘｐ３の調節に有意な役割を果たさないことを示した。同様に、ｐ１１０γ特異的阻害剤ＡＳ−６０５２４０は、ｐ１１０γについてのそのＩＣ５０のはるかに過剰な濃度でのみＦｏｘｐ３に影響を与え（０．００８μＭ）、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０γについての役割が除外された（図５ａ、ｂ）。
【０１４９】
ｐ１１０α及びｐ１１０δは、新たに活性化されたＴ細胞中のＦｏｘｐ３発現を調節する。阻害剤ＩＣ−８７１１４は、０．０１μＭまで、ＴＣＲ遮断のみに加えて、細胞の１０〜１５％のＦｏｘｐ３を誘発した。これらの濃度では、ＩＣ−８７１１４はｐ１１０δを選択的に阻害し、Ｆｏｘｐ３の調節に対するｐ１１０δアイソザイムの有意な寄与を実証する。ＰＩ−１０３化合物は、Ｆｏｘｐ３を強く誘発して、ＴＣＲシグナル遮断のみよりも＞２０％、Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数を上昇させた。ＰＩ−１０３は、ｍＴＯＲＣ１についてのそのインビトロＩＣ５０をわずかに下回る濃度（０．０２μＭ）及びｐ１１０αについてのＩＣ５０あたりの濃度（０．００８μＭ）でＦｏｘｐ３を誘発し、ｐ１１０αについての役割と一致した。ｐ１１０α特異的阻害剤ＰＩＫ７５は、発明者らのアッセイの期間にわたる毒性によりこの示唆を試験するのに使用することができなかった（データ示さず）。決定的証拠は、ＰＩＫ９０の分析からもたらされ、ＰＩＫ９０は０．１μＭでＦｏｘｐ３を強く誘発した。ＰＩＫ９０は、ｐ１１０α及びｐ１１０γを選択的に阻害する（図５ａ、ｂ）。ＡＳ−６０５２４０を用いて発明者らの実験によりｐ１１０γについての役割が除外されるので、この結果は、ｐ１１０αを、Ｆｏｘｐ３の調節での有力なｐ１１０アイソザイムとして同定する。これらの研究に基づき、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０アイソザイムの役割は選択的であるように思われる。ｐ１１０β及びｐ１１０γは検出可能な役割を果たさず、ｐ１１０δは中程度に重要であり、ｐ１１０αは有力である。
【実施例７】
【０１５０】
ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害によるＦｏｘｐ３誘発でのＴＧＦβの関与
ＴＧＦβは、インビトロでの、通常のＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の強力な誘発物質として知られており、したがって、発明者らは、ＴＧＦβが、新たに活性化されたＴ細胞のＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によってＦｏｘｐ３の誘発を媒介するかどうかを調べた。ＦＣＳを追加した細胞培養培地はＴＧＦβを含有するので、発明者らは、無血清リンパ球培地（ＡＩＭ−Ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でこの部に記載される実験を実行した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、免疫系で有力なＴＧＦβアイソフォームであるＴＧＦ−β１の増加は検出されなかったが、ＴＧＦ−β調節は複雑であることが知られており、ＲＮＡレベルは、必ずしも、分泌されたタンパク質の量と相互に関連しない。ＡＬＫ５及びＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合するＴＧＦβの結合は、受容体関連Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化をもたらし、これは、続いて、ｃｏ−Ｓｍａｄと関連し、核に移動させ、転写調節因子として作用する。したがって、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化は、ＴＧＦβシグナル伝達の感受性の指標となる。ナイーブＬＮ Ｔ細胞を、無血清培地中で１８時間活性化し、次いで、ＴＣＲシグナル遮断又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２について、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）に曝露した。全細胞抽出物を、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）を用いるＳＤＳゲル電気泳動及びウエスタンブロッティングにかけたところ、ＴＧＦβに応じた、Ｓｍａｄ２の強いリン酸化を示した（図６ａ レーン１）。対照的に、ＴＣＲシグナル遮断（図６ａ、レーン２）又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２（図６ａ、レーン３及び４）に応じたＳｍａｄ２の検出可能なリン酸化はなかった。ブロットは、続いて、装填コントロールとして抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。
【０１５１】
次に、発明者らは、２つの独立したアプローチ、ＴＧＦβに対する中和抗体及びＴＧＦβアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ，activin receptor-like kinase）の阻害剤であるＳＢ ４３１５４２を使用してＴＧＦβシグナル伝達を阻害しようと試みた。ＳＢ−４３１５４２は、形質転換成長因子−ベータスーパーファミリーＩ型アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の強力で特異的な阻害剤である（Inman et al 2002 Mol Pharmacol. vol 62:65-74）。ＦＣＳを追加した細胞培養培地はＴＧＦβを含有するので、発明者らは、無血清リンパ球培地（ＡＩＭ−Ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でこれらの実験を実行した。中和ＴＧＦβ抗体及びＳＢ４３１５４２は、それぞれ８５％及び９６％、ＴＧＦβによるＦｏｘｐ３誘発をブロックしたが、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発に対する効果は有していなかった（図６ｂ）。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
実施例１〜７の要約
発明者らは、ＴＣＲシグナル伝達及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ活性が、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発にアンタゴナイズすることを示す。理論によって拘束されることなく、この発見は、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞のどちらかになる運命の選出をＴＣＲシグナル伝達の終止に関連づけるので、免疫の調節を理解するための重要な密接な関係を有する。有効の免疫応答は抗原負荷を低下させて、抗原の有用性が制限的になる条件を作り出す。発明者らの結果は、免疫の調節が免疫応答の関与の段階にどのように関連づけられる可能性があるかを示し、これは、Ｔ細胞のホメオスタシスにとって及び免疫病態を抑えるために重要である。
【０１５４】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の薬理学的阻害は、ＴＣＲシグナルの遮断によって引き起こされたＦｏｘｐ３誘発を強化する。ＰＫＣ、Ｎ−ＦＡＴ、ＧＳＫ−３、ＭＡＰＫ、Ｎｏｔｃｈ、及びその他の妨害が、実施例の系でＦｏｘｐ３誘発をもたらさないので、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの関与は選択的である。ＰＩ３−Ｋ活性は、Ｔ細胞活性化に続いて長時間持続し、発明者らの発見は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸が、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発を予防するのに重大であることを実証する。クラスＩ ＰＩ３キナーゼは、ＰＩ３−Ｋの触媒サブユニットであるｐ１１０イソ酵素の選択的な関与に基づいて、２つのグループ、Ａ及びＢにさらに分けられる。ｐ１１０δサブユニット及びｐ１１０γサブユニットの発現は主として白血球に制限されるが、ｐ１１０α及びｐ１１０βは広範に発現し、胚発生にとって不可欠である。クラスＩＢの単一のメンバーであるｐ１１０γはＴ細胞の発達及び活性化にとって重要であり、炎症応答及び自己免疫性疾患の治療のための主要な標的となる。ＰＩ３Ｋシグナル伝達及び疾患の間の関連は、ＰＩ３−Ｋサブユニットの選択的阻害剤の発達及び診療所への導入のための主要な推進力を提供した。発明者らは、ｐ１１０アイソザイムの間の選択性を示すために広範囲に特徴づけられた選択的阻害剤を用いたが、ｐ１１０α及びｐ１１０δはＦｏｘｐ３を調節するが、ｐ１１０β又はｐ１１０γは調節しない。ｐ１１０γは、Ｇタンパク質共役受容体によって活性化されるが、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋ ｐ１１０α、ｐ１１０δ、及びｐ１１０βは、受容体チロシンキナーゼの下流で典型的に活性化され、したがって、リンパ球受容体シグナル伝達に関与している。興味深いことには、Ｆｏｘｐ３調節でのＩＡ ＰＩ３Ｋの間の階層性は、ＴＣＲ刺激性のＰＩ３−Ｋ活性に対するそれらの相対的な寄与とは別個であるように思われる。遺伝学的及び薬理学的分析は、両方とも、Ｂリンパ球及びＴリンパ球中での抗原受容体シグナル伝達でのｐ１１０δについての突出した役割を示すが、発明者らのデータは、ｐ１１０δが、Ｆｏｘｐ３調節において、有意ではあるが、それほど有力ではない役割を有することを示し、ｐ１１０αが最重要であるように思われる。ＴＣＲシグナル伝達及びＦｏｘｐ３調節でのｐ１１０アイソフォームの間の機能的な相違は免疫応答の操作において当業者を助ける。
【０１５５】
ｐ１１０δ欠損マウスはリンパ球活性化の欠陥を示すだけではなく、Ｔｒｅｇ欠損の特徴である炎症性腸疾患をも発症する。これについての可能性のある説明は、肥満細胞に由来するＩＬ−９に対するＴｒｅｇ耐性の依存性及び肥満細胞機能のためのｐ１１０δの不可欠な役割によって示唆される。これらのデータと一致して、Ｔｒｅｇ機能はｐ１１０δ欠損マウスの末梢で損なわれる。これにもかかわらず、Ｔｒｅｇの分化は、発明者らの発見に一致して、ｐ１１０δ欠損胸腺中で増加する。
【０１５６】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤及びラパマイシンの両方は不要な免疫応答を抑圧するために使用されてきたが、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が免疫を調節するメカニズムはほとんど知られていない。ＰＩ３−Ｋ阻害剤及び自己免疫病の間の関連は、ＰＩ３−Ｋシグナル伝達のアンタゴニストであるＰｔｅｎについてヘテロ接合性のマウスは自己免疫病及び他の所見を発症したといった発見によって示唆された。ＰＩ３−Ｋは、複数の細胞型の多数のプロセスを調節し、自己免疫病でのＰＩ３−Ｋの関与についての可能性のあるメカニズムは、Ｔ細胞の生存の増加並びに抗原提示細胞、肥満細胞、及び他の炎症性の細胞型の動員及び活性化を含む。ラパマイシンは、長期的なアッセイで、調節性Ｔ細胞の数に正に又は負に影響を与えることが以前に報告された。発明者らの発見は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が免疫を調整するメカニズムとしてのＦｏｘｐ３の調節を確立する。
【０１５７】
クラスＩＡアイソザイムｐ１１０α及びｐ１１０δとは対照的に、クラスＩＢ ＰＩ３−Ｋアイソザイムｐ１１０γは、Ｇタンパク質共役受容体（ｓｒｃチロシンキナーゼではなく）の下流で圧倒的に機能し、ＰＩ３−Ｋγは有意にＦｏｘｐ３を調節しない。それにもかかわらず、ＰＩ３−ＫγはＴ細胞の発達及び活性化に重要な役割を果たし、最近では、自己免疫性疾患の治療ための標的として認識されてきた。ＰＩ３−Ｋγの阻害剤は、自己免疫病の予防及び治療で有効な薬剤となるが、発明者らが実証するように、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発を介するものではない。
【０１５８】
以前の研究は、特に成長因子の中止と組み合わせて、ラパマイシンを、先在するＴｒｅｇの欠失又は増大の延長に関連づけたが、ラパマイシンは、Ｆｏｘｐ３のデノボ誘発に効果を有していないように思われた。ここで、発明者らは、ＴＣＲシグナル遮断と組み合わせた、ラパマイシンによるＦｏｘｐ３の迅速なデノボ誘発を示す。
【０１５９】
ＴＧＦβは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３の強力な誘発物質であり、したがって、発明者らは、ＴＧＦβが、新たに活性化されたＴ細胞のＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発に関与するどうかを調べた。発明者らは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害に応じて、新たに活性化されたＴ細胞がＴＧＦβ産生を増加させるといった証拠を見出さなかった。Ｆｏｘｐ３誘発は無血清培地中で効率的であり、これは、血清に由来するＴＧＦβの必要を除外する。発明者らの発見は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、Ｓｍａｄ２の検出可能なリン酸化をもたらさないこと並びにＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発は、外因性のＴＧＦβとは無関係であり、中和抗ＴＧＦβに対して抵抗性であり、ＳＢ４３１５４２に対して抵抗性であることを示す。したがって、それらは、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が、ＴＧＦβとは無関係な経路によってＦｏｘｐ３を誘発するモデルと一致している。
【０１６０】
要約すると、発明者らは、新たに活性化されたナイーブＴ細胞中でのＦｏｘｐ３誘発の、新規な、ＴＧＦβとは無関係な経路を同定した。発明者らの発見は、エフェクターになる運命及びＴｒｅｇ機能のどちらかの選出のためのＴＣＲシグナル伝達の重要性を強調し、発明者らは、免疫応答の操作が望ましい状態で、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達の小分子阻害剤によって調節性Ｔ細胞分化を駆動するための新たなアプローチを記載する。
【実施例８】
【０１６１】
デノボＦｏｘｐ３発現の誘発
発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化が、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達によってコントロールされる、Ｆｏｘｐ３発現の誘発のための絶好の機会を作り出すことを教示する。
【０１６２】
概要：活性化は、一連のＴヘルパー（Ｔｈ，T helper）細胞型に分化する又はその代わりに調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）になる運命を取るナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の潜在力を明らかにする。エフェクター細胞対調節性細胞の運命の選出がどのようにコントロールされるかは先行技術でほとんど知られていない。発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞の特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現が、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルが活性化の直後に取り除かれる場合に誘発されることを示す。Ｆｏｘｐ３誘発は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）触媒サブユニットｐ１１０α及びｐ１１０δ、Ａｋｔ、並びにｍＴＯＲによってコントロールされる。これらの発見は、ＴＣＲシグナル伝達経路をＴｒｅｇ細胞の運命の選出に関連づける。本発明は、調節性Ｔ細胞分化の実験用の及び治療上の操作のための新たなアプローチを提供する。
【０１６３】
序論：多細胞生物の特殊化した細胞型は、遺伝子発現の特異的なパターンによって定義される。多能性の造血幹細胞からそれらの分化の間に、発達中のＴ細胞は、それらの系統についての潜在力についてかなりの制限を受ける。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞に余地が残されている選択肢は、いくつかの別個のＴｈサブセット（Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７など）並びにＴｒｅｇ細胞になる運命を含む。Ｔｈ系統の選出は、特異的な病原体に対する有効な免疫応答にとって重要であるが、エフェクター機能及び調節性機能の間のバランスは、過度の免疫病態及び自己免疫病を回避しながら免疫適格を保証するのに重大である。自然調節性Ｔ細胞は、特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現によって特徴づけられ、Ｆｏｘｐ３の安定した高レベルの発現は、調節性Ｔ細胞の機能にとって必要であり、且つ十分である。Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺中で発生し、ナイーブ末梢ＣＤ４ Ｔ細胞から発生する。ＴＧＦβは、インビトロでＦｏｘｐ３発現を指示するが、ＩＬ−２と同様に、Ｔｒｅｇ細胞分化ではなく、インビボでのＴｒｅｇ細胞の維持にとって重要である。エフェクターＴ細胞になる運命及び調節性Ｔ細胞になる運命のどちらかの選出についての分子的なベースは先行技術で知られていないので、発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３発現及び調節性Ｔ細胞の機能を誘発するシグナルを同定することを目指す。
【０１６４】
実験：ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び可溶性抗ＣＤ２８を用いて活性化し、次いで、可溶性抗ＣＤ２８のみを有する新鮮なウェルに移動させる。２日後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、継続的なＴＣＲシグナルに曝露されたコントロールと比較して、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞中でＦｏｘｐ３ ＲＮＡの発現が上昇したことを示した（図７ａ）。Ｆｏｘｐ３タンパク質は、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞で１０．８±７．６％（ｎ＝３０）と検出されたが、ＴＣＲ抗体と接触させたままの細胞ではわずか１．０±０．８％（ｎ＝２１）であった（図７ｂ）。ＴＣＲシグナル伝達の下流でＦｏｘｐ３をコントロールする経路を同定するために、発明者らは、シグナル伝達に関与する酵素の小分子阻害剤をスクリーニングした。ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの阻害剤はＦｏｘｐ３誘発を著しく強化した（図７ｂ）が、カルシニューリン／ＮＦＡＴ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ及びＦＫ−５０６）、マイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ ＪＮＫ、ＳＡＰＫ、ｐ３８、及び上流キナーゼ）、プロテインキナーゼＣアイソザイム、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、低酸素誘発因子、並びにγ−セクレターゼ／Ｎｏｔｃｈの阻害剤は強化しなかった。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンは、２６．８±１４．４％の細胞でＦｏｘｐ３を誘発した（ｎ＝３０、図７ｂ）。同様に、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎは、２６．９±１１．４％（ｎ＝２５、図７ｂ）及び１７．３±５．３％（ｎ＝３）の細胞でＦｏｘｐ３をそれぞれ誘発した。ＬＹ２９４００２誘導体のＬＹ３０３５１１はモルホリン環中の単一の原子の置換のためにＰＩ３Ｋを阻害せず、Ｆｏｘｐ３発現を誘発しなかった。ＴＧＦβはポジティブコントロールとして使用した（図７ｂ）。Ｆｏｘｐ３発現の増加が、先在するＦｏｘｐ３＋細胞の選択的な増大に起因したかどうかを検討するために、発明者らは、活性化に先立って、ＣＦＳＥを用いてナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を標識化した。細胞を阻害剤に曝露した場合、細胞分裂は１８時間後に起こらなかった。ラパマイシン及びＬＹ２９４００２は、次の２４〜４８時間の間に起こった細胞分裂の数をわずかに低下させたが、Ｆｏｘｐ３発現の度数を実質的に増強し（図７ｂ）、Ｆｏｘｐ３は、細胞分裂を受けなかった多くの細胞中で発現した（図７ｂ）。よって、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を誘発する。
【０１６５】
Ｔ細胞活性化はＦｏｘｐ３誘発に必要とされ（図７ｃ）、同時刺激は著しくその効率を増強した。
【０１６６】
同時刺激は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じてＦｏｘｐ３誘発の効率を著しく増強した。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
Ｔ細胞活性化及びＦｏｘｐ３誘発の間の一時的な関係を調査するために、発明者らは、異なる時間にＴＣＲ刺激を中止し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲを阻害した（図７ｃ）。Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ／ｍＴｏｒ阻害に先立って１８時間活性化した場合、Ｆｏｘｐ３誘発は最大となった。阻害剤をより早く添加すると細胞分裂をブロックし、Ｆｏｘｐ３の誘発はそれほど効率的ではなくなった。同様に、細胞分裂が起こると、より後の時点では、Ｆｏｘｐ３誘発は非効率的であった（図７ｃ）。発明者らは、Ｔ細胞活性化がＦｏｘｐ３誘発のための絶好の機会を作り出すといった結論を下す。
【０１６９】
誘発されると、Ｆｏｘｐ３発現は有糸分裂的に遺伝性であり、数回の再刺激を通して維持された（図７ｄ）。Ｆｏｘｐ３誘発細胞（３６％ Ｆｏｘｐ３＋）が、可溶性抗ＣＤ３に応じて、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞の細胞分裂を効率的にブロックした（図７ｅ、上部のパネル）が、コントロールの活性化細胞（１％のＦｏｘｐ３＋）はブロックしなかった（図７ｅ、下部のパネル）ので、Ｆｏｘｐ３発現には調節性Ｔ細胞の機能が伴った。休止ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞又はコントロールの活性化ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞は、リンパ球欠損（Ｒａｇ−／−）マウスに移入した場合、大腸炎を引き起こすが、Ｆｏｘｐ３が、移入に先立って、ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞の一部分で誘発された場合（２８％ Ｆｏｘｐ３＋）、大腸炎は、それほど著しく重症ではなかった（図７ｆ）。
【０１７０】
末梢ＣＤ４ Ｔ細胞は「適応可能な」Ｔｒｅｇ細胞を生じさせることができるが、胸腺中で「自然に」発生するＴｒｅｇ細胞と比較したそれらの生理学的関連性は関心分野である。ＴＣＲシグナル伝達の操作が胸腺細胞中でのＦｏｘｐ３発現を駆動するかどうかを検討するために、発明者らは、ＣＤ４単一陽性、ＣＤ２５陰性胸腺細胞を１８時間活性化し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を添加した（図７ｆ）。Ｆｏｘｐ３発現の分析は、２日後に、胸腺細胞のかなりの画分のＦｏｘｐ３の誘発を実証した。
【０１７１】
新世代のＰＩ３Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられている。ＰＩ３Ｋアイソザイムについてのこれらの化合物の選択性は、インビトロキナーゼアッセイ及び細胞ベースの実験（表１を参照されたい）によって並びにインスリンシグナル伝達及びリンパ球活性化に対する、薬理学的及び遺伝学的消失の効果を直接比較することによって広範囲に検証された。発明者らは、Ｆｏｘｐ３のコントロールでの、ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットの関与を定義するためにこれらの化合物を利用した。ＴＧＸ１１５化合物は１０μＭではＦｏｘｐ３発現にわずかな影響を及ぼし、ＴＧＸ１１５化合物はｐ１１０β及びｐ１１０δの両方を阻害するが、０．１μＭではＦｏｘｐ３発現に影響を与えず、ＴＧＸ１１５化合物はｐ１１０βを選択的に阻害する。同様に、ｐ１１０γ特異的阻害剤ＡＳ−６０５２４０は、ｐ１１０γについてのそのＩＣ５０のはるかに過剰な濃度でのみＦｏｘｐ３に影響を与えた（０．００８μＭ、ｐ１１０β及びｐ１１０γは、この状況で、Ｆｏｘｐ３の調節に有意な役割を果たさないことを示す（図８ａ、ｂ）。ＩＣ−８７１１４化合物は、ｐ１１０δを選択的に阻害する濃度（０．０１μＭ）で、ＴＣＲ遮断のみに加えて、細胞の１０〜１５％でＦｏｘｐ３を一貫して誘発し、Ｆｏｘｐ３の調節に対するｐ１１０δの有意な寄与を実証した。ＰＩ−１０３化合物は、Ｆｏｘｐ３を強く誘発して、＞２０％までＦｏｘｐ３発現細胞の度数を上昇させた。ＰＩ−１０３は、ｍＴＯＲについてのそのインビトロＩＣ５０をわずかに下回る濃度（０．０２μＭ）及びｐ１１０αについてのインビトロＩＣ５０あたりの濃度（０．００８μＭ）でＦｏｘｐ３を誘発し、ｐ１１０αについての役割と一致した。ｐ１１０α特異的阻害剤ＰＩＫ７５は、アッセイの期間にわたる毒性によりこの示唆を試験するのに使用することができなかった。ｐ１１０αの役割についての決定的証拠は、ＰＩＫ９０の分析からもたらされ、ＰＩＫ９０は０．１μＭでＦｏｘｐ３を強く誘発し、ＰＩＫ９０は、ｐ１１０α及びｐ１１０γを選択的に阻害する（図８ａ、ｂ）。ｐ１１０γ阻害がＦｏｘｐ３誘発に影響を与えなかったので（上記参照）、この結果は、ｐ１１０αを、この状況で、有力なｐ１１０アイソザイムとして同定する。ｐ１１０アイソザイムのこの階層性（α＞δ＞＞＞β及びγ）はリンパ球活性化とは別にＦｏｘｐ３調節を設定するように思われ、ｐ１１０δは有力なものとして見なされる。
【０１７２】
もちろん、インビトロＩＣ５０値は、細胞のＩＣ５０についての指標として扱われなければならない；細胞の値は、ＡＴＰからの競合のために典型的にやや高い。ＩＣ８７１１４は、とりわけ１μＭで非常にｐ１１０δに選択的であり、したがって、その濃度での１５％の誘発は明らかにδによるものである。ＴＧＸ−１１５は１０μＭでさえ非常に小さな効果しか有しておらず（小さなδ阻害が得られる）、したがって、ベータは重要性が限られていそうである又はそれほど重要性がなさそうである。α阻害剤１０３及び９０は、低用量で、ＩＣ８７１１４を上回る劇的な誘発を示し、αが有意な役割を果たすことを示す。しかし、それらの化合物にとっての、α及びδの間の差はそれほど大きくはなく、したがって、重大な所見は、それらが、完全にδを不活性化する用量（１０μＭ）で、ＩＣ８７１１４よりも多くの活性を有するということである。ＡＳ−６０５２４０データの解釈は、その化合物についての細胞のＩＣ５０がγについてのどのようなものなのかに依存し、１０μＭで、いくらかのα阻害がこの化合物で得られる。したがって、ガンマが、この状況で、ＴＣＲシグナル伝達と共役するといったことはあまりありそうもない。
【０１７３】
ＴＧＦβは、インビトロでの、通常のＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の強力な誘発物質であり、発明者らは、発明者らの系でのその役割を検討した。ＡＬＫ５及びＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合するＴＧＦβの結合は、受容体関連Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化をもたらし、これは、ＴＧＦβシグナル伝達の感受性の指標を提供する。ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）は、ＴＧＦβに応じて容易に検出可能となったが（図９ａ レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（図９ａ、レーン２）又はＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害（図９ａ、レーン３及び４）に応じて検出可能とならなかった。中和ＴＧＦβ抗体及びＴＧＦβアクチビン受容体様キナーゼをブロックするＳＢ ４３１５４２は、ＴＧＦβによるＦｏｘｐ３誘発を低下させたが（それぞれ８５％及び９６％）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発に対する効果はなく（図９ｂ）、ＴＧＦβは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３の誘発にとって重要でないことを実証した。
【０１７４】
新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でのＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の活性をモニターするために、発明者らは、ｍＴＯＲ調節性のｐ７０ Ｓ６キナーゼＳ６Ｋ１の標的であるＳ６リボソームタンパク質（ｐＳ６）のリン酸化を分析した。ＴＣＲ／ＣＤ２８シグナル伝達（しかし抗ＣＤ２８単独ではない）は、高レベルのｐＳ６を誘発した（図１０ａ）。ＴＣＲシグナルを中止した場合に、Ｓ６リン酸化は減退したので、１８時間活性化されたＴ細胞中でのｍＴＯＲ活性の維持は、継続的なＴＣＲシグナル伝達を必要とした（図１０ｂ）。Ｓ６リン酸化は、ラパマイシン又はＬＹ２９４００２によって完全に除去された（図１０ｂ）。セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢは、ＴＣＲ／ＣＤ２８を通してのシグナル伝達に応じて速やかにリン酸化されるが、ｐＳ６とは対照的に、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）は、ＴＣＲ／ＣＤ２８シグナル伝達の開始の１８時間後にもはや検出されなかった（図１０ｃ）。しかしながら、１８時間活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルを取り除いた場合に、Ａｋｔ（Ｓ４７３）リン酸化は回復し、これは、１、３、及び８時間でのｐＡｋｔのレベルの増加並びにｐＳ６レベルの相反する減退をもたらした（図１０ｃ）。１時間のラパマイシンへの曝露は類似の効果を有した。ＴＣＲシグナル遮断及びラパマイシン処理に応じたＡｋｔリン酸化の増加は、従来の線状のシグナル伝達経路と適合しないが（図１０ｄ）、Ａｋｔ活性がＰＤＫ１及びｍＴＯＲＣ２の両方によってコントロールされるネットワークモデルと一致している。このモデルで、ｍＴＯＲＣ２（ｍＴＯＲ／ｒｉｃｔｏｒ／Ｓｉｎ１）は、Ｓ６Ｋ１を介するｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ／ｒａｐｔｏｒ）の負のフィードバックコントロール下にあり、Ｓ６Ｋ１は、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１，insulin receptor substrate 1）をリン酸化し、阻害し、また、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、及びｍＴＯＲＣ２を介してＡｋｔ活性化を低下させる（図１０ｅ）。発明者らのデータに適用させると、ＴＣＲシグナル伝達の中止は、ｍＴＯＲＣ１及びＳ６Ｋ１の活性を低下させ（図１０ｂ）、これは、ｍＴＯＲＣ２のフィードバック阻害を低下させ、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）の観測された増加について説明する（図１０ｃ）。同様に、ラパマイシンを用いる短期の処理は、ｍＴＯＲＣ２の、ｍＴＯＲＣ１依存性のフィードバック阻害をブロックし、Ａｋｔ（Ｓ４７３）リン酸化をもたらす（図１０ｃ、ｅ）。興味深いことには、ＴＧＦβもまたｐＳ６の低下及びｐＡｋｔ Ｓ４７３の増加をもたらし、この点に関して、ＴＣＲシグナル遮断及びｍＴＯＲ阻害に似ている（図１０ｃ）。
【０１７５】
１８時間活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞の栄養源の遮断はｐＳ６を阻害するが、Ｆｏｘｐ３を誘発しなかったので、Ｓ６リン酸化の低下のみではＦｏｘｐ３発現を誘発するのに十分ではなかった（ＴＣＲシグナル伝達の継続：２％ Ｆｏｘｐ３＋；ＴＣＲシグナル遮断 １１％ Ｆｏｘｐ３＋；ラパマイシン：２５％ Ｆｏｘｐ３＋；０．１％ ＦＣＳを有するＩＭＤＭ培地：４％ Ｆｏｘｐ３＋；１０％ ＦＣＳを有するＰＢＳ：５％ Ｆｏｘｐ３＋；０．１％ ＦＣＳを有するＰＢＳ：２％ Ｆｏｘｐ３＋）。ＴＣＲシグナル遮断によるＦｏｘｐ３の誘発は、ｍＴＯＲＣ１媒介性のフィードバック阻害の損失に続く、Ａｋｔ活性の増加又はその代わりに、ラパマイシンへの長期的な曝露が、ｍＴＯＲＣ２の構築及び結果的にＡｋｔ（Ｓ４７３）のリン酸化に干渉する場合に起こるＡｋｔ活性の最終的な損失によるものかどうかといった余地が残されている。この疑問を検討するために、発明者らはアロステリック阻害剤、Ａｋｔｉ−１／２を使用した。Ａｋｔｉ−１／２は、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２（それぞれ５８ｎＭ及び２１０ｎＭ）についてのそのＩＣ５０のあたりの濃度で少し前に活性化されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を増強し、Ａｋｔ活性化ではなく、Ａｋｔ阻害がＦｏｘｐ３誘発を駆動することを実証する（図１０ｆ）。
【０１７６】
要約
要約すると、発明者らは、活性化が、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３の誘発のための絶好の機会を作り出すことを示した。Ｆｏｘｐ３誘発は、ＴＧＦβとは無関係であるように思われ、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達によってアンタゴナイズされる。この発見は、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞のどちらかになる運命の選出をＴＣＲシグナル伝達経路に関連づけるので、免疫の調節を理解するための重要な密接な関係を有する。ｐ１１０δがＦｏｘｐ３発現を調節するといった発明者らの発見と一致して、通常よりも高い数のＴｒｅｇ細胞がｐ１１０δ欠損マウスの胸腺中で産生される。より長い期間では、おそらくｐ１１０δが、順番にＴｒｅｇ細胞に影響を与える肥満細胞のような他の細胞型にとって重要であるので、ｐ１１０δの欠損は、Ｔｒｅｇ細胞の維持及び機能を損なう。発明者らが実証した、Ｆｏｘｐ３調節でのｐ１１０アイソザイムの特異な役割に加えたこれらの考察は、免疫応答の操作についての新たな戦略を可能にする。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害による抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞の産生に対する可能性のある障害は、アプローチが、Ｆｏｘｐ３誘発を可能にするのにＴＣＲリガンドの除去を必要とするかどうかである。しかしながら、発明者らは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在が継続した状態で、かなりの割合のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤がＦｏｘｐ３を誘発することを示す（図１２）。Ｆｏｘｐ３はまた、抗原提示細胞及び特異的なペプチドによって刺激されたＲａｇ１欠損ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４ ＬＮ細胞中でＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によって誘発可能であり、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を使用して、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を産生することが、有利なことには、現在可能であることを実証する。
【０１７７】
興味深いことには、損なわれたＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達は、Ｔｒｅｇ細胞分化を促進するだけではなく、報告によれば、Ａｋｔシグナル伝達はＴｒｅｇ細胞及びそれらの標的で損なわれ、調節性Ｔ細胞の機能がＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達の変化を含む可能性を高める。
【０１７８】
ＴＣＲ関与の持続の欠如又は損なわれたＴＣＲシグナル伝達が、ノンプロフェッショナルＡＰＣによる抗原提示、免疫応答の関与の段階の間の低抗原用量、又はモザイク抗原発現などのような免疫の調節に関連する状態で起こるかもしれない。これは、胸腺及びリンパ節中で組織特異抗原を異所的に発現する上皮細胞によるＴｒｅｇ細胞の選択と一致している。
【０１７９】
実施例８の材料及び方法
マウス、細胞選別、及び培養。動物についての作業はＡｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ、ＵＫに従って実行した。野生型からのリンパ節（ＬＮ）細胞又は胸腺細胞は、記載されるように、染色し、分析し、フローサイトメトリーによって、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、若しくはＣ５７ＢＬ／６ｘ１２９）マウス又はＲａｇ１欠損Ｈ２ｂＴＣＲトランスジェニックマウスと選別した（Thompson et al., 2007 Immunity Vol 26 pp 335-344）。抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下での骨髄に由来し、抗原ペプチドと共にインキュベートした。Ｆｏｘｐ３タンパク質についての細胞内染色は、メーカーによって助言されるように行った（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化ステータスは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製Ｆｏｘｐ３染色キット及び抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はＩｇＧ−Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、抗ｐＳ６ Ｓｅｒ２３５／２３６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｔ．ｎｏ．２２１１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）を使用して決定した。Ｆｏｘｐ３発現の誘発について、選別したＬＮ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＴＣＲβ（Ｈ５７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、２００ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性又はプレートに結合した抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に１〜３×１０６／ｍｌで培養した。１８時間後、細胞は、ＴＣＲ刺激の継続のために所定の位置に放置した又は示す添加剤と共に、コーティングされていないウェルに移動させた。
【０１８０】
調節性機能を評価するために、示すように培養したＣＤ４ Ｔ細胞を、１×１０５ＣＦＳＥ標識化全ＬＮ細胞又は５×１０４ＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれか及び１×１０５マイトマイシンＣ処理（２５μｇ／ｍｌ、２０分間、３７℃）Ｔ細胞除去脾細胞を含む丸底ウェル中に、示す濃度の抗ＣＤ３（２Ｃ１１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に滴定した。ＣＤ４ Ｔ細胞ＣＦＳＥプロファイルは４８〜７２時間後に記録した。
【０１８１】
養子移入実験。ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉナイーブＣＤ４細胞をリンパ球欠損（Ｒａｇ−／−）宿主に移入し、大腸炎を、記載されるようにスコア化した（Powrie et al., 1993 Int. Immunol. Vol 5 pp 1461-1471）。
【０１８２】
ＲＴ−ＰＣＲ並びにノーザンブロット及びイムノブロット。全ＲＮＡは、ＲＮＡｂｅｅ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を使用して単離し、逆転写した。リアルタイムＰＣＲ分析は、（Thompson et al., 2007 上記）に記載されるように、Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）ＤＮＡエンジンで実行し（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．；７２℃でのプレートリードと共に、１５分間９５℃、その後、１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び３０秒間７２℃の４０サイクル）、Ｙｗｈａｚ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）及びＵｂｅ２Ｌ３（ユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｌ３）の相乗平均に正規化した。プライマー配列 （５’〜３’）Ｙｗｈａｚフォワード：
ＣＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴ；Ｙｗｈａｚリバース：
ＴＣＴＧＧＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧ；Ｕｂｃフォワード：
ＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡ；Ｕｂｃリバース：
ＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡ；Ｆｏｘｐ３フォワード：
ＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧ；Ｆｏｘｐ３リバース：
ＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴ
【０１８３】
イムノブロットは記載されるように行った（Thompson et al., 2007 上記）。
【０１８４】
上記の明細書で言及された刊行物はすべて、参照によって本明細書に組込まれる。記載される態様の様々な修正及び変形並びに本発明の実施形態は本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明白となるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。実際に、当業者に明白な、本発明を実行するための記載された形態の様々な修正は以下の請求項の範囲内であることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ，phosphatidyl inositol-3-kinase）阻害剤の新たな使用に関する。特に、本発明は、Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の誘発のための新たな方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞，regulatory T cell）は、Ｔｒｅｇ細胞の非存在下でエフェクターＴ細胞によって引き起こされる自己免疫病及び免疫病態を予防するのに不可欠である。エフェクターＴ細胞を抑止すること（自己免疫病及び免疫病態を抑えること）又は免疫応答（たとえば腫瘍に対する）を高めることを目的とした免疫介入は、Ｔｒｅｇ細胞及びエフェクターＴ細胞の間のバランスを変化させるアプローチを必要とする。現在のアプローチは、時間がかかり、非効率的であり、生物学的な供給源から精製された生理活性ペプチドの使用に依存する又は先在するＴｒｅｇ細胞の増大に依存する。
【０００３】
転写調節因子Ｆｏｘｐ３、細胞内タンパク質、及び転写調節因子のフォークヘッド／ウィングドヘリックスファミリーのメンバーの発現は、Ｔｒｅｇ細胞の特徴である。
【０００４】
生理活性ペプチドＴＧＦベータを用いるＴ細胞の処理は、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現を誘発することで知られている（Chen et al., 2003 J. Exp. Med. vol 198, pp1875-1886）。
【０００５】
ある種のインビボ免疫化プロトコールは、Ｔ細胞受容体トランスジェニックＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発することが報告された（Kretschmer et al., 2005 Nature Immunol. vol 6 p1219）。このアプローチは、抗原に対する特異性及び標的Ｔ細胞のＭＨＣ拘束性の両方についての知識を必要とし、したがって、その結果、免疫化に使用される抗原は選択することができる。この条件は、Ｔ細胞がトランスジェニックＴ細胞受容体を保有する、人工的な実験系によって満たされる。この条件は自然発生の自己免疫性疾患を満たさないといったことがこのアプローチに関する課題となる。
【０００６】
ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）は、Ｆｏｘｐ３を発現する、先在するＴｒｅｇ細胞の増大を操作するために使用されてきた（Zheng et al., 2003 Immunity vol 19 p503; Battaglia et al., 2005 Blood vol 105 p4743）。しかしながら、そのような処理は、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現を誘発しないことが示され、これは課題となる。たとえば、Battagliaら（同書）は、「ラパマイシンを曝露したＴ細胞培養物中の・・・ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔｒ細胞の存在は、ＣＤ２５ Ｔ細胞からのＣＤ２５ Ｔｒ細胞のデノボ誘発又は培養の初めに、限られた量で既に存在する（つまり、１０％のＣＤ４ ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ Ｔ細胞がナイーブ脾臓中に普通見出される）、自然発生のＣＤ４ ＣＤ２５ ＦｏｘＰ３ Ｔｒ細胞サブセットの選択的な増大のいずれかによるものであるかもしれない。この疑問を検討するために、ＣＤ２５ Ｔｒ細胞を除去したＣＤ４ Ｔ細胞を、ラパマイシンの存在下又は非存在下で３週間培養した。ＣＤ４ Ｔ細胞とは対照的に（図３Ａ）、ラパマイシンの存在下で活性化されたＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ細胞は、インビトロでの細胞増殖を抑制しなかったＴ細胞の集団を生じさせた（図４Ａ）。したがって、ＦｏｘＰ３発現は、ＣＤ４ ＣＤ２５ラパマイシン処理Ｔ細胞中でではなくラパマイシンに曝露されたＣＤ４ Ｔ細胞中で増強された（図４Ｂ）」と述べている。そのうえ、用いられるプロトコールは、数週間にわたる、複数回のインビトロ刺激に依存し、これは、非常に大きな労働力を要する欠点を有する。Ｔｒｅｇ細胞数に対するラパマイシンの負の効果もまた当技術分野で報告された。ラパマイシンは、合成化合物ではなく、したがって、不純物の課題及び／若しくは変化又は製剤の課題から影響を受け得る。
【０００７】
したがって、先行技術による技術は、典型的に、既にＦｏｘｐ３を発現している細胞中でのＦｏｘｐ３発現を増強することができる既存のＴｒｅｇの刺激若しくは活性化を介して作用している又は非Ｔｒｅｇのブロッキングに基づき、集団中でのＴｒｅｇの増大／選択若しくは過剰発現をもたらす。これらの結果は、上記に言及されるようなラパマイシン処理と同じである。他の例は、Ｆｏｘｐ３発現の既に存在するレベルを典型的に増強するＴＧＦベータの使用である。そのようなアプローチは、デノボＦｏｘｐ３発現／デノボＴｒｅｇをもたらさない。
【０００８】
ＰＩ３Ｋアイソザイムｐ１１０デルタの遺伝子ターゲティングは、胸腺中でのＴｒｅｇ細胞数の増加をもたらすが、末梢リンパ系器官中でのＴｒｅｇ細胞数の減少をもたらす。これには炎症性腸疾患が伴い、これは、Ｔｒｅｇ細胞の欠損に関連づけられることが多い。ＰＩ３Ｋシグナル伝達及びＦｏｘｐ３発現の間の関係に関する明確な結論はこれらの研究から引き出すことはできない。
【０００９】
ＰＩ３Ｋアイソザイムｐ１１０ガンマの阻害剤は、Ｔｒｅｇ細胞とは別個のメカニズムに基づいた自己免疫性疾患の治療についての評価中である。
【００１０】
国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレットは、エフェクターＴ細胞又は調節性Ｔ細胞と優先的に関連する分子及びそれらの使用の方法を開示する。この文献は、集団レベルについての研究を示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤は、この文献の７６ページ及び図２３Ａに記載されている。Ｆｏｘｐ３発現に対する効果（たとえあったとしても、高用量の、この文献による阻害剤は、おそらく細胞毒性であり、低用量ではほぼ間違いなく有意な効果を示さない）は、Ｆｏｘｐ３発現細胞の増大又はＦｏｘｐ３発現細胞中でのＦｏｘｐ３の発現の増強によるものであるように思われる。国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレットの教示にデノボＦｏｘｐ３発現の証拠はない。この文献の根本的な方針は、免疫系のバランスを傾けるような、たとえば全般的に自己免疫病を低下させようとする又は全般的に応答を増強しようとする試みにある。新たなＴｒｅｇを作製するための教示も示唆もない。それらの方法は、せいぜい、休止細胞（ＰＢＬ）が、同時に、活性化され（ＣＤ３／ＣＤ２８）、阻害される（ＬＹ２９４００２）こと、つまり、同時の活性化及び刺激を教示するものである。他の先行技術による研究（たとえばBattaglia（同書））と共通して及び発明者ら自身の研究と共通して、そのような処理は、デノボＦｏｘｐ３発現／デノボＴｒｅｇを生じない。
【００１１】
米国特許出願公開第２００４／００７２７６６号は、細胞内シグナル伝達を操作することによってＴ細胞応答を調整するための方法を開示する。この文献に開示される方法は、刺激物質及び阻害剤を一緒に、つまり一度に又は同時に添加することを含む。デノボＦｏｘｐ３発現はこのアプローチでは生じない。
【００１２】
Foeyら（Arthritis Res 2002 vol 4 pp64-70）は、サイトカインに刺激されたＴ細胞が、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びｐ７０Ｓ６Ｋに依存する、マクロファージによるＩＬ−１０の産生を誘発するといったこと並びに関節リウマチのその密接な関係を開示する。これは、Ｔ細胞の存在下でのマクロファージに関する研究に関する。Ｔ細胞は、接触の前及び後の効果を分けるために固定された。したがって、細胞は固定されており、ＰＩ３Ｋ阻害剤がこれらの方法で添加される場合、細胞はもはや生きていない。したがって、デノボＦｏｘｐ３発現は、これらの方法によってもたらされない。
【００１３】
Breslinらは、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２が協力して、Ｔ細胞増殖を阻害することを開示する。この例は、他の研究と共通して、増殖などのようなそれらの生態の側面を研究するために、Ｔ細胞を阻害剤に曝露することを含む。阻害剤は、刺激の前に、典型的に、刺激の少なくとも３０分前に添加される。次いで、細胞数又は他のパラメーターが検査される。デノボＦｏｘｐ３発現はそのような技術によって生じない。
【００１４】
米国特許出願公開第２００５／０２６１３１７号は、ヒトＰＩ３Ｋデルタの阻害剤を開示する。この文献は、単に、ある種の好中球、Ｂ細胞、及びある種のエキソサイトーシス細胞について検査するものであり、Ｔ細胞又はＴｒｅｇと関係がない。示されるデータは、単に、開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤が関係のある機能を実際にブロックするといったことを検証することを目的とする。
【００１５】
米国特許出願公開第２００４／０１２６７８１号は、ＣＤ２８媒介性の同時刺激シグナルの阻害によって免疫媒介性の流産を予防する方法を開示する。これらの方法は、可溶性のリガンドを用いるＣＤ２８のブロッキングを含む。可溶性のリガンドを用いるＣＤ２８のブロッキングはＴ細胞の刺激／活性化と明らかに相互に排他的である。
【００１６】
本発明は、先行技術と関連する（１又は複数の）課題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３２８６７Ａ３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００７２７６６号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／０２６１３１７号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０１２６７８１号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Chen et al., 2003 J. Exp. Med. vol 198, pp1875-1886
【非特許文献２】Kretschmer et al., 2005 Nature Immunol. vol 6 p1219
【非特許文献３】Zheng et al., 2003 Immunity vol 19 p503
【非特許文献４】Battaglia et al., 2005 Blood vol 105 p4743
【非特許文献５】Arthritis Res 2002 vol 4 pp64-70
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
Ｆｏｘｐ３発現は、調節性Ｔ細胞の機能と関連している。一定の状況では、Ｆｏｘｐ３発現は、調節性Ｔ細胞の機能を誘発するのに必要であり、且つ十分であることが示された。実際に、Ｆｏｘｐ３発現は、ある環境では、Ｔ細胞の他の亜集団と比較した、調節性Ｔ細胞の指標又はそれを確認するものとして見なされてきた。先行技術では、Ｆｏｘｐ３発現を薬理学的に誘発する唯一知られている方法は、生理活性ペプチドＴＧＦβを用いてＴ細胞の集団を処理することによるものであった。
【００２０】
本発明者らは、驚いたことに、Ｆｏｘｐ３発現の誘発のための新たな技術を発見した。この新たな方法は、Ｆｏｘｐ３発現を誘発することが以前に示されていないＰＩ３−Ｋ阻害剤の使用を含む。
【００２１】
本発明者らの重大な発見は、標的細胞に対する処理のタイミングに関連するものである。具体的には、発明者らは、阻害剤（ＰＩ３Ｋ阻害剤など）が、細胞を刺激した後にのみ細胞に添加されなければならないといったことを見出した。したがって、阻害剤を細胞と接触させる前に、刺激／活性化ステップの後にインキュベーションしなければならない又は時間的な猶予を設けなければならない。活性化と同時の又は活性化の前の、阻害剤の添加はデノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。したがって、阻害剤は、刺激／活性化の後に添加されるべきであるといったことは本発明の重大な教示となる。これらの重要なタイミングは、下記に、より詳細に説明される。
【００２２】
一定のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲを阻害することが示されたが、Ｆｏｘｐ３発現を誘発するようにそれらが作用する証拠はない。そのうえ、ラパマイシン（ｍＴＯＲに作用する）は、ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞を選択的に増大させることができることが示されたが、そのような技術を使用するデノボＦｏｘｐ３発現のいかなる誘発の実証もなかった。したがって、ある種のＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｔ細胞中でのデノボＦｏｘｐ３発現の誘発及びＴｒｅｇの機能を直接もたらし得るといった、本発明者らによってなされた発見は、驚くべき、意義深い進歩である。
【００２３】
本発明は、これらの驚くべき発見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
したがって、第１の態様では、本発明は、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法を提供する。
【００２５】
他の態様では、本発明は、あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含み、前記阻害が、刺激の１０〜２２時間後に開始される方法に関する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、１又は複数の調節性Ｔ細胞を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップであって、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始されるステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法に関する。
【００２７】
適切には、前記阻害が、刺激の約１７〜１９時間後に開始される。
【００２８】
適切には、前記阻害が、刺激の約１８時間後に開始される。
【００２９】
適切には、シグナル伝達ステップを阻害するステップは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む。
【００３０】
適切には、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップは、前記細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する。
【００３１】
適切には、前記方法は、シグナル伝達を阻害する時間までに前記刺激を中止するステップをさらに含む。
【００３２】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法に関する。
【００３３】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＣＤ８−Ｔ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法に関する。
【００３４】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法に関する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を用いて処理するステップを含む方法を提供する。ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン（シロリムス）若しくはＲＡＤ００１（エベロリムス）等のその類似体、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＡＰ２３５７３、又はＰＩ１０３等の混合ｍ−ＴＯＲ／ｐ１１０アルファ阻害剤等の、あらゆる知られているｍ−ＴＯＲ阻害剤であってもよい。好ましくは、前記ｍ−ＴＯＲ阻害剤はラパマイシンである。
【００３６】
刺激は、本明細書に記載されるように、Ｔｒｅｇ産生に向けて、Ｔ細胞を、ＰＩ３Ｋ阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲ阻害剤の作用に感受性にする、あらゆる適した方法によるものであってもよい。好ましくは、Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体の刺激によるものである。いくつかの実施形態では、この刺激は、持続的な又は永続的な刺激であってもよく、これは、ＰＩ３Ｋ阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲ阻害剤の作用時に刺激が必ずしも中止されないことを意味する。好ましくは、刺激されたＴ細胞は、Ｔ細胞受容体を介して刺激されたＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体刺激の中止が後続する前記ＴＣＲ受容体の刺激によるものである。他の実施形態では、刺激は、ＣＤ３を介するものであってもよい。いずれの場合も、好ましくは、ＣＤ２８などのような同時刺激受容体もまた刺激される。好ましくは、ＣＤ２８は、ＴＣＲ受容体（１又は複数）又はＣＤ３受容体（１又は複数）の刺激と同時に刺激される。好ましい実施形態では、刺激は、好ましくはＴＣＲ及びＣＤ３を介する刺激の中止が後続する、ＴＣＲ及び／又はＣＤ３並びにＣＤ２８の同時の刺激を介するものである。刺激の中止は、シグナルの単純な除去を指してもよい又は阻害剤（１又は複数）の添加時の、ＣＤ３／ＣＤ２８の同時刺激のブロッキングなどのような、より積極的な方法を指してもよい。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態は、たとえば実施例の部に説明されるように、シグナル遮断ステップをさらに含んでいてもよい。
【００３８】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、（iii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介する及び／又はｍ−ＴＯＲを介する及び／又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。好ましくは、ステップ（ii）は、前記刺激を中止するステップを含む。
【００３９】
前記Ｔ細胞の刺激は、ＴＣＲ受容体の刺激を介する又はＣＤ３及びＣＤ２８などのような同時刺激受容体を介するものであってもよい。好ましくは、刺激は、Ｔ細胞受容体を介する前記刺激の中止が後続する、Ｔ細胞受容体を介するものである。
【００４０】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（ｉｖ）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法を提供する。好ましくは、ステップ（iii）は、前記刺激を中止するステップを含む。
【００４１】
好ましくは、前記Ｔ細胞を刺激するステップは、前記Ｔ細胞を、抗ＴＣＲ抗体又は抗ＣＤ３抗体と接触させるステップを含む。好ましくは、前記Ｔ細胞を刺激するステップは、前記Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体と接触させるステップ、好ましくは、前記Ｔ細胞を、抗ＴＣＲ抗体又は抗ＣＤ３抗体と、さらに抗ＣＤ２８抗体と同時に接触させるステップをさらに含む。そのような抗体の提示の形態は操作者が選択することができ、たとえば、これは、プレートに結合した抗体を使用して又は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体などのような抗体でコーティングしたビーズを使用することによって、又は操作者に知られている提示の他の方法によって達成することができる。
【００４２】
他の実施形態では、刺激は、特異的なペプチド抗原と接触させた抗原提示細胞などのような抗原提示細胞との、末梢Ｔ細胞などのような標的細胞の接触によるものであってもよい。これらの実施形態では、他の刺激形態を含む実施形態と同様、前記刺激は、永続的又は持続的であってもよく、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に刺激が中止されないことを意味し得る。他の実施形態では、刺激は、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に中止してもよく、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時の前に中止してもよく、適切には、刺激は、ｍ−ＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害時に中止してもよい。
【００４３】
他の態様では、本発明は、あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含む方法を提供する。
【００４４】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、Ｔ細胞を刺激するステップと、前記刺激を中止するステップと、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。好ましくは、前記方法は、Ｔ細胞受容体を介してＴ細胞を刺激することによって、Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発するステップと、Ｔ細胞受容体を介して前記刺激を中止するステップと、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップとを含む方法を提供する。
【００４５】
他の態様では、本発明は、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ及び／又はｍ−ＴＯＲ及び／又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む、上記に記載されるような方法を提供する。好ましくは、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップは前記細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含む。好ましくは、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する。
【００４６】
ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップが、ｍ−ＴＯＲを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む場合、好ましくは、ｍ−ＴＯＲを介するシグナル伝達を阻害するステップは、前記細胞をラパマイシンと接触させるステップを含む。
【００４７】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用を提供する。
【００４８】
他の態様では、本発明は、Ｆｏｘｐ３発現の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用を提供する。
【００４９】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用を提供する。
【００５０】
好ましくは、調節性Ｔ細胞の欠損症は自己免疫障害又は免疫病態である。好ましくは、前記欠損症は、関節リウマチ若しくは糖尿病、好ましくはＩ型糖尿病、大腸炎、又はＴｒｅｇ細胞の存在が好ましい予後を示すリンパ増殖性障害、好ましくはＢ細胞リンパ腫である。
【００５１】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤を提供する。
【００５２】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤を提供する。
【００５３】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのｍ−ＴＯＲ阻害剤を提供する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＡｋｔ阻害剤を提供する。
【００５５】
他の態様では、本発明は、ＴＣＲ刺激剤並びにＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤及び／又はｍ−ＴＯＲの阻害剤及び／又はＡｋｔの阻害剤を含むキットを提供する。
【００５６】
他の態様では、本発明は、前記ＴＣＲ刺激剤が抗ＴＣＲ又は抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８を含む、上記に記載されるようなキットを提供する。好ましくは、抗ＴＣＲ作用物質／抗ＣＤ３作用物質／抗ＣＤ２８作用物質は、それぞれ、ＴＣＲ／ＣＤ３／ＣＤ２８の抗体である。
【００５７】
他の態様では、本発明は、ラパマイシン等のｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、上記に記載されるようなキットを提供する。ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、本発明のキットのＴＣＲ刺激剤／ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用によって産生されたＦｏｘｐ３を発現するＴ細胞の増大に有利に使用することができる。そのうえ、ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、有利には、Ｆｏｘｐ３誘発の効率を増加させてもよい。
【００５８】
他の態様では、本発明は、Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、上記に記載されるようなキットを提供する。
【００５９】
最も好ましい実施形態では、阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤である。好ましくは、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤はＬＹ２９４００２を含み、好ましくは、前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩＫ−９０（アルファ／ｍ−ＴＯＲ）、ＰＩ−１０３（アルファ／ガンマ）、又はＹＭ−０２４（アルファ／デルタ）などのようなクラスＩＡ ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む。
【００６０】
好ましい態様
適切には、Ｆｏｘｐ３が誘発されることになる細胞（標的細胞）の出発集団は、先在するＴｒｅｇが除去される。適切には、細胞の出発集団は、ＣＤ２５＋細胞が除去される。細胞の集団が１％未満のＴｒｅｇを含む場合、本発明者らは、それを、Ｔｒｅｇが除去されたもの又は事実上Ｔｒｅｇがないものと見なす。適切には、細胞の出発集団はＴｒｅｇを含まない。適切には、本発明の方法は、そのような除去のさらなるステップを含み、適切には、そのようなステップは刺激の前に実行される。
【００６１】
適切には、Ｆｏｘｐ３が誘発されることになる細胞（標的細胞）の出発集団はナイーブＴ細胞で豊富である。適切には、出発集団は、ＣＤ６２Ｌ細胞で豊富であり且つ／又はＣＤ４５Ｒｂ細胞で豊富である。適切には、出発集団は、ＣＤ６２Ｌ細胞で豊富であり且つＣＤ４５Ｒｂ細胞で豊富である。適切には、本発明の方法は、そのような豊富化のさらなるステップを含み、適切には、そのようなステップは刺激の前に実行される。
【００６２】
細胞の活性化及び阻害が経時的に分離されるのは本発明の重要な特徴である。同時の活性化及び阻害は、デノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。適切には、活性化及び阻害は、本発明に従って同時に行われない。これは先行技術にあり、デノボＦｏｘｐ３発現をもたらさない。たとえば、本明細書の図１Ｃに関して、「０」時点は、先行技術の処理を示す−これは、刺激／活性化及び阻害剤の添加の間の０時間を表わす、つまり阻害剤は、活性化／刺激と同時に添加される。この処理は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発で無効であることが非常に明らかである。対照的に、刺激及び阻害の間に猶予又はインキュベーションを含む本発明による処理は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発にとって有効である。これは、なお存在する活性化剤と共に阻害剤を添加することができないことを意味しないが、活性化が阻害に先行しなければならないこと又は阻害が活性化の後に起こらなければならないことを意味する。分離の時間は非常に重要になり得、当技術分野に対する重大な寄与となる。活性化及び阻害の間の時間は、本明細書に教示されるように、特定の用途（複数可）のために具体的に選んでよい。例示的なタイミングは、阻害剤処理が、活性化の約１２〜１８時間後に、適切には、活性化の約１８時間の後に、適用される場合である。これは、下記により詳細に説明される。
【００６３】
適切には、本発明の方法は、細胞の増大を必要とすることなく、Ｆｏｘｐ３を誘発するために適用される。
【００６４】
望まれる特異性の細胞がＴｒｅｇに変換されるかもしれないといったことは本発明の利点となる。本明細書に説明される多くの利点を提供するのはこの能力である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＴＣＲシグナル遮断が、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤との相乗作用で、新たに活性化されたＴ細胞によるＦｏｘｐ３発現を誘発することを示す図である。ａ）ナイーブＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ Ｔ細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、ＴＣＲ抗体の存在下（ＴＣＲシグナル伝達の継続）又はＴＣＲ抗体の非存在下（ＴＣＲシグナル遮断）でさらに２日間培養した。Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、ａ）と同様、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、１８時間後に、示す条件に移した。Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現は２日後に、細胞内染色によって評価した。ＣＦＳＥプロファイルをＦｏｘｐ３−細胞及びＦｏｘｐ３＋細胞について示す。ｃ）Ｆｏｘｐ３誘発は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化の１８時間後に最も有効となる。
【図２】ＴＣＲシグナル伝達が、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でｍＴＯＲ活性をコントロールすることを示す図である。ａ）１時間若しくは１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて又は抗ＣＤ２８のみを用いて１時間（ＴＣＲシグナル伝達なし）ナイーブＬＮ Ｔ細胞を刺激した。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化は、細胞内染色及びフローサイトメトリーを使用して単一細胞レベルで決定した。ｂ）ナイーブＬＮ細胞をａ）と同様活性化した。１８時間後、ラパマイシン（２５ｎＭ）若しくはＬｙ２９４００２（１０μＭ）をさらなる１時間の間、添加し、又は細胞を、抗ＴＣＲの非存在下で示す時間の間、培養した。ｐＳ６レベルをａ）と同様決定した。
【図３】ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発は安定しており、調節性機能の獲得をもたらすことを示す図である。ａ）Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬｙ２９４００２によってナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で誘発され、ある期間にわたってモニターした。細胞は、ＩＬ−２の存在下で７日ごとに再刺激した。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を１８時間活性化し、さらに２日間、抗ＴＣＲを用いて（コントロール、＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）又は抗ＴＣＲを用いずにラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で（Ｆｏｘｐ３誘発、２８％ Ｆｏｘｐ３＋）培養した。段階的な数のＦｏｘｐ３誘発細胞又はコントロール細胞を、ＡＰＣ及び可溶性抗ＣＤ３の存在下で、新鮮で、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加し、細胞分裂に対する効果（ＣＦＳＥプロファイル）を４８時間後に記録した。
【図４】インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現を示す図である。ａ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、示されるように、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２のｉ．ｐ．と共に又はそれらを伴わずに、１８時間後に、同一遺伝子の免疫適格性宿主にｉ．ｖ．で移入した。内在性（ＣＦＳＥ−）ＣＤ４＋脾臓細胞及び移入した（ＣＦＳＥ＋、挿入図は、はるかに多くのイベントを示す）ＣＤ４＋脾臓細胞によるＦｏｘｐ３タンパク質の発現を２日後に細胞内染色によって評価した。ｂ）１８時間又は４８時間での１１回の移入実験の概要
【図５】Ｆｏｘｐ３誘発でのｐ１１０アイソザイムの特異な関与を示す図である。ナイーブＬＮ細胞を図１と同様活性化し、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を１８時間後に添加した。使用した濃度での各阻害剤のｐ１１０アイソフォーム特異性を示す（左パネル）。ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージ（本実験で１４％）を、ＰＩ３−Ｋ阻害剤の正味の効果（各散布図中の赤色のΔ値）を示すために減算した。細胞は、細胞分裂をモニターするために、活性化に先立ってＣＦＳＥを用いて標識化した（左パネル）。各阻害剤について、Ｓ６リボソームタンパク質リン酸化を、９０分後に細胞内染色によって決定した。ｐＳ６＋細胞のパーセンテージを示す（黒色、平均値±ＳＤ、ＴＧＸ−１１５のｎ＝１以外はｎ＝３〜５、右パネル）。Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージは、ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージを減算した後のものを示す（赤色、平均値±ＳＤ、ｎ＝４〜１２）。インビトロで決定したＩＣ５０値（Camps et al., 2005;Knight et al., 2006）を関係のある酵素について示す（右パネル）。
【図６】ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達の阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発はＴＧＦβとは無関係であることを示す図である。ａ）ナイーブＬＮ Ｔ細胞は、１８時間、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で活性化し、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）（９０分間、レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（９０分間、レーン２）、又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２（９０分間、レーン３若しくは８時間、レーン４）に細胞を曝露した後に、全細胞抽出物を、ＳＤＳゲル電気泳動及びウエスタンブロッティングにかけた。引き続いて、ブロットを、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）及び抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。ｂ）ａ）と同様活性化したナイーブＬＮ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ＴＧＦβ及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤をグラフの下に示されるように添加した。Ｆｏｘｐ３発現細胞のパーセンテージを２４〜４８時間後に決定した。培養物に、中和抗ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３μｇ／ｍｌ）又はＳｍａｄキナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ、２０μＭ）を追加した。ＴＣＲシグナルを取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３発現（９．２±５．６％、ｎ＝６）を減算した。コントロール培養物に正規化した、抗ＴＧＦβ（濃い灰色のバー）又はＳＢ４３１５４２（薄い灰色のバー）の存在下でのＦｏｘｐ３発現を示す（１００％、黒色のバー；ＴＧＦβ ２２．３±７．０％、ｎ＝９；ＰＩＫ９０ ３６．０±１２．９％、ｎ＝７；ＰＩ−１０３ ３５．１±３．８％、ｎ＝８；Ｌｙ２９４００２ ２１．５±４．０％、ｎ＝４、及びラパマイシン ２８．６±９．０％、ｎ＝４）。ＮＤ：実施せず。
【図７】ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤が、新たに活性化されたＴ細胞によるＦｏｘｐ３発現を誘発することを示す図である。ａ）ナイーブＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ Ｔ細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び可溶性抗ＣＤ２８を用いて刺激し、ＴＣＲ抗体を用いて（ＴＣＲシグナル伝達の継続）又はＴＣＲ抗体を用いずに（ＴＣＲシグナル遮断）さらに２日間培養した。Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡの発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。ｂ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＦＳＥを用いて標識化し、ａ）と同様、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、１８時間後に、示す条件に移した。Ｆｏｘｐ３タンパク質の発現は２日後に、細胞内染色によって評価した。細胞の回収率は、投入した細胞の６７〜１０８％であった。ＣＦＳＥプロファイルをＦｏｘｐ３−細胞及びＦｏｘｐ３＋細胞について示す。ｃ）ナイーブＬＮ ＣＤ４ Ｔ細胞は、示す時間の間、ａ）と同様活性化し、その後、細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２に曝露した。Ｆｏｘｐ３発現細胞のパーセンテージは２日後に決定した（２回の実験の平均値）。ｄ）Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬＹ２９４００２によってナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で誘発された。細胞は、ＩＬ−２の存在下で毎週再刺激し、Ｆｏｘｐ３発現をモニターした。自然Ｔｒｅｇ細胞を比較のために示す。ｅ）ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を１８時間活性化し、さらに２日間、抗ＴＣＲを用いて（コントロール、＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）又は抗ＴＣＲを用いずにラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で（Ｆｏｘｐ３誘発、２８％ Ｆｏｘｐ３＋）培養した。段階的な数のＦｏｘｐ３誘発細胞又はコントロール細胞を、ＡＰＣ及び可溶性抗ＣＤ３の存在下で、新鮮で、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加し、細胞分裂に対する効果を４８時間後に記録した（ＣＦＳＥプロファイル）。ｆ）ナイーブＣＤ４５ＲＢｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を、同一遺伝子の、Ｒａｇ欠損レシピエントに静脈内に移入し、新たにエクスビボに単離した、ＴＣＲ活性化の継続と共にコントロール条件下で活性化した、又はＴＣＲシグナルを取り除き、１８時間後にラパマイシン及びＬＹ２９４００２を用いて処理した。大腸炎スコアを８週後に決定した。ｇ）ＣＤ４単一陽性、ＣＤ２５陰性胸腺細胞を活性化し、ＴＣＲシグナルを中止し、ラパマイシン／ＬＹ２９４００２を１８時間後に添加し、Ｆｏｘｐ３発現をｂ）と同様２日後に分析した。
【図８】Ｆｏｘｐ３誘発でのｐ１１０アイソザイムの特異な関与を示す図である。ａ）ナイーブＬＮ細胞を図１と同様活性化し、ＰＩ３Ｋ阻害剤を１８時間後に添加した。使用した濃度での各阻害剤のｐ１１０アイソフォーム特異性を、Ｆｏｘｐ３＋細胞のパーセンテージと一緒に示す。ｂ）ｐＳ６＋細胞のパーセンテージは９０分間の時点で細胞内染色によって決定した（黒色、平均値±ＳＤ、ＴＧＸ−１１５のｎ＝１以外はｎ＝３〜５、右パネル）。ＴＣＲシグナル伝達を取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３＋細胞を超えるＦｏｘｐ３＋細胞の増加が示される（赤色、平均値±ＳＤ、ｎ＝４〜１２）。インビトロで決定したＩＣ５０値を関係のある酵素について示す。
【図９】ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達によるＦｏｘｐ３誘発はＴＧＦβとは無関係であることを示す図である。ａ）ナイーブＬＮ Ｔ細胞は、１８時間、無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で活性化し、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）（９０分間、レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（９０分間、レーン２）、又はＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＬｙ２９４００２（９０分間、レーン３若しくは８時間、レーン４）に細胞を曝露した後に、全細胞抽出物を、ＳＤＳゲル電気泳動及びイムノブロッティングにかけた。ブロットを、切り離し、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）及び抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。ｂ）ａ）と同様活性化したナイーブＬＮ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除き、ＴＧＦβ及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を示されるように添加した。培養物に、中和抗ＴＧＦβ（３μｇ／ｍｌ）又はＳｍａｄキナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２（２０μＭ）を追加した。２日後に決定し、且つ抗ＴＧＦβ及びＳＢ４３１５４２を用いないコントロール培養物に正規化した、抗ＴＧＦβ（濃い灰色のバー）又はＳＢ４３１５４２（薄い灰色のバー）の存在下でのＦｏｘｐ３発現を示す（黒色のバー；ＴＧＦβ ２２．３±７．０％、ｎ＝９；ＰＩＫ９０ ３６．０±１２．９％、ｎ＝７；ＰＩ−１０３ ３５．１±３．８％、ｎ＝８；ＬＹ２９４００２ ２１．５±４．０％、ｎ＝４、及びラパマイシン ２８．６±９．０％、ｎ＝４）。ＮＤ：実施せず。ＴＣＲシグナルを取り除いた培養物中のＦｏｘｐ３発現（９．２±５．６％、ｎ＝６）を減算した。
【図１０】新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中のＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔネットワークに対するＴＣＲシグナル伝達の影響を示す図である。ａ）１時間若しくは１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８を用いて又は抗ＣＤ２８のみを用いて１時間（ＴＣＲシグナル伝達なし））ナイーブＬＮ ＣＤ４ Ｔ細胞を刺激した。Ｓ６リン酸化は、細胞内染色及びフローサイトメトリーによって決定した。ｂ）ナイーブＬＮ細胞をａ）と同様活性化した。１８時間後、ラパマイシン（２５ｎＭ）若しくはＬｙ２９４００２（１０μＭ）をさらなる１時間の間、添加し、又は細胞を、抗ＴＣＲの非存在下で示す時間の間、培養した。ｐＳ６レベルをａ）と同様決定した。ｃ）イムノブロッティングにより、ｂ）の単一細胞レベルで検出した、ＴＣＲシグナル遮断及びラパマイシンに応じて減退するｐＳ６を確認した。ＴＧＦβもまたｐＳ６を低下させた。ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）は、Ｔ細胞活性化の１８時間後にではなく１時間後に目に見えたが、ＴＣＲシグナル遮断、ラパマイシン、及びＴＧＦβに応じて再び現われた。ｄ）ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の経路モデル。ＰＩ３ＫはＰＤＫ１を介してＡｋｔを活性化し、ＡｋｔはＴＳＣ１／２を阻害し、Ａｋｔは、ｍＴＯＲを活性化し、４ＥＢＰ／ｅＩＦ４Ｅを介して翻訳の阻害を軽減し、Ｓ６Ｋ１／ｅＩＦ４Ｅを介してリボソームの活性を刺激する。ｅ）ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸のネットワークモデルは、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２を区別する。ｍＴＯＲＣ１依存性のＳ６Ｋ１活性は、ＩＲＳ１を介してＰＩ３ＫによるｍＴＯＲＣ２の活性化をブロックする。Ａｋｔ活性は、ＰＤＫ１（Ｔ３０８）及びｍＴＯＲＣ２（Ｓ４７３）の両方に依存する（Jacinto et al., 2006;Sabatini, 2006）。ｆ）Ａｋｔｉ１／２によるＡｋｔの阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発する。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を活性化し、Ｆｏｘｐ３発現を図１と同様評価した。
【図１１】インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現を示す図である。ａ）ＴＣＲシグナル遮断を模倣するために、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を活性化し、次いで、腹腔内のラパマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＬＹ２９４００２（１５ｍｇ／ｋｇ）と共に又はそれらを伴わずに、同一遺伝子の、完全免疫適格性宿主に静脈内に移入した（レシピエント当たり２〜４×１０６細胞）。内在性ＣＤ４脾臓細胞（ＣＦＳＥ−）及び移入した（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４脾臓細胞によるＦｏｘｐ３発現を２日後にアッセイした。５．３±４．６％（ｎ＝１１）で、回収したＦｏｘｐ３＋細胞の度数は、もとの接種物（１．５±１．１％）のＦｏｘｐ３＋細胞の度数よりも３倍高かった。細胞移入に、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２のｉ．ｐ．を伴った場合、Ｆｏｘｐ３＋細胞の度数はさらに増加したが、内在性（ＣＦＳＥ−）Ｔ細胞中のＦｏｘｐ３発現は変化せず、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞ではなく通常の細胞に対する選択的な毒性を実証した。ｂ）１１回の移入実験の概要。Ｆｏｘｐ３発現細胞の増加が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞の選択的な回収又はＦｏｘｐ３誘発によるものであるかどうかを検討するために、発明者らは、ＴＣＲ遮断がもはや効率的ではなくなる時間である、活性化の４８時間後に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を移入し、インビトロでＦｏｘｐ３発現を誘発した（図１ｃを参照されたい）。これらの条件下で、１．３±０．５％のＣＦＳＥ＋細胞が移入後にＦｏｘｐ３を発現し（ｎ＝４）、１．６±０．３％のＣＦＳＥ＋細胞が、ラパマイシン及びＬＹ２９４００２の存在下で移入後にＦｏｘｐ３を発現した（ｎ＝３）。
【図１２】ＴＣＲリガンドの有用性が継続した状態でのＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発を示す図である。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｌ、４μｌ／１０６細胞）を用いて活性化した。示すＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を、ビーズを除去することなく、１８時間の時点で添加し（１μＭ）、Ｆｏｘｐ３発現を２日後に評価した。
【図１３】生理学的ＴＣＲリガンド及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３誘発を示す図である。Ｒａｇ１欠損Ｈ２ｂＴＣＲトランスジェニックマウス由来のＣＤ４ ＬＮ細胞を、ＣＦＳＥを用いて標識化し、示す濃度のハトシトクロムＣペプチド８１〜１０４を用いてあらかじめ負荷した、ＢＭに由来するＢ１０．ＢＲ（Ｈ２ｋ）抗原提示細胞と共に培養した。ＰＩＫ９０（１μＭ）を、抗原提示細胞又は抗原ペプチドを除去することなく、１８時間後に添加した。Ｆｏｘｐ３発現を２日後に分析した。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
多細胞生物の特殊化した細胞型は、遺伝子発現の特異的なパターンによって定義される。造血幹細胞からそれらの分化の間に、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、それらの発生的な潜在力のかなりの制限を受けるが、多くの選択肢、すなわち、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、またＴｒｅｇの余地がそれらに残されている。Ｔｈ系統の選出は、特異的な病原体に対する有効な免疫応答にとって重要であるが、エフェクター機能及び調節性機能の間のバランスは、過度の免疫病態及び自己免疫病を回避しながら免疫適格を保証するのに重大である。自然調節性Ｔ細胞は、特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現によって特徴づけられ、Ｆｏｘｐ３の持続的な発現は、調節性Ｔ細胞の機能にとって必要であり、且つ十分である。Ｔｒｅｇは、胸腺中で「自然に」発生し、ナイーブ末梢ＣＤ４ Ｔ細胞から発生し得る。発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３発現及び調節性Ｔ細胞の機能を誘発するシグナルを同定する。発明者らは、新たに活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルが取り除かれた場合にＦｏｘｐ３発現が誘発されることを開示する。この状況では、Ｆｏｘｐ３誘発は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の阻害剤によって選択的に強化され、Ｔｒｅｇ分化の古典的な誘発物質であるＴＧＦベータとは無関係であるように思われる。
【００６７】
特に、本発明は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくはＰＩ３Ｋ阻害剤の使用を提供し、これは、ＴＣＲシグナル遮断と相乗作用を示して、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３を誘発する。
【００６８】
ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化は、エフェクター細胞又は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）になるためのそれらの潜在力を明らかにする。エフェクターは免疫応答を媒介し、Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞のバランスを取り、ホメオスタシスを維持し、免疫病態を予防する。発明者らは、Ｔｒｅｇの特徴となる転写因子であるＦｏｘｐ３の安定した誘発のための新規な方法を記載するが、これは、新たに活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルが取り除かれ、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害剤、好ましくはＰＩ３Ｋの小分子阻害剤によって強化された場合に引き起こされる。クラスＩ ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットの選択的阻害は、Ｆｏｘｐ３の調節因子として、ｐ１１０ガンマ又はｐ１１０ベータではなく、ｐ１１０アルファ及びｐ１１０デルタを同定する。Ｆｏｘｐ３誘発は、外因性のＴＧＦベータとは無関係であり、中和ＴＧＦベータ抗体及びＳｍａｄシグナル伝達の薬理学的アンタゴニストに抵抗性である。これらの開示は、新たなアプローチが調節性Ｔ細胞分化を操作することを可能にする。
【００６９】
デノボＦｏｘｐ３発現が誘発されるといったことが本発明の利点であることに注目されたい。これは、現在までに示された最高の効果が、既にＦｏｘｐ３を発現しているＴ細胞の増大であった先行技術での状態と対比される。目下Ｆｏｘｐ３を発現していない細胞中でＦｏｘｐ３発現を活発に誘発する可能性は、本発明の意義深い利点である。
【００７０】
本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の小分子阻害剤が、Ｔｒｅｇ細胞系統の特徴となる転写因子であるＦｏｘｐ３のデノボ発現を速やかに且つ効率的に誘発することを示す。これは、新たな治療上のアプローチが、自己免疫性疾患の予防及び治療などのような、Ｔｒｅｇ細胞のデノボ産生が望ましい臨床状況に適用されることを可能にする。関節リウマチ及びＩ型糖尿病などのようなこれらの疾患の多くは、非常に臨床的に重要である。したがって、本発明の産業上の用途及び有用性はこれらの意義深い医療への用途から生じる。
【００７１】
ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）
ＰＩ３−Ｋのファミリーは、多数の異なる個々のアイソザイムを有する酵素のファミリーである。広範囲の態様では、本発明は、Ｆｏｘｐ３発現の誘発での、ＰＩ３−Ｋ阻害剤、好ましくはクラスＩ ＰＩ３Ｋ阻害剤の使用に関する。しかしながら、クラスＩＢ ＰＩ３Ｋガンマの阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発しないということ及びＰＩ３−Ｋγは調節性Ｔ細胞を介して作用しないということが発明者自身らのデータから明らかである。この観察は、ＰＩ３−Ｋγが調整性の効果を有し得るといったことを述べる、先行技術の教示と対照的である。しかしながら、本明細書に開示されるように、事実上、ＰＩ３−Ｋγは、調節性Ｔ細胞中での作用によるその効果を発揮しておらず、したがって、ＰＩ３−Ｋγの阻害又は阻害剤は本発明から明確に放棄される。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及は、ＰＩ３−Ｋベータに対して特異的ではないクラスＩＡ ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及として解釈されるべきである。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤への言及は、ＰＩ３−Ｋγ活性を阻害するように作用するあらゆる化合物を指さないように解釈されるべきである。
【００７２】
化合物がＰＩ３−Ｋγ活性などのような特定のＰＩ３Ｋ活性を阻害するように作用するかどうかは容易に決定されるかもしれない。たとえば、ＰＩ３−Ｋγの阻害を決定してもよい１つの方法は実施例で説明される。さらに、本明細書又は先行技術に記載される方法によって試験することによって、化合物が、ＰＩ３−Ｋγ特異的阻害剤又はＰＩ３−Ｋγ選択的阻害剤などのようなＰＩ３Ｋアイソフォーム特異的阻害剤又はＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤かどうかを決定してもよい。標準的な試験では、キナーゼを生成し、異なる濃度の阻害剤及び試験しているキナーゼによってリン酸化することができる適した試験基質を用いる滴定実験で、阻害剤を用いてインビトロでキナーゼを試験する。そのうえ、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、典型的に、メーカー／サプライヤーによって又は所望の化合物と関係がある文献中でそれらの特異性に関して特徴づけられる。
【００７３】
ＰＩ３−Ｋへの言及は、ＰＩ３−Ｋのファミリー、好ましくは、クラスＩ ＰＩ３Ｋのファミリー、好ましくは、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋのファミリー、好ましくは、ガンマを除く、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋのファミリー、最も好ましくは、ＰＩ３−Ｋα、ＰＩ３−Ｋβ、ＰＩ３−Ｋδからなる群から選択されるクラスＩＡ ＰＩ３−Ｋに関するものとして解釈されるべきである。
【００７４】
ＰＩ３−Ｋβが、Ｆｏｘｐ３誘発で、限られた役割を有する又は役割を有していないことが本明細書でさらに開示される。したがって、好ましくは、ＰＩ３−ＫはＰＩ３−Ｋβではなく、好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋβに対して特異的ではない又は選択的ではない。
【００７５】
具体的には、発明者らは、ＰＩ３−Ｋα又はＰＩ３−Ｋδの阻害が特に有利であることを示す。したがって、好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋαに対して特異的な又は選択的な阻害剤である。他の好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋδに対して選択的な又は特異的な阻害剤である。
【００７６】
標的細胞
Ｆｏｘｐ３発現を生成することが望まれる標的細胞は任意の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、造血性の細胞であり、好ましくは、細胞は、Ｔ細胞系統の細胞であり、好ましくは、細胞は、胸腺細胞又はリンパ球であり、好ましくは、細胞は、成熟Ｔ細胞の亜集団を含む、末梢リンパ球（たとえば末梢血リンパ球）などのような、リンパ球の集団である。好ましくは、標的細胞は、Ｔ細胞、好ましくは成熟ナイーブＴ細胞である。細胞が胸腺細胞である場合、好ましくは、使用される技術は、末梢Ｔ細胞と同じ技術である。
【００７７】
好ましくは、標的細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞ではない。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化及びＰＩ３Ｋ阻害の後にＦｏｘｐ３を発現しない。適切には、標的細胞（複数可）はＣＤ８＋Ｔ細胞を含まない。適切には、標的細胞（複数可）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が除去されている又は本質的にＣＤ８＋Ｔ細胞がない。適切には、標的細胞はナイーブＴ細胞である。
【００７８】
好ましくは、標的細胞は、トランスジェニック細胞ではない。トランスジェニック細胞は遺伝的に不安定となり得る。トランスジェニック細胞は、対象へのそれらの再導入を企図する場合、調節性の課題となりやすい。好ましくは、標的細胞は、所望の対象からあらかじめ収集された自然発生の細胞である。
【００７９】
処理される細胞が標的細胞の亜集団（Ｔ細胞）を含むのみである場合、たとえば、処理が末梢リンパ球に対して行われる場合、明らかに、用語「標的細胞」は、処理されている細胞の全集団の中のＴ細胞を指すと適宜解釈されなければならない。言いかえれば、本発明を実施する際に、事実上、それらの細胞の亜集団のみが標的細胞である場合、Ｆｏｘｐ３発現を誘発するように細胞の集団を処理することが望ましいかもしれない。たとえば、末梢リンパ球の集団はＢ細胞、Ｔ細胞、及び他の細胞を含んでいてもよい。便宜上、末梢リンパ球の全集団を処理してもよいが、もちろん、それらの一部分のみ（つまりＴ細胞）が事実上、標的細胞となることが熟練の読者によって十分に理解されるであろう。目的は典型的にＴｒｅｇを産生することであるので、標的細胞は非Ｔｒｅｇ細胞となるであろう。好ましくは、標的細胞は、本発明の処理（１又は複数）の前にＦｏｘｐ３を発現しないＴ細胞である。
【００８０】
調節性Ｔ細胞を産生する方法
広範囲の態様では、本発明は、１又は複数のＴ細胞の集団を採取し、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いてそれらを処理し、調節性Ｔ細胞を得ることに関する。
【００８１】
もう少し詳細には、好ましくは、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ，T cell receptor）又はシグナル伝達タンパク質のＴＣＲ関連ＣＤ３複合体を介して刺激される。実際に、ＴＣＲシグナルは、その関連タンパク質を介して事実上伝達される。したがって、ＴＣＲを介して刺激するために、実在するＴＣＲ自体を標的とすること（たとえば抗原特異的ＴＣＲターゲティング）又はＣＤ３（たとえばＴＣＲ関連タンパク質（１又は複数））が可能である。次いで、この刺激は好ましくは中止される。この刺激の中止に続いて、細胞は、ＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いて処理される。ＰＩ３−Ｋ阻害剤とのインキュベーションに続いて、調節性Ｔ細胞が得られる。具体的には、ＰＩ３−Ｋ阻害剤の処理はＦｏｘｐ３発現を誘発し、これは、調節性Ｔ細胞になる運命又は調節性Ｔ細胞への分化をもたらす。
【００８２】
この効果をもたらすための例証となる方法は実施例で提供される。
【００８３】
ＴＣＲ刺激に関するタイミングは、効果を改善するために有利に操作することができる。好ましくは、Ｔ細胞は、それらがＰＩ３−Ｋ阻害剤を用いて処理される場合、少し前に活性化されている。活性化は、Ｔ細胞受容体を介する刺激を指す。「少し前の」によって、直前の２日以内の刺激又は活性化が意味される。
【００８４】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理が活性化の４８時間以内に適用される場合、最高の結果が得られる。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の３〜４７時間以内に、好ましくは、刺激の４７時間以内に、好ましくは、刺激の３０時間以内に、好ましくは、刺激から約１８時間で、好ましくは、刺激から１８時間で提供される。好ましくは、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の少なくとも３時間後に、好ましくは、刺激の少なくとも４時間後に、好ましくは、刺激の９時間を超える時間の後に、好ましくは、刺激の少なくとも１０時間後に、好ましくは、刺激の約１８時間後に、好ましくは 刺激の１８時間後に提供される。これらのタイミングの技術的な利益はＦｏｘｐ３誘発の最適化及び／又は最大化である。
【００８５】
好ましくは、刺激からの時間は、Ｔ細胞受容体を介するシグナル伝達の中止からの時間である。
【００８６】
好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激から３〜４７時間の範囲で、好ましくは、刺激から４〜４７時間の範囲で、好ましくは、刺激から４〜３０時間の範囲で、好ましくは、刺激から１０〜３０時間の範囲で、好ましくは、刺激から１２〜２５時間の範囲で、好ましくは、刺激から１５〜２５時間の範囲で、好ましくは、刺激から１７〜１９時間の範囲で、好ましくは、刺激から約１８時間で、好ましくは、刺激から１８時間で提供される。これらのタイミングの技術的な利益はＦｏｘｐ３誘発の最適化及び／又は最大化である。
【００８７】
最も好ましい実施形態では、ＰＩ３−Ｋ阻害剤処理などのような阻害剤処理は、刺激の１０〜２２時間後の時間に、好ましくは、刺激の１２〜２０時間後の時間に、好ましくは、刺激の１２〜１８時間後の時間に、好ましくは、刺激の１７〜１９時間後の時間に、好ましくは、刺激の約１８時間後に、好ましくは、刺激の１８時間後に提供される。これは、優れたＦｏｘｐ３誘発という利点を有する。実際に、これらのタイミングの技術的な利益は、実施例の部で、たとえば図１Ｃに関して示される。
【００８８】
調節性Ｔ細胞
調節性Ｔ細胞（時にＴｒｅｇと呼ばれる）は健常な免疫系の重要な構成要素である。調節性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞を抑えること及び自己免疫性疾患の主要な要因となり得る「自己認識」の予防に関与する。
【００８９】
調節性Ｔ細胞は、当技術分野で知られている、多数の承認されているバイオマーカーを有する。これらは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、及びＦｏｘｐ３＋を含む。特に、本発明によれば、調節性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３発現（Ｆｏｘｐ３＋）を示さなければならない。
【００９０】
調節性Ｔ細胞は、好ましくは、調節性機能を示さなければならない。調節性機能の表示は、当技術分野で知られている任意の適した方法によって決定してもよい。特に、そのような試験の例は、実施例の部で説明される。具体的には、図３に例示される試験は、調節性Ｔ細胞の機能についての標準的なインビトロ試験として見なされる。
【００９１】
インビボで、調節性Ｔ細胞は、それらの生存及び／又はそれらの調節性機能の維持のために、ＩＬ−２、ＴＧＦベータ、又はＩＬ−９（肥満細胞に由来するＩＬ−９など）などのような付加的な因子を必要とすると広く考えられている。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、前記リンホカインとそれらのＴ細胞を接触させることに加えた、Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発に関し、前記リンホカインと接触させることは、肥満細胞などのような、前記リンホカインを生成する細胞と接触させることによって達成し得る。本実施形態では、前記リンホカインを生成する細胞（たとえば肥満細胞）は、処理されている対象中にインビボで提供することができる。ＰＩ３ＫＰ１１０δノックアウト動物は、肥満細胞依存性の応答を有しておらず、Ｔｒｅｇ機能の低下を示すことに注目されたい。
【００９２】
ＰＩ３Ｋ／ｍ−ＴＯＲ／Ａｋｔ阻害剤
本発明のＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ、好ましくはクラスＩ ＰＩ３Ｋ、好ましくはクラスＩＡ ＰＩ３Ｋを阻害することができる任意の１つ又は複数の化合物であってもよい。特に、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、生体高分子であってもよく又は小有機化合物若しくは小無機化合物であってもよい。好ましくは、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、小有機化合物、好ましくは合成化合物である。
【００９３】
いくつかの小分子ＰＩ３Ｋ阻害剤は臨床上の使用のための評価の下にあり、これらは本発明の好ましい阻害剤である。ＰＩ３Ｋのいくつかの小分子阻害剤は臨床上の使用のために承認されており、これらは本発明のより好ましい阻害剤である。
【００９４】
もちろん、いくつかのＰＩ３−Ｋ阻害剤は１つを超えるアイソザイムに作用してもよい。ＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｆｏｘｐ３発現の誘発を直接引き起こさないと発明者らが開示する、ＰＩ３−Ｋサブタイプの１つに作用する場合、これは、そのＰＩ３−Ｋ阻害剤を本発明から除外するものではない。本明細書で使用されるようなＰＩ３−Ｋ阻害剤の重要な特徴は、そのＰＩ３−Ｋ阻害剤が、Ｆｏｘｐ３発現の誘発にとって重要であるとして開示されるＰＩ３−Ｋアイソザイムの１つを阻害するように作用することである。したがって、本発明によるＰＩ３−Ｋ阻害剤は、好ましくは、ＰＩ３−Ｋα及び／又はＰＩ３−Ｋδの作用を阻害する活性を示さなければならない。そのような阻害剤がまた、ＰＩ３−Ｋβ又はＰＩ３−Ｋγなどのような異なるＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する副次的な効果をも有する場合、そのような阻害剤は、本発明から除外されるものと見なされるべきでない。しかしながら、明らかに、投与を単純化し、且つ不要な多面効果又は副作用を回避するために、可能な限り特異的な効果を有するＰＩ３−Ｋ阻害剤を選ぶことが好ましい。したがって、好ましくは、本発明のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、所与のＰＩ３−Ｋアイソザイムに対して特異的である。好ましくは、本発明のＰＩ３−Ｋ阻害剤は、ＰＩ３−Ｋα及び／又はＰＩ３−Ｋδに対して特異的である。好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋαに対して特異的である。好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋδに対して特異的である。ＰＩ３−Ｋα及びＰＩ３−Ｋδの両方の活性を低下させる阻害剤は特に好ましく、最も好ましいのは、ＰＩ３−Ｋα及びＰＩ３−Ｋδの活性を低下させるが、ＰＩ３−Ｋγ及び／又はＰＩ３−Ｋβなどのような他のアイソザイムの活性を低下させない阻害剤である。
【００９５】
これらの阻害剤は、Ｆｏｘｐ３の調節で有力に活性であるので、最も好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋアルファ又はＰＩ３−Ｋデルタに対して特異的であり、好ましくは、阻害剤は、ＰＩ３−Ｋアルファ及びＰＩ３−Ｋデルタに対して特異的である。
【００９６】
最も好ましいのは、臨床上の使用のために承認され、且つＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害するＰＩ３Ｋ阻害剤である。さらに好ましいのは、ＰＩ３−Ｋγ及び／又はＰＩ３−Ｋβなどのような他のアイソザイムの活性をも低下をさせないような阻害剤である。
【００９７】
先行技術で使用されてきたような、生物学的な供給源から精製された生理活性ペプチド（たとえばＴＧＦベータ）とは対照的に、ＰＩ３Ｋの小分子阻害剤は、合成的に生成することができ、且つ優れた薬理学的特性を有する（インスリン及び経口糖尿病薬の間の違いと似ている）。個々のＰＩ３Ｋアイソザイムに対する選択性を有する化合物などのような合成ＰＩ３Ｋ阻害剤化合物の使用は、生理活性ペプチドの副作用を最小限にする又は排除することができるといった技術的な利点を提供する。
【００９８】
新世代のＰＩ３−Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられており、幅広い範囲の他のキナーゼよりも優先的に、ＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する選択性を有することが示された（Knight et al., 2006 Cell vol 125 pp733-747）。選択的なクラスＩＡ ＰＩ３Ｋ阻害剤は本発明の好ましい阻害剤である。好ましい阻害剤は、実施例の部で示され、最も好ましいのは、実施例の部のアルファＰＩ３Ｋ阻害剤及びデルタＰＩ３Ｋ阻害剤である。
【００９９】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、及びＰＩＫ−９０などのような合成化合物を含む。好ましいｍ−ＴＯＲ阻害剤は、上記及び実施例の部に開示される。最も好ましいのはラパマイシンである。
【０１００】
プロテインキナーゼＢ又はＡｋｔ（ＰＫＢ／Ａｋｔ−便宜上、これを単に「Ａｋｔ」と本明細書で呼ぶ）は、セリン／トレオニンキナーゼであり、これは、哺乳動物では、ＰＫＢアルファ（Ａｋｔ１）、ＰＫＢベータ（Ａｋｔ２）、及びＰＫＢガンマ（Ａｋｔ３）として知られている３つの高度に相同的なメンバーを含む。Ａｋｔ阻害剤は、アロステリック阻害剤Ａｋｔｉ−１／２を含む。
【０１０１】
ラパマイシン
ｍ−ＴＯＲシグナル伝達の阻害（つまりラパマイシン処理）は、先行技術で、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの増大に寄与することが示されたが、ラパマイシンによるＦｏｘｐ３の誘発の教示はない。その発明者らは、当技術分野の、ｍ−ＴＯＲ阻害及びＦｏｘｐ３誘発の間のあらゆる関連に気づいていない。実際に、本発明者らは、生物学的に関係のある飢餓／栄養源の除去を使用して、この分野を調査し、ｍ−ＴＯＲ活性の低下を誘発した。これらのシグナルは、ｍ−ＴＯＲ活性の低下の実証としてｐＳ６を消失させることが示されたが、Ｆｏｘｐ３の誘発をもたらさない。その系の、この簡潔にして要を得た精査は、本発明の方法が、Ｆｏｘｐ３の誘発への新たなアプローチを提供することを示し、ｍ−ＴＯＲシグナル伝達を介して作用して、Ｆｏｘｐ３＋細胞の増大をもたらす先行技術のアプローチは、事実上、Ｆｏｘｐ３のデノボ発現及びＴｒｅｇの分化を誘発しないことをさらに示す。
【０１０２】
ラパマイシンはＰＩ３Ｋ阻害剤ではない。たとえば、「試験したどのプロテインキナーゼも、細胞ベースのアッセイで、ｍＴｏｒを阻害するのに必要とされる濃度よりも１０〜２０倍高い濃度である１マイクロＭのラパマイシンによって有意に阻害されなかった（Ｂｉｏｃｈ． Ｊ． ３５１：９５−１０５， ２０００）」ことが当技術分野で実証されており、これは、阻害剤の特異性についての標準的な作業である。
【０１０３】
組合せ
Ｆｏｘｐ３発現が本発明によって誘発されると、本明細書で教示される方法を、それらの細胞の増大を促進する方法と組み合わせることは有利であるかもしれない。したがって、好ましい実施形態では、好ましくは、Ｆｏｘｐ３発現が誘発された調節性Ｔ細胞は続いて増大させられる。好ましくは、これは、ラパマイシン処理によって達成される。特に、これは、Battaglia et al 2005 Blood Volume 105 page 4743と同様達成することができる。
【０１０４】
さらなる用途
本発明は、自己免疫性疾患の予防及び／又は治療などのような、Ｔｒｅｇ細胞のデノボ産生が望ましい臨床状況での広範囲の用途を見出す。
【０１０５】
ｍ−ＴＯＲ阻害は、インビトロの調節性機能の維持にとって重要であるかもしれない。
【０１０６】
本発明は、特異的な抗原に対する調節性Ｔ細胞の誘発での用途を見出す。本実施形態では、抗原は最初に選択され、次いで、Ｆｏｘｐ３誘発は、その特異的な抗原に応答することができるＴ細胞中で起こる。
【０１０７】
調節性Ｔ細胞は免疫系をコントロールする。特に、それらは、Ｔエフェクター細胞を抑える。調節性Ｔ細胞の欠損症は、関節リウマチなどのような自己免疫疾患と関連する。したがって、調節性Ｔ細胞を作製することによって、典型的に、本明細書に開示されるようにＦｏｘｐ３発現を誘発することによって、そのような免疫損傷を妨げる、予防する、又は低下させることができる。
【０１０８】
本発明は、有利には、インビトロでの調節性Ｔ細胞の産生に適用することができる。先行技術では、これは、ＴＧＦβを用いる処理によって達成された。本発明は、この方法に対する好都合な代替物を提供する。そのうえ、本発明は、生理活性ＴＧＦβペプチドへの曝露を回避する利点を提供する。
【０１０９】
特に、本発明は、調節性Ｔ細胞のエクスビボ産生での用途を見出す。本実施形態では、Ｔ細胞の集団は患者から採取される。次いで、これらは、調節性Ｔ細胞を誘発するために、本発明の方法に従って処理される。次いで、これらの調節性Ｔ細胞は、治療効果を提供するためにその患者に再導入することができる。
【０１１０】
本発明は、免疫抑制での用途を見出す。特に、免疫抑制は、臓器移植又は移植片対宿主病に続いて適用することができる。
【０１１１】
本発明はまた、一般に自己免疫性疾患での用途をも見出す。特に、本発明は、胃炎、甲状腺炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症、又は他の自己免疫性疾患などのような自己免疫性疾患での用途を見出す。
【０１１２】
そのうえ、本発明は、同種移植片拒絶反応及び関節リウマチ又はコラーゲン誘発性の関節炎などのような関節炎の例の抑制での用途を見出す。さらに、本発明は、本明細書に説明されるように、ある種の癌、具体的には、それら自体、Ｂ細胞悪性腫瘍（たとえば白血病、リンパ腫など）などのようなリンパ球からなるそれらの癌を撲滅する際の用途を見出す。
【０１１３】
他の実施形態では、好ましくは、本発明の方法はインビトロでのものである。好ましくは、本発明の方法は、ヒト又は動物の体を含まない。
【０１１４】
適切には、Ｆｏｘｐ３発現の誘発への言及は、デノボＦｏｘｐ３発現の誘発を意味することが理解されるべきである。適切には、既存のＦｏｘｐ３発現の増強又は既にＦｏｘｐ３を発現する細胞の増大は、本発明の一部ではない。適切には、本発明は、本発明の処理／方法の前にＦｏｘｐ３を発現していなかった細胞（複数可）中でのＦｏｘｐ３発現の生成に関する。理論によって拘束されることなく、Ｆｏｘｐ３の発現は、適切な標的細胞からのＴｒｅｇ産生にとって必要であり且つ十分である。したがって、細胞のインキュベーションは、本発明に従ってデノボでのＦｏｘｐ３発現を引き起こし、Ｔｒｅｇ産生をもたらす。
【０１１５】
本発明のある態様は、以下の番号が付けられた項に関して理解され得る。
【０１１６】
１．調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＴ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法。
【０１１７】
２．調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０１１８】
３．調節性Ｔ細胞（複数可）を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと、
（ｖ）上述の対象に上述のＴ細胞を再導入するステップと
を含む方法。
【０１１９】
４．あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含む方法。
【０１２０】
５．Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iii）ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する上述のＴ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップと
を含む方法。
【０１２１】
６．上述のＴ細胞を刺激するステップが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して上述のＴ細胞を刺激するステップを含む、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
７．ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップが、上述の細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する項１〜６のいずれかに記載の方法。
【０１２３】
８．調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発でのＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【０１２４】
９．Ｆｏｘｐ３発現の誘発でのＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、上述の阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【０１２５】
１０．調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用。
【０１２６】
１１．調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤。
【０１２７】
１２．調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤。
【０１２８】
１３．（ｉ）ＴＣＲ刺激剤と、
（ii）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤と
を含むキット。
【０１２９】
１４．上述のＴＣＲ刺激剤が抗ＴＣＲ抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、前記１３に記載のキット。
【０１３０】
１５．ｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、前記１３又は１４に記載のキット。
【０１３１】
１６．上述のｍ−ＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、前記１５に記載のキット。
【０１３２】
１７．Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、前記１３〜１６のいずれかに記載のキット。
【０１３３】
１８．上述のＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２を含む、前記１〜７のいずれかに記載の方法、前記８〜１０のいずれかに記載の使用、及び前記１１若しくは項１２に記載の阻害剤又は前記１３〜１７のいずれかに記載のキット。
【０１３４】
本発明を実施例によってこれから記載する。これらの実施例は、例証となるように意図され、添付された請求項を限定するようには意図されない。
［実施例］
【０１３５】
材料及び方法
マウス系統、細胞選別、及び培養。動物についての作業はＡｎｉｍａｌｓ （Scientific Procedures） Ａｃｔ、ＵＫに従って実行した。リンパ節（ＬＮ）細胞は、染色し、分析し、記載されるようにフローサイトメトリーによって選別した（Cobb et al 2005 J. Exp. Med. 201: 1367-1373）。Ｆｏｘｐ３タンパク質についての細胞内染色は、メーカーによって助言されるように行った（eBiosciences．Com）。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化ステータスは、eBioscience社製Ｆｏｘｐ３染色キット及び抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はＩｇＧ−Ｃｙ５（Jackson ImmunoResearch）を使用して、抗ｐＳ６ Ｓｅｒ２３５／２３６（Cellsignaling cat.no.2211、http://www.cellsignal.com）を使用して決定した。Ｆｏｘｐ３発現の誘発について、選別したＬＮ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＴＣＲβ（Ｈ５７、Pharmingen、２００ｎｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ、Pharmingen）と共に１〜３×１０６／ｍｌで培養した。１８時間後、細胞は、ＴＣＲ刺激の継続のために所定の位置に放置したか示す添加剤と共に、コーティングされていないウェルに移動させた。
【０１３６】
調節性機能を評価するために、示すように培養したＣＤ４ Ｔ細胞を、１×１０５ＣＦＳＥ標識化全ＬＮ細胞又は５×１０４ＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれか及び１×１０５マイトマイシンＣ処理（２５μｇ／ｍｌ、２０分間、３７℃）Ｔ細胞除去脾細胞を含む丸底ウェル中に、示す濃度の抗ＣＤ３（２Ｃ１１、Pharmingen）と共に滴定した。ＣＤ４ Ｔ細胞ＣＦＳＥプロファイルは４８〜７２時間後に記録した。
【０１３７】
養子移入実験。インビボで、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害の影響を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ ＬＮ Ｔ細胞をＣＦＳＥを用いて標識化し、上記のように１８時間活性化し、未治療の同一遺伝子のレシピエント（レシピエント当たり２〜４×１０６細胞）の中にｉ．ｖ．で移入した。ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は示すようにｉ．ｐ．で与えた。脾細胞は、４８時間後に、ＣＤ４及びＦｏｘｐ３について染色した。Ｆｏｘｐ３発現は、内在性（ＣＦＳＥ−）ＣＤ４＋細胞及び移入した（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４＋細胞について決定した。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット。全ＲＮＡは、ＲＮＡｂｅｅ（Tel−Test、Friendswood、ＴＸ）を使用して単離し、逆転写した。リアルタイムＰＣＲ分析は、（Cobb et al 2005 同書）に記載されるように、Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）ＤＮＡエンジンで実行し（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．；７２℃でのプレートリードと共に、１５分間９５℃、その後、１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び３０秒間７２℃の４０サイクル）、Ｙｗｈａｚ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）及びユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｌ３（Ube2L3,ubiquitin conjugating enzyme E2L3）の相乗平均に正規化した。プライマー配列 （５’〜３’）
Ｙｗｈａｚフォワード：ＣＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴ
Ｙｗｈａｚリバース：ＴＣＴＧＧＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧ
Ｕｂｃフォワード：ＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡ
Ｕｂｃリバース：ＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡ
Ｆｏｘｐ３フォワード：ＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧ
Ｆｏｘｐ３リバース：ＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴ
【実施例１】
【０１３９】
ＴＣＲシグナルの中止は、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を誘発する。
ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ（Ｈ５７）及び抗ＣＤ２８を用いて刺激し、次いで、ＴＣＲ抗体でコーティングされていないプレートに（それらのもとの培地中に）移した。４８時間後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、継続的なＴＣＲシグナル伝達に曝露されたコントロールと比較して、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞中でＦｏｘｐ３ ＲＮＡのレベルが上昇したことを示した（図１ａ）。細胞内染色は、ＴＣＲシグナルを取り除いた、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞のかなりの画分でのＦｏｘｐ３タンパク質の発現を示した（１０．８±７．６％ ｎ＝３０）（図１ｂ）が、ＴＣＲ抗体と接触させたままの細胞中では発現を示さなかった（１．０±０．８％ ｎ＝２１）。
【実施例２】
【０１４０】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ経路の阻害は、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を促進する。
Ｆｏｘｐ３の誘発に関係のあるシグナル伝達経路を同定するために、発明者らは、シグナル伝達経路の活性化剤及び阻害剤をスクリーニングした。これらは、ＮＦＡＴの核移行をブロックする、カルシニューリンの阻害剤（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ及びＦＫ−５０６）、関係のあるマイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ，mitogen activated kinase、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ／ｐ３８及び上流キナーゼを含む）の活性化剤及び阻害剤、ＰＫＣアイソザイム、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３，glycogen synthase kinase-3）、低酸素誘発因子（ＨＩＦ−１，hypoxia inducible factor）、Ｎｏｔｃｈ（γ−セクレターゼ阻害剤 Ｌ−６８５４５８を使用）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ，bone morphogenetic protein、ＴＧＦβの類縁体である）の広範囲の阻害剤並びに偽基質を含んだ。これらのうちのどれも、ＴＣＲシグナル遮断によって引き起こされるＦｏｘｐ３の発現を検出可能に増強しなかった。対照的に、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの阻害剤はＦｏｘｐ３誘発を著しく強化した。免疫抑制性マクロライド抗生物質であるラパマイシンは２４〜４８時間内に細胞の２６．８±１４．４％でＦｏｘｐ３の発現を誘発した（ｎ＝３０、図１ｂ）。同様に、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬｙ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎはＦｏｘｐ３を誘発した（Ｌｙ２９４００２については２６．９±１１．４％、ｎ＝２５、図１ｂ及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎについては１７．３±５．３％、ｎ＝３）。コントロール化合物Ｌｙ３０３５１１（２−ピペラジニル−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）はＬｙ２９４００２に構造上、非常に類似しているが、モルホリン環中の単一の原子の置換のためにＰＩ３−Ｋを阻害しない。Ｌｙ３０３５１１は、発明者らの系でのＦｏｘｐ３発現に影響を与えなかった（６．６±３．０％、ｎ＝７）。細胞分裂が起こる前の、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化の１８時間後にＴＣＲシグナル遮断と組み合わせて使用した場合に、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は最大に有効となった（下記参照）。ＴＣＲシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤がＦｏｘｐ３を誘発するために必要とされ、同時刺激は、Ｆｏｘｐ３誘発の効率を著しく増強した（ＴＣＲシグナル中止については３％から９％、ＴＧＦβについては７％から４６％、ラパマイシンについては１０％から２５％、及びＬｙ２９４００２については４％から４４％、２回の実験の平均。ポジティブコントロールとして、ＴＧＦβは、継続的なＴＣＲシグナル伝達を取り除いた細胞の４６．０±１５．１％でＦｏｘｐ３を誘発した（ｎ＝３０、図１ｂ）。Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数の増加が先在するＦｏｘｐ３＋細胞の選択的な増大によるものかどうかを検討するために、発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化に先立って、ＣＦＳＥを用いてそれらを標識化した。細胞分裂は、活性化後の１８時間までに起こらなかった、その時点で、細胞を示す培養条件に置いた（図１ｂ）。２４時間後に、投入細胞の６７〜１０８％が回収された。Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数を実質的に増強するにもかかわらず、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２は、細胞分裂の数のわずかな低下をもたらした。これは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤に応じたＦｏｘｐ３発現細胞の度数の増加の説明としての選択的な増大を除外するものである。
【０１４１】
ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲの阻害は、後の時点で及び細胞分裂が起こると、Ｆｏｘｐ３を誘発するのにそれほど有効ではなかった（図１ｃ）。
【実施例３】
【０１４２】
ＴＣＲシグナル伝達は、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でｍＴＯＲ活性をコントロールする。
ＴＣＲシグナル伝達、ＴＣＲシグナル中止、並びにラパマイシン及びＬｙ２９４００２を用いる処理に応じるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の活性をモニターするために、発明者らは、ｍＴＯＲによって直接調節されるｐ７０ Ｓ６キナーゼの標的である、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（ｐＳ６）のレベルを分析した。ｐＳ６の細胞内染色は、単一細胞レベルで、抗ＣＤ２８と組み合わせたＴＣＲシグナル伝達（プレートに結合したＨ５７、３００ｎｇ／ｍｌ）が、大多数のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で高レベルのＳ６リン酸化を誘発したことを示した（図２ａ）。抗ＣＤ２８単独では、効果はなかった（図２ａ、上部のパネル）。Ｓ６リン酸化は、継続的なＴＣＲシグナル伝達の存在下では持続したが、ラパマイシン（２５ｎＭ）又はＬｙ２９４００２（１０μｇ／ｍｌ）によって１時間以内に完全に除去された（図２ｂ）。プレートに結合したＨ５７及び抗ＣＤ２８を用いて１８時間、活性化したナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルを取り除くと、ｐＳ６は、より徐々にではあるが減退した（図２ｂ）。よって、Ｆｏｘｐ３誘発は、Ｓ６リン酸化を低下させる操作に応じて起こる。しかしながら、重要なことには、Ｓ６リン酸化の低下はＦｏｘｐ３誘発にとって十分ではない。特に、新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞の栄養源の遮断によるｍＴＯＲ阻害はＦｏｘｐ３発現を誘発しない。
【実施例４】
【０１４３】
ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発は安定しており、調節性機能の獲得をもたらす。
上記に記載されるように、Ｆｏｘｐ３発現は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤に応じて２４〜４８時間以内に誘発された。調節性機能を有していないＦｏｘｐ３の一時的なアップレギュレーションがヒトＣＤ４ Ｔ細胞で記載されているので、発明者らは、次に、Ｆｏｘｐ３発現の安定性及びＦｏｘｐ３誘発細胞の機能的適格性を検査した。Ｆｏｘｐ３は、誘発の７日後までに強く発現し、Ｆｏｘｐ３は、ＩＬ−２中での数回の再刺激を通して安定して維持されたので、発現は、有糸分裂的に遺伝性であった（図３ａ）。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３の誘発が調節性Ｔ細胞の機能をもたらすかどうかを評価するために、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を活性化し、ＴＣＲシグナルを取り除き、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で培養した。段階的な数の、結果として生じる集団（細胞内染色により２８％ Ｆｏｘｐ３＋）を、新鮮な、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞に添加した、またその集団は、細胞分裂プロファイルによって評価されるように、可溶性抗ＣＤ３（２Ｃ１１、１μｇ／ｍｌ）に対するそれらの反応を効率的にブロックした（図３ｂ、上部のパネル）。対照的に、コントロール細胞（＜１％ Ｆｏｘｐ３＋）は、ＣＦＳＥ標識化レスポンダー細胞の抗ＣＤ３誘発性の分裂をブロックしなかった（図３ｂ、下部のパネル）。
【０１４４】
発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞がＴ細胞欠損レシピエントに移入された場合に誘導される、大腸炎を防御する能力を、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３誘発が付与するかどうかを試験するために、大腸炎のＴ細胞移入モデル（Powrie et al., 1993）を使用した。（Powrie et al., 1993）
【実施例５】
【０１４５】
インビボでのＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じるＦｏｘｐ３発現
発明者らは、次に、Ｆｏｘｐ３が、インビボで、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によって誘発されるかどうかを検討した。ＴＣＲシグナル遮断を模倣するために、発明者らは、同一遺伝子の完全免疫適格性宿主の尾の静脈に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を注射し、活性化した。２日後に、発明者らは、内在性ＣＤ４脾臓細胞（ＣＦＳＥ−）及び移入された（ＣＦＳＥ＋）ＣＤ４脾臓細胞によるＦｏｘｐ３発現を評価した（図４ａ）。５．３±４．６％（ｎ＝１１）で、回収したＦｏｘｐ３＋細胞の度数は、もとの接種物に含有されるＦｏｘｐ３＋細胞の度数（１．５±１．１％、図４ｂに要約）よりも３倍高かった。ＣＦＳＥ標識化活性化Ｔ細胞のｉ．ｖ．移入に、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２のｉ．ｐ．注射が伴った場合、２日後に回収されたＦｏｘｐ３発現細胞の度数は約１０％までさらに増加した（図４）。対照的に、内在性（ＣＦＳＥ−）Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の度数は変わらないままであり、阻害剤が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞ではなく、通常の細胞に対して選択的に毒性であった可能性を除外した（図４）。我々は、次に、Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数の上昇が、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４ Ｔ細胞の選択的な回収率又はＦｏｘｐ３の誘発によるものであるかどうかを検討した。発明者らは、ＴＣＲ遮断がインビトロでＦｏｘｐ３発現をもはや効率的に誘発しなくなる時間である、活性化の４８時間後に、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＮ細胞を移入した（図１ｃを参照されたい）。これらの条件下で、わずか１．３±０．５％のＣＦＳＥ＋細胞が移入後にＦｏｘｐ３を発現し（ｎ＝４）、１．６±０．３％のＣＦＳＥ＋細胞が、ラパマイシン及びＬｙ２９４００２の存在下で移入後にＦｏｘｐ３を発現した（ｎ＝３、図４ｂ）。
【０１４６】
よって、ＴＣＲシグナル遮断は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ軸の阻害との相乗作用で、新たに活性化されたＴ細胞にＦｏｘｐ３発現を起こしやすくし、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達が、インビトロ及びインビボで、新たに活性化されたＴ細胞中のＦｏｘｐ３誘発にアンタゴナイズすることを示す。
【実施例６】
【０１４７】
選択的なＰＩ３−Ｋ阻害剤は、Ｆｏｘｐ３の調節での、ｐ１１０アイソザイムの間の階層性を明らかにする。
新世代のＰＩ３−Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられており、幅広い範囲の他のキナーゼよりも優先的に、ＰＩ３−Ｋアイソザイムに対する選択性を有することが示された（Camps et al., Nat Med. 2005, 11:936-943;Knight et al., 2006 同書）。発明者らは、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０アイソザイムの役割を、発明者らのＴ細胞分化アッセイにそれらを滴定することによって精査するためにこれらの化合物を利用した。これらの実験で、ＣＦＳＥ標識化は活性化及び生存率の基準として細胞周期進行を評価するために使用し、Ｆｏｘｐ３の誘発は、Ｓ６リン酸化（図５ｂ）と共に、単一細胞レベル（図５ａ、ｂ）でアッセイした。
【０１４８】
ｐ１１０β及びｐ１１０γはＦｏｘｐ３発現に検出可能に影響を与えない。ＴＧＸ１１５は１０μＭでＦｏｘｐ３発現にわずかな影響を及ぼした。ＴＧＸ１１５はｐ１１０β及びｐ１１０δの両方を阻害する。ＴＧＸ１１５がｐ１１０βを選択的に阻害する０．１μＭでは、ＴＧＸ１１５はＦｏｘｐ３発現に影響を与えず、ｐ１１０βは、この状況で、Ｆｏｘｐ３の調節に有意な役割を果たさないことを示した。同様に、ｐ１１０γ特異的阻害剤ＡＳ−６０５２４０は、ｐ１１０γについてのそのＩＣ５０のはるかに過剰な濃度でのみＦｏｘｐ３に影響を与え（０．００８μＭ）、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０γについての役割が除外された（図５ａ、ｂ）。
【０１４９】
ｐ１１０α及びｐ１１０δは、新たに活性化されたＴ細胞中のＦｏｘｐ３発現を調節する。阻害剤ＩＣ−８７１１４は、０．０１μＭまで、ＴＣＲ遮断のみに加えて、細胞の１０〜１５％のＦｏｘｐ３を誘発した。これらの濃度では、ＩＣ−８７１１４はｐ１１０δを選択的に阻害し、Ｆｏｘｐ３の調節に対するｐ１１０δアイソザイムの有意な寄与を実証する。ＰＩ−１０３化合物は、Ｆｏｘｐ３を強く誘発して、ＴＣＲシグナル遮断のみよりも＞２０％、Ｆｏｘｐ３発現細胞の度数を上昇させた。ＰＩ−１０３は、ｍＴＯＲＣ１についてのそのインビトロＩＣ５０をわずかに下回る濃度（０．０２μＭ）及びｐ１１０αについてのＩＣ５０あたりの濃度（０．００８μＭ）でＦｏｘｐ３を誘発し、ｐ１１０αについての役割と一致した。ｐ１１０α特異的阻害剤ＰＩＫ７５は、発明者らのアッセイの期間にわたる毒性によりこの示唆を試験するのに使用することができなかった（データ示さず）。決定的証拠は、ＰＩＫ９０の分析からもたらされ、ＰＩＫ９０は０．１μＭでＦｏｘｐ３を強く誘発した。ＰＩＫ９０は、ｐ１１０α及びｐ１１０γを選択的に阻害する（図５ａ、ｂ）。ＡＳ−６０５２４０を用いて発明者らの実験によりｐ１１０γについての役割が除外されるので、この結果は、ｐ１１０αを、Ｆｏｘｐ３の調節での有力なｐ１１０アイソザイムとして同定する。これらの研究に基づき、Ｆｏｘｐ３の調節でのｐ１１０アイソザイムの役割は選択的であるように思われる。ｐ１１０β及びｐ１１０γは検出可能な役割を果たさず、ｐ１１０δは中程度に重要であり、ｐ１１０αは有力である。
【実施例７】
【０１５０】
ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害によるＦｏｘｐ３誘発でのＴＧＦβの関与
ＴＧＦβは、インビトロでの、通常のＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の強力な誘発物質として知られており、したがって、発明者らは、ＴＧＦβが、新たに活性化されたＴ細胞のＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によってＦｏｘｐ３の誘発を媒介するかどうかを調べた。ＦＣＳを追加した細胞培養培地はＴＧＦβを含有するので、発明者らは、無血清リンパ球培地（ＡＩＭ−Ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でこの部に記載される実験を実行した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、免疫系で有力なＴＧＦβアイソフォームであるＴＧＦ−β１の増加は検出されなかったが、ＴＧＦ−β調節は複雑であることが知られており、ＲＮＡレベルは、必ずしも、分泌されたタンパク質の量と相互に関連しない。ＡＬＫ５及びＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合するＴＧＦβの結合は、受容体関連Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化をもたらし、これは、続いて、ｃｏ−Ｓｍａｄと関連し、核に移動させ、転写調節因子として作用する。したがって、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化は、ＴＧＦβシグナル伝達の感受性の指標となる。ナイーブＬＮ Ｔ細胞を、無血清培地中で１８時間活性化し、次いで、ＴＣＲシグナル遮断又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２について、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）に曝露した。全細胞抽出物を、抗ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）を用いるＳＤＳゲル電気泳動及びウエスタンブロッティングにかけたところ、ＴＧＦβに応じた、Ｓｍａｄ２の強いリン酸化を示した（図６ａ レーン１）。対照的に、ＴＣＲシグナル遮断（図６ａ、レーン２）又はＴＣＲシグナル遮断プラスラパマイシン及びＬｙ２９４００２（図６ａ、レーン３及び４）に応じたＳｍａｄ２の検出可能なリン酸化はなかった。ブロットは、続いて、装填コントロールとして抗Ｓｍａｄ２／３を用いてプローブした。
【０１５１】
次に、発明者らは、２つの独立したアプローチ、ＴＧＦβに対する中和抗体及びＴＧＦβアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ，activin receptor-like kinase）の阻害剤であるＳＢ ４３１５４２を使用してＴＧＦβシグナル伝達を阻害しようと試みた。ＳＢ−４３１５４２は、形質転換成長因子−ベータスーパーファミリーＩ型アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の強力で特異的な阻害剤である（Inman et al 2002 Mol Pharmacol. vol 62:65-74）。ＦＣＳを追加した細胞培養培地はＴＧＦβを含有するので、発明者らは、無血清リンパ球培地（ＡＩＭ−Ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でこれらの実験を実行した。中和ＴＧＦβ抗体及びＳＢ４３１５４２は、それぞれ８５％及び９６％、ＴＧＦβによるＦｏｘｐ３誘発をブロックしたが、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発に対する効果は有していなかった（図６ｂ）。
【０１５２】
【表１】
【０１５３】
実施例１〜７の要約
発明者らは、ＴＣＲシグナル伝達及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ活性が、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発にアンタゴナイズすることを示す。理論によって拘束されることなく、この発見は、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞のどちらかになる運命の選出をＴＣＲシグナル伝達の終止に関連づけるので、免疫の調節を理解するための重要な密接な関係を有する。有効の免疫応答は抗原負荷を低下させて、抗原の有用性が制限的になる条件を作り出す。発明者らの結果は、免疫の調節が免疫応答の関与の段階にどのように関連づけられる可能性があるかを示し、これは、Ｔ細胞のホメオスタシスにとって及び免疫病態を抑えるために重要である。
【０１５４】
ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の薬理学的阻害は、ＴＣＲシグナルの遮断によって引き起こされたＦｏｘｐ３誘発を強化する。ＰＫＣ、Ｎ−ＦＡＴ、ＧＳＫ−３、ＭＡＰＫ、Ｎｏｔｃｈ、及びその他の妨害が、実施例の系でＦｏｘｐ３誘発をもたらさないので、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの関与は選択的である。ＰＩ３−Ｋ活性は、Ｔ細胞活性化に続いて長時間持続し、発明者らの発見は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸が、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発を予防するのに重大であることを実証する。クラスＩ ＰＩ３キナーゼは、ＰＩ３−Ｋの触媒サブユニットであるｐ１１０イソ酵素の選択的な関与に基づいて、２つのグループ、Ａ及びＢにさらに分けられる。ｐ１１０δサブユニット及びｐ１１０γサブユニットの発現は主として白血球に制限されるが、ｐ１１０α及びｐ１１０βは広範に発現し、胚発生にとって不可欠である。クラスＩＢの単一のメンバーであるｐ１１０γはＴ細胞の発達及び活性化にとって重要であり、炎症応答及び自己免疫性疾患の治療のための主要な標的となる。ＰＩ３Ｋシグナル伝達及び疾患の間の関連は、ＰＩ３−Ｋサブユニットの選択的阻害剤の発達及び診療所への導入のための主要な推進力を提供した。発明者らは、ｐ１１０アイソザイムの間の選択性を示すために広範囲に特徴づけられた選択的阻害剤を用いたが、ｐ１１０α及びｐ１１０δはＦｏｘｐ３を調節するが、ｐ１１０β又はｐ１１０γは調節しない。ｐ１１０γは、Ｇタンパク質共役受容体によって活性化されるが、クラスＩＡ ＰＩ３Ｋ ｐ１１０α、ｐ１１０δ、及びｐ１１０βは、受容体チロシンキナーゼの下流で典型的に活性化され、したがって、リンパ球受容体シグナル伝達に関与している。興味深いことには、Ｆｏｘｐ３調節でのＩＡ ＰＩ３Ｋの間の階層性は、ＴＣＲ刺激性のＰＩ３−Ｋ活性に対するそれらの相対的な寄与とは別個であるように思われる。遺伝学的及び薬理学的分析は、両方とも、Ｂリンパ球及びＴリンパ球中での抗原受容体シグナル伝達でのｐ１１０δについての突出した役割を示すが、発明者らのデータは、ｐ１１０δが、Ｆｏｘｐ３調節において、有意ではあるが、それほど有力ではない役割を有することを示し、ｐ１１０αが最重要であるように思われる。ＴＣＲシグナル伝達及びＦｏｘｐ３調節でのｐ１１０アイソフォームの間の機能的な相違は免疫応答の操作において当業者を助ける。
【０１５５】
ｐ１１０δ欠損マウスはリンパ球活性化の欠陥を示すだけではなく、Ｔｒｅｇ欠損の特徴である炎症性腸疾患をも発症する。これについての可能性のある説明は、肥満細胞に由来するＩＬ−９に対するＴｒｅｇ耐性の依存性及び肥満細胞機能のためのｐ１１０δの不可欠な役割によって示唆される。これらのデータと一致して、Ｔｒｅｇ機能はｐ１１０δ欠損マウスの末梢で損なわれる。これにもかかわらず、Ｔｒｅｇの分化は、発明者らの発見に一致して、ｐ１１０δ欠損胸腺中で増加する。
【０１５６】
ＰＩ３−Ｋ阻害剤及びラパマイシンの両方は不要な免疫応答を抑圧するために使用されてきたが、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が免疫を調節するメカニズムはほとんど知られていない。ＰＩ３−Ｋ阻害剤及び自己免疫病の間の関連は、ＰＩ３−Ｋシグナル伝達のアンタゴニストであるＰｔｅｎについてヘテロ接合性のマウスは自己免疫病及び他の所見を発症したといった発見によって示唆された。ＰＩ３−Ｋは、複数の細胞型の多数のプロセスを調節し、自己免疫病でのＰＩ３−Ｋの関与についての可能性のあるメカニズムは、Ｔ細胞の生存の増加並びに抗原提示細胞、肥満細胞、及び他の炎症性の細胞型の動員及び活性化を含む。ラパマイシンは、長期的なアッセイで、調節性Ｔ細胞の数に正に又は負に影響を与えることが以前に報告された。発明者らの発見は、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が免疫を調整するメカニズムとしてのＦｏｘｐ３の調節を確立する。
【０１５７】
クラスＩＡアイソザイムｐ１１０α及びｐ１１０δとは対照的に、クラスＩＢ ＰＩ３−Ｋアイソザイムｐ１１０γは、Ｇタンパク質共役受容体（ｓｒｃチロシンキナーゼではなく）の下流で圧倒的に機能し、ＰＩ３−Ｋγは有意にＦｏｘｐ３を調節しない。それにもかかわらず、ＰＩ３−ＫγはＴ細胞の発達及び活性化に重要な役割を果たし、最近では、自己免疫性疾患の治療ための標的として認識されてきた。ＰＩ３−Ｋγの阻害剤は、自己免疫病の予防及び治療で有効な薬剤となるが、発明者らが実証するように、新たに活性化されたＴ細胞中でのＦｏｘｐ３の誘発を介するものではない。
【０１５８】
以前の研究は、特に成長因子の中止と組み合わせて、ラパマイシンを、先在するＴｒｅｇの欠失又は増大の延長に関連づけたが、ラパマイシンは、Ｆｏｘｐ３のデノボ誘発に効果を有していないように思われた。ここで、発明者らは、ＴＣＲシグナル遮断と組み合わせた、ラパマイシンによるＦｏｘｐ３の迅速なデノボ誘発を示す。
【０１５９】
ＴＧＦβは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３の強力な誘発物質であり、したがって、発明者らは、ＴＧＦβが、新たに活性化されたＴ細胞のＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３の誘発に関与するどうかを調べた。発明者らは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲの阻害に応じて、新たに活性化されたＴ細胞がＴＧＦβ産生を増加させるといった証拠を見出さなかった。Ｆｏｘｐ３誘発は無血清培地中で効率的であり、これは、血清に由来するＴＧＦβの必要を除外する。発明者らの発見は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、Ｓｍａｄ２の検出可能なリン酸化をもたらさないこと並びにＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発は、外因性のＴＧＦβとは無関係であり、中和抗ＴＧＦβに対して抵抗性であり、ＳＢ４３１５４２に対して抵抗性であることを示す。したがって、それらは、ＰＩ３−Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤が、ＴＧＦβとは無関係な経路によってＦｏｘｐ３を誘発するモデルと一致している。
【０１６０】
要約すると、発明者らは、新たに活性化されたナイーブＴ細胞中でのＦｏｘｐ３誘発の、新規な、ＴＧＦβとは無関係な経路を同定した。発明者らの発見は、エフェクターになる運命及びＴｒｅｇ機能のどちらかの選出のためのＴＣＲシグナル伝達の重要性を強調し、発明者らは、免疫応答の操作が望ましい状態で、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達の小分子阻害剤によって調節性Ｔ細胞分化を駆動するための新たなアプローチを記載する。
【実施例８】
【０１６１】
デノボＦｏｘｐ３発現の誘発
発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の活性化が、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲシグナル伝達によってコントロールされる、Ｆｏｘｐ３発現の誘発のための絶好の機会を作り出すことを教示する。
【０１６２】
概要：活性化は、一連のＴヘルパー（Ｔｈ，T helper）細胞型に分化する又はその代わりに調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）になる運命を取るナイーブＣＤ４ Ｔ細胞の潜在力を明らかにする。エフェクター細胞対調節性細胞の運命の選出がどのようにコントロールされるかは先行技術でほとんど知られていない。発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞の特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現が、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からＴＣＲシグナルが活性化の直後に取り除かれる場合に誘発されることを示す。Ｆｏｘｐ３誘発は、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）触媒サブユニットｐ１１０α及びｐ１１０δ、Ａｋｔ、並びにｍＴＯＲによってコントロールされる。これらの発見は、ＴＣＲシグナル伝達経路をＴｒｅｇ細胞の運命の選出に関連づける。本発明は、調節性Ｔ細胞分化の実験用の及び治療上の操作のための新たなアプローチを提供する。
【０１６３】
序論：多細胞生物の特殊化した細胞型は、遺伝子発現の特異的なパターンによって定義される。多能性の造血幹細胞からそれらの分化の間に、発達中のＴ細胞は、それらの系統についての潜在力についてかなりの制限を受ける。ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞に余地が残されている選択肢は、いくつかの別個のＴｈサブセット（Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７など）並びにＴｒｅｇ細胞になる運命を含む。Ｔｈ系統の選出は、特異的な病原体に対する有効な免疫応答にとって重要であるが、エフェクター機能及び調節性機能の間のバランスは、過度の免疫病態及び自己免疫病を回避しながら免疫適格を保証するのに重大である。自然調節性Ｔ細胞は、特徴となる転写因子Ｆｏｘｐ３の発現によって特徴づけられ、Ｆｏｘｐ３の安定した高レベルの発現は、調節性Ｔ細胞の機能にとって必要であり、且つ十分である。Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺中で発生し、ナイーブ末梢ＣＤ４ Ｔ細胞から発生する。ＴＧＦβは、インビトロでＦｏｘｐ３発現を指示するが、ＩＬ−２と同様に、Ｔｒｅｇ細胞分化ではなく、インビボでのＴｒｅｇ細胞の維持にとって重要である。エフェクターＴ細胞になる運命及び調節性Ｔ細胞になる運命のどちらかの選出についての分子的なベースは先行技術で知られていないので、発明者らは、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３発現及び調節性Ｔ細胞の機能を誘発するシグナルを同定することを目指す。
【０１６４】
実験：ナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、１８時間、プレートに結合した抗ＴＣＲ及び可溶性抗ＣＤ２８を用いて活性化し、次いで、可溶性抗ＣＤ２８のみを有する新鮮なウェルに移動させる。２日後に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、継続的なＴＣＲシグナルに曝露されたコントロールと比較して、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞中でＦｏｘｐ３ ＲＮＡの発現が上昇したことを示した（図７ａ）。Ｆｏｘｐ３タンパク質は、ＴＣＲシグナルを取り除いた細胞で１０．８±７．６％（ｎ＝３０）と検出されたが、ＴＣＲ抗体と接触させたままの細胞ではわずか１．０±０．８％（ｎ＝２１）であった（図７ｂ）。ＴＣＲシグナル伝達の下流でＦｏｘｐ３をコントロールする経路を同定するために、発明者らは、シグナル伝達に関与する酵素の小分子阻害剤をスクリーニングした。ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲの阻害剤はＦｏｘｐ３誘発を著しく強化した（図７ｂ）が、カルシニューリン／ＮＦＡＴ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ及びＦＫ−５０６）、マイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ ＪＮＫ、ＳＡＰＫ、ｐ３８、及び上流キナーゼ）、プロテインキナーゼＣアイソザイム、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３、低酸素誘発因子、並びにγ−セクレターゼ／Ｎｏｔｃｈの阻害剤は強化しなかった。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンは、２６．８±１４．４％の細胞でＦｏｘｐ３を誘発した（ｎ＝３０、図７ｂ）。同様に、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２及びｗｏｒｔｍａｎｎｉｎは、２６．９±１１．４％（ｎ＝２５、図７ｂ）及び１７．３±５．３％（ｎ＝３）の細胞でＦｏｘｐ３をそれぞれ誘発した。ＬＹ２９４００２誘導体のＬＹ３０３５１１はモルホリン環中の単一の原子の置換のためにＰＩ３Ｋを阻害せず、Ｆｏｘｐ３発現を誘発しなかった。ＴＧＦβはポジティブコントロールとして使用した（図７ｂ）。Ｆｏｘｐ３発現の増加が、先在するＦｏｘｐ３＋細胞の選択的な増大に起因したかどうかを検討するために、発明者らは、活性化に先立って、ＣＦＳＥを用いてナイーブＣＤ４ Ｔ細胞を標識化した。細胞を阻害剤に曝露した場合、細胞分裂は１８時間後に起こらなかった。ラパマイシン及びＬＹ２９４００２は、次の２４〜４８時間の間に起こった細胞分裂の数をわずかに低下させたが、Ｆｏｘｐ３発現の度数を実質的に増強し（図７ｂ）、Ｆｏｘｐ３は、細胞分裂を受けなかった多くの細胞中で発現した（図７ｂ）。よって、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現を誘発する。
【０１６５】
Ｔ細胞活性化はＦｏｘｐ３誘発に必要とされ（図７ｃ）、同時刺激は著しくその効率を増強した。
【０１６６】
同時刺激は、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害に応じてＦｏｘｐ３誘発の効率を著しく増強した。
【０１６７】
【表２】
【０１６８】
Ｔ細胞活性化及びＦｏｘｐ３誘発の間の一時的な関係を調査するために、発明者らは、異なる時間にＴＣＲ刺激を中止し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲを阻害した（図７ｃ）。Ｔ細胞をＰＩ３Ｋ／ｍＴｏｒ阻害に先立って１８時間活性化した場合、Ｆｏｘｐ３誘発は最大となった。阻害剤をより早く添加すると細胞分裂をブロックし、Ｆｏｘｐ３の誘発はそれほど効率的ではなくなった。同様に、細胞分裂が起こると、より後の時点では、Ｆｏｘｐ３誘発は非効率的であった（図７ｃ）。発明者らは、Ｔ細胞活性化がＦｏｘｐ３誘発のための絶好の機会を作り出すといった結論を下す。
【０１６９】
誘発されると、Ｆｏｘｐ３発現は有糸分裂的に遺伝性であり、数回の再刺激を通して維持された（図７ｄ）。Ｆｏｘｐ３誘発細胞（３６％ Ｆｏｘｐ３＋）が、可溶性抗ＣＤ３に応じて、ＣＦＳＥによって標識化したＣＤ４ ＬＮ Ｔ細胞の細胞分裂を効率的にブロックした（図７ｅ、上部のパネル）が、コントロールの活性化細胞（１％のＦｏｘｐ３＋）はブロックしなかった（図７ｅ、下部のパネル）ので、Ｆｏｘｐ３発現には調節性Ｔ細胞の機能が伴った。休止ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞又はコントロールの活性化ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞は、リンパ球欠損（Ｒａｇ−／−）マウスに移入した場合、大腸炎を引き起こすが、Ｆｏｘｐ３が、移入に先立って、ＣＤ４５ＲＢｈｉ ＣＤ４ Ｔ細胞の一部分で誘発された場合（２８％ Ｆｏｘｐ３＋）、大腸炎は、それほど著しく重症ではなかった（図７ｆ）。
【０１７０】
末梢ＣＤ４ Ｔ細胞は「適応可能な」Ｔｒｅｇ細胞を生じさせることができるが、胸腺中で「自然に」発生するＴｒｅｇ細胞と比較したそれらの生理学的関連性は関心分野である。ＴＣＲシグナル伝達の操作が胸腺細胞中でのＦｏｘｐ３発現を駆動するかどうかを検討するために、発明者らは、ＣＤ４単一陽性、ＣＤ２５陰性胸腺細胞を１８時間活性化し、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を添加した（図７ｆ）。Ｆｏｘｐ３発現の分析は、２日後に、胸腺細胞のかなりの画分のＦｏｘｐ３の誘発を実証した。
【０１７１】
新世代のＰＩ３Ｋ阻害剤は最近、生化学的、構造的、及び生物学的レベルで特徴づけられている。ＰＩ３Ｋアイソザイムについてのこれらの化合物の選択性は、インビトロキナーゼアッセイ及び細胞ベースの実験（表１を参照されたい）によって並びにインスリンシグナル伝達及びリンパ球活性化に対する、薬理学的及び遺伝学的消失の効果を直接比較することによって広範囲に検証された。発明者らは、Ｆｏｘｐ３のコントロールでの、ＰＩ３Ｋ触媒サブユニットの関与を定義するためにこれらの化合物を利用した。ＴＧＸ１１５化合物は１０μＭではＦｏｘｐ３発現にわずかな影響を及ぼし、ＴＧＸ１１５化合物はｐ１１０β及びｐ１１０δの両方を阻害するが、０．１μＭではＦｏｘｐ３発現に影響を与えず、ＴＧＸ１１５化合物はｐ１１０βを選択的に阻害する。同様に、ｐ１１０γ特異的阻害剤ＡＳ−６０５２４０は、ｐ１１０γについてのそのＩＣ５０のはるかに過剰な濃度でのみＦｏｘｐ３に影響を与えた（０．００８μＭ、ｐ１１０β及びｐ１１０γは、この状況で、Ｆｏｘｐ３の調節に有意な役割を果たさないことを示す（図８ａ、ｂ）。ＩＣ−８７１１４化合物は、ｐ１１０δを選択的に阻害する濃度（０．０１μＭ）で、ＴＣＲ遮断のみに加えて、細胞の１０〜１５％でＦｏｘｐ３を一貫して誘発し、Ｆｏｘｐ３の調節に対するｐ１１０δの有意な寄与を実証した。ＰＩ−１０３化合物は、Ｆｏｘｐ３を強く誘発して、＞２０％までＦｏｘｐ３発現細胞の度数を上昇させた。ＰＩ−１０３は、ｍＴＯＲについてのそのインビトロＩＣ５０をわずかに下回る濃度（０．０２μＭ）及びｐ１１０αについてのインビトロＩＣ５０あたりの濃度（０．００８μＭ）でＦｏｘｐ３を誘発し、ｐ１１０αについての役割と一致した。ｐ１１０α特異的阻害剤ＰＩＫ７５は、アッセイの期間にわたる毒性によりこの示唆を試験するのに使用することができなかった。ｐ１１０αの役割についての決定的証拠は、ＰＩＫ９０の分析からもたらされ、ＰＩＫ９０は０．１μＭでＦｏｘｐ３を強く誘発し、ＰＩＫ９０は、ｐ１１０α及びｐ１１０γを選択的に阻害する（図８ａ、ｂ）。ｐ１１０γ阻害がＦｏｘｐ３誘発に影響を与えなかったので（上記参照）、この結果は、ｐ１１０αを、この状況で、有力なｐ１１０アイソザイムとして同定する。ｐ１１０アイソザイムのこの階層性（α＞δ＞＞＞β及びγ）はリンパ球活性化とは別にＦｏｘｐ３調節を設定するように思われ、ｐ１１０δは有力なものとして見なされる。
【０１７２】
もちろん、インビトロＩＣ５０値は、細胞のＩＣ５０についての指標として扱われなければならない；細胞の値は、ＡＴＰからの競合のために典型的にやや高い。ＩＣ８７１１４は、とりわけ１μＭで非常にｐ１１０δに選択的であり、したがって、その濃度での１５％の誘発は明らかにδによるものである。ＴＧＸ−１１５は１０μＭでさえ非常に小さな効果しか有しておらず（小さなδ阻害が得られる）、したがって、ベータは重要性が限られていそうである又はそれほど重要性がなさそうである。α阻害剤１０３及び９０は、低用量で、ＩＣ８７１１４を上回る劇的な誘発を示し、αが有意な役割を果たすことを示す。しかし、それらの化合物にとっての、α及びδの間の差はそれほど大きくはなく、したがって、重大な所見は、それらが、完全にδを不活性化する用量（１０μＭ）で、ＩＣ８７１１４よりも多くの活性を有するということである。ＡＳ−６０５２４０データの解釈は、その化合物についての細胞のＩＣ５０がγについてのどのようなものなのかに依存し、１０μＭで、いくらかのα阻害がこの化合物で得られる。したがって、ガンマが、この状況で、ＴＣＲシグナル伝達と共役するといったことはあまりありそうもない。
【０１７３】
ＴＧＦβは、インビトロでの、通常のＣＤ４ Ｔ細胞中でのＦｏｘｐ３発現の強力な誘発物質であり、発明者らは、発明者らの系でのその役割を検討した。ＡＬＫ５及びＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合するＴＧＦβの結合は、受容体関連Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化をもたらし、これは、ＴＧＦβシグナル伝達の感受性の指標を提供する。ｐＳｍａｄ２（Ｓ４６５／４６７）は、ＴＧＦβに応じて容易に検出可能となったが（図９ａ レーン１）、ＴＣＲシグナル遮断（図９ａ、レーン２）又はＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害（図９ａ、レーン３及び４）に応じて検出可能とならなかった。中和ＴＧＦβ抗体及びＴＧＦβアクチビン受容体様キナーゼをブロックするＳＢ ４３１５４２は、ＴＧＦβによるＦｏｘｐ３誘発を低下させたが（それぞれ８５％及び９６％）、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤によるＦｏｘｐ３誘発に対する効果はなく（図９ｂ）、ＴＧＦβは、ＴＣＲシグナル遮断及びＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によるＦｏｘｐ３の誘発にとって重要でないことを実証した。
【０１７４】
新たに活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞中でのＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ軸の活性をモニターするために、発明者らは、ｍＴＯＲ調節性のｐ７０ Ｓ６キナーゼＳ６Ｋ１の標的であるＳ６リボソームタンパク質（ｐＳ６）のリン酸化を分析した。ＴＣＲ／ＣＤ２８シグナル伝達（しかし抗ＣＤ２８単独ではない）は、高レベルのｐＳ６を誘発した（図１０ａ）。ＴＣＲシグナルを中止した場合に、Ｓ６リン酸化は減退したので、１８時間活性化されたＴ細胞中でのｍＴＯＲ活性の維持は、継続的なＴＣＲシグナル伝達を必要とした（図１０ｂ）。Ｓ６リン酸化は、ラパマイシン又はＬＹ２９４００２によって完全に除去された（図１０ｂ）。セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ／ＰＫＢは、ＴＣＲ／ＣＤ２８を通してのシグナル伝達に応じて速やかにリン酸化されるが、ｐＳ６とは対照的に、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）は、ＴＣＲ／ＣＤ２８シグナル伝達の開始の１８時間後にもはや検出されなかった（図１０ｃ）。しかしながら、１８時間活性化されたＴ細胞からＴＣＲシグナルを取り除いた場合に、Ａｋｔ（Ｓ４７３）リン酸化は回復し、これは、１、３、及び８時間でのｐＡｋｔのレベルの増加並びにｐＳ６レベルの相反する減退をもたらした（図１０ｃ）。１時間のラパマイシンへの曝露は類似の効果を有した。ＴＣＲシグナル遮断及びラパマイシン処理に応じたＡｋｔリン酸化の増加は、従来の線状のシグナル伝達経路と適合しないが（図１０ｄ）、Ａｋｔ活性がＰＤＫ１及びｍＴＯＲＣ２の両方によってコントロールされるネットワークモデルと一致している。このモデルで、ｍＴＯＲＣ２（ｍＴＯＲ／ｒｉｃｔｏｒ／Ｓｉｎ１）は、Ｓ６Ｋ１を介するｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲ／ｒａｐｔｏｒ）の負のフィードバックコントロール下にあり、Ｓ６Ｋ１は、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ１，insulin receptor substrate 1）をリン酸化し、阻害し、また、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、及びｍＴＯＲＣ２を介してＡｋｔ活性化を低下させる（図１０ｅ）。発明者らのデータに適用させると、ＴＣＲシグナル伝達の中止は、ｍＴＯＲＣ１及びＳ６Ｋ１の活性を低下させ（図１０ｂ）、これは、ｍＴＯＲＣ２のフィードバック阻害を低下させ、ｐＡｋｔ（Ｓ４７３）の観測された増加について説明する（図１０ｃ）。同様に、ラパマイシンを用いる短期の処理は、ｍＴＯＲＣ２の、ｍＴＯＲＣ１依存性のフィードバック阻害をブロックし、Ａｋｔ（Ｓ４７３）リン酸化をもたらす（図１０ｃ、ｅ）。興味深いことには、ＴＧＦβもまたｐＳ６の低下及びｐＡｋｔ Ｓ４７３の増加をもたらし、この点に関して、ＴＣＲシグナル遮断及びｍＴＯＲ阻害に似ている（図１０ｃ）。
【０１７５】
１８時間活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞の栄養源の遮断はｐＳ６を阻害するが、Ｆｏｘｐ３を誘発しなかったので、Ｓ６リン酸化の低下のみではＦｏｘｐ３発現を誘発するのに十分ではなかった（ＴＣＲシグナル伝達の継続：２％ Ｆｏｘｐ３＋；ＴＣＲシグナル遮断 １１％ Ｆｏｘｐ３＋；ラパマイシン：２５％ Ｆｏｘｐ３＋；０．１％ ＦＣＳを有するＩＭＤＭ培地：４％ Ｆｏｘｐ３＋；１０％ ＦＣＳを有するＰＢＳ：５％ Ｆｏｘｐ３＋；０．１％ ＦＣＳを有するＰＢＳ：２％ Ｆｏｘｐ３＋）。ＴＣＲシグナル遮断によるＦｏｘｐ３の誘発は、ｍＴＯＲＣ１媒介性のフィードバック阻害の損失に続く、Ａｋｔ活性の増加又はその代わりに、ラパマイシンへの長期的な曝露が、ｍＴＯＲＣ２の構築及び結果的にＡｋｔ（Ｓ４７３）のリン酸化に干渉する場合に起こるＡｋｔ活性の最終的な損失によるものかどうかといった余地が残されている。この疑問を検討するために、発明者らはアロステリック阻害剤、Ａｋｔｉ−１／２を使用した。Ａｋｔｉ−１／２は、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２（それぞれ５８ｎＭ及び２１０ｎＭ）についてのそのＩＣ５０のあたりの濃度で少し前に活性化されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を増強し、Ａｋｔ活性化ではなく、Ａｋｔ阻害がＦｏｘｐ３誘発を駆動することを実証する（図１０ｆ）。
【０１７６】
要約
要約すると、発明者らは、活性化が、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中で、Ｆｏｘｐ３の誘発のための絶好の機会を作り出すことを示した。Ｆｏｘｐ３誘発は、ＴＧＦβとは無関係であるように思われ、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達によってアンタゴナイズされる。この発見は、エフェクターＴ細胞及び調節性Ｔ細胞のどちらかになる運命の選出をＴＣＲシグナル伝達経路に関連づけるので、免疫の調節を理解するための重要な密接な関係を有する。ｐ１１０δがＦｏｘｐ３発現を調節するといった発明者らの発見と一致して、通常よりも高い数のＴｒｅｇ細胞がｐ１１０δ欠損マウスの胸腺中で産生される。より長い期間では、おそらくｐ１１０δが、順番にＴｒｅｇ細胞に影響を与える肥満細胞のような他の細胞型にとって重要であるので、ｐ１１０δの欠損は、Ｔｒｅｇ細胞の維持及び機能を損なう。発明者らが実証した、Ｆｏｘｐ３調節でのｐ１１０アイソザイムの特異な役割に加えたこれらの考察は、免疫応答の操作についての新たな戦略を可能にする。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害による抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞の産生に対する可能性のある障害は、アプローチが、Ｆｏｘｐ３誘発を可能にするのにＴＣＲリガンドの除去を必要とするかどうかである。しかしながら、発明者らは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在が継続した状態で、かなりの割合のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞中でＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤がＦｏｘｐ３を誘発することを示す（図１２）。Ｆｏｘｐ３はまた、抗原提示細胞及び特異的なペプチドによって刺激されたＲａｇ１欠損ＴＣＲトランスジェニックＣＤ４ ＬＮ細胞中でＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害によって誘発可能であり、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤を使用して、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を産生することが、有利なことには、現在可能であることを実証する。
【０１７７】
興味深いことには、損なわれたＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達は、Ｔｒｅｇ細胞分化を促進するだけではなく、報告によれば、Ａｋｔシグナル伝達はＴｒｅｇ細胞及びそれらの標的で損なわれ、調節性Ｔ細胞の機能がＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ／Ａｋｔシグナル伝達の変化を含む可能性を高める。
【０１７８】
ＴＣＲ関与の持続の欠如又は損なわれたＴＣＲシグナル伝達が、ノンプロフェッショナルＡＰＣによる抗原提示、免疫応答の関与の段階の間の低抗原用量、又はモザイク抗原発現などのような免疫の調節に関連する状態で起こるかもしれない。これは、胸腺及びリンパ節中で組織特異抗原を異所的に発現する上皮細胞によるＴｒｅｇ細胞の選択と一致している。
【０１７９】
実施例８の材料及び方法
マウス、細胞選別、及び培養。動物についての作業はＡｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ、ＵＫに従って実行した。野生型からのリンパ節（ＬＮ）細胞又は胸腺細胞は、記載されるように、染色し、分析し、フローサイトメトリーによって、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、若しくはＣ５７ＢＬ／６ｘ１２９）マウス又はＲａｇ１欠損Ｈ２ｂＴＣＲトランスジェニックマウスと選別した（Thompson et al., 2007 Immunity Vol 26 pp 335-344）。抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下での骨髄に由来し、抗原ペプチドと共にインキュベートした。Ｆｏｘｐ３タンパク質についての細胞内染色は、メーカーによって助言されるように行った（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）。Ｓ６リボソームタンパク質のリン酸化ステータスは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製Ｆｏｘｐ３染色キット及び抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ又はＩｇＧ−Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、抗ｐＳ６ Ｓｅｒ２３５／２３６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｔ．ｎｏ．２２１１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ）を使用して決定した。Ｆｏｘｐ３発現の誘発について、選別したＬＮ ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌｈｉ Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＴＣＲβ（Ｈ５７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、２００ｎｇ／ｍｌ）及び可溶性又はプレートに結合した抗ＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に１〜３×１０６／ｍｌで培養した。１８時間後、細胞は、ＴＣＲ刺激の継続のために所定の位置に放置した又は示す添加剤と共に、コーティングされていないウェルに移動させた。
【０１８０】
調節性機能を評価するために、示すように培養したＣＤ４ Ｔ細胞を、１×１０５ＣＦＳＥ標識化全ＬＮ細胞又は５×１０４ＣＦＳＥ標識化ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のいずれか及び１×１０５マイトマイシンＣ処理（２５μｇ／ｍｌ、２０分間、３７℃）Ｔ細胞除去脾細胞を含む丸底ウェル中に、示す濃度の抗ＣＤ３（２Ｃ１１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に滴定した。ＣＤ４ Ｔ細胞ＣＦＳＥプロファイルは４８〜７２時間後に記録した。
【０１８１】
養子移入実験。ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢｈｉナイーブＣＤ４細胞をリンパ球欠損（Ｒａｇ−／−）宿主に移入し、大腸炎を、記載されるようにスコア化した（Powrie et al., 1993 Int. Immunol. Vol 5 pp 1461-1471）。
【０１８２】
ＲＴ−ＰＣＲ並びにノーザンブロット及びイムノブロット。全ＲＮＡは、ＲＮＡｂｅｅ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）を使用して単離し、逆転写した。リアルタイムＰＣＲ分析は、（Thompson et al., 2007 上記）に記載されるように、Ｏｐｔｉｃｏｎ（商標）ＤＮＡエンジンで実行し（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．；７２℃でのプレートリードと共に、１５分間９５℃、その後、１５秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び３０秒間７２℃の４０サイクル）、Ｙｗｈａｚ（チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド）及びＵｂｅ２Ｌ３（ユビキチン抱合酵素Ｅ２Ｌ３）の相乗平均に正規化した。プライマー配列 （５’〜３’）Ｙｗｈａｚフォワード：
ＣＧＴＴＧＴＡＧＧＡＧＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＴ；Ｙｗｈａｚリバース：
ＴＣＴＧＧＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧ；Ｕｂｃフォワード：
ＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡ；Ｕｂｃリバース：
ＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡ；Ｆｏｘｐ３フォワード：
ＡＣＴＣＧＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧ；Ｆｏｘｐ３リバース：
ＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴ
【０１８３】
イムノブロットは記載されるように行った（Thompson et al., 2007 上記）。
【０１８４】
上記の明細書で言及された刊行物はすべて、参照によって本明細書に組込まれる。記載される態様の様々な修正及び変形並びに本発明の実施形態は本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明白となるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載されたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。実際に、当業者に明白な、本発明を実行するための記載された形態の様々な修正は以下の請求項の範囲内であることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項２】
あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含み、前記阻害が、刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項３】
調節性Ｔ細胞（１又は複数）を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップであって、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始されるステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法。
【請求項４】
阻害が、刺激の約１７〜１９時間後に開始される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
阻害が、刺激の約１８時間後に開始される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
シグナル伝達ステップを阻害するステップが、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップが、細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シグナル伝達を阻害する時間までに刺激を中止するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞を刺激するステップが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して前記Ｔ細胞を刺激するステップを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【請求項１１】
Ｆｏｘｐ３発現の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【請求項１２】
調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用。
【請求項１３】
調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤。
【請求項１４】
調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤。
【請求項１５】
（ｉ）ＴＣＲ刺激剤と、
（ii）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤と
を含むキット。
【請求項１６】
ＴＣＲ刺激剤が、抗ＴＣＲ抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項２１】
調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＣＤ８−Ｔ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法。
【請求項２２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２を含む、請求項１〜９、２０、２１のいずれかに記載の方法、請求項１０〜１２のいずれかに記載の使用、請求項１３若しくは１４に記載の阻害剤、又は請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項１】
Ｔ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項２】
あらかじめ刺激されたＴ細胞中でＦｏｘｐ３発現を誘発する方法であって、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介する前記Ｔ細胞中のシグナル伝達を阻害するステップを含み、前記阻害が、刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項３】
調節性Ｔ細胞（１又は複数）を必要とする対象を治療する方法であって、
（ｉ）対象から、Ｔ細胞を含む試料を取り出すステップと、
（ii）前記Ｔ細胞を刺激するステップと、
（iii）任意で前記刺激を中止するステップと、
（iv）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップであって、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始されるステップと、
（ｖ）前記対象に前記Ｔ細胞を再導入するステップと
を含む方法。
【請求項４】
阻害が、刺激の約１７〜１９時間後に開始される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
阻害が、刺激の約１８時間後に開始される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
シグナル伝達ステップを阻害するステップが、ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタを介するシグナル伝達を阻害するステップが、細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤と接触させるステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
シグナル伝達を阻害する時間までに刺激を中止するステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｔ細胞を刺激するステップが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して前記Ｔ細胞を刺激するステップを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
調節性Ｔ細胞へのＴ細胞の分化の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【請求項１１】
Ｆｏｘｐ３発現の誘発におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する使用。
【請求項１２】
調節性Ｔ細胞の欠損症のための医薬品の製造における、ＰＩ３Ｋアルファ阻害剤又はＰＩ３Ｋデルタ阻害剤の使用。
【請求項１３】
調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファ阻害剤。
【請求項１４】
調節性Ｔ細胞の欠損症の治療で使用するためのＰＩ３Ｋデルタ阻害剤。
【請求項１５】
（ｉ）ＴＣＲ刺激剤と、
（ii）ＰＩ３Ｋアルファ又はＰＩ３Ｋデルタの阻害剤と
を含むキット。
【請求項１６】
ＴＣＲ刺激剤が、抗ＴＣＲ抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤をさらに含む、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤がラパマイシンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
Ａｋｔ阻害剤をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、
（ｉ）Ｔ細胞を刺激するステップと、
（ii）前記Ｔ細胞中で、ＰＩ３Ｋアルファ、ＰＩ３Ｋデルタ、ｍ−ＴＯＲ又はＡｋｔを介するシグナル伝達を阻害するステップと
を含み、前記阻害が、（ｉ）の刺激の１０〜２２時間後に開始される方法。
【請求項２１】
調節性Ｔ細胞を産生するための方法であって、刺激されたＣＤ８−Ｔ細胞を、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤を用いて処理するステップを含み、前記阻害剤が、ＰＩ３Ｋアルファ及び／又はＰＩ３Ｋデルタを阻害する方法。
【請求項２２】
ＰＩ３Ｋ阻害剤がＬＹ２９４００２を含む、請求項１〜９、２０、２１のいずれかに記載の方法、請求項１０〜１２のいずれかに記載の使用、請求項１３若しくは１４に記載の阻害剤、又は請求項１５〜１９のいずれかに記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５１２７３８（Ｐ２０１０−５１２７３８Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４０８６０（Ｐ２００９−５４０８６０）
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１９７４
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０４１７１４３３）メディカル リサーチ カウンシル (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４７８４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７１９７４
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（５０４１７１４３３）メディカル リサーチ カウンシル (16)
【Ｆターム（参考）】
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