核内受容体および／または転写因子の活性化促進剤
【課題】大豆サポニンの作用点を解明し、作用機序から演繹される大豆サポニンの適切な予防、治療の対象となる疾患を特定し、大豆サポニンあるいは大豆サポニンを含有する食品を特定された疾患の予防、治療を目的として利用すること。
【解決手段】サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤。
【解決手段】サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体および／または転写因子の活性化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆はアジア原産の植物であり、古来より種々の機能性が報告されているが、その機能性成分については、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）などのイソフラボンおよびイソフラボン配糖体とともに大豆サポニンが主要な成分として知られている。大豆サポニンはオレアナン型トリテルペンサポニンであるソーヤサポニン（ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ）Ｉ〜Ｖ、とアセチルソーヤサポニン（ａｃｅｔｙｌｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ）Ａ１〜Ａ６などから構成されている。
大豆サポニンの薬理作用に関しては、血清脂質改善作用、肥満抑制作用、脂質酸化抑制などの抗酸化作用、肝保護作用、免疫増強活性、殺虫作用などが従来報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、近年、抗癌作用［アポトーシス誘導、シアリルトランスフェラーゼ阻害による癌転移抑制、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）阻害によるシグナル伝達阻止などの機序に基づく］、抗ウイルス活性（ＨＩＶ、ヘルペス）、抗アレルギー作用、皮膚機能改善作用［コラーゲン、ラミニン産生促進、ＨＳＰ（熱ストレス蛋白質）３２合成刺激による皮膚抗酸化増強等］などが報告されている（例えば、特許文献２〜４参照。）。また、肥満抑制作用の機序としてアディポネクチン分泌促進作用の報告もされている（特許文献５参照。）。大豆サポニンは、此処に示すように、高脂血症、肥満などの生活習慣病を始めとして、広範な疾患に対する予防、治療効果が報告されているが、その薬理作用の作用点は必ずしも全面的に解明されているわけでは無い。
【０００３】
疾患の予防、治療剤はその作用機序が解明されることにより、その薬理作用の明解な理解が得られ、薬剤の適切な予防、治療への応用が図られると考えられる。この点において、大豆サポニンの作用機序の解明は現状、極めて不十分なところで留まっている。
【特許文献１】特開平０６−３１１８６７号公報
【特許文献２】特開２００６−１６９１８６号公報
【特許文献３】特開２００７−１９７３９８号公報
【特許文献４】特開２００６−２１３６４９号公報
【特許文献５】特開２００６−１４３６０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、大豆サポニンの作用点を解明し、作用機序から演繹される大豆サポニンの適切な予防、治療の対象となる疾患を特定し、大豆サポニンあるいは大豆サポニンを含有する食品を特定された疾患の予防、治療を目的として利用することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
大豆サポニンについて既に散発的に知られている薬理作用の多くが、近年解明されてきている核内受容体の薬理作用と共通する。しかしながら、現在まで、大豆サポニンの核内受容体のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（以下、ＰＰＡＲと略記する。）に対する作用の検討については、既に報告されているが、まだ十分とはいえない。我々は生活習慣病に関連する他の核内受容体並びに転写因子を主にして、大豆サポニンの核内受容体に対する活性化作用を検討した。その結果、大豆サポニンは複数の核内受容体並びに転写因子に対して活性化を促進することを明らかにすることが出来た。さらに、本発明者らは、研究を重ね、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤、
［２］核内受容体が、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）から選択される少なくとも１の受容体である前記［１］に記載の活性化促進剤、
［３］転写因子が、Ｎｒｆ−２である、前記［１］に記載の活性化促進剤、
［４］ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγから選択される少なくとも１である前記［２］に記載の活性化促進剤、
［５］ＬＸＲが、ＬＸＲαまたはＬＸＲβである前記［２］に記載の活性化促進剤、
［６］ＥＲが、ＥＲαである前記［２］に記載の活性化促進剤、
［７］サポニンが、大豆サポニンである前記［１］〜［６］のいずれかに記載の活性化促進剤。
［８］メタボリックシンドロームの予防、治療用である前記［１］、［２］、［４］、［７］のいずれかに記載の剤、
［９］アルツハイマー症候群の予防、治療用である前記［１］、［２］、［４］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１０］炎症の予防、治療用である前記［１］、［２］、［５］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１１］骨粗鬆症の予防、治療用である前記［１］、［２］、［６］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１２］酸化ストレスまたは生体異物の解毒用である前記［１］、［３］、［７］のいずれかに記載の剤、および
［１３］食品の形態である前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明において、大豆サポニンが示した作用は、既知の薬理作用を説明することが出来るものであると共に、従来知られていない薬理作用も推定させるものであり、本知見は、既知の薬理作用についても、本作用点を介しての作用であることを踏まえて、より適切な大豆サポニンの使用法を促すものであり、また同時に、新たな疾患への利用を可能にするものである。
【０００８】
大豆サポニンの作用は、脂質代謝、糖代謝を制御するＰＰＡＲのすべてのサブタイプα、δ、γに対する活性化、コレステロール代謝の制御に関与するＬＸＲα、βに対する活性化、ホルモン作用を示すＥＲαに対する活性化、更に抗酸化ストレスや解毒誘導作用を有するＮｒｆ−２に対する活性化を含む。特に、Ｎｒｆ−２の活性化は、第二相解毒酵素群の発現およびメタロチオネインなどの解毒蛋白の産生を誘導できるので、生体内に取り込まれた生体異物（例えば、外来異物、発がん物質、重金属、環境ホルモンなどの化学物質など）を解毒し得る。また、Ｎｒｆ−２の活性化は、酸化ストレスや生体異物に対する防御能を増大させ、細胞の損傷や中毒を抑制することができる。
【０００９】
大豆サポニンのＰＰＡＲに対する活性化作用は、脂肪細胞の分化誘導、脂肪細胞由来分泌因子であるアディポネクチンの産生増強、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）αの産生抑制、アディポステロイド合成酵素１１βＨＳＤ（hydroxysteroid
dehydrogenase）１の産生抑制、脂肪代謝関連酵素ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＦＡＴＰ(fatty-acid
transport protein)の産生増強、糖代謝関連酵素グリセロールキナーゼ、ＰＥＰＣＫ（phosphoenolpyruvate
carboxykinase）−Ｃの産生増強などを介して、高脂血症、糖尿病、肥満あるいはこれらを複合したメタボリックシンドロームあるいはアルツハイマー症候群の予防、治療に有用である。大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用は、コレステロールの細胞外排出を担うＡＢＣＡ１などのトランスポーターの産生増強、コレステロール逆輸送を担うＡｐｏＥなどのアポリポ蛋白の産生増強、コレステロール逆輸送を担うｐｒｅ−β−ＨＤＬ形成に関与するリポ蛋白再構成蛋白群ＬＰＬ、ＣＥＴＰ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＬＴＰ（Ｐｌａｓｍａ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の産生増強などを介して、動脈硬化の予防、治療に有用である。また、大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用は、一連の炎症に関わる因子ＮＯＳ（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ（シクロオキシゲナーゼ）−２、ＩＬ（インターロイキン）−６などの産生抑制を介して炎症の予防、治療に有用である。
【００１０】
大豆サポニンのＥＲαに対する活性化作用は、単球からの破骨細胞前駆細胞への分化抑制並びに骨芽細胞のＯＤＦ（破骨細胞分化因子）の産生抑制を介して骨粗鬆症の予防、治療に有用である。
【００１１】
更に、上述の核内受容体および／または転写因子に対する大豆サポニンの活性化作用は以下の作用を介して、皮膚機能の改善に有用である。ＰＰＡＲδの活性化作用は架橋酵素トランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）−１、架橋蛋白インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）・ＣＤ３６の産生を増強し、またＰＰＡＲαの活性化作用は表皮セラミドを産生増強し、表皮透過障壁機能の増強による皮膚保湿に有用である。大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用はインボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）の産生増強を介して皮膚保湿に有用であり、またＩＬ−１α・ＴＮＦαの産生抑制を介して、アレルギー性皮膚炎、刺激性皮膚炎の予防、治療に有用である。ＥＲαに対する活性化作用は表皮の脂質、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の産生増強を介して皮膚保湿に有用であり、また、真皮におけるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）やグリコサミノグリカンの産生増強を介して、皮膚の皺の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
本発明における大豆サポニンは、大豆などに含まれる配糖体の一種で、例えば、下記に示されるソーヤサポニンＡ（例えば、アセチルソーヤサポニンＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６など）およびソーヤサポニンＢ（例えば、ソーヤサポニンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ等）などが含まれる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
大豆サポニンは、ソーヤサポニンＡまたはＢを単独で使用してもよく、また２以上を混合して使用してもよい。大豆サポニンは、大豆（好ましくは大豆種子）を公知の方法で抽出することで得ることもできる。抽出方法としては、例えば、まず、大豆を粉砕する工程、溶媒で抽出する工程を含む。粉砕は、公知の方法、例えば粉砕機などで実施できる。溶媒としては、例えば、油脂、ヘキサン、酢酸エチル、アセトンまたはアルコールなどが挙げられる。アルコールは限定されないが、メタノール、エタノールおよびプロパノールを含む。溶媒は、１種でもよく、または２種以上を混合して用いることもできる。溶媒は水を含んでもよい。この場合、含水量は、溶媒に対して約２０容量％未満が好ましい。溶媒抽出に先立ち、公知の方法で脱脂処理をしてもよい。さらに、溶媒抽出に先立ち、粉砕した大豆を水に溶解または懸濁させた後、水溶出画分を例えば吸着剤などを用いて吸着させて水溶出画分を除去してもよい。あるいは、溶媒抽出後、溶媒抽出物を濃縮し、水に溶解または懸濁させた後、水溶出画分を吸着剤に吸着させて水溶出画分を除去してもよい。
【００１５】
溶媒抽出後の抽出液は、溶媒除去することが好ましい。溶媒除去は公知の方法、例えば、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結乾燥などにより実施できる。また、これらの抽出物は、核内受容体活性化促進作用を失わない範囲内で脱臭、精製などの操作を加えることが出来る。溶媒除去した抽出物は、そのまま、または適切な溶媒や担体で希釈などして用いることができる。
【００１６】
核内受容体としては、ＰＰＡＲα、
δ、 γ、ＬＸＲα、 β 、ＦＸＲ（ファーネソイドＸ受容体）、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）γ、ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）α、ＥＲα、 ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＴＲ（甲状腺ホルモン受容体）α、ＴまたはＰＸＲ（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などが挙げられる。
転写因子としては、例えばＮｒｆ−２などが好ましく挙げられる。Ｎｒｆ−２は、ＣＮＣファミリーに属する核内転写因子である。Ｎｒｆ−２の活性化は、第二相酵素群の発現増加やグルタチオン量増加をもたらし、酸化ストレスや生体異物に対する防御能を増大させることができる。このため、本発明に係る活性化促進剤は、生体内の酸化ストレスによる細胞の損傷を抑制することができ、生体内に取り込まれた生体異物（例えば、外来異物、発がん物質、環境ホルモンなど）を解毒し得る。
【００１７】
また、Ｎｒｆ−２の活性化は、例えば、高血圧、抗炎症、脳神経変性疾患、眼疾患、皮膚疾患、喘息、発がんなどを治療、予防、改善、状態の緩和、またはその進行を遅延することができることが報告されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，１０１，７０９４−７０９９（２００４）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７，３８８−９４（２００２）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１，６９−７７ （１９９８）；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．，２７３，１０９−１２（１９９９）；Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．，４３，１１６２−７（２００２）；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３，６５−７３，（２００４）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３，３４６７−３４８１（２００４）；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８０（４），２６９−２７８（２００７）など）。本発明に係る活性化促進剤は、これら疾患または病態の治療、予防、改善、状態の緩和、またはその進行の遅延に有用である。本発明における「予防」または「改善」には、完全な予防効果または改善効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００１８】
核内受容体の活性化作用は、核内受容体リガンド結合領域に対する結合に基づく活性化作用を、リガンド結合領域と、例えば、ＧＡＬ４などのＤＮＡ結合領域との融合タンパクを利用して、ＧＡＬ４結合、ＤＮＡ配列下流に配置したルシフェラーゼ遺伝子の発現で評価するレポーター・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８０３〜８１２頁）や、核内受容体結合領域を含むタンパクを用いたコンペティション・バインディング・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８１３〜８１９頁）などにより測定することができる。
【００１９】
本発明に係る活性化促進剤は、生理学的に許容される添加物、例えば、担体、賦形剤、あるいは希釈剤などと混合し、組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口用組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤あるいは懸濁剤などの剤型とすることができる。非経口用組成物としては、外用薬剤などの剤型を選択することができる。外用薬剤としては、経鼻投与剤、軟膏剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはパップ剤などを挙げることができる。上記剤型は、公知の製剤技術などを使用して製造できる。
【００２０】
例えば、経口投与用の錠剤は、賦形剤、崩壊剤、結合剤および滑沢剤などを加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンあるいはマンニトールなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロースあるいはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００２１】
錠剤は、マスキングや腸溶性製剤とするために、白糖などによる糖衣や公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、例えば、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートなどを用いることができる。
【００２２】
上記組成物の形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）や健康食品などの飲食品、医薬品、医薬部外品などとして用いることが出来る。組成物は、例えば、飲食用もしくは動物用が含まれる。
該組成物は、「予防剤」、「改善剤」、「飲食用組成物」、「飲料」、「食品」または「飼料」などと表記することもできる。
【００２３】
本発明に係る活性化促進剤の投与量は、投与方法、病状、患者の年齢などによって変化し得るが、大人では、通常、固形分換算して１日当たり約０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは約１〜２００ｍｇ程度である。
【００２４】
また、本発明に係る活性化促進剤は、種々の形態の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品などあらゆる食品に適宜配合することができる。
【００２５】
本発明の飲食品としては、例えば、飲料が好ましく挙げられる。飲料としては、茶系飲料、清涼飲料、果実飲料、野菜飲料、発泡性飲料、乳飲料、乳酸菌飲料またはアルコール性飲料などを挙げることができる。また、本発明の飲食品としては、液状、固形状、粉末状の嗜好飲料類、調味料および香辛料類、もしくは調理加工食品、および、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などを挙げることができる。本発明に係る活性化剤を含む飲食品は、上述の各種疾患、症状または病態を予防または改善し得る。
【００２６】
飲食品には、その種類に応じて種々の添加物を配合することができる。添加物としては、食品衛生上許容される成分であれば特に制限されず、例えば、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、還元型アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、還元型グルタチン、トコトリエノール、カロチン、カロチノイド、リコピン、カテキン、イソフラボン、フラボノイド類、ポリフェノール、コウジ酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ビタミンＤ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸カルシウム、アルブミン、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、イヌリン、オリゴ糖、オルニチン、果糖、Ｌ−カルニチン、還元麦芽糖、乳酸オリゴマー、γ−アミノ酪酸、絹タンパク、グルコマンナン、クレアチン、ゲルマニウム、コエンザイムＱ１０、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、植物繊維、食物繊維、ゼラチン、チオクト酸、デキストリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、乳清、乳糖、ホスファチジルセリン、リノール酸またはリノレン酸などの食品添加物、マグネシウム、亜鉛、クロム、セレン、カリウムなどが挙げられる。
【００２７】
本発明に係る活性化促進剤を飲食品に適用する場合の添加量としては、飲食品に対して、固形分換算して約０．１〜１００質量％であるのが好ましい。
【００２８】
また本発明は、本発明に係る活性化促進剤もしくは上記組成物を個体（例えば、患者など）へ投与する工程を含む、上述の各種疾患の予防または改善方法を提供する。
【００２９】
本発明の予防または改善方法の対象となる個体は、上述の各種疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例において、略語は以下を意味する。
ＰＰＡＲ：ペルオキシソーム増殖剤受容体（peroxisome proliferator-activated receptor）
ＲＸＲ：レチノイドＸ受容体（retinoid X receptor）
ＶＤＲ：ビタミンＤ受容体（Vitamin D Receptor）
ＥＲ：エストロゲン受容体（Estrogen Receptor）
ＴＲ：甲状腺ホルモン受容体（thyroid hormone receptor）
ＦＸＲ：ファーネソイドＸ受容体（Farnesoid X receptor）
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（Doulbecco’s modified Eagle’s Medium）
ＦＢＳ：ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum)
ＣＳ：仔牛血清（Calf Serum)
ｔＢＨＱ：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（tertiary-butyl hydroquinone）
ＩＢＭＸ：3-イソブチル-1-メチルキサンチン（isobutylmethylxanthine）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス(cytomegarovirus)
Ｔ３：３，３’，５−トリヨード-L-チロニン（3,3’,5-triiodo-L-thyronine）
ＶｉｔＤ３：１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（1α,25-dihydroxy-vitamin D3）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid）
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸（ribonucleic acid）
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ(deoxyribonuclease)
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
Ｔｍ：融解温度（melting temperature）
ＡＴＲＡ：全トランス型レチノイン酸（all trans-retinoic acid）
％は、特に明記しない場合は質量％を示す。
【実施例１】
【００３１】
ＰＰＡＲα、δ、 およびγ活性化試験
ＰＰＡＲ α、 δおよびγ活性はＰＰＡＲ α、 δ
またはγ依存的遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。すなわち、サル由来ＣＶ−１細胞を２×１０5細胞／ｗｅｌｌとなるよう、６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）およびＰＰＡＲα、δまたはγのリガンド結合ドメイン（ＰＰＡＲγ−ＬＢＤ）が結合したキメラタンパクの発現プラスミド（ｐＧａｌ４ＤＢＤ／ＰＰＡＲγＬＢＤ）、Ｇａｌ４応答配列（配列番号1：ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ）およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ｐＧ５−Ｌｕｃ）、およびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にＣＭＶプロモーターを連結したコントロールプラスミド（ｐＧＬ４．７５ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を同時に各々１μｇ、０．９μｇ、０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社製）と共に加え、前記培養した細胞にプラスミドを導入した。その後形質転換された細胞をトリプシンによりはがし、細胞をＰＢＳにて洗浄後、９６穴プレートに、１．６×１０4細胞／ｗｅｌｌとなるよう再度播種した。この際、培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。ＰＢＳにて細胞を洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。すなわち細胞溶解液で細胞を溶解し、ルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの発光量を各々測定した。なお、ＰＰＡＲα、 γ およびγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００３２】
ルシフェラーゼ活性＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００３３】
上記に示すＰＰＡＲα、 δ
およびγ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＰＰＡＲα、 δ およびγ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）としてＰＰＡＲα、 δ およびγ夫々に対してＷＹ１４６４３（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＧＷ５０１５１６（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）およびピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ；Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ製）を夫々１００μＭ、１μＭ、および１０μＭとなるよう添加した。
結果を図１に示す。大豆サポニンはＰＰＡＲα、 δ およびγに対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、夫々、コントロールに比して２．７、６．５、９．９倍の活性化作用を示した。なお、各ルシフェラーゼ活性値は、コントロール（ＤＭＳＯ）におけるルシフェラーゼ活性を１とし、それに対する相対値で示す。
【実施例２】
【００３４】
ＬＸＲα, β およびＦＸＲ活性化試験
ＬＸＲα、 βおよびＦＸＲ活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定法と同様にして、ＬＸＲα、 β
およびＦＸＲ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＬＸＲα、β およびＦＸＲ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＬＸＲα、 βおよびＦＸＲ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＬＸＲα、 βに対しては、Ｔ０９０１３１７（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を１μＭとなるように、ＦＸＲに対してはＧＷ４０６４（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を０．１μＭとなるように添加した。
探索の結果、図２に示すように、大豆サポニンはコレステロール代謝に関与する核内受容体の中、ＦＸＲに対しては無作用であるが、ＬＸＲαおよびδに対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、夫々、コントロールに比して５．２および２．９倍の活性化作用を示した。
【実施例３】
【００３５】
ＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化試験
ＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定と同様にして、ＲＡＲγおよびＲＸＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＲＡＲγおよびＲＸＲα依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＲＡＲγおよびＲＸＲαに対して、ＡＴＲＡ（和光純薬工業株式会社製）および９シスレチノイン酸（９ｃｉｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ；フナコシ薬品株式会社製）を夫々０．１μＭとなるよう添加した。
図３に示すように、大豆サポニンはレチノイド系核内受容体ＲＡＲγおよびＲＸＲαに対して活性化作用を示さなかった。
【実施例４】
【００３６】
ＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化試験
ＥＲα、 ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＴＲαおよびＴＲβ活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定と同様にして、ＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＥＲα、
ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＥＲα、 ＶＤＲおよびＴＲα、 ＴＲβに対して、β−エストラジオール（β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ；和光純薬工業株式会社製）、ＶｉｔＤ３（フナコシ薬品株式会社製）、Ｔ３（Ｓｉｇｍａ社製）を夫々１μＭ、０．１μＭおよび１μＭとなるよう添加した。
図４に示すように、大豆サポニンはホルモン関連核内受容体の中、ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβに対しては作用を示さなかったが、ＥＲα に対しては濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、コントロールに比して２０．１倍の活性化作用を示した。
【実施例５】
【００３７】
ＰＸＲおよびＮｒｆ−２活性化試験
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞を８×１０５／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。ＰＸＲの標的遺伝子の１つであるＣＹＰ３Ａ４のプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ＣＹＰ３Ａ４−Ｌｕｃ）、またＮｒｆ−２の標的遺伝子の１つであるＧＳＴＡ２のプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを構築し（ＧＳＴＡ２−Ｌｕｃ）、内部標準プラスミドｐＧＬ４．７３ｈＲｌｕｃ−ＳＶ４０と同時に各々１．９μｇ、０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社製）と共に加え、ＨｅｐＧ２細胞内に上記プラスミドを導入した。その後形質転換された細胞をトリプシンによりはがし、９６穴プレートに２×１０４／ｗｅｌｌとなるよう再度播種した。以後の操作はＰＰＡＲ活性化試験と同様に行った。
【００３８】
上述の活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＰＸＲおよびＮｒｆ−２依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＰＸＲおよびＮｒｆ−２に対して、リファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ；和光純薬工業株式会社製）、ｔＢＨＱ（和光純薬工業株式会社製）を用い、夫々２５μＭ、２０μＭとなるよう培地に添加した。
【００３９】
図５に示すように、大豆サポニンは解毒系の核内受容体および転写因子に対して、ＰＸＲには無作用であったが、Ｎｒｆ−２に対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、コントロールに比して９．２倍の活性化作用を示した。
【実施例６】
【００４０】
アセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用評価試験
アセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用評価試験には、マウス肝臓由来ＡＭＬ１２細胞を用いた。ＡＭＬ１２細胞を２×１０5／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＨＡＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（フェノールレッド無添加、活性炭処理１０％ＦＢＳを含む。）に交換した。被験物質（大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製））は各々終濃度０．０２％、０．０５％、０．２％となるように培地に添加した。またＰＰＡＲ−α活性化剤の陽性対照としてフェノフィブリン酸（Ｆｅｎｏｆｉｂｒｉｃ ａｃｉｄ；２００μＭ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）をＤＭＳＯに終濃度０．２％となるように添加した。４８時間培養後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、回収した。
【００４１】
回収した細胞からのトータルＲＮＡの抽出はＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ社製）のプロトコルに従って行った。調製後、ＤＮａｓｅ処理により混入したゲノムＤＮＡを分解した。ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔにより不活化した。
トータルＲＮＡは０．２μｇ／μＬ濃度に調製し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）のプロトコルにしたがって逆転写反応を行った。プライマーはｏｌｉｇｏ ｄＴを使用した。この操作により、１００ｎｇ／μＬ濃度のｃＤＮＡを得た。
大豆サポニンのＰＰＡＲα標的遺伝子であるマウスアシルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）のｍＲＮＡ合成増強作用は、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。１００ｎｇのｃＤＮＡにプライマー（５μＭ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加え、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて反応を行った。アニール温度はプライマーのＴｍ値に設定した。内部標準としてマウスＧＡＰＤＨの発現も同時に測定し、補正値をグラフ化した。
図６に示すように、大豆サポニンは濃度依存的にマウスＡＣＳのｍＲＮＡ合成を増強し、０．２％において対照の１０．４倍の増強作用を示した。
【実施例７】
【００４２】
前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導作用
マウス前駆脂肪細胞由来３Ｔ３−Ｌ１細胞株を６０ｍｍ培養皿に播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＣＳを含む。）中で３日培養した。培養液をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）に交換し、さらに２日培養した。その後分化誘導培地［ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ、５０μＭ ＩＢＭＸ、２μＭインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、１μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）を含む。］に交換し、２日間培養した。さらに培養液を大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）０．０１％および０．０５％を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに交換し、２日間培養した。培養後、この日を０日目とし、２、４、６日目に各被験物質を新たに培地に添加した。８日目に分化誘導した細胞を回収し、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を用いて脂肪滴の量を蛍光強度としてプレートリーダー（ＡＲＶＯ ＭＸ社製）にて測定した。陽性対照として、ピオグリタゾン（１０μＭ）を用いた。また本試験は各被験物質につき２点行い、その平均値をグラフ化した。
図７に示すように、大豆サポニンは濃度依存的に、脂肪細胞の分化誘導能を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、大豆サポニンのＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγの活性化作用を示す図である。
【図２】図２は、大豆サポニンのＬＸＲα、 β およびＦＸＲ活性化作用を示す図である。
【図３】図３は、大豆サポニンのＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化作用を示す図である。
【図４】図４は、大豆サポニンのＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化作用を示す図である。
【図５】図５は、大豆サポニンのＰＸＲおよびＮｒｆ−２活性化作用を示す図である。
【図６】図６は、大豆サポニンのアセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用を示す図である。
【図７】図７は、大豆サポニンの前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化作用を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体および／または転写因子の活性化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆はアジア原産の植物であり、古来より種々の機能性が報告されているが、その機能性成分については、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ダイズイン（ｄａｉｄｚｉｎ）などのイソフラボンおよびイソフラボン配糖体とともに大豆サポニンが主要な成分として知られている。大豆サポニンはオレアナン型トリテルペンサポニンであるソーヤサポニン（ｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ）Ｉ〜Ｖ、とアセチルソーヤサポニン（ａｃｅｔｙｌｓｏｙａｓａｐｏｎｉｎ）Ａ１〜Ａ６などから構成されている。
大豆サポニンの薬理作用に関しては、血清脂質改善作用、肥満抑制作用、脂質酸化抑制などの抗酸化作用、肝保護作用、免疫増強活性、殺虫作用などが従来報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、近年、抗癌作用［アポトーシス誘導、シアリルトランスフェラーゼ阻害による癌転移抑制、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）阻害によるシグナル伝達阻止などの機序に基づく］、抗ウイルス活性（ＨＩＶ、ヘルペス）、抗アレルギー作用、皮膚機能改善作用［コラーゲン、ラミニン産生促進、ＨＳＰ（熱ストレス蛋白質）３２合成刺激による皮膚抗酸化増強等］などが報告されている（例えば、特許文献２〜４参照。）。また、肥満抑制作用の機序としてアディポネクチン分泌促進作用の報告もされている（特許文献５参照。）。大豆サポニンは、此処に示すように、高脂血症、肥満などの生活習慣病を始めとして、広範な疾患に対する予防、治療効果が報告されているが、その薬理作用の作用点は必ずしも全面的に解明されているわけでは無い。
【０００３】
疾患の予防、治療剤はその作用機序が解明されることにより、その薬理作用の明解な理解が得られ、薬剤の適切な予防、治療への応用が図られると考えられる。この点において、大豆サポニンの作用機序の解明は現状、極めて不十分なところで留まっている。
【特許文献１】特開平０６−３１１８６７号公報
【特許文献２】特開２００６−１６９１８６号公報
【特許文献３】特開２００７−１９７３９８号公報
【特許文献４】特開２００６−２１３６４９号公報
【特許文献５】特開２００６−１４３６０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、大豆サポニンの作用点を解明し、作用機序から演繹される大豆サポニンの適切な予防、治療の対象となる疾患を特定し、大豆サポニンあるいは大豆サポニンを含有する食品を特定された疾患の予防、治療を目的として利用することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
大豆サポニンについて既に散発的に知られている薬理作用の多くが、近年解明されてきている核内受容体の薬理作用と共通する。しかしながら、現在まで、大豆サポニンの核内受容体のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（以下、ＰＰＡＲと略記する。）に対する作用の検討については、既に報告されているが、まだ十分とはいえない。我々は生活習慣病に関連する他の核内受容体並びに転写因子を主にして、大豆サポニンの核内受容体に対する活性化作用を検討した。その結果、大豆サポニンは複数の核内受容体並びに転写因子に対して活性化を促進することを明らかにすることが出来た。さらに、本発明者らは、研究を重ね、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤、
［２］核内受容体が、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）から選択される少なくとも１の受容体である前記［１］に記載の活性化促進剤、
［３］転写因子が、Ｎｒｆ−２である、前記［１］に記載の活性化促進剤、
［４］ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγから選択される少なくとも１である前記［２］に記載の活性化促進剤、
［５］ＬＸＲが、ＬＸＲαまたはＬＸＲβである前記［２］に記載の活性化促進剤、
［６］ＥＲが、ＥＲαである前記［２］に記載の活性化促進剤、
［７］サポニンが、大豆サポニンである前記［１］〜［６］のいずれかに記載の活性化促進剤。
［８］メタボリックシンドロームの予防、治療用である前記［１］、［２］、［４］、［７］のいずれかに記載の剤、
［９］アルツハイマー症候群の予防、治療用である前記［１］、［２］、［４］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１０］炎症の予防、治療用である前記［１］、［２］、［５］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１１］骨粗鬆症の予防、治療用である前記［１］、［２］、［６］、［７］のいずれかに記載の剤、
［１２］酸化ストレスまたは生体異物の解毒用である前記［１］、［３］、［７］のいずれかに記載の剤、および
［１３］食品の形態である前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明において、大豆サポニンが示した作用は、既知の薬理作用を説明することが出来るものであると共に、従来知られていない薬理作用も推定させるものであり、本知見は、既知の薬理作用についても、本作用点を介しての作用であることを踏まえて、より適切な大豆サポニンの使用法を促すものであり、また同時に、新たな疾患への利用を可能にするものである。
【０００８】
大豆サポニンの作用は、脂質代謝、糖代謝を制御するＰＰＡＲのすべてのサブタイプα、δ、γに対する活性化、コレステロール代謝の制御に関与するＬＸＲα、βに対する活性化、ホルモン作用を示すＥＲαに対する活性化、更に抗酸化ストレスや解毒誘導作用を有するＮｒｆ−２に対する活性化を含む。特に、Ｎｒｆ−２の活性化は、第二相解毒酵素群の発現およびメタロチオネインなどの解毒蛋白の産生を誘導できるので、生体内に取り込まれた生体異物（例えば、外来異物、発がん物質、重金属、環境ホルモンなどの化学物質など）を解毒し得る。また、Ｎｒｆ−２の活性化は、酸化ストレスや生体異物に対する防御能を増大させ、細胞の損傷や中毒を抑制することができる。
【０００９】
大豆サポニンのＰＰＡＲに対する活性化作用は、脂肪細胞の分化誘導、脂肪細胞由来分泌因子であるアディポネクチンの産生増強、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）αの産生抑制、アディポステロイド合成酵素１１βＨＳＤ（hydroxysteroid
dehydrogenase）１の産生抑制、脂肪代謝関連酵素ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＦＡＴＰ(fatty-acid
transport protein)の産生増強、糖代謝関連酵素グリセロールキナーゼ、ＰＥＰＣＫ（phosphoenolpyruvate
carboxykinase）−Ｃの産生増強などを介して、高脂血症、糖尿病、肥満あるいはこれらを複合したメタボリックシンドロームあるいはアルツハイマー症候群の予防、治療に有用である。大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用は、コレステロールの細胞外排出を担うＡＢＣＡ１などのトランスポーターの産生増強、コレステロール逆輸送を担うＡｐｏＥなどのアポリポ蛋白の産生増強、コレステロール逆輸送を担うｐｒｅ−β−ＨＤＬ形成に関与するリポ蛋白再構成蛋白群ＬＰＬ、ＣＥＴＰ（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＬＴＰ（Ｐｌａｓｍａ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の産生増強などを介して、動脈硬化の予防、治療に有用である。また、大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用は、一連の炎症に関わる因子ＮＯＳ（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＣＯＸ（シクロオキシゲナーゼ）−２、ＩＬ（インターロイキン）−６などの産生抑制を介して炎症の予防、治療に有用である。
【００１０】
大豆サポニンのＥＲαに対する活性化作用は、単球からの破骨細胞前駆細胞への分化抑制並びに骨芽細胞のＯＤＦ（破骨細胞分化因子）の産生抑制を介して骨粗鬆症の予防、治療に有用である。
【００１１】
更に、上述の核内受容体および／または転写因子に対する大豆サポニンの活性化作用は以下の作用を介して、皮膚機能の改善に有用である。ＰＰＡＲδの活性化作用は架橋酵素トランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）−１、架橋蛋白インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）・ＣＤ３６の産生を増強し、またＰＰＡＲαの活性化作用は表皮セラミドを産生増強し、表皮透過障壁機能の増強による皮膚保湿に有用である。大豆サポニンのＬＸＲα、 βに対する活性化作用はインボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）の産生増強を介して皮膚保湿に有用であり、またＩＬ−１α・ＴＮＦαの産生抑制を介して、アレルギー性皮膚炎、刺激性皮膚炎の予防、治療に有用である。ＥＲαに対する活性化作用は表皮の脂質、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）の産生増強を介して皮膚保湿に有用であり、また、真皮におけるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）やグリコサミノグリカンの産生増強を介して、皮膚の皺の改善に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
本発明における大豆サポニンは、大豆などに含まれる配糖体の一種で、例えば、下記に示されるソーヤサポニンＡ（例えば、アセチルソーヤサポニンＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６など）およびソーヤサポニンＢ（例えば、ソーヤサポニンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ等）などが含まれる。
【００１３】
【化１】
【００１４】
大豆サポニンは、ソーヤサポニンＡまたはＢを単独で使用してもよく、また２以上を混合して使用してもよい。大豆サポニンは、大豆（好ましくは大豆種子）を公知の方法で抽出することで得ることもできる。抽出方法としては、例えば、まず、大豆を粉砕する工程、溶媒で抽出する工程を含む。粉砕は、公知の方法、例えば粉砕機などで実施できる。溶媒としては、例えば、油脂、ヘキサン、酢酸エチル、アセトンまたはアルコールなどが挙げられる。アルコールは限定されないが、メタノール、エタノールおよびプロパノールを含む。溶媒は、１種でもよく、または２種以上を混合して用いることもできる。溶媒は水を含んでもよい。この場合、含水量は、溶媒に対して約２０容量％未満が好ましい。溶媒抽出に先立ち、公知の方法で脱脂処理をしてもよい。さらに、溶媒抽出に先立ち、粉砕した大豆を水に溶解または懸濁させた後、水溶出画分を例えば吸着剤などを用いて吸着させて水溶出画分を除去してもよい。あるいは、溶媒抽出後、溶媒抽出物を濃縮し、水に溶解または懸濁させた後、水溶出画分を吸着剤に吸着させて水溶出画分を除去してもよい。
【００１５】
溶媒抽出後の抽出液は、溶媒除去することが好ましい。溶媒除去は公知の方法、例えば、加熱濃縮、減圧濃縮、凍結乾燥などにより実施できる。また、これらの抽出物は、核内受容体活性化促進作用を失わない範囲内で脱臭、精製などの操作を加えることが出来る。溶媒除去した抽出物は、そのまま、または適切な溶媒や担体で希釈などして用いることができる。
【００１６】
核内受容体としては、ＰＰＡＲα、
δ、 γ、ＬＸＲα、 β 、ＦＸＲ（ファーネソイドＸ受容体）、ＲＡＲ（レチノイン酸受容体）γ、ＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）α、ＥＲα、 ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＴＲ（甲状腺ホルモン受容体）α、ＴまたはＰＸＲ（Ｐｒｅｇｎａｎｅ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などが挙げられる。
転写因子としては、例えばＮｒｆ−２などが好ましく挙げられる。Ｎｒｆ−２は、ＣＮＣファミリーに属する核内転写因子である。Ｎｒｆ−２の活性化は、第二相酵素群の発現増加やグルタチオン量増加をもたらし、酸化ストレスや生体異物に対する防御能を増大させることができる。このため、本発明に係る活性化促進剤は、生体内の酸化ストレスによる細胞の損傷を抑制することができ、生体内に取り込まれた生体異物（例えば、外来異物、発がん物質、環境ホルモンなど）を解毒し得る。
【００１７】
また、Ｎｒｆ−２の活性化は、例えば、高血圧、抗炎症、脳神経変性疾患、眼疾患、皮膚疾患、喘息、発がんなどを治療、予防、改善、状態の緩和、またはその進行を遅延することができることが報告されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，１０１，７０９４−７０９９（２００４）；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２７７，３８８−９４（２００２）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７１，６９−７７ （１９９８）；Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．，２７３，１０９−１２（１９９９）；Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．，４３，１１６２−７（２００２）；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３，６５−７３，（２００４）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３，３４６７−３４８１（２００４）；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８０（４），２６９−２７８（２００７）など）。本発明に係る活性化促進剤は、これら疾患または病態の治療、予防、改善、状態の緩和、またはその進行の遅延に有用である。本発明における「予防」または「改善」には、完全な予防効果または改善効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００１８】
核内受容体の活性化作用は、核内受容体リガンド結合領域に対する結合に基づく活性化作用を、リガンド結合領域と、例えば、ＧＡＬ４などのＤＮＡ結合領域との融合タンパクを利用して、ＧＡＬ４結合、ＤＮＡ配列下流に配置したルシフェラーゼ遺伝子の発現で評価するレポーター・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８０３〜８１２頁）や、核内受容体結合領域を含むタンパクを用いたコンペティション・バインディング・アッセイ（Ｃｅｌｌ，１９９５年，８３巻，８１３〜８１９頁）などにより測定することができる。
【００１９】
本発明に係る活性化促進剤は、生理学的に許容される添加物、例えば、担体、賦形剤、あるいは希釈剤などと混合し、組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口用組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤あるいは懸濁剤などの剤型とすることができる。非経口用組成物としては、外用薬剤などの剤型を選択することができる。外用薬剤としては、経鼻投与剤、軟膏剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤またはパップ剤などを挙げることができる。上記剤型は、公知の製剤技術などを使用して製造できる。
【００２０】
例えば、経口投与用の錠剤は、賦形剤、崩壊剤、結合剤および滑沢剤などを加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンあるいはマンニトールなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウムなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロースあるいはポリビニルピロリドンなどが挙げられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００２１】
錠剤は、マスキングや腸溶性製剤とするために、白糖などによる糖衣や公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、例えば、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネートなどを用いることができる。
【００２２】
上記組成物の形態は限定されず、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）や健康食品などの飲食品、医薬品、医薬部外品などとして用いることが出来る。組成物は、例えば、飲食用もしくは動物用が含まれる。
該組成物は、「予防剤」、「改善剤」、「飲食用組成物」、「飲料」、「食品」または「飼料」などと表記することもできる。
【００２３】
本発明に係る活性化促進剤の投与量は、投与方法、病状、患者の年齢などによって変化し得るが、大人では、通常、固形分換算して１日当たり約０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは約１〜２００ｍｇ程度である。
【００２４】
また、本発明に係る活性化促進剤は、種々の形態の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品などあらゆる食品に適宜配合することができる。
【００２５】
本発明の飲食品としては、例えば、飲料が好ましく挙げられる。飲料としては、茶系飲料、清涼飲料、果実飲料、野菜飲料、発泡性飲料、乳飲料、乳酸菌飲料またはアルコール性飲料などを挙げることができる。また、本発明の飲食品としては、液状、固形状、粉末状の嗜好飲料類、調味料および香辛料類、もしくは調理加工食品、および、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品などを挙げることができる。本発明に係る活性化剤を含む飲食品は、上述の各種疾患、症状または病態を予防または改善し得る。
【００２６】
飲食品には、その種類に応じて種々の添加物を配合することができる。添加物としては、食品衛生上許容される成分であれば特に制限されず、例えば、ブドウ糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、還元型アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ビタミンＥ、還元型グルタチン、トコトリエノール、カロチン、カロチノイド、リコピン、カテキン、イソフラボン、フラボノイド類、ポリフェノール、コウジ酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ビタミンＤ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸カルシウム、アルブミン、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、イヌリン、オリゴ糖、オルニチン、果糖、Ｌ−カルニチン、還元麦芽糖、乳酸オリゴマー、γ−アミノ酪酸、絹タンパク、グルコマンナン、クレアチン、ゲルマニウム、コエンザイムＱ１０、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、植物繊維、食物繊維、ゼラチン、チオクト酸、デキストリン、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、乳清、乳糖、ホスファチジルセリン、リノール酸またはリノレン酸などの食品添加物、マグネシウム、亜鉛、クロム、セレン、カリウムなどが挙げられる。
【００２７】
本発明に係る活性化促進剤を飲食品に適用する場合の添加量としては、飲食品に対して、固形分換算して約０．１〜１００質量％であるのが好ましい。
【００２８】
また本発明は、本発明に係る活性化促進剤もしくは上記組成物を個体（例えば、患者など）へ投与する工程を含む、上述の各種疾患の予防または改善方法を提供する。
【００２９】
本発明の予防または改善方法の対象となる個体は、上述の各種疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例において、略語は以下を意味する。
ＰＰＡＲ：ペルオキシソーム増殖剤受容体（peroxisome proliferator-activated receptor）
ＲＸＲ：レチノイドＸ受容体（retinoid X receptor）
ＶＤＲ：ビタミンＤ受容体（Vitamin D Receptor）
ＥＲ：エストロゲン受容体（Estrogen Receptor）
ＴＲ：甲状腺ホルモン受容体（thyroid hormone receptor）
ＦＸＲ：ファーネソイドＸ受容体（Farnesoid X receptor）
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（Doulbecco’s modified Eagle’s Medium）
ＦＢＳ：ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum)
ＣＳ：仔牛血清（Calf Serum)
ｔＢＨＱ：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（tertiary-butyl hydroquinone）
ＩＢＭＸ：3-イソブチル-1-メチルキサンチン（isobutylmethylxanthine）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス(cytomegarovirus)
Ｔ３：３，３’，５−トリヨード-L-チロニン（3,3’,5-triiodo-L-thyronine）
ＶｉｔＤ３：１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（1α,25-dihydroxy-vitamin D3）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸（Deoxyribonucleic acid）
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸（ribonucleic acid）
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
ＤＮａｓｅ：デオキシリボヌクレアーゼ(deoxyribonuclease)
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction）
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）
Ｔｍ：融解温度（melting temperature）
ＡＴＲＡ：全トランス型レチノイン酸（all trans-retinoic acid）
％は、特に明記しない場合は質量％を示す。
【実施例１】
【００３１】
ＰＰＡＲα、δ、 およびγ活性化試験
ＰＰＡＲ α、 δおよびγ活性はＰＰＡＲ α、 δ
またはγ依存的遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。すなわち、サル由来ＣＶ−１細胞を２×１０5細胞／ｗｅｌｌとなるよう、６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＤＢＤ）およびＰＰＡＲα、δまたはγのリガンド結合ドメイン（ＰＰＡＲγ−ＬＢＤ）が結合したキメラタンパクの発現プラスミド（ｐＧａｌ４ＤＢＤ／ＰＰＡＲγＬＢＤ）、Ｇａｌ４応答配列（配列番号1：ＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ）およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ｐＧ５−Ｌｕｃ）、およびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にＣＭＶプロモーターを連結したコントロールプラスミド（ｐＧＬ４．７５ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を同時に各々１μｇ、０．９μｇ、０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社製）と共に加え、前記培養した細胞にプラスミドを導入した。その後形質転換された細胞をトリプシンによりはがし、細胞をＰＢＳにて洗浄後、９６穴プレートに、１．６×１０4細胞／ｗｅｌｌとなるよう再度播種した。この際、培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。ＰＢＳにて細胞を洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。すなわち細胞溶解液で細胞を溶解し、ルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの発光量を各々測定した。なお、ＰＰＡＲα、 γ およびγ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
【００３２】
ルシフェラーゼ活性＝（ｐＧ５−Ｌｕｃによるホタルルシフェラーゼ活性）／（ｈＲｌｕｃ−ＣＭＶによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００３３】
上記に示すＰＰＡＲα、 δ
およびγ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＰＰＡＲα、 δ およびγ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）としてＰＰＡＲα、 δ およびγ夫々に対してＷＹ１４６４３（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＧＷ５０１５１６（Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）およびピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ；Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ製）を夫々１００μＭ、１μＭ、および１０μＭとなるよう添加した。
結果を図１に示す。大豆サポニンはＰＰＡＲα、 δ およびγに対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、夫々、コントロールに比して２．７、６．５、９．９倍の活性化作用を示した。なお、各ルシフェラーゼ活性値は、コントロール（ＤＭＳＯ）におけるルシフェラーゼ活性を１とし、それに対する相対値で示す。
【実施例２】
【００３４】
ＬＸＲα, β およびＦＸＲ活性化試験
ＬＸＲα、 βおよびＦＸＲ活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定法と同様にして、ＬＸＲα、 β
およびＦＸＲ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＬＸＲα、β およびＦＸＲ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＬＸＲα、 βおよびＦＸＲ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＬＸＲα、 βに対しては、Ｔ０９０１３１７（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を１μＭとなるように、ＦＸＲに対してはＧＷ４０６４（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を０．１μＭとなるように添加した。
探索の結果、図２に示すように、大豆サポニンはコレステロール代謝に関与する核内受容体の中、ＦＸＲに対しては無作用であるが、ＬＸＲαおよびδに対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、夫々、コントロールに比して５．２および２．９倍の活性化作用を示した。
【実施例３】
【００３５】
ＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化試験
ＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定と同様にして、ＲＡＲγおよびＲＸＲα依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＲＡＲγおよびＲＸＲα依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＲＡＲγおよびＲＸＲαに対して、ＡＴＲＡ（和光純薬工業株式会社製）および９シスレチノイン酸（９ｃｉｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ；フナコシ薬品株式会社製）を夫々０．１μＭとなるよう添加した。
図３に示すように、大豆サポニンはレチノイド系核内受容体ＲＡＲγおよびＲＸＲαに対して活性化作用を示さなかった。
【実施例４】
【００３６】
ＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化試験
ＥＲα、 ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）、ＴＲαおよびＴＲβ活性化は実施例１に記載したＰＰＡＲ 活性化試験の測定と同様にして、ＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性）を指標に検討した。
上述のＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＥＲα、
ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＥＲα、 ＶＤＲおよびＴＲα、 ＴＲβに対して、β−エストラジオール（β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ；和光純薬工業株式会社製）、ＶｉｔＤ３（フナコシ薬品株式会社製）、Ｔ３（Ｓｉｇｍａ社製）を夫々１μＭ、０．１μＭおよび１μＭとなるよう添加した。
図４に示すように、大豆サポニンはホルモン関連核内受容体の中、ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβに対しては作用を示さなかったが、ＥＲα に対しては濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、コントロールに比して２０．１倍の活性化作用を示した。
【実施例５】
【００３７】
ＰＸＲおよびＮｒｆ−２活性化試験
ヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞を８×１０５／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。ＰＸＲの標的遺伝子の１つであるＣＹＰ３Ａ４のプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（ＣＹＰ３Ａ４−Ｌｕｃ）、またＮｒｆ−２の標的遺伝子の１つであるＧＳＴＡ２のプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを構築し（ＧＳＴＡ２−Ｌｕｃ）、内部標準プラスミドｐＧＬ４．７３ｈＲｌｕｃ−ＳＶ４０と同時に各々１．９μｇ、０．１μｇ／ｗｅｌｌとなるようトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ；Ｒｏｃｈｅ社製）と共に加え、ＨｅｐＧ２細胞内に上記プラスミドを導入した。その後形質転換された細胞をトリプシンによりはがし、９６穴プレートに２×１０４／ｗｅｌｌとなるよう再度播種した。以後の操作はＰＰＡＲ活性化試験と同様に行った。
【００３８】
上述の活性化試験を用い、大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）添加時のＰＸＲおよびＮｒｆ−２依存的なルシフェラーゼ活性を測定した。大豆サポニンはＤＭＳＯに１００ｍＭの濃度で溶解したものを１０、２０、５０、１００μＭの濃度となるよう培地に添加した。コントロール（ネガティブコントロール）として０．３３％ＤＭＳＯを添加した。また陽性対照（ポジティブコントロール）として、ＰＸＲおよびＮｒｆ−２に対して、リファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ；和光純薬工業株式会社製）、ｔＢＨＱ（和光純薬工業株式会社製）を用い、夫々２５μＭ、２０μＭとなるよう培地に添加した。
【００３９】
図５に示すように、大豆サポニンは解毒系の核内受容体および転写因子に対して、ＰＸＲには無作用であったが、Ｎｒｆ−２に対して濃度依存的な活性化作用を示し、大豆サポニン０．５％存在下では、コントロールに比して９．２倍の活性化作用を示した。
【実施例６】
【００４０】
アセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用評価試験
アセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用評価試験には、マウス肝臓由来ＡＭＬ１２細胞を用いた。ＡＭＬ１２細胞を２×１０5／ｗｅｌｌとなるよう６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＨＡＭ（１０％ＦＢＳを含む。）中で１日培養した。培養液を、被験物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（フェノールレッド無添加、活性炭処理１０％ＦＢＳを含む。）に交換した。被験物質（大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製））は各々終濃度０．０２％、０．０５％、０．２％となるように培地に添加した。またＰＰＡＲ−α活性化剤の陽性対照としてフェノフィブリン酸（Ｆｅｎｏｆｉｂｒｉｃ ａｃｉｄ；２００μＭ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）をＤＭＳＯに終濃度０．２％となるように添加した。４８時間培養後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、回収した。
【００４１】
回収した細胞からのトータルＲＮＡの抽出はＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ社製）のプロトコルに従って行った。調製後、ＤＮａｓｅ処理により混入したゲノムＤＮＡを分解した。ＤＮａｓｅはＤＮａｓｅ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔにより不活化した。
トータルＲＮＡは０．２μｇ／μＬ濃度に調製し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）のプロトコルにしたがって逆転写反応を行った。プライマーはｏｌｉｇｏ ｄＴを使用した。この操作により、１００ｎｇ／μＬ濃度のｃＤＮＡを得た。
大豆サポニンのＰＰＡＲα標的遺伝子であるマウスアシルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）のｍＲＮＡ合成増強作用は、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。１００ｎｇのｃＤＮＡにプライマー（５μＭ）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を加え、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて反応を行った。アニール温度はプライマーのＴｍ値に設定した。内部標準としてマウスＧＡＰＤＨの発現も同時に測定し、補正値をグラフ化した。
図６に示すように、大豆サポニンは濃度依存的にマウスＡＣＳのｍＲＮＡ合成を増強し、０．２％において対照の１０．４倍の増強作用を示した。
【実施例７】
【００４２】
前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導作用
マウス前駆脂肪細胞由来３Ｔ３−Ｌ１細胞株を６０ｍｍ培養皿に播種し、ＤＭＥＭ（１０％ＣＳを含む。）中で３日培養した。培養液をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む。）に交換し、さらに２日培養した。その後分化誘導培地［ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ、５０μＭ ＩＢＭＸ、２μＭインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、１μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）を含む。］に交換し、２日間培養した。さらに培養液を大豆サポニン（株式会社常磐植物化学研究所製）０．０１％および０．０５％を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳに交換し、２日間培養した。培養後、この日を０日目とし、２、４、６日目に各被験物質を新たに培地に添加した。８日目に分化誘導した細胞を回収し、ＡｄｉｐｏＲｅｄ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を用いて脂肪滴の量を蛍光強度としてプレートリーダー（ＡＲＶＯ ＭＸ社製）にて測定した。陽性対照として、ピオグリタゾン（１０μＭ）を用いた。また本試験は各被験物質につき２点行い、その平均値をグラフ化した。
図７に示すように、大豆サポニンは濃度依存的に、脂肪細胞の分化誘導能を有することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、大豆サポニンのＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγの活性化作用を示す図である。
【図２】図２は、大豆サポニンのＬＸＲα、 β およびＦＸＲ活性化作用を示す図である。
【図３】図３は、大豆サポニンのＲＡＲγおよびＲＸＲα活性化作用を示す図である。
【図４】図４は、大豆サポニンのＥＲα、 ＶＤＲ、ＴＲαおよびＴＲβ活性化作用を示す図である。
【図５】図５は、大豆サポニンのＰＸＲおよびＮｒｆ−２活性化作用を示す図である。
【図６】図６は、大豆サポニンのアセチルＣｏＡシンテターゼｍＲＮＡ合成増強作用を示す図である。
【図７】図７は、大豆サポニンの前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化作用を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤。
【請求項２】
核内受容体が、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）から選択される少なくとも１の受容体である請求項1に記載の活性化促進剤。
【請求項３】
転写因子が、Ｎｒｆ−２である、請求項１に記載の活性化促進剤。
【請求項４】
ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγから選択される少なくとも１である請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項５】
ＬＸＲが、ＬＸＲαまたはＬＸＲβである請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項６】
ＥＲが、ＥＲαである請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項７】
サポニンが、大豆サポニンである請求項１〜６のいずれかに記載の活性化促進剤。
【請求項８】
メタボリックシンドロームの予防、治療用である請求項１、２、４、７のいずれかに記載の剤。
【請求項９】
アルツハイマー症候群の予防、治療用である請求項１、２、４、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
炎症の予防、治療用である請求項１、２、５、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１１】
骨粗鬆症の予防、治療用である請求項１、２、６、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１２】
酸化ストレスまたは生体異物の解毒用である請求項１、３、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１３】
食品の形態である請求項１〜１２のいずれかに記載の剤。
【請求項１】
サポニンを含有することを特徴とする核内受容体および／または転写因子活性化促進剤。
【請求項２】
核内受容体が、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）およびエストロゲン受容体（ＥＲ）から選択される少なくとも１の受容体である請求項1に記載の活性化促進剤。
【請求項３】
転写因子が、Ｎｒｆ−２である、請求項１に記載の活性化促進剤。
【請求項４】
ＰＰＡＲが、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδおよびＰＰＡＲγから選択される少なくとも１である請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項５】
ＬＸＲが、ＬＸＲαまたはＬＸＲβである請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項６】
ＥＲが、ＥＲαである請求項２に記載の活性化促進剤。
【請求項７】
サポニンが、大豆サポニンである請求項１〜６のいずれかに記載の活性化促進剤。
【請求項８】
メタボリックシンドロームの予防、治療用である請求項１、２、４、７のいずれかに記載の剤。
【請求項９】
アルツハイマー症候群の予防、治療用である請求項１、２、４、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１０】
炎症の予防、治療用である請求項１、２、５、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１１】
骨粗鬆症の予防、治療用である請求項１、２、６、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１２】
酸化ストレスまたは生体異物の解毒用である請求項１、３、７のいずれかに記載の剤。
【請求項１３】
食品の形態である請求項１〜１２のいずれかに記載の剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１００５４５（Ｐ２０１０−１００５４５Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７１７７１（Ｐ２００８−２７１７７１）
【出願日】平成２０年１０月２２日（２００８．１０．２２）
【出願人】（５０７１８６６８７）株式会社セラバリューズ (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２２日（２００８．１０．２２）
【出願人】（５０７１８６６８７）株式会社セラバリューズ (13)
【Ｆターム（参考）】
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