核酸分析デバイス、核酸分析装置及び核酸分析方法
【課題】核酸プローブを基板上の金属構造体上の蛍光増強場発生領域に特異的に結合させると共に、試料中のターゲット分子とプローブ分子の特異的結合速度を高め、解析の前準備を短時間、低コストで完了させる核酸分析デバイスを提供する。
【解決手段】金属構造体を有する基板への光照射を行うのと同時に、基板を挟む形で配置した２枚の平面電極間に高周波交流電圧を印加する。基板への光照射によって基板上の金属構造体に局在型表面プラズモンを発生させ、高周波交流電圧の印加によって電界分布を作り出すことにより、誘電泳動を利用して強電界が存在する位置、すなわち蛍光増強場へ核酸プローブおよび核酸試料を特異的に誘導する。この効果を利用して、核酸プローブ分子を金属構造体上の特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に結合させると共に、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を増加させる。
【解決手段】金属構造体を有する基板への光照射を行うのと同時に、基板を挟む形で配置した２枚の平面電極間に高周波交流電圧を印加する。基板への光照射によって基板上の金属構造体に局在型表面プラズモンを発生させ、高周波交流電圧の印加によって電界分布を作り出すことにより、誘電泳動を利用して強電界が存在する位置、すなわち蛍光増強場へ核酸プローブおよび核酸試料を特異的に誘導する。この効果を利用して、核酸プローブ分子を金属構造体上の特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に結合させると共に、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を増加させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析デバイス、核酸分析装置及び核酸分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を分析する技術として、ＤＮＡ（DeoxyriboNucleic Acid）やＲＮＡ（RiboNucleic Acid）の塩基配列を決定する新規技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した塩基配列決定方法においては、あらかじめ配列決定用のＤＮＡ断片またはＲＮＡサンプルから逆転写反応により合成したｃＤＮＡ断片を調整し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後電気泳動を行い、分量分析展開パターンを計測することにより配列解析を行っている。
【０００４】
これに対し、近年、例えば非特許文献１に開示されているように、基板にＤＮＡ等を固定し、その塩基配列を決定する方法が提案されている。この方法では、基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、１分子ずつ伸長させ、その結果を蛍光計測で検出することにより、塩基配列を決定する。具体的には、（１）ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれ、その後のＤＮＡ伸長反応を保護基の存在により停止することが可能で、かつ標識を有する４種類のｄＮＴＰ誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行う工程、（２）取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、および、（３）ＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。この方法では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定できるため、同時に多数の断片の解析が可能であり、解析スループットを高めることができる。さらにこの方法では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来の方法で問題となるクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製、増幅工程が不要となるため、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
また、近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ゲノミクス、進化の研究、法医学、その他の分野において、広範囲に活用され始めている。
【０００６】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多様のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。ハイブリダイゼーションの検出は、一般には試料中のヌクレオチド鎖の蛍光標識を検出することにより行われる。
【０００７】
ハイブリダイゼーションの検出精度を改善するため、基板へのゴミ、蛍光分子等の非特異吸着により生じるバックグラウンドノイズを低減するため、種々のアプローチが提案されている。
【０００８】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003，Vol.100，pp. 3960-3964
【非特許文献２】J.Chem.Phys.2004, Vol.120, pp. 357-366
【非特許文献３】BUNSEKI KAGAKU 2005, Vol.54, No.6, pp.459-465
【非特許文献４】Biophys J BioFAST 2007, Vol.106, pp.1529-1544
【非特許文献５】J.Phys.Chem.B. 2003, Vol.107, pp.668-677
【非特許文献６】P.N.A.S. 2006, vol.103, pp.19635-19640
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
基板上における伸長反応を用いて塩基配列を解析する場合、非特許文献１で開示される方法に代表されるように、一塩基伸長反応、未反応基質の洗浄、および、計測を１サイクルとした、いわゆる逐次反応方式が一般的である。単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列を解析する場合、一塩基伸長反応によってプローブ上に取り込まれたヌクレオチドに付随している蛍光色素１分子の蛍光を測定することになるが、通常の蛍光測定ではプローブＤＮＡ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子とその近傍に浮遊している未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子を識別することは不可能であり、このため一塩基の伸長ごとに未反応基質を洗浄によって除去することが不可欠となる。この洗浄工程が入ることで、基板上に複雑な流路や送液装置および廃液処理装置を形成する必要があり、また、反応試薬も大量に消費してしまうと共に、トータルの解析に必要な反応時間も長くなってしまうという問題があった。
【００１０】
この問題を解決するためには、プローブ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子の識別手段が必須である。
【００１１】
プローブＤＮＡ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子とを識別するためには、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光分子のみが強力な蛍光を発し、未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子由来の蛍光が無視できる程度に微弱となるような条件を作り出す必要がある。
【００１２】
上記識別手段を含有した核酸分析デバイスとして、蛍光増強場を発生する金属構造体にプローブを固定し、このプローブに蛍光分子を捕捉していくように構成することが考えられる。
【００１３】
しかしながらこのような核酸分析デバイスには、２つの大きな問題がある。問題の１つは、金属構造体の蛍光増強場の発生領域にプローブを固定するのが困難なことである。局在型表面プラズモンによる蛍光増強場の発生領域が数ｎｍに局在化しているため、ブロッキング等の手法では、この領域に特異的に核酸プローブを固定化することが非常に困難であり、他の部位に核酸プローブが固定されてしまう確率が非常に高い。核酸プローブが蛍光増強場以外の部分に固定化されてしまうと、核酸プローブ上に捕捉されるヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子との識別が不可能となってしまい、洗浄を必要としない「リアルタイム」計測系が構築できない。
【００１４】
もう一つの問題は、撹拌機構等がない場合には、核酸プローブに核酸試料をハイブリダイズさせるのに通常２４時間以上要し、しかも大量の試料が必要とされるため、大量の試料の調整およびハイブリダイゼーションに莫大な費用と時間、労力が要求されることである。特に、低発現遺伝子の解析を行う場合、きわめて多くのターゲット試料が必要となる。
【００１５】
本発明は、このような実情を鑑みてなされたものであり、核酸プローブを基板上の金属構造体上の蛍光増強場発生領域に特異的に結合させると共に、試料中のターゲット分子とプローブ分子の特異的結合速度を高め、解析の前準備を短時間、低コストで完了させる核酸分析デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の核酸分析デバイスでは、金属構造体を有する基板への光照射を行うのと同時に、基板を挟む形で配置した２枚の平面電極間に高周波交流電圧を印加する。基板への光照射によって基板上の金属構造体に局在型表面プラズモンを発生させ、高周波交流電圧の印加によって電界分布を作り出すことにより、誘電泳動を利用して強電界が存在する位置、すなわち蛍光増強場へ核酸プローブおよび核酸試料を特異的に誘導する。この効果を利用して、核酸プローブ分子を金属構造体上の特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に結合させると共に、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を増加させる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、核酸プローブを基板上の金属構造体上の蛍光増強場発生領域に特異的に結合させると共に、試料中のターゲット分子とプローブ分子の特異的結合速度を高め、解析の前準備を短時間、低コストで完了させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、図面に示された各実施の形態は、本発明のかかわるものや方法の代表的な例を示したものであり、これらにより本発明の範囲を狭く解釈すべきではない。
【００１９】
図１は、本発明の核酸分析デバイスの概念を説明する図である。核酸分析デバイスは、第１の電極１と第２の電極２によって反応領域３を挟み込むように配置する。第１の電極１の反応領域３側には、表面に金属構造体４をアレイ状に構築した基板５を配置する。基板５の材質としては、例えばサファイア、石英等が好適であり、寸法は、１０ｍｍ角程度が好適である。反応領域３は、物質間の相互作用の場を提供する空間として機能し、核酸プローブ溶液や試料溶液等が貯留される。反応領域３には、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電源Ｖによって交流電界が印加される。さらに、第１の電極１の基板５が配置されている表面とは反対側の表面に励起光を照射する。第１の電極１は、照射光を完全には反射できない材質なら何でもよいが、透明な導体で形成されていることが望ましい。例えば、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）が好適である。第１の電極１には、基板５の設置部位が設けられていてもよい。
【００２０】
核酸プローブを金属構造体４の蛍光増強場発生領域に結合させるために、反応領域３に核酸プローブＰの溶液を貯留し、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電界を印加するとともに、第１の電極１に励起光を照射する。
【００２１】
第１の電極１を通過した励起光により、金属構造体４上に局在型表面プラズモンが誘起される。
【００２２】
交流電界の印加により、誘電泳動を利用して、金属構造体４の局在型表面プラズモンが誘起される特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に核酸プローブＰを誘導し、結合させることができる。
【００２３】
誘電泳動は、試料溶液に交流電圧を印加することにより分子に誘起双極子を発生させ、電界が一様でない場において、強電界が存在する方へ分子を駆動させる方法である。特に、高周波交流電界中においては、平均電場の２乗の勾配（∇Ｅ２）に比例して双極子に力が働くため、局在型表面プラズモン発生領域のように大きな電場勾配が生じる部分には、きわめて大きな誘電泳動力が働く。この手法は、分子の電荷の有無にかかわらず、分極して誘起双極子を生ずるすべての分子に適用できる。また、電気泳動と異なり、分子の到達目的部位の電位の符号を制御する必要がなく、負電荷を有する核酸プローブを特異的微細位置へ誘導する場合に、特異的微細位置（数ｎｍの領域）の電位のみが正となるように制御しなければならないという困難性がない。
【００２４】
また、金属構造体４に核酸プローブを結合させた状態で、反応領域３に試料核酸溶液を貯留し、上記と同様に、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電界を印加するとともに、第１の電極１に励起光を照射することにより、核酸プローブの近傍に試料核酸を誘導し、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を向上させることもできる。
【００２５】
基板への光照射条件は、分析を行う際に用いる光照射条件と同一にすることが望ましい。
【００２６】
本発明の核酸分析デバイスは、蛍光増強場と電場増強場が一致するという特徴を利用し、核酸プローブを蛍光増強効果を生ずる微小領域に特異的に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去せずに塩基伸長反応を計測することができる。
【００２７】
光照射により強力な局在型表面プラズモンが発生するような基板上の金属構造体としては、例えば、図２に示すような、２枚の円板状の金属２３及び２４の間にＳｉＯ２等の絶縁層２２を挟んだものや、図３に示すような、先端を鮮鋭化したコーン型の金属構造体３４において、先端部分のみが露出するようにＳｉＯ２等の絶縁層３３で覆ったもの等が好適である。頂点を有する形状であれば、コーン型の代わりに三角錐や四角錐等の多面体であってもよい。また、後述するように、絶縁層３３を省くこともできる。これらの金属構造体のサイズは数ｎｍ程度であり、基板上に数１００万個アレイ状に配置される。これらの金属構造体に用いる金属としては、金、銀、または白金等の貴金属が好適である。また、絶縁層としては、ＳｉＯ２等の無機材料でもポリイミドに代表されるような有機材料を用いてもよい。
【００２８】
図２に示すような金属間に絶縁層を挿入した金属構造体において、核酸プローブを金属構造体に結合するには、金属表面と絶縁層との化学的性質の差を利用し、適した官能基を絶縁層に付与するか、あるいは核酸プローブの末端に官能基を修飾しておき、それを金属構造体と反応させる方法があるが、このような従来の方法では、蛍光増強場が発生する所望の特異的微細位置に核酸プローブを結合させることは非常に困難である。なぜなら、非特許文献２に記載の電場強度のシミュレーション結果からも分かるように、該構造体において、絶縁層の周囲で等価に増強電場が発生するのではなく、絶縁層の一部分にしか増強電場が発生しないからである。金属表面と絶縁層との化学的性質の差を利用しても、絶縁層には全体的に等価に核酸プローブが結合してしまうため、所望の特異的微細位置以外の蛍光増強場が発生しない領域への蛍光プローブの結合確率が圧倒的に高くなってしまう。
【００２９】
本発明の核酸分析デバイスでは、このような問題を以下のようにして解決している。例としてアミノシラン処理を用いる方法を説明する。まず、アミノシラン処理により、金属構造体の絶縁層であるＳｉＯ２膜にアミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応させる。この段階では、ＳｉＯ２膜全体にストレプトアビジンが結合した状態になっている。次に、金属構造体を次にこの基板を本発明装置に設置し、予めビオチンを末端に修飾しておいた核酸プローブ溶液を反応領域３に貯留した後、５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの高周波交流電圧の印加と基板への光照射を同時に行う。これにより、ビオチン修飾核酸プローブは大きな電場勾配が存在する方向、即ち、増強電場の存在する特異的微細位置に向かって泳動する。このようにして、核酸プローブを所望の特異的微細位置に結合させることが可能となる。
【００３０】
図３に示すような先端を先鋭化させた金属をＳｉＯ２で覆い、先端部分のみを露出させた金属構造体において、金属とＳｉＯ２の化学的性質の差を利用して核酸プローブを金属構造体に結合する方法がある。具体的にはＳｉＯ２膜上にヒドロキシシラン処理によってヒドロキシ基を導入し非特異的吸着を防止するとともに、末端にチオール基等の官能基を修飾したプローブ核酸を反応させることでプローブ核酸付き金属構造体を作製するという方法である。しかし、この従来の方法では、蛍光増強場が発生する所望の特異的微細位置にプローブ核酸を結合させることは困難である。非特許文献２のＡｇ三角プリズムに対する電場強度シミュレーション結果によると、増強電場は構造体の頂点を中心として数ｎｍの領域に局在するため、この領域のみ露出するようにスピンコートとエッチングを組み合わせてＳｉＯ２膜を作製するのは至難である。
【００３１】
先端部分の露出を１０ｎｍに抑えても、高い確率で増強電場発生領域以外の部位にプローブ核酸が結合してしまう。また、金属構造体を覆う薄膜が核酸分析デバイスとしての特性に悪影響を与える場合には、プローブ核酸を結合させた後、薄膜を除去せねばならないが、プロセス数が増す上、この除去工程がプローブ核酸の脱離、基板からの金属構造体の脱離などの悪影響を生ずる可能性もある。
【００３２】
本発明の核酸分析デバイスでは、この問題を以下のようにして解決している。本発明の核酸分析デバイスでは、金属構造体を薄膜で覆い、先端部分のみを露出させるというプロセスの除去も可能である。先端を先鋭化させた金属構造体が構築された基板を本発明装置に設置し、予めチオール基を末端に修飾しておいた核酸プローブ溶液を反応領域３に貯留した後、５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの高周波交流電圧の印加と基板への光照射を同時に行う。これにより、チオール基修飾核酸プローブは大きな電場勾配が存在する方向、即ち、増強電場の存在する特異的微細位置（金属構造体の頂点部位）に向かって泳動する。このようにして、核酸プローブを所望の特異的微細位置に結合させることが可能となる。
【００３３】
ここで、本発明の核酸分析デバイスによるプローブ核酸固定化の際に生ずる誘電泳動力について具体的に以下に述べる。
【００３４】
まず、誘電泳動力は次式で表される。
Ｆ＝２πεｍｒ３Ｒｅ［Ｋ（ω）］∇Ｅ２
上式において、εｍは溶媒の誘電率、rは動的イオン雲を含んだ粒子半径、Ｋ（ω）はＣｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ因子、Ｅは電界を表す。
【００３５】
核酸については、溶媒として水を用いた場合、１ｋＨｚ〜１ＭＨｚの周波数において、Ｒｅ［Ｋ（ω）］は正の値となるため、誘電泳動力は∇Ｅ２が大きい値となる方向に働く。誘電泳動を利用してＤＮＡの泳動を行う研究はこれまでに複数なされており、その際、様々な形態の電極が使用されている。非特許文献３で使用されているような四重極電極、非特許文献４で用いられている光照射部分のみ導電率を上昇させることが可能な電極、らせん型電極等、他にも様々な形状の電極が用いられている。非特許文献３、非特許文献４、特許文献２ではＤＮＡを移動させる為に要する∇Ｅ２の最低値は１０９〜１０１０［Ｖ２／ｍ３］となっており、泳動の終点に対応する∇Ｅ２、即ち∇Ｅ２の最高値は１０１１〜１０１３［Ｖ２／ｍ３］となっている。
【００３６】
本発明の核酸分析デバイスに基板を設置し、核酸プローブ溶液を反応領域に貯留した後、光照射をせず、高周波交流電圧の印加のみを行うと、基板上には金属構造体が凸部として存在するため、この方向に向かって電場が集中し、電場勾配が生じる。この時、印加電圧を１０Ｖ、電極間距離を１ｍｍとすると、∇Ｅ２＝１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配が生じる。これにより、誘電泳動力が金属構造体の存在する方向へ働くが、この状態では金属構造体全体に核酸プローブが引き寄せられてしまい、金属構造体上の特異的微細位置に核酸プローブを結合させることができない。
【００３７】
これに対し、本発明の核酸分析デバイスに基板を設置し、核酸プローブ溶液を反応領域に貯留した後、高周波交流電圧の印加と同時に基板への光照射を行い、基板上の金属構造体上に局在化表面プラズモンを発生させると、非特許文献２、非特許文献５のシミュレーション結果から分かるように、金属構造体上の特異的微細位置に非常に大きな電場勾配が生じる。この効果により、核酸プローブは金属構造体の近傍へ引き寄せられた後、さらに金属構造体上の特異的微細位置に向かって誘導される。
【００３８】
次に、金属構造体上の特異的微細位置近傍において生じるＥ、∇Ｅ２について説明する。図２に示すような金属間に絶縁層を挿入した金属構造体において、金属部分にＡｕを使用し、図に示した設計値を有する金属構造体を使用し、局在型表面プラズモンを発生させるために５３３ｎｍの波長の光を基板に対し全反射照明させた場合、増強場は光の照射方向に依存してＳｉＯ２の周囲の一部分のみに形成される。この部分について、水平方向（ＯＡ方向）対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図４のグラフに示し、水平方向から３０度の方向（ＯＢ方向）に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図５のグラフに示した。これらのグラフによれば、水平方向では、ＳｉＯ２表面から２０ｎｍ離れた点Ａにおいて、∇Ｅ２＝１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、ＳｉＯ２表面から１０ｎｍの点で∇Ｅ２＝１．２×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。また、水平方向から３０度の方向に対しては、ＳｉＯ２表面から２３ｎｍ離れた点Ｂにおいて、∇Ｅ２＝１．２×１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、ＳｉＯ２表面から１０ｎｍの点で∇Ｅ２＝１．４×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。これらの計算値から、核酸が金属構造体近傍まで誘導された後、強力な力でＡｕ間の狭間に存在する増強場形成部位に誘導されることが予測される。
【００３９】
図３に示すような先端を先鋭化させた金属をＳｉＯ２で覆い、先端部分のみを露出させた金属構造体において、金属にＡｕを使用し、図に示した設計値を有する金属構造体を使用し、局在型表面プラズモンを発生させるために５３３ｎｍの波長の光を基板に対し全反射照明させた場合、増強場はコーンの先端部分に形成される。この部分について、頂点からの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図５のグラフに示した。このグラフによれば、頂点から２０ｎｍ離れた点において、∇Ｅ２＝１．１×１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、頂点部分では∇Ｅ２＝６．３×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。これらの計算値から、核酸が構造体近傍まで誘導された後、強力な力で増強場形成部位であるコーンの頂点部分に誘導されることが予測される。
【００４０】
また、同様の原理で金属構造体の特異的微細位置に固定化されたプローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーション速度を増大させることも可能である。
【００４１】
また、マイクロメータステージを利用し、電極間の距離を調節できるようにしてもよい。
【００４２】
以上のように、誘電泳動技術と局在型表面プラズモン発生技術が組み合わさった本発明の核酸分析デバイスを使用することで、これまで困難であったｎｍスケールの特異的微細位置へのプローブ分子の選択結合、及び該プローブへのターゲット分子の特異的結合速度の増大が可能となり、単分子計測用基板の製造プロセスの短縮、安定した高い蛍光増強効果の実現、ハイブリダイゼーション等の測定前処理の時間短縮によるＴＡＴ（Turn Around Time）の短縮が図れる。
【００４３】
核酸分析装置の実施例について説明する。核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図７を参照しながら説明する。
【００４４】
本実施例では、図２及び図３に示すような核酸プローブを固定した核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバーに本発明の核酸分析デバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０．１７ｍｍとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ、出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５１０および５０９を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるように調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、核酸分析デバイス５０５の金属構造体において局在型表面プラズモンが発生し、金属構造体に結合した核酸プローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１５（×６０、ＮＡ１．３５、差動距離０．１５ｍｍ）により平行光束とされ、光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
【００４５】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして非特許文献６に開示されているような、リボースの３’ＯＨの位置に３’−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３’ＯＨの位置に３’−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要はなく、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いればよい。
【００４６】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化、デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の核酸分析デバイスの概念を説明するための図である。
【図２】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体を用いる本発明の核酸分析デバイスの動作の一例を説明するための図である。
【図３】コーン型金属構造体を用いる本発明の核酸分析デバイスの動作の一例を説明するための図である。
【図４】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体における、水平方向に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図５】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体における、水平方向から３０度の方向に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図６】コーン型金属構造体における、頂点からの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図７】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１ 第１の電極
２ 第２の電極
３ 反応領域
４、３４ 金属構造体
５ 基板
２２、３３ 絶縁層
２３、２４ 金属
５０１ カバープレート
５０２ 検出窓
５０３ 注入口
５０４ 排出口
５０５ 核酸分析デバイス
５０７、５０８ ＹＡＧレーザ光源
５０９、５１０ レーザ光
５１１ λ／４板
５１２ ダイクロイックミラー
５１３ レンズ
５１４ プリズム
５１６ 光学フィルタ
５１７ 結像レンズ
５１８ ２次元ＣＣＤカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析デバイス、核酸分析装置及び核酸分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を分析する技術として、ＤＮＡ（DeoxyriboNucleic Acid）やＲＮＡ（RiboNucleic Acid）の塩基配列を決定する新規技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した塩基配列決定方法においては、あらかじめ配列決定用のＤＮＡ断片またはＲＮＡサンプルから逆転写反応により合成したｃＤＮＡ断片を調整し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後電気泳動を行い、分量分析展開パターンを計測することにより配列解析を行っている。
【０００４】
これに対し、近年、例えば非特許文献１に開示されているように、基板にＤＮＡ等を固定し、その塩基配列を決定する方法が提案されている。この方法では、基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、１分子ずつ伸長させ、その結果を蛍光計測で検出することにより、塩基配列を決定する。具体的には、（１）ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれ、その後のＤＮＡ伸長反応を保護基の存在により停止することが可能で、かつ標識を有する４種類のｄＮＴＰ誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行う工程、（２）取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、および、（３）ＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。この方法では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定できるため、同時に多数の断片の解析が可能であり、解析スループットを高めることができる。さらにこの方法では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来の方法で問題となるクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製、増幅工程が不要となるため、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
また、近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ゲノミクス、進化の研究、法医学、その他の分野において、広範囲に活用され始めている。
【０００６】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多様のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ等のヌクレオチド鎖が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。ハイブリダイゼーションの検出は、一般には試料中のヌクレオチド鎖の蛍光標識を検出することにより行われる。
【０００７】
ハイブリダイゼーションの検出精度を改善するため、基板へのゴミ、蛍光分子等の非特異吸着により生じるバックグラウンドノイズを低減するため、種々のアプローチが提案されている。
【０００８】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003，Vol.100，pp. 3960-3964
【非特許文献２】J.Chem.Phys.2004, Vol.120, pp. 357-366
【非特許文献３】BUNSEKI KAGAKU 2005, Vol.54, No.6, pp.459-465
【非特許文献４】Biophys J BioFAST 2007, Vol.106, pp.1529-1544
【非特許文献５】J.Phys.Chem.B. 2003, Vol.107, pp.668-677
【非特許文献６】P.N.A.S. 2006, vol.103, pp.19635-19640
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
基板上における伸長反応を用いて塩基配列を解析する場合、非特許文献１で開示される方法に代表されるように、一塩基伸長反応、未反応基質の洗浄、および、計測を１サイクルとした、いわゆる逐次反応方式が一般的である。単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列を解析する場合、一塩基伸長反応によってプローブ上に取り込まれたヌクレオチドに付随している蛍光色素１分子の蛍光を測定することになるが、通常の蛍光測定ではプローブＤＮＡ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子とその近傍に浮遊している未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子を識別することは不可能であり、このため一塩基の伸長ごとに未反応基質を洗浄によって除去することが不可欠となる。この洗浄工程が入ることで、基板上に複雑な流路や送液装置および廃液処理装置を形成する必要があり、また、反応試薬も大量に消費してしまうと共に、トータルの解析に必要な反応時間も長くなってしまうという問題があった。
【００１０】
この問題を解決するためには、プローブ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子の識別手段が必須である。
【００１１】
プローブＤＮＡ上に捕捉されたヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子とを識別するためには、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光分子のみが強力な蛍光を発し、未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子由来の蛍光が無視できる程度に微弱となるような条件を作り出す必要がある。
【００１２】
上記識別手段を含有した核酸分析デバイスとして、蛍光増強場を発生する金属構造体にプローブを固定し、このプローブに蛍光分子を捕捉していくように構成することが考えられる。
【００１３】
しかしながらこのような核酸分析デバイスには、２つの大きな問題がある。問題の１つは、金属構造体の蛍光増強場の発生領域にプローブを固定するのが困難なことである。局在型表面プラズモンによる蛍光増強場の発生領域が数ｎｍに局在化しているため、ブロッキング等の手法では、この領域に特異的に核酸プローブを固定化することが非常に困難であり、他の部位に核酸プローブが固定されてしまう確率が非常に高い。核酸プローブが蛍光増強場以外の部分に固定化されてしまうと、核酸プローブ上に捕捉されるヌクレオチド付随の蛍光分子と未反応ヌクレオチド付随の蛍光分子との識別が不可能となってしまい、洗浄を必要としない「リアルタイム」計測系が構築できない。
【００１４】
もう一つの問題は、撹拌機構等がない場合には、核酸プローブに核酸試料をハイブリダイズさせるのに通常２４時間以上要し、しかも大量の試料が必要とされるため、大量の試料の調整およびハイブリダイゼーションに莫大な費用と時間、労力が要求されることである。特に、低発現遺伝子の解析を行う場合、きわめて多くのターゲット試料が必要となる。
【００１５】
本発明は、このような実情を鑑みてなされたものであり、核酸プローブを基板上の金属構造体上の蛍光増強場発生領域に特異的に結合させると共に、試料中のターゲット分子とプローブ分子の特異的結合速度を高め、解析の前準備を短時間、低コストで完了させる核酸分析デバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の核酸分析デバイスでは、金属構造体を有する基板への光照射を行うのと同時に、基板を挟む形で配置した２枚の平面電極間に高周波交流電圧を印加する。基板への光照射によって基板上の金属構造体に局在型表面プラズモンを発生させ、高周波交流電圧の印加によって電界分布を作り出すことにより、誘電泳動を利用して強電界が存在する位置、すなわち蛍光増強場へ核酸プローブおよび核酸試料を特異的に誘導する。この効果を利用して、核酸プローブ分子を金属構造体上の特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に結合させると共に、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を増加させる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、核酸プローブを基板上の金属構造体上の蛍光増強場発生領域に特異的に結合させると共に、試料中のターゲット分子とプローブ分子の特異的結合速度を高め、解析の前準備を短時間、低コストで完了させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、図面に示された各実施の形態は、本発明のかかわるものや方法の代表的な例を示したものであり、これらにより本発明の範囲を狭く解釈すべきではない。
【００１９】
図１は、本発明の核酸分析デバイスの概念を説明する図である。核酸分析デバイスは、第１の電極１と第２の電極２によって反応領域３を挟み込むように配置する。第１の電極１の反応領域３側には、表面に金属構造体４をアレイ状に構築した基板５を配置する。基板５の材質としては、例えばサファイア、石英等が好適であり、寸法は、１０ｍｍ角程度が好適である。反応領域３は、物質間の相互作用の場を提供する空間として機能し、核酸プローブ溶液や試料溶液等が貯留される。反応領域３には、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電源Ｖによって交流電界が印加される。さらに、第１の電極１の基板５が配置されている表面とは反対側の表面に励起光を照射する。第１の電極１は、照射光を完全には反射できない材質なら何でもよいが、透明な導体で形成されていることが望ましい。例えば、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）が好適である。第１の電極１には、基板５の設置部位が設けられていてもよい。
【００２０】
核酸プローブを金属構造体４の蛍光増強場発生領域に結合させるために、反応領域３に核酸プローブＰの溶液を貯留し、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電界を印加するとともに、第１の電極１に励起光を照射する。
【００２１】
第１の電極１を通過した励起光により、金属構造体４上に局在型表面プラズモンが誘起される。
【００２２】
交流電界の印加により、誘電泳動を利用して、金属構造体４の局在型表面プラズモンが誘起される特異的微細位置（蛍光増強場発生領域）に核酸プローブＰを誘導し、結合させることができる。
【００２３】
誘電泳動は、試料溶液に交流電圧を印加することにより分子に誘起双極子を発生させ、電界が一様でない場において、強電界が存在する方へ分子を駆動させる方法である。特に、高周波交流電界中においては、平均電場の２乗の勾配（∇Ｅ２）に比例して双極子に力が働くため、局在型表面プラズモン発生領域のように大きな電場勾配が生じる部分には、きわめて大きな誘電泳動力が働く。この手法は、分子の電荷の有無にかかわらず、分極して誘起双極子を生ずるすべての分子に適用できる。また、電気泳動と異なり、分子の到達目的部位の電位の符号を制御する必要がなく、負電荷を有する核酸プローブを特異的微細位置へ誘導する場合に、特異的微細位置（数ｎｍの領域）の電位のみが正となるように制御しなければならないという困難性がない。
【００２４】
また、金属構造体４に核酸プローブを結合させた状態で、反応領域３に試料核酸溶液を貯留し、上記と同様に、第１の電極１および第２の電極２を介して交流電界を印加するとともに、第１の電極１に励起光を照射することにより、核酸プローブの近傍に試料核酸を誘導し、核酸プローブと試料核酸のハイブリダイゼーション速度を向上させることもできる。
【００２５】
基板への光照射条件は、分析を行う際に用いる光照射条件と同一にすることが望ましい。
【００２６】
本発明の核酸分析デバイスは、蛍光増強場と電場増強場が一致するという特徴を利用し、核酸プローブを蛍光増強効果を生ずる微小領域に特異的に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去せずに塩基伸長反応を計測することができる。
【００２７】
光照射により強力な局在型表面プラズモンが発生するような基板上の金属構造体としては、例えば、図２に示すような、２枚の円板状の金属２３及び２４の間にＳｉＯ２等の絶縁層２２を挟んだものや、図３に示すような、先端を鮮鋭化したコーン型の金属構造体３４において、先端部分のみが露出するようにＳｉＯ２等の絶縁層３３で覆ったもの等が好適である。頂点を有する形状であれば、コーン型の代わりに三角錐や四角錐等の多面体であってもよい。また、後述するように、絶縁層３３を省くこともできる。これらの金属構造体のサイズは数ｎｍ程度であり、基板上に数１００万個アレイ状に配置される。これらの金属構造体に用いる金属としては、金、銀、または白金等の貴金属が好適である。また、絶縁層としては、ＳｉＯ２等の無機材料でもポリイミドに代表されるような有機材料を用いてもよい。
【００２８】
図２に示すような金属間に絶縁層を挿入した金属構造体において、核酸プローブを金属構造体に結合するには、金属表面と絶縁層との化学的性質の差を利用し、適した官能基を絶縁層に付与するか、あるいは核酸プローブの末端に官能基を修飾しておき、それを金属構造体と反応させる方法があるが、このような従来の方法では、蛍光増強場が発生する所望の特異的微細位置に核酸プローブを結合させることは非常に困難である。なぜなら、非特許文献２に記載の電場強度のシミュレーション結果からも分かるように、該構造体において、絶縁層の周囲で等価に増強電場が発生するのではなく、絶縁層の一部分にしか増強電場が発生しないからである。金属表面と絶縁層との化学的性質の差を利用しても、絶縁層には全体的に等価に核酸プローブが結合してしまうため、所望の特異的微細位置以外の蛍光増強場が発生しない領域への蛍光プローブの結合確率が圧倒的に高くなってしまう。
【００２９】
本発明の核酸分析デバイスでは、このような問題を以下のようにして解決している。例としてアミノシラン処理を用いる方法を説明する。まず、アミノシラン処理により、金属構造体の絶縁層であるＳｉＯ２膜にアミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応させる。この段階では、ＳｉＯ２膜全体にストレプトアビジンが結合した状態になっている。次に、金属構造体を次にこの基板を本発明装置に設置し、予めビオチンを末端に修飾しておいた核酸プローブ溶液を反応領域３に貯留した後、５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの高周波交流電圧の印加と基板への光照射を同時に行う。これにより、ビオチン修飾核酸プローブは大きな電場勾配が存在する方向、即ち、増強電場の存在する特異的微細位置に向かって泳動する。このようにして、核酸プローブを所望の特異的微細位置に結合させることが可能となる。
【００３０】
図３に示すような先端を先鋭化させた金属をＳｉＯ２で覆い、先端部分のみを露出させた金属構造体において、金属とＳｉＯ２の化学的性質の差を利用して核酸プローブを金属構造体に結合する方法がある。具体的にはＳｉＯ２膜上にヒドロキシシラン処理によってヒドロキシ基を導入し非特異的吸着を防止するとともに、末端にチオール基等の官能基を修飾したプローブ核酸を反応させることでプローブ核酸付き金属構造体を作製するという方法である。しかし、この従来の方法では、蛍光増強場が発生する所望の特異的微細位置にプローブ核酸を結合させることは困難である。非特許文献２のＡｇ三角プリズムに対する電場強度シミュレーション結果によると、増強電場は構造体の頂点を中心として数ｎｍの領域に局在するため、この領域のみ露出するようにスピンコートとエッチングを組み合わせてＳｉＯ２膜を作製するのは至難である。
【００３１】
先端部分の露出を１０ｎｍに抑えても、高い確率で増強電場発生領域以外の部位にプローブ核酸が結合してしまう。また、金属構造体を覆う薄膜が核酸分析デバイスとしての特性に悪影響を与える場合には、プローブ核酸を結合させた後、薄膜を除去せねばならないが、プロセス数が増す上、この除去工程がプローブ核酸の脱離、基板からの金属構造体の脱離などの悪影響を生ずる可能性もある。
【００３２】
本発明の核酸分析デバイスでは、この問題を以下のようにして解決している。本発明の核酸分析デバイスでは、金属構造体を薄膜で覆い、先端部分のみを露出させるというプロセスの除去も可能である。先端を先鋭化させた金属構造体が構築された基板を本発明装置に設置し、予めチオール基を末端に修飾しておいた核酸プローブ溶液を反応領域３に貯留した後、５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの高周波交流電圧の印加と基板への光照射を同時に行う。これにより、チオール基修飾核酸プローブは大きな電場勾配が存在する方向、即ち、増強電場の存在する特異的微細位置（金属構造体の頂点部位）に向かって泳動する。このようにして、核酸プローブを所望の特異的微細位置に結合させることが可能となる。
【００３３】
ここで、本発明の核酸分析デバイスによるプローブ核酸固定化の際に生ずる誘電泳動力について具体的に以下に述べる。
【００３４】
まず、誘電泳動力は次式で表される。
Ｆ＝２πεｍｒ３Ｒｅ［Ｋ（ω）］∇Ｅ２
上式において、εｍは溶媒の誘電率、rは動的イオン雲を含んだ粒子半径、Ｋ（ω）はＣｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ因子、Ｅは電界を表す。
【００３５】
核酸については、溶媒として水を用いた場合、１ｋＨｚ〜１ＭＨｚの周波数において、Ｒｅ［Ｋ（ω）］は正の値となるため、誘電泳動力は∇Ｅ２が大きい値となる方向に働く。誘電泳動を利用してＤＮＡの泳動を行う研究はこれまでに複数なされており、その際、様々な形態の電極が使用されている。非特許文献３で使用されているような四重極電極、非特許文献４で用いられている光照射部分のみ導電率を上昇させることが可能な電極、らせん型電極等、他にも様々な形状の電極が用いられている。非特許文献３、非特許文献４、特許文献２ではＤＮＡを移動させる為に要する∇Ｅ２の最低値は１０９〜１０１０［Ｖ２／ｍ３］となっており、泳動の終点に対応する∇Ｅ２、即ち∇Ｅ２の最高値は１０１１〜１０１３［Ｖ２／ｍ３］となっている。
【００３６】
本発明の核酸分析デバイスに基板を設置し、核酸プローブ溶液を反応領域に貯留した後、光照射をせず、高周波交流電圧の印加のみを行うと、基板上には金属構造体が凸部として存在するため、この方向に向かって電場が集中し、電場勾配が生じる。この時、印加電圧を１０Ｖ、電極間距離を１ｍｍとすると、∇Ｅ２＝１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配が生じる。これにより、誘電泳動力が金属構造体の存在する方向へ働くが、この状態では金属構造体全体に核酸プローブが引き寄せられてしまい、金属構造体上の特異的微細位置に核酸プローブを結合させることができない。
【００３７】
これに対し、本発明の核酸分析デバイスに基板を設置し、核酸プローブ溶液を反応領域に貯留した後、高周波交流電圧の印加と同時に基板への光照射を行い、基板上の金属構造体上に局在化表面プラズモンを発生させると、非特許文献２、非特許文献５のシミュレーション結果から分かるように、金属構造体上の特異的微細位置に非常に大きな電場勾配が生じる。この効果により、核酸プローブは金属構造体の近傍へ引き寄せられた後、さらに金属構造体上の特異的微細位置に向かって誘導される。
【００３８】
次に、金属構造体上の特異的微細位置近傍において生じるＥ、∇Ｅ２について説明する。図２に示すような金属間に絶縁層を挿入した金属構造体において、金属部分にＡｕを使用し、図に示した設計値を有する金属構造体を使用し、局在型表面プラズモンを発生させるために５３３ｎｍの波長の光を基板に対し全反射照明させた場合、増強場は光の照射方向に依存してＳｉＯ２の周囲の一部分のみに形成される。この部分について、水平方向（ＯＡ方向）対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図４のグラフに示し、水平方向から３０度の方向（ＯＢ方向）に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図５のグラフに示した。これらのグラフによれば、水平方向では、ＳｉＯ２表面から２０ｎｍ離れた点Ａにおいて、∇Ｅ２＝１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、ＳｉＯ２表面から１０ｎｍの点で∇Ｅ２＝１．２×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。また、水平方向から３０度の方向に対しては、ＳｉＯ２表面から２３ｎｍ離れた点Ｂにおいて、∇Ｅ２＝１．２×１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、ＳｉＯ２表面から１０ｎｍの点で∇Ｅ２＝１．４×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。これらの計算値から、核酸が金属構造体近傍まで誘導された後、強力な力でＡｕ間の狭間に存在する増強場形成部位に誘導されることが予測される。
【００３９】
図３に示すような先端を先鋭化させた金属をＳｉＯ２で覆い、先端部分のみを露出させた金属構造体において、金属にＡｕを使用し、図に示した設計値を有する金属構造体を使用し、局在型表面プラズモンを発生させるために５３３ｎｍの波長の光を基板に対し全反射照明させた場合、増強場はコーンの先端部分に形成される。この部分について、頂点からの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を図５のグラフに示した。このグラフによれば、頂点から２０ｎｍ離れた点において、∇Ｅ２＝１．１×１０１０［Ｖ２／ｍ３］の勾配を有し、ＳｉＯ２表面に近づくに従い、∇Ｅ２の値は急激に増加していき、頂点部分では∇Ｅ２＝６．３×１０１３［Ｖ２／ｍ３］となる。これらの計算値から、核酸が構造体近傍まで誘導された後、強力な力で増強場形成部位であるコーンの頂点部分に誘導されることが予測される。
【００４０】
また、同様の原理で金属構造体の特異的微細位置に固定化されたプローブ核酸と試料核酸とのハイブリダイゼーション速度を増大させることも可能である。
【００４１】
また、マイクロメータステージを利用し、電極間の距離を調節できるようにしてもよい。
【００４２】
以上のように、誘電泳動技術と局在型表面プラズモン発生技術が組み合わさった本発明の核酸分析デバイスを使用することで、これまで困難であったｎｍスケールの特異的微細位置へのプローブ分子の選択結合、及び該プローブへのターゲット分子の特異的結合速度の増大が可能となり、単分子計測用基板の製造プロセスの短縮、安定した高い蛍光増強効果の実現、ハイブリダイゼーション等の測定前処理の時間短縮によるＴＡＴ（Turn Around Time）の短縮が図れる。
【００４３】
核酸分析装置の実施例について説明する。核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の好ましい構成の一例について図７を参照しながら説明する。
【００４４】
本実施例では、図２及び図３に示すような核酸プローブを固定した核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段と、を備える。より具体的には、カバープレート５０１と検出窓５０２と溶液交換用口である注入口５０３と排出口５０４から構成される反応チャンバーに本発明の核酸分析デバイス５０５を設置する。なお、カバープレート５０１と検出窓５０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓５０２の厚さは０．１７ｍｍとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ、出力２０ｍＷ）５０７およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ、出力２０ｍＷ）５０８から発振するレーザ光５１０および５０９を、レーザ光５０９のみをλ／４板５１１によって円偏光し、ダイクロイックミラー５１２（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるように調整した後、レンズ５１３によって集光し、その後、プリズム５１４を介してデバイス５０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、核酸分析デバイス５０５の金属構造体において局在型表面プラズモンが発生し、金属構造体に結合した核酸プローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓５０２を介して出射される。また、検出窓５０２より出射される蛍光は、対物レンズ５１５（×６０、ＮＡ１．３５、差動距離０．１５ｍｍ）により平行光束とされ、光学フィルタ５１６により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ５１７により２次元ＣＣＤカメラ５１８上に結像される。
【００４５】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして非特許文献６に開示されているような、リボースの３’ＯＨの位置に３’−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。さらに、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。この場合には、前記ヌクレオチドにおいて、リボースの３’ＯＨの位置に３’−Ｏ−アリル基を保護基として入れる必要はなく、光照射で切断可能な官能基を介して色素と結びついているヌクレオチドを用いればよい。
【００４６】
上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化、デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の核酸分析デバイスの概念を説明するための図である。
【図２】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体を用いる本発明の核酸分析デバイスの動作の一例を説明するための図である。
【図３】コーン型金属構造体を用いる本発明の核酸分析デバイスの動作の一例を説明するための図である。
【図４】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体における、水平方向に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図５】金属間に絶縁層を挿入した金属構造体における、水平方向から３０度の方向に対し、点Ｏからの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図６】コーン型金属構造体における、頂点からの距離とＥ、∇Ｅ２の値の関係を示すグラフである。
【図７】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の構成の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１ 第１の電極
２ 第２の電極
３ 反応領域
４、３４ 金属構造体
５ 基板
２２、３３ 絶縁層
２３、２４ 金属
５０１ カバープレート
５０２ 検出窓
５０３ 注入口
５０４ 排出口
５０５ 核酸分析デバイス
５０７、５０８ ＹＡＧレーザ光源
５０９、５１０ レーザ光
５１１ λ／４板
５１２ ダイクロイックミラー
５１３ レンズ
５１４ プリズム
５１６ 光学フィルタ
５１７ 結像レンズ
５１８ ２次元ＣＣＤカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
プローブ溶液又は試料溶液が供給される反応領域と、
前記反応領域を挟む形で配置され、交流電圧が印加される２枚の電極と、
前記２枚の電極の一方の上に配置された平滑な支持基板上にアレイ状に配置され、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体とを備えることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項２】
前記２枚の電極のうち前記支持基板が配置された電極が透明電極であり、該透明電極を透過させて前記支持基板に光を照射可能な光照射手段をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項３】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項４】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項５】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項６】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項７】
前記金属構造体は、金、銀、または白金から選ばれる貴金属から成ることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項８】
核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段とを備え、
前記核酸分析デバイスは、
プローブ溶液、又は、前記蛍光色素を有するヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が供給される反応領域と、
前記反応領域を挟む形で配置され、交流電圧が印加される２枚の電極と、
前記２枚の電極の一方の上に配置された平滑な支持基板上にアレイ状に配置され、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体とを備えることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項８に記載の核酸分析装置。
【請求項１０】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項８に記載の核酸分析装置。
【請求項１１】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分析装置。
【請求項１２】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分析装置。
【請求項１３】
蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析方法であって、
反応領域を挟む形で配置された２枚の電極の一方の上に、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体がアレイ状に配置された平滑な支持基板を配置する工程と、
前記反応領域にプローブ溶液を供給する工程と、
前記２枚の電極に交流電圧を印加すると共に前記金属構造体に光を照射して前記金属構造体にプローブを結合する工程と、
前記反応領域に、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する工程と、
前記２枚の電極に交流電圧を印加すると共に前記金属構造体に光を照射する工程と、
前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する工程とを含むことを特徴とする核酸分析方法。
【請求項１４】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項１５に記載の核酸分析方法。
【請求項１７】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項１５に記載の核酸分析方法。
【請求項１】
蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
プローブ溶液又は試料溶液が供給される反応領域と、
前記反応領域を挟む形で配置され、交流電圧が印加される２枚の電極と、
前記２枚の電極の一方の上に配置された平滑な支持基板上にアレイ状に配置され、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体とを備えることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項２】
前記２枚の電極のうち前記支持基板が配置された電極が透明電極であり、該透明電極を透過させて前記支持基板に光を照射可能な光照射手段をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項３】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項４】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析デバイス。
【請求項５】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項６】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項７】
前記金属構造体は、金、銀、または白金から選ばれる貴金属から成ることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析デバイス。
【請求項８】
核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスと、
前記核酸分析デバイスに対して、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する発光検出手段とを備え、
前記核酸分析デバイスは、
プローブ溶液、又は、前記蛍光色素を有するヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が供給される反応領域と、
前記反応領域を挟む形で配置され、交流電圧が印加される２枚の電極と、
前記２枚の電極の一方の上に配置された平滑な支持基板上にアレイ状に配置され、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体とを備えることを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項８に記載の核酸分析装置。
【請求項１０】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項８に記載の核酸分析装置。
【請求項１１】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分析装置。
【請求項１２】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項１０に記載の核酸分析装置。
【請求項１３】
蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析方法であって、
反応領域を挟む形で配置された２枚の電極の一方の上に、光照射により局在型表面プラズモンが発生する金属構造体がアレイ状に配置された平滑な支持基板を配置する工程と、
前記反応領域にプローブ溶液を供給する工程と、
前記２枚の電極に交流電圧を印加すると共に前記金属構造体に光を照射して前記金属構造体にプローブを結合する工程と、
前記反応領域に、蛍光色素を有するヌクレオチド、核酸合成酵素、及び核酸試料を供給する工程と、
前記２枚の電極に交流電圧を印加すると共に前記金属構造体に光を照射する工程と、
前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する工程とを含むことを特徴とする核酸分析方法。
【請求項１４】
前記金属構造体は、前記支持基板表面に対して垂直な方向に、金属体、絶縁層、および金属体が順に積み重なって配置されているものであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分析方法。
【請求項１５】
前記金属構造体は、頂点を有する形状の金属から成るものであることを特徴とする請求項１３に記載の核酸分析方法。
【請求項１６】
絶縁層を備え、前記金属構造体の一部が前記絶縁層から露出していることを特徴とする請求項１５に記載の核酸分析方法。
【請求項１７】
前記金属構造体が円錐型又は多角錐型であることを特徴とする請求項１５に記載の核酸分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１４６２２（Ｐ２０１０−１４６２２Ａ）
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７６２２９（Ｐ２００８−１７６２２９）
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月４日（２００８．７．４）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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