核酸分析デバイス，核酸分析装置、及び核酸分析方法
【課題】本発明の目的は、核酸分析デバイスからの蛍光を検出する際のノイズ低減に関する。
【解決手段】本発明は、核酸分析デバイス表面に水溶性の被覆膜を有することに関する。分析直前に被覆膜を水溶液で溶解し、除去した後、核酸の分析を行う。デバイス表面は、製造直後から分析直前の間に空気と接触することがないため、デバイス表面への有機物の付着を防止することができる。本発明により、核酸分析デバイス表面に付着する有機物由来のノイズを低減でき、塩基配列情報の信頼性を高めることができる。
【解決手段】本発明は、核酸分析デバイス表面に水溶性の被覆膜を有することに関する。分析直前に被覆膜を水溶液で溶解し、除去した後、核酸の分析を行う。デバイス表面は、製造直後から分析直前の間に空気と接触することがないため、デバイス表面への有機物の付着を防止することができる。本発明により、核酸分析デバイス表面に付着する有機物由来のノイズを低減でき、塩基配列情報の信頼性を高めることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、配列決定用のＤＮＡ断片やＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を予め調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、非特許文献１にあるように、ＤＮＡなどを基板に固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。分析すべき試料ＤＮＡ断片を基板表面にランダムに１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、まず、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ、検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程を実施する。次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を実施する。これら３工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより、試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
解析スループットをさらに上げる方法として、非特許文献２では、保護基を持たない基質を用いる方法が開示されている。この方法では、連続的に進行するＤＮＡ鎖伸長反応を時々刻々と検出するものあり、非特許文献１では必須な１塩基伸長完了毎の洗浄工程がないため、解析スループットを飛躍的に大きくすることができる。
【０００６】
単一ＤＮＡ分子の配列決定に用いられる核酸分析デバイスとしては、特許文献１，特許文献２、及び特許文献３にあるような、微細なアパーチャが数多く存在するアレイや、特許文献４にあるような、スライドとフローセルを組み合わせたものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳＰ６９１７７２６
【特許文献２】特開２００４−１６３１２２号公報
【特許文献３】ＵＳＰ７３１３３０８
【特許文献４】ＵＳＰ７２７６７２０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003，Vol. 100，pp. 3960-3964.
【非特許文献２】P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181
【非特許文献３】Nano Letters. 2004、vol.4，957-961
【非特許文献４】P.N.A.S. 2006，vol. 103，pp 19635-19640
【非特許文献５】P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１開示技術等の解析スループット向上について本願発明者が鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１０】
単一ＤＮＡ分子の検出においては、高感度な単一蛍光色素の検出が求められ、核酸分析デバイス表面に付着したわずかな異物からの蛍光がノイズとなる。これら異物は、空気中に広く一般的に浮遊する有機物が主であり、核酸分析デバイスを空気中で扱う限りにおいては、付着を完全に防止することは極めて困難である。特許文献１，特許文献２、及び特許文献３の核酸分析デバイスについては、微細な加工が必要であり、一般的には、検出装置が存在する場所とは異なる場所で作製されるものである。核酸分析デバイスを製造直後に異物除去の洗浄を行ったとしても、検出場所までの移送時に生じる有機物の付着を完全に防止することは極めて困難である。
【００１１】
本発明の目的は、核酸分析デバイスからの蛍光を検出する際のノイズ低減に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、核酸分析デバイス表面に水溶性の被覆膜を有することに関する。分析直前に被覆膜を水溶液で溶解し、除去した後、核酸の分析を行う。デバイス表面は、製造直後から分析直前の間に空気と接触することがないため、デバイス表面への有機物の付着を防止することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、核酸分析デバイス表面に付着する有機物由来のノイズを低減でき、塩基配列情報の信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図２】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図３】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図５】核酸分析デバイスを使用形態の一例を説明するため概略図。
【図６】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、当該支持基体の表面に水溶性の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。水溶液に容易に溶解する被膜を用いることにより、被膜の溶解・除去プロセスを簡略化することができる。水溶液に容易に溶解する被膜は、分析装置の溶解・除去のための機構を簡素化するものである。
【００１６】
また、本実施例では、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスを開示する。検出機器の光学フィルタを組み合わせることにより、２色以上の蛍光を同時に検出することができる。
【００１７】
さらに、本実施例では、支持基体の表面に高分子化合物の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。水溶性の高分子化合物は広く一般的に世の中に存在するため、材料調達が容易である。
【００１８】
さらに、本実施例では、支持基体の表面に金属の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。スパッタリングなどの薄膜形成技術が広く公知であり、容易に１μｍ以下の薄膜を形成することができる。
【００１９】
さらに、本実施例では、支持基体の表面にアルミニウムの被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。塩化物イオンを含む中性水溶液で容易に溶解・除去することができる。
【００２０】
さらに、本実施例では、核酸分析に用いるプローブを支持基体上に備える核酸分析デバイスを開示する。水溶性の被覆膜を除去後に、新たにプローブを導入することなく核酸分析を開始することができ、核酸分析装置を簡略化することができる。
【００２１】
さらに、本実施例では、核酸、又はタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であるプローブを支持基体上に備える核酸分析デバイスを開示する。核酸、又は核酸合成酵素などのタンパク質は、測定対象である核酸を取り込む際の特異性が高く、測定対象のみを特異的に測定することができる。
【００２２】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置を開示する。被覆膜の溶解・除去から蛍光検出までの間にデバイス最表面が空気に接触することがないため、異物によるノイズを低減できる。
【００２３】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに、水溶性の洗浄液を供給し、水溶性の被覆膜を除去し、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、核酸分析デバイスに光を照射し、ヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、核酸試料の塩基配列を解析する方法を開示する。
【００２４】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。なお、ここでは本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合わせることが可能であり、本明細書は当該組み合わせ形態についても開示している。
【実施例１】
【００２５】
本実施例における核酸分析デバイスを用いた核酸分析手順ついて、図１や図２を用いて説明する。
【００２６】
支持基体１０１上に形成された水溶性の被覆膜１０２を溶解し、除去した後、プローブ１０３を基板に固定する。その後、プローブ１０３を介して核酸試料１０４を固定した後、核酸合成酵素１０５や、蛍光色素を有するヌクレオチド１０６を供給し、１塩基伸長反応を行う。測定対象の蛍光色素１０７は伸長反応生成物の先端部に取り込まれる。未反応の蛍光色素を有するヌクレオチド１０６を洗浄し、除去した後、測定対象の蛍光色素１０７を励起し、蛍光を検出する。
【００２７】
水溶性の被覆膜１０２は、水溶液で溶解し、除去できるものであれば特に制限がないが、水溶性の高分子化合物や金属が望ましい。水溶性の高分子化合物としては、天然由来のデンプン，ゼラチン，カルボキシメチルセルロース，メチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルアルコール，ポリアクリル酸系ポリマー，ポリアクリルアミド，ポリエチレンオキシド，キチン，キトサンなどを用いることができる。ポリアクリル酸系ポリマーについては、ポリアクリル酸，ポリアクリル酸ナトリウムをはじめとする、アクリル酸／マレイン酸共重合体，アクリル酸／スルホン酸系モノマー共重合体などを用いることができる。
【００２８】
高分子化合物による被覆膜の形成方法についても、薄膜を形成できるものであれば特に制限がなく、スプレーコーティング，ディップコーティング，フローコーティング，スピンコーティング，電着などを用いることができる。
【００２９】
水溶性の金属についても、水溶性であれば特に制限がないが、中性でも塩化物イオンを含む水溶液に溶解するアルミニウムが特に望ましい。金属被覆膜の形成方法にも特に制限はなく、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition），ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などを用いることができる。
【００３０】
支持基体１０１も特に制限ははく、プラスチック，無機高分子，金属，天然高分子、及びセラミックから選ばれる１種又は２種以上の材料を用いることができる。プラスチックとしては、ポリエチレン，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリプロピレン，ポリアミド，フェノール樹脂，エポキシ樹脂，ポリカルボジイミド樹脂，ポリ塩化ビニル，ポリフッ化ビニリデン，ポリフッ化エチレン，ポリイミド及びアクリル樹脂などを例示することができる。無機高分子としては、ガラス，水晶，カーボン，シリカゲル、及びグラファイトを例示することができる。金属としては、金，白金，銀，銅，鉄，アルミニウム，磁石などの常温固体金属を例示することができる。セラミックとしては、サファイア，アルミナ，シリカ，炭化ケイ素，窒化ケイ素、及び炭化ホウ素などを例示することができる。特に、光透過性に優れ、基材界面の平坦性が高く、且つ、平坦性を保持しやすい石英，水晶，ＢＫ−７やＳＦ−２などの各種光学ガラス、サファイアなどが好ましい。
【００３１】
また、プライマや核酸合成などのプローブ１０３が固定しやすい様に、支持基体１０１表面に適当な官能基を導入しても良い。この様な官能基としては、アミノ基，チオール基，カルボキシル基，ヒドロキシル基，アルデヒド基，ケトン基などが挙げられる。これらの官能基を導入する方法としては、支持基体１０１上に適当な酸化物を導入した後、カルボン酸，ホスホン酸，リン酸エステル，有機シラン化合物を反応する方法が挙げられる。また、支持体表面上に、金，銀，水銀，インジウム，パラジウム，ルテニウム，亜鉛などの貴金属を導入した後、有機硫黄化合物，有機セレン化合物、または、有機テルル化合物などを反応させる方法も挙げられる。さらに、プローブを固定するための反応効率を高める手法として、二価性の化合物を用いて、ＮＨＳ−エステル基，イミドエステル基，スルフィジル基，エポキシ基，ヒドラジド基などの官能基を導入しても良い。これらの支持体最表面に導入された官能基に対して、アミノ基，チオール基，ビオチン基などで修飾されたプローブ１０３を供給することで支持基体１０１上に効果的にプローブを固定化することができる。また、アビジン，デンドロン，クラウンエーテルなどの化合物を介して、プローブ１０３を固定しても良い。
【００３２】
プローブ１０３についても、測定対象の核酸試料１０４を補足できるものであれば特に制限はない。核酸試料１０４を直接補足できる様なプローブとしては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡなどの核酸、または、酵素などのタンパク質が挙げられる。また、染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを介して、核酸試料１０４を補足しても良い。
【００３３】
図１では、水溶性の被覆膜１０２を溶解し、除去した後、プローブ１０３を基板に固定したが、図２に示す様に、プローブ１０３が固定化された支持基体１０１上に水溶性の被覆膜２０２を有する核酸分析デバイスを出発材とし用いても良い。
【実施例２】
【００３４】
金属を材質とする三角柱が近接すると、その間の空間には、強力な局在型表面プラズモンが発生することが非特許文献３に示されている。本実施例では、この局在型表面プラズモンを利用した核酸分析デバイスを用いる場合について説明する。
【００３５】
核酸分析デバイスの概要を図３に示す。本実施例の核酸分析デバイスでは、支持基体３０１上に数多くの微細な三角柱である金属体３０２が搭載されている。金属体３０２が近接する部位に、プローブ３０３が金属３０４を介して固定化されている。デバイスの製造方法について、図４を用いて説明する。金属体３０２を形成する金属に特に制限がないが、局在型表面プラズモンを高めるためには、金，銀，白金，アルミニウム、又は銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることが望ましい。
【００３６】
（１）金属膜の形成
平滑な支持基体３０１上に、薄膜状の金属３０４を形成する。平滑な支持基体３０１には、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板などが用いられる。金属３０４は、上記裏面より励起光を照射する場合には、その厚さは薄いほど好ましく、より好ましくは５〜１００ｎｍである。薄膜は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いて作られる。金属３０４に特に制限はないが、金属体３０２と支持基体３０１との接着性を高めるためにはＴｉが望ましい。
【００３７】
（２）シリコン膜の形成，（３）シリコンのパターニング
金属３０４上に、厚さが５ｎｍ以上のシリコン膜３０５を形成する。薄膜形成方法は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどが好ましい。得られたシリコン膜に対して、フォトリソグラフィ，エッチングを施し、パターニングを行う。パターンは、向き合った金属体３０２をアレイ状に配置するための所望のパターンに準じる。例えば、１μｍピッチで向き合った金属体３０２を構成した場合、形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。フォトリソグラフィは、既存のｉ線（波長３６５ｎｍ），ＫｒＦエキシマレーザ（波長２４８ｎｍ），ＡｒＦエキシマレーザ（波長１９３ｎｍ），Ｘ線、又は電子線を光源とした方法を用いることができる。エッチングのパターニングの精度を高めるには、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）を用いることが好ましい。
【００３８】
（４）絶縁膜の形成，（５）絶縁膜のエッチング，（６）シリコンのエッチング
シリコン上に、ＣＶＤを用いて、絶縁膜３０６を形成する。絶縁膜３０６の厚さは、金属体３０２間の距離を制御するものである。金属体３０２間の距離が短い程、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を高めることができる。好ましい厚さは５０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。本実施例のような絶縁膜３０６の膜厚で金属体間の距離を制御する方法は、１５ｎｍ以下の距離の制御も精度良く行え、製造上のバラツキを小さくできる。このような絶縁膜としては、半導体のゲート電極のサイドウォール（側壁酸化膜）製造プロセスで用いられる二酸化ケイ素や窒化ケイ素が好ましい。本実施例では、絶縁膜を用いるプロセスを示したが、（４）の薄膜形成から（６）のエッチングプロセスでの膜厚を制御できればよく、金属膜で実施しても良い。これらのプロセスで用いられるエッチングについては、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。以上のプロセスを実施することにより、金属体３０２間の距離を制御する仕切り板３０７を形成することができる。
【００３９】
（７）金属膜の形成，（８）仕切り板の除去
金属膜の厚さは、金属体３０２の高さを制御するものである。局在型表面プラズモンが効果的に生じる厚さは、計測時に用いる励起波長により異なる。望ましい厚さは１０００ｎｍ以下である。薄膜形成方法としては、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いることができる。仕切り板の除去は、一般的なウェット（またはドライ）エッチングを行う。具体的には、二酸化ケイ素，窒化ケイ素とともに、フッ酸または、フッ酸を含む溶液を用いる。
【００４０】
（９）レジスト塗布，（１０）パターニング
パターニングの大きさや形状は、局在型表面プラズモンの効果に大きく関わる。図３に示した様な、三角形に類似した形状であれば、三角形の一辺が１０００ｎｍ以下であることが好ましい。レジスト３０８としては、電子線用のネガ型ポジストを用いることができる。具体的には、ＴＥＢＮ−１（株式会社トクヤマ社製）が挙げられる。レジストをスピンナーで塗布した後、ホットプレートで２〜５分程度プリベイクする。加速電圧５０〜１００ＫＶの電子線で描画した後、乳酸エチル，イソプロパノール、またはエタノールで現像する。
【００４１】
（１１）エッチング，（１２）レジスト除去
パターニングされたレジストをマスクとして、金属体３０２を形成する。パターン精度を高めるには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。レジスト除去には、広く一般的に用いられるオゾンアッシングのプロセスを用いることができる。
【００４２】
（１３）プローブ固定
プローブ３０３が核酸である場合、固定方法には種々の方法が考えられるが、例として、アミノプロピルリン酸を用いる方法を記述する。デバイスをアミノプロピルリン酸水溶液にディップして、金属３０４上にアミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応させる。次に、予めビオチンを末端に修飾しておいたプローブを反応させることにより、近接した二つの金属体３０２の間にプローブを固定する。プローブ３０３が核酸合成酵素の様なタンパク質であっても、同様の方法で固定化することができる。具体的には、アミノ化された酸化膜上に二価性試薬であるＮ−（４−Maleimidobutyryloxy）succinimide（同仁化学研究所社製、ＧＭＢＳ）を反応させた後、核酸合成酵素を反応させることにより核酸合成酵素を固定することができる。その他、酸化膜上にニトロセルロース，ポリアクリルアミドなどとの物理吸着を利用する方法，ヒスチジンとニッケルイオンやコバルトイオンとの特異的な親和を利用する方法、またはビオチンとアビジンの結合を利用する方法などを用いることができる。得られた核酸分析デバイスに対して、実施例１で示した通りに、水溶性の被覆膜を導入することにより、本実施例の核酸分析デバイスを作製することができる。
【実施例３】
【００４３】
核酸分析デバイスの使用形態の一例について、図５を参照しながら説明する。支持基体５０１の上に、金属体が格子状に配置されている領域５０２が複数搭載されている。金属体は、先に述べた、近接した二つの金属体の間にプローブを固定した構造体が該当する。配置の間隔は、解析しようとする核酸試料、蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体５０１とし、１マイクロ・メートル間隔で格子状に金属構造体を配置した領域５０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、支持基体５０１上に搭載することができる。したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。前記のように、複数の反応領域を支持基体５０１の上に設けるには、流路５０４を予め設けた反応チャンバー５０３を、光透過性支持基体５０１の上にかぶせることにより達成できる。反応チャンバー５０３は、流路５０４の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）などの樹脂基体からなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質などを保存・温度管理する温調ユニット５０５，反応液を送り出す分注ユニット５０６，液の流れを制御するバルブ５０７，廃液タンク５０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応開始前に流路５０４を通じて洗浄液を供給することにより、水溶性の被覆膜を除去することができる。被覆膜を除去した洗浄液は廃液タンク５０８に収納される。
【実施例４】
【００４４】
核酸分析装置の実施例について、図６を用いて説明する。本実施例では、核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６、及びＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８及び６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、水溶性の洗浄液で核酸分析デバイス上の被覆膜を除去した後、伸長反応を行う。伸長反応時に取り込まれた蛍光体はレーザ光により励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００４５】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006，vol. 103，pp 19635-19640（非特許文献４）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することにより切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００４６】
さらに、本実施例では、P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181（非特許文献５）に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることでにより洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れる。逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【符号の説明】
【００４７】
１０１，２０１，３０１，５０１ 支持基体
１０２，２０２ 水溶性の被覆膜
１０３，２０３，３０３ プローブ
１０４，２０４ 核酸試料
１０５，２０５ 核酸合成酵素
１０６，２０６ 蛍光色素を有するヌクレオチド
１０７，２０７ 測定対象の蛍光色素
３０２ 金属体
３０４ 金属
３０５ シリコン膜
３０６ 絶縁膜
３０７ 仕切り板
３０８ レジスト
５０２ 金属体が格子状に配置されている領域
５０３ 反応チャンバー
５０４ 流路
５０５ 温調ユニット
５０６ 分注ユニット
５０７ バルブ
５０８ 廃液タンク
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、配列決定用のＤＮＡ断片やＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を予め調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、非特許文献１にあるように、ＤＮＡなどを基板に固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。分析すべき試料ＤＮＡ断片を基板表面にランダムに１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、まず、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ、検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程を実施する。次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を実施する。これら３工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより、試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
解析スループットをさらに上げる方法として、非特許文献２では、保護基を持たない基質を用いる方法が開示されている。この方法では、連続的に進行するＤＮＡ鎖伸長反応を時々刻々と検出するものあり、非特許文献１では必須な１塩基伸長完了毎の洗浄工程がないため、解析スループットを飛躍的に大きくすることができる。
【０００６】
単一ＤＮＡ分子の配列決定に用いられる核酸分析デバイスとしては、特許文献１，特許文献２、及び特許文献３にあるような、微細なアパーチャが数多く存在するアレイや、特許文献４にあるような、スライドとフローセルを組み合わせたものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳＰ６９１７７２６
【特許文献２】特開２００４−１６３１２２号公報
【特許文献３】ＵＳＰ７３１３３０８
【特許文献４】ＵＳＰ７２７６７２０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003，Vol. 100，pp. 3960-3964.
【非特許文献２】P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181
【非特許文献３】Nano Letters. 2004、vol.4，957-961
【非特許文献４】P.N.A.S. 2006，vol. 103，pp 19635-19640
【非特許文献５】P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１開示技術等の解析スループット向上について本願発明者が鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【００１０】
単一ＤＮＡ分子の検出においては、高感度な単一蛍光色素の検出が求められ、核酸分析デバイス表面に付着したわずかな異物からの蛍光がノイズとなる。これら異物は、空気中に広く一般的に浮遊する有機物が主であり、核酸分析デバイスを空気中で扱う限りにおいては、付着を完全に防止することは極めて困難である。特許文献１，特許文献２、及び特許文献３の核酸分析デバイスについては、微細な加工が必要であり、一般的には、検出装置が存在する場所とは異なる場所で作製されるものである。核酸分析デバイスを製造直後に異物除去の洗浄を行ったとしても、検出場所までの移送時に生じる有機物の付着を完全に防止することは極めて困難である。
【００１１】
本発明の目的は、核酸分析デバイスからの蛍光を検出する際のノイズ低減に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、核酸分析デバイス表面に水溶性の被覆膜を有することに関する。分析直前に被覆膜を水溶液で溶解し、除去した後、核酸の分析を行う。デバイス表面は、製造直後から分析直前の間に空気と接触することがないため、デバイス表面への有機物の付着を防止することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、核酸分析デバイス表面に付着する有機物由来のノイズを低減でき、塩基配列情報の信頼性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図２】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図３】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図５】核酸分析デバイスを使用形態の一例を説明するため概略図。
【図６】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、当該支持基体の表面に水溶性の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。水溶液に容易に溶解する被膜を用いることにより、被膜の溶解・除去プロセスを簡略化することができる。水溶液に容易に溶解する被膜は、分析装置の溶解・除去のための機構を簡素化するものである。
【００１６】
また、本実施例では、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスを開示する。検出機器の光学フィルタを組み合わせることにより、２色以上の蛍光を同時に検出することができる。
【００１７】
さらに、本実施例では、支持基体の表面に高分子化合物の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。水溶性の高分子化合物は広く一般的に世の中に存在するため、材料調達が容易である。
【００１８】
さらに、本実施例では、支持基体の表面に金属の被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。スパッタリングなどの薄膜形成技術が広く公知であり、容易に１μｍ以下の薄膜を形成することができる。
【００１９】
さらに、本実施例では、支持基体の表面にアルミニウムの被覆膜を備える核酸分析デバイスを開示する。塩化物イオンを含む中性水溶液で容易に溶解・除去することができる。
【００２０】
さらに、本実施例では、核酸分析に用いるプローブを支持基体上に備える核酸分析デバイスを開示する。水溶性の被覆膜を除去後に、新たにプローブを導入することなく核酸分析を開始することができ、核酸分析装置を簡略化することができる。
【００２１】
さらに、本実施例では、核酸、又はタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であるプローブを支持基体上に備える核酸分析デバイスを開示する。核酸、又は核酸合成酵素などのタンパク質は、測定対象である核酸を取り込む際の特異性が高く、測定対象のみを特異的に測定することができる。
【００２２】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、核酸分析デバイスに光を照射する手段と、核酸分析デバイス上においてヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、核酸試料の塩基配列情報を取得する核酸分析装置を開示する。被覆膜の溶解・除去から蛍光検出までの間にデバイス最表面が空気に接触することがないため、異物によるノイズを低減できる。
【００２３】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに、水溶性の洗浄液を供給し、水溶性の被覆膜を除去し、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、核酸分析デバイスに光を照射し、ヌクレオチド，核酸合成酵素、及び核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、核酸試料の塩基配列を解析する方法を開示する。
【００２４】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。なお、ここでは本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合わせることが可能であり、本明細書は当該組み合わせ形態についても開示している。
【実施例１】
【００２５】
本実施例における核酸分析デバイスを用いた核酸分析手順ついて、図１や図２を用いて説明する。
【００２６】
支持基体１０１上に形成された水溶性の被覆膜１０２を溶解し、除去した後、プローブ１０３を基板に固定する。その後、プローブ１０３を介して核酸試料１０４を固定した後、核酸合成酵素１０５や、蛍光色素を有するヌクレオチド１０６を供給し、１塩基伸長反応を行う。測定対象の蛍光色素１０７は伸長反応生成物の先端部に取り込まれる。未反応の蛍光色素を有するヌクレオチド１０６を洗浄し、除去した後、測定対象の蛍光色素１０７を励起し、蛍光を検出する。
【００２７】
水溶性の被覆膜１０２は、水溶液で溶解し、除去できるものであれば特に制限がないが、水溶性の高分子化合物や金属が望ましい。水溶性の高分子化合物としては、天然由来のデンプン，ゼラチン，カルボキシメチルセルロース，メチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルアルコール，ポリアクリル酸系ポリマー，ポリアクリルアミド，ポリエチレンオキシド，キチン，キトサンなどを用いることができる。ポリアクリル酸系ポリマーについては、ポリアクリル酸，ポリアクリル酸ナトリウムをはじめとする、アクリル酸／マレイン酸共重合体，アクリル酸／スルホン酸系モノマー共重合体などを用いることができる。
【００２８】
高分子化合物による被覆膜の形成方法についても、薄膜を形成できるものであれば特に制限がなく、スプレーコーティング，ディップコーティング，フローコーティング，スピンコーティング，電着などを用いることができる。
【００２９】
水溶性の金属についても、水溶性であれば特に制限がないが、中性でも塩化物イオンを含む水溶液に溶解するアルミニウムが特に望ましい。金属被覆膜の形成方法にも特に制限はなく、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition），ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などを用いることができる。
【００３０】
支持基体１０１も特に制限ははく、プラスチック，無機高分子，金属，天然高分子、及びセラミックから選ばれる１種又は２種以上の材料を用いることができる。プラスチックとしては、ポリエチレン，ポリスチレン，ポリカーボネート，ポリプロピレン，ポリアミド，フェノール樹脂，エポキシ樹脂，ポリカルボジイミド樹脂，ポリ塩化ビニル，ポリフッ化ビニリデン，ポリフッ化エチレン，ポリイミド及びアクリル樹脂などを例示することができる。無機高分子としては、ガラス，水晶，カーボン，シリカゲル、及びグラファイトを例示することができる。金属としては、金，白金，銀，銅，鉄，アルミニウム，磁石などの常温固体金属を例示することができる。セラミックとしては、サファイア，アルミナ，シリカ，炭化ケイ素，窒化ケイ素、及び炭化ホウ素などを例示することができる。特に、光透過性に優れ、基材界面の平坦性が高く、且つ、平坦性を保持しやすい石英，水晶，ＢＫ−７やＳＦ−２などの各種光学ガラス、サファイアなどが好ましい。
【００３１】
また、プライマや核酸合成などのプローブ１０３が固定しやすい様に、支持基体１０１表面に適当な官能基を導入しても良い。この様な官能基としては、アミノ基，チオール基，カルボキシル基，ヒドロキシル基，アルデヒド基，ケトン基などが挙げられる。これらの官能基を導入する方法としては、支持基体１０１上に適当な酸化物を導入した後、カルボン酸，ホスホン酸，リン酸エステル，有機シラン化合物を反応する方法が挙げられる。また、支持体表面上に、金，銀，水銀，インジウム，パラジウム，ルテニウム，亜鉛などの貴金属を導入した後、有機硫黄化合物，有機セレン化合物、または、有機テルル化合物などを反応させる方法も挙げられる。さらに、プローブを固定するための反応効率を高める手法として、二価性の化合物を用いて、ＮＨＳ−エステル基，イミドエステル基，スルフィジル基，エポキシ基，ヒドラジド基などの官能基を導入しても良い。これらの支持体最表面に導入された官能基に対して、アミノ基，チオール基，ビオチン基などで修飾されたプローブ１０３を供給することで支持基体１０１上に効果的にプローブを固定化することができる。また、アビジン，デンドロン，クラウンエーテルなどの化合物を介して、プローブ１０３を固定しても良い。
【００３２】
プローブ１０３についても、測定対象の核酸試料１０４を補足できるものであれば特に制限はない。核酸試料１０４を直接補足できる様なプローブとしては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡなどの核酸、または、酵素などのタンパク質が挙げられる。また、染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター，ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを介して、核酸試料１０４を補足しても良い。
【００３３】
図１では、水溶性の被覆膜１０２を溶解し、除去した後、プローブ１０３を基板に固定したが、図２に示す様に、プローブ１０３が固定化された支持基体１０１上に水溶性の被覆膜２０２を有する核酸分析デバイスを出発材とし用いても良い。
【実施例２】
【００３４】
金属を材質とする三角柱が近接すると、その間の空間には、強力な局在型表面プラズモンが発生することが非特許文献３に示されている。本実施例では、この局在型表面プラズモンを利用した核酸分析デバイスを用いる場合について説明する。
【００３５】
核酸分析デバイスの概要を図３に示す。本実施例の核酸分析デバイスでは、支持基体３０１上に数多くの微細な三角柱である金属体３０２が搭載されている。金属体３０２が近接する部位に、プローブ３０３が金属３０４を介して固定化されている。デバイスの製造方法について、図４を用いて説明する。金属体３０２を形成する金属に特に制限がないが、局在型表面プラズモンを高めるためには、金，銀，白金，アルミニウム、又は銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることが望ましい。
【００３６】
（１）金属膜の形成
平滑な支持基体３０１上に、薄膜状の金属３０４を形成する。平滑な支持基体３０１には、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板などが用いられる。金属３０４は、上記裏面より励起光を照射する場合には、その厚さは薄いほど好ましく、より好ましくは５〜１００ｎｍである。薄膜は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いて作られる。金属３０４に特に制限はないが、金属体３０２と支持基体３０１との接着性を高めるためにはＴｉが望ましい。
【００３７】
（２）シリコン膜の形成，（３）シリコンのパターニング
金属３０４上に、厚さが５ｎｍ以上のシリコン膜３０５を形成する。薄膜形成方法は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどが好ましい。得られたシリコン膜に対して、フォトリソグラフィ，エッチングを施し、パターニングを行う。パターンは、向き合った金属体３０２をアレイ状に配置するための所望のパターンに準じる。例えば、１μｍピッチで向き合った金属体３０２を構成した場合、形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。フォトリソグラフィは、既存のｉ線（波長３６５ｎｍ），ＫｒＦエキシマレーザ（波長２４８ｎｍ），ＡｒＦエキシマレーザ（波長１９３ｎｍ），Ｘ線、又は電子線を光源とした方法を用いることができる。エッチングのパターニングの精度を高めるには、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）を用いることが好ましい。
【００３８】
（４）絶縁膜の形成，（５）絶縁膜のエッチング，（６）シリコンのエッチング
シリコン上に、ＣＶＤを用いて、絶縁膜３０６を形成する。絶縁膜３０６の厚さは、金属体３０２間の距離を制御するものである。金属体３０２間の距離が短い程、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を高めることができる。好ましい厚さは５０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。本実施例のような絶縁膜３０６の膜厚で金属体間の距離を制御する方法は、１５ｎｍ以下の距離の制御も精度良く行え、製造上のバラツキを小さくできる。このような絶縁膜としては、半導体のゲート電極のサイドウォール（側壁酸化膜）製造プロセスで用いられる二酸化ケイ素や窒化ケイ素が好ましい。本実施例では、絶縁膜を用いるプロセスを示したが、（４）の薄膜形成から（６）のエッチングプロセスでの膜厚を制御できればよく、金属膜で実施しても良い。これらのプロセスで用いられるエッチングについては、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。以上のプロセスを実施することにより、金属体３０２間の距離を制御する仕切り板３０７を形成することができる。
【００３９】
（７）金属膜の形成，（８）仕切り板の除去
金属膜の厚さは、金属体３０２の高さを制御するものである。局在型表面プラズモンが効果的に生じる厚さは、計測時に用いる励起波長により異なる。望ましい厚さは１０００ｎｍ以下である。薄膜形成方法としては、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いることができる。仕切り板の除去は、一般的なウェット（またはドライ）エッチングを行う。具体的には、二酸化ケイ素，窒化ケイ素とともに、フッ酸または、フッ酸を含む溶液を用いる。
【００４０】
（９）レジスト塗布，（１０）パターニング
パターニングの大きさや形状は、局在型表面プラズモンの効果に大きく関わる。図３に示した様な、三角形に類似した形状であれば、三角形の一辺が１０００ｎｍ以下であることが好ましい。レジスト３０８としては、電子線用のネガ型ポジストを用いることができる。具体的には、ＴＥＢＮ−１（株式会社トクヤマ社製）が挙げられる。レジストをスピンナーで塗布した後、ホットプレートで２〜５分程度プリベイクする。加速電圧５０〜１００ＫＶの電子線で描画した後、乳酸エチル，イソプロパノール、またはエタノールで現像する。
【００４１】
（１１）エッチング，（１２）レジスト除去
パターニングされたレジストをマスクとして、金属体３０２を形成する。パターン精度を高めるには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。レジスト除去には、広く一般的に用いられるオゾンアッシングのプロセスを用いることができる。
【００４２】
（１３）プローブ固定
プローブ３０３が核酸である場合、固定方法には種々の方法が考えられるが、例として、アミノプロピルリン酸を用いる方法を記述する。デバイスをアミノプロピルリン酸水溶液にディップして、金属３０４上にアミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応させる。次に、予めビオチンを末端に修飾しておいたプローブを反応させることにより、近接した二つの金属体３０２の間にプローブを固定する。プローブ３０３が核酸合成酵素の様なタンパク質であっても、同様の方法で固定化することができる。具体的には、アミノ化された酸化膜上に二価性試薬であるＮ−（４−Maleimidobutyryloxy）succinimide（同仁化学研究所社製、ＧＭＢＳ）を反応させた後、核酸合成酵素を反応させることにより核酸合成酵素を固定することができる。その他、酸化膜上にニトロセルロース，ポリアクリルアミドなどとの物理吸着を利用する方法，ヒスチジンとニッケルイオンやコバルトイオンとの特異的な親和を利用する方法、またはビオチンとアビジンの結合を利用する方法などを用いることができる。得られた核酸分析デバイスに対して、実施例１で示した通りに、水溶性の被覆膜を導入することにより、本実施例の核酸分析デバイスを作製することができる。
【実施例３】
【００４３】
核酸分析デバイスの使用形態の一例について、図５を参照しながら説明する。支持基体５０１の上に、金属体が格子状に配置されている領域５０２が複数搭載されている。金属体は、先に述べた、近接した二つの金属体の間にプローブを固定した構造体が該当する。配置の間隔は、解析しようとする核酸試料、蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体５０１とし、１マイクロ・メートル間隔で格子状に金属構造体を配置した領域５０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、支持基体５０１上に搭載することができる。したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。前記のように、複数の反応領域を支持基体５０１の上に設けるには、流路５０４を予め設けた反応チャンバー５０３を、光透過性支持基体５０１の上にかぶせることにより達成できる。反応チャンバー５０３は、流路５０４の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）などの樹脂基体からなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質などを保存・温度管理する温調ユニット５０５，反応液を送り出す分注ユニット５０６，液の流れを制御するバルブ５０７，廃液タンク５０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応開始前に流路５０４を通じて洗浄液を供給することにより、水溶性の被覆膜を除去することができる。被覆膜を除去した洗浄液は廃液タンク５０８に収納される。
【実施例４】
【００４４】
核酸分析装置の実施例について、図６を用いて説明する。本実施例では、核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６、及びＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８及び６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、水溶性の洗浄液で核酸分析デバイス上の被覆膜を除去した後、伸長反応を行う。伸長反応時に取り込まれた蛍光体はレーザ光により励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００４５】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006，vol. 103，pp 19635-19640（非特許文献４）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することにより切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００４６】
さらに、本実施例では、P.N.A.S. 2008，vol. 105，pp 1176-1181（非特許文献５）に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることでにより洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れる。逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【符号の説明】
【００４７】
１０１，２０１，３０１，５０１ 支持基体
１０２，２０２ 水溶性の被覆膜
１０３，２０３，３０３ プローブ
１０４，２０４ 核酸試料
１０５，２０５ 核酸合成酵素
１０６，２０６ 蛍光色素を有するヌクレオチド
１０７，２０７ 測定対象の蛍光色素
３０２ 金属体
３０４ 金属
３０５ シリコン膜
３０６ 絶縁膜
３０７ 仕切り板
３０８ レジスト
５０２ 金属体が格子状に配置されている領域
５０３ 反応チャンバー
５０４ 流路
５０５ 温調ユニット
５０６ 分注ユニット
５０７ バルブ
５０８ 廃液タンク
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、当該支持基体の表面に水溶性の被覆膜を備える核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が、蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、高分子化合物であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、金属であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、アルミニウムであることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
核酸分析に用いるプローブを前記支持基体上に備えることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが、核酸、又はタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、
ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、
前記核酸分析デバイスに、水溶性の洗浄液を供給し、水溶性の被覆膜を除去し、
蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、
前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、
核酸試料の塩基配列を解析する方法。
【請求項１】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、当該支持基体の表面に水溶性の被覆膜を備える核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が、蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、高分子化合物であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、金属であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記水溶性の被覆膜が、アルミニウムであることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
核酸分析に用いるプローブを前記支持基体上に備えることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが、核酸、又はタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、水溶性の洗浄液を供給する手段と、
ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、
前記核酸分析デバイスに、水溶性の洗浄液を供給し、水溶性の被覆膜を除去し、
蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、
前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、
核酸試料の塩基配列を解析する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２３６９６９（Ｐ２０１０−２３６９６９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８４００２（Ｐ２００９−８４００２）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]