標的タンパク質の翻訳条件評価方法
【課題】標的タンパク質の翻訳条件を、単量体と凝集体との比率を指標とし、迅速に評価するための方法の提供。
【解決手段】ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む溶液中の蛍光標識物質から、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、ｂ）標準物質として標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む溶液中の標準物質から、工程ａ）と同様に並進拡散時間等を求める工程と、ｃ）工程ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分Ａとその他の物質の画分Ｂの２成分に区分し、画分Ａの割合及び／又は数量を算出することにより、標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程とを有する遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【解決手段】ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む溶液中の蛍光標識物質から、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、ｂ）標準物質として標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む溶液中の標準物質から、工程ａ）と同様に並進拡散時間等を求める工程と、ｃ）工程ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分Ａとその他の物質の画分Ｂの２成分に区分し、画分Ａの割合及び／又は数量を算出することにより、標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程とを有する遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、蛍光解析法を用いて迅速かつ簡便に評価するための方法、及び、該方法により得られた評価に基づき、標的タンパク質の翻訳条件を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学や構造生物学の研究においては、タンパク質を用いた実験が通常行われている。例えば、あるタンパク質と他の分子との相互作用を解析するために、該タンパク質を固相化した後、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等の手法を用いることが広く行われている。
【０００３】
これらの実験等に用いられるタンパク質は、組織等から抽出して精製することにより得ることもできるが、組織等からの抽出及び精製は、非常に困難であり、精製の過程でタンパク質が失活する場合も多い。また、精製操作における損失や、元々組織中における発現量が少ない等により、充分な量のタンパク質が得られない場合もある。これに対して、遺伝子組換え技術を用いた発現系により目的のタンパク質（標的タンパク質）を過剰発現させた後、回収することにより、充分な精度及び量のタンパク質をより簡便に得ることができる。特に、大量のタンパク質を簡便かつ安価に得られるため、大腸菌の発現系を用いたタンパク質の発現が多く行われている。
【０００４】
大腸菌の発現系を用いてタンパク質を発現させた場合には、タンパク質が正常にフォールディングされない場合が多いという問題がある。例えば大腸菌の細胞内において外来タンパク質が急速に大量発現すると、該外来タンパク質が凝集して多量体が形成されたり、該外来タンパク質の凝集体を含む顆粒が形成されたりする。このような顆粒は、封入体（Ｉｎｃｌｏｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）と呼ばれる。このため、大腸菌内に過剰発現させた標的タンパク質を回収するためには、まず、大腸菌を破砕し、遠心分離法を用いて標的タンパク質の凝集体や封入体を回収する。その後、変性剤を用いてこれらの凝集体や封入体を一度変性させて単量体にする。さらに、変性剤を取り除いて、変性させた単量体を巻き戻すことにより、正常なフォールディングを有する標的タンパク質を得ることができる。
【０００５】
ここで、変性させた単量体を巻き戻す工程では、徐々に変性剤を除去することが肝要であり、通常、約４８時間という長時間をかけて変性剤の除去が行われている。また、タンパク質の種類によっては、巻き戻しを行った際に、一部のタンパク質は巻き戻されずに凝集して沈澱することもある。このように、変性させたタンパク質の巻き戻しには、時間と手間がかかる。一方で、過剰発現させたタンパク質の凝集や封入体の形成は、翻訳条件に大きく依存している。そこで、翻訳条件を最適化し、過剰発現させたタンパク質による凝集体や封入体の形成を抑制することにより、変性させたタンパク質の巻き戻し工程を要することなく、迅速かつ簡便に、正常なフォールディングを有する標的タンパク質を得ることができる。
【０００６】
翻訳条件を最適化するためには、ある翻訳条件において発現させたタンパク質が正常なフォールディングを有するタンパク質であるか、又は凝集体であるかを速やかに評価することが重要である。タンパク質の構造を溶液中で観測する方法として、例えば、円偏光２色性を計測し、ヘリックス構造やシート構造等の特定の二次構造を検出し、構造の確認を行う方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の翻訳条件を検討するためには、それぞれの翻訳条件において得られるタンパク質の、正常なフォールディングを有していることが期待できる単量体と凝集体との比率を指標として考慮することが好ましい。しかしながら、円偏光２色性を計測する方法では、タンパク質が大方巻き戻った状態は計測することができるが、凝集体を観測することはできないため、単量体と凝集体の比率を計測することは困難である。
【０００８】
その他、遠心分離法により凝集体を沈降させて回収した後、紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法等の公知のタンパク質定量方法を用いて定量することによっても、各翻訳条件における凝集体量を測定することができる。しかしながら、凝集体は非常に取り扱いが困難であり、凝集体のみを溶液から回収した後に定量する場合には、精度において信頼性が低く、このようにして得られた凝集体量に基づいて翻訳条件を検討することはやはり困難である。
【０００９】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、単量体と凝集体との比率を指標として、迅速かつ簡便に評価するための方法、及び、該方法により得られた評価に基づき、標的タンパク質の翻訳条件を改善する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的タンパク質と一分子当たり同等の分子量や蛍光強度を有する物質を標準物質とすることにより、一分子蛍光分析法及び蛍光解析法を用いて、各翻訳条件において発現された標的タンパク質のうち、単量体の割合及び量を解析することができるため、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｂ）一分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、前記蛍光解析法が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、さらに、前記蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識された生産量標準物質を用いて、（ｄ）一分子蛍光分析法を用いて、前記生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）において求められた数量と、前記工程（ｃ）において算出された画分（Ａ）の数量とを比較することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、前記発現系が、無細胞発現系であることを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、前記いずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により評価した後、前記工程（ｃ）において得られた画分（Ａ）の割合及び／又は数量を、調整前の翻訳条件における場合よりも増大させるように前記発現系の翻訳条件を調整することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法を提供するものである。
また、本発明は、翻訳条件の調整が、発現用溶液中に界面活性剤、グルタチオン、分子シャペロンからなる群より選択される１以上を添加することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法を用いることにより、各翻訳条件において発現された標的タンパク質のうち、単量体の割合及び量を迅速かつ簡便に測定することができるため、遺伝子組換え技術を用いた発現系における標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することができる。特に、ＦＣＳ解析等の蛍光解析法では、一試料当たり１〜数１０秒程度の非常に短い時間で溶液中の単量体の割合及び量を解析することが可能であり、翻訳条件の評価に要する時間を従来よりも飛躍的に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における遺伝子組換え技術を用いた発現系とは、生物が有する転写・翻訳機構を利用して標的タンパク質（発現させる目的のタンパク質）を発現させる系であって、転写時の鋳型として、遺伝子組換え技術を用いて調製した標的タンパク質をコードする遺伝子（塩基配列）を有するＤＮＡを用いる発現系を意味する。このようなＤＮＡ（標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡ）は、転写のための鋳型として機能し得るものであり、かつ転写産物であるｍＲＮＡが翻訳に供され得るものであれば、特に限定されるものではない。例えば、汎用されているタンパク質発現用ベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだものであってもよく、標的タンパク質をコードする遺伝子の５’末端にプロモーター配列と３’末端にターミネーター配列をそれぞれ有する直鎖状ＤＮＡであってもよい。該標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても作製することができる。なお、このようなタンパク質発現用ベクターや、プロモーター配列及びターミネーター配列は、標的タンパク質の発現に利用する生物の翻訳機構を考慮して、適宜決定することができる。例えば、標的タンパク質の発現に大腸菌を用いる場合には、Ｔ７プロモーターやＴ７ターミネーター等を用いることができる。
【００１４】
本発明における発現系は、特に限定されるものではなく、タンパク質の過剰発現等に通常用いられている発現系のいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌の転写・翻訳機構を利用した発現系であってもよく、哺乳細胞や昆虫細胞等の培養細胞の転写・翻訳機構を利用した発現系であってもよい。本発明における発現系としては、大腸菌を利用した発現系であることが好ましい。培養細胞を利用した発現系よりも操作が簡便であり、かつ、試薬等がより安価であり、経済的であるためである。また、通常、原核細胞である大腸菌を利用した発現系のほうが、真核細胞である培養細胞を利用した発現系よりも、発現させたタンパク質が凝集等を起こしやすく、翻訳条件の適正化が特に重要である。このため、大腸菌を利用した発現系により発現させた標的タンパク質に対して本発明の翻訳条件評価方法を用いることにより、迅速かつ簡便に翻訳条件を評価し得るという本発明の効果がより効果的に発揮される。
【００１５】
また、本発明における発現系は、生細胞内において標的タンパク質を発現させる系であってもよく、無細胞発現系であってもよい。ここで、生細胞内において発現させる系として、例えば、形質転換により標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを導入された大腸菌やトランスフェクションにより標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを導入された培養細胞を培養して、細胞内に標的タンパク質を過剰発現させた後、大腸菌や培養細胞から標的タンパク質を抽出する発現系等がある。一方、無細胞発現系とは、生細胞ではなく、リボゾームや酵素等の転写・翻訳に必要な全ての成分を含む細胞抽出液を利用して細胞外でタンパク質を発現させる系である。このような無細胞発現系として、大腸菌由来の細胞抽出液を利用する系、コムギ由来の細胞抽出液を利用する系等が広く用いられている。細胞抽出液に、標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡ、メチオニン等のアミノ酸、発現用バッファー等を適宜添加した発現用溶液を、適当な温度及び時間インキュベートすることにより、タンパク質を発現させることができる。インキュベートの温度や時間は、利用する細胞抽出液中の酵素や標的タンパク質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００１６】
細胞から発現させたタンパク質を抽出する操作が不要であること、封入体の形成がより抑えられること、生細胞に影響を与えるタンパク質であっても容易に発現させることができること等により、本発明における発現系は無細胞発現系であることが好ましく、大腸菌由来の細胞抽出液を利用する無細胞発現系であることがより好ましい。
【００１７】
本発明の翻訳条件評価方法においては、まず、標的タンパク質を、蛍光物質を用いて標識し、蛍光標的タンパク質とする。該蛍光物質は、通常タンパク質の標識に用いられる蛍光物質であれば、特に限定されるものではない。該蛍光物質として、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)等がある。標的タンパク質の活性や機能等を損なうおそれが小さいことから、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。
【００１８】
蛍光物質による標識の態様は特に限定されるものではなく、標的タンパク質のＮ末端に標識してもよく、Ｃ末端に標識してもよく、標的タンパク質のタンパク質表面の任意の場所に標識してもよい。標的タンパク質のフォールディング等の影響を受けにくく、蛍光標識の強度が損なわれるおそれが小さいことから、標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に標識することが好ましい。また、標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質は一分子であってもよく、複数分子であってもよい。さらに、標的タンパク質毎に標識する蛍光物質の分子数が異なっていてもよい。但し、解析を後述するＦＩＤＡ又はＦＩＤＡ−ＰＯにより行う場合には、標的タンパク質一分子当たりの蛍光強度が等しい必要がある。このため、標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質量が一定であることが好ましく、標的タンパク質一分子当たり一分子の蛍光物質が標識されていることがより好ましい。
【００１９】
標的タンパク質を蛍光物質により標識する方法は、特に限定されるものではなく、タンパク質を標識する場合に通常用いられる方法により標識することができる。例えば、タンパク質を発現させた後に化学的に標識してもよく、予め蛍光標識されたタンパク質を発現させてもよい。タンパク質を発現させた後に蛍光標識を行う工程を減らすことができ、操作工程が少なくて済むため、本発明の標的タンパク質は、予め蛍光標識されたタンパク質を発現させる方法により蛍光標識されることが好ましい。
【００２０】
予め蛍光標識されたタンパク質を発現させる方法として、例えば、蛍光物質をコードする遺伝子を、標的タンパク質をコードする遺伝子に付加し、蛍光物質が付加された標的タンパク質を発現させる方法や、蛍光標識したアミノ酸を用いて翻訳する方法等がある。標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質量を容易に制御し得るため、蛍光物質をコードする遺伝子を付加した標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを用いる方法や、標的タンパク質のある特定の部位にのみ蛍光標識されたアミノ酸を導入する方法が好ましい。
【００２１】
特に、蛍光標識アミノ酸として、天然アミノ酸のコドン以外のアンバーコドンやｃｇｇｇ等の４塩基コドン等の非天然型コドンに対するアンチコドンを有する非天然型ｔＲＮＡと蛍光物質との複合体を用いて、タンパク質の翻訳時に蛍光標識を行う方法が好ましい（例えば特開２００７−９７４２３号公報参照。）。標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡの適当な箇所に該非天然型コドンを挿入することにより、標的タンパク質の反応部位の保護や構造の安定性に配慮して蛍光標識することができる。特に標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に特異的に蛍光標識されるように、標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡに該非天然型コドンを挿入することが好ましい。また、非天然型コドンとして４塩基コドンを用いた場合に、４塩基の読み枠を３塩基で読んでしまった場合には次が終止コドンとなるようにすることにより、翻訳時の読み枠のずれによる標的タンパク質以外のタンパク質の発現を効果的に防止することができ、標的タンパク質の蛍光標識効率をほぼ１００％とすることができる。
【００２２】
翻訳後の精製を簡便にすることができるため、標的タンパク質には精製用のタグを付加しておくことが好ましい。標的タンパク質のタグとして、タンパク質の精製に通常用いられているタグを用いることができる。該タグとして、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)タグ、ＨＡ（ｈｅｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等がある。また、標的タンパク質のタグとして、これらの汎用タグを１種類のみで用いてもよく、複数種類を組み合わせたものを用いてもよい。また、タグは標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加することが好ましい。これらの汎用タグをコードする塩基配列を、標的タンパク質をコードする遺伝子に付加することにより、タグ付標的タンパク質を発現させることができる。
【００２３】
本発明の翻訳条件評価方法に供される標的タンパク質溶液は、精製された蛍光標的タンパク質の溶液であることが好ましい。蛍光標的タンパク質の精製は、カラムクロマトグラフィー法等のタンパク質の精製に通常用いられる方法により行うことができる。例えば、標的タンパク質がタグ付タンパク質である場合には、該タグと特異的に結合し得る物質を充填したアフィニティカラム等を用いて常法により精製することができる。
【００２４】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｂ）分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。
【００２５】
まず、一分子蛍光分析法を用いて、前記蛍光標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める。一分子蛍光分析法による検出であるため、適当な測定用バッファーを用いて希釈等することにより、標的タンパク質溶液の濃度を１〜１００ｎＭに調整しておくことが好ましい。標的タンパク質溶液の濃度は１〜２０ｎＭであることがより好ましく、１〜１０ｎＭであることが特に好ましい。測定用バッファーは、蛍光シグナルや標的タンパク質の活性やフォールディングに対する影響が少ないバッファーであれば、特に限定されるものではなく、通常タンパク質を用いたアッセイ系において用いられるバッファーを用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。濃度を調整した標的タンパク質溶液に、該標的タンパク質を標識している蛍光物質の分光特性に最適な波長の光を照射し、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質からの蛍光シグナルを、高感度な検出装置を用いて検出し、該蛍光シグナルの揺らぎを計測する。蛍光シグナルの検出は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて行うことができる。
【００２６】
本発明における溶液中の蛍光標識物質とは、一分子蛍光分析法により、一塊の物質として蛍光シグナルが検出される蛍光標識された物質を意味し、一分子からなる物質であってもよく、複数分子からなる凝集体であってもよい。該標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質としては、蛍光標的タンパク質のみであるため、標的タンパク質一分子当たりに標識される蛍光物質量が等しい場合には、理論上は、全ての蛍光標識物質から検出される蛍光シグナルはほぼ等しくなる。しかしながら、標的タンパク質の中には発現後フォールディングや巻き戻しが正常に行われない等により凝集体を形成するものがあり、このような凝集体と、正常なフォールディングを有する単量体の蛍光標的タンパク質では、一蛍光標識物質当たりの大きさや蛍光強度が大きく異なり、該標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から検出される蛍光シグナルは多様となる。
【００２７】
そこで、単量体の蛍光標的タンパク質とほぼ同等の蛍光シグナルを期待できる物質や、単量体の蛍光標的タンパク質から理論上検出される蛍光シグナルを概算するための基準となり得る物質を標準物質とし、該標準物質の蛍光シグナルから得られる解析値を基準とすることにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、単量体の蛍光標的タンパク質であるか、又は凝集体等の単量体以外の蛍光標的タンパク質であるか、を区分することができる。つまり、それぞれの翻訳条件において、発現された標的タンパク質全体に対しての正常なフォールディングを有していることが期待できる単量体の割合や数量等を算出することができるため、各翻訳条件を評価することができる。
【００２８】
なお、標準物質は、標的タンパク質の蛍光シグナル解析の基準とするため、標的タンパク質の標識に用いられる蛍光物質と同一種類の蛍光物質又は当該蛍光物質により標識された物質であることを要する。該標準物質の分子量や蛍光標識の方法等は、解析方法等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質や、蛍光標的タンパク質と一分子当たり同等の蛍光強度を有している物質等が挙げられる。標準物質はタンパク質であってもよく、非タンパク質であってもよい。標準物質がタンパク質である場合には、蛍光標識の手法による相違を回避することができるため、標的タンパク質と同じ標識方法により蛍光標識されたタンパク質であることが好ましい。同様に、標的タンパク質と同じ発現系を用いて発現させたタンパク質であることも好ましい。
【００２９】
凝集体の大きさや構成する分子数等は多種多様であり、凝集体に特有の蛍光シグナルを同定することは困難であるが、標準物質の蛍光シグナルを基準とした２成分解析を行うことにより、簡便に単量体と凝集体の割合を概算することが可能となる。つまり、標準物質の蛍光シグナルとほぼ同等の蛍光シグナルを有する蛍光標識物質を単量体として区分し、標準物質の蛍光シグナルとは異なる蛍光シグナルを有する蛍光標識物質を凝集体として区分することにより、単量体の割合や数量を算出することができる。
【００３０】
具体的には、標的タンパク質と同様にして、一分子蛍光分析法を用いて、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める。その後、標準物質溶液の解析から求められた解析値を基準とし、標的タンパク質溶液中の解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する。例えば、画分（Ａ）の割合が低い場合には、翻訳条件が適当ではなく、正常なフォールディングを有する標的タンパク質よりも凝集体が多く得られており、翻訳条件の最適化が必要であると判断できる。一方で、画分（Ａ）の割合が高い場合には、翻訳条件が適切であると判断できる。
【００３１】
検出された蛍光シグナルは、蛍光解析法により解析される。具体的には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）により解析することができる（例えば特開２００５−８３９８２号公報参照。）。これらの解析法を適宜組み合わせて解析してもよい。
【００３２】
ＦＣＳは、蛍光分子の標識拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる解析法である。並進拡散時間は分子の大きさによって異なるため、分子の相互作用や分解、凝集等の大きさの変化をモニターするために主に用いられる解析法である。また、観測領域中に存在する蛍光分子の数を算出することができるため、試料溶液における蛍光分子の濃度を概算することが可能である。さらに、計測している系（試料溶液）中に２種類以上の大きさを持つ蛍光分子が存在している場合、それぞれの並進拡散時間を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。蛍光標的タンパク質が凝集している場合には、単量体の蛍光標的タンパク質よりも大きくなるため、並進拡散時間は長くなる。
【００３３】
例えば、まず、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質を標準物質とし、ＦＣＳにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の並進拡散時間及び数と、標準物質溶液中の標準物質の並進拡散時間を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の並進拡散時間を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＣＳ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも並進拡散時間が長い物質の画分（以下、画分（ＢＦＣＳ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＣＳ）の割合や数量を算出する。
【００３４】
ＦＣＳによる解析を行う場合の標準物質は、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質であることが好ましく、発現方法や蛍光標識の方法が標的タンパク質と異なるタンパク質であってもよい。また、標準タンパク質の一分子当たりの蛍光強度が、蛍光標的タンパク質と異なっていてもよい。
【００３５】
その他、分子量が既知であれば、標的タンパク質とは異なる分子量を有しているタンパク質も、標準物質として用いることができる。体積と分子量を等価とし、タンパク質を球状とみなすと、並進拡散時間は球の半径がパラメータとなっているため、ＦＣＳにより、並進拡散時間からタンパク質の分子量を概算することができるためである。つまり、標準物質の並進拡散時間に、標準物質と標的タンパク質との分子量比の３乗根を掛けた値が、標的タンパク質の並進拡散時間の理論値となる。標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の並進拡散時間が、該理論値よりも長い場合や、ＳＤ値が大きい場合には、標的タンパク質の凝集が疑われる。つまり、画分（ＡＦＣＳ）を、このようにして得られた理論値とほぼ同等の並進拡散時間を有する物質の画分とすることにより、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質を標準物質とした場合と同様に、標的タンパク質の翻訳条件を評価することができる。例えば、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質の分子量が既知である場合には、該蛍光物質の単量体を標準物質とすることができる。
【００３６】
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度を求めることができる解析法であり、計測している系（試料溶液）中に蛍光強度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光強度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、標的タンパク質が凝集している場合には、一蛍光標識物質当たりの蛍光強度が大きくなる。そこで、ＦＩＤＡにより一分子当たりの蛍光強度を観測し、標準物質の蛍光強度と比較することにより、標的タンパク質の凝集の有無を検出することができる。
【００３７】
例えば、まず、蛍光標的タンパク質と同等の蛍光強度を有している物質を標準物質とし、ＦＩＤＡにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の蛍光強度及び数と、標準物質溶液中の標準物質の蛍光強度を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の蛍光強度を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＩＤＡ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも蛍光強度が大きい物質の画分（以下、画分（ＢＦＩＤＡ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＩＤＡ）の割合や数量を算出する。
【００３８】
ＦＩＤＡによる解析を行う場合の標準物質は、標的タンパク質と同等の蛍光強度を有している物質であればよく、タンパク質であってもよく、非タンパク質であってもよい。例えば、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質であってもよい。標準物質がタンパク質である場合には、標的タンパク質と同じ発現系を用いて発現させたタンパク質であることが好ましい。
【００３９】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、ＦＩＤＡと蛍光偏光解析を複合させた解析法であり、蛍光分子の蛍光偏光度と分子数を求めることができる。計測している系（試料溶液）中に蛍光偏光度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光偏光度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、標的タンパク質が凝集している場合には、一蛍光標識物質当たりの蛍光強度が大きくなり、回転運動もゆっくりとなるため、蛍光偏光度が大きくなる。そこで、ＦＩＤＡ−ＰＯにより一分子当たりの蛍光偏光度を観測し、標準物質の蛍光偏光度と比較することにより、標的タンパク質の凝集の有無を検出することができる。
【００４０】
例えば、まず、蛍光標的タンパク質と一分子当たり同等の分子量と蛍光強度を有している物質を標準物質とし、ＦＩＤＡ−ＰＯにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の蛍光偏光度及び数と、標準物質溶液中の標準物質の蛍光偏光度を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の蛍光偏光度を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＩＤＡ−ＰＯ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも蛍光偏光度が大きい物質の画分（以下、画分（ＢＦＩＤＡ−ＰＯ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＩＤＡ−ＰＯ）の割合や数量を算出する。
【００４１】
ＦＩＤＡ−ＰＯによる解析を行う場合の標準物質は、蛍光標的タンパク質と同等の分子量と蛍光強度を有している物質であればよいが、標的タンパク質と同じ発現系及び蛍光標識法により得られた標準物質であることが好ましい。
【００４２】
一分子蛍光分析法において検出される蛍光シグナルは、分子の大きさに依存するものであり、分子量が同じであっても、立体構造の相違等により大きさが異なる蛍光タンパク質同士は、検出される蛍光シグナルが異なる。このため、蛍光標的タンパク質と標準物質の分子量が同一である場合であっても、解析の結果得られる並進拡散時間等が一致しない場合も多い。特に、標準物質の分子量と標的タンパク質の分子量の比に基づいて、標準物質の並進拡散時間等から標的タンパク質の並進拡散時間等を推定する場合には、いずれのタンパク質も球状であると仮定して推定するため、通常、標準物質の解析値から推定された標的タンパク質の並進拡散時間等は、実測値と１０〜２０％程度の誤差が生じ得る。しかし、凝集体の並進拡散時間等は、通常単量体から大きくかけ離れているため、標準物質の解析値を基準とすることにより、凝集体と単量体を容易に区分することができる。
【００４３】
本発明の翻訳条件評価方法の結果に基づき、翻訳条件の最適化を行うか否かを決定することができる。例えば、単量体の標的タンパク質、すなわち画分（Ａ）の割合が低い場合には、翻訳条件の最適化を行うことが好ましい。翻訳条件の最適化を検討すべきか否かの判断基準となる画分（Ａ）の割合は、標的タンパク質の種類や発現させた標的タンパク質を用いて行われるアッセイの種類等を考慮して適宜決定することができるが、画分（Ａ）の割合が６０％未満である場合には、翻訳条件の最適化を行うことが好ましい。
【００４４】
翻訳条件の最適化は、タンパク質の正常なフォールディングや巻き戻しの促進、凝集の阻害等を目的として行われる公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、発現用溶液中に、界面活性剤、還元剤、分子シャペロン等を添加することにより、翻訳条件を改善させ、画分（Ａ）の割合を増大させることができる。その他、発現温度、すなわち、転写・翻訳時の温度を、常法よりも２〜１０℃程度、好ましくは５℃程度低下させてもよい。
【００４５】
発現用溶液に添加する界面活性剤、還元剤、分子シャペロン等の種類や濃度は、標的タンパク質の種類や、本発明の翻訳条件評価方法の結果等を考慮して、適宜決定することができる。界面活性剤と還元剤や分子シャペロン等を適宜組み合わせて用いてもよい。また、複数種類の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
例えば、まず、Ｂｒｉｊｉ３５等の非イオン性界面活性剤を０．１〜０．５％添加した条件で標的タンパク質を発現させ、本発明の翻訳条件評価方法により、翻訳条件を評価し、画分（Ａ）の割合が６０％未満である等、翻訳条件の改善が見られない場合や改善が不十分である場合には、他の種類の界面活性剤、例えば、ジギトニンを０．１〜０．５％添加する等の翻訳条件の改善を行う。
【００４７】
標的タンパク質がＳ−Ｓ結合を有する場合には、翻訳条件の改善のために、発現用溶液にグルタチオンを添加することが好ましい。酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを１：０〜４：１の割合で添加することがより好ましい。添加量は、本発明の翻訳条件評価方法の結果を考慮して適宜決定することができるが、発現用溶液に対して最終濃度が１０ｍＭ程度となるように添加することが好ましい。
【００４８】
分子シャペロンとは、タンパク質の巻き戻りを助ける働きをする分子であり、このような機能を有することが公知の分子の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、大腸菌の転写・翻訳系を利用した発現系の場合には、分子シャペロンとして、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ等を用いることができる。
【００４９】
また、本発明の翻訳条件評価方法においては、画分（Ａ）の割合と試料溶液に含まれる蛍光標識物質の数より数量も求めることができる。そこで、標的タンパク質を発現させる発現系と同一の発現系において高発現し得るタンパク質を生産量標準物質として、該生産量標準物質の発現量を基準として、発現効率の点から標的タンパク質の翻訳条件を評価することもできる。なお、標準物質と同様に、該生産量標準物質は、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識されているタンパク質であることを要する。また、該生産量標準物質は、標的タンパク質の発現に用いる発現系において高発現し得ることが確認されているタンパク質であればよく、標的タンパク質と分子量が異なるものや、異なる手法で蛍光標識されたものであってもよい。
【００５０】
具体的には、まず、該生産量標準物質を、標的タンパク質と同じ発現系により発現させた後、一分子蛍光分析法を用いて、該生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める。該蛍光解析法は、ＦＣＳであってもよく、ＦＩＤＡであってもよく、ＦＩＤＡ−ＰＯであってもよい。解析の結果求められた数量と、前述の方法により求めた画分（Ａ）の数量とを比較することにより、標的タンパク質の翻訳条件を評価することができる。例えば、該生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量よりも、画分（Ａ）の数量が低い場合には、翻訳条件の最適化により標的タンパク質の生産量の向上が期待できると判断できる。一方で、画分（Ａ）の割合が高い場合には、翻訳条件が適切であると判断できる。
【００５１】
標的タンパク質の生産量を向上させるための翻訳条件の最適化は、発現量の増大を目的として行われる公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。具体的には、タンパク質の正常なフォールディングや巻き戻しの促進、凝集の阻害等を目的とする場合の翻訳条件の最適化において用いられる手法として挙げられたものを用いることができる。その他、発現時間を延長又は短縮させてもよい。
【００５２】
標的タンパク質の発現から翻訳条件の評価、検討、及び確定までのフローチャートを図１に示す。具体的には、蛍光標的タンパク質と同等の分子量を有している物質を標準物質とし、標的タンパク質と生産量標準物質を無細胞発現系により予め蛍光標識されたＨｉｓタグ付タンパク質として発現させ、ＦＣＳにより解析した場合の一連の手順を示している。なお、本発明の翻訳条件評価方法は該一態様に限定されるものではない。
【００５３】
まず、ＦＣＳにより標準物質の並進拡散時間（Ｔ０）を計測する（ステップ１）。また、生産量標準物質を無細胞発現系により転写・翻訳した後（ステップ２）、精製する（ステップ３）。ＦＣＳにより、精製した生産量標準物質溶液中の各標準物質の数量（Ｎｃ）を計測する（ステップ４）。さらに、蛍光標的タンパク質を無細胞発現系により転写・翻訳した後（ステップ５）、精製する（ステップ６）。ＦＣＳにより、精製した蛍光標的タンパク質を希釈した標的タンパク質溶液中の各標準物質の並進拡散時間（Ｔ）を計測する（ステップ７）。標的タンパク質溶液中の各標準物質を、並進拡散時間がＴ≒Ｔ０である画分（ＡＦＣＳ）と、並進拡散時間がＴ＞Ｔ０である画分（Ｂ）に区分し、各区分の割合を計測する（ステップ８）。その後、画分（ＡＦＣＳ）が６０％以上であるかどうかを判断し（ステップ９）、画分（ＡＦＣＳ）が６０％未満である場合には、翻訳条件の検討を行い（ステップ１０）、検討後の翻訳条件により再度転写・翻訳し、同様に画分（ＡＦＣＳ）の割合を算出する。画分（ＡＦＣＳ）が６０％以上である場合には、画分（ＡＦＣＳ）の数量（Ｎ）とＮｃを比較する（ステップ１１）。画分（ＡＦＣＳ）の数量（Ｎ）が、標的タンパク質の使用目的に適した生産量であるか否かを判断し（ステップ１２）、生産量が不足している場合には翻訳条件の検討を行い（ステップ１３）、検討後の翻訳条件により再度転写・翻訳し、同様に画分（ＡＦＣＳ）の割合及び数量を算出する。生産量が充分である場合には、翻訳条件を確定する（ステップ１４）。なお、標準物質の並進拡散時間（Ｔ０）の計測（ステップ１）と、精製した蛍光標的タンパク質を希釈した標的タンパク質溶液中の各標準物質の並進拡散時間（Ｔ）の計測（ステップ７）は同時に行ってもよい。同様に、生産量標準物質の転写・翻訳（ステップ２）、精製（ステップ３）、各標準物質の数量（Ｎｃ）の計測（ステップ４）は、蛍光標的タンパク質（ステップ５〜８）と同時に行ってもよい。
【００５４】
並進拡散時間に代えて、蛍光強度や蛍光偏光度を計測することにより、ＦＩＤＡやＦＩＤＡ−ＰＯによる解析を行う場合であっても、ＦＣＳと同様の手順により翻訳条件を評価し、最適化した後確定することができる。
【００５５】
本発明の翻訳条件評価方法は、一分子蛍光分析法を用いるため、一試料当たり１〜数１０秒程度の非常に短い時間で計測が可能であり、翻訳条件を従来に無く迅速かつ簡便に評価することができる。従来、大腸菌への発現用ベクターの導入、大腸菌の大量培養、封入体の調整、発現させたタンパク質の変性、巻き戻し、遠心分離による凝集体の確認、という一連の作業に、ほぼ３日間程度要していたが、例えば、無細胞発現系を用いて標的タンパク質発現させる場合、標的タンパク質の発現に約２時間、精製を含むＦＣＳ計測用試料の調製に約１時間、ＦＣＳ計測に約１５秒程度により、翻訳条件の評価を行うことができる。
【００５６】
また、翻訳条件の評価以外にも、タンパク質の調製条件の検討にも応用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等の手法を用いて、標的タンパク質と他の分子との相互作用解析を行う場合には、標的タンパク質を固相化することが広く行われているが、タンパク質の固相化のためのバッファー条件の検討や、固相化によるタンパク質の構造変化の評価等においても、本発明の翻訳条件評価方法を応用することができる。
【００５７】
その他、標的タンパク質溶液に、標的タンパク質と反応する分子を添加した反応溶液を、公知の一分子蛍光分析システムを用いて蛍光解析を行うことにより、標的タンパク質と該分子との相互作用を確認することができる。例えば、標的タンパク質と該分子との反応の強さが妥当であれば、標的タンパク質の巻き戻しが上手くいっており、翻訳条件が適当であると判断することができる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
［実施例１］
Ｎ末端に蛍光色素ＴＡＭＲＡ、Ｃ末端にＨｉｓタグをそれぞれ付加した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質１（以下、タンパク質１という。）を、無細胞発現系を用いて発現させ、翻訳条件を評価し、最適化を行った。タンパク質１の分子量は約２０ｋＤａである。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｉｎ−ｐｏｉｎｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ５４３（オリンパス社製）に添付の発現用ベクターに、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質１をコードする遺伝子と該遺伝子のＣ末端にＨｉｓタグをコードする遺伝子を組み込み、タンパク質１用発現ベクターを作成した。このタンパク質１用発現ベクターを鋳型として、大腸菌由来無細胞発現系キットのＲＴＳ１００Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた。具体的な発現用溶液の組成を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
発現させた蛍光タンパク質１を、Ｈｉｓタグ精製レジン（Ｈｉｓ−ｓｐｉｎｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した。洗浄用バッファーとして、６０ｍＭイミダゾール及び０．１％ポリエチレン（２３）ラウリルエーテル含有ＰＢＳを、溶出用バッファーとして、５００ｍＭイミダゾール及び０．１％ポリエチレン（２３）ラウリルエーテル含有ＰＢＳを、それぞれ用いた。
精製した蛍光タンパク質１を、ＰＢＳを用いて希釈してタンパク質１溶液を調製した後、一分子蛍光分析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）にて、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを計測した。計測条件は、５４３ｎｍのレーザーを１００μＷのパワーで、１蛍光標識物質当たりの計測時間を１５秒とし、５回計測した。検出された各蛍光シグナルをＦＣＳ解析することにより、それぞれの並進拡散時間を計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた並進拡散時間を図２に示す。
【００６２】
一方、標準物質として、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体を用いた。まず、蛍光タンパク質１と同様にして、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体の並進拡散時間を測定したところ、約１００μｓであった。ここで、ＴＡＭＲＡの分子量は５００であり、タンパク質１との分子量比は約４０である。上述したように、ＦＣＳ計測で得られる並進拡散時間は、分子の半径をパラメータとしているため、両者の体積比（分子量比）の３乗根を、ＴＡＭＲＡの並進拡散時間と掛け合わせることにより、蛍光タンパク質１の理論的な並進拡散時間を算出することができる。すなわち、約１００μｓに４０の３乗根を掛け合わせた約３５０μｓが、蛍光タンパク質１の並進拡散時間の理論値である。但し、実際にはタンパク質１の立体構造は球状からはずれていると考えられるため、理論値から１０〜２０％の誤差が見込まれる。したがって、測定ごとの誤差も考慮して、蛍光タンパク質１の並進拡散時間は３００〜４２０μｓ程度と推察される。
【００６３】
計測されたタンパク質１溶液中の蛍光標識物質を、蛍光色素ＴＡＭＲＡの解析値を基準として算出された３００〜４２０μｓの並進拡散時間の蛍光標識物質を画分（Ａ）、それよりも並進拡散時間が長い蛍光標識物質を区分（Ｂ）とすると、いずれも４２０μｓよりも長く、画分（Ｂ）に区分された。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質１は凝集しており、翻訳条件が適切ではないと評価することができた。
【００６４】
そこで、表１記載の発現用溶液に界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５を０．５％となるように添加して、翻訳条件の調整を行った。具体的な発現用溶液の組成を表２に示す。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
発現させた蛍光タンパク質１を、翻訳条件調整前と同様にしてＦＣＳ計測し、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質を５回計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた並進拡散時間を図３に示す。この結果、５回全てにおいて並進拡散時間は約４００μｓとなり、いずれも画分（Ａ）に区分された。また、同様の計測を繰り返したところ、再現性も得られた。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質１は単量体であり、翻訳条件が適切であると評価することができた。つまり、界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５を適宜添加することにより、翻訳条件を改善することができた。
【００６７】
［実施例２］
タンパク質１に代えて、抗体のように振舞う免疫性タンパク質２（以下、タンパク質２という。）を用いて、タンパク質２用発現ベクターを作成した。このタンパク質２用発現ベクターを鋳型として、大腸菌由来無細胞発現系キットのＲＴＳ１００Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質２を発現させた。発現用溶液には、タンパク質の凝集回避を目的として、Ｂｒｉｊｉ３５を０．５％となるように添加した。さらに、タンパク質２はジスルフィド結合を有しているため、巻き戻り時のｓ−ｓ結合を促進するため、酸化型グルタチオンＧＳＳＧ（和光純薬社製）も添加した。具体的な発現用溶液の組成を表３に示す。
【００６８】
【表３】
【００６９】
発現させた蛍光タンパク質２を、Ｈｉｓタグ精製レジン（Ｈｉｓ−ｓｐｉｎｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した。具体的には、２４℃１０分間蛍光タンパク質２をＨｉｓタグ精製レジンと反応させた後、該レジンを洗浄用バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、０．５Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾール、０．１％Ｂｒｉｊｉ３５、ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄後、溶出用バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、０．１％Ｂｒｉｊｉ３５、ｐＨ７．４）と２４℃１０分間反応させることにより、精製した。
精製した蛍光タンパク質２を、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて希釈してタンパク質２溶液を調製した後、一分子蛍光分析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）にて、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを計測した。計測条件は、５４３ｎｍのレーザーを１００μＷのパワーで、１蛍光標識物質当たりの計測時間を１５秒とし、１０回計測した。検出された各蛍光シグナルをＦＩＤＡ解析することにより、それぞれの蛍光強度を計測した。各回（１〜１０）の計測の結果得られた蛍光強度を図４に示す。
【００７０】
一方、標準物質として、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体を用いた。まず、蛍光タンパク質２と同様にして、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体の蛍光強度を測定したところ、約４５ｋＨｚであった。そこで、４０〜５０ｋＨｚ程度の蛍光強度の蛍光標識物質を画分（Ａ）、それよりも蛍光強度が大きい蛍光標識物質を区分（Ｂ）として、計測されたタンパク質２溶液中の１０蛍光標識物質を区分すると、２、３、９回目の蛍光標識物質が画分（Ａ）、その他が画分（Ｂ）に区分された。なお、５回目の蛍光強度は、あまりに値が小さいため、信頼性が低いものとしていずれにも区分しなかった。つまり、画分（Ａ）が全体の約３０％であったため、該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質２は凝集しており、翻訳条件が適切ではないと評価することができた。
【００７１】
そこで、表３記載の発現用溶液のうち、Ｂｒｉｊｉ３５をジギトニンに代えて、翻訳条件の調整を行った。なお、ジギトニンは膜タンパク質の可溶化にも用いられている界面活性剤である。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質２を発現させた。発現させた蛍光タンパク質２を、翻訳条件調整前と同様にしてＦＩＤＡ計測し、タンパク質２溶液中の蛍光標識物質を５回計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた蛍光強度を図５に示す。この結果、５回全てにおいて蛍光強度は４０〜４５ｋＨｚとなり、いずれも画分（Ａ）に区分された。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質２は単量体であり、翻訳条件が適切であると評価することができた。つまり、界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５をジギトニンに代えることにより、翻訳条件を改善することができた。
【００７２】
［実施例３］
タンパク質の生産量の点から、実施例１において調整後の翻訳条件について評価した。
まず、実施例１の蛍光タンパク質１と同様にして、生産量標準物質を発現させた後、得られた発現用溶液の２００倍希釈溶液を調製し、ＦＣＳ解析により分子数を求めると平均して４分子であった。なお、生産量標準物質として、分子量約２６ｋＤａのＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を用いた。
実施例１の調整後の翻訳条件、すなわち、表２記載の発現用溶液を３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた後、得られた発現用溶液の１０倍希釈溶液を調製した。実施例１と同様にして、該１０倍希釈溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを５回計測した後、各蛍光シグナルをＦＣＳ解析し、並進拡散時間と分子数を求めた。その結果、得られた並進拡散時間はほぼ一定であり、発現させた蛍光タンパク質１は、凝集体ではなく単量体として存在していることが確認された。一方で、分子数は平均して７．１分子であった。つまり、実施例１の調整後の翻訳条件により蛍光タンパク質１を発現させると、凝集体の形成を抑制することはできるが、生産量が生産量標準物質である蛍光ＣＡＴの１０分の１程度しか得られなかった。各計測から求められた分子数の２０分の１の分子数、つまり、２００倍希釈液中に存在していたであろう分子数を、図６に示した。
そこで、生産量を向上させるべく、より翻訳条件を改善するために、界面活性剤と分子シャペロンを添加して、翻訳条件の調整を行った。具体的な発現用溶液の組成を表４に示す。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた後、得られた発現用溶液の２００倍希釈溶液を調製し、ＦＣＳ解析により分子数を求めた。各計測から求められた分子数を、図６に示した。平均すると４分子であり、生産量標準物質である蛍光ＣＡＴとほぼ同等の生産量となり、翻訳条件を改善することができた。
【００７３】
【表４】
【００７４】
このように、ＦＣＳ計測から生産量を評価し、翻訳条件の検討を行い、改善することができた。また、実施例１と３の作業は、全て約３時間で計測が可能であり、検討は約１日で完了することができるため、従来になく迅速に翻訳条件を最適化することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することができるため、主に、生化学や構造生物学の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法を用いて、翻訳条件を確定するまでの一連の手順のフローチャートを示したものである。図中のＳは、ステップの意味である。
【図２】実施例１において、翻訳条件調整前に、５回のＦＣＳ計測の結果得られた並進拡散時間を示した図である。
【図３】実施例１において、翻訳条件調整後に、５回のＦＣＳ計測の結果得られた並進拡散時間を示した図である。
【図４】実施例２において、翻訳条件調整前に、１０回のＦＩＤＡ計測の結果得られた蛍光強度を示した図である。
【図５】実施例２において、翻訳条件調整後に、５回のＦＩＤＡ計測の結果得られた蛍光強度を示した図である。
【図６】実施例３において、５回のＦＣＳ計測の結果算出された、蛍光タンパク質１の発現用溶液の２００倍希釈溶液中の分子数を示した図である。各回の左カラムが翻訳条件調整前の発現用溶液中の分子数であり、右カラムが翻訳条件調整後の発現用溶液中の分子数である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、蛍光解析法を用いて迅速かつ簡便に評価するための方法、及び、該方法により得られた評価に基づき、標的タンパク質の翻訳条件を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学や構造生物学の研究においては、タンパク質を用いた実験が通常行われている。例えば、あるタンパク質と他の分子との相互作用を解析するために、該タンパク質を固相化した後、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等の手法を用いることが広く行われている。
【０００３】
これらの実験等に用いられるタンパク質は、組織等から抽出して精製することにより得ることもできるが、組織等からの抽出及び精製は、非常に困難であり、精製の過程でタンパク質が失活する場合も多い。また、精製操作における損失や、元々組織中における発現量が少ない等により、充分な量のタンパク質が得られない場合もある。これに対して、遺伝子組換え技術を用いた発現系により目的のタンパク質（標的タンパク質）を過剰発現させた後、回収することにより、充分な精度及び量のタンパク質をより簡便に得ることができる。特に、大量のタンパク質を簡便かつ安価に得られるため、大腸菌の発現系を用いたタンパク質の発現が多く行われている。
【０００４】
大腸菌の発現系を用いてタンパク質を発現させた場合には、タンパク質が正常にフォールディングされない場合が多いという問題がある。例えば大腸菌の細胞内において外来タンパク質が急速に大量発現すると、該外来タンパク質が凝集して多量体が形成されたり、該外来タンパク質の凝集体を含む顆粒が形成されたりする。このような顆粒は、封入体（Ｉｎｃｌｏｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）と呼ばれる。このため、大腸菌内に過剰発現させた標的タンパク質を回収するためには、まず、大腸菌を破砕し、遠心分離法を用いて標的タンパク質の凝集体や封入体を回収する。その後、変性剤を用いてこれらの凝集体や封入体を一度変性させて単量体にする。さらに、変性剤を取り除いて、変性させた単量体を巻き戻すことにより、正常なフォールディングを有する標的タンパク質を得ることができる。
【０００５】
ここで、変性させた単量体を巻き戻す工程では、徐々に変性剤を除去することが肝要であり、通常、約４８時間という長時間をかけて変性剤の除去が行われている。また、タンパク質の種類によっては、巻き戻しを行った際に、一部のタンパク質は巻き戻されずに凝集して沈澱することもある。このように、変性させたタンパク質の巻き戻しには、時間と手間がかかる。一方で、過剰発現させたタンパク質の凝集や封入体の形成は、翻訳条件に大きく依存している。そこで、翻訳条件を最適化し、過剰発現させたタンパク質による凝集体や封入体の形成を抑制することにより、変性させたタンパク質の巻き戻し工程を要することなく、迅速かつ簡便に、正常なフォールディングを有する標的タンパク質を得ることができる。
【０００６】
翻訳条件を最適化するためには、ある翻訳条件において発現させたタンパク質が正常なフォールディングを有するタンパク質であるか、又は凝集体であるかを速やかに評価することが重要である。タンパク質の構造を溶液中で観測する方法として、例えば、円偏光２色性を計測し、ヘリックス構造やシート構造等の特定の二次構造を検出し、構造の確認を行う方法がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
タンパク質の翻訳条件を検討するためには、それぞれの翻訳条件において得られるタンパク質の、正常なフォールディングを有していることが期待できる単量体と凝集体との比率を指標として考慮することが好ましい。しかしながら、円偏光２色性を計測する方法では、タンパク質が大方巻き戻った状態は計測することができるが、凝集体を観測することはできないため、単量体と凝集体の比率を計測することは困難である。
【０００８】
その他、遠心分離法により凝集体を沈降させて回収した後、紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法等の公知のタンパク質定量方法を用いて定量することによっても、各翻訳条件における凝集体量を測定することができる。しかしながら、凝集体は非常に取り扱いが困難であり、凝集体のみを溶液から回収した後に定量する場合には、精度において信頼性が低く、このようにして得られた凝集体量に基づいて翻訳条件を検討することはやはり困難である。
【０００９】
本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、単量体と凝集体との比率を指標として、迅速かつ簡便に評価するための方法、及び、該方法により得られた評価に基づき、標的タンパク質の翻訳条件を改善する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的タンパク質と一分子当たり同等の分子量や蛍光強度を有する物質を標準物質とすることにより、一分子蛍光分析法及び蛍光解析法を用いて、各翻訳条件において発現された標的タンパク質のうち、単量体の割合及び量を解析することができるため、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｂ）一分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、前記蛍光解析法が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、さらに、前記蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識された生産量標準物質を用いて、（ｄ）一分子蛍光分析法を用いて、前記生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）において求められた数量と、前記工程（ｃ）において算出された画分（Ａ）の数量とを比較することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、前記発現系が、無細胞発現系であることを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法を提供するものである。
また、本発明は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、前記いずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により評価した後、前記工程（ｃ）において得られた画分（Ａ）の割合及び／又は数量を、調整前の翻訳条件における場合よりも増大させるように前記発現系の翻訳条件を調整することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法を提供するものである。
また、本発明は、翻訳条件の調整が、発現用溶液中に界面活性剤、グルタチオン、分子シャペロンからなる群より選択される１以上を添加することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法を用いることにより、各翻訳条件において発現された標的タンパク質のうち、単量体の割合及び量を迅速かつ簡便に測定することができるため、遺伝子組換え技術を用いた発現系における標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することができる。特に、ＦＣＳ解析等の蛍光解析法では、一試料当たり１〜数１０秒程度の非常に短い時間で溶液中の単量体の割合及び量を解析することが可能であり、翻訳条件の評価に要する時間を従来よりも飛躍的に短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における遺伝子組換え技術を用いた発現系とは、生物が有する転写・翻訳機構を利用して標的タンパク質（発現させる目的のタンパク質）を発現させる系であって、転写時の鋳型として、遺伝子組換え技術を用いて調製した標的タンパク質をコードする遺伝子（塩基配列）を有するＤＮＡを用いる発現系を意味する。このようなＤＮＡ（標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡ）は、転写のための鋳型として機能し得るものであり、かつ転写産物であるｍＲＮＡが翻訳に供され得るものであれば、特に限定されるものではない。例えば、汎用されているタンパク質発現用ベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだものであってもよく、標的タンパク質をコードする遺伝子の５’末端にプロモーター配列と３’末端にターミネーター配列をそれぞれ有する直鎖状ＤＮＡであってもよい。該標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても作製することができる。なお、このようなタンパク質発現用ベクターや、プロモーター配列及びターミネーター配列は、標的タンパク質の発現に利用する生物の翻訳機構を考慮して、適宜決定することができる。例えば、標的タンパク質の発現に大腸菌を用いる場合には、Ｔ７プロモーターやＴ７ターミネーター等を用いることができる。
【００１４】
本発明における発現系は、特に限定されるものではなく、タンパク質の過剰発現等に通常用いられている発現系のいずれを用いてもよい。例えば、大腸菌の転写・翻訳機構を利用した発現系であってもよく、哺乳細胞や昆虫細胞等の培養細胞の転写・翻訳機構を利用した発現系であってもよい。本発明における発現系としては、大腸菌を利用した発現系であることが好ましい。培養細胞を利用した発現系よりも操作が簡便であり、かつ、試薬等がより安価であり、経済的であるためである。また、通常、原核細胞である大腸菌を利用した発現系のほうが、真核細胞である培養細胞を利用した発現系よりも、発現させたタンパク質が凝集等を起こしやすく、翻訳条件の適正化が特に重要である。このため、大腸菌を利用した発現系により発現させた標的タンパク質に対して本発明の翻訳条件評価方法を用いることにより、迅速かつ簡便に翻訳条件を評価し得るという本発明の効果がより効果的に発揮される。
【００１５】
また、本発明における発現系は、生細胞内において標的タンパク質を発現させる系であってもよく、無細胞発現系であってもよい。ここで、生細胞内において発現させる系として、例えば、形質転換により標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを導入された大腸菌やトランスフェクションにより標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを導入された培養細胞を培養して、細胞内に標的タンパク質を過剰発現させた後、大腸菌や培養細胞から標的タンパク質を抽出する発現系等がある。一方、無細胞発現系とは、生細胞ではなく、リボゾームや酵素等の転写・翻訳に必要な全ての成分を含む細胞抽出液を利用して細胞外でタンパク質を発現させる系である。このような無細胞発現系として、大腸菌由来の細胞抽出液を利用する系、コムギ由来の細胞抽出液を利用する系等が広く用いられている。細胞抽出液に、標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡ、メチオニン等のアミノ酸、発現用バッファー等を適宜添加した発現用溶液を、適当な温度及び時間インキュベートすることにより、タンパク質を発現させることができる。インキュベートの温度や時間は、利用する細胞抽出液中の酵素や標的タンパク質の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００１６】
細胞から発現させたタンパク質を抽出する操作が不要であること、封入体の形成がより抑えられること、生細胞に影響を与えるタンパク質であっても容易に発現させることができること等により、本発明における発現系は無細胞発現系であることが好ましく、大腸菌由来の細胞抽出液を利用する無細胞発現系であることがより好ましい。
【００１７】
本発明の翻訳条件評価方法においては、まず、標的タンパク質を、蛍光物質を用いて標識し、蛍光標的タンパク質とする。該蛍光物質は、通常タンパク質の標識に用いられる蛍光物質であれば、特に限定されるものではない。該蛍光物質として、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（インビトロジェン社製）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)、ＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ)等がある。標的タンパク質の活性や機能等を損なうおそれが小さいことから、ＴＡＭＲＡ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ローダミン、ＮＢＤ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ等の比較的分子量の小さい蛍光物質であることが好ましい。
【００１８】
蛍光物質による標識の態様は特に限定されるものではなく、標的タンパク質のＮ末端に標識してもよく、Ｃ末端に標識してもよく、標的タンパク質のタンパク質表面の任意の場所に標識してもよい。標的タンパク質のフォールディング等の影響を受けにくく、蛍光標識の強度が損なわれるおそれが小さいことから、標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に標識することが好ましい。また、標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質は一分子であってもよく、複数分子であってもよい。さらに、標的タンパク質毎に標識する蛍光物質の分子数が異なっていてもよい。但し、解析を後述するＦＩＤＡ又はＦＩＤＡ−ＰＯにより行う場合には、標的タンパク質一分子当たりの蛍光強度が等しい必要がある。このため、標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質量が一定であることが好ましく、標的タンパク質一分子当たり一分子の蛍光物質が標識されていることがより好ましい。
【００１９】
標的タンパク質を蛍光物質により標識する方法は、特に限定されるものではなく、タンパク質を標識する場合に通常用いられる方法により標識することができる。例えば、タンパク質を発現させた後に化学的に標識してもよく、予め蛍光標識されたタンパク質を発現させてもよい。タンパク質を発現させた後に蛍光標識を行う工程を減らすことができ、操作工程が少なくて済むため、本発明の標的タンパク質は、予め蛍光標識されたタンパク質を発現させる方法により蛍光標識されることが好ましい。
【００２０】
予め蛍光標識されたタンパク質を発現させる方法として、例えば、蛍光物質をコードする遺伝子を、標的タンパク質をコードする遺伝子に付加し、蛍光物質が付加された標的タンパク質を発現させる方法や、蛍光標識したアミノ酸を用いて翻訳する方法等がある。標的タンパク質一分子当たりに標識する蛍光物質量を容易に制御し得るため、蛍光物質をコードする遺伝子を付加した標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡを用いる方法や、標的タンパク質のある特定の部位にのみ蛍光標識されたアミノ酸を導入する方法が好ましい。
【００２１】
特に、蛍光標識アミノ酸として、天然アミノ酸のコドン以外のアンバーコドンやｃｇｇｇ等の４塩基コドン等の非天然型コドンに対するアンチコドンを有する非天然型ｔＲＮＡと蛍光物質との複合体を用いて、タンパク質の翻訳時に蛍光標識を行う方法が好ましい（例えば特開２００７−９７４２３号公報参照。）。標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡの適当な箇所に該非天然型コドンを挿入することにより、標的タンパク質の反応部位の保護や構造の安定性に配慮して蛍光標識することができる。特に標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に特異的に蛍光標識されるように、標的タンパク質発現用鋳型ＤＮＡに該非天然型コドンを挿入することが好ましい。また、非天然型コドンとして４塩基コドンを用いた場合に、４塩基の読み枠を３塩基で読んでしまった場合には次が終止コドンとなるようにすることにより、翻訳時の読み枠のずれによる標的タンパク質以外のタンパク質の発現を効果的に防止することができ、標的タンパク質の蛍光標識効率をほぼ１００％とすることができる。
【００２２】
翻訳後の精製を簡便にすることができるため、標的タンパク質には精製用のタグを付加しておくことが好ましい。標的タンパク質のタグとして、タンパク質の精製に通常用いられているタグを用いることができる。該タグとして、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)タグ、ＨＡ（ｈｅｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等がある。また、標的タンパク質のタグとして、これらの汎用タグを１種類のみで用いてもよく、複数種類を組み合わせたものを用いてもよい。また、タグは標的タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加することが好ましい。これらの汎用タグをコードする塩基配列を、標的タンパク質をコードする遺伝子に付加することにより、タグ付標的タンパク質を発現させることができる。
【００２３】
本発明の翻訳条件評価方法に供される標的タンパク質溶液は、精製された蛍光標的タンパク質の溶液であることが好ましい。蛍光標的タンパク質の精製は、カラムクロマトグラフィー法等のタンパク質の精製に通常用いられる方法により行うことができる。例えば、標的タンパク質がタグ付タンパク質である場合には、該タグと特異的に結合し得る物質を充填したアフィニティカラム等を用いて常法により精製することができる。
【００２４】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法は、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｂ）分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、を有することを特徴とする。以下、工程ごとに説明する。
【００２５】
まず、一分子蛍光分析法を用いて、前記蛍光標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める。一分子蛍光分析法による検出であるため、適当な測定用バッファーを用いて希釈等することにより、標的タンパク質溶液の濃度を１〜１００ｎＭに調整しておくことが好ましい。標的タンパク質溶液の濃度は１〜２０ｎＭであることがより好ましく、１〜１０ｎＭであることが特に好ましい。測定用バッファーは、蛍光シグナルや標的タンパク質の活性やフォールディングに対する影響が少ないバッファーであれば、特に限定されるものではなく、通常タンパク質を用いたアッセイ系において用いられるバッファーを用いることができる。該バッファーとして、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等のリン酸バッファーやトリスバッファー等がある。濃度を調整した標的タンパク質溶液に、該標的タンパク質を標識している蛍光物質の分光特性に最適な波長の光を照射し、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質からの蛍光シグナルを、高感度な検出装置を用いて検出し、該蛍光シグナルの揺らぎを計測する。蛍光シグナルの検出は、例えば、ＭＦ２０（オリンパス社製）等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて行うことができる。
【００２６】
本発明における溶液中の蛍光標識物質とは、一分子蛍光分析法により、一塊の物質として蛍光シグナルが検出される蛍光標識された物質を意味し、一分子からなる物質であってもよく、複数分子からなる凝集体であってもよい。該標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質としては、蛍光標的タンパク質のみであるため、標的タンパク質一分子当たりに標識される蛍光物質量が等しい場合には、理論上は、全ての蛍光標識物質から検出される蛍光シグナルはほぼ等しくなる。しかしながら、標的タンパク質の中には発現後フォールディングや巻き戻しが正常に行われない等により凝集体を形成するものがあり、このような凝集体と、正常なフォールディングを有する単量体の蛍光標的タンパク質では、一蛍光標識物質当たりの大きさや蛍光強度が大きく異なり、該標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から検出される蛍光シグナルは多様となる。
【００２７】
そこで、単量体の蛍光標的タンパク質とほぼ同等の蛍光シグナルを期待できる物質や、単量体の蛍光標的タンパク質から理論上検出される蛍光シグナルを概算するための基準となり得る物質を標準物質とし、該標準物質の蛍光シグナルから得られる解析値を基準とすることにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、単量体の蛍光標的タンパク質であるか、又は凝集体等の単量体以外の蛍光標的タンパク質であるか、を区分することができる。つまり、それぞれの翻訳条件において、発現された標的タンパク質全体に対しての正常なフォールディングを有していることが期待できる単量体の割合や数量等を算出することができるため、各翻訳条件を評価することができる。
【００２８】
なお、標準物質は、標的タンパク質の蛍光シグナル解析の基準とするため、標的タンパク質の標識に用いられる蛍光物質と同一種類の蛍光物質又は当該蛍光物質により標識された物質であることを要する。該標準物質の分子量や蛍光標識の方法等は、解析方法等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質や、蛍光標的タンパク質と一分子当たり同等の蛍光強度を有している物質等が挙げられる。標準物質はタンパク質であってもよく、非タンパク質であってもよい。標準物質がタンパク質である場合には、蛍光標識の手法による相違を回避することができるため、標的タンパク質と同じ標識方法により蛍光標識されたタンパク質であることが好ましい。同様に、標的タンパク質と同じ発現系を用いて発現させたタンパク質であることも好ましい。
【００２９】
凝集体の大きさや構成する分子数等は多種多様であり、凝集体に特有の蛍光シグナルを同定することは困難であるが、標準物質の蛍光シグナルを基準とした２成分解析を行うことにより、簡便に単量体と凝集体の割合を概算することが可能となる。つまり、標準物質の蛍光シグナルとほぼ同等の蛍光シグナルを有する蛍光標識物質を単量体として区分し、標準物質の蛍光シグナルとは異なる蛍光シグナルを有する蛍光標識物質を凝集体として区分することにより、単量体の割合や数量を算出することができる。
【００３０】
具体的には、標的タンパク質と同様にして、一分子蛍光分析法を用いて、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める。その後、標準物質溶液の解析から求められた解析値を基準とし、標的タンパク質溶液中の解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する。例えば、画分（Ａ）の割合が低い場合には、翻訳条件が適当ではなく、正常なフォールディングを有する標的タンパク質よりも凝集体が多く得られており、翻訳条件の最適化が必要であると判断できる。一方で、画分（Ａ）の割合が高い場合には、翻訳条件が適切であると判断できる。
【００３１】
検出された蛍光シグナルは、蛍光解析法により解析される。具体的には、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）により解析することができる（例えば特開２００５−８３９８２号公報参照。）。これらの解析法を適宜組み合わせて解析してもよい。
【００３２】
ＦＣＳは、蛍光分子の標識拡散する時間（並進拡散時間）を求めることができる解析法である。並進拡散時間は分子の大きさによって異なるため、分子の相互作用や分解、凝集等の大きさの変化をモニターするために主に用いられる解析法である。また、観測領域中に存在する蛍光分子の数を算出することができるため、試料溶液における蛍光分子の濃度を概算することが可能である。さらに、計測している系（試料溶液）中に２種類以上の大きさを持つ蛍光分子が存在している場合、それぞれの並進拡散時間を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。蛍光標的タンパク質が凝集している場合には、単量体の蛍光標的タンパク質よりも大きくなるため、並進拡散時間は長くなる。
【００３３】
例えば、まず、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質を標準物質とし、ＦＣＳにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の並進拡散時間及び数と、標準物質溶液中の標準物質の並進拡散時間を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の並進拡散時間を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＣＳ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも並進拡散時間が長い物質の画分（以下、画分（ＢＦＣＳ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＣＳ）の割合や数量を算出する。
【００３４】
ＦＣＳによる解析を行う場合の標準物質は、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質であることが好ましく、発現方法や蛍光標識の方法が標的タンパク質と異なるタンパク質であってもよい。また、標準タンパク質の一分子当たりの蛍光強度が、蛍光標的タンパク質と異なっていてもよい。
【００３５】
その他、分子量が既知であれば、標的タンパク質とは異なる分子量を有しているタンパク質も、標準物質として用いることができる。体積と分子量を等価とし、タンパク質を球状とみなすと、並進拡散時間は球の半径がパラメータとなっているため、ＦＣＳにより、並進拡散時間からタンパク質の分子量を概算することができるためである。つまり、標準物質の並進拡散時間に、標準物質と標的タンパク質との分子量比の３乗根を掛けた値が、標的タンパク質の並進拡散時間の理論値となる。標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の並進拡散時間が、該理論値よりも長い場合や、ＳＤ値が大きい場合には、標的タンパク質の凝集が疑われる。つまり、画分（ＡＦＣＳ）を、このようにして得られた理論値とほぼ同等の並進拡散時間を有する物質の画分とすることにより、標的タンパク質と同等の分子量を有しているタンパク質を標準物質とした場合と同様に、標的タンパク質の翻訳条件を評価することができる。例えば、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質の分子量が既知である場合には、該蛍光物質の単量体を標準物質とすることができる。
【００３６】
ＦＩＤＡは、蛍光分子の一分子当たりの蛍光強度を求めることができる解析法であり、計測している系（試料溶液）中に蛍光強度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光強度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、標的タンパク質が凝集している場合には、一蛍光標識物質当たりの蛍光強度が大きくなる。そこで、ＦＩＤＡにより一分子当たりの蛍光強度を観測し、標準物質の蛍光強度と比較することにより、標的タンパク質の凝集の有無を検出することができる。
【００３７】
例えば、まず、蛍光標的タンパク質と同等の蛍光強度を有している物質を標準物質とし、ＦＩＤＡにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の蛍光強度及び数と、標準物質溶液中の標準物質の蛍光強度を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の蛍光強度を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＩＤＡ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも蛍光強度が大きい物質の画分（以下、画分（ＢＦＩＤＡ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＩＤＡ）の割合や数量を算出する。
【００３８】
ＦＩＤＡによる解析を行う場合の標準物質は、標的タンパク質と同等の蛍光強度を有している物質であればよく、タンパク質であってもよく、非タンパク質であってもよい。例えば、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質であってもよい。標準物質がタンパク質である場合には、標的タンパク質と同じ発現系を用いて発現させたタンパク質であることが好ましい。
【００３９】
ＦＩＤＡ−ＰＯは、ＦＩＤＡと蛍光偏光解析を複合させた解析法であり、蛍光分子の蛍光偏光度と分子数を求めることができる。計測している系（試料溶液）中に蛍光偏光度が異なる２種類以上の蛍光分子が存在している場合、それぞれの蛍光偏光度を有する分子の数量及び割合を算出することもできる。例えば、標的タンパク質が凝集している場合には、一蛍光標識物質当たりの蛍光強度が大きくなり、回転運動もゆっくりとなるため、蛍光偏光度が大きくなる。そこで、ＦＩＤＡ−ＰＯにより一分子当たりの蛍光偏光度を観測し、標準物質の蛍光偏光度と比較することにより、標的タンパク質の凝集の有無を検出することができる。
【００４０】
例えば、まず、蛍光標的タンパク質と一分子当たり同等の分子量と蛍光強度を有している物質を標準物質とし、ＦＩＤＡ−ＰＯにより、標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質の蛍光偏光度及び数と、標準物質溶液中の標準物質の蛍光偏光度を、それぞれ解析する。その後、解析された標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質を、標準物質溶液中の標準物質とほぼ同等の蛍光偏光度を有する物質の画分（以下、画分（ＡＦＩＤＡ−ＰＯ）という。）と、標準物質溶液中の標準物質よりも蛍光偏光度が大きい物質の画分（以下、画分（ＢＦＩＤＡ−ＰＯ）という。）の２成分に区分し、画分（ＡＦＩＤＡ−ＰＯ）の割合や数量を算出する。
【００４１】
ＦＩＤＡ−ＰＯによる解析を行う場合の標準物質は、蛍光標的タンパク質と同等の分子量と蛍光強度を有している物質であればよいが、標的タンパク質と同じ発現系及び蛍光標識法により得られた標準物質であることが好ましい。
【００４２】
一分子蛍光分析法において検出される蛍光シグナルは、分子の大きさに依存するものであり、分子量が同じであっても、立体構造の相違等により大きさが異なる蛍光タンパク質同士は、検出される蛍光シグナルが異なる。このため、蛍光標的タンパク質と標準物質の分子量が同一である場合であっても、解析の結果得られる並進拡散時間等が一致しない場合も多い。特に、標準物質の分子量と標的タンパク質の分子量の比に基づいて、標準物質の並進拡散時間等から標的タンパク質の並進拡散時間等を推定する場合には、いずれのタンパク質も球状であると仮定して推定するため、通常、標準物質の解析値から推定された標的タンパク質の並進拡散時間等は、実測値と１０〜２０％程度の誤差が生じ得る。しかし、凝集体の並進拡散時間等は、通常単量体から大きくかけ離れているため、標準物質の解析値を基準とすることにより、凝集体と単量体を容易に区分することができる。
【００４３】
本発明の翻訳条件評価方法の結果に基づき、翻訳条件の最適化を行うか否かを決定することができる。例えば、単量体の標的タンパク質、すなわち画分（Ａ）の割合が低い場合には、翻訳条件の最適化を行うことが好ましい。翻訳条件の最適化を検討すべきか否かの判断基準となる画分（Ａ）の割合は、標的タンパク質の種類や発現させた標的タンパク質を用いて行われるアッセイの種類等を考慮して適宜決定することができるが、画分（Ａ）の割合が６０％未満である場合には、翻訳条件の最適化を行うことが好ましい。
【００４４】
翻訳条件の最適化は、タンパク質の正常なフォールディングや巻き戻しの促進、凝集の阻害等を目的として行われる公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。例えば、発現用溶液中に、界面活性剤、還元剤、分子シャペロン等を添加することにより、翻訳条件を改善させ、画分（Ａ）の割合を増大させることができる。その他、発現温度、すなわち、転写・翻訳時の温度を、常法よりも２〜１０℃程度、好ましくは５℃程度低下させてもよい。
【００４５】
発現用溶液に添加する界面活性剤、還元剤、分子シャペロン等の種類や濃度は、標的タンパク質の種類や、本発明の翻訳条件評価方法の結果等を考慮して、適宜決定することができる。界面活性剤と還元剤や分子シャペロン等を適宜組み合わせて用いてもよい。また、複数種類の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
例えば、まず、Ｂｒｉｊｉ３５等の非イオン性界面活性剤を０．１〜０．５％添加した条件で標的タンパク質を発現させ、本発明の翻訳条件評価方法により、翻訳条件を評価し、画分（Ａ）の割合が６０％未満である等、翻訳条件の改善が見られない場合や改善が不十分である場合には、他の種類の界面活性剤、例えば、ジギトニンを０．１〜０．５％添加する等の翻訳条件の改善を行う。
【００４７】
標的タンパク質がＳ−Ｓ結合を有する場合には、翻訳条件の改善のために、発現用溶液にグルタチオンを添加することが好ましい。酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンを１：０〜４：１の割合で添加することがより好ましい。添加量は、本発明の翻訳条件評価方法の結果を考慮して適宜決定することができるが、発現用溶液に対して最終濃度が１０ｍＭ程度となるように添加することが好ましい。
【００４８】
分子シャペロンとは、タンパク質の巻き戻りを助ける働きをする分子であり、このような機能を有することが公知の分子の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、大腸菌の転写・翻訳系を利用した発現系の場合には、分子シャペロンとして、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ等を用いることができる。
【００４９】
また、本発明の翻訳条件評価方法においては、画分（Ａ）の割合と試料溶液に含まれる蛍光標識物質の数より数量も求めることができる。そこで、標的タンパク質を発現させる発現系と同一の発現系において高発現し得るタンパク質を生産量標準物質として、該生産量標準物質の発現量を基準として、発現効率の点から標的タンパク質の翻訳条件を評価することもできる。なお、標準物質と同様に、該生産量標準物質は、標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識されているタンパク質であることを要する。また、該生産量標準物質は、標的タンパク質の発現に用いる発現系において高発現し得ることが確認されているタンパク質であればよく、標的タンパク質と分子量が異なるものや、異なる手法で蛍光標識されたものであってもよい。
【００５０】
具体的には、まず、該生産量標準物質を、標的タンパク質と同じ発現系により発現させた後、一分子蛍光分析法を用いて、該生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める。該蛍光解析法は、ＦＣＳであってもよく、ＦＩＤＡであってもよく、ＦＩＤＡ−ＰＯであってもよい。解析の結果求められた数量と、前述の方法により求めた画分（Ａ）の数量とを比較することにより、標的タンパク質の翻訳条件を評価することができる。例えば、該生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量よりも、画分（Ａ）の数量が低い場合には、翻訳条件の最適化により標的タンパク質の生産量の向上が期待できると判断できる。一方で、画分（Ａ）の割合が高い場合には、翻訳条件が適切であると判断できる。
【００５１】
標的タンパク質の生産量を向上させるための翻訳条件の最適化は、発現量の増大を目的として行われる公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。具体的には、タンパク質の正常なフォールディングや巻き戻しの促進、凝集の阻害等を目的とする場合の翻訳条件の最適化において用いられる手法として挙げられたものを用いることができる。その他、発現時間を延長又は短縮させてもよい。
【００５２】
標的タンパク質の発現から翻訳条件の評価、検討、及び確定までのフローチャートを図１に示す。具体的には、蛍光標的タンパク質と同等の分子量を有している物質を標準物質とし、標的タンパク質と生産量標準物質を無細胞発現系により予め蛍光標識されたＨｉｓタグ付タンパク質として発現させ、ＦＣＳにより解析した場合の一連の手順を示している。なお、本発明の翻訳条件評価方法は該一態様に限定されるものではない。
【００５３】
まず、ＦＣＳにより標準物質の並進拡散時間（Ｔ０）を計測する（ステップ１）。また、生産量標準物質を無細胞発現系により転写・翻訳した後（ステップ２）、精製する（ステップ３）。ＦＣＳにより、精製した生産量標準物質溶液中の各標準物質の数量（Ｎｃ）を計測する（ステップ４）。さらに、蛍光標的タンパク質を無細胞発現系により転写・翻訳した後（ステップ５）、精製する（ステップ６）。ＦＣＳにより、精製した蛍光標的タンパク質を希釈した標的タンパク質溶液中の各標準物質の並進拡散時間（Ｔ）を計測する（ステップ７）。標的タンパク質溶液中の各標準物質を、並進拡散時間がＴ≒Ｔ０である画分（ＡＦＣＳ）と、並進拡散時間がＴ＞Ｔ０である画分（Ｂ）に区分し、各区分の割合を計測する（ステップ８）。その後、画分（ＡＦＣＳ）が６０％以上であるかどうかを判断し（ステップ９）、画分（ＡＦＣＳ）が６０％未満である場合には、翻訳条件の検討を行い（ステップ１０）、検討後の翻訳条件により再度転写・翻訳し、同様に画分（ＡＦＣＳ）の割合を算出する。画分（ＡＦＣＳ）が６０％以上である場合には、画分（ＡＦＣＳ）の数量（Ｎ）とＮｃを比較する（ステップ１１）。画分（ＡＦＣＳ）の数量（Ｎ）が、標的タンパク質の使用目的に適した生産量であるか否かを判断し（ステップ１２）、生産量が不足している場合には翻訳条件の検討を行い（ステップ１３）、検討後の翻訳条件により再度転写・翻訳し、同様に画分（ＡＦＣＳ）の割合及び数量を算出する。生産量が充分である場合には、翻訳条件を確定する（ステップ１４）。なお、標準物質の並進拡散時間（Ｔ０）の計測（ステップ１）と、精製した蛍光標的タンパク質を希釈した標的タンパク質溶液中の各標準物質の並進拡散時間（Ｔ）の計測（ステップ７）は同時に行ってもよい。同様に、生産量標準物質の転写・翻訳（ステップ２）、精製（ステップ３）、各標準物質の数量（Ｎｃ）の計測（ステップ４）は、蛍光標的タンパク質（ステップ５〜８）と同時に行ってもよい。
【００５４】
並進拡散時間に代えて、蛍光強度や蛍光偏光度を計測することにより、ＦＩＤＡやＦＩＤＡ−ＰＯによる解析を行う場合であっても、ＦＣＳと同様の手順により翻訳条件を評価し、最適化した後確定することができる。
【００５５】
本発明の翻訳条件評価方法は、一分子蛍光分析法を用いるため、一試料当たり１〜数１０秒程度の非常に短い時間で計測が可能であり、翻訳条件を従来に無く迅速かつ簡便に評価することができる。従来、大腸菌への発現用ベクターの導入、大腸菌の大量培養、封入体の調整、発現させたタンパク質の変性、巻き戻し、遠心分離による凝集体の確認、という一連の作業に、ほぼ３日間程度要していたが、例えば、無細胞発現系を用いて標的タンパク質発現させる場合、標的タンパク質の発現に約２時間、精製を含むＦＣＳ計測用試料の調製に約１時間、ＦＣＳ計測に約１５秒程度により、翻訳条件の評価を行うことができる。
【００５６】
また、翻訳条件の評価以外にも、タンパク質の調製条件の検討にも応用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法等の手法を用いて、標的タンパク質と他の分子との相互作用解析を行う場合には、標的タンパク質を固相化することが広く行われているが、タンパク質の固相化のためのバッファー条件の検討や、固相化によるタンパク質の構造変化の評価等においても、本発明の翻訳条件評価方法を応用することができる。
【００５７】
その他、標的タンパク質溶液に、標的タンパク質と反応する分子を添加した反応溶液を、公知の一分子蛍光分析システムを用いて蛍光解析を行うことにより、標的タンパク質と該分子との相互作用を確認することができる。例えば、標的タンパク質と該分子との反応の強さが妥当であれば、標的タンパク質の巻き戻しが上手くいっており、翻訳条件が適当であると判断することができる。
【実施例】
【００５８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
［実施例１］
Ｎ末端に蛍光色素ＴＡＭＲＡ、Ｃ末端にＨｉｓタグをそれぞれ付加した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質１（以下、タンパク質１という。）を、無細胞発現系を用いて発現させ、翻訳条件を評価し、最適化を行った。タンパク質１の分子量は約２０ｋＤａである。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｉｎ−ｐｏｉｎｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ５４３（オリンパス社製）に添付の発現用ベクターに、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質１をコードする遺伝子と該遺伝子のＣ末端にＨｉｓタグをコードする遺伝子を組み込み、タンパク質１用発現ベクターを作成した。このタンパク質１用発現ベクターを鋳型として、大腸菌由来無細胞発現系キットのＲＴＳ１００Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた。具体的な発現用溶液の組成を表１に示す。
【００６０】
【表１】
【００６１】
発現させた蛍光タンパク質１を、Ｈｉｓタグ精製レジン（Ｈｉｓ−ｓｐｉｎｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した。洗浄用バッファーとして、６０ｍＭイミダゾール及び０．１％ポリエチレン（２３）ラウリルエーテル含有ＰＢＳを、溶出用バッファーとして、５００ｍＭイミダゾール及び０．１％ポリエチレン（２３）ラウリルエーテル含有ＰＢＳを、それぞれ用いた。
精製した蛍光タンパク質１を、ＰＢＳを用いて希釈してタンパク質１溶液を調製した後、一分子蛍光分析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）にて、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを計測した。計測条件は、５４３ｎｍのレーザーを１００μＷのパワーで、１蛍光標識物質当たりの計測時間を１５秒とし、５回計測した。検出された各蛍光シグナルをＦＣＳ解析することにより、それぞれの並進拡散時間を計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた並進拡散時間を図２に示す。
【００６２】
一方、標準物質として、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体を用いた。まず、蛍光タンパク質１と同様にして、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体の並進拡散時間を測定したところ、約１００μｓであった。ここで、ＴＡＭＲＡの分子量は５００であり、タンパク質１との分子量比は約４０である。上述したように、ＦＣＳ計測で得られる並進拡散時間は、分子の半径をパラメータとしているため、両者の体積比（分子量比）の３乗根を、ＴＡＭＲＡの並進拡散時間と掛け合わせることにより、蛍光タンパク質１の理論的な並進拡散時間を算出することができる。すなわち、約１００μｓに４０の３乗根を掛け合わせた約３５０μｓが、蛍光タンパク質１の並進拡散時間の理論値である。但し、実際にはタンパク質１の立体構造は球状からはずれていると考えられるため、理論値から１０〜２０％の誤差が見込まれる。したがって、測定ごとの誤差も考慮して、蛍光タンパク質１の並進拡散時間は３００〜４２０μｓ程度と推察される。
【００６３】
計測されたタンパク質１溶液中の蛍光標識物質を、蛍光色素ＴＡＭＲＡの解析値を基準として算出された３００〜４２０μｓの並進拡散時間の蛍光標識物質を画分（Ａ）、それよりも並進拡散時間が長い蛍光標識物質を区分（Ｂ）とすると、いずれも４２０μｓよりも長く、画分（Ｂ）に区分された。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質１は凝集しており、翻訳条件が適切ではないと評価することができた。
【００６４】
そこで、表１記載の発現用溶液に界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５を０．５％となるように添加して、翻訳条件の調整を行った。具体的な発現用溶液の組成を表２に示す。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
発現させた蛍光タンパク質１を、翻訳条件調整前と同様にしてＦＣＳ計測し、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質を５回計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた並進拡散時間を図３に示す。この結果、５回全てにおいて並進拡散時間は約４００μｓとなり、いずれも画分（Ａ）に区分された。また、同様の計測を繰り返したところ、再現性も得られた。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質１は単量体であり、翻訳条件が適切であると評価することができた。つまり、界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５を適宜添加することにより、翻訳条件を改善することができた。
【００６７】
［実施例２］
タンパク質１に代えて、抗体のように振舞う免疫性タンパク質２（以下、タンパク質２という。）を用いて、タンパク質２用発現ベクターを作成した。このタンパク質２用発現ベクターを鋳型として、大腸菌由来無細胞発現系キットのＲＴＳ１００Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（ロシュ社製）を用いて、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質２を発現させた。発現用溶液には、タンパク質の凝集回避を目的として、Ｂｒｉｊｉ３５を０．５％となるように添加した。さらに、タンパク質２はジスルフィド結合を有しているため、巻き戻り時のｓ−ｓ結合を促進するため、酸化型グルタチオンＧＳＳＧ（和光純薬社製）も添加した。具体的な発現用溶液の組成を表３に示す。
【００６８】
【表３】
【００６９】
発現させた蛍光タンパク質２を、Ｈｉｓタグ精製レジン（Ｈｉｓ−ｓｐｉｎｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した。具体的には、２４℃１０分間蛍光タンパク質２をＨｉｓタグ精製レジンと反応させた後、該レジンを洗浄用バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、０．５Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭイミダゾール、０．１％Ｂｒｉｊｉ３５、ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄後、溶出用バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、０．１％Ｂｒｉｊｉ３５、ｐＨ７．４）と２４℃１０分間反応させることにより、精製した。
精製した蛍光タンパク質２を、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて希釈してタンパク質２溶液を調製した後、一分子蛍光分析装置ＭＦ２０（オリンパス社製）にて、タンパク質１溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを計測した。計測条件は、５４３ｎｍのレーザーを１００μＷのパワーで、１蛍光標識物質当たりの計測時間を１５秒とし、１０回計測した。検出された各蛍光シグナルをＦＩＤＡ解析することにより、それぞれの蛍光強度を計測した。各回（１〜１０）の計測の結果得られた蛍光強度を図４に示す。
【００７０】
一方、標準物質として、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体を用いた。まず、蛍光タンパク質２と同様にして、蛍光色素ＴＡＭＲＡの単量体の蛍光強度を測定したところ、約４５ｋＨｚであった。そこで、４０〜５０ｋＨｚ程度の蛍光強度の蛍光標識物質を画分（Ａ）、それよりも蛍光強度が大きい蛍光標識物質を区分（Ｂ）として、計測されたタンパク質２溶液中の１０蛍光標識物質を区分すると、２、３、９回目の蛍光標識物質が画分（Ａ）、その他が画分（Ｂ）に区分された。なお、５回目の蛍光強度は、あまりに値が小さいため、信頼性が低いものとしていずれにも区分しなかった。つまり、画分（Ａ）が全体の約３０％であったため、該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質２は凝集しており、翻訳条件が適切ではないと評価することができた。
【００７１】
そこで、表３記載の発現用溶液のうち、Ｂｒｉｊｉ３５をジギトニンに代えて、翻訳条件の調整を行った。なお、ジギトニンは膜タンパク質の可溶化にも用いられている界面活性剤である。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質２を発現させた。発現させた蛍光タンパク質２を、翻訳条件調整前と同様にしてＦＩＤＡ計測し、タンパク質２溶液中の蛍光標識物質を５回計測した。各回（１〜５）の計測の結果得られた蛍光強度を図５に示す。この結果、５回全てにおいて蛍光強度は４０〜４５ｋＨｚとなり、いずれも画分（Ａ）に区分された。該区分の結果から、発現された蛍光タンパク質２は単量体であり、翻訳条件が適切であると評価することができた。つまり、界面活性剤Ｂｒｉｊｉ３５をジギトニンに代えることにより、翻訳条件を改善することができた。
【００７２】
［実施例３］
タンパク質の生産量の点から、実施例１において調整後の翻訳条件について評価した。
まず、実施例１の蛍光タンパク質１と同様にして、生産量標準物質を発現させた後、得られた発現用溶液の２００倍希釈溶液を調製し、ＦＣＳ解析により分子数を求めると平均して４分子であった。なお、生産量標準物質として、分子量約２６ｋＤａのＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を用いた。
実施例１の調整後の翻訳条件、すなわち、表２記載の発現用溶液を３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた後、得られた発現用溶液の１０倍希釈溶液を調製した。実施例１と同様にして、該１０倍希釈溶液中の蛍光標識物質から得られる蛍光シグナルを５回計測した後、各蛍光シグナルをＦＣＳ解析し、並進拡散時間と分子数を求めた。その結果、得られた並進拡散時間はほぼ一定であり、発現させた蛍光タンパク質１は、凝集体ではなく単量体として存在していることが確認された。一方で、分子数は平均して７．１分子であった。つまり、実施例１の調整後の翻訳条件により蛍光タンパク質１を発現させると、凝集体の形成を抑制することはできるが、生産量が生産量標準物質である蛍光ＣＡＴの１０分の１程度しか得られなかった。各計測から求められた分子数の２０分の１の分子数、つまり、２００倍希釈液中に存在していたであろう分子数を、図６に示した。
そこで、生産量を向上させるべく、より翻訳条件を改善するために、界面活性剤と分子シャペロンを添加して、翻訳条件の調整を行った。具体的な発現用溶液の組成を表４に示す。調整後の発現用溶液を、３０℃、２時間反応させることにより、蛍光タンパク質１を発現させた後、得られた発現用溶液の２００倍希釈溶液を調製し、ＦＣＳ解析により分子数を求めた。各計測から求められた分子数を、図６に示した。平均すると４分子であり、生産量標準物質である蛍光ＣＡＴとほぼ同等の生産量となり、翻訳条件を改善することができた。
【００７３】
【表４】
【００７４】
このように、ＦＣＳ計測から生産量を評価し、翻訳条件の検討を行い、改善することができた。また、実施例１と３の作業は、全て約３時間で計測が可能であり、検討は約１日で完了することができるため、従来になく迅速に翻訳条件を最適化することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により、遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を迅速かつ簡便に評価することができるため、主に、生化学や構造生物学の分野において利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の標的タンパク質の翻訳条件評価方法を用いて、翻訳条件を確定するまでの一連の手順のフローチャートを示したものである。図中のＳは、ステップの意味である。
【図２】実施例１において、翻訳条件調整前に、５回のＦＣＳ計測の結果得られた並進拡散時間を示した図である。
【図３】実施例１において、翻訳条件調整後に、５回のＦＣＳ計測の結果得られた並進拡散時間を示した図である。
【図４】実施例２において、翻訳条件調整前に、１０回のＦＩＤＡ計測の結果得られた蛍光強度を示した図である。
【図５】実施例２において、翻訳条件調整後に、５回のＦＩＤＡ計測の結果得られた蛍光強度を示した図である。
【図６】実施例３において、５回のＦＣＳ計測の結果算出された、蛍光タンパク質１の発現用溶液の２００倍希釈溶液中の分子数を示した図である。各回の左カラムが翻訳条件調整前の発現用溶液中の分子数であり、右カラムが翻訳条件調整後の発現用溶液中の分子数である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、
（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、
（ｂ）一分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、
を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項２】
前記蛍光解析法が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする、請求項１記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項３】
さらに、前記蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識された生産量標準物質を用いて、
（ｄ）一分子蛍光分析法を用いて、前記生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において求められた数量と、前記工程（ｃ）において算出された画分（Ａ）の数量とを比較することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、
を有することを特徴とする請求項１又は２記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項４】
前記発現系が、無細胞発現系であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項５】
遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、請求項１〜７のいずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により評価した後、前記工程（ｃ）において得られた画分（Ａ）の割合及び／又は数量を、調整前の翻訳条件における場合よりも増大させるように前記発現系の翻訳条件を調整することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法。
【請求項６】
翻訳条件の調整が、発現用溶液中に界面活性剤、グルタチオン、分子シャペロンからなる群より選択される１以上を添加することを特徴とする請求項５記載の標的タンパク質の翻訳条件改善方法。
【請求項１】
遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を評価する方法であって、
（ａ）一分子蛍光分析法を用いて、蛍光標識された標的タンパク質を含む標的タンパク質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、
（ｂ）一分子蛍光分析法を用いて、標準物質として、前記標的タンパク質の標識に用いた蛍光物質又は当該蛍光物質により標識されたタンパク質を含む標準物質溶液中の標準物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、並進拡散時間、蛍光強度、蛍光偏光度、及び数量からなる群より選択される１以上を求める工程と、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた解析値を基準とし、工程（ａ）により解析された蛍光標識物質を、一分子の蛍光標的タンパク質の画分（Ａ）と、その他の物質の画分（Ｂ）の２成分に区分し、画分（Ａ）の割合及び／又は数量を算出することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、
を有することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項２】
前記蛍光解析法が、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−ＰＯ）からなる群より選択される１以上であることを特徴とする、請求項１記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項３】
さらに、前記蛍光物質と同一種類の蛍光物質により標識された生産量標準物質を用いて、
（ｄ）一分子蛍光分析法を用いて、前記生産量標準物質を含む生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質から、蛍光シグナルを検出した後、蛍光解析法により、前記生産量標準物質溶液中の蛍光標識物質の数量を求める工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）において求められた数量と、前記工程（ｃ）において算出された画分（Ａ）の数量とを比較することにより、前記標的タンパク質の翻訳条件を評価する工程と、
を有することを特徴とする請求項１又は２記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項４】
前記発現系が、無細胞発現系であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法。
【請求項５】
遺伝子組換え技術を用いた発現系により発現させた標的タンパク質の翻訳条件を、請求項１〜７のいずれか記載の標的タンパク質の翻訳条件評価方法により評価した後、前記工程（ｃ）において得られた画分（Ａ）の割合及び／又は数量を、調整前の翻訳条件における場合よりも増大させるように前記発現系の翻訳条件を調整することを特徴とする標的タンパク質の翻訳条件改善方法。
【請求項６】
翻訳条件の調整が、発現用溶液中に界面活性剤、グルタチオン、分子シャペロンからなる群より選択される１以上を添加することを特徴とする請求項５記載の標的タンパク質の翻訳条件改善方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−１７８１５３（Ｐ２００９−１７８１５３Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２２８６２（Ｐ２００８−２２８６２）
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１日（２００８．２．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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