標的核酸配列の検出方法
【課題】簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＬＡＭＰ増幅産物、及びＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法を提供すること。
【解決手段】両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つハイブリダイゼーションにより二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、一端が固相基体表面に結合されたプローブ核酸を準備する工程と、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸にハイブリダイズさせる工程と、前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、ハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定するターゲット核酸配列の検出方法。
【解決手段】両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つハイブリダイゼーションにより二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、一端が固相基体表面に結合されたプローブ核酸を準備する工程と、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸にハイブリダイズさせる工程と、前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、ハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定するターゲット核酸配列の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列の検出技術に関し、詳しくはＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法並びに標的核酸配列の検出に用いるＬＡＭＰ増幅産物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
感染症の原因菌を特定することは、適切な治療薬を選択するために重要である。現状の微生物検査には培養法と核酸増幅法が使われている。
近年培養法は、検出感度の向上や培養日数の短縮のために更なる改良工夫がなされている。特に、抗原抗体反応を用いたイムノクロマトグラフィーは簡便な識別法として急速に普及してきている(例えば、特許文献１及び２参照。)。しかしながら、依然として、菌の発育に数週間かかることから、医療現場のニーズに対応できているとは言い難い。患者は、判定結果がでるまでの間、誤った治療を受けているケースが少なくない。
【０００３】
一方、核酸増幅法は、それぞれの微生物に特異的なプライマーを使用し、増幅の有無を調べることで、菌種あるいは耐性菌を判定する方法である。試料調製も含めて、６−７時間程度で結果がわかり、迅速検査法として大変有用である。また、近年のゲノム解析競争の結果、多くの生物の全遺伝子情報が解析されつつあり、今後、幅広い菌種判定に使用されることが期待される。
【０００４】
核酸増幅技術として一般的に知られている方法がＰＣＲ法(Polymerase Chain Reaction法 Roche社)である。ＰＣＲ法は、遺伝子クローニングや構造決定など遺伝子解析ツールとして幅広く使用されている。しかしながら、ＰＣＲ法においてはサーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なこと、反応時間が２時間以上かかる点が不利である。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。
【０００５】
また、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する場合、生成される産物が２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪いのが問題であった。そこで、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法がとられているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残されていた。
【０００６】
この問題を解決する遺伝子増幅法として、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification法）が開発された。ＬＡＭＰ法は等温条件下、１時間足らずで遺伝子増幅が達成される。最終産物量もＰＣＲ産物と比較し１００−１０００倍多い。また、６箇所のプライマー領域を設定するためＰＣＲ法と比較すると特異性が高いという利点がある（例えば、特許文献３参照）。これらの特徴からＬＡＭＰ法は微生物・ウィルス、さらには遺伝子変異(例えば、特許文献４参照）などを迅速かつ高感度に検出する技術として、期待されている。
【０００７】
現在ＬＡＭＰ法を用いた検査としては、増幅の過程で生成される副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定することにより、遺伝子増幅の有無を判定する方法が製品化されている（例えば、特許文献５参照。）。しかしながら、前記副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定する方法では、万が一目的産物以外の増幅が起こってしまった場合の確認方法がない。また複数の標的遺伝子を同時に検出することができないという問題点を有する。
その他、ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、インターカレーターを用いるものや光学的特性を利用する方法がある（例えば、特許文献６参照。）。さらに別の方法として、ＬＡＭＰ産物中に存在する１本鎖ループ部分にハイブリダイズするプローブを蛍光標識し、反応液の蛍光偏光度を測定するものや（例えば、特許文献７参照。）、１本鎖ループ部分にハイブリするプライマーの５’末端側に不溶性担体を固定化し、増幅反応に伴う凝集反応を観察するものがある（例えば、特許文献８参照）。
【特許文献１】特開２００１−１０３９８１号公報 （段落００１１−００１２）
【特許文献２】特開２００２−１２５６９５号公報 （段落０００２）
【特許文献３】特許第３３１３３５８号公報
【特許文献４】特許第２００３−１５９１００号公報
【特許文献５】特開２００３−１７４９００号公報
【特許文献６】特開２００２−１８６４８１号公報
【特許文献７】特開２００２−２７２４７５号公報
【特許文献８】特開２００２−３４５４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
増幅法としてＬＡＭＰ法を採用した場合には、産物中に１本鎖ループ部分が存在する。ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、該１本鎖領域に標的配列を設計する技術が開示されていることは上述の通りであるが（例えば、特許文献7、8参照）、１本鎖領域に標的配列が設けられたＬＡＭＰ増幅産物と基板上のプローブとのハイブリダイゼーション反応を利用した検出技術については、複雑な構造上の問題も含め不明確な部分は多く、このためＬＡＭＰ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する技術の確立が切望されているのが実情である。
【０００９】
本発明は、かかる実情に鑑み開発されたものであり、簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＬＡＭＰ増幅産物、及びＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等が前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明により、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明の一態様において、前記測定用核酸及びプローブ核酸はＤＮＡである。
また、本発明の他の態様において、前記プローブ核酸はＤＮＡチップを構成している。
【００１３】
また、本発明の他の態様において、前記測定用核酸はＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であり、該ＬＡＭＰ産物における前記ターゲット配列は、ＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間、Ｂ１領域とＢ２領域との間、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間に挿入されていることを特徴とする。
【００１４】
本発明においては、前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
【００１５】
また、本発明により、ターゲット配列を検出するためにＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であって、前記ターゲット配列がＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間(Ｆ２領域含む)、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間(Ｆ２c領域含む)、Ｂ１領域とＢ２領域との間(Ｂ２領域含む)、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間(Ｂ２ｃ領域含む)に挿入されていることを特徴とするＬＡＭＰ産物が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の高いＬＡＭＰ増幅産物の提供が可能となり、また核酸検出におけるハイブリダイゼーション反応において、一本鎖調製工程を経ることなく、なお且つ複雑な温度制御も不要な、簡便且つ短時間での核酸検出が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１８】
＜測定用核酸＞
本発明の方法における第一の特徴は、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を対象として、ターゲット核酸配列の検出が行なわれることである。このようなステム・アンド・ループ構造の核酸は、例えば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが自己ハイブリダイゼーションしたときにも形成されるが、最も典型的な例は、ＬＡＭＰ法による増幅産物として形成される。
【００１９】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示している。従来、ＬＡＭＰ増幅産物においては、ターゲット配列が、増幅産物のステム・アンド・ループ構造の中央に位置するように含まれていた(図2)。このようにターゲット配列を増幅・検出しようとする場合は、その両側に位置する配列に基づいて、合計４種類のプライマー配列（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰ＝Ｆ１ｃ＋Ｆ２、ＢＩＰ＝Ｂ２＋Ｂ１ｃ）を含んでいる。これらプライマーとして用いられる合計６つの領域を、以下では夫々プライマー領域と称することにする。上記４種類のプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６４８１号公報（特許文献５）を参照されたい。
【００２０】
一方、本発明では、図２に示したような従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する。即ち、図３に示すように、本発明においては、ターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間(Ｆ２領域含む)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(Ｆ２ｃ領域含む)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(Ｂ２領域含む)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(Ｂ２ｃ領域含む)の何れかに位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されていてもよく、したがって、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれる。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうことにより、図４に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部を得る。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成することとなる。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は図４に示すような一本鎖の状態のものが存在することから、変性操作を行なうことなく、図示のように各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションにより検出することができる。特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味している。
【００２１】
＜プローブ核酸＞
本発明においては、図４で説明したように、ステム・アンド・ループ構造を有する測定用核酸の一本鎖のループ構造内に含まれるターゲット配列を、これと相補的な配列を有するプローブ核酸を用いて検出する。このプローブ核酸は固相基体表面に固定化されたものであり、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものを用いるが、他のマイクロアレイを構成するプローブを用いてもよい。
【００２２】
ＤＮＡチップとは、数センチ角のガラスやシリコン基板上に異なる配列のプローブを数十から数十万種類固定化したもので、一度に複数の配列情報を調べることができる。これにより従来、数週間かかっていた遺伝子発現パターンの解析や一塩基多型などの解析を数日で行うことが可能になった。現在は新しい遺伝子の探索、機能の解明、研究支援技術として主に用いられているが、最近になって病気の診断技術としても普及し始めている。
【００２３】
ＤＮＡチップの代表的なものとしては、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸの技術が一般的に紹介されている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, p 5022-5026参照。）。この技術は、蛍光で標識したサンプル遺伝子をチップ上のプローブと反応させ、高感度な蛍光解析装置を使って検出する方式である。また別の検出方法として、電流検出型のＤＮＡチップも開発されている。これは、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する挿入剤を添加し、挿入剤から得られる電気化学的な信号を測定する方法である。電気化学的なＤＮＡチップは標識が不要で検出に高価な装置が必要ないことから第二世代のＤＮＡチップとして期待されている（例えば、特開平５−１９９８９８号公報参照）。
【００２４】
＜測定用核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応＞
前記測定用核酸は、その中に含まれる一本鎖のターゲット配列と前記プローブ核酸との特異的ハイブリダイゼーション反応により、前記固体表面に結合される。本発明においては、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを、更なる特徴の一つとする（図５（Ａ）参照）。すなわち、かかる特徴は、プローブ核酸およびターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きが図５（Ｃ）に例示したような向きを有する場合、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、プローブが結合した基体と立体障害を起こし（図６（Ｂ）参照）、これが要因となってハイブリダイゼーション効率が低下するとの知見に基づき見出されたものであり、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるようにプローブ核酸およびターゲット配列部分双方における５′→３′の配列の向きを図５（Ｂ）に例示したように設定することにより、ＬＡＭＰ産物とプローブ核酸が結合した固相基体との立体障害が回避され（図６（Ａ）参照）、これによりハイブリダイゼーション効率を向上させることを可能としたものである。
【００２５】
＜プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の検出＞
本発明において、プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の有無を検出する手段は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
【実施例１】
【００２６】
以下に、本発明による核酸検出方法を実施例を用いてより具体的に説明する。
本実施例では、サンプル用核酸としてＬＡＭＰ増幅産物を製造し、ハイブリダイゼーション反応後、該ＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸を電流検出方式を用いて検出した。ＬＡＭＰ反応は以下に示す２組のプライマーを使用し、N-Acetyltransferase 2 (NAT2) 遺伝子の一部分を増幅させた。
【００２７】
（１）合成オリゴヌクレオチド
プライマー１
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の２本鎖領域（ステム領域）に存在するように設計する。図７に周辺ゲノム配列を示す。
【００２８】
NAT F3 Primer : 5’ ACAGAAGAGAGAGGAATCTGGT 3’
NAT FIP Primer: 5’ TGTTTCTTCTTTGGCAGGAGATGAGAA-GGACCAAATCAGGAGAGAGCA 3’
NAT B3 Primer : 5’ GATGAAGCCCACCAAACAGTA 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATGAATACATACAGACGTCTCC-CTGGGGTCTGCAAGGAAC 3’。
【００２９】
プライマー２
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の１本鎖領域（ループ領域）に存在するように設計する。図８に周辺ゲノム配列を示す。
【００３０】
NAT F3 Primer : 5’ ACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCAT 3’
NAT FIP Primer: 5’ CGTCTGCAGGTATGTATTCATAGACTCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACC 3’
NAT B3 Primer : 5’ CGACCAGATCTGTATTGTCTT 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCATGAATTTTCTATAGGTGAGGATGA 3’。
【００３１】
（２）ＬＡＭＰ反応溶液
ＬＡＭＰ反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純水 １．５μＬ
Ｂｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ １ μＬ
バッファー １２．５μＬ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４０ ｍＭ
ＫＣｌ ２０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４ １６ ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０． ２％
Ｂｅｔａｉｎｅ １．６ Ｍ
ＤＮＴＰ ２．８ ｍＭ
Ｆ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
Ｂ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
ＦＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
ＢＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
テンプレート（purified human genome） １ μＬ
合計 ２５ μＬ。
【００３２】
（３）ＬＡＭＰ法による核酸増幅
温度は５８℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。この時、テンプレートの代わりに滅菌水を添加したものをnegative controlとした。
【００３３】
（４）標的核酸の増幅確認
上記の方法で増幅したＬＡＭＰ産物を図９に示すようにアガロースゲル電気泳動で確認した。また、目的産物の有無は制限酵素切断により確認した。図９において、レーン１〜７はそれぞれ以下に示すサンプル１〜７に対応する。
【００３４】
電気泳動の結果を以下に示す。
１．100bP ladder (TAKARA)
２．Negative control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
３．Positive control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
４．Negative control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
５．Positive control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
６．PstI 制限酵素処理：二本鎖領域に標的核酸が存在
７．PstI 制限酵素処理：一本鎖領域に標的核酸が存在。
【００３５】
制限酵素による消化を行った結果、理論通りの断片を得ることができた。さらに、未消化でのバンドの殆どが消化後には推定されるバンドへ変化したことから、非特異的な産物はほとんどないことが示唆された。
【００３６】
（５）核酸プローブ固定化電極の作製
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Positive-probe FP: AACCTCGAACAATTG
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA。
【００３７】
ＦＰプローブとＦＰｃプローブは互いに相補的な関係にある。ＦＰプローブおよびＦＰｃプローブについて、それぞれ３´ＳＨおよび５´ＳＨ修飾プローブ計４本を検討した。一方、Ｎ−プローブは、ネガティブコントロールとして使用したプローブであり、上記４本のプローブとは無関係な配列を有する。
【００３８】
この標識プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、メルカプトヘキサノール溶液に浸し、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。その後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極とした。電極配置は図１０に示した通りである。
【００３９】
（６）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記（３）で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（４）で作製した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
【００４０】
（７）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定した電極における電流値増加量として図１１に示す。二本鎖部分（ステム部分）に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、３´ＳＨ ＦＰｃ、５´ＳＨ ＦＰ、および５´ＳＨ ＦＰｃのすべてにおいてハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかった（図１１（Ａ））。これに対し、一本鎖ループ部分に標的核酸が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、５´ＳＨ ＦＰｃではハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかったが、３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ハイブリダイズに由来すると推測される電流値増加が見られた（図１１（Ｂ））。
【００４１】
ループ状一本鎖部分に標的核酸が存在する産物で、電流値増加が見られなかった３´ＳＨ ＦＰおよび５´ＳＨ ＦＰｃでは、ＬＡＭＰ産物の一本鎖ループ部分とハイブリダイゼーションする場合、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体に近接する方向に伸びることとなり立体障害を起こし（図５（Ｂ）、又は図６（Ａ）参照）、一方電流値増加が見られた３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体から離間する方向に伸びることとなり立体障害が回避される（図５（Ｃ）、又は図６（Ｂ）参照）。
【００４２】
これらの結果から、まず、ＬＡＭＰ産物をＤＮＡチップで検出するには、標的核酸をループ状一本鎖部分に設計することが必須であることが明らかになった。さらに、ハイブリダイゼーション反応時におけるＬＡＭＰ産物と基体との立体障害を回避するために、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および標的配列部分の双方における５´→３´の配列の向きを設定することが必要であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００４３】
次に本発明による核酸検出方法の応用例として、標的核酸配列の一塩基変異(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)を検出した。
【００４４】
実施例２では、サンプル用核酸として実施例１と同じくＬＡＭＰ産物を製造し、ハイブリダイゼーション後、該ＬＡＭＰ産物中に存在する標的核酸配列のSNPｓを電流検出方式を用いて検出した。
【００４５】
（１）検出に用いたＬＡＭＰ産物
ＬＡＭＰ産物については、実施例１、（１）合成オリゴヌクレオチド プライマー２を用い増幅させたものと同一のものを使用した。
【００４６】
（２）検出に用いたプローブ
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
【００４７】
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT 3’ SH （実施例１で使用したもの）
Positive-probe FPc SNP: CAATTGTTGGAGGTT 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer: ATCTTCAATTGTTCGAGGTTCAAGC 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer SNP: ATCTTCAATTGTTGGAGGTTCAAGC 3’ SH
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA 3’ SH
FPcとNPは実施例１で使用したものと同一のものである。FPc SNPはFPc配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。FPc ２５merはFPcの上流側、下流側にそれぞれ５塩基ずつ標的核酸配列をのばしたものである。FPc ２５mer SNPは、FPc ２５mer配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。上記５本のプローブはすべて３´ＳＨ修飾とした。
【００４８】
プローブの固定化は、実施例１と同様の方法で行った。電極配置は図１２に示した通りである。
【００４９】
（３）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記(１)で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（２）で作成した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、３５、４０、４５℃の０．２×ＳＳＣバッファーにそれぞれ４０分間浸漬し、その後、超純水で軽く洗浄したものとハイブリダイゼーション後に超純水で軽く洗浄しただけのもの、計４種類の洗浄条件の基板を作成した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
【００５０】
（４）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定化した電極における電流値増加量として図13に示す。ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰについては、(Ａ)ハイブリ後、超純水で軽く洗浄しただけの基板で、ＰＦｃＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃでは優位な電流値増加が見られている。さらに、(Ｂ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を３５℃、４０分行った基板では、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰ共に電流値増加が見られなくなった。このことから、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰは(Ａ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
【００５１】
標的配列を長くしたＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰについては、(Ｃ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４０℃、４０分行った基板では、ＦＰｃ２５mer、ＰＦｃ２５merＳＮＰ共に電流値増加が見られているが、(Ｄ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４５℃、４０分行った基板では、ＰＦｃ２５merＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃ２５merでは優位な電流値増加が見られている。このことから、ＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰは(Ｄ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
【００５２】
これらの結果から、プローブの配列の違いによって、ハイブリ、または洗浄条件を適宜選択すること、逆にハイブリ、洗浄条件を定めて、その条件にあった最適プローブを選択することによって一塩基変異を検出できることが明らかになった。
【００５３】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】従来のＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】従来のＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】本発明の測定用核酸の製造における増幅方法を説明するための模式図。
【図４】本発明の測定用核酸を説明するための模式図。
【図５】ループ状一本鎖部分に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を模式的に示した説明図であり、（Ａ）及び（Ｂ）はＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基盤に離間する方向に伸びるようにプローブ核酸および標的配列部分の双方における５´→３´の配列の向きが設定された状態を示し、（Ｃ）は該二本鎖部分が基盤に近接する方向に伸びるように同５´→３´の配列の向きが設定された状態を示す。
【図６】ループ状一本鎖部分に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を模式的に示した説明図であり、（Ａ）はＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基盤に離間するように伸びている状態を示し、（Ｂ）は該二本鎖部分が基盤に近接する方向に伸びている状態を示す。
【図７】二本鎖領域（ステム領域）に標的核酸が存在するように設計したプライマー及び標的配列のNAT遺伝子上の位置を示す図。
【図８】一本鎖領域（ループ領域）に標的核酸が存在するように設計したプライマー及び標的配列のNAT遺伝子上の位置を示す図。
【図９】二本鎖領域（ステム領域）又は一本鎖領域（ループ領域）に標的配列が存在するように設計したＬＡＭＰ増幅産物及び制限酵素処理をした産物の電気泳動図。
【図１０】実施例においてＬＡＭＰ産物の検出のために用いた電極配置を示す説明図。
【図１１】実施例においてＬＡＭＰ産物を電気的に検出した測定結果を示すグラフであり、（Ａ）は二本鎖部分に標的核酸を含むＬＡＭＰ産物の測定結果を示すグラフ、（Ｂ）は一本鎖ループ部分に標的核酸を含むＬＡＭＰ産物の測定結果を示すグラフ。
【図１２】実施例２においてＬＡＭＰ産物の一塩基変異検出のために用いた電極配置を示す説明図。
【図１３】実施例２においてＬＡＭＰ産物の一塩基変異を電気的に検出した測定結果を示すグラフであり、（Ａ）はハイブリダイゼーション後、超純水で軽く洗浄した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｂ）はハイブリダイゼーション後、３５℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｃ）はハイブリダイゼーション後、４０℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｄ）はハイブリダイゼーション後、４５℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸配列の検出技術に関し、詳しくはＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法並びに標的核酸配列の検出に用いるＬＡＭＰ増幅産物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
感染症の原因菌を特定することは、適切な治療薬を選択するために重要である。現状の微生物検査には培養法と核酸増幅法が使われている。
近年培養法は、検出感度の向上や培養日数の短縮のために更なる改良工夫がなされている。特に、抗原抗体反応を用いたイムノクロマトグラフィーは簡便な識別法として急速に普及してきている(例えば、特許文献１及び２参照。)。しかしながら、依然として、菌の発育に数週間かかることから、医療現場のニーズに対応できているとは言い難い。患者は、判定結果がでるまでの間、誤った治療を受けているケースが少なくない。
【０００３】
一方、核酸増幅法は、それぞれの微生物に特異的なプライマーを使用し、増幅の有無を調べることで、菌種あるいは耐性菌を判定する方法である。試料調製も含めて、６−７時間程度で結果がわかり、迅速検査法として大変有用である。また、近年のゲノム解析競争の結果、多くの生物の全遺伝子情報が解析されつつあり、今後、幅広い菌種判定に使用されることが期待される。
【０００４】
核酸増幅技術として一般的に知られている方法がＰＣＲ法(Polymerase Chain Reaction法 Roche社)である。ＰＣＲ法は、遺伝子クローニングや構造決定など遺伝子解析ツールとして幅広く使用されている。しかしながら、ＰＣＲ法においてはサーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なこと、反応時間が２時間以上かかる点が不利である。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。
【０００５】
また、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する場合、生成される産物が２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪いのが問題であった。そこで、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法がとられているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残されていた。
【０００６】
この問題を解決する遺伝子増幅法として、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification法）が開発された。ＬＡＭＰ法は等温条件下、１時間足らずで遺伝子増幅が達成される。最終産物量もＰＣＲ産物と比較し１００−１０００倍多い。また、６箇所のプライマー領域を設定するためＰＣＲ法と比較すると特異性が高いという利点がある（例えば、特許文献３参照）。これらの特徴からＬＡＭＰ法は微生物・ウィルス、さらには遺伝子変異(例えば、特許文献４参照）などを迅速かつ高感度に検出する技術として、期待されている。
【０００７】
現在ＬＡＭＰ法を用いた検査としては、増幅の過程で生成される副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定することにより、遺伝子増幅の有無を判定する方法が製品化されている（例えば、特許文献５参照。）。しかしながら、前記副産物ピロリン酸Ｍｇの白濁を測定する方法では、万が一目的産物以外の増幅が起こってしまった場合の確認方法がない。また複数の標的遺伝子を同時に検出することができないという問題点を有する。
その他、ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、インターカレーターを用いるものや光学的特性を利用する方法がある（例えば、特許文献６参照。）。さらに別の方法として、ＬＡＭＰ産物中に存在する１本鎖ループ部分にハイブリダイズするプローブを蛍光標識し、反応液の蛍光偏光度を測定するものや（例えば、特許文献７参照。）、１本鎖ループ部分にハイブリするプライマーの５’末端側に不溶性担体を固定化し、増幅反応に伴う凝集反応を観察するものがある（例えば、特許文献８参照）。
【特許文献１】特開２００１−１０３９８１号公報 （段落００１１−００１２）
【特許文献２】特開２００２−１２５６９５号公報 （段落０００２）
【特許文献３】特許第３３１３３５８号公報
【特許文献４】特許第２００３−１５９１００号公報
【特許文献５】特開２００３−１７４９００号公報
【特許文献６】特開２００２−１８６４８１号公報
【特許文献７】特開２００２−２７２４７５号公報
【特許文献８】特開２００２−３４５４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
増幅法としてＬＡＭＰ法を採用した場合には、産物中に１本鎖ループ部分が存在する。ＬＡＭＰ増幅産物を検出する手法として、該１本鎖領域に標的配列を設計する技術が開示されていることは上述の通りであるが（例えば、特許文献7、8参照）、１本鎖領域に標的配列が設けられたＬＡＭＰ増幅産物と基板上のプローブとのハイブリダイゼーション反応を利用した検出技術については、複雑な構造上の問題も含め不明確な部分は多く、このためＬＡＭＰ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出する技術の確立が切望されているのが実情である。
【０００９】
本発明は、かかる実情に鑑み開発されたものであり、簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＬＡＭＰ増幅産物、及びＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸配列の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等が前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明により、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法が提供される。
【００１２】
本発明の一態様において、前記測定用核酸及びプローブ核酸はＤＮＡである。
また、本発明の他の態様において、前記プローブ核酸はＤＮＡチップを構成している。
【００１３】
また、本発明の他の態様において、前記測定用核酸はＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であり、該ＬＡＭＰ産物における前記ターゲット配列は、ＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間、Ｂ１領域とＢ２領域との間、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間に挿入されていることを特徴とする。
【００１４】
本発明においては、前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
【００１５】
また、本発明により、ターゲット配列を検出するためにＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であって、前記ターゲット配列がＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間(Ｆ２領域含む)、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間(Ｆ２c領域含む)、Ｂ１領域とＢ２領域との間(Ｂ２領域含む)、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間(Ｂ２ｃ領域含む)に挿入されていることを特徴とするＬＡＭＰ産物が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ハイブリダイゼーション効率の高いＬＡＭＰ増幅産物の提供が可能となり、また核酸検出におけるハイブリダイゼーション反応において、一本鎖調製工程を経ることなく、なお且つ複雑な温度制御も不要な、簡便且つ短時間での核酸検出が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１８】
＜測定用核酸＞
本発明の方法における第一の特徴は、両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を対象として、ターゲット核酸配列の検出が行なわれることである。このようなステム・アンド・ループ構造の核酸は、例えば一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが自己ハイブリダイゼーションしたときにも形成されるが、最も典型的な例は、ＬＡＭＰ法による増幅産物として形成される。
【００１９】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示している。従来、ＬＡＭＰ増幅産物においては、ターゲット配列が、増幅産物のステム・アンド・ループ構造の中央に位置するように含まれていた(図2)。このようにターゲット配列を増幅・検出しようとする場合は、その両側に位置する配列に基づいて、合計４種類のプライマー配列（ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー）を設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰ＝Ｆ１ｃ＋Ｆ２、ＢＩＰ＝Ｂ２＋Ｂ１ｃ）を含んでいる。これらプライマーとして用いられる合計６つの領域を、以下では夫々プライマー領域と称することにする。上記４種類のプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６４８１号公報（特許文献５）を参照されたい。
【００２０】
一方、本発明では、図２に示したような従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する。即ち、図３に示すように、本発明においては、ターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間(Ｆ２領域含む)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(Ｆ２ｃ領域含む)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(Ｂ２領域含む)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(Ｂ２ｃ領域含む)の何れかに位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されていてもよく、したがって、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれる。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうことにより、図４に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部を得る。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成することとなる。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は図４に示すような一本鎖の状態のものが存在することから、変性操作を行なうことなく、図示のように各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションにより検出することができる。特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味している。
【００２１】
＜プローブ核酸＞
本発明においては、図４で説明したように、ステム・アンド・ループ構造を有する測定用核酸の一本鎖のループ構造内に含まれるターゲット配列を、これと相補的な配列を有するプローブ核酸を用いて検出する。このプローブ核酸は固相基体表面に固定化されたものであり、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものを用いるが、他のマイクロアレイを構成するプローブを用いてもよい。
【００２２】
ＤＮＡチップとは、数センチ角のガラスやシリコン基板上に異なる配列のプローブを数十から数十万種類固定化したもので、一度に複数の配列情報を調べることができる。これにより従来、数週間かかっていた遺伝子発現パターンの解析や一塩基多型などの解析を数日で行うことが可能になった。現在は新しい遺伝子の探索、機能の解明、研究支援技術として主に用いられているが、最近になって病気の診断技術としても普及し始めている。
【００２３】
ＤＮＡチップの代表的なものとしては、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸの技術が一般的に紹介されている（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, p 5022-5026参照。）。この技術は、蛍光で標識したサンプル遺伝子をチップ上のプローブと反応させ、高感度な蛍光解析装置を使って検出する方式である。また別の検出方法として、電流検出型のＤＮＡチップも開発されている。これは、２本鎖ＤＮＡに特異的に反応する挿入剤を添加し、挿入剤から得られる電気化学的な信号を測定する方法である。電気化学的なＤＮＡチップは標識が不要で検出に高価な装置が必要ないことから第二世代のＤＮＡチップとして期待されている（例えば、特開平５−１９９８９８号公報参照）。
【００２４】
＜測定用核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応＞
前記測定用核酸は、その中に含まれる一本鎖のターゲット配列と前記プローブ核酸との特異的ハイブリダイゼーション反応により、前記固体表面に結合される。本発明においては、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを、更なる特徴の一つとする（図５（Ａ）参照）。すなわち、かかる特徴は、プローブ核酸およびターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きが図５（Ｃ）に例示したような向きを有する場合、ＬＡＭＰ産物に特徴的な複雑な高次構造が、プローブが結合した基体と立体障害を起こし（図６（Ｂ）参照）、これが要因となってハイブリダイゼーション効率が低下するとの知見に基づき見出されたものであり、プローブ核酸およびターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、測定用核酸の二本鎖部分が固相表面から離間する方向に伸びるようにプローブ核酸およびターゲット配列部分双方における５′→３′の配列の向きを図５（Ｂ）に例示したように設定することにより、ＬＡＭＰ産物とプローブ核酸が結合した固相基体との立体障害が回避され（図６（Ａ）参照）、これによりハイブリダイゼーション効率を向上させることを可能としたものである。
【００２５】
＜プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の検出＞
本発明において、プローブ核酸にハイブリダイズした測定用核酸の有無を検出する手段は特に限定されるものではなく、例えば、蛍光ラベルに基づいて検出してもよいし、あるいは二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出してもよい。
【実施例１】
【００２６】
以下に、本発明による核酸検出方法を実施例を用いてより具体的に説明する。
本実施例では、サンプル用核酸としてＬＡＭＰ増幅産物を製造し、ハイブリダイゼーション反応後、該ＬＡＭＰ増幅産物中に存在する標的核酸を電流検出方式を用いて検出した。ＬＡＭＰ反応は以下に示す２組のプライマーを使用し、N-Acetyltransferase 2 (NAT2) 遺伝子の一部分を増幅させた。
【００２７】
（１）合成オリゴヌクレオチド
プライマー１
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の２本鎖領域（ステム領域）に存在するように設計する。図７に周辺ゲノム配列を示す。
【００２８】
NAT F3 Primer : 5’ ACAGAAGAGAGAGGAATCTGGT 3’
NAT FIP Primer: 5’ TGTTTCTTCTTTGGCAGGAGATGAGAA-GGACCAAATCAGGAGAGAGCA 3’
NAT B3 Primer : 5’ GATGAAGCCCACCAAACAGTA 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATGAATACATACAGACGTCTCC-CTGGGGTCTGCAAGGAAC 3’。
【００２９】
プライマー２
標的核酸配列がＬＡＭＰ増幅産物の１本鎖領域（ループ領域）に存在するように設計する。図８に周辺ゲノム配列を示す。
【００３０】
NAT F3 Primer : 5’ ACAAACAAAGAATTTCTTAATTCTCAT 3’
NAT FIP Primer: 5’ CGTCTGCAGGTATGTATTCATAGACTCAAAAAATATACTTATTTACGCTTGAACC 3’
NAT B3 Primer : 5’ CGACCAGATCTGTATTGTCTT 3’
NAT BIP Primer: 5’ ATAACCACATCATTTTGTTCCTTGCATGAATTTTCTATAGGTGAGGATGA 3’。
【００３１】
（２）ＬＡＭＰ反応溶液
ＬＡＭＰ反応溶液は以下の組成とした。
滅菌超純水 １．５μＬ
Ｂｓｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ １ μＬ
バッファー １２．５μＬ
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ４０ ｍＭ
ＫＣｌ ２０ ｍＭ
ＭｇＳＯ４ １６ ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０． ２％
Ｂｅｔａｉｎｅ １．６ Ｍ
ＤＮＴＰ ２．８ ｍＭ
Ｆ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
Ｂ３−プライマー（１０μＭ） ０．５ μＬ
ＦＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
ＢＩＰ−プライマ（１０μＭ） ４ μＬ
テンプレート（purified human genome） １ μＬ
合計 ２５ μＬ。
【００３２】
（３）ＬＡＭＰ法による核酸増幅
温度は５８℃、時間は１時間として核酸増幅を行った。この時、テンプレートの代わりに滅菌水を添加したものをnegative controlとした。
【００３３】
（４）標的核酸の増幅確認
上記の方法で増幅したＬＡＭＰ産物を図９に示すようにアガロースゲル電気泳動で確認した。また、目的産物の有無は制限酵素切断により確認した。図９において、レーン１〜７はそれぞれ以下に示すサンプル１〜７に対応する。
【００３４】
電気泳動の結果を以下に示す。
１．100bP ladder (TAKARA)
２．Negative control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
３．Positive control: 二本鎖領域に標的核酸が存在
４．Negative control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
５．Positive control: 一本鎖領域に標的核酸が存在
６．PstI 制限酵素処理：二本鎖領域に標的核酸が存在
７．PstI 制限酵素処理：一本鎖領域に標的核酸が存在。
【００３５】
制限酵素による消化を行った結果、理論通りの断片を得ることができた。さらに、未消化でのバンドの殆どが消化後には推定されるバンドへ変化したことから、非特異的な産物はほとんどないことが示唆された。
【００３６】
（５）核酸プローブ固定化電極の作製
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Positive-probe FP: AACCTCGAACAATTG
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT
3’ SH, 5’ SH プローブ 計二本
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA。
【００３７】
ＦＰプローブとＦＰｃプローブは互いに相補的な関係にある。ＦＰプローブおよびＦＰｃプローブについて、それぞれ３´ＳＨおよび５´ＳＨ修飾プローブ計４本を検討した。一方、Ｎ−プローブは、ネガティブコントロールとして使用したプローブであり、上記４本のプローブとは無関係な配列を有する。
【００３８】
この標識プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、メルカプトヘキサノール溶液に浸し、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄した。その後、超純水で洗浄、風乾し、プローブ固定化電極とした。電極配置は図１０に示した通りである。
【００３９】
（６）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記（３）で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（４）で作製した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、超純水で軽く洗浄した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
【００４０】
（７）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定した電極における電流値増加量として図１１に示す。二本鎖部分（ステム部分）に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、３´ＳＨ ＦＰｃ、５´ＳＨ ＦＰ、および５´ＳＨ ＦＰｃのすべてにおいてハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかった（図１１（Ａ））。これに対し、一本鎖ループ部分に標的核酸が存在するＬＡＭＰ産物では、ＮＰ、３´ＳＨ ＦＰ、５´ＳＨ ＦＰｃではハイブリダイズに由来する電流値増加は見られなかったが、３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ハイブリダイズに由来すると推測される電流値増加が見られた（図１１（Ｂ））。
【００４１】
ループ状一本鎖部分に標的核酸が存在する産物で、電流値増加が見られなかった３´ＳＨ ＦＰおよび５´ＳＨ ＦＰｃでは、ＬＡＭＰ産物の一本鎖ループ部分とハイブリダイゼーションする場合、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体に近接する方向に伸びることとなり立体障害を起こし（図５（Ｂ）、又は図６（Ａ）参照）、一方電流値増加が見られた３´ＳＨ ＦＰｃと５´ＳＨ ＦＰでは、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体から離間する方向に伸びることとなり立体障害が回避される（図５（Ｃ）、又は図６（Ｂ）参照）。
【００４２】
これらの結果から、まず、ＬＡＭＰ産物をＤＮＡチップで検出するには、標的核酸をループ状一本鎖部分に設計することが必須であることが明らかになった。さらに、ハイブリダイゼーション反応時におけるＬＡＭＰ産物と基体との立体障害を回避するために、ＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基体表面から離間する方向に伸びるように、プローブ核酸および標的配列部分の双方における５´→３´の配列の向きを設定することが必要であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００４３】
次に本発明による核酸検出方法の応用例として、標的核酸配列の一塩基変異(Single Nucleotide Polymorphisms:SNPs)を検出した。
【００４４】
実施例２では、サンプル用核酸として実施例１と同じくＬＡＭＰ産物を製造し、ハイブリダイゼーション後、該ＬＡＭＰ産物中に存在する標的核酸配列のSNPｓを電流検出方式を用いて検出した。
【００４５】
（１）検出に用いたＬＡＭＰ産物
ＬＡＭＰ産物については、実施例１、（１）合成オリゴヌクレオチド プライマー２を用い増幅させたものと同一のものを使用した。
【００４６】
（２）検出に用いたプローブ
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
【００４７】
Positive-probe FPc: CAATTGTTCGAGGTT 3’ SH （実施例１で使用したもの）
Positive-probe FPc SNP: CAATTGTTGGAGGTT 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer: ATCTTCAATTGTTCGAGGTTCAAGC 3’ SH
Positive-probe FPc 25mer SNP: ATCTTCAATTGTTGGAGGTTCAAGC 3’ SH
N-probe NP: CTGGACGAAGACTGA 3’ SH
FPcとNPは実施例１で使用したものと同一のものである。FPc SNPはFPc配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。FPc ２５merはFPcの上流側、下流側にそれぞれ５塩基ずつ標的核酸配列をのばしたものである。FPc ２５mer SNPは、FPc ２５mer配列の中央付近の配列をG→Cに変換したものである。上記５本のプローブはすべて３´ＳＨ修飾とした。
【００４８】
プローブの固定化は、実施例１と同様の方法で行った。電極配置は図１２に示した通りである。
【００４９】
（３）核酸プローブへのＬＡＭＰ産物のハイブリダイゼーション
試料核酸は、上記(１)で増幅したＬＡＭＰ産物を用いた。（２）で作成した核酸プローブ固定化表面を２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、３５、４０、４５℃の０．２×ＳＳＣバッファーにそれぞれ４０分間浸漬し、その後、超純水で軽く洗浄したものとハイブリダイゼーション後に超純水で軽く洗浄しただけのもの、計４種類の洗浄条件の基板を作成した。この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。
【００５０】
（４）結果
電流測定の結果を、各プローブを固定化した電極における電流値増加量として図13に示す。ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰについては、(Ａ)ハイブリ後、超純水で軽く洗浄しただけの基板で、ＰＦｃＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃでは優位な電流値増加が見られている。さらに、(Ｂ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を３５℃、４０分行った基板では、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰ共に電流値増加が見られなくなった。このことから、ＦＰｃとＰＦｃＳＮＰは(Ａ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
【００５１】
標的配列を長くしたＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰについては、(Ｃ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４０℃、４０分行った基板では、ＦＰｃ２５mer、ＰＦｃ２５merＳＮＰ共に電流値増加が見られているが、(Ｄ)ハイブリ後、０．２×ＳＳＣ溶液で洗浄を４５℃、４０分行った基板では、ＰＦｃ２５merＳＮＰでは電流値増加がみられないが、ＦＰｃ２５merでは優位な電流値増加が見られている。このことから、ＦＰｃ２５merとＰＦｃ２５merＳＮＰは(Ｄ)の洗浄条件の場合に一塩基変異を判定できることが明らかになった。
【００５２】
これらの結果から、プローブの配列の違いによって、ハイブリ、または洗浄条件を適宜選択すること、逆にハイブリ、洗浄条件を定めて、その条件にあった最適プローブを選択することによって一塩基変異を検出できることが明らかになった。
【００５３】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】従来のＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】従来のＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】本発明の測定用核酸の製造における増幅方法を説明するための模式図。
【図４】本発明の測定用核酸を説明するための模式図。
【図５】ループ状一本鎖部分に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を模式的に示した説明図であり、（Ａ）及び（Ｂ）はＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基盤に離間する方向に伸びるようにプローブ核酸および標的配列部分の双方における５´→３´の配列の向きが設定された状態を示し、（Ｃ）は該二本鎖部分が基盤に近接する方向に伸びるように同５´→３´の配列の向きが設定された状態を示す。
【図６】ループ状一本鎖部分に標的配列が存在するＬＡＭＰ産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応を模式的に示した説明図であり、（Ａ）はＬＡＭＰ産物の二本鎖部分が基盤に離間するように伸びている状態を示し、（Ｂ）は該二本鎖部分が基盤に近接する方向に伸びている状態を示す。
【図７】二本鎖領域（ステム領域）に標的核酸が存在するように設計したプライマー及び標的配列のNAT遺伝子上の位置を示す図。
【図８】一本鎖領域（ループ領域）に標的核酸が存在するように設計したプライマー及び標的配列のNAT遺伝子上の位置を示す図。
【図９】二本鎖領域（ステム領域）又は一本鎖領域（ループ領域）に標的配列が存在するように設計したＬＡＭＰ増幅産物及び制限酵素処理をした産物の電気泳動図。
【図１０】実施例においてＬＡＭＰ産物の検出のために用いた電極配置を示す説明図。
【図１１】実施例においてＬＡＭＰ産物を電気的に検出した測定結果を示すグラフであり、（Ａ）は二本鎖部分に標的核酸を含むＬＡＭＰ産物の測定結果を示すグラフ、（Ｂ）は一本鎖ループ部分に標的核酸を含むＬＡＭＰ産物の測定結果を示すグラフ。
【図１２】実施例２においてＬＡＭＰ産物の一塩基変異検出のために用いた電極配置を示す説明図。
【図１３】実施例２においてＬＡＭＰ産物の一塩基変異を電気的に検出した測定結果を示すグラフであり、（Ａ）はハイブリダイゼーション後、超純水で軽く洗浄した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｂ）はハイブリダイゼーション後、３５℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｃ）はハイブリダイゼーション後、４０℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ、（Ｄ）はハイブリダイゼーション後、４５℃の洗浄バッファーに４０分浸漬した基板の測定結果を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法。
【請求項２】
前記測定用核酸およびプローブ核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ核酸は、ＤＮＡチップを構成していることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定用核酸はＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＡＭＰ産物における前記ターゲット配列は、ＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間、Ｂ１領域とＢ２領域との間、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間に挿入されていることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、蛍光ラベルに基づいて検出することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出することを特徴とする、請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ターゲット配列を検出するためにＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であって、前記ターゲット配列がＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間(Ｆ２領域含む)、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間(Ｆ２ｃ領域含む)、Ｂ１領域とＢ２領域との間(Ｂ２領域含む)、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間(Ｂ２ｃ領域含む)に挿入されていることを特徴とするＬＡＭＰ産物。
【請求項１】
両端の相補的配列部分および該相補的配列部分の間に存在するターゲット配列部分を含み、且つ前記両端の相補的配列部分のハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖部分およびそれ以外のループ状一本鎖部分を含んでなるステム・アンド・ループ構造の測定用核酸を準備する工程と、
一端が固相基体表面に結合され且つ前記ターゲット配列部分に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を準備する工程と、
前記測定用核酸と前記プローブ核酸とを反応させることにより、前記測定用核酸のターゲット配列部分を前記プローブ核酸に特異的にハイブリダイズさせる工程と、
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を検出する工程とを具備し、
前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分がハイブリダイズしたときに、前記測定用核酸の二本鎖部分が前記固相表面から離間する方向に伸びるように、前記プローブ核酸および前記ターゲット配列部分の双方における５′→３′の配列の向きを設定することを特徴とする、ターゲット核酸配列の検出方法。
【請求項２】
前記測定用核酸およびプローブ核酸がＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ核酸は、ＤＮＡチップを構成していることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定用核酸はＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＡＭＰ産物における前記ターゲット配列は、ＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間、Ｂ１領域とＢ２領域との間、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間に挿入されていることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、蛍光ラベルに基づいて検出することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プローブ核酸にハイブリダイズした前記測定用核酸の有無を、二本鎖特異的で且つ電位差を生ずるインターカレータを用いて電気的に検出することを特徴とする、請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ターゲット配列を検出するためにＬＡＭＰ法により増幅されたＬＡＭＰ産物であって、前記ターゲット配列がＬＡＭＰ産物のＦ１領域とＦ２領域との間(Ｆ２領域含む)、Ｆ２ｃ領域とＦ１ｃ領域との間(Ｆ２ｃ領域含む)、Ｂ１領域とＢ２領域との間(Ｂ２領域含む)、および／またはＢ２ｃ領域とＢ１ｃ領域との間(Ｂ２ｃ領域含む)に挿入されていることを特徴とするＬＡＭＰ産物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２５９５１０（Ｐ２００８−２５９５１０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１９１０３（Ｐ２００８−１１９１０３）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【分割の表示】特願２００４−９３６６２（Ｐ２００４−９３６６２）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【分割の表示】特願２００４−９３６６２（Ｐ２００４−９３６６２）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
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