機能性抗体
本発明は、単一ドメイン結合部位を含む、新規な抗体に関する。本抗体は二価または多価であってもよく、二重特異性であってもよい。本発明はさらに、ｍＰＤＧＦＲαに結合する単一特異性および二重特異性抗体に関する。本抗体は、単独で、あるいは抗血管新生薬または抗腫瘍薬と組み合わせて投与することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年２月１５日出願の米国特許出願第６０／７７３，９９４号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／７７３，９９４号は、参照することによりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、単一ドメイン結合部位を含む新規な抗体に関する。抗体は、二価または多価であってもよく、二重特異性または多重特異性であってもよい。また、細胞表面受容体タンパク質と結合する二重特異性および多重特異性抗体も開示される。被験体に単独で、または抗血管新生薬または抗腫瘍薬と組み合わせて投与されると、該抗体は、腫瘍増殖を阻害するため、ならびに過剰増殖性疾患を阻害するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、同一かまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープと結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づく分子である。実験室での研究および初期の臨床研究の両方で、癌治療において、例えば腫瘍細胞を細胞傷害性薬剤、例えばエフェクター細胞、放射性核種、薬物および毒素などでターゲッティングすることによるか（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１９０−２．；ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３９１−７；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：１−６．）、または個々の抗体治療薬の生物学的活性を強化するために２つの異なる腫瘍標的（またはエピトープ）を同時にターゲッティングすることにより（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３０：１５９−７１；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：７００２−８．；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：２１３−２６）ＢｓＡｂが有意な用途を有しうることが実証された。ＢｓＡｂに基づく治療薬の開発における主な障害は、ハイブリッドハイブリドーマおよび化学コンジュゲーション（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ４：４６３−７０）を含む伝統的な方法によって臨床研究のために十分な量および質の材料を製造する際の困難さであった。２つの異なる組のＩｇＧ軽鎖および重鎖の同時発現により、多様な軽鎖および重鎖の対をもたらすことができ、そのうちの唯一つが所望の機能性の二重特異性ヘテロ二量体である（Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。一方、２つのＩｇＧまたはそれらの断片の化学架橋は、非効率的である場合が多く、抗体活性の損失をもたらし得る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．８６：１２７−３４）。両方の方法において、非機能性種、例えばハイブリッドハイブリドーマにより産生されるコグネイト（同族）でないＩｇ軽鎖および重鎖のホモ二量体および不対合ヘテロ二量体など、ならびに化学コンジュゲーションによりもたらされる多量体凝集体からのＢｓＡｂの精製は困難である場合が多く、収率は通常低い（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：６３５−４４）。
【０００４】
効率を改善するため、抗体断片（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ ３：８３−１０５；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：４７−６６）および全長ＩｇＧ型式（Ｃａｒｔｅｒ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７−１５）として、両方のＢｓＡｂ製造のための多様な組換え法が開発されてきた。例えば、同種の全長ＩｇＧ様ＢｓＡｂの製造は、効率的なＩｇ ＣＨ３ドメインヘテロ二量体形成のためのいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」操作により（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７−２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−８１）、さらに異なる特異性をもつ２本の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を全長ＩｇＧ分子のＮ末端かまたはＣ末端のいずれかの上に融合することにより（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：３６１−７；Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３）達成されている。また、ＢｓＡｂは、柔軟なリンカーの使用の有無にかかわらず、二量体形成手段、例えば、ロイシンジッパー（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３；ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−４）、およびＩｇ ＣＬ／ＣＨ１ドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２２：２５９−６４）；ダイアボディーを用いて（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：６４４４−８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）１４：１９２−６）；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−７）；ならびにミニ抗体フォーマット（Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１ ：１５７９−８４；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７）などを介して２本の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片を遺伝的に融合することにより構築された（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６；Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７０２１−５；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２）。これらの事例の過半数において、これらの組換えアプローチは、それらの標的抗原の各々に対して一価である、二価の二重特異性抗体分子の産生をもたらす。さらに、機能性Ｆｃドメインを含むＩｇＧ様二重特異性抗体の例は限定されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位を含む新規な二重特異性抗体を提供する。また、本発明の抗体には、ｓＶＤ抗原結合部位に加えて抗体Ｆｖｓを含む抗原結合部位が含まれ得る。
【０００６】
本発明の抗体は、任意の抗原に対して特異的であってよい。一実施形態では、本発明の抗体は、受容体チロシンキナーゼ（ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない）であってよい細胞表面抗原と結合する。もう１つの実施形態では、本発明の抗体は細胞表面受容体のリガンドと結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、受容体中和活性を有する。本発明はさらに、該抗体の医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明は、１以上の受容体チロシンキナーゼの活性化を阻害する方法を提供する。哺乳類における腫瘍増殖は、哺乳類に有効量の本抗体を投与することにより治療または阻害され得る。本抗体は、その他の細胞表面抗原（例えば、ＲＴＫを含む）またはサイトカイン（例えば、ＲＴＫリガンドを含む）と結合する抗体と共に同時投与されることができる。特定の実施形態では、本方法は、また、哺乳類に、例えば、化学療法薬および／または放射線療法を含む、抗腫瘍薬または治療を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、哺乳類において非がん性過剰増殖性疾患、例えば、乾癬を治療する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位を含む新規な抗体を提供する。本発明はまた、単一ドメインの抗原結合部位と２ドメインのＦｖ様抗原結合部位の両方を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０００９】
単一ドメイン抗原結合部位は、免疫グロブリンの可変ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）に類似するが、第２の抗原結合ドメイン（例えば、対になるＶＬまたはＶＨ）の非存在下で抗原と特異的結合が可能である。そのような単一ドメインは、実際には対となる結合ドメインと安定な会合ができないであろう。しかし、単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインとＶＨドメインの両方を含む抗体のそれと同様の親和性および結合力をもつ抗原と結合することができる。さらに、天然抗体のように、単一ドメイン抗体は受容体−リガンド相互作用を阻止することができる。従って、単一ドメイン結合部位を含む本発明の抗体は、例えば、ハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス、およびＦａｂまたはｓｃＦｖ結合ドメインのファージディスプレイライブラリーから得られる抗体と同じ目的に使用される。
【００１０】
本発明の抗体は、いくつかの点で免疫グロブリン様である。１）ＩｇＧ様である本発明の抗体はヘテロ四量体であり、２つの異なるポリペプチド鎖の各々のうちの２つからなる。２）異なるポリペプチド鎖は会合し、例えば、標準的な、天然に存在する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖定常領域と同じ方法でジスルフィド結合により共有結合しうる。３）ポリペプチド鎖の１つは、天然に存在する免疫グロブリン重鎖と同じ方法で安定な自己会合が可能である。例えば、ポリペプチド鎖のうちの１つには、天然に存在する免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４に対応する１以上のドメインが含まれ得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、天然に存在するＩｇＧの定常ドメイン構造を含む。
【００１１】
免疫グロブリン様構造の非常に大きな１つの利点は、抗体鎖が発現時に自然に対となることである。先行技術の多くの四量体抗体とは異なり、同種の抗体の調製物を得るためにさらなる操作は必要でない。
【００１２】
本発明の抗原結合タンパク質は単一可変ドメイン（ｓＶＤ）である抗原結合部位を含む。本発明の特定の実施形態では、ｓＶＤ結合部位はＩｇＧ様抗体の１つの可変ドメインと置き換わり、ｓｃＦｖはその他の可変ドメインと置き換わる。そのような実施形態の例は、図１Ａに示される。本発明の他の実施形態では、ｓＶＤ結合部位は、ＩｇＧ重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端でＩｇＧ抗体へグラフトされる。そのような実施形態の例は、図１Ｂに示される。ｓＶＤはまた、その他の位置でも免疫グロブリン様抗体に組み込むことができる。例えば、ｓＶＤはＣＨおよび／またはＣＬ定常ドメインのＣ末端で結合され得る。さらに、図１のようにｓＶＤ結合部位の置換と、ｓＶＤ結合部位のＣＨおよび／またはＣＬ定常ドメインのＣ末端への付加を組み合わせることにより、特定の抗原に対して多重特異性および／または多価のＩｇＧ様抗体を生成することができる。
【００１３】
当技術分野で公知のように、Ｆｖは２つのドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）からなる。標準的な抗体では、ＦｖのＶＨおよびＶＬドメインは、会合して抗原結合部位を形成するが、直接結合しているのではなく、各々が結合された抗体定常領域に連結されている。ＦｖのＶＨおよびＶＬドメインはまた、合成リンカーに連結されて単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することもできる。
【００１４】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識をさす。例えば、天然の抗体は単一特異性である。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。抗原結合タンパク質が１よりも多くの特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原と、または１よりも多くの抗原と会合しうる。
【００１５】
天然の抗体分子は、同一の２本の重鎖と同一の２本の軽鎖で構成される。各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合により重鎖と共有結合されている。２本の重鎖はさらにヒンジ領域で複数のジスルフィド結合により相互に結合されている。個々の鎖は折り畳まれて同様の大きさ（約１１０〜１２５アミノ酸）および構造であるが、異なる機能を有するドメインとなる。軽鎖は１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、抗体のクラスまたはアイソタイプによって、３または４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む。マウスおよびヒトにおいて、アイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプに細かく分かれる。ＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体の部分は「Ｆｖ」と名付けられ、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１本のポリペプチド鎖に１つのＶＬドメインおよび１つのＶＨドメインを含む操作されたタンパク質であり、その一方のドメインのＮ末端ともう一方のドメインのＣ末端は、柔軟なリンカーによって連結されている。「Ｆａｂ」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる抗体の部分をさす。
【００１６】
可変ドメインは、抗体間で、特に抗原結合部位の位置で相当なアミノ酸配列の多様性を示す。「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域がＶＬおよびＶＨの各々に見出される。
【００１７】
「Ｆｃ」は、対になった重鎖定常ドメインを含む抗体の部分の呼称である。ＩｇＧ１抗体では、例えば、ＦｃはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃは、さらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞性細胞障害の活性化に関係している。複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭなどの天然の抗体については、複合体形成にＦｃ定常ドメインが必要とされる。
【００１８】
最後に、「ヒンジ」領域は抗体のＦａｂ部分とＦｃ部分を分離して、Ｆａｂの、お互いに対する、さらにＦｃに対する可動性をもたらすと同時に２本の重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。
【００１９】
本発明の抗体は望ましい特長の組合せを有する。第１に、それらは本質的に均一である。デザインにより、抗体重鎖と軽鎖の不対合は大幅に減少されるかまたは排除される。例えば、一部の二重特異性抗体は、２つの特異性を提供するために２本の異なる重鎖を用いる。かかる重鎖がＩｇＧ型分子に配置される場合には、４通りの組合せが可能である。これらのうちの２通りは、その生成物が単一特異性であるような不対合重鎖からなる。本発明の抗体において、不対合は実質的に排除される。
【００２０】
本発明の抗体の第２の特長は、それらが各結合特異性に対して二価であることである。多くの二重特異性抗体は、それに含まれる抗体結合部位の各々に対して一価である。二価性は、結合の協同性、および単一の抗原特異的結合部位を含む分子について結合力の有意な増大を可能にするため、二価であることは抗体機能にとって重要である。
【００２１】
本発明の抗体の第３の利点は、天然の抗体のＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１分子のＣＨ２および／またはＣＨ３）を構成し、その他の抗体機能を提供する１以上の重鎖定常ドメインが存在することである。さらに、定常ドメインにより提供される機能が損なわれないように複数の結合ドメインが定常ドメインから分離されている。定常ドメイン機能には、特定のアクセサリー分子との結合（例えば、細胞表面および可溶性Ｆｃ受容体との結合、ＩｇＡおよびＩｇＭに関してＪ鎖との会合、ＩｇＡに関してＳタンパク質）、補体経路の活性化（補体依存性細胞障害（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）、ＣＤＣ）、いくつかの異なる白血球集団による、標的細胞と結合した抗体の認識（抗体依存性細胞媒介性細胞障害、ＡＤＣＣ）およびオプソニン化（食作用の促進）が含まれる。また、Ｆｃ重鎖定常ドメイン（１または複数）は増加した血清半減期を付与し得る。
【００２２】
本発明のタンパク質の第４の利点は、完全な生成物を得るためのインビトロプロセシング要件がないことである。人工的な方法で再配置されているが、各々のドメインは生物系での発現を可能にする天然の特性を有する。例えば、二重特異性抗体は原核生物および真核生物発現系で発現させることができる。生成されるタンパク質は実質的に二重特異性である。
【００２３】
本発明の抗体における使用のためのｓＶＤ抗原結合部位およびＦｖ領域含有結合部位は、多様な方法により得ることができる。選定された結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ部分のアミノ酸配列は天然に存在する抗体から得ることができ、あるいは所望の結合特性について選択または修飾され、スクリーニングされ、または選定される。例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、所望の結合特性を有するモノクローナル抗体から直接得ることができる。あるいは、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、選択哺乳類由来のＶ遺伝子配列のライブラリー由来のものであってよい。かかるライブラリーの要素は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインのランダムな組合せを示し、任意の所望の抗原を用いてスクリーニングされて所望の結合特性を有する要素が特定される。特に好ましいものはヒトＶ遺伝子ライブラリーである。かかるスクリーニングのための方法は当技術分野で公知である。あるいは、選定された非ヒト供給源由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを、ヒト定常ドメインを含むキメラ抗体に組み込んでもよい。例えば、ヒトへの投与には、ＶＨおよびＶＬドメインが非ヒト供給源から選定された１以上の機能性ヒト定常ドメインを含む抗体を使用することが望ましいであろう。定常ドメイン関連機能を最大化するか、または抗体の免疫原性を低下させるため、ヒト定常ドメインが好ましい。
【００２４】
あるいは、「ヒト化」されたＶドメインを作製することができる。ヒト化可変ドメインは、非ヒト起源の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列をヒトフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトして構築される。例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−２７；およびＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号参照。ヒト化構築物は、有害な免疫原性特性の排除に、例えば、非ヒト供給源由来の抗原結合ドメインをヒトにおける治療のために使用することが望まれる場合に特に役立つ。可変ドメインは高度の構造的相同性を有し、ＣＤＲおよびＦＲに相当する可変ドメイン内のアミノ酸残基の特定を容易にする。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ参照。よって、抗原結合に関与するアミノ酸は容易に特定される。さらに、グラフトされたＣＤＲを含むヒト化結合ドメインの抗原に対する親和性を保存または増強するための方法が開発された。一つの方法は、受容可変ドメイン中にＣＤＲ領域の立体構造に影響を及ぼす外来フレームワーク残基を含めることである。もう一つの方法は、外来ＣＤＲを外来可変領域に最も近い相同性をもつヒト可変ドメインの上にグラフトすることである。Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９−３３。ＣＤＲは、まず所望のＣＤＲ配列を含む重複プライマーを用いて個々のＦＲ配列を増幅させること、そして得られる遺伝子セグメントをその後の増幅反応において連結させることにより、異なるＦＲ上に最も容易にグラフトされる。異なる可変ドメイン上にＣＤＲをグラフトすることは、さらに、アミノ酸配列中のＣＤＲに隣接するか、またはＣＤＲの立体構造に影響を及ぼす折り畳まれた可変ドメイン構造中のＣＤＲにパッキングされた（ｐａｃｋｅｄ）アミノ酸残基の置換を伴ってよい。そのため、本発明のヒト化可変ドメインには、１以上の非ヒトＣＤＲを含むヒトドメインならびに結合特性を保存または増強するためにさらなる置換または置き換えがなされているかかるドメインが含まれる。
【００２５】
本発明の抗体はまた、抗体を免疫系に対して自己として現れさせるために表面露出残基を置き換えることにより免疫原性を低くさせた可変ドメインを用いることができる（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９−９８）。抗体はこのプロセスにより親和性を失うことなく修飾された（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１，９６９−９７３）。抗原結合部位の近傍のアミノ酸残基の内部パッキングは不変のままであるので、親和性は保存される。免疫原性の低下を目的とする、本発明による表面露出残基の置換は、結合特性に影響を及ぼすＣＤＲ残基または隣接残基の置換を意味しない。
【００２６】
本質的にヒトである可変ドメインを用いることが多くの場合好ましい。ヒト結合ドメインは、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの組合せが線維状ファージの表面に提示されるファージディスプレイライブラリーから得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５４；Ａｕｊａｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８，１５５−６８参照）。可変ドメインの組合せは、一般にＦａｂまたはｓｃＦｖの形で線維状ファージ上に提示される。このライブラリーを、所望の抗原結合特性を有する可変ドメインの組合せを有するファージについてスクリーニングする。好ましい単一ドメインと可変ドメインの組合せは、選定された抗原に対して高親和性を示し、その他の関連抗原に対して交差反応性をほとんど示さない。非常に大きな抗体断片のレパートリーをスクリーニングすることにより（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３，３２４５−６０参照）、良好な多様性の高親和性結合ドメインが単離され、多くは所望の抗原に対してナノモル以下の親和性を有すると予想される。
【００２７】
あるいは、ヒト結合ドメインは、再配置されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントがその中に導入されており、内因性マウスＩｇ遺伝子を不活化されているトランスジェニック動物から得ることができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，４５５−５８に概説）。好ましいトランスジェニック動物には、１Ｍｂを超える大きさの非常に大きな連続したＩｇ遺伝子断片が含まれる（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１５，１４６−５６）が、中程度の親和性をもつヒトＭａｂは、より小さな遺伝子座を含むトランスジェニック動物から作製することができる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，２６７２−８１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７，１３−２１参照）。
【００２８】
ｓＶＤ結合部位は、抗原特異的Ｆｖ領域（ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含む）から得ることができる。多くの場合、Ｆｖ領域の結合親和性および特異性は、主に可変ドメインのうちの１つによって寄与されることが示され得る。あるいは、ｓｃＦｖを直接得てもよい。ｓＶＤの直接供給源には、ＶＨドメインのみを含有する抗体を自然に発現する哺乳類（例えば、ラクダ科動物）、および単一可変ドメインだけを発現するよう構築されたファージディスプレイライブラリーが含まれる。例えば、ヒトドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーは、Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から市販されている。本明細書に例示されるように、ＰＤＧＦＲαに特異的なｓＶＤ結合部位は、ＶＬドメインが自然に欠落している変異体を含むＦａｂライブラリーから得た。
【００２９】
生理学的免疫応答において、発現抗体遺伝子の突然変異および選定は、それらの標的抗原に高い親和性をもつ抗体の産生を導く。本発明の抗体に組み込まれているＶＨドメインおよびＶＬドメインを、同様に、インビトロ突然変異およびスクリーニング手順に付して高親和性の変異体を得ることができる。よって、本発明の結合ドメインには、直接突然変異によるかまたは親和性成熟方法により結合特性が改善された結合ドメインが含まれる。親和性および特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより変更または改良することができる（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５４，３９２−４０３参照）。単一ドメイン抗体結合の一次決定基であるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔに定義されるＣＤＲの中にあってよいが、同様にその他の残基、例えば、例として、そうでなければＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬ界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）に埋もれるであろう残基などを含んでよいことが理解される。ＣＤＲまたは結合を決定するその他の残基は多様な方法で変異される。一つの方法は、その他の点では同一の抗原結合部位の集団において、全２０個のアミノ酸またはそのサブセットが特定の位置に見出されるように、個々の残基または残基の組合せをランダム化することである。あるいは、突然変異をエラープローンＰＣＲ法によりＣＤＲ残基の範囲にわたって誘導させる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２６，８８９−９６参照）。結合ドメインをコードする遺伝子を含むファージディスプレイベクター（例えば、重鎖および／または軽鎖可変領域遺伝子）は、大腸菌のミューテーター株で増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５０，３５９−６８参照）。これらの突然変異誘発法は当業者に公知の多くの方法の実例である。
【００３０】
本発明の抗体の各可変ドメインは、完全な免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインであってよく、あるいは、天然に存在するドメインの機能的同等物または変異体または誘導体、あるいは、例えば、ＷＯ ９３／１１２３６号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ／Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されるものなどの技法を用いてインビトロで構築される合成ドメインであってよい。例として、１以上のアミノ酸を欠損している抗体可変ドメインに相当するドメインを組み込むことが可能である。特性を表す重要な特長は、各可変ドメインが相補可変ドメインと会合して抗原結合部位を形成する能力である。
【００３１】
本発明の抗原結合タンパク質は、任意のエピトープ、抗原性部位またはタンパク質のための結合部位を有する。特に注目されるものは疾患の治療に有用な抗体である。好ましい抗体は、受容体タンパク質、例えば血管新生および／または腫瘍形成に関与する受容体などを中和する。受容体を中和するとは、シグナルを形質導入する受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化することを意味する。受容体中和について信頼できるアッセイは、受容体リン酸化の阻害である。本発明は、何らかの特定の受容体中和機構に制限されない。いくつかの可能性のある機構としては、リガンドと受容体の細胞外結合ドメインの結合の阻止、および受容体の二量体化またはオリゴマー化の阻止が挙げられる。しかし、その他の機構を除外することはできない。
【００３２】
内皮細胞または非内皮細胞、例えば腫瘍細胞のサンプルにおける受容体の活性化の中和は、インビトロで行われてもインビボで行われてもよい。受容体発現細胞のサンプルにおいて受容体の活性化を中和することは、細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。インビトロでは、細胞サンプルにＶＥＧＦを添加する前、添加と同時に、または添加した後に細胞を抗体と接触させる。インビボでは、哺乳類への投与により本発明の抗体を受容体と接触させる。哺乳類への投与方法としては、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が挙げられる。
【００３３】
かかる受容体の例としては、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ−４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）および同種類のものが挙げられるが、これらに限定されない。受容体チロシンキナーゼのさらなる非限定的な例としては、Ｆｌｔ−４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴｅｋおよびＴｉｅ２が挙げられる。
【００３４】
インビボ血管新生および／または腫瘍の増殖の可能性のあるレギュレーターとして意味づけられるその他の因子としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられる。対応する受容体は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−Ｒ）、および神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）である。細胞遊走、形態変化、および侵襲性にかかわる別の受容体は、マクロファージ刺激タンパク質受容体（「ＭＳＰ−Ｒ」または「ＲＯＮ」）である。関心対象の受容体としては、ヒトタンパク質およびその他の哺乳類に由来するホモログが挙げられる。
【００３５】
本発明の抗体は、任意の供給源由来のＩｇ抗原結合ドメインを組み込むことができる。例えば、抗体は、上に記載される受容体として知られており、本発明の抗体で用いるＶＨおよびＶＬドメインの供給源である。ＫＤＲに特異的なｓｃＦｖ可変領域結合ドメインの例としては、例えば、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１および２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３および４）（ＷＯ００／４４７７７号参照）、ＩＭＣ−２Ｃ６（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号５および６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号７および８）（ＷＯ０３／０７５８４０号参照）、ならびにＩＭＣ−１１２１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号５および６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号９および１０）（ＷＯ０３／０７５８４０号参照）のＶＨドメインおよびＶＬドメインが挙げられる。Ｆｌｔ−１に特異的な結合ドメインの例としては、６．１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１１および１２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１３および１４）ならびにＩＭＣ−１８Ｆ１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２７および２８。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２９および３０）が挙げられる。
【００３６】
ＥＧＦＲに特異的な結合ドメインとしては、例えば、ＷＯ９６／４０２１０号に開示されるＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ；ＩＭＣ−Ｃ２２５）（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１５および１６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１７および１８）ならびにＩＭＣ１１Ｆ８（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１９および２０。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２１および２２）が挙げられる。ＩＧＦＲに特異的な結合ドメインの例は、ＩＭＣ−Ａ１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２３および２４。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２５および２６）である。ＦＧＦ受容体と結合する抗体（ＷＯ２００５／０３７２３５号参照）としては、例えば、ＦＲ１−Ｈ７（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３１および３２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３３および３４）、ＦＲ１−Ａ１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３５および３６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３７および３８）、ならびにＦＲ１−４Ｈ（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３９および４０。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４１および４２）が挙げられる。ＲＯＮまたはＭＳＰ−Ｒと結合する抗体（ＷＯ２００５／１２０５５７号参照）としては、ＩＭＣ−４１Ａ１０（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４３および４４。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４５および４６）ならびにＩＭＣ−４１Ｂ１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４７および４８。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４９および５０）が挙げられる。ＰＤＧＦＲαと結合する抗体としては、例えば、３Ｇ３および７Ｇ１１が挙げられる（Ｌｏｉｚｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．４：３６９）。
【００３７】
さらに、上に記載される結合ドメインの部分、例えばＣＤＲ領域などは、本明細書に記載される結合タンパク質を作製するために使用される結合ドメインに組み込むことができる。
【００３８】
特定の好ましい抗体は上に記載される受容体の２つと結合する。本発明の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は血管新生に関与する２つの異なる受容体チロシンキナーゼと結合し、その活性化を阻止する。そのような一実施形態では、抗体はＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦ受容体、例えば、例として、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲなどと結合する。そのような別の実施形態では、抗体はＫＤＲおよびＦＬＴ−１と結合する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の抗体はＨＥＲ２およびＥＧＦＲと結合する。さらにもう１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体はＥＧＦＲおよびＩＧＦＲと結合する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲと結合する。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ２である。そのような抗体は、ＥＧＦＲとＶＥＧＦＲの両方を経由するシグナル伝達を阻止することによる、血管上皮細胞の刺激の阻止に有用である。これはＥＧＦＲリガンド、特に腫瘍細胞に分泌されるＴＧＦαに応答して生じる場合に特に有用である。
【００４１】
本発明の抗体を用いて標的細胞上の抗原と免疫系エフェクター細胞上の抗原を架橋することができる。これは、例えば、細胞表面上に特定の関心対象の抗原を有する細胞に対する免疫応答を促進するために有用である。本発明によれば、免疫系エフェクター細胞には、細胞の免疫応答を活性化するＴ細胞などの抗原特異的細胞および細胞の免疫応答を媒介するマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの非特異的細胞が含まれる。
【００４２】
本発明の抗体は、免疫系エフェクター細胞の任意の細胞表面抗原の結合部位を有し得る。そのような細胞表面抗原としては、例えば、サイトカインおよびリンホカイン受容体、Ｆｃ受容体、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２およびＣＤ６４が挙げられる。ｓＶＤによりもたらされる抗原結合部位に加えて、二重特異性抗体にはＦｖによりもたらされる結合部位が含まれ得る。かかるＦｖは、コンビナトリアルライブラリーから、ならびに当技術分野で公知のその他の方法により、上述の抗原に対する抗体から得ることができる。サイトカイン受容体およびリンホカイン受容体に特異的な二重特異性抗体も、受容体の天然リガンドの全部または一部に相当するアミノ酸の配列を含む結合部位を含み得る。例えば、細胞表面抗原がＩＬ−２受容体である場合、本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−２に相当するアミノ酸の配列を含む抗原結合部位を有し得る。その他のサイトカインおよびリンホカインとしては、例えば、インターロイキン類、例えばインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）、ならびにコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗体は２本のポリペプチド鎖を発現させることにより作製され、それらは総合して、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。２本のポリペプチド鎖は各々、少なくとも１つの二量体化の可能な重鎖定常ドメインを含む（例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３）。抗体は、各ポリペプチド鎖の先頭に細菌の分泌シグナル配列を含むＤＮＡ構築物を用いて、大腸菌において都合よく産生される。多様な細菌のシグナル配列は当技術分野で公知である。好ましいシグナル配列は、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ；軟腐病菌）のｐｅｌＢ遺伝子に由来する。本抗体をコードするＤＮＡ断片は、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよび高レベル発現のためのエンハンサーを用いて、哺乳類細胞、例えば、例として、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＣＯＳ−７、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞など、ならびにリンパ起源の細胞系統、例えばリンパ腫細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞などにおいて、ベクターにクローニングすることができる（例えば、Ｂｅｎｄｉｇ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４０，２９９号；Ｍａｅｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２，１２４−３４参照）。
【００４４】
選択マーカーは、選択培地中で増殖される形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。典型的な選択マーカーは、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補う、あるいは（ｃ）複合培地から得られない決定的な栄養を供給する、タンパク質をコードする（例えばバチルスのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。特に有用な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与する。例えば、ＤＨＦＲ選別遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全ての形質転換細胞を培養することにより特定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ７７，４２１６に記載されるように調製し増殖させた、ＤＨＦＲ活性欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統である。次に、この形質転換細胞を増加したレベルのメトトレキサートに曝す。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピーと、同時に、発現ベクターを含むその他のＤＮＡの複数のコピー、例えば抗体または抗体断片をコードするＤＮＡなどの合成がもたらされる。
【００４５】
遺伝子構築物を酵母で発現させることを望む場合、酵母での使用に適した選別遺伝子の例は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ，２８２，３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｇｅｎｅ ７，１４１。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンで増殖する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１。Ｊｏｎｅｓ （１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５，１２。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１損傷が存在すると、トリプトファンの非存在下で増殖により形質転換を検出するために効果的な環境がもたらされる。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ番号２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドで補完される。
【００４６】
形質転換宿主細胞は、当技術分野で公知の方法により、炭素（例えば、グルコースまたはラクトースなどの炭水化物）、窒素（例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、または、ペプトン、アンモニウム塩もしくは同種類のものなどのそれらの分解生成物）、ならびに無機塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩）の資化可能な供給源（ａｓｓｉｍｉｌａｂｌｅ ｓｏｕｒｃｅｓ）を含む液体培地中で培養される。培地はさらに、例えば、増殖促進物質（例えば、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガンおよび同種類のものなど）を含む。
【００４７】
増殖因子受容体と結合する抗体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の活性化を阻止できることが好ましい。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を用いて、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然もしくは合成基質のリン酸化を測定することにより決定することができる。よって、リン酸化アッセイは本発明のＲＴＫアンタゴニストを決定する際に有用である。リン酸化は、例えば、ホスホチロシンに特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイで、またはウエスタンブロットで検出することができる。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかのアッセイはＰａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．（１９９７）２８３：１４３３−４４ および Ｂａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９９８）６２：１４３−５０に記載されている。
【００４８】
さらに、測定されるタンパク質の発現がＲＴＫに媒介される、タンパク質発現の検出のための方法を、ＲＴＫアンタゴニストを決定するために利用することができる。これらの方法には、タンパク質発現検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合的放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング手法、例えばノーザンブロットおよびサザンブロットなど、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが含まれる。例えば、Ｇｒａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，（１９９６）７８：１２８４−９２；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９４）８５：５６７−７１；Ｓａｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，（１９９６）１４８：１０４７−５３；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｌｉａ，（１９９５）１５：２８９−９６；Ｒａｄｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９５）１：１９−３１；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９０）５０：３９３４−３９；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９７）１７：４４１９−２６；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９５）５５：３１４０−４８参照。
【００４９】
抗体のリガンド結合を阻止する能力は、例えば、インビトロ競合的アッセイにより測定することができる。そのようなアッセイでは、ＲＴＫのリガンド（例えば、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ）を固定化し、ＲＴＫと固定化されたリガンドの結合を競合的に阻害する抗体の有効性を決定するための結合アッセイが行われる。
【００５０】
インビボアッセイもＲＴＫアンタゴニストを決定するために使用することができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在下および不在下、受容体リガンドで刺激した細胞株を用いる細胞分裂促進アッセイにより観察することができる。例えば、ＥＧＦで刺激したＡ４３１細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ１，ＭＤ）を用いてＥＧＦＲ阻害をアッセイすることができる。別の方法には、例えば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いてＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖の阻害を試験することが含まれる。米国特許第６，３６５，１５７号（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）参照。
【００５１】
好ましい本発明の抗体は二重特異性を有し、２つの異なる抗原と同時に結合することが可能である。異なる抗原は異なる細胞上または同じ細胞上に位置し得る。抗原の架橋はインビトロで、例えば、第１の抗原が結合している固体表面を提供し、第１の抗原と第２の抗原（結合タンパク質はこれに対しても特異的である）に特異的な二重特異性抗体を加え、結合した第２の抗原の存在を検出することにより示され得る。
【００５２】
好ましい本発明の抗体は、２つの受容体とそれらのそれぞれのリガンド間の相互作用を阻止することが可能である。例えば、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１に特異的な抗体は、ＶＥＧＦに誘導される細胞遊走ならびにＰｌＧＦに誘導される細胞遊走を阻害する。二重特異性抗体における２つの受容体の結合特異性の組合せは、個々の親抗体よりも細胞遊走の阻害に有効であり得る（例えば、Ｚｈｕ，Ｚ．，ＷＯ ２００４／００３２１１号参照）。
【００５３】
単一特異性の抗体と比較して、二重特異性抗体は、細胞機能のより強力な阻害剤であり得る。例えば、ＶＥＧＦに刺激される細胞機能、例えば、例として、内皮細胞の増殖など、ならびにＶＥＧＦおよびＰｌＧＦに誘導されるヒト白血病細胞の遊走などは、２つの標的抗原の一方または両方に対する親和性が低下している場合でさえも、二重特異性抗体により一層効率的に阻害され得る。ＫＤＲとＦｌｔ−１の両方に対して特異的な（一価の）抗体は、いずれかの標的抗原に対して作られた単一特異性ｓｃＦｖよりもＶＥＧＦまたはＰｌＧＦに誘導される細胞遊走を一層効果的に阻害することができる（ＷＯ２００４／００３２１１号）。
【００５４】
別の例では、ＥＧＦＲ（またはＨｅｒ２／ｎｅｕ）とＩＧＦＲの両方に対して二重特異性を有し、両方の受容体と結合が可能であり、それらの特異的リガンドとの相互作用を阻止することの可能な抗体は、ＥＦＧおよびＩＧＦに刺激される受容体活性化の両方および下流シグナル伝達の中和に用いられる。ＥＧＦＲかまたはＩＧＦＲのいずれかの刺激は、程度は異なるが、Ａｋｔおよびｐ４４／４２を含む、共通の下流シグナル伝達分子の活性化（例えば、リン酸化）をもたらすことが観察される。特定の腫瘍細胞では、ＥＧＦＲ機能の阻害は、その他の成長因子受容体シグナル伝達経路のアップレギュレーションにより、特にＩＧＦＲ刺激により補償され得る。１つの受容体と結合し、Ａｋｔかまたはｐ４４／４２のいずれかのリン酸化を完全に阻止しない抗体を用いる治療と対照的に、ＥＧＦＲとＩＧＦＲの両方と結合する抗体での腫瘍細胞のインキュベーションは、Ａｋｔおよびｐ４４／４２の両方のリン酸化を阻止する。従って、ＩＧＦＲシグナル伝達の阻害は、腫瘍増殖の阻害および特定の治療薬に対する腫瘍細胞の感受性の増加をもたらす。
【００５５】
そのような共通のシグナル伝達カスケード成分のリン酸化の阻害も、その他のＲＴＫ、例えば、ＲＯＮなどと結合する抗体で観察される。従って、抗原結合タンパク質は、複数のシグナル伝達経路の活性化に起因する細胞増殖または形質転換を特徴とする腫瘍性疾患を治療するために一般に有用である。
【００５６】
本発明の抗体は、多様な増殖性障害の治療に有用である。例えば、本発明は、１より多くの受容体チロシンキナーゼを発現し、それを経由して刺激を受ける腫瘍の治療を提供する。その１より多くの受容体を経由する刺激は、各受容体単独の封鎖に非感受性の制御されない増殖をもたらし得る。あるいは、第２の受容体の刺激を、第１の受容体を経由する刺激に応答して観察される活性化に加えることができる。あるいは、個々の受容体からの貢献は増殖性であってよい。上の例の各々において、両方の受容体を阻止する抗原結合タンパク質の存在下で、有意に改善された腫瘍増殖の阻害が観察される。
【００５７】
本発明の抗体は、受容体刺激がＥＧＦＲパラ分泌および／または自己分泌ループを経由している疾患を治療するために有用である。例えば、ＥＧＦＲ発現腫瘍は、それらの環境中に存在するＥＧＦに対して特徴的に感受性があり、さらに、腫瘍産生ＥＧＦまたはＴＧＦ−αにより刺激を受け得る。任意の特定の機構に縛られるものではないが、本方法により治療または予防されうる疾患および状態としては、例えば、腫瘍増殖が刺激されるものが挙げられる。そのため、本方法は、血管新生していないか、またはまだ実質的に血管新生していない固形腫瘍を治療するために効果的である。
【００５８】
本発明の特定の抗体は、過剰増殖性疾患に関連する血管新生を阻害するために有用である。例えば、腫瘍に関連する血管新生を阻止することにより、腫瘍増殖は阻害されうる。一実施形態では、抗体は腫瘍関連ＲＴＫと結合し、腫瘍による血管新生リガンド（すなわちＶＥＧＦ）の産生を阻害し、また脈管構造の細胞に関連するＶＥＧＦ受容体と結合してかかる細胞の増殖を阻害する。異なる実施形態では、抗体は複数のＶＥＧＦ受容体と結合し、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ（例えば、ＰｌＧＦ）リガンドのその他のリガンドが１種類より多くのＶＥＧＦ受容体との結合から阻止される。
【００５９】
治療されうる腫瘍としては、原発腫瘍および転移性腫瘍、ならびに難治性腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍としては、化学療法薬のみ、抗体のみ、放射線のみまたはそれらの組合せを用いる治療に応答できないかまたは抵抗性のある腫瘍が挙げられる。また、難治性腫瘍は、そのような薬剤を用いる治療により阻害されると思われるが、治療を中断してから５年まで、時には１０年まで、またはそれよりも後に再発する腫瘍を包含する。腫瘍はＥＧＦＲまたはその他のＲＴＫを正常レベルで発現するか、または腫瘍はＲＴＫを、例えば、正常レベルの少なくとも１０、１００、または１０００倍のレベルで過剰発現する。
【００６０】
ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲのリガンドにより刺激される腫瘍の例としては、癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫、および腺腫が挙げられる。かかる腫瘍は実質的に身体の全ての部分で起こり、それには、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頚部または肝臓が含まれる。本発明に従って治療されうる、ＥＧＦＲを過剰発現することが観察される一部の腫瘍としては、結腸直腸および頭頚部の腫瘍、特に頭頚部の扁平上皮癌、神経膠芽腫などの脳腫瘍、ならびに肺、乳房、膵臓、食道、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頚部、および前立腺の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。構成的に活性な（すなわち制御されていない）受容体チロシンキナーゼ活性を有することが観察される腫瘍の限定されない例としては、神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。腫瘍のその他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ腫瘍、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、胃腸癌および腎癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは、多形性膠芽腫、ならびに平滑筋肉腫が挙げられる。その他のＲＴＫの過剰発現は同様の増殖不良を生じ得る。例えば、たいていの転移性骨癌は、前立腺、乳房、または肺の原発腫瘍に起因する。前立腺腫瘍は初期にはホルモン依存性でありうるが、そのような依存関係の喪失が、骨へと遊走する細胞のＩＧＦＲに媒介される刺激と同時に起こる。
【００６１】
また、抗体は、腫瘍以外の過剰増殖性疾患を治療するためにも有用であり、哺乳類へ有効量の本発明の抗体を投与することを含む。本明細書に開示されるように「過剰増殖性疾患」は、ＥＧＦＲファミリーまたはその他のチロシンキナーゼ受容体のメンバーを発現する非癌細胞の過剰な増殖によって起こる状態として定義される。過剰増殖性疾患により産生された過剰な細胞はＲＴＫを正常レベルで発現するか、またはそれらはＲＴＫを過剰発現する。
【００６２】
過剰増殖性疾患の例としては、乾癬、光線性角化症、および脂漏性角化症、いぼ、ケロイド瘢痕、ならびに湿疹が挙げられる。ウイルス感染、例えばパピローマウイルス感染などにより起こる過剰増殖性疾患も含まれる。例えば、乾癬には多くの異なる変形形態および重篤度の程度がある。異なる種類の乾癬は、膿様の水疱（膿疱性乾癬）、重度の皮膚の脱落（乾癬性紅皮症）、水滴様の点（滴状乾癬）および平滑な炎症病変（逆乾癬）などの特性を示す。全ての種類の乾癬（例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｉｃａ）、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症）の治療が、本発明により意図される。
【００６３】
本発明によれば、抗体は、疾患の治療のために、化学的にまたは生合成的にその他の薬剤、例えば抗腫瘍薬または血管新生阻害薬とコンジュゲートされ得る。抗体と連結された抗腫瘍薬には、抗体が結合している腫瘍を破壊または損傷させる、または抗体が結合している細胞の環境において腫瘍を破壊または損傷させる、任意の薬剤が含まれる。例えば、抗腫瘍薬は、化学療法薬または放射性同位元素などの毒物である。化学療法薬は従来法を用いて抗体とコンジュゲートされ（例えば、Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ Ｓｅｉｌｅｒ （１９８８）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８２、１９７−２１５参照）、それにはペプチドおよび非ペプチドリンカーによるものが含まれる。
【００６４】
また、本発明の抗体は、診断目的のためにインビボおよびインビトロで有用な、検出可能なシグナル生成剤と連結することもできる。シグナル生成剤は、外部手段、通常電磁放射の測定により検出できる測定可能なシグナルを生じる。大部分、シグナル生成剤は酵素または発色団であり、あるいは蛍光、燐光またはケミルミネッセンスにより発光する。発色団は、紫外または可視領域の光を吸収する色素を含み、酵素触媒反応の基質または分解生成物であってよい。
【００６５】
本発明はさらに、第２の試薬に組み込まれた治療薬もしくは診断薬ととともに抗体の使用を企図する。例えば、結合対の１つのメンバーを本発明の抗体と連結させる。例えば、抗腫瘍薬は、かかる対の第２のメンバーとコンジュゲートされ、その結果抗体が結合している部位に向けられる。好ましい実施形態では、ビオチンを本発明の抗体とコンジュゲートし、それにより、抗腫瘍薬の標的あるいはアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされた他の部分がもたらされる。あるいは、ビオチンまたは別のかかる部分は本発明の抗体と連結され、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされている診断系において、レポーターとして用いられる。
【００６６】
抗体は、１以上の適したアジュバント、例えば、例として、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）など、またはその他の免疫賦活剤、例えば、限定されるものではないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドと組み合わせて投与してよい。しかし、抗体単独の投与が、治療上効果的な方法で腫瘍の進行を防止、阻害または低下させるために十分であることは当然理解される。
【００６７】
特定の実施形態では、ＲＴＫと結合し、リガンドと結合する別の抗原結合タンパク質と一緒にリガンド結合を阻止する本発明の抗体を投与することが望ましい。リガンド結合抗体は当技術分野で周知であり、例えば、抗ＶＥＧＦ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）；ベバシズマブ）が挙げられる。
【００６８】
本発明の抗体はまた、化学療法薬または放射性同位元素などの抗腫瘍薬とともに投与する併用療法で使用される。適した化学療法薬は当業者に公知であり、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリチアマイシンが挙げられる。抗体と抗血管新生薬または抗腫瘍薬は、血管新生を阻害し、かつ／または腫瘍増殖を低下させるために有効な量で患者に投与される。抗体はまた、その他の治療計画と、例えば、放射線療法などの治療と組み合わせて投与される。併用療法の例については、例えば、米国特許第６，２１７，８６６号（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ａｎｄｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）；ＷＯ９９／６００２３号（Ｗａｋｓａｌ ｅｔ ａｌ．）（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）参照。
【００６９】
任意の適した抗腫瘍薬、例えば、化学療法薬、放射線またはそれらの組合せなどを使用することができる。当技術分野で公知であるか評価されている抗腫瘍薬は、その標的または作用様式に基づいてクラスに分類することができる。例えば、アルキル化剤には、限定されるものではないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが含まれる。代謝拮抗薬の例としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびパクリタキセル、ゲムシタビン、およびトポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、およびトポテカン（トポイソメラーゼＩ）およびエトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）が挙げられる。放射線に関して、線源は、治療される患者に対して外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）かまたは内部（近接照射療法−ＢＴ）であってよい。かかる分類は使用する抗腫瘍薬の選択に有用であり得る。例えば、ＩＧＦＲと結合する抗体は、トポイソメラーゼ阻害剤とともに投与される場合に特に効果的でありうることが観察されている。
【００７０】
投与される抗腫瘍薬の用量は、多数の因子に依存し、それには、例えば、薬剤の種類、治療される腫瘍の種類および重篤度ならびに薬剤の投与経路が挙げられる。しかし、本発明が何らかの特定の用量に制限されないことは強調されるべきである。
【００７１】
併用療法において、抗体は、治療開始の前、途中、または後に別の薬剤ならびにその任意の組合せとともに、すなわち、抗腫瘍薬治療の開始の前および途中、前および後、途中および前、あるいは前、途中および後に投与される。例えば、腫瘍または腫瘍性疾患の治療には、抗体は放射線療法開始前の１〜３０日の間、好ましくは、３〜２０日、より好ましくは、５〜１２日の間に投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、化学療法は抗体療法と同時に、前に、または後に投与される。
【００７２】
本発明において、任意の適した方法または経路を用いて本発明の抗体を投与することができ、かつ、所望により、抗腫瘍薬、受容体アンタゴニスト、またはその他の医薬組成物と同時投与することができる。例えば、本発明に従って用いられる抗腫瘍薬投与計画には、患者の腫瘍の状態の治療に最も適していると考えられる任意の投与計画が含まれる。様々な悪性腫瘍が特異的抗腫瘍抗体および特異的抗腫瘍薬の使用を必要とし得、それは患者ごとに決定される。投与の経路としては、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が挙げられる。投与される抗腫瘍薬の用量は多数の因子に依存し、それには、例えば、抗腫瘍薬の種類、治療される腫瘍の種類および重篤度ならびに抗腫瘍薬の投与経路が挙げられる。しかし、本発明が何らかの特定の方法または投与経路に制限されないことは強調されるべきである。
【００７３】
本発明の抗体は、予防または治療の目的のために哺乳類において使用される場合、製薬上許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが当然理解される。適した製薬上許容される担体としては、例えば、１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよび同種類のもの、ならびにそれらの組合せが挙げられる。製薬上許容される担体は、結合タンパク質の保存期間または有効性を促進する、湿潤もしくは乳化剤、防腐剤またはバッファーなどの少量の補助物質をさらに含む。注射用組成物は、当技術分野で周知のように、哺乳類への投与の後に有効成分の即時、持続または遅延放出をもたらすように処方される。
【００７４】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の抗体を含む、腫瘍増殖および／または血管新生を阻害する、またはその他の疾患を治療するためのキットを含む。ヒトまたはヒト化抗体が好ましい。このキットにはさらに、例えば、腫瘍形成または血管新生に関与する別の増殖因子受容体（例えば、上記のＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＦＧＦＲ、他）の任意の適したアンタゴニストが含まれる。代わりに、またはそれに加えて、本発明のキットは抗腫瘍薬をさらに含んでよい。本発明の文脈において適した抗腫瘍薬の例は本明細書に記載されている。本発明のキットは、さらにアジュバントを含んでよく、例も上に記載されている。
【００７５】
また、当技術分野で周知の調査または診断方法のための、インビボおよびインビトロでの本抗体の使用も本発明の範囲に含まれる。診断法には、本発明の抗体を含むキットが含まれる。
【００７６】
従って、本受容体結合抗体は、よって、当技術分野で周知の調査、診断、予防もしくは治療方法のためにインビボおよびインビトロで使用することができる。当然、本明細書に開示される本発明の原則の変動が当業者によりなされ得ることが理解され、そのような変更形態も本発明の範囲内にあることが意図される。本明細書中で言及されるすべての参照文献は、参照することによりその全文が組み込まれる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例でさらに本発明を説明するが、決して本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。従来法、例えば、ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のかかるベクターおよびプラスミドへの挿入、宿主細胞へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその定量などに用いられた方法の詳細な説明は、多数の刊行物から得ることができ、それにはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄが含まれる。
【００７８】
ファージディスプレイＦａｂライブラリーからのヒト抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の選定。Ｄｙａｘ製の大型の未処置の（ｎａｉｖｅ）ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリー（３．７×１０１０クローンを含む）を用いてｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対して作成された抗体を選定した。ライブラリーストック（１００μｌ）を、２０ｍｌの２ＹＴＡＧ培地中で対数期まで増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いてレスキューし、２ＹＴＡＫ培地（２ＹＴは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）中で３０℃にて一晩増幅させた。ファージ調製物を４％ＰＥＧ、０．５Ｍ ＮａＣｌに沈殿させた。ファージ調製物を、２４０μｇの非関連ヒトＩｇＧを含む１ｍｌの３％無脂肪乳／ＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートして非特異的結合およびｍＰＤＧＦＲαタンパク質のＦｃタグとの結合を阻止した。
【００７９】
選定用チューブをコートするタンパク質の量を減少させながら（それぞれ５０、１０および２μｇ）、固定化ｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃに関して３ラウンドの選定を行った。各選定ラウンドでは、ｍＰＤＧＦＲα−ＦｃコートＭａｘｉｓｏｒｐ Ｓｔａｒチューブ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｌｉｄｅ，ＤｅｎＭａｒｋ）を、まず３％乳／ＰＢＳで３７℃にて１時間ブロッキングし、次いでファージ調製物とともに室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でチューブを１５回洗浄した後、ＰＢＳで１５回洗浄した。結合したファージを、１ｍｌの新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ）溶液で、室温にて１０分間溶出させた。溶出させたファージを、１０ｍｌの対数期中期のＴＧ１細胞とともに３７℃にて３０分間静置し、３０分間振盪させながらインキュベートした。感染したＴＧ１細胞をペレット化し、３枚の２ＹＴＡＧプレート上に蒔き、３０℃にて一晩インキュベートした。プレート上で増殖した全てのコロニーを、３〜５ｍｌの２ＹＴＡ培地中へかき取り、グリセロール（終濃度：１０％）と混合し、等分して、−８０℃にて保存した。その後の選定ラウンドでは、前回の選定ラウンド由来のファージストック溶液（１００μｌ）を増幅させ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＳｔａｒチューブをコートするためのｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃの量を減らした上記の手順に従って、選定に使用した。
【００８０】
ファージ投入量を評価するために、選定前の１０μｌのファージを用いてＴＧ１細胞を感染させ、次いで２ＹＴＡＧプレートで力価を測定した。選定からのファージの回収を評価するため、上記選定手順から溶出したファージで感染させた１０μｌのＴＧ１細胞の力価を２ＹＴＡＧプレートで測定した。各選定ラウンドの回収率を計算したところ、コートするｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃが減少しているにもかかわらず、連続するラウンドごとに回収率は増加した（第１ラウンド１×１０−６％、；第２ラウンド４×１０−６％；第３ラウンド２×１０−４％）。
【００８１】
結合および阻止活性を有する抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング。２回目および３回目の選定ラウンドの後、各ラウンドから１９０のクローンをランダムに選び、ファージＥＬＩＳＡおよびＦａｂ ＥＬＩＳＡの両法により結合および阻止活性を試験した。要するに、２回目および３回目の選定ラウンド後に回収された個々のＴＧ１クローンをランダムに選び、９６ウェルプレート中で３７℃にて培養した。ファージを作製するために、上記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて細胞をレスキューした。可溶性Ｆａｂを作製するために、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ＹＴＡ培地中で細胞をインキュベートした。結合ＥＬＩＳＡ用には、ファージ調製物および可溶性Ｆａｂを含有する細胞培養上清を、１／６量の１８％乳／ＰＢＳを用いて室温にて１時間ブロッキングした。次いでブロッキングされたファージ調製物または細胞培養上清を、ｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでコートした（１μｇ／ｍｌ、５０μｌ、４℃にて一晩）９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に加え、室温にて１時間インキュベートした。室温にて１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。
【００８２】
ファージＥＬＩＳＡ用には、プレートを抗Ｍ１３ファージ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした。Ｆａｂ ＥＬＩＳＡ用には、プレートを抗ヒトＦａｂ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とともにインキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えることにより発色させ、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４５０ｎＭにて吸光度を測定した。ライブラリースクリーニングにおいて結合剤であることが確認されたＦｃ特異的抗体を除去するために、１Ｃ１１ ＩｇＧとの結合についてのＥＬＩＳＡも行った。２回目の選定後に選ばれたクローンの７７％超、および３回目の選定後に回収されたクローンの９９％超がｍＰＤＧＦＲα結合アッセイにおいて陽性であり、選定プロセスの効率が高いことが示唆された。
【００８３】
阻止ＥＬＩＳＡ用には、５０μｌのファージ調製物またはＦａｂ培養物上清を一定量のｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃ（０．５μｇ／ｍｌ）と混合し、室温にて３０分間インキュベートした。次にこの混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡ（０．５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でプレコートした９６ウェルプレートに移し、室温にて１時間インキュベートした。結合したｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質を定量するため、次にプレートをウサギ抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともに室温にて１時間インキュベートし、その後に３回洗浄し、ＴＭＳペルオキシダーゼ基質を加えた。結合したｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質は、４５０ｎＭでの吸光度を読み取ることにより定量した。阻止活性は、抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートにより検出されるＥＬＩＳＡシグナルの低下で示された。ｍＰＤＧＦＲαに結合したクローンの約４．２％が、ＰＤＧＦ−ＡＡ阻止活性を示した。
【００８４】
阻止アッセイの結果に基づき、さらなる試験のために、最初に１４のクローン（阻止しない結合剤を対照クローン（３Ｆ３）として含む）を選定した。ファージミドＤＮＡを単離し、ジデオキシヌクレオチドシークエンシングによりＤＮＡ配列を決定した。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の分類およびアラインメントは、Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＧｒｏｕｐのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ）およびＤＮＡｓｔａｒのＭａｇＡｌｉｇｎを用いて行った。
【００８５】
選定された抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の分析。１４のクローンのうち、９つの特徴のある抗体が明らかとなった（表１）。１Ｃ１０および１Ｆ２の他に、同一のＶＨまたはＶＬは見られなかった。興味深いことに、より強い阻止活性を有する抗体のうちの４つが、不完全な軽鎖を有していた。クローン１Ｆ２および１Ｆ９は、インフレームＶＬ欠失を有していた（リーダーペプチド配列に続いてＣＬ配列がある）。クローン１Ｃ１０および１Ｆ２は同じＶＨ遺伝子を共有していた。しかし、１Ｃ１０の配列をコードするＶＬに終止コドンが含まれるため、ＣＬは発現されなかった。クローン３Ｇ７はＶＬ遺伝子の５’末端に出現する終止コドンを含んでいた。１Ｃ１０および３Ｇ７の双方は、強い阻止を示した。Ｆａｂ発現および結合活性は非常に低いと思われたが、これは抗ヒト−Ｆａｂ二次試薬の結合が弱いことにより説明することができる。
【表１】
【００８６】
Ｆａｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に示す。１Ｅ１０ ＶＨドメイン：配列番号５１および５２。１Ｅ１０ ＶＬドメイン：配列番号５３および５４。１Ａ１２ ＶＨドメイン：配列番号５５および５６。１Ａ１２ ＶＬドメイン：配列番号５７および５８。３Ｂ２ ＶＨドメイン：配列番号５９および６０。３Ｂ２ ＶＬドメイン：配列番号６１および６２。１Ｃ１０ ＶＨドメイン：配列番号６３および６４。１Ｃ１０ ＶＬドメイン：配列番号６５および６６。３Ｇ７ ＶＨドメイン：配列番号６７および６８。３Ｇ７ ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号６９。３Ｇ７ ＶＬドメイン：ＱＡＷ；１Ｆ９ ＶＨドメイン：配列番号７０および７１。１Ｆ９ ＶＬドメイン：配列番号７２および７３。１Ｆ２ ＶＨドメイン：配列番号７４および７５。１Ｆ２ ＶＬドメイン：配列番号７６および７７。図１５は、それぞれのドメイン（３Ｇ７、１Ｆ９、および１Ｆ２のＶＬ切断または欠失を含む）、ならびにＣＤＲ領域の位置を示す。
【００８７】
６つのクローンのＦａｂ断片を大腸菌ＨＢ２１５１宿主細胞において発現させ、アフィニティークロマトグラフィープロテインＧカラムにより精製した。個々の選定クローンのファージミドを用いて、非サプレッサー大腸菌宿主ＨＢ２１５１を形質転換した。ＨＢ２１５１におけるＦａｂ断片の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ＹＴＡ培地中で細胞を３０℃にて培養することにより誘導した。Ｌｕ（ｘ）に記載されるように、細胞の周辺質抽出物を調製した。可溶性Ｆａｂタンパク質は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って、プロテインＧカラムを用いて精製した。調製物の純度および分子量を調べるために、精製された抗体をＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で電気泳動させ、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液で染色することにより可視化した。
【００８８】
精製された結合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図２）。完全軽鎖を有するＦａｂは図２Ａに示され、分子量は約５０，０００である。その一方、１Ｆ２および１Ｆ９の非還元断片は、標準対照Ｆａｂと比較して小さなバンド（−ＤＴＴ：ＭＷ約３７，５００）を生じた（図２Ｂ）。還元性条件下では（＋ＤＴＴ）、２つのバンドは明瞭であり、上部のバンドは正常なサイズのＶＨ−ＣＨ１断片と一致し、下部のバンドはＣＬ断片を有する軽鎖と一致したが（ＭＷ約１２，５００）、可変ドメインが欠如していた。
【００８９】
抗ｍＰＤＧＦＲα抗体によるｍＰＤＧＦＲα結合およびｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡ阻止。６つの抗ｍＰＤＧＦＲαクローンの可溶性Ｆａｂ断片を、ｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡ相互作用の阻止におけるそれらの抗原結合効率および効力について、定量的に比較した。結合アッセイにおいて、ＦａｂをまずｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）でプレコートした９６ウェルプレート中で室温にて１時間インキュベートし、その後ウサギ抗−抗ヒトＦａｂ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにさらに１時間インキュベートした。次に、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより、プレートに結合した抗体−ＨＲＰを定量した。最初のスクリーニング結果に一致して（表１）、１Ｆ２ Ｆａｂは他の全てのＦａｂタンパク質よりもさらに効率よくｍＰＤＧＦＲαに結合した（図３Ａ）。
【００９０】
様々な抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いる表面プラズモン共鳴により測定し、ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．０プログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて評価した。親和定数、Ｋｄを、解離速度（ｋｏｆｆ）／会合速度（ｋｏｎ）の比から計算した。報告された値は、Ｆａｂに関しては少なくとも２回の測定、ＩｇＧに関しては３回の測定からの平均±Ｓ．Ｅ．を示す（表２）。結合アッセイに一致して、ｓＶＤ抗体１Ｆ２は、選定された標準Ｆａｂである１Ｅ１０よりも２３倍以上高い、約０．５ｎＭというより高い親和性（Ｋｄ）を示した。
【００９１】
表２において、１Ｆ２−２Ｈ Ｆａｂは、ＣＬとの融合物として発現された第二の同一のＶＨドメインを含む、操作された二価のＦａｂである。この二価Ｆａｂを、大腸菌中で発現させ、プロテインＧクロマトグラフィーにより精製した。精製された１Ｆ２−２Ｈ ＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、約５０ｋＤの１つの単一タンパク質バンドが示され、それは標準Ｆａｂ断片のものと類似していた（図５）。二価のＦａｂの親和性は７９．５ｐＭであり、一価の１Ｆ２ Ｆａｂの４１８ｐＭと比較して５．２倍の増強を示した（表２）。
【表２】
【００９２】
阻止アッセイでは、様々な量の抗体を、溶液中の一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合物とともに３０分間インキュベートし、次いでその混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレートへ移し、１時間インキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、結合した抗ヒトＦｃ−Ａｂを定量することにより定量した。１Ｆ２ Ｆａｂは、ｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡの相互作用を強力に阻止し（図３Ｂ）、ＩＣ５０値は、１Ｆ９、１Ｅ１０および１Ａ１１のそれぞれ５７ｎＭ、１４０ｎＭおよび２２０ｎＭと比較して１２ｎＭであった。等モルベースでは、二価のＦａｂは、ｍＰＤＦＧＲαへの結合および受容体／リガンド相互作用の阻止の両方において、中程度に増強された活性を示した（図６）。
【００９３】
完全ＩｇＧのクローニング、発現、および精製。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを重鎖発現ベクターであるｐＤＦｃと、軽鎖発現ベクターであるｐＬＣκにそれぞれクローニングすることにより、選定されたクローンのＦａｂを全長ＩｇＧに変換した。ｐＤＦｃは、リーダーペプチド配列のコード遺伝子とＣＨ１の間にクローニング部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｈｅ Ｉを有する。ｐＬＣκは、リーダーペプチド配列とＣＬの間にクローニング部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢｓｉ ＷＩを有する。要するに、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を、ファージミドＤＮＡからの逆転写ＰＣＲにより増幅し、それらのそれぞれの発現ベクターにクローニングした。次に、既に記載されたように、重鎖および軽鎖発現ベクター（ＶＨ−ｐＤＦｃおよびＶＬ−ｐＬＣκ）を一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクトした。細胞培養の培地をトランスフェクション後４８時間および９６時間に回収し、プールした。抗体は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って、プロテインＡカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。ＩｇＧの機能を確認した後、発現されたＶＨ遺伝子とＬ遺伝子の対を単一発現ベクターにクローニングし、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。抗体精製は上記の通り行った。
【００９４】
ＶＨを１つだけ含む１Ｆ２ Ｉｇから３つのＩｇＧ様構築物を作製し（図７参照）、それには４つのＶＨを有する四価の１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧ（Ａ）、およびＣＨまたはＣＬいずれかとの融合物として発現された１Ｆ２ ＶＨを含む二価の１Ｆ２（ＢおよびＣ）が含まれた。軽鎖および重鎖を発現するプラスミドを用いて、一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞をコトランスフェクトした。細胞培養物の上清を用いるＥＬＩＳＡにより抗体の発現レベルをモニターした。１Ｆ２−２Ｈの発現は、両方の二価の１Ｆ２抗体よりも一貫してより少なく、二価の１Ｆ２抗体の約１／４であった。細胞培養物の上清由来の抗体を、プロテインＡカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００９５】
標準抗体成分を有する遮断剤であるクローン１Ｅ１０もまた、全長ＩｇＧへと変換した。１Ｅ１０のＶＨおよびＶＬ遺伝子を、まずｐＤＦｃおよびｐＬＣκにそれぞれクローニングした。上記のように、ＤＮＡシークエンシングおよび１Ｅ１０ ＩｇＧ結合活性の確認の後、発現されたＶＨ／ＶＬ対を単一発現ベクターにクローニングし、次いでそれを用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした後、抗体を精製した。
【００９６】
精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して調製物の純度および分子量を決定した。二価抗体１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ（分子量約１２５，０００）は、標準ＩｇＧ（１Ｅ１０および２Ｂ４；図８の左パネル）よりも速く移動した。抗体を電気泳動前にＤＴＴで処理した場合（図８の右パネル）、重鎖および軽鎖成分は分離した。抗体１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬは、１Ｅ１０および２Ｂ４の重鎖に似た重鎖と関連のある上部のバンド、および予想された移動度に近い移動度の、速く移動する下部のバンド（ＭＷ約１２，５００、ＣＬのみ）を有していた。一方、抗体１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨは１Ｅ１０および２Ｂ４の移動度に似た移動度の軽鎖を示す下部のバンド、およびＣＨ１−Ｆｃポリペプチドのみに関連のある上部バンド（ＭＷ約３７，５００）を有していた。
【００９７】
全長抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の結合および阻止活性。３つの全ての精製１Ｆ２変異抗体、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧ、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ、ならびに抗体１Ｅ１０を、ＥＬＩＳＡによりｍＰＤＧＦＲαに対する結合親和性について比較した。様々な量の抗体を、ｍＰＤＧＦＲα／ＦｃでコートしたＥＬＩＳＡプレート中でインキュベートし、次にｍＰＤＧＦＲα−結合抗体を抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートにより検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧが４つの結合部位を有しているとしても、１Ｆ２−２Ｈの結合活性は両方の二価の１Ｆ２ ＩｇＧ（１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ）よりも約８倍低いことを示す（図９Ａ）。一方、二価の１Ｆ２（１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ）は両方とも、ＥＬＩＳＡ（図９Ａ）およびＢＩＡｃｏｒｅ分析（表２）により非常に類似した結合親和性を示した。二価の１Ｆ２ ＩｇＧの親和性は、親の１Ｆ２ Ｆａｂから約１等級（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）増加し、１Ｅ１０ ＩｇＧはそのＦａｂから２０倍増加した（表２）。全体にわたって、二価の１Ｆ２ ＩｇＧ両方のｍＰＤＧＦＲαに対する結合親和性は、１Ｅ１０ ＩｇＧよりも約１等級高かった（図９Ａおよび表２）。
【００９８】
抗ｍＰＤＧＦＲα抗体を評価するために、定量的阻止アッセイも行った。上に記載されるように、様々な量の抗体を溶液中の一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合物とともに３０分間インキュベートし、次いでその混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレートへ移し、１時間インキュベートした。次に、結合した抗ヒトＦｃ−Ａｂを定量することにより、結合したｍＰＤＧＦＲαを定量した。結合データに一致して、二価の１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨは１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧおよび１Ｅ１０ ＩｇＧよりも優れた遮断剤であった：ＩＣ５０値は、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬ、１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧおよび１Ｅ１０ ＩｇＧそれぞれに対して３．２、２．７、１７、および９．６ｎＭであった（図９Ｂ）。
【００９９】
二重特異性抗体。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＳｔａｒチューブをｍＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質でコートする以外は上記と同じ手順を用いて、抗Ｆｌｋ−１抗体２Ｂ４もＤｙａｘ Ｆａｂファージライブラリーから単離した。２Ｂ４のＦａｂはＦｌｋ−１に特異的であり、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ１６５の相互作用を阻止した。Ｆａｂ ２Ｂ４のＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号７９および８１により提供される。図１５は、各ドメインおよびＣＤＲ領域の位置を示す。２Ｂ４ Ｆａｂを、上に記載されるように完全ＩｇＧ１に変換した。２Ｂ４ ＦａｂおよびＩｇＧの結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定した。２Ｂ４ ＦａｂおよびＩｇＧのｍＶＥＧＦＲ２への結合親和性は、それぞれ６．７±３．０ｎＭおよび０．３９±０．１ｎＭである。２Ｂ４ ＩｇＧは、ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦ１６５の相互作用を、約３．５ｎＭのＩＣ５０値で阻止する（図１３Ｂ）。
【０１００】
ドメインに基づく二重特異性抗体の構築（抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｔ−１）。ドメインに基づく二重特異性抗体を、２つの型式、つまりｓｃＦｖ−型とＦａｂ−型に構築した（図１０、ＡおよびＢ）。ｓｃＦｖ−型では、２Ｂ４のＶＨおよびＶＬ遺伝子をコードするＰＣＲ断片をまずオーバーラップＰＣＲを用いてアセンブルした。２Ｂ４ ＶＬのＣＯＯＨ末端を５−アミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、ＣＬドメインのＮ末端から取得）を介して２Ｂ４ ＶＨのＮＨ２末端に連結した（図１０Ａ）。２Ｂ４ ＶＬ−ＶＨをコードする、得られる遺伝子を、次にｓｃＦｖ２Ｂ４−ＣＨ融合物（２Ｂ４ ＶＬ−２Ｂ４ ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３から成る）の発現のためにＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｈｅ Ｉライゲーションを介してベクターｐＤＦｃにクローニングした。次に、ｓｃＦｖ２Ｂ４−ＣＨ発現ベクターを、一過性発現のためのＣＯＳ−７細胞のコトランスフェクションにより、上に記載される１Ｆ２ＶＨ−ＣＬ発現ベクターと対にした。
【０１０１】
Ｆａｂ−型では、１Ｆ２のＶＨ遺伝子および２Ｂ４のＶＬをまずオーバーラップＰＣＲを用いてアセンブルした。この融合物において、１Ｆ２ ＶＨのＣＯＯＨ末端をＣＨの５’末端由来の５−アミノ酸リンカーを介して２Ｂ４ ＶＬのアミノ末端に連結した。次に、１Ｆ２ ＶＨ−２Ｂ４ ＶＬ−ＣＬ−融合タンパク質の発現のために、１Ｆ２ ＶＨ−２Ｂ４ ＶＬをコードする遺伝子をＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＢｓｉＷ Ｉ部位を介してベクターｐＬＣκにクローニングした。ＶＨ発現のために、２Ｂ４ ＶＨ遺伝子を上記のようにｐＤＦｃベクターにクローニングした。軽鎖および重鎖を発現するためのプラスミドを、図１０Ｂに表されるように対にして、一過性の発現のためにＣＯＳ−７細胞をコトランスフェクトするために使用した。
【０１０２】
二重結合活性についてＥＬＩＳＡによりクローンを試験した後、Ｉｇ発現構築物を単一発現ベクターに組み入れ、次いで、デザインされたＩｇＧの一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするために使用した。抗体は、上記のように細胞培養物の上清から精製した。
【０１０３】
ドメインに基づく二重特異性抗体の発現および精製。１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４抗体を、ＣＯＳ−７細胞（１００〜２００ｍｌの細胞培養物）におけるトランスフェクションおよび一過性発現により作製した。抗体を、プロテインＡカラムを用いる細胞培養物の上清のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１０４】
精製された二重特異性抗体（１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４）ならびにそれらの親抗体１Ｆ２および２Ｂ４をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図８）。未処理の二重特異性抗体（−ＤＴＴ）の移動度がより低いのは、２Ｂ４ ＩｇＧおよび分子量位置約１２５，０００にて移動した二価のＦ２−ＣＨ／ＣＬと比較して、それらの分子量が大きい（約１７５，０００）ことと関連していた。４つの抗体それぞれの２つの成分を、ＤＴＴで処理した後に別々に分離した。標準ＩｇＧ（２Ｂ４）と比較すると、二重特異性抗体１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４（ＶＨ−ＣＬ融合物）の下部のバンドは標準ＩｇＧ軽鎖に相当する。上部バンドは、ｓｃＦｖ−重鎖融合タンパク質（ＭＷ約６２，５００）と相関する。一方、１Ｆ２−２Ｂ４の上部バンドは標準ＩｇＧ（２Ｂ４）の重鎖に相当し、下部バンドはＶＨ−軽鎖融合物とみられる位置に観察される（ＭＷ約３７，５００）。
【０１０５】
ドメインに基づく二重特異性抗体の二重特異性。架橋アッセイにおいて、最初に二重特異性１Ｆ２−２Ｂ４抗体および単一特異性１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび２Ｂ４抗体を、まず溶液中のｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２とともにインキュベートし、次に第２の受容体（それぞれｍＶＥＧＦＲ２またはｍＰＤＧＦＲα）でコートしたマイクロタイタープレートに移し、その後に第１の受容体に対するビオチン標識ポリクローナル抗体とともにインキュベートする。ＢｓＡｂのみが（親の単一特異性２Ｂ４ ＩｇＧおよび１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬではない）、２つの標的受容体と架橋することが可能であった。
【０１０６】
ドメインに基づく二重特異性抗体の抗原結合効率を、固定化ｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１で判定した。ＥＬＩＳＡでは、二重特異性抗体、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１に結合したが、親抗体１Ｆ２および２Ｂ４ほど効率的でなかった（図１２）。しかし、両方の場合で、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４と比較して、１Ｆ２−２Ｂ４抗体の結合のほうがわずかに効率的であった。予想通り、Ｆｌｋ−１特異的抗体２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲαと結合せず（図１２Ａ）、ｍＰＤＧＦＲα特異的抗体１Ｆ２もＦｌｋ−１に結合しなかった（図１２Ｂ）。二重特異性抗体のｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１への結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用いる表面プラズモン共鳴により測定した（表３）。ＥＬＩＳＡの所見と一致して、１Ｆ２−２Ｂ４抗体は、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４抗体と比較して、ｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１両方により強い親和性を有する。
【表３】
【０１０７】
図１３は、両方の二重特異性抗体が、ｍＰＤＧＦＲαを固定化ＰＤＧＦ−ＡＡとの結合から阻害し（図１３Ａ）、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４に対して推定ＩＣ５０がそれぞれ９．９ｎＭおよび２５．３ｎＭであることを示す。抗体はまた、Ｆｌｋ−１を固定化ＶＥＧＦ１６５との結合からも阻止し（図１３Ｂ）、ＩＣ５０値はそれぞれ９．５ｎＭおよび１９．５ｎＭである。予想通り、２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡの相互作用に対して影響を及ぼさず、一方１Ｆ２はＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ１６５の相互作用に対して影響を及ぼさなかった。
【０１０８】
ｍＰＤＧＦα結合およびｍＶＥＧＦＲ２結合において、それぞれ単一特異性二価分子である１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび２Ｂ４ ＩｇＧと比較して二重特異性抗体の結合親和性は低いにもかかわらず（表３）、ｅＥｎｄ．１細胞（ｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２両方を発現する細胞）上の細胞表面発現受容体との結合を調べた場合、ＢｓＡｂは親の単一特異性二価抗体のいずれかよりも高い効率を実証した。細胞上の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬ（ｍＰＤＧＦＲα結合）、２Ｂ４ ＩｇＧ（ｍＶＥＧＦＲ２結合）および１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧ（ｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２結合）それぞれに対して１５．７、３１および３６．９であった。
【０１０９】
ｍＶＥＧＦＲ２およびｍＰＤＧＦＲのリガンド誘発活性化の阻害。ｍＶＥＧＦＲ２およびｍＰＤＧＦＲαの発現は、ｅＥｎｄ．１細胞において、ＦＡＣＳ分析を介して示された。細胞を、２Ｂ４ ＩｇＧ、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬまたは１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）とともに４℃にて１時間インキュベートした後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．）とともにさらに１時間インキュベートし、Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で分析した。
【０１１０】
受容体リン酸化を調べるために、ｅＥｎｄ．１細胞を６ｃｍの皿に蒔き、集密度７０〜８０％まで増殖させ、その後ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、無血清培地中で一晩培養した。最初にこの細胞を様々な抗体とともに３７℃にて３０分間インキュベートし、その後ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ−ＡＡを用いて３７℃にて１５分間刺激した。細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で１時間溶解させ、その後溶解物を４℃にて１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。抗ｍＰＤＧＦＲα（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗ｍＶＥＧＦＲ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、細胞溶解物上清から受容体を免疫沈降させ、その後２０μｌのＰｒｏＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した。沈殿した受容体タンパク質を４〜１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。ホスホ−ｍＶＥＧＦＲ２およびホスホ−ｍＰＤＧＦＲαを、抗ホスホチロシン抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるブロット上に検出した。ゲルに負荷した全受容体タンパク質を、ｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２に対する抗体（両方ともＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いてアッセイした。
【０１１１】
図１４に示されるように、ＢｓＡｂはｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２受容体のＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ刺激リン酸化の両方を阻害し、一方、単一特異性親抗体は、その同種リガンドにより刺激された単一受容体の活性化を阻止したのみであった。対照として、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｃ２２５は、いずれの受容体のリガンド刺激活性化に対しても何ら影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の単一ドメイン抗体に基づく二重特異性抗原結合タンパク質の例を表す模式図である。単一ドメイン（図中、ＶＨ２で示される）は、他の抗体ドメインのＮ末端またはＣ末端との融合により導入することができる。
【図２】ｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂの発現および精製を示す図である。Ｆａｂを大腸菌宿主ＨＢ２１５１細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。Ａ）同様の分子量の重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖を有する「標準的な」ｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂ。Ｂ）ＤＴＴの存在または不在下で、ＶＬドメインを欠く１Ｆ２および１Ｆ９ Ｆａｂ断片ならびに標準的なＦａｂ対照。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図３】精製されたＦａｂの結合および阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製されたＦａｂのネズミＰＤＧＦＲαに対する定量的結合ＥＬＩＳＡ。様々な量のＦａｂを、まずｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質でプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いてウサギ抗抗ヒトκ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂによる、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量のＦａｂを、溶液中、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートした。混合物を、ＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレート中で、それに続いて抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図４】本発明の一価および二価のＦａｂの構造を表す図である。
【図５】二価のｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂの発現および精製を表す図である。Ｆａｂを大腸菌宿主ＨＢ２１５１細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。二価の１Ｆ２−２Ｈ Ｆａｂを、非還元条件下で標準的なＦａｂ（５Ｃ５）と比較する。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図６】精製された抗体の結合および阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された抗ｍＰＤＧＦＲα一価および二価の１Ｆ２ Ｆａｂ抗体の定量的結合アッセイ。様々な量の抗体をｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂ抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量の抗体を、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートし、混合物をＰＤＧＦ−ＡＡでプレコートしたプレートに移した。洗浄後、次に、プレートを抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。２Ｂ４は、マウスＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）に対して作られた抗体である。
【図７】１Ｆ２に基づく全長ＩｇＧの模式図を表す。１Ｆ２ ＶＨはＣＬおよび／またはＣＨに対する融合タンパク質として表され、四価（パネルＡ；ＭＷ約１５０，０００）または二価（パネルＢおよびＣ：ＭＷ約１２５，０００）の抗体が得られる。
【図８】抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の発現および精製を表す図である。右側のパネルでは、電気泳動の前に抗体をＤＴＴ処理した。
【図９】精製された抗体の結合およびリガンド阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の定量的結合。様々な量の抗体を、ｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂ抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量の抗体を、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートし、ＰＤＧＦ−ＡＡでプレコートしたプレートに移した。プレートを洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。データは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。２Ｂ４は、マウスＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）に対して作られた抗体である。
【図１０】ｍＰＤＧＦＲαおよびｆｌｋ−１と結合する、選定された１Ｆ２に基づく四価の二重特異性抗体の模式図を表す。Ａ）１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４と名付けられたＩｇＧ様抗体。１Ｆ２ ＶＨはＣＬに対する融合物として表され、２Ｂ４はＣＨに対するｓｃＦｖ融合物として表される。Ｂ）１Ｆ２−２Ｂ４と名付けられたＩｇＧ様抗体。１Ｆ２ ＶＨは２Ｂ４ ＶＬのアミノ末端の融合物として表される。
【図１１】１Ｆ２に基づく二重特異性抗体の発現および精製を表す図である。抗体を哺乳類細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。電気泳動の前にＤＴＴを用いて／用いずに（＋／−）抗体を処理した。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図１２】精製された抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｋ−１二重特異性抗体の定量的結合アッセイを表すグラフである。Ａ）様々な量の抗体を、まずｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。Ｂ）様々な量の抗体を、まずＦｌｋ−ｌ／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図１３】精製された二重特異性抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｋ−１二重特異性抗体の阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された二重特異性抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。Ｂ）精製された二重特異性抗体による、Ｆｌｋ−１と固定化されたＶＥＧＦ１６５の結合の阻害。両方のアッセイにおいて、様々な量の抗体を溶液中、一定量の受容体（ｍＰＤＧＦＲα／ＦｃまたはＦｌｋ−１）とともにインキュベートし、リガンド（ＰＤＧＦ−ＡＡまたはＶＥＧＦ１６５）でプレコートしたプレートに移した。次に、プレートを抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図１４】二重特異性１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧによる、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに刺激される受容体リン酸化の阻害を表す図である。ｅＥｎｄ．１細胞をまず様々な抗体で３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いてＶＥＧＦまたはＰＤＧＦで３７℃にて１５分間刺激した。細胞溶解後、抗ｍＰＤＧＦＲαまたは抗ｍＶＥＧＦＲ２抗体で、それに続いてＰｒｏＡ／Ｇ−セファロースビーズとともにインキュベートすることにより、細胞溶解物上清から受容体を免疫沈降させた。沈殿した受容体タンパク質を４〜１２％Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離させ、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。抗ホスホチロシン抗体−ＨＲＰコンジュゲートを用いてホスホ−ｍＶＥＧＦＲ２およびホスホ−ｍＰＤＧＦＲαをブロット上に検出した。ゲルに負荷した全受容体タンパク質を、ｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２に対する抗体を用いてアッセイした。
【図１５】いくつかの同定されたＦａｂタンパク質のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を表す。Ｆａｂ １Ｅ１０、１Ａ１１、３Ｂ２、１Ｃ１０、３Ｇ７、１Ｆ９、および１Ｆ２を、ネズミＰＤＧＦＲαと結合するＦａｂ−ファージについてのスクリーニングで同定した。Ｆａｂ ２Ｂ４はネズミＶＥＧＦＲ２と結合するＦａｂ−ファージについてのスクリーニングで同定された。＾：フレームシフト突然変異；＊フレームシフト突然変異によりもたらされる停止コドン；＠．．．＠：インフレーム欠失。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年２月１５日出願の米国特許出願第６０／７７３，９９４号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／７７３，９９４号は、参照することによりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、単一ドメイン結合部位を含む新規な抗体に関する。抗体は、二価または多価であってもよく、二重特異性または多重特異性であってもよい。また、細胞表面受容体タンパク質と結合する二重特異性および多重特異性抗体も開示される。被験体に単独で、または抗血管新生薬または抗腫瘍薬と組み合わせて投与されると、該抗体は、腫瘍増殖を阻害するため、ならびに過剰増殖性疾患を阻害するために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、同一かまたは異なる抗原上の２つの異なるエピトープと結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）に基づく分子である。実験室での研究および初期の臨床研究の両方で、癌治療において、例えば腫瘍細胞を細胞傷害性薬剤、例えばエフェクター細胞、放射性核種、薬物および毒素などでターゲッティングすることによるか（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１９０−２．；ｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３９１−７；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：１−６．）、または個々の抗体治療薬の生物学的活性を強化するために２つの異なる腫瘍標的（またはエピトープ）を同時にターゲッティングすることにより（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３０：１５９−７１；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：７００２−８．；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：２１３−２６）ＢｓＡｂが有意な用途を有しうることが実証された。ＢｓＡｂに基づく治療薬の開発における主な障害は、ハイブリッドハイブリドーマおよび化学コンジュゲーション（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ４：４６３−７０）を含む伝統的な方法によって臨床研究のために十分な量および質の材料を製造する際の困難さであった。２つの異なる組のＩｇＧ軽鎖および重鎖の同時発現により、多様な軽鎖および重鎖の対をもたらすことができ、そのうちの唯一つが所望の機能性の二重特異性ヘテロ二量体である（Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。一方、２つのＩｇＧまたはそれらの断片の化学架橋は、非効率的である場合が多く、抗体活性の損失をもたらし得る（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．８６：１２７−３４）。両方の方法において、非機能性種、例えばハイブリッドハイブリドーマにより産生されるコグネイト（同族）でないＩｇ軽鎖および重鎖のホモ二量体および不対合ヘテロ二量体など、ならびに化学コンジュゲーションによりもたらされる多量体凝集体からのＢｓＡｂの精製は困難である場合が多く、収率は通常低い（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９：６３５−４４）。
【０００４】
効率を改善するため、抗体断片（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ ３：８３−１０５；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：４７−６６）および全長ＩｇＧ型式（Ｃａｒｔｅｒ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：７−１５）として、両方のＢｓＡｂ製造のための多様な組換え法が開発されてきた。例えば、同種の全長ＩｇＧ様ＢｓＡｂの製造は、効率的なＩｇ ＣＨ３ドメインヘテロ二量体形成のためのいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」操作により（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７−２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７−８１）、さらに異なる特異性をもつ２本の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を全長ＩｇＧ分子のＮ末端かまたはＣ末端のいずれかの上に融合することにより（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：３６１−７；Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３）達成されている。また、ＢｓＡｂは、柔軟なリンカーの使用の有無にかかわらず、二量体形成手段、例えば、ロイシンジッパー（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３；ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７６３０−４）、およびＩｇ ＣＬ／ＣＨ１ドメイン（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２２：２５９−６４）；ダイアボディーを用いて（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：６４４４−８；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）１４：１９２−６）；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−７）；ならびにミニ抗体フォーマット（Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１ ：１５７９−８４；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７）などを介して２本の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片を遺伝的に融合することにより構築された（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６；Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：７０２１−５；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２）。これらの事例の過半数において、これらの組換えアプローチは、それらの標的抗原の各々に対して一価である、二価の二重特異性抗体分子の産生をもたらす。さらに、機能性Ｆｃドメインを含むＩｇＧ様二重特異性抗体の例は限定されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位を含む新規な二重特異性抗体を提供する。また、本発明の抗体には、ｓＶＤ抗原結合部位に加えて抗体Ｆｖｓを含む抗原結合部位が含まれ得る。
【０００６】
本発明の抗体は、任意の抗原に対して特異的であってよい。一実施形態では、本発明の抗体は、受容体チロシンキナーゼ（ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲを含むが、これらに限定されない）であってよい細胞表面抗原と結合する。もう１つの実施形態では、本発明の抗体は細胞表面受容体のリガンドと結合する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、受容体中和活性を有する。本発明はさらに、該抗体の医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明は、１以上の受容体チロシンキナーゼの活性化を阻害する方法を提供する。哺乳類における腫瘍増殖は、哺乳類に有効量の本抗体を投与することにより治療または阻害され得る。本抗体は、その他の細胞表面抗原（例えば、ＲＴＫを含む）またはサイトカイン（例えば、ＲＴＫリガンドを含む）と結合する抗体と共に同時投与されることができる。特定の実施形態では、本方法は、また、哺乳類に、例えば、化学療法薬および／または放射線療法を含む、抗腫瘍薬または治療を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、哺乳類において非がん性過剰増殖性疾患、例えば、乾癬を治療する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位を含む新規な抗体を提供する。本発明はまた、単一ドメインの抗原結合部位と２ドメインのＦｖ様抗原結合部位の両方を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【０００９】
単一ドメイン抗原結合部位は、免疫グロブリンの可変ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）に類似するが、第２の抗原結合ドメイン（例えば、対になるＶＬまたはＶＨ）の非存在下で抗原と特異的結合が可能である。そのような単一ドメインは、実際には対となる結合ドメインと安定な会合ができないであろう。しかし、単一ドメイン抗体は、ＶＬドメインとＶＨドメインの両方を含む抗体のそれと同様の親和性および結合力をもつ抗原と結合することができる。さらに、天然抗体のように、単一ドメイン抗体は受容体−リガンド相互作用を阻止することができる。従って、単一ドメイン結合部位を含む本発明の抗体は、例えば、ハイブリドーマ、ヒト抗体を発現するトランスジェニックマウス、およびＦａｂまたはｓｃＦｖ結合ドメインのファージディスプレイライブラリーから得られる抗体と同じ目的に使用される。
【００１０】
本発明の抗体は、いくつかの点で免疫グロブリン様である。１）ＩｇＧ様である本発明の抗体はヘテロ四量体であり、２つの異なるポリペプチド鎖の各々のうちの２つからなる。２）異なるポリペプチド鎖は会合し、例えば、標準的な、天然に存在する免疫グロブリンの重鎖および軽鎖定常領域と同じ方法でジスルフィド結合により共有結合しうる。３）ポリペプチド鎖の１つは、天然に存在する免疫グロブリン重鎖と同じ方法で安定な自己会合が可能である。例えば、ポリペプチド鎖のうちの１つには、天然に存在する免疫グロブリンのＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４に対応する１以上のドメインが含まれ得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、天然に存在するＩｇＧの定常ドメイン構造を含む。
【００１１】
免疫グロブリン様構造の非常に大きな１つの利点は、抗体鎖が発現時に自然に対となることである。先行技術の多くの四量体抗体とは異なり、同種の抗体の調製物を得るためにさらなる操作は必要でない。
【００１２】
本発明の抗原結合タンパク質は単一可変ドメイン（ｓＶＤ）である抗原結合部位を含む。本発明の特定の実施形態では、ｓＶＤ結合部位はＩｇＧ様抗体の１つの可変ドメインと置き換わり、ｓｃＦｖはその他の可変ドメインと置き換わる。そのような実施形態の例は、図１Ａに示される。本発明の他の実施形態では、ｓＶＤ結合部位は、ＩｇＧ重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端でＩｇＧ抗体へグラフトされる。そのような実施形態の例は、図１Ｂに示される。ｓＶＤはまた、その他の位置でも免疫グロブリン様抗体に組み込むことができる。例えば、ｓＶＤはＣＨおよび／またはＣＬ定常ドメインのＣ末端で結合され得る。さらに、図１のようにｓＶＤ結合部位の置換と、ｓＶＤ結合部位のＣＨおよび／またはＣＬ定常ドメインのＣ末端への付加を組み合わせることにより、特定の抗原に対して多重特異性および／または多価のＩｇＧ様抗体を生成することができる。
【００１３】
当技術分野で公知のように、Ｆｖは２つのドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）からなる。標準的な抗体では、ＦｖのＶＨおよびＶＬドメインは、会合して抗原結合部位を形成するが、直接結合しているのではなく、各々が結合された抗体定常領域に連結されている。ＦｖのＶＨおよびＶＬドメインはまた、合成リンカーに連結されて単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することもできる。
【００１４】
抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識をさす。例えば、天然の抗体は単一特異性である。二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。抗原結合タンパク質が１よりも多くの特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原と、または１よりも多くの抗原と会合しうる。
【００１５】
天然の抗体分子は、同一の２本の重鎖と同一の２本の軽鎖で構成される。各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合により重鎖と共有結合されている。２本の重鎖はさらにヒンジ領域で複数のジスルフィド結合により相互に結合されている。個々の鎖は折り畳まれて同様の大きさ（約１１０〜１２５アミノ酸）および構造であるが、異なる機能を有するドメインとなる。軽鎖は１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、抗体のクラスまたはアイソタイプによって、３または４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む。マウスおよびヒトにおいて、アイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらにサブクラスまたはサブタイプに細かく分かれる。ＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体の部分は「Ｆｖ」と名付けられ、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１本のポリペプチド鎖に１つのＶＬドメインおよび１つのＶＨドメインを含む操作されたタンパク質であり、その一方のドメインのＮ末端ともう一方のドメインのＣ末端は、柔軟なリンカーによって連結されている。「Ｆａｂ」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる抗体の部分をさす。
【００１６】
可変ドメインは、抗体間で、特に抗原結合部位の位置で相当なアミノ酸配列の多様性を示す。「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域がＶＬおよびＶＨの各々に見出される。
【００１７】
「Ｆｃ」は、対になった重鎖定常ドメインを含む抗体の部分の呼称である。ＩｇＧ１抗体では、例えば、ＦｃはＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃは、さらにＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞性細胞障害の活性化に関係している。複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭなどの天然の抗体については、複合体形成にＦｃ定常ドメインが必要とされる。
【００１８】
最後に、「ヒンジ」領域は抗体のＦａｂ部分とＦｃ部分を分離して、Ｆａｂの、お互いに対する、さらにＦｃに対する可動性をもたらすと同時に２本の重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。
【００１９】
本発明の抗体は望ましい特長の組合せを有する。第１に、それらは本質的に均一である。デザインにより、抗体重鎖と軽鎖の不対合は大幅に減少されるかまたは排除される。例えば、一部の二重特異性抗体は、２つの特異性を提供するために２本の異なる重鎖を用いる。かかる重鎖がＩｇＧ型分子に配置される場合には、４通りの組合せが可能である。これらのうちの２通りは、その生成物が単一特異性であるような不対合重鎖からなる。本発明の抗体において、不対合は実質的に排除される。
【００２０】
本発明の抗体の第２の特長は、それらが各結合特異性に対して二価であることである。多くの二重特異性抗体は、それに含まれる抗体結合部位の各々に対して一価である。二価性は、結合の協同性、および単一の抗原特異的結合部位を含む分子について結合力の有意な増大を可能にするため、二価であることは抗体機能にとって重要である。
【００２１】
本発明の抗体の第３の利点は、天然の抗体のＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１分子のＣＨ２および／またはＣＨ３）を構成し、その他の抗体機能を提供する１以上の重鎖定常ドメインが存在することである。さらに、定常ドメインにより提供される機能が損なわれないように複数の結合ドメインが定常ドメインから分離されている。定常ドメイン機能には、特定のアクセサリー分子との結合（例えば、細胞表面および可溶性Ｆｃ受容体との結合、ＩｇＡおよびＩｇＭに関してＪ鎖との会合、ＩｇＡに関してＳタンパク質）、補体経路の活性化（補体依存性細胞障害（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）、ＣＤＣ）、いくつかの異なる白血球集団による、標的細胞と結合した抗体の認識（抗体依存性細胞媒介性細胞障害、ＡＤＣＣ）およびオプソニン化（食作用の促進）が含まれる。また、Ｆｃ重鎖定常ドメイン（１または複数）は増加した血清半減期を付与し得る。
【００２２】
本発明のタンパク質の第４の利点は、完全な生成物を得るためのインビトロプロセシング要件がないことである。人工的な方法で再配置されているが、各々のドメインは生物系での発現を可能にする天然の特性を有する。例えば、二重特異性抗体は原核生物および真核生物発現系で発現させることができる。生成されるタンパク質は実質的に二重特異性である。
【００２３】
本発明の抗体における使用のためのｓＶＤ抗原結合部位およびＦｖ領域含有結合部位は、多様な方法により得ることができる。選定された結合ドメインのＶＨおよび／またはＶＬ部分のアミノ酸配列は天然に存在する抗体から得ることができ、あるいは所望の結合特性について選択または修飾され、スクリーニングされ、または選定される。例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、所望の結合特性を有するモノクローナル抗体から直接得ることができる。あるいは、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、選択哺乳類由来のＶ遺伝子配列のライブラリー由来のものであってよい。かかるライブラリーの要素は、ＶＨおよび／またはＶＬドメインのランダムな組合せを示し、任意の所望の抗原を用いてスクリーニングされて所望の結合特性を有する要素が特定される。特に好ましいものはヒトＶ遺伝子ライブラリーである。かかるスクリーニングのための方法は当技術分野で公知である。あるいは、選定された非ヒト供給源由来のＶＨおよび／またはＶＬドメインを、ヒト定常ドメインを含むキメラ抗体に組み込んでもよい。例えば、ヒトへの投与には、ＶＨおよびＶＬドメインが非ヒト供給源から選定された１以上の機能性ヒト定常ドメインを含む抗体を使用することが望ましいであろう。定常ドメイン関連機能を最大化するか、または抗体の免疫原性を低下させるため、ヒト定常ドメインが好ましい。
【００２４】
あるいは、「ヒト化」されたＶドメインを作製することができる。ヒト化可変ドメインは、非ヒト起源の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列をヒトフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトして構築される。例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３−２７；およびＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号参照。ヒト化構築物は、有害な免疫原性特性の排除に、例えば、非ヒト供給源由来の抗原結合ドメインをヒトにおける治療のために使用することが望まれる場合に特に役立つ。可変ドメインは高度の構造的相同性を有し、ＣＤＲおよびＦＲに相当する可変ドメイン内のアミノ酸残基の特定を容易にする。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ ｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ参照。よって、抗原結合に関与するアミノ酸は容易に特定される。さらに、グラフトされたＣＤＲを含むヒト化結合ドメインの抗原に対する親和性を保存または増強するための方法が開発された。一つの方法は、受容可変ドメイン中にＣＤＲ領域の立体構造に影響を及ぼす外来フレームワーク残基を含めることである。もう一つの方法は、外来ＣＤＲを外来可変領域に最も近い相同性をもつヒト可変ドメインの上にグラフトすることである。Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９−３３。ＣＤＲは、まず所望のＣＤＲ配列を含む重複プライマーを用いて個々のＦＲ配列を増幅させること、そして得られる遺伝子セグメントをその後の増幅反応において連結させることにより、異なるＦＲ上に最も容易にグラフトされる。異なる可変ドメイン上にＣＤＲをグラフトすることは、さらに、アミノ酸配列中のＣＤＲに隣接するか、またはＣＤＲの立体構造に影響を及ぼす折り畳まれた可変ドメイン構造中のＣＤＲにパッキングされた（ｐａｃｋｅｄ）アミノ酸残基の置換を伴ってよい。そのため、本発明のヒト化可変ドメインには、１以上の非ヒトＣＤＲを含むヒトドメインならびに結合特性を保存または増強するためにさらなる置換または置き換えがなされているかかるドメインが含まれる。
【００２５】
本発明の抗体はまた、抗体を免疫系に対して自己として現れさせるために表面露出残基を置き換えることにより免疫原性を低くさせた可変ドメインを用いることができる（Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，４８９−９８）。抗体はこのプロセスにより親和性を失うことなく修飾された（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１，９６９−９７３）。抗原結合部位の近傍のアミノ酸残基の内部パッキングは不変のままであるので、親和性は保存される。免疫原性の低下を目的とする、本発明による表面露出残基の置換は、結合特性に影響を及ぼすＣＤＲ残基または隣接残基の置換を意味しない。
【００２６】
本質的にヒトである可変ドメインを用いることが多くの場合好ましい。ヒト結合ドメインは、ヒト重鎖および軽鎖可変ドメインの組合せが線維状ファージの表面に提示されるファージディスプレイライブラリーから得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２−５４；Ａｕｊａｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ８，１５５−６８参照）。可変ドメインの組合せは、一般にＦａｂまたはｓｃＦｖの形で線維状ファージ上に提示される。このライブラリーを、所望の抗原結合特性を有する可変ドメインの組合せを有するファージについてスクリーニングする。好ましい単一ドメインと可変ドメインの組合せは、選定された抗原に対して高親和性を示し、その他の関連抗原に対して交差反応性をほとんど示さない。非常に大きな抗体断片のレパートリーをスクリーニングすることにより（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯＪ．１３，３２４５−６０参照）、良好な多様性の高親和性結合ドメインが単離され、多くは所望の抗原に対してナノモル以下の親和性を有すると予想される。
【００２７】
あるいは、ヒト結合ドメインは、再配置されていないヒトＩｇ遺伝子セグメントがその中に導入されており、内因性マウスＩｇ遺伝子を不活化されているトランスジェニック動物から得ることができる（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，４５５−５８に概説）。好ましいトランスジェニック動物には、１Ｍｂを超える大きさの非常に大きな連続したＩｇ遺伝子断片が含まれる（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１５，１４６−５６）が、中程度の親和性をもつヒトＭａｂは、より小さな遺伝子座を含むトランスジェニック動物から作製することができる（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２，２６７２−８１；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７，１３−２１参照）。
【００２８】
ｓＶＤ結合部位は、抗原特異的Ｆｖ領域（ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含む）から得ることができる。多くの場合、Ｆｖ領域の結合親和性および特異性は、主に可変ドメインのうちの１つによって寄与されることが示され得る。あるいは、ｓｃＦｖを直接得てもよい。ｓＶＤの直接供給源には、ＶＨドメインのみを含有する抗体を自然に発現する哺乳類（例えば、ラクダ科動物）、および単一可変ドメインだけを発現するよう構築されたファージディスプレイライブラリーが含まれる。例えば、ヒトドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーは、Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から市販されている。本明細書に例示されるように、ＰＤＧＦＲαに特異的なｓＶＤ結合部位は、ＶＬドメインが自然に欠落している変異体を含むＦａｂライブラリーから得た。
【００２９】
生理学的免疫応答において、発現抗体遺伝子の突然変異および選定は、それらの標的抗原に高い親和性をもつ抗体の産生を導く。本発明の抗体に組み込まれているＶＨドメインおよびＶＬドメインを、同様に、インビトロ突然変異およびスクリーニング手順に付して高親和性の変異体を得ることができる。よって、本発明の結合ドメインには、直接突然変異によるかまたは親和性成熟方法により結合特性が改善された結合ドメインが含まれる。親和性および特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位についてスクリーニングすることにより変更または改良することができる（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５４，３９２−４０３参照）。単一ドメイン抗体結合の一次決定基であるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔに定義されるＣＤＲの中にあってよいが、同様にその他の残基、例えば、例として、そうでなければＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬ界面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）に埋もれるであろう残基などを含んでよいことが理解される。ＣＤＲまたは結合を決定するその他の残基は多様な方法で変異される。一つの方法は、その他の点では同一の抗原結合部位の集団において、全２０個のアミノ酸またはそのサブセットが特定の位置に見出されるように、個々の残基または残基の組合せをランダム化することである。あるいは、突然変異をエラープローンＰＣＲ法によりＣＤＲ残基の範囲にわたって誘導させる（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２６，８８９−９６参照）。結合ドメインをコードする遺伝子を含むファージディスプレイベクター（例えば、重鎖および／または軽鎖可変領域遺伝子）は、大腸菌のミューテーター株で増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２５０，３５９−６８参照）。これらの突然変異誘発法は当業者に公知の多くの方法の実例である。
【００３０】
本発明の抗体の各可変ドメインは、完全な免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメインであってよく、あるいは、天然に存在するドメインの機能的同等物または変異体または誘導体、あるいは、例えば、ＷＯ ９３／１１２３６号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ／Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．）に記載されるものなどの技法を用いてインビトロで構築される合成ドメインであってよい。例として、１以上のアミノ酸を欠損している抗体可変ドメインに相当するドメインを組み込むことが可能である。特性を表す重要な特長は、各可変ドメインが相補可変ドメインと会合して抗原結合部位を形成する能力である。
【００３１】
本発明の抗原結合タンパク質は、任意のエピトープ、抗原性部位またはタンパク質のための結合部位を有する。特に注目されるものは疾患の治療に有用な抗体である。好ましい抗体は、受容体タンパク質、例えば血管新生および／または腫瘍形成に関与する受容体などを中和する。受容体を中和するとは、シグナルを形質導入する受容体の内因性キナーゼ活性を不活性化することを意味する。受容体中和について信頼できるアッセイは、受容体リン酸化の阻害である。本発明は、何らかの特定の受容体中和機構に制限されない。いくつかの可能性のある機構としては、リガンドと受容体の細胞外結合ドメインの結合の阻止、および受容体の二量体化またはオリゴマー化の阻止が挙げられる。しかし、その他の機構を除外することはできない。
【００３２】
内皮細胞または非内皮細胞、例えば腫瘍細胞のサンプルにおける受容体の活性化の中和は、インビトロで行われてもインビボで行われてもよい。受容体発現細胞のサンプルにおいて受容体の活性化を中和することは、細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。インビトロでは、細胞サンプルにＶＥＧＦを添加する前、添加と同時に、または添加した後に細胞を抗体と接触させる。インビボでは、哺乳類への投与により本発明の抗体を受容体と接触させる。哺乳類への投与方法としては、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が挙げられる。
【００３３】
かかる受容体の例としては、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ−Ｒ）、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦＲ１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ−４）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）および同種類のものが挙げられるが、これらに限定されない。受容体チロシンキナーゼのさらなる非限定的な例としては、Ｆｌｔ−４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＴｅｋおよびＴｉｅ２が挙げられる。
【００３４】
インビボ血管新生および／または腫瘍の増殖の可能性のあるレギュレーターとして意味づけられるその他の因子としては、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）が挙げられる。対応する受容体は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−Ｒ）、および神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）である。細胞遊走、形態変化、および侵襲性にかかわる別の受容体は、マクロファージ刺激タンパク質受容体（「ＭＳＰ−Ｒ」または「ＲＯＮ」）である。関心対象の受容体としては、ヒトタンパク質およびその他の哺乳類に由来するホモログが挙げられる。
【００３５】
本発明の抗体は、任意の供給源由来のＩｇ抗原結合ドメインを組み込むことができる。例えば、抗体は、上に記載される受容体として知られており、本発明の抗体で用いるＶＨおよびＶＬドメインの供給源である。ＫＤＲに特異的なｓｃＦｖ可変領域結合ドメインの例としては、例えば、ＩＭＣ−１Ｃ１１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１および２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３および４）（ＷＯ００／４４７７７号参照）、ＩＭＣ−２Ｃ６（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号５および６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号７および８）（ＷＯ０３／０７５８４０号参照）、ならびにＩＭＣ−１１２１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号５および６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号９および１０）（ＷＯ０３／０７５８４０号参照）のＶＨドメインおよびＶＬドメインが挙げられる。Ｆｌｔ−１に特異的な結合ドメインの例としては、６．１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１１および１２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１３および１４）ならびにＩＭＣ−１８Ｆ１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２７および２８。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２９および３０）が挙げられる。
【００３６】
ＥＧＦＲに特異的な結合ドメインとしては、例えば、ＷＯ９６／４０２１０号に開示されるＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ；ＩＭＣ−Ｃ２２５）（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１５および１６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１７および１８）ならびにＩＭＣ１１Ｆ８（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号１９および２０。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２１および２２）が挙げられる。ＩＧＦＲに特異的な結合ドメインの例は、ＩＭＣ−Ａ１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２３および２４。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号２５および２６）である。ＦＧＦ受容体と結合する抗体（ＷＯ２００５／０３７２３５号参照）としては、例えば、ＦＲ１−Ｈ７（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３１および３２。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３３および３４）、ＦＲ１−Ａ１（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３５および３６。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３７および３８）、ならびにＦＲ１−４Ｈ（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号３９および４０。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４１および４２）が挙げられる。ＲＯＮまたはＭＳＰ−Ｒと結合する抗体（ＷＯ２００５／１２０５５７号参照）としては、ＩＭＣ−４１Ａ１０（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４３および４４。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４５および４６）ならびにＩＭＣ−４１Ｂ１２（ＶＨのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４７および４８。ＶＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列：配列番号４９および５０）が挙げられる。ＰＤＧＦＲαと結合する抗体としては、例えば、３Ｇ３および７Ｇ１１が挙げられる（Ｌｏｉｚｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．４：３６９）。
【００３７】
さらに、上に記載される結合ドメインの部分、例えばＣＤＲ領域などは、本明細書に記載される結合タンパク質を作製するために使用される結合ドメインに組み込むことができる。
【００３８】
特定の好ましい抗体は上に記載される受容体の２つと結合する。本発明の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は血管新生に関与する２つの異なる受容体チロシンキナーゼと結合し、その活性化を阻止する。そのような一実施形態では、抗体はＰＤＧＦＲおよびＶＥＧＦ受容体、例えば、例として、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲなどと結合する。そのような別の実施形態では、抗体はＫＤＲおよびＦＬＴ−１と結合する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の抗体はＨＥＲ２およびＥＧＦＲと結合する。さらにもう１つの好ましい実施形態では、本発明の抗体はＥＧＦＲおよびＩＧＦＲと結合する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はＥＧＦＲおよびＶＥＧＦＲと結合する。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦＲはＶＥＧＦＲ２である。そのような抗体は、ＥＧＦＲとＶＥＧＦＲの両方を経由するシグナル伝達を阻止することによる、血管上皮細胞の刺激の阻止に有用である。これはＥＧＦＲリガンド、特に腫瘍細胞に分泌されるＴＧＦαに応答して生じる場合に特に有用である。
【００４１】
本発明の抗体を用いて標的細胞上の抗原と免疫系エフェクター細胞上の抗原を架橋することができる。これは、例えば、細胞表面上に特定の関心対象の抗原を有する細胞に対する免疫応答を促進するために有用である。本発明によれば、免疫系エフェクター細胞には、細胞の免疫応答を活性化するＴ細胞などの抗原特異的細胞および細胞の免疫応答を媒介するマクロファージ、好中球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの非特異的細胞が含まれる。
【００４２】
本発明の抗体は、免疫系エフェクター細胞の任意の細胞表面抗原の結合部位を有し得る。そのような細胞表面抗原としては、例えば、サイトカインおよびリンホカイン受容体、Ｆｃ受容体、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２およびＣＤ６４が挙げられる。ｓＶＤによりもたらされる抗原結合部位に加えて、二重特異性抗体にはＦｖによりもたらされる結合部位が含まれ得る。かかるＦｖは、コンビナトリアルライブラリーから、ならびに当技術分野で公知のその他の方法により、上述の抗原に対する抗体から得ることができる。サイトカイン受容体およびリンホカイン受容体に特異的な二重特異性抗体も、受容体の天然リガンドの全部または一部に相当するアミノ酸の配列を含む結合部位を含み得る。例えば、細胞表面抗原がＩＬ−２受容体である場合、本発明の二重特異性抗体は、ＩＬ−２に相当するアミノ酸の配列を含む抗原結合部位を有し得る。その他のサイトカインおよびリンホカインとしては、例えば、インターロイキン類、例えばインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）、ならびにコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗体は２本のポリペプチド鎖を発現させることにより作製され、それらは総合して、少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。２本のポリペプチド鎖は各々、少なくとも１つの二量体化の可能な重鎖定常ドメインを含む（例えば、ＣＨ２および／またはＣＨ３）。抗体は、各ポリペプチド鎖の先頭に細菌の分泌シグナル配列を含むＤＮＡ構築物を用いて、大腸菌において都合よく産生される。多様な細菌のシグナル配列は当技術分野で公知である。好ましいシグナル配列は、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ；軟腐病菌）のｐｅｌＢ遺伝子に由来する。本抗体をコードするＤＮＡ断片は、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよび高レベル発現のためのエンハンサーを用いて、哺乳類細胞、例えば、例として、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＣＯＳ−７、およびＰＥＲ．Ｃ６細胞など、ならびにリンパ起源の細胞系統、例えばリンパ腫細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞などにおいて、ベクターにクローニングすることができる（例えば、Ｂｅｎｄｉｇ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４０，２９９号；Ｍａｅｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２，１２４−３４参照）。
【００４４】
選択マーカーは、選択培地中で増殖される形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。典型的な選択マーカーは、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補う、あるいは（ｃ）複合培地から得られない決定的な栄養を供給する、タンパク質をコードする（例えばバチルスのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。特に有用な選択マーカーは、メトトレキサートに対する耐性を付与する。例えば、ＤＨＦＲ選別遺伝子で形質転換された細胞は、まず、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地中で全ての形質転換細胞を培養することにより特定される。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ７７，４２１６に記載されるように調製し増殖させた、ＤＨＦＲ活性欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系統である。次に、この形質転換細胞を増加したレベルのメトトレキサートに曝す。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピーと、同時に、発現ベクターを含むその他のＤＮＡの複数のコピー、例えば抗体または抗体断片をコードするＤＮＡなどの合成がもたらされる。
【００４５】
遺伝子構築物を酵母で発現させることを望む場合、酵母での使用に適した選別遺伝子の例は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ，２８２，３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｇｅｎｅ ７，１４１。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンで増殖する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１。Ｊｏｎｅｓ （１９７７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５，１２。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１損傷が存在すると、トリプトファンの非存在下で増殖により形質転換を検出するために効果的な環境がもたらされる。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ番号２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドで補完される。
【００４６】
形質転換宿主細胞は、当技術分野で公知の方法により、炭素（例えば、グルコースまたはラクトースなどの炭水化物）、窒素（例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、または、ペプトン、アンモニウム塩もしくは同種類のものなどのそれらの分解生成物）、ならびに無機塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩）の資化可能な供給源（ａｓｓｉｍｉｌａｂｌｅ ｓｏｕｒｃｅｓ）を含む液体培地中で培養される。培地はさらに、例えば、増殖促進物質（例えば、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガンおよび同種類のものなど）を含む。
【００４７】
増殖因子受容体と結合する抗体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の活性化を阻止できることが好ましい。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法を用いて、例えば、組換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然もしくは合成基質のリン酸化を測定することにより決定することができる。よって、リン酸化アッセイは本発明のＲＴＫアンタゴニストを決定する際に有用である。リン酸化は、例えば、ホスホチロシンに特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡアッセイで、またはウエスタンブロットで検出することができる。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかのアッセイはＰａｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．（１９９７）２８３：１４３３−４４ および Ｂａｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９９８）６２：１４３−５０に記載されている。
【００４８】
さらに、測定されるタンパク質の発現がＲＴＫに媒介される、タンパク質発現の検出のための方法を、ＲＴＫアンタゴニストを決定するために利用することができる。これらの方法には、タンパク質発現検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅の検出のための蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合的放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング手法、例えばノーザンブロットおよびサザンブロットなど、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが含まれる。例えば、Ｇｒａｎｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，（１９９６）７８：１２８４−９２；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９４）８５：５６７−７１；Ｓａｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，（１９９６）１４８：１０４７−５３；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｌｉａ，（１９９５）１５：２８９−９６；Ｒａｄｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９５）１：１９−３１；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９０）５０：３９３４−３９；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９７）１７：４４１９−２６；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，（１９９５）５５：３１４０−４８参照。
【００４９】
抗体のリガンド結合を阻止する能力は、例えば、インビトロ競合的アッセイにより測定することができる。そのようなアッセイでは、ＲＴＫのリガンド（例えば、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ）を固定化し、ＲＴＫと固定化されたリガンドの結合を競合的に阻害する抗体の有効性を決定するための結合アッセイが行われる。
【００５０】
インビボアッセイもＲＴＫアンタゴニストを決定するために使用することができる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在下および不在下、受容体リガンドで刺激した細胞株を用いる細胞分裂促進アッセイにより観察することができる。例えば、ＥＧＦで刺激したＡ４３１細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ１，ＭＤ）を用いてＥＧＦＲ阻害をアッセイすることができる。別の方法には、例えば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いてＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖の阻害を試験することが含まれる。米国特許第６，３６５，１５７号（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）参照。
【００５１】
好ましい本発明の抗体は二重特異性を有し、２つの異なる抗原と同時に結合することが可能である。異なる抗原は異なる細胞上または同じ細胞上に位置し得る。抗原の架橋はインビトロで、例えば、第１の抗原が結合している固体表面を提供し、第１の抗原と第２の抗原（結合タンパク質はこれに対しても特異的である）に特異的な二重特異性抗体を加え、結合した第２の抗原の存在を検出することにより示され得る。
【００５２】
好ましい本発明の抗体は、２つの受容体とそれらのそれぞれのリガンド間の相互作用を阻止することが可能である。例えば、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１に特異的な抗体は、ＶＥＧＦに誘導される細胞遊走ならびにＰｌＧＦに誘導される細胞遊走を阻害する。二重特異性抗体における２つの受容体の結合特異性の組合せは、個々の親抗体よりも細胞遊走の阻害に有効であり得る（例えば、Ｚｈｕ，Ｚ．，ＷＯ ２００４／００３２１１号参照）。
【００５３】
単一特異性の抗体と比較して、二重特異性抗体は、細胞機能のより強力な阻害剤であり得る。例えば、ＶＥＧＦに刺激される細胞機能、例えば、例として、内皮細胞の増殖など、ならびにＶＥＧＦおよびＰｌＧＦに誘導されるヒト白血病細胞の遊走などは、２つの標的抗原の一方または両方に対する親和性が低下している場合でさえも、二重特異性抗体により一層効率的に阻害され得る。ＫＤＲとＦｌｔ−１の両方に対して特異的な（一価の）抗体は、いずれかの標的抗原に対して作られた単一特異性ｓｃＦｖよりもＶＥＧＦまたはＰｌＧＦに誘導される細胞遊走を一層効果的に阻害することができる（ＷＯ２００４／００３２１１号）。
【００５４】
別の例では、ＥＧＦＲ（またはＨｅｒ２／ｎｅｕ）とＩＧＦＲの両方に対して二重特異性を有し、両方の受容体と結合が可能であり、それらの特異的リガンドとの相互作用を阻止することの可能な抗体は、ＥＦＧおよびＩＧＦに刺激される受容体活性化の両方および下流シグナル伝達の中和に用いられる。ＥＧＦＲかまたはＩＧＦＲのいずれかの刺激は、程度は異なるが、Ａｋｔおよびｐ４４／４２を含む、共通の下流シグナル伝達分子の活性化（例えば、リン酸化）をもたらすことが観察される。特定の腫瘍細胞では、ＥＧＦＲ機能の阻害は、その他の成長因子受容体シグナル伝達経路のアップレギュレーションにより、特にＩＧＦＲ刺激により補償され得る。１つの受容体と結合し、Ａｋｔかまたはｐ４４／４２のいずれかのリン酸化を完全に阻止しない抗体を用いる治療と対照的に、ＥＧＦＲとＩＧＦＲの両方と結合する抗体での腫瘍細胞のインキュベーションは、Ａｋｔおよびｐ４４／４２の両方のリン酸化を阻止する。従って、ＩＧＦＲシグナル伝達の阻害は、腫瘍増殖の阻害および特定の治療薬に対する腫瘍細胞の感受性の増加をもたらす。
【００５５】
そのような共通のシグナル伝達カスケード成分のリン酸化の阻害も、その他のＲＴＫ、例えば、ＲＯＮなどと結合する抗体で観察される。従って、抗原結合タンパク質は、複数のシグナル伝達経路の活性化に起因する細胞増殖または形質転換を特徴とする腫瘍性疾患を治療するために一般に有用である。
【００５６】
本発明の抗体は、多様な増殖性障害の治療に有用である。例えば、本発明は、１より多くの受容体チロシンキナーゼを発現し、それを経由して刺激を受ける腫瘍の治療を提供する。その１より多くの受容体を経由する刺激は、各受容体単独の封鎖に非感受性の制御されない増殖をもたらし得る。あるいは、第２の受容体の刺激を、第１の受容体を経由する刺激に応答して観察される活性化に加えることができる。あるいは、個々の受容体からの貢献は増殖性であってよい。上の例の各々において、両方の受容体を阻止する抗原結合タンパク質の存在下で、有意に改善された腫瘍増殖の阻害が観察される。
【００５７】
本発明の抗体は、受容体刺激がＥＧＦＲパラ分泌および／または自己分泌ループを経由している疾患を治療するために有用である。例えば、ＥＧＦＲ発現腫瘍は、それらの環境中に存在するＥＧＦに対して特徴的に感受性があり、さらに、腫瘍産生ＥＧＦまたはＴＧＦ−αにより刺激を受け得る。任意の特定の機構に縛られるものではないが、本方法により治療または予防されうる疾患および状態としては、例えば、腫瘍増殖が刺激されるものが挙げられる。そのため、本方法は、血管新生していないか、またはまだ実質的に血管新生していない固形腫瘍を治療するために効果的である。
【００５８】
本発明の特定の抗体は、過剰増殖性疾患に関連する血管新生を阻害するために有用である。例えば、腫瘍に関連する血管新生を阻止することにより、腫瘍増殖は阻害されうる。一実施形態では、抗体は腫瘍関連ＲＴＫと結合し、腫瘍による血管新生リガンド（すなわちＶＥＧＦ）の産生を阻害し、また脈管構造の細胞に関連するＶＥＧＦ受容体と結合してかかる細胞の増殖を阻害する。異なる実施形態では、抗体は複数のＶＥＧＦ受容体と結合し、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ（例えば、ＰｌＧＦ）リガンドのその他のリガンドが１種類より多くのＶＥＧＦ受容体との結合から阻止される。
【００５９】
治療されうる腫瘍としては、原発腫瘍および転移性腫瘍、ならびに難治性腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍としては、化学療法薬のみ、抗体のみ、放射線のみまたはそれらの組合せを用いる治療に応答できないかまたは抵抗性のある腫瘍が挙げられる。また、難治性腫瘍は、そのような薬剤を用いる治療により阻害されると思われるが、治療を中断してから５年まで、時には１０年まで、またはそれよりも後に再発する腫瘍を包含する。腫瘍はＥＧＦＲまたはその他のＲＴＫを正常レベルで発現するか、または腫瘍はＲＴＫを、例えば、正常レベルの少なくとも１０、１００、または１０００倍のレベルで過剰発現する。
【００６０】
ＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲのリガンドにより刺激される腫瘍の例としては、癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫、および腺腫が挙げられる。かかる腫瘍は実質的に身体の全ての部分で起こり、それには、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頚部または肝臓が含まれる。本発明に従って治療されうる、ＥＧＦＲを過剰発現することが観察される一部の腫瘍としては、結腸直腸および頭頚部の腫瘍、特に頭頚部の扁平上皮癌、神経膠芽腫などの脳腫瘍、ならびに肺、乳房、膵臓、食道、膀胱、腎臓、卵巣、子宮頚部、および前立腺の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。構成的に活性な（すなわち制御されていない）受容体チロシンキナーゼ活性を有することが観察される腫瘍の限定されない例としては、神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌および前立腺癌が挙げられる。腫瘍のその他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ腫瘍、神経芽腫、毛細血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、胃腸癌および腎癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは、多形性膠芽腫、ならびに平滑筋肉腫が挙げられる。その他のＲＴＫの過剰発現は同様の増殖不良を生じ得る。例えば、たいていの転移性骨癌は、前立腺、乳房、または肺の原発腫瘍に起因する。前立腺腫瘍は初期にはホルモン依存性でありうるが、そのような依存関係の喪失が、骨へと遊走する細胞のＩＧＦＲに媒介される刺激と同時に起こる。
【００６１】
また、抗体は、腫瘍以外の過剰増殖性疾患を治療するためにも有用であり、哺乳類へ有効量の本発明の抗体を投与することを含む。本明細書に開示されるように「過剰増殖性疾患」は、ＥＧＦＲファミリーまたはその他のチロシンキナーゼ受容体のメンバーを発現する非癌細胞の過剰な増殖によって起こる状態として定義される。過剰増殖性疾患により産生された過剰な細胞はＲＴＫを正常レベルで発現するか、またはそれらはＲＴＫを過剰発現する。
【００６２】
過剰増殖性疾患の例としては、乾癬、光線性角化症、および脂漏性角化症、いぼ、ケロイド瘢痕、ならびに湿疹が挙げられる。ウイルス感染、例えばパピローマウイルス感染などにより起こる過剰増殖性疾患も含まれる。例えば、乾癬には多くの異なる変形形態および重篤度の程度がある。異なる種類の乾癬は、膿様の水疱（膿疱性乾癬）、重度の皮膚の脱落（乾癬性紅皮症）、水滴様の点（滴状乾癬）および平滑な炎症病変（逆乾癬）などの特性を示す。全ての種類の乾癬（例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｅｒｙｔｈｒｏｄｅｒｍｉｃａ）、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症）の治療が、本発明により意図される。
【００６３】
本発明によれば、抗体は、疾患の治療のために、化学的にまたは生合成的にその他の薬剤、例えば抗腫瘍薬または血管新生阻害薬とコンジュゲートされ得る。抗体と連結された抗腫瘍薬には、抗体が結合している腫瘍を破壊または損傷させる、または抗体が結合している細胞の環境において腫瘍を破壊または損傷させる、任意の薬剤が含まれる。例えば、抗腫瘍薬は、化学療法薬または放射性同位元素などの毒物である。化学療法薬は従来法を用いて抗体とコンジュゲートされ（例えば、Ｈｅｒｍｅｎｔｉｎ ａｎｄ Ｓｅｉｌｅｒ （１９８８）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８２、１９７−２１５参照）、それにはペプチドおよび非ペプチドリンカーによるものが含まれる。
【００６４】
また、本発明の抗体は、診断目的のためにインビボおよびインビトロで有用な、検出可能なシグナル生成剤と連結することもできる。シグナル生成剤は、外部手段、通常電磁放射の測定により検出できる測定可能なシグナルを生じる。大部分、シグナル生成剤は酵素または発色団であり、あるいは蛍光、燐光またはケミルミネッセンスにより発光する。発色団は、紫外または可視領域の光を吸収する色素を含み、酵素触媒反応の基質または分解生成物であってよい。
【００６５】
本発明はさらに、第２の試薬に組み込まれた治療薬もしくは診断薬ととともに抗体の使用を企図する。例えば、結合対の１つのメンバーを本発明の抗体と連結させる。例えば、抗腫瘍薬は、かかる対の第２のメンバーとコンジュゲートされ、その結果抗体が結合している部位に向けられる。好ましい実施形態では、ビオチンを本発明の抗体とコンジュゲートし、それにより、抗腫瘍薬の標的あるいはアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされた他の部分がもたらされる。あるいは、ビオチンまたは別のかかる部分は本発明の抗体と連結され、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされている診断系において、レポーターとして用いられる。
【００６６】
抗体は、１以上の適したアジュバント、例えば、例として、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）など、またはその他の免疫賦活剤、例えば、限定されるものではないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドと組み合わせて投与してよい。しかし、抗体単独の投与が、治療上効果的な方法で腫瘍の進行を防止、阻害または低下させるために十分であることは当然理解される。
【００６７】
特定の実施形態では、ＲＴＫと結合し、リガンドと結合する別の抗原結合タンパク質と一緒にリガンド結合を阻止する本発明の抗体を投与することが望ましい。リガンド結合抗体は当技術分野で周知であり、例えば、抗ＶＥＧＦ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）；ベバシズマブ）が挙げられる。
【００６８】
本発明の抗体はまた、化学療法薬または放射性同位元素などの抗腫瘍薬とともに投与する併用療法で使用される。適した化学療法薬は当業者に公知であり、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシンおよびドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリチアマイシンが挙げられる。抗体と抗血管新生薬または抗腫瘍薬は、血管新生を阻害し、かつ／または腫瘍増殖を低下させるために有効な量で患者に投与される。抗体はまた、その他の治療計画と、例えば、放射線療法などの治療と組み合わせて投与される。併用療法の例については、例えば、米国特許第６，２１７，８６６号（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ａｎｄｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）；ＷＯ９９／６００２３号（Ｗａｋｓａｌ ｅｔ ａｌ．）（Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｄｉａｔｉｏｎ）参照。
【００６９】
任意の適した抗腫瘍薬、例えば、化学療法薬、放射線またはそれらの組合せなどを使用することができる。当技術分野で公知であるか評価されている抗腫瘍薬は、その標的または作用様式に基づいてクラスに分類することができる。例えば、アルキル化剤には、限定されるものではないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、およびダカルバジンが含まれる。代謝拮抗薬の例としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、およびパクリタキセル、ゲムシタビン、およびトポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、およびトポテカン（トポイソメラーゼＩ）およびエトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）が挙げられる。放射線に関して、線源は、治療される患者に対して外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）かまたは内部（近接照射療法−ＢＴ）であってよい。かかる分類は使用する抗腫瘍薬の選択に有用であり得る。例えば、ＩＧＦＲと結合する抗体は、トポイソメラーゼ阻害剤とともに投与される場合に特に効果的でありうることが観察されている。
【００７０】
投与される抗腫瘍薬の用量は、多数の因子に依存し、それには、例えば、薬剤の種類、治療される腫瘍の種類および重篤度ならびに薬剤の投与経路が挙げられる。しかし、本発明が何らかの特定の用量に制限されないことは強調されるべきである。
【００７１】
併用療法において、抗体は、治療開始の前、途中、または後に別の薬剤ならびにその任意の組合せとともに、すなわち、抗腫瘍薬治療の開始の前および途中、前および後、途中および前、あるいは前、途中および後に投与される。例えば、腫瘍または腫瘍性疾患の治療には、抗体は放射線療法開始前の１〜３０日の間、好ましくは、３〜２０日、より好ましくは、５〜１２日の間に投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、化学療法は抗体療法と同時に、前に、または後に投与される。
【００７２】
本発明において、任意の適した方法または経路を用いて本発明の抗体を投与することができ、かつ、所望により、抗腫瘍薬、受容体アンタゴニスト、またはその他の医薬組成物と同時投与することができる。例えば、本発明に従って用いられる抗腫瘍薬投与計画には、患者の腫瘍の状態の治療に最も適していると考えられる任意の投与計画が含まれる。様々な悪性腫瘍が特異的抗腫瘍抗体および特異的抗腫瘍薬の使用を必要とし得、それは患者ごとに決定される。投与の経路としては、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が挙げられる。投与される抗腫瘍薬の用量は多数の因子に依存し、それには、例えば、抗腫瘍薬の種類、治療される腫瘍の種類および重篤度ならびに抗腫瘍薬の投与経路が挙げられる。しかし、本発明が何らかの特定の方法または投与経路に制限されないことは強調されるべきである。
【００７３】
本発明の抗体は、予防または治療の目的のために哺乳類において使用される場合、製薬上許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが当然理解される。適した製薬上許容される担体としては、例えば、１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよび同種類のもの、ならびにそれらの組合せが挙げられる。製薬上許容される担体は、結合タンパク質の保存期間または有効性を促進する、湿潤もしくは乳化剤、防腐剤またはバッファーなどの少量の補助物質をさらに含む。注射用組成物は、当技術分野で周知のように、哺乳類への投与の後に有効成分の即時、持続または遅延放出をもたらすように処方される。
【００７４】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の抗体を含む、腫瘍増殖および／または血管新生を阻害する、またはその他の疾患を治療するためのキットを含む。ヒトまたはヒト化抗体が好ましい。このキットにはさらに、例えば、腫瘍形成または血管新生に関与する別の増殖因子受容体（例えば、上記のＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＦＧＦＲ、他）の任意の適したアンタゴニストが含まれる。代わりに、またはそれに加えて、本発明のキットは抗腫瘍薬をさらに含んでよい。本発明の文脈において適した抗腫瘍薬の例は本明細書に記載されている。本発明のキットは、さらにアジュバントを含んでよく、例も上に記載されている。
【００７５】
また、当技術分野で周知の調査または診断方法のための、インビボおよびインビトロでの本抗体の使用も本発明の範囲に含まれる。診断法には、本発明の抗体を含むキットが含まれる。
【００７６】
従って、本受容体結合抗体は、よって、当技術分野で周知の調査、診断、予防もしくは治療方法のためにインビボおよびインビトロで使用することができる。当然、本明細書に開示される本発明の原則の変動が当業者によりなされ得ることが理解され、そのような変更形態も本発明の範囲内にあることが意図される。本明細書中で言及されるすべての参照文献は、参照することによりその全文が組み込まれる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例でさらに本発明を説明するが、決して本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。従来法、例えば、ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のかかるベクターおよびプラスミドへの挿入、宿主細胞へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその定量などに用いられた方法の詳細な説明は、多数の刊行物から得ることができ、それにはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄが含まれる。
【００７８】
ファージディスプレイＦａｂライブラリーからのヒト抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の選定。Ｄｙａｘ製の大型の未処置の（ｎａｉｖｅ）ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリー（３．７×１０１０クローンを含む）を用いてｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に対して作成された抗体を選定した。ライブラリーストック（１００μｌ）を、２０ｍｌの２ＹＴＡＧ培地中で対数期まで増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いてレスキューし、２ＹＴＡＫ培地（２ＹＴは１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）中で３０℃にて一晩増幅させた。ファージ調製物を４％ＰＥＧ、０．５Ｍ ＮａＣｌに沈殿させた。ファージ調製物を、２４０μｇの非関連ヒトＩｇＧを含む１ｍｌの３％無脂肪乳／ＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートして非特異的結合およびｍＰＤＧＦＲαタンパク質のＦｃタグとの結合を阻止した。
【００７９】
選定用チューブをコートするタンパク質の量を減少させながら（それぞれ５０、１０および２μｇ）、固定化ｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃに関して３ラウンドの選定を行った。各選定ラウンドでは、ｍＰＤＧＦＲα−ＦｃコートＭａｘｉｓｏｒｐ Ｓｔａｒチューブ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｌｉｄｅ，ＤｅｎＭａｒｋ）を、まず３％乳／ＰＢＳで３７℃にて１時間ブロッキングし、次いでファージ調製物とともに室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でチューブを１５回洗浄した後、ＰＢＳで１５回洗浄した。結合したファージを、１ｍｌの新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ）溶液で、室温にて１０分間溶出させた。溶出させたファージを、１０ｍｌの対数期中期のＴＧ１細胞とともに３７℃にて３０分間静置し、３０分間振盪させながらインキュベートした。感染したＴＧ１細胞をペレット化し、３枚の２ＹＴＡＧプレート上に蒔き、３０℃にて一晩インキュベートした。プレート上で増殖した全てのコロニーを、３〜５ｍｌの２ＹＴＡ培地中へかき取り、グリセロール（終濃度：１０％）と混合し、等分して、−８０℃にて保存した。その後の選定ラウンドでは、前回の選定ラウンド由来のファージストック溶液（１００μｌ）を増幅させ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＳｔａｒチューブをコートするためのｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃの量を減らした上記の手順に従って、選定に使用した。
【００８０】
ファージ投入量を評価するために、選定前の１０μｌのファージを用いてＴＧ１細胞を感染させ、次いで２ＹＴＡＧプレートで力価を測定した。選定からのファージの回収を評価するため、上記選定手順から溶出したファージで感染させた１０μｌのＴＧ１細胞の力価を２ＹＴＡＧプレートで測定した。各選定ラウンドの回収率を計算したところ、コートするｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃが減少しているにもかかわらず、連続するラウンドごとに回収率は増加した（第１ラウンド１×１０−６％、；第２ラウンド４×１０−６％；第３ラウンド２×１０−４％）。
【００８１】
結合および阻止活性を有する抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング。２回目および３回目の選定ラウンドの後、各ラウンドから１９０のクローンをランダムに選び、ファージＥＬＩＳＡおよびＦａｂ ＥＬＩＳＡの両法により結合および阻止活性を試験した。要するに、２回目および３回目の選定ラウンド後に回収された個々のＴＧ１クローンをランダムに選び、９６ウェルプレート中で３７℃にて培養した。ファージを作製するために、上記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて細胞をレスキューした。可溶性Ｆａｂを作製するために、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ＹＴＡ培地中で細胞をインキュベートした。結合ＥＬＩＳＡ用には、ファージ調製物および可溶性Ｆａｂを含有する細胞培養上清を、１／６量の１８％乳／ＰＢＳを用いて室温にて１時間ブロッキングした。次いでブロッキングされたファージ調製物または細胞培養上清を、ｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでコートした（１μｇ／ｍｌ、５０μｌ、４℃にて一晩）９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に加え、室温にて１時間インキュベートした。室温にて１時間のインキュベーションの後、ＰＢＳＴを用いてプレートを３回洗浄した。
【００８２】
ファージＥＬＩＳＡ用には、プレートを抗Ｍ１３ファージ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートした。Ｆａｂ ＥＬＩＳＡ用には、プレートを抗ヒトＦａｂ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）とともにインキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えることにより発色させ、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、４５０ｎＭにて吸光度を測定した。ライブラリースクリーニングにおいて結合剤であることが確認されたＦｃ特異的抗体を除去するために、１Ｃ１１ ＩｇＧとの結合についてのＥＬＩＳＡも行った。２回目の選定後に選ばれたクローンの７７％超、および３回目の選定後に回収されたクローンの９９％超がｍＰＤＧＦＲα結合アッセイにおいて陽性であり、選定プロセスの効率が高いことが示唆された。
【００８３】
阻止ＥＬＩＳＡ用には、５０μｌのファージ調製物またはＦａｂ培養物上清を一定量のｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃ（０．５μｇ／ｍｌ）と混合し、室温にて３０分間インキュベートした。次にこの混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡ（０．５μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でプレコートした９６ウェルプレートに移し、室温にて１時間インキュベートした。結合したｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質を定量するため、次にプレートをウサギ抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともに室温にて１時間インキュベートし、その後に３回洗浄し、ＴＭＳペルオキシダーゼ基質を加えた。結合したｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃタンパク質は、４５０ｎＭでの吸光度を読み取ることにより定量した。阻止活性は、抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートにより検出されるＥＬＩＳＡシグナルの低下で示された。ｍＰＤＧＦＲαに結合したクローンの約４．２％が、ＰＤＧＦ−ＡＡ阻止活性を示した。
【００８４】
阻止アッセイの結果に基づき、さらなる試験のために、最初に１４のクローン（阻止しない結合剤を対照クローン（３Ｆ３）として含む）を選定した。ファージミドＤＮＡを単離し、ジデオキシヌクレオチドシークエンシングによりＤＮＡ配列を決定した。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の分類およびアラインメントは、Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＧｒｏｕｐのＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ）およびＤＮＡｓｔａｒのＭａｇＡｌｉｇｎを用いて行った。
【００８５】
選定された抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の分析。１４のクローンのうち、９つの特徴のある抗体が明らかとなった（表１）。１Ｃ１０および１Ｆ２の他に、同一のＶＨまたはＶＬは見られなかった。興味深いことに、より強い阻止活性を有する抗体のうちの４つが、不完全な軽鎖を有していた。クローン１Ｆ２および１Ｆ９は、インフレームＶＬ欠失を有していた（リーダーペプチド配列に続いてＣＬ配列がある）。クローン１Ｃ１０および１Ｆ２は同じＶＨ遺伝子を共有していた。しかし、１Ｃ１０の配列をコードするＶＬに終止コドンが含まれるため、ＣＬは発現されなかった。クローン３Ｇ７はＶＬ遺伝子の５’末端に出現する終止コドンを含んでいた。１Ｃ１０および３Ｇ７の双方は、強い阻止を示した。Ｆａｂ発現および結合活性は非常に低いと思われたが、これは抗ヒト−Ｆａｂ二次試薬の結合が弱いことにより説明することができる。
【表１】
【００８６】
Ｆａｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に示す。１Ｅ１０ ＶＨドメイン：配列番号５１および５２。１Ｅ１０ ＶＬドメイン：配列番号５３および５４。１Ａ１２ ＶＨドメイン：配列番号５５および５６。１Ａ１２ ＶＬドメイン：配列番号５７および５８。３Ｂ２ ＶＨドメイン：配列番号５９および６０。３Ｂ２ ＶＬドメイン：配列番号６１および６２。１Ｃ１０ ＶＨドメイン：配列番号６３および６４。１Ｃ１０ ＶＬドメイン：配列番号６５および６６。３Ｇ７ ＶＨドメイン：配列番号６７および６８。３Ｇ７ ＶＬドメインヌクレオチド配列：配列番号６９。３Ｇ７ ＶＬドメイン：ＱＡＷ；１Ｆ９ ＶＨドメイン：配列番号７０および７１。１Ｆ９ ＶＬドメイン：配列番号７２および７３。１Ｆ２ ＶＨドメイン：配列番号７４および７５。１Ｆ２ ＶＬドメイン：配列番号７６および７７。図１５は、それぞれのドメイン（３Ｇ７、１Ｆ９、および１Ｆ２のＶＬ切断または欠失を含む）、ならびにＣＤＲ領域の位置を示す。
【００８７】
６つのクローンのＦａｂ断片を大腸菌ＨＢ２１５１宿主細胞において発現させ、アフィニティークロマトグラフィープロテインＧカラムにより精製した。個々の選定クローンのファージミドを用いて、非サプレッサー大腸菌宿主ＨＢ２１５１を形質転換した。ＨＢ２１５１におけるＦａｂ断片の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ＹＴＡ培地中で細胞を３０℃にて培養することにより誘導した。Ｌｕ（ｘ）に記載されるように、細胞の周辺質抽出物を調製した。可溶性Ｆａｂタンパク質は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って、プロテインＧカラムを用いて精製した。調製物の純度および分子量を調べるために、精製された抗体をＮｕＰＡＧＥ（商標）４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で電気泳動させ、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液で染色することにより可視化した。
【００８８】
精製された結合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図２）。完全軽鎖を有するＦａｂは図２Ａに示され、分子量は約５０，０００である。その一方、１Ｆ２および１Ｆ９の非還元断片は、標準対照Ｆａｂと比較して小さなバンド（−ＤＴＴ：ＭＷ約３７，５００）を生じた（図２Ｂ）。還元性条件下では（＋ＤＴＴ）、２つのバンドは明瞭であり、上部のバンドは正常なサイズのＶＨ−ＣＨ１断片と一致し、下部のバンドはＣＬ断片を有する軽鎖と一致したが（ＭＷ約１２，５００）、可変ドメインが欠如していた。
【００８９】
抗ｍＰＤＧＦＲα抗体によるｍＰＤＧＦＲα結合およびｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡ阻止。６つの抗ｍＰＤＧＦＲαクローンの可溶性Ｆａｂ断片を、ｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡ相互作用の阻止におけるそれらの抗原結合効率および効力について、定量的に比較した。結合アッセイにおいて、ＦａｂをまずｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍｌ）でプレコートした９６ウェルプレート中で室温にて１時間インキュベートし、その後ウサギ抗−抗ヒトＦａｂ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにさらに１時間インキュベートした。次に、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより、プレートに結合した抗体−ＨＲＰを定量した。最初のスクリーニング結果に一致して（表１）、１Ｆ２ Ｆａｂは他の全てのＦａｂタンパク質よりもさらに効率よくｍＰＤＧＦＲαに結合した（図３Ａ）。
【００９０】
様々な抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いる表面プラズモン共鳴により測定し、ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．０プログラム（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて評価した。親和定数、Ｋｄを、解離速度（ｋｏｆｆ）／会合速度（ｋｏｎ）の比から計算した。報告された値は、Ｆａｂに関しては少なくとも２回の測定、ＩｇＧに関しては３回の測定からの平均±Ｓ．Ｅ．を示す（表２）。結合アッセイに一致して、ｓＶＤ抗体１Ｆ２は、選定された標準Ｆａｂである１Ｅ１０よりも２３倍以上高い、約０．５ｎＭというより高い親和性（Ｋｄ）を示した。
【００９１】
表２において、１Ｆ２−２Ｈ Ｆａｂは、ＣＬとの融合物として発現された第二の同一のＶＨドメインを含む、操作された二価のＦａｂである。この二価Ｆａｂを、大腸菌中で発現させ、プロテインＧクロマトグラフィーにより精製した。精製された１Ｆ２−２Ｈ ＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、約５０ｋＤの１つの単一タンパク質バンドが示され、それは標準Ｆａｂ断片のものと類似していた（図５）。二価のＦａｂの親和性は７９．５ｐＭであり、一価の１Ｆ２ Ｆａｂの４１８ｐＭと比較して５．２倍の増強を示した（表２）。
【表２】
【００９２】
阻止アッセイでは、様々な量の抗体を、溶液中の一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合物とともに３０分間インキュベートし、次いでその混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレートへ移し、１時間インキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、結合した抗ヒトＦｃ−Ａｂを定量することにより定量した。１Ｆ２ Ｆａｂは、ｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡの相互作用を強力に阻止し（図３Ｂ）、ＩＣ５０値は、１Ｆ９、１Ｅ１０および１Ａ１１のそれぞれ５７ｎＭ、１４０ｎＭおよび２２０ｎＭと比較して１２ｎＭであった。等モルベースでは、二価のＦａｂは、ｍＰＤＦＧＲαへの結合および受容体／リガンド相互作用の阻止の両方において、中程度に増強された活性を示した（図６）。
【００９３】
完全ＩｇＧのクローニング、発現、および精製。ＶＨドメインおよびＶＬドメインを重鎖発現ベクターであるｐＤＦｃと、軽鎖発現ベクターであるｐＬＣκにそれぞれクローニングすることにより、選定されたクローンのＦａｂを全長ＩｇＧに変換した。ｐＤＦｃは、リーダーペプチド配列のコード遺伝子とＣＨ１の間にクローニング部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＮｈｅ Ｉを有する。ｐＬＣκは、リーダーペプチド配列とＣＬの間にクローニング部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢｓｉ ＷＩを有する。要するに、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を、ファージミドＤＮＡからの逆転写ＰＣＲにより増幅し、それらのそれぞれの発現ベクターにクローニングした。次に、既に記載されたように、重鎖および軽鎖発現ベクター（ＶＨ−ｐＤＦｃおよびＶＬ−ｐＬＣκ）を一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞にコトランスフェクトした。細胞培養の培地をトランスフェクション後４８時間および９６時間に回収し、プールした。抗体は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコールに従って、プロテインＡカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。ＩｇＧの機能を確認した後、発現されたＶＨ遺伝子とＬ遺伝子の対を単一発現ベクターにクローニングし、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。抗体精製は上記の通り行った。
【００９４】
ＶＨを１つだけ含む１Ｆ２ Ｉｇから３つのＩｇＧ様構築物を作製し（図７参照）、それには４つのＶＨを有する四価の１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧ（Ａ）、およびＣＨまたはＣＬいずれかとの融合物として発現された１Ｆ２ ＶＨを含む二価の１Ｆ２（ＢおよびＣ）が含まれた。軽鎖および重鎖を発現するプラスミドを用いて、一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞をコトランスフェクトした。細胞培養物の上清を用いるＥＬＩＳＡにより抗体の発現レベルをモニターした。１Ｆ２−２Ｈの発現は、両方の二価の１Ｆ２抗体よりも一貫してより少なく、二価の１Ｆ２抗体の約１／４であった。細胞培養物の上清由来の抗体を、プロテインＡカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００９５】
標準抗体成分を有する遮断剤であるクローン１Ｅ１０もまた、全長ＩｇＧへと変換した。１Ｅ１０のＶＨおよびＶＬ遺伝子を、まずｐＤＦｃおよびｐＬＣκにそれぞれクローニングした。上記のように、ＤＮＡシークエンシングおよび１Ｅ１０ ＩｇＧ結合活性の確認の後、発現されたＶＨ／ＶＬ対を単一発現ベクターにクローニングし、次いでそれを用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした後、抗体を精製した。
【００９６】
精製された抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析して調製物の純度および分子量を決定した。二価抗体１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ（分子量約１２５，０００）は、標準ＩｇＧ（１Ｅ１０および２Ｂ４；図８の左パネル）よりも速く移動した。抗体を電気泳動前にＤＴＴで処理した場合（図８の右パネル）、重鎖および軽鎖成分は分離した。抗体１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬは、１Ｅ１０および２Ｂ４の重鎖に似た重鎖と関連のある上部のバンド、および予想された移動度に近い移動度の、速く移動する下部のバンド（ＭＷ約１２，５００、ＣＬのみ）を有していた。一方、抗体１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨは１Ｅ１０および２Ｂ４の移動度に似た移動度の軽鎖を示す下部のバンド、およびＣＨ１−Ｆｃポリペプチドのみに関連のある上部バンド（ＭＷ約３７，５００）を有していた。
【００９７】
全長抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の結合および阻止活性。３つの全ての精製１Ｆ２変異抗体、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧ、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ、ならびに抗体１Ｅ１０を、ＥＬＩＳＡによりｍＰＤＧＦＲαに対する結合親和性について比較した。様々な量の抗体を、ｍＰＤＧＦＲα／ＦｃでコートしたＥＬＩＳＡプレート中でインキュベートし、次にｍＰＤＧＦＲα−結合抗体を抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートにより検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧが４つの結合部位を有しているとしても、１Ｆ２−２Ｈの結合活性は両方の二価の１Ｆ２ ＩｇＧ（１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ）よりも約８倍低いことを示す（図９Ａ）。一方、二価の１Ｆ２（１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ）は両方とも、ＥＬＩＳＡ（図９Ａ）およびＢＩＡｃｏｒｅ分析（表２）により非常に類似した結合親和性を示した。二価の１Ｆ２ ＩｇＧの親和性は、親の１Ｆ２ Ｆａｂから約１等級（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）増加し、１Ｅ１０ ＩｇＧはそのＦａｂから２０倍増加した（表２）。全体にわたって、二価の１Ｆ２ ＩｇＧ両方のｍＰＤＧＦＲαに対する結合親和性は、１Ｅ１０ ＩｇＧよりも約１等級高かった（図９Ａおよび表２）。
【００９８】
抗ｍＰＤＧＦＲα抗体を評価するために、定量的阻止アッセイも行った。上に記載されるように、様々な量の抗体を溶液中の一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃ融合物とともに３０分間インキュベートし、次いでその混合物をｒｈＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレートへ移し、１時間インキュベートした。次に、結合した抗ヒトＦｃ−Ａｂを定量することにより、結合したｍＰＤＧＦＲαを定量した。結合データに一致して、二価の１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨは１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧおよび１Ｅ１０ ＩｇＧよりも優れた遮断剤であった：ＩＣ５０値は、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬ、１Ｆ２−ＣＬ／ＣＨ、１Ｆ２−２Ｈ ＩｇＧおよび１Ｅ１０ ＩｇＧそれぞれに対して３．２、２．７、１７、および９．６ｎＭであった（図９Ｂ）。
【００９９】
二重特異性抗体。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＳｔａｒチューブをｍＶＥＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質でコートする以外は上記と同じ手順を用いて、抗Ｆｌｋ−１抗体２Ｂ４もＤｙａｘ Ｆａｂファージライブラリーから単離した。２Ｂ４のＦａｂはＦｌｋ−１に特異的であり、Ｆｌｋ−１／ＶＥＧＦ１６５の相互作用を阻止した。Ｆａｂ ２Ｂ４のＶＨおよびＶＬドメインは、それぞれ配列番号７９および８１により提供される。図１５は、各ドメインおよびＣＤＲ領域の位置を示す。２Ｂ４ Ｆａｂを、上に記載されるように完全ＩｇＧ１に変換した。２Ｂ４ ＦａｂおよびＩｇＧの結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により測定した。２Ｂ４ ＦａｂおよびＩｇＧのｍＶＥＧＦＲ２への結合親和性は、それぞれ６．７±３．０ｎＭおよび０．３９±０．１ｎＭである。２Ｂ４ ＩｇＧは、ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦ１６５の相互作用を、約３．５ｎＭのＩＣ５０値で阻止する（図１３Ｂ）。
【０１００】
ドメインに基づく二重特異性抗体の構築（抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｔ−１）。ドメインに基づく二重特異性抗体を、２つの型式、つまりｓｃＦｖ−型とＦａｂ−型に構築した（図１０、ＡおよびＢ）。ｓｃＦｖ−型では、２Ｂ４のＶＨおよびＶＬ遺伝子をコードするＰＣＲ断片をまずオーバーラップＰＣＲを用いてアセンブルした。２Ｂ４ ＶＬのＣＯＯＨ末端を５−アミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、ＣＬドメインのＮ末端から取得）を介して２Ｂ４ ＶＨのＮＨ２末端に連結した（図１０Ａ）。２Ｂ４ ＶＬ−ＶＨをコードする、得られる遺伝子を、次にｓｃＦｖ２Ｂ４−ＣＨ融合物（２Ｂ４ ＶＬ−２Ｂ４ ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３から成る）の発現のためにＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｈｅ Ｉライゲーションを介してベクターｐＤＦｃにクローニングした。次に、ｓｃＦｖ２Ｂ４−ＣＨ発現ベクターを、一過性発現のためのＣＯＳ−７細胞のコトランスフェクションにより、上に記載される１Ｆ２ＶＨ−ＣＬ発現ベクターと対にした。
【０１０１】
Ｆａｂ−型では、１Ｆ２のＶＨ遺伝子および２Ｂ４のＶＬをまずオーバーラップＰＣＲを用いてアセンブルした。この融合物において、１Ｆ２ ＶＨのＣＯＯＨ末端をＣＨの５’末端由来の５−アミノ酸リンカーを介して２Ｂ４ ＶＬのアミノ末端に連結した。次に、１Ｆ２ ＶＨ−２Ｂ４ ＶＬ−ＣＬ−融合タンパク質の発現のために、１Ｆ２ ＶＨ−２Ｂ４ ＶＬをコードする遺伝子をＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＢｓｉＷ Ｉ部位を介してベクターｐＬＣκにクローニングした。ＶＨ発現のために、２Ｂ４ ＶＨ遺伝子を上記のようにｐＤＦｃベクターにクローニングした。軽鎖および重鎖を発現するためのプラスミドを、図１０Ｂに表されるように対にして、一過性の発現のためにＣＯＳ−７細胞をコトランスフェクトするために使用した。
【０１０２】
二重結合活性についてＥＬＩＳＡによりクローンを試験した後、Ｉｇ発現構築物を単一発現ベクターに組み入れ、次いで、デザインされたＩｇＧの一過性発現のためにＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするために使用した。抗体は、上記のように細胞培養物の上清から精製した。
【０１０３】
ドメインに基づく二重特異性抗体の発現および精製。１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４抗体を、ＣＯＳ−７細胞（１００〜２００ｍｌの細胞培養物）におけるトランスフェクションおよび一過性発現により作製した。抗体を、プロテインＡカラムを用いる細胞培養物の上清のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１０４】
精製された二重特異性抗体（１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４）ならびにそれらの親抗体１Ｆ２および２Ｂ４をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図８）。未処理の二重特異性抗体（−ＤＴＴ）の移動度がより低いのは、２Ｂ４ ＩｇＧおよび分子量位置約１２５，０００にて移動した二価のＦ２−ＣＨ／ＣＬと比較して、それらの分子量が大きい（約１７５，０００）ことと関連していた。４つの抗体それぞれの２つの成分を、ＤＴＴで処理した後に別々に分離した。標準ＩｇＧ（２Ｂ４）と比較すると、二重特異性抗体１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４（ＶＨ−ＣＬ融合物）の下部のバンドは標準ＩｇＧ軽鎖に相当する。上部バンドは、ｓｃＦｖ−重鎖融合タンパク質（ＭＷ約６２，５００）と相関する。一方、１Ｆ２−２Ｂ４の上部バンドは標準ＩｇＧ（２Ｂ４）の重鎖に相当し、下部バンドはＶＨ−軽鎖融合物とみられる位置に観察される（ＭＷ約３７，５００）。
【０１０５】
ドメインに基づく二重特異性抗体の二重特異性。架橋アッセイにおいて、最初に二重特異性１Ｆ２−２Ｂ４抗体および単一特異性１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび２Ｂ４抗体を、まず溶液中のｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２とともにインキュベートし、次に第２の受容体（それぞれｍＶＥＧＦＲ２またはｍＰＤＧＦＲα）でコートしたマイクロタイタープレートに移し、その後に第１の受容体に対するビオチン標識ポリクローナル抗体とともにインキュベートする。ＢｓＡｂのみが（親の単一特異性２Ｂ４ ＩｇＧおよび１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬではない）、２つの標的受容体と架橋することが可能であった。
【０１０６】
ドメインに基づく二重特異性抗体の抗原結合効率を、固定化ｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１で判定した。ＥＬＩＳＡでは、二重特異性抗体、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１に結合したが、親抗体１Ｆ２および２Ｂ４ほど効率的でなかった（図１２）。しかし、両方の場合で、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４と比較して、１Ｆ２−２Ｂ４抗体の結合のほうがわずかに効率的であった。予想通り、Ｆｌｋ−１特異的抗体２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲαと結合せず（図１２Ａ）、ｍＰＤＧＦＲα特異的抗体１Ｆ２もＦｌｋ−１に結合しなかった（図１２Ｂ）。二重特異性抗体のｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１への結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器を用いる表面プラズモン共鳴により測定した（表３）。ＥＬＩＳＡの所見と一致して、１Ｆ２−２Ｂ４抗体は、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４抗体と比較して、ｍＰＤＧＦＲαおよびＦｌｋ−１両方により強い親和性を有する。
【表３】
【０１０７】
図１３は、両方の二重特異性抗体が、ｍＰＤＧＦＲαを固定化ＰＤＧＦ−ＡＡとの結合から阻害し（図１３Ａ）、１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４および１Ｆ２−２Ｂ４に対して推定ＩＣ５０がそれぞれ９．９ｎＭおよび２５．３ｎＭであることを示す。抗体はまた、Ｆｌｋ−１を固定化ＶＥＧＦ１６５との結合からも阻止し（図１３Ｂ）、ＩＣ５０値はそれぞれ９．５ｎＭおよび１９．５ｎＭである。予想通り、２Ｂ４はｍＰＤＧＦＲα／ＰＤＧＦ−ＡＡの相互作用に対して影響を及ぼさず、一方１Ｆ２はＦｌｋ−１／ＶＥＧＦ１６５の相互作用に対して影響を及ぼさなかった。
【０１０８】
ｍＰＤＧＦα結合およびｍＶＥＧＦＲ２結合において、それぞれ単一特異性二価分子である１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬおよび２Ｂ４ ＩｇＧと比較して二重特異性抗体の結合親和性は低いにもかかわらず（表３）、ｅＥｎｄ．１細胞（ｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２両方を発現する細胞）上の細胞表面発現受容体との結合を調べた場合、ＢｓＡｂは親の単一特異性二価抗体のいずれかよりも高い効率を実証した。細胞上の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬ（ｍＰＤＧＦＲα結合）、２Ｂ４ ＩｇＧ（ｍＶＥＧＦＲ２結合）および１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧ（ｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２結合）それぞれに対して１５．７、３１および３６．９であった。
【０１０９】
ｍＶＥＧＦＲ２およびｍＰＤＧＦＲのリガンド誘発活性化の阻害。ｍＶＥＧＦＲ２およびｍＰＤＧＦＲαの発現は、ｅＥｎｄ．１細胞において、ＦＡＣＳ分析を介して示された。細胞を、２Ｂ４ ＩｇＧ、１Ｆ２−ＣＨ／ＣＬまたは１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）とともに４℃にて１時間インキュベートした後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．）とともにさらに１時間インキュベートし、Ｇｕａｖａ Ｅａｓｙｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で分析した。
【０１１０】
受容体リン酸化を調べるために、ｅＥｎｄ．１細胞を６ｃｍの皿に蒔き、集密度７０〜８０％まで増殖させ、その後ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、無血清培地中で一晩培養した。最初にこの細胞を様々な抗体とともに３７℃にて３０分間インキュベートし、その後ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ−ＡＡを用いて３７℃にて１５分間刺激した。細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、および１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で１時間溶解させ、その後溶解物を４℃にて１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。抗ｍＰＤＧＦＲα（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗ｍＶＥＧＦＲ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、細胞溶解物上清から受容体を免疫沈降させ、その後２０μｌのＰｒｏＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加した。沈殿した受容体タンパク質を４〜１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。ホスホ−ｍＶＥＧＦＲ２およびホスホ−ｍＰＤＧＦＲαを、抗ホスホチロシン抗体−ＨＲＰコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いるブロット上に検出した。ゲルに負荷した全受容体タンパク質を、ｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２に対する抗体（両方ともＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いてアッセイした。
【０１１１】
図１４に示されるように、ＢｓＡｂはｍＰＤＧＦＲαおよびｍＶＥＧＦＲ２受容体のＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ刺激リン酸化の両方を阻害し、一方、単一特異性親抗体は、その同種リガンドにより刺激された単一受容体の活性化を阻止したのみであった。対照として、抗ＥＧＦＲ抗体、Ｃ２２５は、いずれの受容体のリガンド刺激活性化に対しても何ら影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明の単一ドメイン抗体に基づく二重特異性抗原結合タンパク質の例を表す模式図である。単一ドメイン（図中、ＶＨ２で示される）は、他の抗体ドメインのＮ末端またはＣ末端との融合により導入することができる。
【図２】ｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂの発現および精製を示す図である。Ｆａｂを大腸菌宿主ＨＢ２１５１細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。Ａ）同様の分子量の重（ＶＨ−ＣＨ１）鎖および軽（ＶＬ−ＣＬ）鎖を有する「標準的な」ｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂ。Ｂ）ＤＴＴの存在または不在下で、ＶＬドメインを欠く１Ｆ２および１Ｆ９ Ｆａｂ断片ならびに標準的なＦａｂ対照。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図３】精製されたＦａｂの結合および阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製されたＦａｂのネズミＰＤＧＦＲαに対する定量的結合ＥＬＩＳＡ。様々な量のＦａｂを、まずｍＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質でプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いてウサギ抗抗ヒトκ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂによる、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量のＦａｂを、溶液中、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートした。混合物を、ＰＤＧＦ−ＡＡでコートした９６ウェルプレート中で、それに続いて抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図４】本発明の一価および二価のＦａｂの構造を表す図である。
【図５】二価のｍＰＤＧＦＲα特異的Ｆａｂの発現および精製を表す図である。Ｆａｂを大腸菌宿主ＨＢ２１５１細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。二価の１Ｆ２−２Ｈ Ｆａｂを、非還元条件下で標準的なＦａｂ（５Ｃ５）と比較する。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図６】精製された抗体の結合および阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された抗ｍＰＤＧＦＲα一価および二価の１Ｆ２ Ｆａｂ抗体の定量的結合アッセイ。様々な量の抗体をｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂ抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量の抗体を、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートし、混合物をＰＤＧＦ−ＡＡでプレコートしたプレートに移した。洗浄後、次に、プレートを抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。２Ｂ４は、マウスＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）に対して作られた抗体である。
【図７】１Ｆ２に基づく全長ＩｇＧの模式図を表す。１Ｆ２ ＶＨはＣＬおよび／またはＣＨに対する融合タンパク質として表され、四価（パネルＡ；ＭＷ約１５０，０００）または二価（パネルＢおよびＣ：ＭＷ約１２５，０００）の抗体が得られる。
【図８】抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の発現および精製を表す図である。右側のパネルでは、電気泳動の前に抗体をＤＴＴ処理した。
【図９】精製された抗体の結合およびリガンド阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された抗ｍＰＤＧＦＲα抗体の定量的結合。様々な量の抗体を、ｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。プレート結合抗体ＨＲＰを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量化し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。Ｂ）精製されたＦａｂ抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。様々な量の抗体を、一定量のｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃとともにインキュベートし、ＰＤＧＦ−ＡＡでプレコートしたプレートに移した。プレートを洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。データは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。２Ｂ４は、マウスＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）に対して作られた抗体である。
【図１０】ｍＰＤＧＦＲαおよびｆｌｋ−１と結合する、選定された１Ｆ２に基づく四価の二重特異性抗体の模式図を表す。Ａ）１Ｆ２／ｓｃＦｖ２Ｂ４と名付けられたＩｇＧ様抗体。１Ｆ２ ＶＨはＣＬに対する融合物として表され、２Ｂ４はＣＨに対するｓｃＦｖ融合物として表される。Ｂ）１Ｆ２−２Ｂ４と名付けられたＩｇＧ様抗体。１Ｆ２ ＶＨは２Ｂ４ ＶＬのアミノ末端の融合物として表される。
【図１１】１Ｆ２に基づく二重特異性抗体の発現および精製を表す図である。抗体を哺乳類細胞に発現させ、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。電気泳動の前にＤＴＴを用いて／用いずに（＋／−）抗体を処理した。分子量マーカーはキロダルトンで表される。
【図１２】精製された抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｋ−１二重特異性抗体の定量的結合アッセイを表すグラフである。Ａ）様々な量の抗体を、まずｍＰＤＧＦＲα／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。Ｂ）様々な量の抗体を、まずＦｌｋ−ｌ／Ｆｃでプレコートした９６ウェルプレート中でインキュベートし、それに続いて抗ヒトκ抗体ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図１３】精製された二重特異性抗ｍＰＤＧＦＲα×抗Ｆｌｋ−１二重特異性抗体の阻止アッセイを表すグラフである。Ａ）精製された二重特異性抗体による、ｍＰＤＧＦＲαと固定化されたＰＤＧＦ−ＡＡの結合の阻害。Ｂ）精製された二重特異性抗体による、Ｆｌｋ−１と固定化されたＶＥＧＦ１６５の結合の阻害。両方のアッセイにおいて、様々な量の抗体を溶液中、一定量の受容体（ｍＰＤＧＦＲα／ＦｃまたはＦｌｋ−１）とともにインキュベートし、リガンド（ＰＤＧＦ−ＡＡまたはＶＥＧＦ１６５）でプレコートしたプレートに移した。次に、プレートを抗ヒトＦｃ抗体−ＨＲＰコンジュゲートとともにインキュベートした。次に、結合したｍＰＤＧＦＲαを、ペルオキシダーゼ基質を添加することにより定量し、吸光度をＡ４５０ｎｍで読み取った。示されるデータは、２通りのサンプルの平均±ＳＤを表す。
【図１４】二重特異性１Ｆ２−２Ｂ４ＩｇＧによる、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに刺激される受容体リン酸化の阻害を表す図である。ｅＥｎｄ．１細胞をまず様々な抗体で３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いてＶＥＧＦまたはＰＤＧＦで３７℃にて１５分間刺激した。細胞溶解後、抗ｍＰＤＧＦＲαまたは抗ｍＶＥＧＦＲ２抗体で、それに続いてＰｒｏＡ／Ｇ−セファロースビーズとともにインキュベートすることにより、細胞溶解物上清から受容体を免疫沈降させた。沈殿した受容体タンパク質を４〜１２％Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離させ、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移した。抗ホスホチロシン抗体−ＨＲＰコンジュゲートを用いてホスホ−ｍＶＥＧＦＲ２およびホスホ−ｍＰＤＧＦＲαをブロット上に検出した。ゲルに負荷した全受容体タンパク質を、ｍＰＤＧＦＲαまたはｍＶＥＧＦＲ２に対する抗体を用いてアッセイした。
【図１５】いくつかの同定されたＦａｂタンパク質のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を表す。Ｆａｂ １Ｅ１０、１Ａ１１、３Ｂ２、１Ｃ１０、３Ｇ７、１Ｆ９、および１Ｆ２を、ネズミＰＤＧＦＲαと結合するＦａｂ−ファージについてのスクリーニングで同定した。Ｆａｂ ２Ｂ４はネズミＶＥＧＦＲ２と結合するＦａｂ−ファージについてのスクリーニングで同定された。＾：フレームシフト突然変異；＊フレームシフト突然変異によりもたらされる停止コドン；＠．．．＠：インフレーム欠失。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドを含んでなる複合体を含む抗原結合タンパク質であって、
各第１のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する第１の抗原結合部位を有し、前記ＣＬドメインは、免疫グロブリン重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定な会合が可能であり、
各第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する第２の抗原結合部位を有し、前記ＣＨ１ドメインの後には安定な自己会合の可能な１以上の重鎖定常ドメインが続き、
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位の少なくとも１つが、単一の可変ドメイン（ｓＶＤ）である、
抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記第１および第２の抗原結合部位の両方が、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記第１および第２の抗原結合部位のうちの一方が、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドを含んでなる複合体を含む抗原結合タンパク質であって、
各第１のポリペプチドは、可変ドメインと定常ドメインで構成される免疫グロブリン重鎖を含み、
各第２のポリペプチドは、可変ドメインと定常ドメインで構成される免疫グロブリン軽鎖を含み、
該２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドが、安定に会合して免疫グロブリン様分子を形成し、
該免疫グロブリン重鎖の可変ドメインが、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインと安定に会合して第１の抗原結合部位を形成し、
前記第１および第２のポリペプチドのいずれかまたは両方が、第２の単鎖可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位をＮ末端またはＣ末端にさらに含む、
抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位が、異なる特異性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記異なる特異性が、異なる抗原上に存在するエピトープに対する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記異なる特異性が、同じ抗原上に存在するエピトープに対する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記第２の抗原結合部位の前記第１の抗原結合部位が、同じ特異性を有する、請求項１および２のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記定常ドメインが、ヒト定常ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記単一可変ドメインが、ヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｆｃ受容体に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
抗腫瘍薬と結合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
検知可能なシグナル生成剤と結合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記第１および第２の抗原結合部位の少なくとも１つが受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に特異的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
リガンドと受容体チロシンキナーゼの結合を阻害する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
受容体チロシンキナーゼの活性化を中和する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を阻害する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
受容体チロシンキナーゼがヒトである、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
受容体チロシンキナーゼが、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＩＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＲＯＮ、Ｔｅｋ、およびＴｉｅ２からなる群から選定される、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＰＤＧＦＲαに特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＶＥＧＦＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＶＥＧＦＲ１に特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＶＥＧＦＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＩＧＦＲに特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
受容体の活性化を中和するために十分な量で、前記受容体チロシンキナーゼに特異的な請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて細胞を処理することを含む、受容体チロシンキナーゼの活性化を中和する方法。
【請求項２６】
該受容体の活性化を中和するために十分な量で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて哺乳類を処理することを含む、血管新生を阻害する方法。
【請求項２７】
腫瘍増殖を減少させるために十分な量で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて哺乳類を処理することを含む、腫瘍増殖を減少させる方法。
【請求項２８】
抗原結合タンパク質が、ＰＤＧＦＲαとＶＥＧＦＲ２とに結合し、ＰＤＧＦＲαのリガンド誘導活性化とＶＥＧＦＲ２のリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２６および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗原結合タンパク質が、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２とに結合し、ＶＥＧＦＲ１のリガンド誘導活性化とＶＥＧＦＲ２のリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２６および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
抗原結合タンパク質が、ＥＧＦＲとＩＧＦＲとに結合し、ＥＧＦＲのリガンド誘導活性化とＩＧＦＲのリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
抗原結合タンパク質が、ＨＥＲ２とＩＧＦＲとに結合し、ＨＥＲ２のリガンド誘導活性化とＩＧＦＲのリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
有効量の抗腫瘍薬を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）宿主細胞において、
免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する第１の抗原結合部位を有する第１のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ構築物と、ここで、前記ＣＬドメインは、免疫グロブリン重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定な会合が可能である、
ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する第２の抗原結合部位を有する第２のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ構築物と、ここで、前記ＣＨ１ドメインの後には安定な自己会合の可能な１以上の重鎖定常ドメインが続く、
をポリペプチドの発現および抗体の形成を可能にするのに十分な時間および方法で同時発現させるステップと、
ここで、前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位の少なくとも１つが、単一の可変ドメイン（ｓＶＤ）であり、
ｂ）抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む、
抗原結合タンパク質を作製するための方法。
【請求項３４】
構築物が、同じＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
構築物が、異なるＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が宿主細胞から分泌される、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドを含んでなる複合体を含む抗原結合タンパク質であって、
各第１のポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する第１の抗原結合部位を有し、前記ＣＬドメインは、免疫グロブリン重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定な会合が可能であり、
各第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する第２の抗原結合部位を有し、前記ＣＨ１ドメインの後には安定な自己会合の可能な１以上の重鎖定常ドメインが続き、
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位の少なくとも１つが、単一の可変ドメイン（ｓＶＤ）である、
抗原結合タンパク質。
【請求項２】
前記第１および第２の抗原結合部位の両方が、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記第１および第２の抗原結合部位のうちの一方が、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドを含んでなる複合体を含む抗原結合タンパク質であって、
各第１のポリペプチドは、可変ドメインと定常ドメインで構成される免疫グロブリン重鎖を含み、
各第２のポリペプチドは、可変ドメインと定常ドメインで構成される免疫グロブリン軽鎖を含み、
該２本の第１のポリペプチドと２本の第２のポリペプチドが、安定に会合して免疫グロブリン様分子を形成し、
該免疫グロブリン重鎖の可変ドメインが、免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインと安定に会合して第１の抗原結合部位を形成し、
前記第１および第２のポリペプチドのいずれかまたは両方が、第２の単鎖可変ドメイン（ｓＶＤ）抗原結合部位をＮ末端またはＣ末端にさらに含む、
抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位が、異なる特異性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記異なる特異性が、異なる抗原上に存在するエピトープに対する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記異なる特異性が、同じ抗原上に存在するエピトープに対する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
前記第２の抗原結合部位の前記第１の抗原結合部位が、同じ特異性を有する、請求項１および２のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記定常ドメインが、ヒト定常ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記単一可変ドメインが、ヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
Ｆｃ受容体に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
抗腫瘍薬と結合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
検知可能なシグナル生成剤と結合されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記第１および第２の抗原結合部位の少なくとも１つが受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に特異的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
リガンドと受容体チロシンキナーゼの結合を阻害する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
受容体チロシンキナーゼの活性化を中和する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達を阻害する、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
受容体チロシンキナーゼがヒトである、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
受容体チロシンキナーゼが、ＰＤＧＦＲα、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＩＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、ＲＯＮ、Ｔｅｋ、およびＴｉｅ２からなる群から選定される、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＰＤＧＦＲαに特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＶＥＧＦＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＶＥＧＦＲ１に特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＶＥＧＦＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記第１および第２の抗原結合部位の一方が、ＩＧＦＲに特異的であり、前記第１および第２の抗原結合部位のもう一方が、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に特異的である、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
受容体の活性化を中和するために十分な量で、前記受容体チロシンキナーゼに特異的な請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて細胞を処理することを含む、受容体チロシンキナーゼの活性化を中和する方法。
【請求項２６】
該受容体の活性化を中和するために十分な量で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて哺乳類を処理することを含む、血管新生を阻害する方法。
【請求項２７】
腫瘍増殖を減少させるために十分な量で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を用いて哺乳類を処理することを含む、腫瘍増殖を減少させる方法。
【請求項２８】
抗原結合タンパク質が、ＰＤＧＦＲαとＶＥＧＦＲ２とに結合し、ＰＤＧＦＲαのリガンド誘導活性化とＶＥＧＦＲ２のリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２６および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗原結合タンパク質が、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２とに結合し、ＶＥＧＦＲ１のリガンド誘導活性化とＶＥＧＦＲ２のリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２６および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
抗原結合タンパク質が、ＥＧＦＲとＩＧＦＲとに結合し、ＥＧＦＲのリガンド誘導活性化とＩＧＦＲのリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
抗原結合タンパク質が、ＨＥＲ２とＩＧＦＲとに結合し、ＨＥＲ２のリガンド誘導活性化とＩＧＦＲのリガンド誘導活性化とを阻害する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
有効量の抗腫瘍薬を投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）宿主細胞において、
免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬドメイン）のＮ末端に位置する第１の抗原結合部位を有する第１のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ構築物と、ここで、前記ＣＬドメインは、免疫グロブリン重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１ドメイン）と安定な会合が可能である、
ＣＨ１ドメインのＮ末端に位置する第２の抗原結合部位を有する第２のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ構築物と、ここで、前記ＣＨ１ドメインの後には安定な自己会合の可能な１以上の重鎖定常ドメインが続く、
をポリペプチドの発現および抗体の形成を可能にするのに十分な時間および方法で同時発現させるステップと、
ここで、前記第１の抗原結合部位および前記第２の抗原結合部位の少なくとも１つが、単一の可変ドメイン（ｓＶＤ）であり、
ｂ）抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む、
抗原結合タンパク質を作製するための方法。
【請求項３４】
構築物が、同じＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
構築物が、異なるＤＮＡ発現ベクター上にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が宿主細胞から分泌される、請求項３３に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５２６８５７（Ｐ２００９−５２６８５７Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５３５９（Ｐ２００８−５５５３５９）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４０５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５３３８
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８１８８６６２）イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (23)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｍｃｌｏｎｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４０５１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５３３８
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８１８８６６２）イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (23)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｍｃｌｏｎｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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