活性酸素生成抑制物質およびそれを含む機能性食品素材
【課題】 生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含む機能性食品素材を提供する。
【解決手段】 鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質、および前記活性酸素生成抑制物質を有効成分として含む機能性食品素材である。
【解決手段】 鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質、および前記活性酸素生成抑制物質を有効成分として含む機能性食品素材である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素生成抑制物質およびそれを含む機能性食品素材に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含む機能性食品素材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、急速な高齢化の時代を迎えつつあるなかで、動脈硬化、虚血性心疾患、糖尿病、がん、痴呆症等の成人病の予防、治療が大きな問題となっているが、これら疾病の発症に、反応性に富んだ活性酸素と呼ばれる一連の分子種による障害（酸素障害）が関与することが明らかにされている。
【０００３】
本来、人などの動物の体内では、恒常的に酸素を消費する過程で、またエネルギー消費が激しい時ほど多量に、活性酸素を発生するが、これらを消去する防御系が存在し、また白血球による殺菌作用にみられるように、活性酸素を生体防御機構にも利用している。
【０００４】
前記の活性酸素を消去する防御系としては、活性酸素の消去や鉄の封鎖に有用なアルブミンやトランスフェリンなどタンパク質、脂質系ラジカル消去に有用なビタミンＥやカロチンなど脂溶性低分子成分、水層での活性酸素を消去する尿酸やビタミンＣなど水溶性低分子成分、そしてスーパーオキシドジスムターゼやグルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素等が挙げられ、これらが二重、三重に防御系を構成している。
【０００５】
しかしながら、若い時期には、例え酸素障害を受けたとしても、上記の防御系による修復機能が働くため問題が生じないが、加齢とともにこのような修復機能が低下して前記の疾病を引き起こすといわれている。
【０００６】
ところで、空気中の酸素分子は三重項酸素（３Ｏ２）と呼ばれており、それ自体では安定な物質であるが、細胞が３Ｏ２からＨ２Ｏへと４電子還元を利用してエネルギー生産を行う過程で、順次一電子ずつ還元されてスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）など反応性に富む分子種が生じる。これに３Ｏ２の光励起などで生じる一重項酸素（１Ｏ２）、およびミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）により産生される次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）を加えて、これらは活性酸素と呼ばれている。
【０００７】
さらにＯ２−から派生するヒドロペルオキシドラジカル（ＨＯＯ・）や金属−酸素錯体、脂質酸化の関連の脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）やそれから生じるフリーラジカルとして脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、脂質アルコキシルラジカル（ＬＯ・）、脂質アルキルラジカル（Ｌ・）などの過酸化脂質などを加えて、広義に活性酸素と呼ぶことがある。
なお、前記一重項酸素（１Ｏ２）は、ＯＣｌ−とＨ２Ｏ２との反応によっても生じる。
【０００８】
これらの活性酸素は、例えば加齢などにより防御系の修復機能が低下した場合に、酸素障害による様々な疾病を引き起こす。したがって、このような場合には、活性酸素生成抑制物質の摂取が重要となる。
【０００９】
一方、ミエロペルオキシダーゼ（以下、ＭＰＯと略記することがある。）は、ヘムａ類似のヘムをもつ酵素であって、主に白血球の好中球に存在している。生体内では白血球による生体防御において、活性酸素が重要な役割を果たす。例えば白血球中の代表的な好中球は、食菌において盛んに活性酸素の一種であるＯ２−を産生する。このＯ２−は、自発的不均化反応によってＨ２Ｏ２となる。また、生体内にはＣｌ−が存在し、前記ＭＰＯの作用により、Ｈ２Ｏ２とＣｌ−からＯＣｌ−が生成し、強力な殺菌作用を示す。しかし、このＭＰＯが過剰に存在したり、あるいはその活性が強すぎたりすると、活性酸素の一種であるＯＣｌ−による生理的障害、例えば全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群および糸球体腎炎などを引き起こす原因となる。このような場合、ＭＰＯ活性阻害物質の摂取が重要となる。
【００１０】
また、生体内、例えばヒトの老化脳神経細胞のリポフスチン中や、Ａｐｏ欠損マウス動脈硬化病巣にジチロシンが存在することが知られている。このジチロシンは、タンパク質中のチロシン残基が、活性酸素の作用によりラジカルとなって二量体を形成することにより、生成すると考えられている。例えば、前記ＭＰＯ生成酸化生成物には、ジチロシンが、ニトロチロシン、メチオニンスルホキシド、脂質過酸化生成物と共に存在することが知られている。このジチロシンは動脈硬化症や痴呆症に関与していることも考えられる。
【００１１】
生体内におけるジチロシンの検出は、例えばジチロシンポリクローナル抗体によって行うことができる（例えば、特許文献１参照）。
【００１２】
ところで羽毛などのケラチン組成物を可溶化処理して得られた可溶化ケラチンの用途として、該可溶化ケラチンを無機担体上に表面修飾してなる光学分割用充填剤が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、その可溶化ケラチンの用途は、本発明の水溶性ケラチン誘導体の用途とは全く異なるものである。
【特許文献１】特開平１１−２７９２００号公報
【特許文献２】特開平７−３１１１８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、このような事情のもとで、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含む機能性食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られたケラチン誘導体、および該ケラチン誘導体にさらに高エネルギー線を照射して得られた改質ケラチン誘導体は、いずれも易水溶性であって、各種の活性酸素の生成を効果的に抑制し得ることを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１） 鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質、
（２） 活性酸素が、１Ｏ２、ＯＣｌ−、・ＯＨ、Ｏ２−およびＨ２Ｏ２の中から選ばれる少なくとも１種である上記（１）項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（３） ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）活性を阻害する上記（１）または（２）項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（４） ジチロシン生成を抑制する上記（１）ないし（３）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（５） 水溶性ケラチン誘導体および改質水溶性ケラチン誘導体の分子量が、それぞれ５〜５０ｋＤａである上記（１）ないし（４）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（６） 上記（１）ないし（５）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする機能性食品素材、および
（７） さらに、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、これらのビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物の中から選ばれる少なくとも１種の天然系抗酸化活性物質を含む上記（６）項に記載の機能性食品素材、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含み、生体内抗酸化能の増強が期待できる機能性食品素材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなるものである。
【００１８】
前記水溶性ケラチン誘導体や改質水溶性ケラチン誘導体の原料として用いられる鳥類の羽毛としては特に制限はなく、各種の鳥類の羽毛を用いることができるが、大量に入手可能で、かつ資源の有効利用の観点から、家禽類の羽毛が好ましい。家禽類としては、食肉用ブロイラー、産卵鶏、アヒル、カモなどが例示されるが、それらの中でブロイラーおよび産卵鶏が、羽毛の大量入手性の点から、工業的に好適である。
【００１９】
鳥類の羽毛には、タンパク質の一種であるケラチンが多く含まれている。ケラチンは、一般に不溶性の細胞内タンパク質であり、ジスルフィド結合が多数存在する。ケラチンタンパク質は１種類のタンパク質分子ではなく、αヘリックスを形成したものが９＋２本の形でロープ状にらせんを形成しているαケラチンと、ポリペプチド鎖間に水素結合したβ構造をもつβケラチンが、典型的なＸ線回折像から知られている。羽毛ケラチンにはβケラチンが多く含まれている。
【００２０】
本発明においては、鳥類の羽毛をアルカリ処理して、羽毛ケラチンを水溶性ケラチン誘導体に変換する。このアルカリ処理においては、原料羽毛を細断してそのままアルカリ処理してもよく、あるいはダウン部と芯部を分別して、別々にアルカリ処理してもよい。アルカリ処理には、一般に水酸化アルカリ金属などの水溶性アルカリの水溶液が用いられる。この水溶性アルカリの水溶液としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの水溶液が挙げられるが、これらの中で、工業的な面から水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。また、反応終了液からの脱塩を回避する目的で、水難溶性または水不溶性アルカリ、例えば水酸化カルシウム、活性白土、イオン交換樹脂なども用いることができる。
【００２１】
アルカリ処理条件は、原料羽毛中のケラチンに異常反応を惹起させない条件であればよく、特に制限はない。例えばアルカリとして、水酸化アルカリ金属の水溶液を用いる場合、その濃度としては、局所的な強アルカリ状態を回避できる濃度であればよく、特に制限はないが、通常１〜２０質量％、好ましくは２〜１２質量％の範囲で選定される。また、この水溶液の使用量は、羽毛に対し、水酸化アルカリ金属として、好ましくは２〜１５質量％、より好ましくは４〜１０質量％の割合になるように選定される。
【００２２】
反応温度は、タンパク質の熱変性温度以下が好ましく、通常２０〜８０℃の範囲で選定される。また、反応方式としては、不均一反応であるため、羽毛とアルカリとが効率よく接触できる方式であればよく、特に制限されず、回分式および連続式のいずれであってもよい。処理時間については、使用するアルカリの濃度や量、反応温度などに左右され、一概に定めることはできないが、通常羽毛が実質上溶解してしまうまでアルカリ処理を行うのが有利である。また、アルカリ処理後、必要に応じ、常法に従って脱色処理や脱臭処理を施してもよい。
【００２３】
前記の各処理が終了後、アルカリ水溶液を用いた場合には、適宜の酸、好ましくは塩酸で中和後、限外ろ過膜などを用いる膜処理によって脱塩および低分子量画分をカットし、一方、水不溶性または水難溶性アルカリを用いた場合には、そのまま常法に従ってろ過などの固液分離を施し、さらに低分子量画分をカットすることにより、目的の水溶性ケラチン誘導体を含む水溶液が得られる。
【００２４】
このようにして得られた水溶性ケラチン誘導体を含む水溶液は、常法に従って所定濃度まで濃縮し、「水溶性ケラチン誘導体（以下、「ＭＦＰ」と略記することがある。）」水溶液製剤としてもよく、またこのものに、常法に従ってさらに乾燥処理、例えば蒸発乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を施し、ＭＦＰ粉剤としてもよい。
【００２５】
一方、前記ＭＦＰに高エネルギー線を照射して得られる改質水溶性ケラチン誘導体（以下、「ＵＶＰ」と略記することがある。）は、以下のようにして製造することができる。
【００２６】
前記ＭＦＰに高エネルギー線を照射する方法としては、ＭＦＰを含む水溶液、例えば前述の乾燥処理する前のＭＦＰを含む水溶液を適当な濃度、具体的には１〜２０質量％程度、好ましくは２〜１０質量％に調整し、これに紫外線、好ましくは２００〜２９０ｎｍの波長域の紫外線を適宜の照射強度で、８０℃以下の温度にて２〜１００時間程度照射させる方法を用いることができる。
【００２７】
この紫外線照射終了液に、必要に応じ、限外ろ過膜などを用いる膜処理を施し、好ましくは分子量５０００以下、より好ましくは１０，０００以下の副生低分子化合物を除去する。次いで、このものを常法に従って所定濃度まで濃縮し、ＵＶＰ水溶液製剤としてもよく、またこのものに、常法に従ってさらに乾燥処理、例えば蒸発乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を施し、ＵＶＰ粉剤としてもよい。
【００２８】
このようにして得られたＭＦＰおよびＵＶＰは、主としてオリゴβケラチン誘導体であり、多重複合化環状構造体と推定される。これらの分子量は５〜５０ｋＤａの範囲にあることが好ましく、一般的には数十ｋＤａの平均分子量を有している。
【００２９】
本発明においては、このようにして得られたＭＦＰおよび／またはＵＶＰを活性酸素生成抑制物質として用いる。
【００３０】
本発明の活性酸素生成抑制物質が適用される活性酸素としては、細胞が三重項酸素（３Ｏ２）からＨ２Ｏへと４電子還元を利用してエネルギー生産を行う過程で、順次一電子ずつ還元されて生成するスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、あるいはミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、３Ｏ２の光励起やＯＣｌ−とＨ２Ｏ２との反応によって生じる一重項酸素（１Ｏ２）などを、さらには、広義の活性酸素に入れることのできるＯ２−から派生するヒドロペルオキシドラジカル（ＨＯＯ・）や金属−酸素錯体、脂質酸化の関連の脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）やそれから生じるフリーラジカルとして脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、脂質アルコキシルラジカル（ＬＯ・）、脂質アルキルラジカル（Ｌ・）などの過酸化脂質等を挙げることができる。
【００３１】
これらの活性酸素や過酸化脂質などは、例えば加齢などにより、生体における防御系の修復機能が低下した場合に、酸素障害による様々な疾病を引き起こす。
【００３２】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記の活性酸素や過酸化脂質の生成を効果的に抑制することができる。
【００３３】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、特にミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を効果的に阻害する作用を有している。
【００３４】
前記ＭＰＯは、ヘムａ類似のヘムをもつ酵素であって、主に白血球の好中球に存在している。この好中球は、食菌において盛んに活性酸素の一種であるＯ２−を産生する。Ｏ２−は自発的不均化反応によってＨ２Ｏ２となる。また、生体内にはＣｌ−が存在し、前記ＭＰＯの作用により、Ｈ２Ｏ２とＣｌ−からＯＣｌ−が生成し、強力な殺菌作用を示す。しかし、このＭＰＯが過剰に存在したり、あるいはその活性が強すぎたりすると、活性酸素の一種であるＯＣｌ−による生理的障害、例えば全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群および糸球体腎炎などを引き起こす原因となる。
【００３５】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記ＭＰＯ活性を阻害し、ＯＣｌ−の生成を効果的に抑制することができる。
【００３６】
また、本発明の活性酸素生成抑制物質は、生体内におけるジチロシンの生成を効果的に抑制する作用を有している。
【００３７】
生体内において、ジチロシンは、例えばヒトの老化脳神経細胞のリポフスチン中や、ＡｐｏＥ欠損マウス動脈硬化病巣に存在することが知られており、したがって、このジチロシンは、動脈硬化症や痴呆症に関与していることが考えられる。
【００３８】
前記ジチロシンは、タンパク質中のチロシン残基が活性酸素の作用によりラジカルとなって二量体を形成することにより、生成すると考えられている。本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記ジチロシンの生成を効果的に抑制することができる。
【００３９】
なお、生体内におけるジチロシンの検出は、例えばジチロシンポリクローナル抗体によって行うことができる。このジチロシンポリクローナル抗体を用いることにより、生体内におけるジチロシンの局在性が明らかになると共に、該ジチロシンを定量することができる。
【００４０】
本発明はまた、前記のＭＰＦおよび／またはＵＶＰからなる活性酸素生成抑制物質を有効成分として含む機能性食品素材をも提供する。
【００４１】
本発明の機能性食品素材には、ＭＦＰやＵＶＰと共に、天然系抗酸化活性物質を含むことができる。
【００４２】
天然系抗酸化物質としては、例えばビタミンＡ、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、これらビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物などが挙げられる。
【００４３】
テルペノイド類としては、β−カロテン、ゲニポシジン酸、カルノソール、ソイサポニン、クロモサポニンＩなどを、フラボノイド類としては、ケルセチン、ミリセチン、ケンフェロール、ケルセチンルチノシド、ビロバライド、ジンクゴライド、タキシフォリン、さらにはエピガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピカテキンなどのカテキン誘導体などを、他のフェノール化合物としては、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸などのフェノール酸、クルクミン、セサモール、ピノレシノール、ジンゲロンなどを例示することができる。
【００４４】
ビタミンＣ類縁体として、ビタミンＣのリン脂質誘導体を用いることができる。水溶性のラジカル捕捉剤であるビタミンＣをホスホリパーゼＤを用いてリン脂質誘導体とすることにより、水層で発生したラジカルによる脂質過酸化反応を、ビタミンＣよりも効率よく抑制することができる。
【００４５】
本発明においては、前記天然系抗酸化物質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【００４７】
製造例１ ＭＦＰの製造
（１）羽毛のアルカリ処理
成鶏処理場で副生する産卵鶏羽毛を通常の脱毛ラインから直接、鮮度よく採取して狭雑物を除去し、羽毛を超音波洗浄装置で適宜な温度および時間で洗浄したのち、細断機でカットし脱水して密封梱包後、冷暗所に保存したものを原料として使用した。
４質量％ＮａＯＨ水溶液１ｋｇに前記脱水羽毛２００ｇ（乾物質量１００ｇ）を加えて室温で攪拌した。羽毛がダウン状になったのち、反応液を加温して７０℃に保持し、ダウンおよび芯部が完全に溶解するまで、５時間攪拌を続けた。
反応終了後、反応液を冷却しながら、１モル／Ｌ濃度の塩酸を滴下して、残存アルカリおよび硫化物を中和した。なお、反応液中に残存する硫化水素は、硫化水素トラップ剤を加え、加熱して完全に除去した。
次に、この中和処理液を、セライトをろ過助剤に使用して、常法により吸引ろ過した。
【００４８】
（２）脱塩・分取
上記（１）で得られたろ液を、以下のようにして限外ろ過し、分子量１万以下、１万超５万以下および５万超の３フラクションを質量比２：７：１の割合で分取した。
・使用装置：アドバンテック東洋（株）製
攪拌型ウルトラホルダー ＵＨＰ−９０Ｋ
使用フィルター ＵＫ−１０（分子量１万以下の物質を透過）
ＵＫ−５０（分子量５万以下の物質を透過）
・操作：マニュアル通り
各フラクション毎にロータリーエバポレーターで適宜に濃縮し、市販装置で凍結乾燥に供した。１万超５万以下のフラクション（ＭＦＰ）の乾燥収量は４９ｇ（原料からの収率は４９％）であった。
【００４９】
（３）ＭＦＰ（分子量１万超５万以下）の特性
（イ）分子量分布（水系ＧＰＣ法）
下記の装置を使用して、標準タンパク質（下記）と対比させてＭＦＰ（１万超５万以下の限外ろ過膜により調製）の相対分子量（ｋＤａ）分布を測定した。
結果は、９．６ｋＤａ及び１０．８ｋＤａにメインピークが測定された。
・装置 ＨＰＬＣ装置 ：東ソー（株）製 ＣＣＰＭ−II
カラムオーブン：東ソー（株）製 ＣＯ−８０２０（３０℃）
検出器 ：東ソー（株）製 ＳＤ−８０２２
データ処理装置：ジーエルサイエンス（株）製 Vstation
Ver.1.65
・カラム：Shodex Asahi Pak GF310 HQ（８ｍｍφ×３００ｍ）
適用分子量範囲；〜５０，０００
・標準タンパク質：１，３５０〜６７，０００の分子量範囲の５種のタンパク質
（BIO-RAD Filtration Standard）
・測定条件
バッファー ：リン酸水素２ナトリウム ０．１モル／Ｌ
同 ｐＨ ：９．０４（無調整）
流速 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検体液注入量：２０μｌ
測定時間 ：６０ｍｉｎ
（ロ）溶解特性
水に極めてよく溶ける。油（中性植物油脂）にも僅かに溶け、両親媒性を有する。
【００５０】
製造例２ ＵＶＰの製造
（１）ＵＶ−Ｃ照射処理
製造例１においてアルカリ反応液を脱塩し分子量１万超５万以下の限外ろ過液を固形分濃度２質量％に調整して、下記のＵＶ−Ｃ照射反応装置に仕込み、除熱しながら室温下で６０時間ＵＶ−Ｃの照射処理を行った。
・紫外線照射ランプ：冷陰極殺菌ランプＱＣＧＬ−５Ｗ（岩崎電気（株）製）
波長 ＵＶ−Ｃ８０％（含、１８０ｎｍを２０％）
照射強度 ３５μＷ／ｃｍ２；５ｃｍ
８００μＷ／ｃｍ２；１ｃｍ
・反応装置：反応液を入れたガラスビーカーに紫外線ランプを直接挿入し、マグ ネチックスターラーで攪拌する。ビーカーを外部冷却する。
反応終了液を、セライトをろ過助剤としてろ過したのち、常法通り濃縮、凍結乾燥してＵＶＰ粉末を収率８４％で得た。
【００５１】
（２）ＵＶＰの特性
（イ）分子量分布
水系ＧＰＣスペクトルを測定したところ、原料ＭＦＰと類似の分子量分布パターンを示した。
（ロ）溶解性能
水に極めてよく溶け、油にも僅かに溶ける両親媒性を有する。
【００５２】
実施例１
ＭＦＰによるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の酸化作用抑制効果
フェントン（Fenton）反応によって生成したヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解反応によって生成するマロンジアルデヒドを、ＴＢＡ法（チオバルビツール酸法）によって測定し、ＭＦＰによるヒドロキシルラジカルの酸化作用抑制効果を調べた。
【００５３】
（１）各試薬の調製
（ａ）１００μモル／Ｌ Ｆｅ２＋／ＥＤＴＡ溶液
硫酸第一鉄［ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、和光純薬工業（株）製］とエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩・２水和物［ＥＤＴＡ、（株）同仁科学研究所製］の１ｍモル／Ｌ混合水溶液を調製し、さらにリン酸緩衝液（０．１モル／Ｌ、ｐＨ７．４）を用い、１００μモル／Ｌに希釈して調製した。
（ｂ）１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水
過酸化水素水［Ｈ２Ｏ２３１質量％含有水溶液、三菱瓦斯化学（株）製、特級過酸化水素水］を使用直前に、前記リン酸緩衝液で１０ｍモル／Ｌになるように希釈して調製した。
（ｃ）１０ｍモル／Ｌ ２−デオキシリボース溶液
２−デオキシリボース［２−デオキシ−Ｄ−リボース、和光純薬工業（株）製］を、前記リン酸緩衝液を用いて１０ｍモル／Ｌになるように調製した。
（ｄ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を、前記リン酸緩衝液を用いて１０ｍｇ／ｍｌになるように調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｅ）ＴＢＡ法発色試薬
２．８質量％トリクロロ酢酸溶液［トリクロロ酢酸：和光純薬工業（株）製］、及び１質量％ ２−チオバルビツール酸溶液［ＭＥＲＣＫ社製、２−チオバルビツール酸と５０ｍモル／Ｌ ＮａＯＨ溶液を用いて調製］をそれぞれ調製した。
【００５４】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に、１００μモル／Ｌ Ｆｅ２＋／ＥＤＴＡ溶液、１０ｍモル／Ｌ ２−デオキシリボース溶液及び各種濃度のＭＦＰ溶液を各１００μｌ、前記リン酸緩衝液を全量が０．９ｍｌになるように加え、混合した。
次いで、１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水を１００μｌ添加し、攪拌して反応を開始し、３７℃、４時間インキュベートした。反応終了後、２．８質量％トリクロロ酢酸溶液、１質量％ ２−チオバルビツール酸溶液を０．５ｍｌずつ添加し攪拌後沸騰水中で１０分間加熱し発色させた。冷却後、分光光度計［ＢＥＣＫＭＡＮ社製、「ＤＵ−７５００」］を用いて５３２ｎｍでの吸光度を測定した。測定値は発色時のε＝１．５６×１０−５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてマロンジアルデヒドとしてＴＢＡＲＳ量を算出した。また使用した各濃度のＭＦＰ溶液における酸化作用抑制効果を、下式
酸化作用抑制効果（％）
＝［１−ＯＤ５３２（サンプル）／ＯＤ５３２（無添加）］×１００
より算出した。なおＯＤ５３２は５３２ｎｍでの吸光度である。
結果を表１に示すと共に、図１に示す。図１は、ヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【００５５】
【００５６】
実施例２
ＭＦＰによるヒドロペルオキシドラジカル（・ＯＯＨ）の酸化作用抑制効果
赤血球膜ゴーストを調製し、ヒドロペルオキシドラジカルによって過酸化脂質を誘導し、生成した過酸化脂質をＴＢＡ法によって測定し、ＭＦＰによるヒドロペルオキシドラジカルの酸化作用抑制効果を調べた。
【００５７】
（１）各試薬の調製
（ａ）赤血球膜ゴースト
兎保存血液［日本バイオテスト社製］１００ｍｌと、等張液（１０ｍモル／Ｌリン酸、１５２ｍモル／Ｌ ＮａＣｌ［和光純薬工業（株）製］、ｐＨ７．４）１５０ｍｌをよく混和し、高速冷却遠心機［日立工機（株）製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｆ」］により、４℃、１５００Ｇ（３５００ｒｐｍ）にて２０分間遠心分離処理した。
上清部分（血清など）をデカンテーション法で除去し、沈殿した赤血球を同様に等張液で計３回洗浄した。洗浄した赤血球（２０ｍｌ）に低張液（１０ｍモル／Ｌ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）１００ｍｌをよく混和し、４℃に１５分ほど静置した後、４℃、２００００Ｇ（１１０００ｒｐｍ）で４０分間遠心分離処理した。ヘモグロビンを含む上清と緩い沈殿（ゴースト部分）、側底に固着したごく少量の堅い沈殿に分かれるので注意深く上清を除去した。ゴースト部分を同様に低張液で４回洗浄した。次第に赤色が抜けて薄いピンク色がかった赤血球膜ゴースト約２０ｍｌを得た。あらかじめ予備テストを行ってＴＢＡ法での吸光度が０．３〜０．３５程度になるようにゴーストの濃度を調整した。
（ｂ）２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液
tert−ブチルヒドロペルオキシド溶液［Aldrich Chemical社製、７０質量％水溶液］を希釈して、２４ｍモル／Ｌ溶液を調製した。
（ｃ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、２００ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｄ）ＴＢＡ法発色試薬
２モル／Ｌ トリクロロ酢酸の１．７モル／Ｌ ＨＣｌ溶液［トリクロロ酢酸：和光純薬工業（株）製］、および０．６７質量％ ２−チオバルビツール酸溶液［２−チオバルビツール酸：ＭＥＲＣＫ社製］を調製した。
【００５８】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に赤血球膜ゴースト０．４５ｍｌ、各濃度のＭＦＰ溶液０．０２５ｍｌを入れ、よく混和しておく。これに、２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液０．０２５ｍｌを加えて反応開始した。３７℃、２０分インキュベート後、２モル／Ｌ トリクロロ酢酸溶液０．５ｍｌ、０．６７質量％ ２−チオバルビツール酸溶液１ｍｌを加えてよく混和し、沸騰水中で１５分加熱した。
発色後直ちに冷却し、卓上遠心分離機［日立工機（株）製、「Ｈｉｍａｃ ＣＴ６０」］により３５００ｒｐｍで遠心分離処理したのち、上清を分光光度計［ＢＥＣＫＭＡＮ社製、「ＤＵ−７５００」］を用いて５３２ｎｍでの吸光度を測定した。測定値はＭＤＡ法発色時のε＝１．５６×１０−５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてマロンジアルデヒドとしてＴＢＡＲＳ量を算出した。
結果を図２に示す。図２は、赤血球膜ゴーストの酸化に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【００５９】
実施例３
赤血球膜ゴーストの酸化の抑制におけるＭＦＰとビタミンＥ、ビタミンＣとの相乗効果について調べた。
【００６０】
（１） 各試薬の調製
赤血球膜ゴースト、tert−ブチルヒドロペルオキシド溶液、ＴＢＡ法発色試薬は実施例２と同様に調製した。
（ａ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、１６０ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製した。
（ｂ）１．６ｍｇ／ｍｌ ビタミンＥ溶液
ＤＬ−α−トコフェロール［和光純薬工業（株）製］の１．６ｍｇ／ｍｌ メタノール溶液を調製した。
（ｃ）１．６ｍｇ／ｍｌ ビタミンＣ水溶液
Ｌ−アスコルビン酸［和光純薬工業（株）製］を用い、１．６ｍｇ／ｍｌ 水溶液を調製した。
【００６１】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に赤血球膜ゴースト０．４５ｍｌ、ＭＦＰ溶液０．０１２５ｍｌを入れ、さらに０．０１２５ｍｌビタミンＥ溶液あるいはビタミンＣ水溶液を加えてよく混和しておく。これに、２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液０．０２５ｍｌを加えて反応開始した。以下は実施例２と同様の操作を行って反応、発色し、ＴＢＡＲＳ量を算出した。
結果を図３に示す。
なお、図において、ＶＣはビタミンＣ、ＶＥはビタミンＥを示す。
【００６２】
実施例４
ＭＦＰによるミエロペルオキシダーゼ活性の阻害効果
（１）各試薬の調製
（ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）溶液
ヒト由来のミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＣ社製］を、リン酸緩衝液［リン酸０．１モル／Ｌ、ＤＴＰＡ（ジエチレントリスミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（同仁科学研究所製））１００μモル／Ｌ、ｐＨ７．４］で１１単位／ｍｌになるように調製した。
（ｂ）１０ｍモル／Ｌ チロシン溶液
Ｌ−チロシン［和光純薬工業（株）製］を、０．１モル／Ｌ ＨＣｌ溶液で１０ｍモル／Ｌ チロシン溶液を調製した。
（ｃ）１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水
過酸化水素水［Ｈ２Ｏ２１質量％含有水溶液、三菱瓦斯化学（株）製、特級過酸化水素水］を使用直前に１０ｍモル／Ｌになるように調製した。
（ｄ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、１００ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｅ）１０ｍモル／Ｌ ビタミンＥ溶液
ＤＬ−α−トコフェロール［和光純薬工業（株）製］の１０ｍモル／Ｌ メタノール溶液を調製した。
（ｆ）１ｍモル／Ｌ ビタミンＣ水溶液
Ｌ−アスコルビン酸［和光純薬工業（株）製］を用い、１ｍモル／Ｌ 水溶液を調製した。
（ｇ）１ｍｇ／ｍｌ カタラーゼ溶液
カタラーゼ［和光純薬工業（株）製］を用い、１ｍｇ／ｍｌ カタラーゼ水溶液を調製した。
【００６３】
（２）操作
マイクロテストチューブに、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）溶液をＭＰＯが１．１単位／ｍｌになるように、１０ｍモル／Ｌ−チロシン溶液をＬ−チロシンが２００μモル／Ｌになるように、ＭＦＰ溶液をＭＦＰが０〜１０ｍｇ／ｍｌになるように、ＤＴＰＯ添加リン酸緩衝液中で混合し、１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水を過酸化水素が２００μモル／Ｌになるように添加して反応を開始した。ビタミンＥ、ビタミンＣを加える場合は、それぞれ１ｍモル／Ｌ、０．１ｍモル／Ｌになるように、１０ｍモル／Ｌ ビタミンＥ溶液および１ｍモル／Ｌ ビタミンＣ水溶液を添加した。
３７℃で３０分間インキュベート後、１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ溶液を、カタラーゼが２５μｇ／ｍｌになるように加えて、１５分間室温に放置して反応を停止した。全量を「ultrafree ＭＣ」［ミリポア社製］に移し、高速冷却遠心機［日立工機（株）製、Ｈｉｍａｃ ＣＲ１５−Ｔ］により、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理したのち、ろ過液をＨＰＬＣ分析した。
【００６４】
＜ＨＰＬＣ条件＞
高速液体クロマトグラフ：日本分光社製（ＰＵ−９８０，ＬＧ−９８０−２，ＤＧ−９８０−５０）のシステムを使用
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶媒 ：０．５質量％酢酸／メタノール容量比＝２９／１
流速 ：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出 ：蛍光検出器［日本分光社製、「ＦＰ−１５２０Ｓ」］を用い、励起３００ｎｍ、蛍光４００ｎｍで行う。
保持時間：約１１分
検出されるジチロシンのピークの面積を測定し［島津製作所社製、「クロマトパックＣ−Ｒ６Ａ」］、ＭＦＰ無添加を１として相対値を算出した。
結果を図４、図５および図６に示す。図４は、ＭＦＰによるジチロシン生成に対する抑制効果、図５は、ジチロシン生成抑制におけるＭＦＰとビタミンＣの相乗効果および図６は、ジチロシン生成抑制におけるＭＦＰとビタミンＥの相乗効果を示すグラフである。
なお、図において、ＶＣはビタミンＣ、ＶＥはビタミンＥを示す。
【００６５】
実施例５
ＵＶＰは、ＭＦＰと同様にヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の酸化作用抑制効果、ヒドロペルオキシドラジカル（・ＯＯＨ）の酸化作用抑制効果及びミエロペルオキシダーゼ活性の阻害効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、鳥類の羽毛から得られた水溶性ケラチン誘導体であって、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制することができ、機能性食品素材として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１における、ヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【図２】実施例２における、赤血球膜ゴーストの酸化に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【図３】実施例３における、赤血球膜ゴーストの酸化の抑制に対するＭＦＰとビタミンＣ、ＭＦＰとビタミンＥとの相乗効果を示すグラフである。
【図４】実施例４における、ＭＦＰによるジチロシン生成に対する抑制効果を示すグラフである。
【図５】実施例４における、ジチロシン生成に対するＭＦＰとビタミンＣとの相乗効果を示すグラフである。
【図６】実施例４における、ジチロシン生成に対するＭＦＰとビタミンＥとの相乗効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素生成抑制物質およびそれを含む機能性食品素材に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含む機能性食品素材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、急速な高齢化の時代を迎えつつあるなかで、動脈硬化、虚血性心疾患、糖尿病、がん、痴呆症等の成人病の予防、治療が大きな問題となっているが、これら疾病の発症に、反応性に富んだ活性酸素と呼ばれる一連の分子種による障害（酸素障害）が関与することが明らかにされている。
【０００３】
本来、人などの動物の体内では、恒常的に酸素を消費する過程で、またエネルギー消費が激しい時ほど多量に、活性酸素を発生するが、これらを消去する防御系が存在し、また白血球による殺菌作用にみられるように、活性酸素を生体防御機構にも利用している。
【０００４】
前記の活性酸素を消去する防御系としては、活性酸素の消去や鉄の封鎖に有用なアルブミンやトランスフェリンなどタンパク質、脂質系ラジカル消去に有用なビタミンＥやカロチンなど脂溶性低分子成分、水層での活性酸素を消去する尿酸やビタミンＣなど水溶性低分子成分、そしてスーパーオキシドジスムターゼやグルタチオンペルオキシダーゼなどの酵素等が挙げられ、これらが二重、三重に防御系を構成している。
【０００５】
しかしながら、若い時期には、例え酸素障害を受けたとしても、上記の防御系による修復機能が働くため問題が生じないが、加齢とともにこのような修復機能が低下して前記の疾病を引き起こすといわれている。
【０００６】
ところで、空気中の酸素分子は三重項酸素（３Ｏ２）と呼ばれており、それ自体では安定な物質であるが、細胞が３Ｏ２からＨ２Ｏへと４電子還元を利用してエネルギー生産を行う過程で、順次一電子ずつ還元されてスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）など反応性に富む分子種が生じる。これに３Ｏ２の光励起などで生じる一重項酸素（１Ｏ２）、およびミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）により産生される次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）を加えて、これらは活性酸素と呼ばれている。
【０００７】
さらにＯ２−から派生するヒドロペルオキシドラジカル（ＨＯＯ・）や金属−酸素錯体、脂質酸化の関連の脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）やそれから生じるフリーラジカルとして脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、脂質アルコキシルラジカル（ＬＯ・）、脂質アルキルラジカル（Ｌ・）などの過酸化脂質などを加えて、広義に活性酸素と呼ぶことがある。
なお、前記一重項酸素（１Ｏ２）は、ＯＣｌ−とＨ２Ｏ２との反応によっても生じる。
【０００８】
これらの活性酸素は、例えば加齢などにより防御系の修復機能が低下した場合に、酸素障害による様々な疾病を引き起こす。したがって、このような場合には、活性酸素生成抑制物質の摂取が重要となる。
【０００９】
一方、ミエロペルオキシダーゼ（以下、ＭＰＯと略記することがある。）は、ヘムａ類似のヘムをもつ酵素であって、主に白血球の好中球に存在している。生体内では白血球による生体防御において、活性酸素が重要な役割を果たす。例えば白血球中の代表的な好中球は、食菌において盛んに活性酸素の一種であるＯ２−を産生する。このＯ２−は、自発的不均化反応によってＨ２Ｏ２となる。また、生体内にはＣｌ−が存在し、前記ＭＰＯの作用により、Ｈ２Ｏ２とＣｌ−からＯＣｌ−が生成し、強力な殺菌作用を示す。しかし、このＭＰＯが過剰に存在したり、あるいはその活性が強すぎたりすると、活性酸素の一種であるＯＣｌ−による生理的障害、例えば全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群および糸球体腎炎などを引き起こす原因となる。このような場合、ＭＰＯ活性阻害物質の摂取が重要となる。
【００１０】
また、生体内、例えばヒトの老化脳神経細胞のリポフスチン中や、Ａｐｏ欠損マウス動脈硬化病巣にジチロシンが存在することが知られている。このジチロシンは、タンパク質中のチロシン残基が、活性酸素の作用によりラジカルとなって二量体を形成することにより、生成すると考えられている。例えば、前記ＭＰＯ生成酸化生成物には、ジチロシンが、ニトロチロシン、メチオニンスルホキシド、脂質過酸化生成物と共に存在することが知られている。このジチロシンは動脈硬化症や痴呆症に関与していることも考えられる。
【００１１】
生体内におけるジチロシンの検出は、例えばジチロシンポリクローナル抗体によって行うことができる（例えば、特許文献１参照）。
【００１２】
ところで羽毛などのケラチン組成物を可溶化処理して得られた可溶化ケラチンの用途として、該可溶化ケラチンを無機担体上に表面修飾してなる光学分割用充填剤が開示されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、その可溶化ケラチンの用途は、本発明の水溶性ケラチン誘導体の用途とは全く異なるものである。
【特許文献１】特開平１１−２７９２００号公報
【特許文献２】特開平７−３１１１８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、このような事情のもとで、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含む機能性食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られたケラチン誘導体、および該ケラチン誘導体にさらに高エネルギー線を照射して得られた改質ケラチン誘導体は、いずれも易水溶性であって、各種の活性酸素の生成を効果的に抑制し得ることを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１） 鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質、
（２） 活性酸素が、１Ｏ２、ＯＣｌ−、・ＯＨ、Ｏ２−およびＨ２Ｏ２の中から選ばれる少なくとも１種である上記（１）項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（３） ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）活性を阻害する上記（１）または（２）項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（４） ジチロシン生成を抑制する上記（１）ないし（３）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（５） 水溶性ケラチン誘導体および改質水溶性ケラチン誘導体の分子量が、それぞれ５〜５０ｋＤａである上記（１）ないし（４）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質、
（６） 上記（１）ないし（５）項のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする機能性食品素材、および
（７） さらに、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、これらのビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物の中から選ばれる少なくとも１種の天然系抗酸化活性物質を含む上記（６）項に記載の機能性食品素材、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制する物質、およびこの活性酸素生成抑制物質を含み、生体内抗酸化能の増強が期待できる機能性食品素材を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなるものである。
【００１８】
前記水溶性ケラチン誘導体や改質水溶性ケラチン誘導体の原料として用いられる鳥類の羽毛としては特に制限はなく、各種の鳥類の羽毛を用いることができるが、大量に入手可能で、かつ資源の有効利用の観点から、家禽類の羽毛が好ましい。家禽類としては、食肉用ブロイラー、産卵鶏、アヒル、カモなどが例示されるが、それらの中でブロイラーおよび産卵鶏が、羽毛の大量入手性の点から、工業的に好適である。
【００１９】
鳥類の羽毛には、タンパク質の一種であるケラチンが多く含まれている。ケラチンは、一般に不溶性の細胞内タンパク質であり、ジスルフィド結合が多数存在する。ケラチンタンパク質は１種類のタンパク質分子ではなく、αヘリックスを形成したものが９＋２本の形でロープ状にらせんを形成しているαケラチンと、ポリペプチド鎖間に水素結合したβ構造をもつβケラチンが、典型的なＸ線回折像から知られている。羽毛ケラチンにはβケラチンが多く含まれている。
【００２０】
本発明においては、鳥類の羽毛をアルカリ処理して、羽毛ケラチンを水溶性ケラチン誘導体に変換する。このアルカリ処理においては、原料羽毛を細断してそのままアルカリ処理してもよく、あるいはダウン部と芯部を分別して、別々にアルカリ処理してもよい。アルカリ処理には、一般に水酸化アルカリ金属などの水溶性アルカリの水溶液が用いられる。この水溶性アルカリの水溶液としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどの水溶液が挙げられるが、これらの中で、工業的な面から水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。また、反応終了液からの脱塩を回避する目的で、水難溶性または水不溶性アルカリ、例えば水酸化カルシウム、活性白土、イオン交換樹脂なども用いることができる。
【００２１】
アルカリ処理条件は、原料羽毛中のケラチンに異常反応を惹起させない条件であればよく、特に制限はない。例えばアルカリとして、水酸化アルカリ金属の水溶液を用いる場合、その濃度としては、局所的な強アルカリ状態を回避できる濃度であればよく、特に制限はないが、通常１〜２０質量％、好ましくは２〜１２質量％の範囲で選定される。また、この水溶液の使用量は、羽毛に対し、水酸化アルカリ金属として、好ましくは２〜１５質量％、より好ましくは４〜１０質量％の割合になるように選定される。
【００２２】
反応温度は、タンパク質の熱変性温度以下が好ましく、通常２０〜８０℃の範囲で選定される。また、反応方式としては、不均一反応であるため、羽毛とアルカリとが効率よく接触できる方式であればよく、特に制限されず、回分式および連続式のいずれであってもよい。処理時間については、使用するアルカリの濃度や量、反応温度などに左右され、一概に定めることはできないが、通常羽毛が実質上溶解してしまうまでアルカリ処理を行うのが有利である。また、アルカリ処理後、必要に応じ、常法に従って脱色処理や脱臭処理を施してもよい。
【００２３】
前記の各処理が終了後、アルカリ水溶液を用いた場合には、適宜の酸、好ましくは塩酸で中和後、限外ろ過膜などを用いる膜処理によって脱塩および低分子量画分をカットし、一方、水不溶性または水難溶性アルカリを用いた場合には、そのまま常法に従ってろ過などの固液分離を施し、さらに低分子量画分をカットすることにより、目的の水溶性ケラチン誘導体を含む水溶液が得られる。
【００２４】
このようにして得られた水溶性ケラチン誘導体を含む水溶液は、常法に従って所定濃度まで濃縮し、「水溶性ケラチン誘導体（以下、「ＭＦＰ」と略記することがある。）」水溶液製剤としてもよく、またこのものに、常法に従ってさらに乾燥処理、例えば蒸発乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を施し、ＭＦＰ粉剤としてもよい。
【００２５】
一方、前記ＭＦＰに高エネルギー線を照射して得られる改質水溶性ケラチン誘導体（以下、「ＵＶＰ」と略記することがある。）は、以下のようにして製造することができる。
【００２６】
前記ＭＦＰに高エネルギー線を照射する方法としては、ＭＦＰを含む水溶液、例えば前述の乾燥処理する前のＭＦＰを含む水溶液を適当な濃度、具体的には１〜２０質量％程度、好ましくは２〜１０質量％に調整し、これに紫外線、好ましくは２００〜２９０ｎｍの波長域の紫外線を適宜の照射強度で、８０℃以下の温度にて２〜１００時間程度照射させる方法を用いることができる。
【００２７】
この紫外線照射終了液に、必要に応じ、限外ろ過膜などを用いる膜処理を施し、好ましくは分子量５０００以下、より好ましくは１０，０００以下の副生低分子化合物を除去する。次いで、このものを常法に従って所定濃度まで濃縮し、ＵＶＰ水溶液製剤としてもよく、またこのものに、常法に従ってさらに乾燥処理、例えば蒸発乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を施し、ＵＶＰ粉剤としてもよい。
【００２８】
このようにして得られたＭＦＰおよびＵＶＰは、主としてオリゴβケラチン誘導体であり、多重複合化環状構造体と推定される。これらの分子量は５〜５０ｋＤａの範囲にあることが好ましく、一般的には数十ｋＤａの平均分子量を有している。
【００２９】
本発明においては、このようにして得られたＭＦＰおよび／またはＵＶＰを活性酸素生成抑制物質として用いる。
【００３０】
本発明の活性酸素生成抑制物質が適用される活性酸素としては、細胞が三重項酸素（３Ｏ２）からＨ２Ｏへと４電子還元を利用してエネルギー生産を行う過程で、順次一電子ずつ還元されて生成するスーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、あるいはミエロペルオキシダーゼにより産生される次亜塩素酸イオン（ＯＣｌ−）、３Ｏ２の光励起やＯＣｌ−とＨ２Ｏ２との反応によって生じる一重項酸素（１Ｏ２）などを、さらには、広義の活性酸素に入れることのできるＯ２−から派生するヒドロペルオキシドラジカル（ＨＯＯ・）や金属−酸素錯体、脂質酸化の関連の脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）やそれから生じるフリーラジカルとして脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）、脂質アルコキシルラジカル（ＬＯ・）、脂質アルキルラジカル（Ｌ・）などの過酸化脂質等を挙げることができる。
【００３１】
これらの活性酸素や過酸化脂質などは、例えば加齢などにより、生体における防御系の修復機能が低下した場合に、酸素障害による様々な疾病を引き起こす。
【００３２】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記の活性酸素や過酸化脂質の生成を効果的に抑制することができる。
【００３３】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、特にミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性を効果的に阻害する作用を有している。
【００３４】
前記ＭＰＯは、ヘムａ類似のヘムをもつ酵素であって、主に白血球の好中球に存在している。この好中球は、食菌において盛んに活性酸素の一種であるＯ２−を産生する。Ｏ２−は自発的不均化反応によってＨ２Ｏ２となる。また、生体内にはＣｌ−が存在し、前記ＭＰＯの作用により、Ｈ２Ｏ２とＣｌ−からＯＣｌ−が生成し、強力な殺菌作用を示す。しかし、このＭＰＯが過剰に存在したり、あるいはその活性が強すぎたりすると、活性酸素の一種であるＯＣｌ−による生理的障害、例えば全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群および糸球体腎炎などを引き起こす原因となる。
【００３５】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記ＭＰＯ活性を阻害し、ＯＣｌ−の生成を効果的に抑制することができる。
【００３６】
また、本発明の活性酸素生成抑制物質は、生体内におけるジチロシンの生成を効果的に抑制する作用を有している。
【００３７】
生体内において、ジチロシンは、例えばヒトの老化脳神経細胞のリポフスチン中や、ＡｐｏＥ欠損マウス動脈硬化病巣に存在することが知られており、したがって、このジチロシンは、動脈硬化症や痴呆症に関与していることが考えられる。
【００３８】
前記ジチロシンは、タンパク質中のチロシン残基が活性酸素の作用によりラジカルとなって二量体を形成することにより、生成すると考えられている。本発明の活性酸素生成抑制物質は、前記ジチロシンの生成を効果的に抑制することができる。
【００３９】
なお、生体内におけるジチロシンの検出は、例えばジチロシンポリクローナル抗体によって行うことができる。このジチロシンポリクローナル抗体を用いることにより、生体内におけるジチロシンの局在性が明らかになると共に、該ジチロシンを定量することができる。
【００４０】
本発明はまた、前記のＭＰＦおよび／またはＵＶＰからなる活性酸素生成抑制物質を有効成分として含む機能性食品素材をも提供する。
【００４１】
本発明の機能性食品素材には、ＭＦＰやＵＶＰと共に、天然系抗酸化活性物質を含むことができる。
【００４２】
天然系抗酸化物質としては、例えばビタミンＡ、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、これらビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物などが挙げられる。
【００４３】
テルペノイド類としては、β−カロテン、ゲニポシジン酸、カルノソール、ソイサポニン、クロモサポニンＩなどを、フラボノイド類としては、ケルセチン、ミリセチン、ケンフェロール、ケルセチンルチノシド、ビロバライド、ジンクゴライド、タキシフォリン、さらにはエピガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピカテキンなどのカテキン誘導体などを、他のフェノール化合物としては、カフェ酸、クロロゲン酸、ロスマリン酸などのフェノール酸、クルクミン、セサモール、ピノレシノール、ジンゲロンなどを例示することができる。
【００４４】
ビタミンＣ類縁体として、ビタミンＣのリン脂質誘導体を用いることができる。水溶性のラジカル捕捉剤であるビタミンＣをホスホリパーゼＤを用いてリン脂質誘導体とすることにより、水層で発生したラジカルによる脂質過酸化反応を、ビタミンＣよりも効率よく抑制することができる。
【００４５】
本発明においては、前記天然系抗酸化物質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【００４７】
製造例１ ＭＦＰの製造
（１）羽毛のアルカリ処理
成鶏処理場で副生する産卵鶏羽毛を通常の脱毛ラインから直接、鮮度よく採取して狭雑物を除去し、羽毛を超音波洗浄装置で適宜な温度および時間で洗浄したのち、細断機でカットし脱水して密封梱包後、冷暗所に保存したものを原料として使用した。
４質量％ＮａＯＨ水溶液１ｋｇに前記脱水羽毛２００ｇ（乾物質量１００ｇ）を加えて室温で攪拌した。羽毛がダウン状になったのち、反応液を加温して７０℃に保持し、ダウンおよび芯部が完全に溶解するまで、５時間攪拌を続けた。
反応終了後、反応液を冷却しながら、１モル／Ｌ濃度の塩酸を滴下して、残存アルカリおよび硫化物を中和した。なお、反応液中に残存する硫化水素は、硫化水素トラップ剤を加え、加熱して完全に除去した。
次に、この中和処理液を、セライトをろ過助剤に使用して、常法により吸引ろ過した。
【００４８】
（２）脱塩・分取
上記（１）で得られたろ液を、以下のようにして限外ろ過し、分子量１万以下、１万超５万以下および５万超の３フラクションを質量比２：７：１の割合で分取した。
・使用装置：アドバンテック東洋（株）製
攪拌型ウルトラホルダー ＵＨＰ−９０Ｋ
使用フィルター ＵＫ−１０（分子量１万以下の物質を透過）
ＵＫ−５０（分子量５万以下の物質を透過）
・操作：マニュアル通り
各フラクション毎にロータリーエバポレーターで適宜に濃縮し、市販装置で凍結乾燥に供した。１万超５万以下のフラクション（ＭＦＰ）の乾燥収量は４９ｇ（原料からの収率は４９％）であった。
【００４９】
（３）ＭＦＰ（分子量１万超５万以下）の特性
（イ）分子量分布（水系ＧＰＣ法）
下記の装置を使用して、標準タンパク質（下記）と対比させてＭＦＰ（１万超５万以下の限外ろ過膜により調製）の相対分子量（ｋＤａ）分布を測定した。
結果は、９．６ｋＤａ及び１０．８ｋＤａにメインピークが測定された。
・装置 ＨＰＬＣ装置 ：東ソー（株）製 ＣＣＰＭ−II
カラムオーブン：東ソー（株）製 ＣＯ−８０２０（３０℃）
検出器 ：東ソー（株）製 ＳＤ−８０２２
データ処理装置：ジーエルサイエンス（株）製 Vstation
Ver.1.65
・カラム：Shodex Asahi Pak GF310 HQ（８ｍｍφ×３００ｍ）
適用分子量範囲；〜５０，０００
・標準タンパク質：１，３５０〜６７，０００の分子量範囲の５種のタンパク質
（BIO-RAD Filtration Standard）
・測定条件
バッファー ：リン酸水素２ナトリウム ０．１モル／Ｌ
同 ｐＨ ：９．０４（無調整）
流速 ：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検体液注入量：２０μｌ
測定時間 ：６０ｍｉｎ
（ロ）溶解特性
水に極めてよく溶ける。油（中性植物油脂）にも僅かに溶け、両親媒性を有する。
【００５０】
製造例２ ＵＶＰの製造
（１）ＵＶ−Ｃ照射処理
製造例１においてアルカリ反応液を脱塩し分子量１万超５万以下の限外ろ過液を固形分濃度２質量％に調整して、下記のＵＶ−Ｃ照射反応装置に仕込み、除熱しながら室温下で６０時間ＵＶ−Ｃの照射処理を行った。
・紫外線照射ランプ：冷陰極殺菌ランプＱＣＧＬ−５Ｗ（岩崎電気（株）製）
波長 ＵＶ−Ｃ８０％（含、１８０ｎｍを２０％）
照射強度 ３５μＷ／ｃｍ２；５ｃｍ
８００μＷ／ｃｍ２；１ｃｍ
・反応装置：反応液を入れたガラスビーカーに紫外線ランプを直接挿入し、マグ ネチックスターラーで攪拌する。ビーカーを外部冷却する。
反応終了液を、セライトをろ過助剤としてろ過したのち、常法通り濃縮、凍結乾燥してＵＶＰ粉末を収率８４％で得た。
【００５１】
（２）ＵＶＰの特性
（イ）分子量分布
水系ＧＰＣスペクトルを測定したところ、原料ＭＦＰと類似の分子量分布パターンを示した。
（ロ）溶解性能
水に極めてよく溶け、油にも僅かに溶ける両親媒性を有する。
【００５２】
実施例１
ＭＦＰによるヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の酸化作用抑制効果
フェントン（Fenton）反応によって生成したヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解反応によって生成するマロンジアルデヒドを、ＴＢＡ法（チオバルビツール酸法）によって測定し、ＭＦＰによるヒドロキシルラジカルの酸化作用抑制効果を調べた。
【００５３】
（１）各試薬の調製
（ａ）１００μモル／Ｌ Ｆｅ２＋／ＥＤＴＡ溶液
硫酸第一鉄［ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、和光純薬工業（株）製］とエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩・２水和物［ＥＤＴＡ、（株）同仁科学研究所製］の１ｍモル／Ｌ混合水溶液を調製し、さらにリン酸緩衝液（０．１モル／Ｌ、ｐＨ７．４）を用い、１００μモル／Ｌに希釈して調製した。
（ｂ）１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水
過酸化水素水［Ｈ２Ｏ２３１質量％含有水溶液、三菱瓦斯化学（株）製、特級過酸化水素水］を使用直前に、前記リン酸緩衝液で１０ｍモル／Ｌになるように希釈して調製した。
（ｃ）１０ｍモル／Ｌ ２−デオキシリボース溶液
２−デオキシリボース［２−デオキシ−Ｄ−リボース、和光純薬工業（株）製］を、前記リン酸緩衝液を用いて１０ｍモル／Ｌになるように調製した。
（ｄ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を、前記リン酸緩衝液を用いて１０ｍｇ／ｍｌになるように調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｅ）ＴＢＡ法発色試薬
２．８質量％トリクロロ酢酸溶液［トリクロロ酢酸：和光純薬工業（株）製］、及び１質量％ ２−チオバルビツール酸溶液［ＭＥＲＣＫ社製、２−チオバルビツール酸と５０ｍモル／Ｌ ＮａＯＨ溶液を用いて調製］をそれぞれ調製した。
【００５４】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に、１００μモル／Ｌ Ｆｅ２＋／ＥＤＴＡ溶液、１０ｍモル／Ｌ ２−デオキシリボース溶液及び各種濃度のＭＦＰ溶液を各１００μｌ、前記リン酸緩衝液を全量が０．９ｍｌになるように加え、混合した。
次いで、１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水を１００μｌ添加し、攪拌して反応を開始し、３７℃、４時間インキュベートした。反応終了後、２．８質量％トリクロロ酢酸溶液、１質量％ ２−チオバルビツール酸溶液を０．５ｍｌずつ添加し攪拌後沸騰水中で１０分間加熱し発色させた。冷却後、分光光度計［ＢＥＣＫＭＡＮ社製、「ＤＵ−７５００」］を用いて５３２ｎｍでの吸光度を測定した。測定値は発色時のε＝１．５６×１０−５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてマロンジアルデヒドとしてＴＢＡＲＳ量を算出した。また使用した各濃度のＭＦＰ溶液における酸化作用抑制効果を、下式
酸化作用抑制効果（％）
＝［１−ＯＤ５３２（サンプル）／ＯＤ５３２（無添加）］×１００
より算出した。なおＯＤ５３２は５３２ｎｍでの吸光度である。
結果を表１に示すと共に、図１に示す。図１は、ヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【００５５】
【００５６】
実施例２
ＭＦＰによるヒドロペルオキシドラジカル（・ＯＯＨ）の酸化作用抑制効果
赤血球膜ゴーストを調製し、ヒドロペルオキシドラジカルによって過酸化脂質を誘導し、生成した過酸化脂質をＴＢＡ法によって測定し、ＭＦＰによるヒドロペルオキシドラジカルの酸化作用抑制効果を調べた。
【００５７】
（１）各試薬の調製
（ａ）赤血球膜ゴースト
兎保存血液［日本バイオテスト社製］１００ｍｌと、等張液（１０ｍモル／Ｌリン酸、１５２ｍモル／Ｌ ＮａＣｌ［和光純薬工業（株）製］、ｐＨ７．４）１５０ｍｌをよく混和し、高速冷却遠心機［日立工機（株）製、「Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｆ」］により、４℃、１５００Ｇ（３５００ｒｐｍ）にて２０分間遠心分離処理した。
上清部分（血清など）をデカンテーション法で除去し、沈殿した赤血球を同様に等張液で計３回洗浄した。洗浄した赤血球（２０ｍｌ）に低張液（１０ｍモル／Ｌ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）１００ｍｌをよく混和し、４℃に１５分ほど静置した後、４℃、２００００Ｇ（１１０００ｒｐｍ）で４０分間遠心分離処理した。ヘモグロビンを含む上清と緩い沈殿（ゴースト部分）、側底に固着したごく少量の堅い沈殿に分かれるので注意深く上清を除去した。ゴースト部分を同様に低張液で４回洗浄した。次第に赤色が抜けて薄いピンク色がかった赤血球膜ゴースト約２０ｍｌを得た。あらかじめ予備テストを行ってＴＢＡ法での吸光度が０．３〜０．３５程度になるようにゴーストの濃度を調整した。
（ｂ）２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液
tert−ブチルヒドロペルオキシド溶液［Aldrich Chemical社製、７０質量％水溶液］を希釈して、２４ｍモル／Ｌ溶液を調製した。
（ｃ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、２００ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｄ）ＴＢＡ法発色試薬
２モル／Ｌ トリクロロ酢酸の１．７モル／Ｌ ＨＣｌ溶液［トリクロロ酢酸：和光純薬工業（株）製］、および０．６７質量％ ２−チオバルビツール酸溶液［２−チオバルビツール酸：ＭＥＲＣＫ社製］を調製した。
【００５８】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に赤血球膜ゴースト０．４５ｍｌ、各濃度のＭＦＰ溶液０．０２５ｍｌを入れ、よく混和しておく。これに、２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液０．０２５ｍｌを加えて反応開始した。３７℃、２０分インキュベート後、２モル／Ｌ トリクロロ酢酸溶液０．５ｍｌ、０．６７質量％ ２−チオバルビツール酸溶液１ｍｌを加えてよく混和し、沸騰水中で１５分加熱した。
発色後直ちに冷却し、卓上遠心分離機［日立工機（株）製、「Ｈｉｍａｃ ＣＴ６０」］により３５００ｒｐｍで遠心分離処理したのち、上清を分光光度計［ＢＥＣＫＭＡＮ社製、「ＤＵ−７５００」］を用いて５３２ｎｍでの吸光度を測定した。測定値はＭＤＡ法発色時のε＝１．５６×１０−５Ｍ−１ｃｍ−１を用いてマロンジアルデヒドとしてＴＢＡＲＳ量を算出した。
結果を図２に示す。図２は、赤血球膜ゴーストの酸化に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【００５９】
実施例３
赤血球膜ゴーストの酸化の抑制におけるＭＦＰとビタミンＥ、ビタミンＣとの相乗効果について調べた。
【００６０】
（１） 各試薬の調製
赤血球膜ゴースト、tert−ブチルヒドロペルオキシド溶液、ＴＢＡ法発色試薬は実施例２と同様に調製した。
（ａ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、１６０ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製した。
（ｂ）１．６ｍｇ／ｍｌ ビタミンＥ溶液
ＤＬ−α−トコフェロール［和光純薬工業（株）製］の１．６ｍｇ／ｍｌ メタノール溶液を調製した。
（ｃ）１．６ｍｇ／ｍｌ ビタミンＣ水溶液
Ｌ−アスコルビン酸［和光純薬工業（株）製］を用い、１．６ｍｇ／ｍｌ 水溶液を調製した。
【００６１】
（２）操作
スクリューキャップ付き試験管に赤血球膜ゴースト０．４５ｍｌ、ＭＦＰ溶液０．０１２５ｍｌを入れ、さらに０．０１２５ｍｌビタミンＥ溶液あるいはビタミンＣ水溶液を加えてよく混和しておく。これに、２４ｍモル／Ｌ ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液０．０２５ｍｌを加えて反応開始した。以下は実施例２と同様の操作を行って反応、発色し、ＴＢＡＲＳ量を算出した。
結果を図３に示す。
なお、図において、ＶＣはビタミンＣ、ＶＥはビタミンＥを示す。
【００６２】
実施例４
ＭＦＰによるミエロペルオキシダーゼ活性の阻害効果
（１）各試薬の調製
（ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）溶液
ヒト由来のミエロペルオキシダーゼ［ＭＰＣ社製］を、リン酸緩衝液［リン酸０．１モル／Ｌ、ＤＴＰＡ（ジエチレントリスミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（同仁科学研究所製））１００μモル／Ｌ、ｐＨ７．４］で１１単位／ｍｌになるように調製した。
（ｂ）１０ｍモル／Ｌ チロシン溶液
Ｌ−チロシン［和光純薬工業（株）製］を、０．１モル／Ｌ ＨＣｌ溶液で１０ｍモル／Ｌ チロシン溶液を調製した。
（ｃ）１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水
過酸化水素水［Ｈ２Ｏ２１質量％含有水溶液、三菱瓦斯化学（株）製、特級過酸化水素水］を使用直前に１０ｍモル／Ｌになるように調製した。
（ｄ）ＭＦＰ溶液
製造例１で得たＭＦＰ粉末を用い、１００ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製し、さらに各種濃度の希釈液を調製した。
（ｅ）１０ｍモル／Ｌ ビタミンＥ溶液
ＤＬ−α−トコフェロール［和光純薬工業（株）製］の１０ｍモル／Ｌ メタノール溶液を調製した。
（ｆ）１ｍモル／Ｌ ビタミンＣ水溶液
Ｌ−アスコルビン酸［和光純薬工業（株）製］を用い、１ｍモル／Ｌ 水溶液を調製した。
（ｇ）１ｍｇ／ｍｌ カタラーゼ溶液
カタラーゼ［和光純薬工業（株）製］を用い、１ｍｇ／ｍｌ カタラーゼ水溶液を調製した。
【００６３】
（２）操作
マイクロテストチューブに、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）溶液をＭＰＯが１．１単位／ｍｌになるように、１０ｍモル／Ｌ−チロシン溶液をＬ−チロシンが２００μモル／Ｌになるように、ＭＦＰ溶液をＭＦＰが０〜１０ｍｇ／ｍｌになるように、ＤＴＰＯ添加リン酸緩衝液中で混合し、１０ｍモル／Ｌ 過酸化水素水を過酸化水素が２００μモル／Ｌになるように添加して反応を開始した。ビタミンＥ、ビタミンＣを加える場合は、それぞれ１ｍモル／Ｌ、０．１ｍモル／Ｌになるように、１０ｍモル／Ｌ ビタミンＥ溶液および１ｍモル／Ｌ ビタミンＣ水溶液を添加した。
３７℃で３０分間インキュベート後、１ｍｇ／ｍｌカタラーゼ溶液を、カタラーゼが２５μｇ／ｍｌになるように加えて、１５分間室温に放置して反応を停止した。全量を「ultrafree ＭＣ」［ミリポア社製］に移し、高速冷却遠心機［日立工機（株）製、Ｈｉｍａｃ ＣＲ１５−Ｔ］により、４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理したのち、ろ過液をＨＰＬＣ分析した。
【００６４】
＜ＨＰＬＣ条件＞
高速液体クロマトグラフ：日本分光社製（ＰＵ−９８０，ＬＧ−９８０−２，ＤＧ−９８０−５０）のシステムを使用
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶媒 ：０．５質量％酢酸／メタノール容量比＝２９／１
流速 ：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出 ：蛍光検出器［日本分光社製、「ＦＰ−１５２０Ｓ」］を用い、励起３００ｎｍ、蛍光４００ｎｍで行う。
保持時間：約１１分
検出されるジチロシンのピークの面積を測定し［島津製作所社製、「クロマトパックＣ−Ｒ６Ａ」］、ＭＦＰ無添加を１として相対値を算出した。
結果を図４、図５および図６に示す。図４は、ＭＦＰによるジチロシン生成に対する抑制効果、図５は、ジチロシン生成抑制におけるＭＦＰとビタミンＣの相乗効果および図６は、ジチロシン生成抑制におけるＭＦＰとビタミンＥの相乗効果を示すグラフである。
なお、図において、ＶＣはビタミンＣ、ＶＥはビタミンＥを示す。
【００６５】
実施例５
ＵＶＰは、ＭＦＰと同様にヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の酸化作用抑制効果、ヒドロペルオキシドラジカル（・ＯＯＨ）の酸化作用抑制効果及びミエロペルオキシダーゼ活性の阻害効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の活性酸素生成抑制物質は、鳥類の羽毛から得られた水溶性ケラチン誘導体であって、生体内の組織や細胞に損傷を与える酸素障害に関与する活性酸素の生成を効果的に抑制することができ、機能性食品素材として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】実施例１における、ヒドロキシルラジカルによるデオキシリボースの酸化分解に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【図２】実施例２における、赤血球膜ゴーストの酸化に対するＭＦＰの抑制効果を示すグラフである。
【図３】実施例３における、赤血球膜ゴーストの酸化の抑制に対するＭＦＰとビタミンＣ、ＭＦＰとビタミンＥとの相乗効果を示すグラフである。
【図４】実施例４における、ＭＦＰによるジチロシン生成に対する抑制効果を示すグラフである。
【図５】実施例４における、ジチロシン生成に対するＭＦＰとビタミンＣとの相乗効果を示すグラフである。
【図６】実施例４における、ジチロシン生成に対するＭＦＰとビタミンＥとの相乗効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質。
【請求項２】
活性酸素が、１Ｏ２、ＯＣｌ−、・ＯＨ、Ｏ２−およびＨ２Ｏ２の中から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項３】
ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）活性を阻害する請求項１または２に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項４】
ジチロシン生成を抑制する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項５】
水溶性ケラチン誘導体および改質水溶性ケラチン誘導体の分子量が、それぞれ５〜５０ｋＤａである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする機能性食品素材。
【請求項７】
さらに、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、これらのビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物の中から選ばれる少なくとも１種の天然系抗酸化活性物質を含む請求項６に記載の機能性食品素材。
【請求項１】
鳥類の羽毛をアルカリ処理して得られた水溶性ケラチン誘導体および／またはそれに高エネルギー線を照射して得られた改質水溶性ケラチン誘導体からなる活性酸素生成抑制物質。
【請求項２】
活性酸素が、１Ｏ２、ＯＣｌ−、・ＯＨ、Ｏ２−およびＨ２Ｏ２の中から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項３】
ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase）活性を阻害する請求項１または２に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項４】
ジチロシン生成を抑制する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項５】
水溶性ケラチン誘導体および改質水溶性ケラチン誘導体の分子量が、それぞれ５〜５０ｋＤａである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の活性酸素生成抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする機能性食品素材。
【請求項７】
さらに、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、これらのビタミン類の類縁体、テルペノイド類、フラボノイド類および他のフェノール化合物の中から選ばれる少なくとも１種の天然系抗酸化活性物質を含む請求項６に記載の機能性食品素材。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１０６６９５（Ｐ２００７−１０６６９５Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９８９０６（Ｐ２００５−２９８９０６）
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５９９０４６２５４）有限会社梅田事務所 (11)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（５９９０４６２５４）有限会社梅田事務所 (11)
【出願人】（５０４１３９６６２）国立大学法人名古屋大学 (996)
【Ｆターム（参考）】
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