温度敏感性ナノ運搬体
【課題】本発明の方法によると、ナノ運搬体を単一相で製造することができる。本発明によると、従来技術の問題点、例えば、有害な有機溶媒の利用、複雑な過程、高い生産単価及び低いローディング能力などを解決することができる。また、従来技術において通常的に用いられる高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないため、本発明は、ローディングされる薬物の安定性を担保することができる。
【解決手段】（ａ）光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射し、前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法、また、温度敏感性ナノ運搬体に関するものである。本発明のナノ運搬体は、温度敏感性を有し、温度変化に対応して可逆的に直径及び瞳孔の大きさが変わる。
【解決手段】（ａ）光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射し、前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法、また、温度敏感性ナノ運搬体に関するものである。本発明のナノ運搬体は、温度敏感性を有し、温度変化に対応して可逆的に直径及び瞳孔の大きさが変わる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度敏感性ナノ運搬体(Temperature−Sensitive Nanocarriers)に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
治療用蛋白質や薬物を生体内に伝達するために用いられる大部分のナノ粒子は、有機溶媒を用いる乳剤蒸発（emulsion evaporation）方法を通じて製造されるため、製造から乾燥時までの製造工程が複雑であり、時間がかなり掛かり、有機溶媒の使用による費用も増え、また、有機溶媒の使用により生体内に問題点を惹起させることがある（T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 8（2007）650−656；T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 7（2006）186４−1870；D．T．Birnbaum，et al.，J．Control．Rel．65（2000）375−387）。このような理由で、多くの研究者らは、ナノ粒子に充填される薬物の変性及びそれらの安定性確保のために、新たなナノ粒子の製造技術開発に多くの時間を投資している。
【０００３】
乳剤蒸発方法の問題点を解決するために、他の研究者らは超臨界流体を用いてナノ粒子を製造した。しかし、この工程は、大部分の医療用高分子が超臨界流体に溶解性が制限的であり、広く用いられていない（K．S．Soppimath et al.，J．Control．Rel．70（2001）1−20）。
【０００４】
また、米国特許第５,０１９,４００号においても生体適合性高分子であるポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（以下、「ＰＬＧＡ」）を超低温冷媒に噴射して蛋白質薬物伝達用マイクロ粒子を製造したものの、ＰＬＧＡを溶解するために用いられる有機溶媒の疎水性によって問題点が発生した。
【０００５】
また、米国特許第６,５８６,０１１号でも蛋白質伝達用ナノ粒子システムを超低温冷媒に噴射する方式で製造しているが、ナノ粒子製造の際に用いられる架橋剤によって蛋白質の安定性に深刻な問題点が惹起された。
【０００６】
また、ナノ粒子を製造する方法で、溶媒蒸発法（solvent evaporation）が用いられるが、この方法も有機溶媒の使用によって様々な問題点を惹起させた。一方、疎水性と毒性の強い有機溶媒の使用の代わり、水とよく混じる有機溶媒（アセトン等）を用いてポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸）（以下、「ＰＬＡ」）ナノ粒子を製造する塩析技法（salting−out）も開発されたものの、蛋白質薬物の活性低下及び安定性問題は解決されなかった（E．Allemann et al.，Pharm．Res．10（1993）1732−1737）。
【０００７】
本明細書の全てに亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表されている。引用されている論文及び特許文献の開示内容は、その全てが本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５,０１９,４００号
【特許文献２】米国特許第６,５８６,０１１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 8（2007）650−656
【非特許文献２】T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 7（2006）186４−1870
【非特許文献３】D．T．Birnbaum，et al.，J．Control．Rel．65（2000）375−387）
【非特許文献４】K．S．Soppimath et al.，J．Control．Rel．70（2001）1−20
【非特許文献５】E．Allemann et al.，Pharm．Res．10（1993）1732−1737）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、薬物運搬体のより効率的な製造方法を開発しようと努力した。その結果、光架橋結合可能な（photo−crosslinkable）作用基を有する水溶性の生体適合性重合体を適合する条件下で架橋結合させてナノ運搬体を製造する場合には、単一相（single phase）で容易に優れた特性を示すナノ運搬体が製造され得ることを確認することによって、本発明を完成するようになった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、徐放性薬物送達システム（drug delivery system）の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、温度敏感性、徐放性ナノ運搬体を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によると、本発明は（ａ）光架橋結合可能な（photo−crosslinkable）作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射して前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明者らは、薬物運搬体のより効率的な製造方法を開発しようと努力した。その結果、光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体を適合した条件下で架橋結合させてナノ運搬体を製造する場合には、単一相で容易に優れた特性を示すナノ運搬体が製造され得ることを確認した。
【００１７】
本明細書において、用語「生体適合性重合体」とは、生体組織または血液と接触して組織を壊死させるか、血液を凝固させない組織適合性（tissue compatibility）及び抗凝血性（blood compatibility）を有している高分子を意味する。用語「水溶性の生体適合性重合体」とは、水または水−混合性溶媒（water−miscible solvent：例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド）に溶解される生体適合性重合体、好ましくは、水に溶解される生体適合性重合体を意味する。
【００１８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明において用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体である。前記水溶性生体適合性重合体のうち、疎水性及び親水性部分を有しており、界面活性剤と類似している様相を示す重合体を用いる場合、好ましくは、この重合体に疎水性部分を追加的に導入させることが本発明において達成しようとする技術的目的に適合する。
【００１９】
より好ましくは、本発明で用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、ポロキサマー系列の重合体である。
【００２０】
最も好ましくは、本発明で用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００２１】
光架橋結合性作用基は、生体適合性重合体の両末端に結合することが好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００２３】
好ましくは、光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミン、またはケイ皮酸塩であり、より好ましくは、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレートまたはオリゴメタクリレートであり、最も好ましくはアクリレートである。
【００２４】
本発明の方法に適合した開始剤は特に制限されない。好ましくは、本発明に用いられ得る開始剤は紫外線または可視光線の照射によってラジカル（radical）反応を誘発することができるラジカル光開始剤（radical photoinitiator）である。本発明に用いられ得る光開始剤の例は、エチルエオシン、２,２−ジメトキシ−ペニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−ペニルアセトフェノン、２−ヒドロキシ−１−[４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル]−２−メチル−１−プロパノン（Irgacure 2959またはDarocur 2959）、カンファーキノン（camphorquinone）、アセトフェノン、アセトフェノンベンジルケタール、１−ヒドロキシシクロヘキシフェニルケトーン、２,２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、キサントン、フルオレノン、ベンズアルデヒド、フルオレン、アントラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール、３−メチルアセトフェノン、４−クロロベンゾフェノン、４,４’−ジメトキシベンゾフェノン、４,４’−ジアミノベンゾフェノン、ベンゾインプロピルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンジルジメチルケタール、１−（４−イソプロフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−オン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、チオクサントン、ジエチルチオクサントン、２−イソプロピルチオクサントン、２−クロロチオチオキサントン、２−メチル−１−[４−（メチルチオ）フェニル]−２−モルホリノ−プロパン−１−オン、２,４,６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキサイド及びｂｉｓ−（２,６−ジメトキシベンゾイル）−２,４,４−トリメチルペンチルホスフィンオキシドを含む。
【００２５】
下記の実施例に記載のように、本発明の具体的な一実施例において Irgacure 2959を用い、これは、生体内毒性が非常に少ない開始剤として知られている（Kristi S. Anseth, et al., Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2000. 11（5）：P.439−457）。
【００２６】
段階（ｃ）で、可視光線または紫外線を照射することにより、重合体の光架橋結合性作用基を通じて重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する。好ましくは、架橋結合のために紫外線が用いられる。本発明の具体的な一実施例によると、紫外線照射のために薄層クロマトグラフィー（Thin Layer Chromatography）用紫外線ランプが用いられ得、これは他の硬化用紫外線ランプに比して値段が安く、容易に得ることができる長所を有しており、特定の３６５ｎｍ波長の紫外線照射によってフリーラジカルを発生させる開始剤（例えば、Irgacure 2959）にも適合する。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、段階（ｃ）のナノ運搬体を段階（ａ）の重合体と異なる種類の生体適合性／生体機能性重合体で官能化（functionalization）させる段階（ｄ）を追加的に含む。この場合、用いられ得る生体適合性／生体機能性重合体は、ヘパリン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、キト酸、コンドロイチン、硫酸、デルマタン５−硫酸（dermatan 5−sulfate）、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリエチレンイミン及びポリリシンを含むが、これに限定されるのではない。例えば、ヘパリンは生体内毒性のない生体適合性重合体であって、米国ＦＤＡが承認している陰イオン性多糖類である。
【００２８】
本発明の好ましい具現例によると、前記段階（ａ）−（ｃ）は有機分散相を用いずに、水溶液分散相単独で実施されることである。即ち、単一相でナノ運搬体の製造が全て行われる。より詳しくは、生体適合性重合体及び開始剤が分散されている水溶液に光を照射することによって、ナノ運搬体の完全な製造が行われる。さらに、本発明の反応は、ｏｎｅ−ｐｏｔ反応で実施することができる。このような側面から、本発明の方法は、「ワン−ポット、単一相合成方法（one−pot, single phase synthesis）」と言える。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加し、逆に温度が上がると、その直径が減少する。好ましくは、４℃の条件におけるナノ運搬体の直径は、４０℃における直径に比べて３−２０倍、より好ましくは４−１５倍、さらに好ましくは５−１２倍、最も好ましくは７−１０倍増加する。
【００３０】
本発明のナノ運搬体のこのような直径の増減は可逆的である。
【００３１】
直径の増減に従い、ナノ運搬体に形成された瞳孔の大きさは変わることになる。例えば、低温（例えば、４℃）で、瞳孔の大きさが増加したナノ運搬体に運搬しようとする薬物を捕集（encapsulation）させた後、これを人体に適用すると、瞳孔の大きさが減少して捕集された薬物の徐放（sustained release）が行われる。
【００３２】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃における瞳孔の大きさは３−２０ｎｍであり、より好ましくは３−１５ｎｍ、最も好ましくは５−１０ｎｍである。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子（nanoparticulate）である。下記の実施例において立証したように、本発明のナノ運搬体は、丸い状を有するナノ粒子の形態を有する。本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は、５０−５００ｎｍの直径、より好ましくは１００−４００ｎｍ、最も好ましくは１２０−３００ｎｍの直径を有する。本発明によるナノ運搬体は、滅菌過程を滅菌フィルターを用いて簡単に処理することができるという側面において、直径は２００ｎｍ以下であることが好ましい。また、ナノ運搬体の多分散（polydispersity）指数は０．１以下のものが有利であり、これは一般的に多分散指数が０．１以下の場合、安定した単分散分布を有するナノ粒子と見なすからである。ナノ運搬体の好ましい多分散指数は０．０１−０．１である。
【００３４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体の表面にはターゲッティングリガンドが結合されている。前記ターゲッティングリガンドの例は、ホルモン、抗体、細胞−接着蛋白質（cell−adhesion molecules）、糖類及び神経伝達者を含むが、これに限定されるのではない。
【００３５】
本発明の方法によると、従来技術の問題点、例えば有害な有機溶媒の利用、複雑な過程、高い生産単価及び低いローディング能力などを解決することができる。また、従来技術において、通常的に用いられる高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明の方法はローディングされる薬物の変性または凝集を避けることができる。
【００３６】
本発明の他の態様によると、本発明は（ａ）温度敏感性生体適合性重合体からなるナノ運搬体及び運搬対象の物質を混合する段階；及び（ｂ）前記混合物をインキュベート（incubating）して、運搬対象の物質をナノ運搬体の内部に自然的に捕集（spontaneous encapsulation）させる段階を含む徐放性薬物送達システムの製造方法を提供する。
【００３７】
本発明の徐放性薬物送達システムの製造方法は、上述した温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法と共通する内容を有し、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によると、前記水溶性の生体適合性重合体は、下記化学式１で示される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００４０】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基はアクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩である。
【００４１】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加する。
【００４２】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体はヒドロゲルでないナノ粒子である。本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍである。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は交差結合されたものである。
【００４４】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬され得る物質は制限されず、治療学的効能を示す多様な物質を含む。本発明の好ましい具現例によると、運搬対象の物質は、蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質である。
【００４５】
本発明の薬物送達システムによって運搬される蛋白質は特に制限されず、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質またはその一部分、抗体またはその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質またはその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及びワクチンなどを含むが、これに限定されない。より詳細には、本発明の薬物送達システムによって運搬される蛋白質はインスリン、ＩＧＦ−１（insulin−like growth factor １）、成長ホルモン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦｓ（granulocyte−colony stimulating factors）、ＧＭ−ＣＳＦｓ（granulocyte/macrophage−colony stimulating factors）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファ及びベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−２、ＥＧＦｓ（epidermal growth factors）、カルシトニン（calcitonin）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial cell growth factor）、ＦＧＦ（fibroblast growth factor）、ＰＤＧＦ（platelet−derived growth factor）、ＡＣＴＨ （adrenocorticotropic hormone）、ＴＧＦ−β（transforming growth factor beta）、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）、アトビスバン（atobisban）、ブセレリン（buserelin）、セトロレリクス（cetroreliｘ）、デスロレリン（deslorelin）、デスモプレシン（desmopressin）、ダイノルフィンＡ（dynorphin A）（１−１３）、エルカトニン（elcatonin）、エレイドシン（eleidosin）、エプチフィバチド（eptifibatide）、ＧＨＲＨ−II（growth hormone releasing hormone−II）、ゴナドレリ
ン（gonadorelin）、ゴセレリン（goserelin）、ヒストレリン（histrelin）、リュープリン（leuprorelin）、リプレシン（lypressin）、オクトレオチド（octreotide）、オキシトシン （oｘytocin）、ピトレシン（pitressin）、セクレチン（secretin）、シンカライド（sincalide）、テルリプレッシン（terlipressin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（thymosine）α１、トリプトレリン（triptorelin）、ビバリルジン（bivalirudin）、カルベトシン（carbetocin）、シクロスポリン、エキセディン（eｘedine）、ランレオチド（lanreotide）、ＬＨＲＨ（luteinizing hormone−releasing hormone）、ナファレリン（nafarelin）、副甲状腺ホルモン、プラムリンチド（praｍlintide）、Ｔ−２０（enfuvirtide）、サイマルファシン（thymalfasin）及びジコノチドを含むが、これに限定されるのではない。
【００４６】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬されることができる核酸分子は、例えばＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、プラスミド及びベクターを含むが、これに限定されるのではない。
【００４７】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬されることができるナノ粒子は、例えば金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄ナノ粒子、転移金属ナノ粒子及び金属酸化物ナノ粒子（例えば、フェライトナノ粒子）を含むが、これに限定されるのではない。例えば、本発明の薬物送達システムがフェライトナノ粒子を運ぶ場合には、ＭＲ（magnetic resonance）造影剤（imaging agent）として用いられ得る。
【００４８】
本発明の徐放性薬物送達システムを用いて蛍光物質を運ぶ場合、好ましくは、蛍光物質はキャリアに結合されている。例えば、蛍光物質を蛋白質または金属ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子）に結合させて用いることができる。前記蛍光物質の例はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアネートスチルベン−２,２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル−ピレンブチラート、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２,２’−ジスルホン酸誘導体、ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ６４０、 ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、リサミン、イソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネート、ジエチレントリアミンペンタアセテート、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸、２−ｐ−トーイジニル−６−ナフタレンスルホン酸、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、９−イソチオシアネートアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾクサゾイリル）フェニル）メレイミド、ベンゾクサジアゾル、スチルベン及びファイレンを含むが、これに限定されるのではない。
【００４９】
本発明の最も大きい特徴の１つは、ナノ運搬体に運搬対象の物質を捕集する過程で単純に前記２つの物質を混合すると、自然的に捕集（spontaneous encapsulation）されるということである。即ち、いかなる追加的な処理なしに、ナノ運搬体と運搬対象の物質が接触（contacting）することができるイベントのみを与えると、運搬対象の物質が自然的にナノ運搬体にローディングされるのである。
【００５０】
本発明の好ましい具現例によると、薬物をナノ運搬体に捕集させる場合、遺棄分散相を用いずに、水溶液分散相で実施する。
【００５１】
本発明の好ましい具現例によると、捕集させる段階は０−２０℃、より好ましくは４−１０℃、最も好ましくは４−６℃の温度条件で実施する。
【００５２】
本発明の徐放性薬物送達システムによる水溶液上での自然的捕集は、ローディングされる薬物、特に蛋白質医薬の安定性を大きく増加させることができる利点がある。自然的捕集によって本発明の薬物送達システムに薬物がローディングされるが、捕集効率（encapsulation efficiency）は９０％以上で非常に高い。さらに、薬物がローディングされる過程において有機溶媒が用いられず、高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明の方法はローディングされる薬物の変成または凝集を避けることができる。
【００５３】
本発明のまた別の態様によると、本発明は、末端にある光架橋結合性作用基を通じて、架橋結合されている水溶性の生体適合性重合体を含み、前記重合体は温度変化により直径が変わり、ヒドロゲルでないナノ粒子形態 （nanoparticulate form）を有することを特徴とする温度敏感性徐放性ナノ運搬体を提供する。
【００５４】
本発明の徐放性薬物送達システムは、上述した本発明の方法と共通する内容を有し、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００５５】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基はアクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩である。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００５７】
本発明の好ましい具現例によると、前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体である。
【００５８】
より好ましくは、水溶性の生体適合性重合体は、下記化学式１で表される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００５９】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加する。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は水溶液分散に分散されていることである。本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍである。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は、他の種類の生体適合性重合体で官能化されている。
【００６２】
本発明の好ましい具現例によると、ナノ運搬体はその内部に蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質を含む。
【００６３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体の表面には、ターゲッティングリガンドが結合されている。前記ターゲッティングリガンドの例は、ホルモン、抗体、細胞−接着蛋白質、糖類及び神経伝達者を含むが、これに限定されるのではない。
【発明の効果】
【００６４】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次のとおりである：
（i）本発明のナノ運搬体は温度敏感性を有し、温度変化に対応して可逆的に直径及び瞳孔の大きさが変わる。
（ii）本発明の方法によると、ナノ運搬体をワン−ポット単一相で製造することができる。
（iii）本発明のナノ運搬体に薬物が自然的に捕集されることができる。
（iv）本発明のナノ運搬体は、人体内の温度条件で瞳孔の大きさが減少して徐放性薬物送達システムとして用いられ得る。
（v）本発明によると、従来技術の問題点、例えば有害な有機溶媒の利用、複雑な過程、高い生産単価及び低いローディング能力などを解決することができる。
（vi）また、従来技術において通常的に用いられる高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明はローディングされる薬物の安定性を担保することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の単一相光重合反応によるプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造過程を示す概略図である。
【図２】ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣ分析（パイレン利用）結果を示すグラフである。
【図３ａ】４℃から４０℃までの温度変化によるうプルロニック−基盤ナノ運搬体の大きさの変化を示すグラフである。
【図３ｂ】４℃で測定したナノ運搬体の単分散分布図を示すグラフである。
【図３ｃ】３７℃で測定したナノ運搬体の単分散分布図を示すグラフである。
【図４】２０℃と３７℃との間での温度スイングによる本発明のナノ運搬体の可逆的大きさの変化を示すことであって、ＤＬＳで測定されたものである。
【図５】プルロニック−基盤ナノ運搬体のイメージである。（ａ）４℃及び（ｂ）３７℃で前平衡な（pre−equilibrated）試料、（ｃ）５ｎｍ金ナノ粒子をローディングした以後の試料に対する透過電子顕微鏡（Transmission electron microscopy）イメージである。パネルｄはＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングされたプルロニック−基盤ナノ運搬体に対する逆象蛍光顕微鏡のイメージである。
【図６】プルロニックＦ １２７（ＰＦ １２７）、ジアクリル化プルロニックＦ １２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）及びＤＡ−ＰＦ １２７の光架橋結合によって製造されたナノ運搬体のＦＴ−ＩＲスペクトラムである。
【図７】３７−４℃の温度変化で本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体からＦＩＴＣ−ＢＳＡが放出されるパターンを示す。
【図８】プルロニック−基盤ナノ運搬体から金ナノ粒子（５ｎｍ及び１０ｎｍ大きさ）が放出されるパターンを示す。
【図９】プルロニックの基本構造及び多様なプルロニック中、プルロニックＦ−１２７（ＰＦ １２７）とプルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）の構造的な特性を示す。
【図１０】４℃から４０℃までの温度変化による０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）の大きさの変化を示すグラフである。
【図１１】水溶液で、時間による金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を示したグラフである。
【図１２】水溶液で、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７）にローディングされた金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を、時間によって観察したグラフである。
【図１３】水溶液で、０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）にローディングされた金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を、時間によって観察したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明しようとする。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨から、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００６７】
実験材料
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（E100P65E100，MW12,600）（ＰＦ １２７）をＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．（Seoul，Korea）から入手した。アクリロイルクロライド、トリエチルアミン及び無水トルエンはＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee，WI，USA）から購入した。４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトン（Irgacure 2959）はＣｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Basel，Switzerland）から購入した。ポタシウムブロマイド、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（fluorescein isothiocyanate−labelled bovine serum albumin）、ポタシウムフォスフェイトモノベイシック、ソジウムフォスフェイトジベイシック及びソジウムアジドはＳｉｇｍａ（St. Louis，MO，USA）から購入した。ソジウムクロライド及びポタシウムクロライドはＭｅｒｋ（Darmstadt，Germany）から購入した。ＮａｎｏｓｅｐＴＭ遠心分離装置（MWCO 300 000）は、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ann Arbor，MI，USA）から購入した。透過膜[セルロースエステル（CE）、MWCO 300000 with a nominal pore size of 35nm]はＳｐｅｃｔｒｕｍ（Houston、TＸ、USA）の製品である。０．２μmセルロース滅菌シリンジフィルターはＷｈａｔｍａｎ（Florham Park、Ｎew Jersey、USA）から購入したものである。
【００６８】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の製造
図１で図示したような方法に従って、本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。プルロニックF−１２７（ＰＦ １２７）５ｇ及び１０倍モールのアクリロイルクロライドとトリエチルアミンを５０ｍＬ無水トルエンで一夜の間アルゴン大気下で攪拌させ、ＰＦ １２７のヒドロキシル基をアクリル化した。収得した重合体を無水ジエチルエーテルで沈殿させて濾過した後、真空下で３日間乾燥させた。アクリル化程度は、３００ ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピー（JNM−LA300WB FT−NMR Spectrometer、JEOL、Japan）を用いて測定し、９８％以上アクリル作用基で置換されたジアクリレートプルロニックＦ−１２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）が製造されることを確認した。
【００６９】
ＤＡ−ＰＦ １２７を脱イオン水に溶解し、１０．０％（ｗ／ｗ）の前駆体溶液を製造した後、該溶液を常温で蒸溜水に希釈することによって、多様な濃度（１．４，０．７７，０．５０，０．３３，０．２０％（ｗ／ｗ））を有する溶液を製造した。希釈された前駆体溶液に７０％エタノールに溶かした光開始剤Irgacure ２９５９を０．０５％（ｗ／ｗ）量で添加した。引き続き、フィルターを除去した１．３ｍＷ／ｃｍ２紫外線ランプ（VL−4.LC，8W，Vilber Lourmat，France）を光源にて一定時間５、１０、１５分間、光照射してプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。ナノ運搬体溶液に存在する不純物は、ＮａｎｏｓｅｐＴＭでスピン濾過（１４，０００ｒｐｍ、１０分）を通じて除去され、回収されたナノ運搬体を蒸溜水に再分散した。
【００７０】
CMC（critical micelle concentration）の測定
ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣは、ピレンを蛍光プローブで用いて測定した（K. C. Cho，et al.，Macromol. Res.，2006，14，348）。アセトンに溶解したピレン（Aldrich，Milwaukee，WI，USA）を脱イオン水に添加して、６ｘ１０−６Ｍの溶液を製造し、引き続き５時間真空乾燥してアセトンを除去した。ＤＡ−ＰＦ １２７の濃度を０．０００１〜１ｗｔ％で多様にし、ピレン溶液（最終濃度：６ｘ１０−７Ｍ）と反応させた。ＤＡ−ＰＦ １２７及びピレンの混合溶液を暗条件下で３０分間室温で反応させた。スペクトロフルオロフォトメーター（Shimadzu，RF−5301PC，Kyoto，Japan）を用い、３３９ｎｍの勵起波長及び３９０ｎｍの放出波長で蛍光スペクトラムを測定した。
【００７１】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性研究
本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体の水力学的直径及び表面電荷は１０ｍＷ Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３２．８ｎｍ）が装着された電気泳動（Electrophoretic）光スキャタリングスペックトロフォトメーター（ELS−8000、Otsuka Electronics Co.，Japan）を用いて試料に対して９０゜の散乱角度にして測定した。温度を調節し、測定は３回反復実施した。また、温度サイクリングの間のナノ運搬体の熱−可逆性は、２０℃及び３７℃で反復的にサイクリングして分析した。２００ｋＶ電圧で作動する透過電子顕微鏡（JEM−2100，JEOL，Japan）を用いてプルロニック−基盤ナノ運搬体のイメージを得た。４℃、２５℃または３７℃で前−平衡なプルロニック−基盤ナノ運搬体懸濁液（０．７７ｗｔ％ ｗｉｔｈ １５ ｍｉｎ ＵＶ−照射）２０μＬを２００−メッシュ炭素コーティングされた銅グリッド上に室温でドロップ−乾燥させてＴＥＭ試料を準備した。ＴＥＭイメージの最小５０ヶのナノ運搬体をカウンティングしてプルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径を決めた。金粒子（５ｎｍ）とナノ運搬体を４℃で反応させ、金粒子（５ｎｍ）−ローディングナノ運搬体を準備し、ＴＥＭイメージを得た。
【００７２】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の光−架橋程度を評価するためにＦＴ−ＩＲスペクトロフォトメーター（SPECTRUM 2000，Perkin−Elmer，USA）を用いた。プルロニック−基盤ナノ運搬体（０．７７ｗｔ％ ｗｉｔｈ １５ ｍｉｎ ＵＶ−照射で製造される）を凍結乾燥し、クラインディングで粉末化した後、ＫＢr薄膜にマウンティングした。４０００ to ４００ｃｍ−１の波長範囲で２０スキャンで１ｃｍ−１の解像度でＩＲスペクトラムを得た。光−架橋後プルロニック−基盤ナノ運搬体に残存する二重結合は、１６３５ｃｍ−１（二重結合のＣ＝Ｃストレッチング）付近のＩＲピークによって分析した。
【００７３】
モデル蛋白質充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中に０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて、モデル蛋白質のＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Fluorescein isothiocyanate−labelled bovine serum albumin）を充填した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ｍＬ）にモデル蛋白質のＦＩＴＣ−ＢＳＡ ２００μｇを添加し、４℃で１２時間放置しながら、モデル蛋白質が自発的に膨張したナノ運搬体内に充填されるようにした。充填されないモデル蛋白質を常温でスピンフィルターを用いて除去した。
【００７４】
プルロニック−基盤ナノ運搬体のＦＩＴＣ−ＢＳＡ捕集効率及びローディング量は、室温で１４,０００ｒｐｍで１０分間スピン濾過した後、Ｆ．Ｑ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ.，２００８，３４９，２７４に記載の方法により計算した。ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングフラックサマナノ運搬体を逆象蛍光顕微鏡（TE2000−U，Nikon，Melville，NY，USA）で可視化した。
【００７５】
本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体から放出されるＦＩＴＣ−ＢＳＡを分析するために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングナノ運搬体懸濁液（０．５ｍＬ）を透過膜チューブに入れた。０．０５％ＮａＮ３があるＰＢＳ（phosphate buffered saline）５ｍＬに前記チューブを入れ、３７℃または４℃で３０ｒｐｍで攪拌しながら特定温度での放出パターンを分析した。それぞれの時点で全体放出ミディアムを新たなものと交替した。それぞれの時点での放出されたＦＩＴＣ−ＢＳＡの量はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−ＢｒａｄｆｏｒｄＴＭ ａｓｓａｙ（PIERCE，Rockford，IL，USA）を用いて分析した。全ての測定は３回反復的に実施した。
【００７６】
金ナノ粒子充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中に０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて、金ナノ粒子を充填した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ｍＬ）及び金ナノ粒子（５ and １０ｎｍ in size，Sigma，St. Louis，MO，USA）０．５ｍＬを混合して４℃で１２時間反応させた。ローディングされない金ナノ粒子を除去するために、スピン濾過を１４,０００ｒｐｍで１０分間室温で実施した。異なる大きさを有する金ナノ粒子の放出をＢＳＡと同様に実施し、放出量はCary １Ｅ ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペックトロフォトメーター（Varian，Melbourne，Australia）を用いて測定した。全ての測定は、３回反復的に実施した。
【００７７】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の製造（ＮＣ−ＰＦ６８）及び特性研究
米国ＦＤＡより承認を受けた多様なプルロニック中、前記実施例で製造したプルロニックＦ−１２７（ＰＦ １２７）のみならず、図９にて示すように構造的に特性において若干異なるプルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）を使用してプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。プルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）も前記実施例で提示した方法と同方法で９８％以上アクリル作用基で置換されたジアクリレートプルロニックＦ−６８（ＤＡ−ＰＦ ６８）を製造した。製造されたＤＡ−ＰＦ ６８を脱イオン水に溶解して１０．０％（ｗ/ｗ）の前駆体溶液を製造した後、該溶液を常温で蒸溜水に希釈することによって０．０５％（ｗ/ｗ）を有する溶液を製造し、前記実施例で示した光重合反応条件（光開始剤濃度：０．０５％（ｗ/ｗ）、光照射時間：１５分）を通じてナノ運搬体を製造した。前記実施例の結果として、図３（ａ）にて示すように、温度敏感性プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性を確認するために４℃から４０℃まで温度変化を与えることによりナノ運搬体の大きさの変化を観察した。
【００７８】
金ナノロッドが充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７）と０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて金ナノロッドを充電した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ ｍＬ）と金ナノロッド（平均大きさ：４０ ｎｍ、aspect ratio：３．９）０．５ｍＬを混合して４℃で１２時間反応させた。ロディングされていない金ナノロッドを除去するために、スピン濾過を１０ ０００ ｒｐｍで５分間実温で実施した。金ナノロッドが充電されたプルロニック−基盤ナノ運搬体は蒸留水に再分散させた後、実温で、時間による吸収波長スペクトラムの変化を８４５３ ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計（Agilent）を用いて分析した。全ての測定は３回反復的に実施した。
【００７９】
実験結果
光−架橋によるプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造
ＤＡ−ＰＦ １２７及び開始剤のみを含む水溶液を多様な条件で光−架橋させ、未反応電球重合体を除去するためにスピンフィルタリングを実施した。表１に記載されているように、簡単な光−架橋処理によって、比較的狭い大きさの分布を有するナノ粒子が形成された。開始剤の特定濃度（０．０５ｗｔ％）及び特定ＵＶ照射の強度（１．３ｍＷｃｍ−２）で０．５乃至１．４ｗｔ％の濃度範囲で光−架橋ナノ運搬体を収得した。２ｗｔ％以上ではマイクロメーターの大きさの凝集体が形成された。０．３３ｗｔ％濃度では１５分以上のＵＶ照射によって、光−架橋ナノ運搬体が製造された。前駆体濃度を０．２ｗｔ％以下にした場合には、ナノ粒子が検出されなかった。光−架橋ナノ運搬体を生成することができる前駆体の濃度範囲（０．３３〜１．４ｗｔ％）でナノ運搬体の平均径は、１１１±１９ｎｍから２１３±３２ｎｍまで徐々に増加した。逆に、特定前駆体の濃度で、光−架橋ナノ運搬体の平均の大きさは、ＵＶ照射時間を増やしても大きく増加しなかった。面白いことは、ＵＶ照射前には３０ｎｍ大きさ以上の粒子が観察されなかった。従って、ＤＡ−ＰＦ １２７の光−架橋によって、ナノ運搬体は形成された。また、ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣ（0.038wt％）以下の濃度では光−架橋ナノ運搬体が形成されなかった（図２）。結論的に、ＤＡ−ＰＦ １２７マイセルで、光重合反応によってナノ運搬体が形成されたことが分かる（図１）。下記表１は、多様な濃度の前駆体を用いて、製造（ＵＶの強度：１．３ｍＷｃｍ−２）されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の大きさを示すものであって、２５℃でＤＬＳにて測定したのである（平均±標準偏差ｎ＝３）。
【００８０】
【表１】
【００８１】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性研究
図３ａから分かるように、０．７７％（ｗ／ｗ）温度敏感性プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）は、４℃から４０℃まで温度を変化させることによって、４６０±３７ｎｍから５５±５ｎｍまでナノ運搬体の大きさの変化を見せ、また図３ｂと図３ｃに示しているように、４℃と３７℃で測定したナノ運搬体の単分散分布度は、製造されたナノ運搬体が均一であるということを見せる。一方、２０℃と３７℃との温度スイングにおける可逆的大きさ変化に関するデータ（図４）も本発明のナノ運搬体が安定性を有するということを裏付ける。
【００８２】
図５は、０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）の構造的な形態と大きさを透過電子顕微鏡で測定した結果であって、ナノ運搬体中に空間が存在することを示す。図５のＴＥＭイメージで、本発明のナノ運搬体は丸い状を有し、温度によって大きさが変わるということが分かる（図５のパネルａ及びｂ）。室温でプルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径は１６０±２０ｎｍであり、これは５０ヶ以上のナノ運搬体をカウンティングして決定したことであって、表１のＤＬＳデータと一致する。
【００８３】
図６で示したように、ジアクリレート作用基を有するプルロニックＦ−１２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）の光重合反応を通じて製造された０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）の架橋程度を赤外線分光器（Fourier Transform Infrared Spectroscopy、FT−IR）で測定した。アクリレート作用基の二重結合は、１６３５ｃｍ−１ ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒで測定されるが、光重合反応後、ナノ運搬体に存在する二重結合が完全に消えたことから１００％架橋されたことが分かる。
【００８４】
結論的に、本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体は、ＤＡ−ＰＦ １２７の完全な光重合によって形成され、これによって、十分な構造的安定性を有することが把握できる。
図１０にて示すように、０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８、光照射時間：１５分）は、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７、光照射時間：１５分）と同じ方法で４℃から４０℃まで温度変化を与えることにより、３８４±５１ ｎｍから９９±５ ｎｍまでナノ運搬体の大きさの変化を見せた。温度変化による特性はほぼ類似しているが、大きさにおいてＮＣ−ＰＦ ６８がＮＣ−ＰＦ １２７より多少大きいので、使用する物質によって大きさの調節が可能であることが把握できる。
【００８５】
モデル蛋白質及びモデルナノ粒子のローディング及び放出
ＦＩＴＣ−結合ＢＳＡを本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体のインビトロ放出実験に対するモデル蛋白質で選択しているが、これはＦＩＴＣ−ＢＳＡを含むナノ運搬体を蛍光顕微鏡で明確に観察することができるからである。ＦＩＴＣ−ＢＳＡをローディングするために、ナノ運搬体及びＦＩＴＣ−ＢＳＡを４℃で単純に混合だけをし、このような簡単な処理によってローディングが可能な理由は、低い温度でナノ運搬体の体積膨張が成り立って、ナノ運搬体がオープン、瞳孔性構造を有するようになるからである。プルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径及び大きさの分布は、ＦＩＴＣ−ＢＳＡが内包されても変化は殆どなかった。本発明によって、ナノ運搬体にＦＩＴＣ−ＢＳＡを捕集する効率は９０％以上で非常に高かった。図５のパネルｄは、ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングされたプルロニック−基盤ナノ運搬体の蛍光顕微鏡イメージであって、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（ＭＷ ６７，０００）がナノ運搬体の内部によく捕集されていることを示し、これは小さい緑色の蛍光点から確認することができる。
【００８６】
同様に、金ナノ粒子（５ｎｍ及び１０ｎｍの大きさ）も、４℃で本発明のナノ運搬体との簡単な混合によって容易にローディングされた。金ナノ粒子−ローディングナノ運搬体のTEMイメージは、運搬体内部に捕集された金ナノ粒子を示す（図５のパネルｃ）。ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディング蛍光イメージと共に、金ナノ粒子−ローディングＴＥＭイメージ及びプルロニック−基盤ナノ運搬体の高いローディング能力は、本発明の運搬体が貯蔵所の特性を有し、これによりターゲット薬物の運搬体で用いられ得ることを示す。
【００８７】
プルロニック−基盤ナノ運搬体からＦＩＴＣ−ＢＳＡが放出されるプロファイルを温度変化によって分析した。期待したように、４℃でプルロニック−基盤ナノ運搬体は膨張するため、充填されたＦＩＴＣ−ＢＳＡが急激に放出されるのに対し、３７℃ではナノ運搬体の収縮現象が発生して、モデル蛋白質または金ナノ粒子の放出速度が大きく減少した。このような温度−依存性放出パターン（図７）は反復的に維持され、且つ可逆的であった。また、３７℃で開始された蛋白質放出は、初期バースト（burst）が殆どなしに発生した。本発明のナノ運搬体の瞳孔の大きさ情報を得るために、５ｎｍまたは１０ｎｍ大きさの金ナノ粒子をナノ運搬体にローディングし、放出プロファイルを照射した。前記二つの金ナノ粒子のいずれも４℃で９０％以上の高い効率でナノ運搬体にローディングされた。しかし、５ｎｍ金ナノ粒子は３７℃で遅く放出されたが、１０ｎｍ粒子は３７℃で放出が観察されなかった（図８）。従って、本発明のナノ運搬体の３７℃での有効瞳孔の大きさは５−１０ｎｍであることが分かる。
【００８８】
金ナノロッドのローディング及び安定性の評価
金ナノロッドも４℃で本発明のナノ運搬体との簡単な混合により前記例で提示された他のモデルタンパク質のように、容易にローディングされた。図１１にて示すように、ナノ運搬体を使用せず、金ナノロッドのみを使用した場合、水溶液で保管する時に不安定であり、吸収波長スペクトラムが時間の経過によって急激に変化することが観察され、一方、図１２と１３にて示したように、金ナノロッドをプルロニック−基盤ナノ運搬体の中にローディングすると、時間が経ても水溶液で安定した状態が維持されるので、金ナノロッドの特性を維持させることができるのが把握できる。
【００８９】
以上で、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術はただ望ましい具現例であるだけであり、これに本発明の範囲が制限されるのではないことは明白である。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度敏感性ナノ運搬体(Temperature−Sensitive Nanocarriers)に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
治療用蛋白質や薬物を生体内に伝達するために用いられる大部分のナノ粒子は、有機溶媒を用いる乳剤蒸発（emulsion evaporation）方法を通じて製造されるため、製造から乾燥時までの製造工程が複雑であり、時間がかなり掛かり、有機溶媒の使用による費用も増え、また、有機溶媒の使用により生体内に問題点を惹起させることがある（T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 8（2007）650−656；T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 7（2006）186４−1870；D．T．Birnbaum，et al.，J．Control．Rel．65（2000）375−387）。このような理由で、多くの研究者らは、ナノ粒子に充填される薬物の変性及びそれらの安定性確保のために、新たなナノ粒子の製造技術開発に多くの時間を投資している。
【０００３】
乳剤蒸発方法の問題点を解決するために、他の研究者らは超臨界流体を用いてナノ粒子を製造した。しかし、この工程は、大部分の医療用高分子が超臨界流体に溶解性が制限的であり、広く用いられていない（K．S．Soppimath et al.，J．Control．Rel．70（2001）1−20）。
【０００４】
また、米国特許第５,０１９,４００号においても生体適合性高分子であるポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（以下、「ＰＬＧＡ」）を超低温冷媒に噴射して蛋白質薬物伝達用マイクロ粒子を製造したものの、ＰＬＧＡを溶解するために用いられる有機溶媒の疎水性によって問題点が発生した。
【０００５】
また、米国特許第６,５８６,０１１号でも蛋白質伝達用ナノ粒子システムを超低温冷媒に噴射する方式で製造しているが、ナノ粒子製造の際に用いられる架橋剤によって蛋白質の安定性に深刻な問題点が惹起された。
【０００６】
また、ナノ粒子を製造する方法で、溶媒蒸発法（solvent evaporation）が用いられるが、この方法も有機溶媒の使用によって様々な問題点を惹起させた。一方、疎水性と毒性の強い有機溶媒の使用の代わり、水とよく混じる有機溶媒（アセトン等）を用いてポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸）（以下、「ＰＬＡ」）ナノ粒子を製造する塩析技法（salting−out）も開発されたものの、蛋白質薬物の活性低下及び安定性問題は解決されなかった（E．Allemann et al.，Pharm．Res．10（1993）1732−1737）。
【０００７】
本明細書の全てに亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表されている。引用されている論文及び特許文献の開示内容は、その全てが本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５,０１９,４００号
【特許文献２】米国特許第６,５８６,０１１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 8（2007）650−656
【非特許文献２】T．G．Park，et al.，Biomacromolecules 7（2006）186４−1870
【非特許文献３】D．T．Birnbaum，et al.，J．Control．Rel．65（2000）375−387）
【非特許文献４】K．S．Soppimath et al.，J．Control．Rel．70（2001）1−20
【非特許文献５】E．Allemann et al.，Pharm．Res．10（1993）1732−1737）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、薬物運搬体のより効率的な製造方法を開発しようと努力した。その結果、光架橋結合可能な（photo−crosslinkable）作用基を有する水溶性の生体適合性重合体を適合する条件下で架橋結合させてナノ運搬体を製造する場合には、単一相（single phase）で容易に優れた特性を示すナノ運搬体が製造され得ることを確認することによって、本発明を完成するようになった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、徐放性薬物送達システム（drug delivery system）の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、温度敏感性、徐放性ナノ運搬体を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によると、本発明は（ａ）光架橋結合可能な（photo−crosslinkable）作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射して前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明者らは、薬物運搬体のより効率的な製造方法を開発しようと努力した。その結果、光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体を適合した条件下で架橋結合させてナノ運搬体を製造する場合には、単一相で容易に優れた特性を示すナノ運搬体が製造され得ることを確認した。
【００１７】
本明細書において、用語「生体適合性重合体」とは、生体組織または血液と接触して組織を壊死させるか、血液を凝固させない組織適合性（tissue compatibility）及び抗凝血性（blood compatibility）を有している高分子を意味する。用語「水溶性の生体適合性重合体」とは、水または水−混合性溶媒（water−miscible solvent：例えば、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド及びジメチルスルホキシド）に溶解される生体適合性重合体、好ましくは、水に溶解される生体適合性重合体を意味する。
【００１８】
本発明の好ましい具現例によると、本発明において用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体である。前記水溶性生体適合性重合体のうち、疎水性及び親水性部分を有しており、界面活性剤と類似している様相を示す重合体を用いる場合、好ましくは、この重合体に疎水性部分を追加的に導入させることが本発明において達成しようとする技術的目的に適合する。
【００１９】
より好ましくは、本発明で用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、ポロキサマー系列の重合体である。
【００２０】
最も好ましくは、本発明で用いられ得る水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００２１】
光架橋結合性作用基は、生体適合性重合体の両末端に結合することが好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００２３】
好ましくは、光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミン、またはケイ皮酸塩であり、より好ましくは、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレートまたはオリゴメタクリレートであり、最も好ましくはアクリレートである。
【００２４】
本発明の方法に適合した開始剤は特に制限されない。好ましくは、本発明に用いられ得る開始剤は紫外線または可視光線の照射によってラジカル（radical）反応を誘発することができるラジカル光開始剤（radical photoinitiator）である。本発明に用いられ得る光開始剤の例は、エチルエオシン、２,２−ジメトキシ−ペニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−ペニルアセトフェノン、２−ヒドロキシ−１−[４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル]−２−メチル−１−プロパノン（Irgacure 2959またはDarocur 2959）、カンファーキノン（camphorquinone）、アセトフェノン、アセトフェノンベンジルケタール、１−ヒドロキシシクロヘキシフェニルケトーン、２,２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、キサントン、フルオレノン、ベンズアルデヒド、フルオレン、アントラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール、３−メチルアセトフェノン、４−クロロベンゾフェノン、４,４’−ジメトキシベンゾフェノン、４,４’−ジアミノベンゾフェノン、ベンゾインプロピルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンジルジメチルケタール、１−（４−イソプロフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−オン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、チオクサントン、ジエチルチオクサントン、２−イソプロピルチオクサントン、２−クロロチオチオキサントン、２−メチル−１−[４−（メチルチオ）フェニル]−２−モルホリノ−プロパン−１−オン、２,４,６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキサイド及びｂｉｓ−（２,６−ジメトキシベンゾイル）−２,４,４−トリメチルペンチルホスフィンオキシドを含む。
【００２５】
下記の実施例に記載のように、本発明の具体的な一実施例において Irgacure 2959を用い、これは、生体内毒性が非常に少ない開始剤として知られている（Kristi S. Anseth, et al., Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 2000. 11（5）：P.439−457）。
【００２６】
段階（ｃ）で、可視光線または紫外線を照射することにより、重合体の光架橋結合性作用基を通じて重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する。好ましくは、架橋結合のために紫外線が用いられる。本発明の具体的な一実施例によると、紫外線照射のために薄層クロマトグラフィー（Thin Layer Chromatography）用紫外線ランプが用いられ得、これは他の硬化用紫外線ランプに比して値段が安く、容易に得ることができる長所を有しており、特定の３６５ｎｍ波長の紫外線照射によってフリーラジカルを発生させる開始剤（例えば、Irgacure 2959）にも適合する。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、段階（ｃ）のナノ運搬体を段階（ａ）の重合体と異なる種類の生体適合性／生体機能性重合体で官能化（functionalization）させる段階（ｄ）を追加的に含む。この場合、用いられ得る生体適合性／生体機能性重合体は、ヘパリン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、キト酸、コンドロイチン、硫酸、デルマタン５−硫酸（dermatan 5−sulfate）、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリエチレンイミン及びポリリシンを含むが、これに限定されるのではない。例えば、ヘパリンは生体内毒性のない生体適合性重合体であって、米国ＦＤＡが承認している陰イオン性多糖類である。
【００２８】
本発明の好ましい具現例によると、前記段階（ａ）−（ｃ）は有機分散相を用いずに、水溶液分散相単独で実施されることである。即ち、単一相でナノ運搬体の製造が全て行われる。より詳しくは、生体適合性重合体及び開始剤が分散されている水溶液に光を照射することによって、ナノ運搬体の完全な製造が行われる。さらに、本発明の反応は、ｏｎｅ−ｐｏｔ反応で実施することができる。このような側面から、本発明の方法は、「ワン−ポット、単一相合成方法（one−pot, single phase synthesis）」と言える。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加し、逆に温度が上がると、その直径が減少する。好ましくは、４℃の条件におけるナノ運搬体の直径は、４０℃における直径に比べて３−２０倍、より好ましくは４−１５倍、さらに好ましくは５−１２倍、最も好ましくは７−１０倍増加する。
【００３０】
本発明のナノ運搬体のこのような直径の増減は可逆的である。
【００３１】
直径の増減に従い、ナノ運搬体に形成された瞳孔の大きさは変わることになる。例えば、低温（例えば、４℃）で、瞳孔の大きさが増加したナノ運搬体に運搬しようとする薬物を捕集（encapsulation）させた後、これを人体に適用すると、瞳孔の大きさが減少して捕集された薬物の徐放（sustained release）が行われる。
【００３２】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃における瞳孔の大きさは３−２０ｎｍであり、より好ましくは３−１５ｎｍ、最も好ましくは５−１０ｎｍである。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子（nanoparticulate）である。下記の実施例において立証したように、本発明のナノ運搬体は、丸い状を有するナノ粒子の形態を有する。本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は、５０−５００ｎｍの直径、より好ましくは１００−４００ｎｍ、最も好ましくは１２０−３００ｎｍの直径を有する。本発明によるナノ運搬体は、滅菌過程を滅菌フィルターを用いて簡単に処理することができるという側面において、直径は２００ｎｍ以下であることが好ましい。また、ナノ運搬体の多分散（polydispersity）指数は０．１以下のものが有利であり、これは一般的に多分散指数が０．１以下の場合、安定した単分散分布を有するナノ粒子と見なすからである。ナノ運搬体の好ましい多分散指数は０．０１−０．１である。
【００３４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体の表面にはターゲッティングリガンドが結合されている。前記ターゲッティングリガンドの例は、ホルモン、抗体、細胞−接着蛋白質（cell−adhesion molecules）、糖類及び神経伝達者を含むが、これに限定されるのではない。
【００３５】
本発明の方法によると、従来技術の問題点、例えば有害な有機溶媒の利用、複雑な過程、高い生産単価及び低いローディング能力などを解決することができる。また、従来技術において、通常的に用いられる高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明の方法はローディングされる薬物の変性または凝集を避けることができる。
【００３６】
本発明の他の態様によると、本発明は（ａ）温度敏感性生体適合性重合体からなるナノ運搬体及び運搬対象の物質を混合する段階；及び（ｂ）前記混合物をインキュベート（incubating）して、運搬対象の物質をナノ運搬体の内部に自然的に捕集（spontaneous encapsulation）させる段階を含む徐放性薬物送達システムの製造方法を提供する。
【００３７】
本発明の徐放性薬物送達システムの製造方法は、上述した温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法と共通する内容を有し、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によると、前記水溶性の生体適合性重合体は、下記化学式１で示される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００４０】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基はアクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩である。
【００４１】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加する。
【００４２】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体はヒドロゲルでないナノ粒子である。本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍである。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は交差結合されたものである。
【００４４】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬され得る物質は制限されず、治療学的効能を示す多様な物質を含む。本発明の好ましい具現例によると、運搬対象の物質は、蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質である。
【００４５】
本発明の薬物送達システムによって運搬される蛋白質は特に制限されず、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質またはその一部分、抗体またはその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質またはその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及びワクチンなどを含むが、これに限定されない。より詳細には、本発明の薬物送達システムによって運搬される蛋白質はインスリン、ＩＧＦ−１（insulin−like growth factor １）、成長ホルモン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦｓ（granulocyte−colony stimulating factors）、ＧＭ−ＣＳＦｓ（granulocyte/macrophage−colony stimulating factors）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファ及びベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−２、ＥＧＦｓ（epidermal growth factors）、カルシトニン（calcitonin）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial cell growth factor）、ＦＧＦ（fibroblast growth factor）、ＰＤＧＦ（platelet−derived growth factor）、ＡＣＴＨ （adrenocorticotropic hormone）、ＴＧＦ−β（transforming growth factor beta）、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）、ＴＮＦ（tumor necrosis factor）、アトビスバン（atobisban）、ブセレリン（buserelin）、セトロレリクス（cetroreliｘ）、デスロレリン（deslorelin）、デスモプレシン（desmopressin）、ダイノルフィンＡ（dynorphin A）（１−１３）、エルカトニン（elcatonin）、エレイドシン（eleidosin）、エプチフィバチド（eptifibatide）、ＧＨＲＨ−II（growth hormone releasing hormone−II）、ゴナドレリ
ン（gonadorelin）、ゴセレリン（goserelin）、ヒストレリン（histrelin）、リュープリン（leuprorelin）、リプレシン（lypressin）、オクトレオチド（octreotide）、オキシトシン （oｘytocin）、ピトレシン（pitressin）、セクレチン（secretin）、シンカライド（sincalide）、テルリプレッシン（terlipressin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（thymosine）α１、トリプトレリン（triptorelin）、ビバリルジン（bivalirudin）、カルベトシン（carbetocin）、シクロスポリン、エキセディン（eｘedine）、ランレオチド（lanreotide）、ＬＨＲＨ（luteinizing hormone−releasing hormone）、ナファレリン（nafarelin）、副甲状腺ホルモン、プラムリンチド（praｍlintide）、Ｔ−２０（enfuvirtide）、サイマルファシン（thymalfasin）及びジコノチドを含むが、これに限定されるのではない。
【００４６】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬されることができる核酸分子は、例えばＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、プラスミド及びベクターを含むが、これに限定されるのではない。
【００４７】
本発明の徐放性薬物送達システムによって運搬されることができるナノ粒子は、例えば金ナノ粒子、銀ナノ粒子、鉄ナノ粒子、転移金属ナノ粒子及び金属酸化物ナノ粒子（例えば、フェライトナノ粒子）を含むが、これに限定されるのではない。例えば、本発明の薬物送達システムがフェライトナノ粒子を運ぶ場合には、ＭＲ（magnetic resonance）造影剤（imaging agent）として用いられ得る。
【００４８】
本発明の徐放性薬物送達システムを用いて蛍光物質を運ぶ場合、好ましくは、蛍光物質はキャリアに結合されている。例えば、蛍光物質を蛋白質または金属ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子）に結合させて用いることができる。前記蛍光物質の例はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアネートスチルベン−２,２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアトフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル−ピレンブチラート、４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２,２’−ジスルホン酸誘導体、ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ６４０、 ＬＣＴＭ−Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、リサミン、イソチオシアネート、エリトロシンイソチオシアネート、ジエチレントリアミンペンタアセテート、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホン酸塩、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸、２−ｐ−トーイジニル−６−ナフタレンスルホン酸、３−フェニル−７−イソシアネートクマリン、９−イソチオシアネートアクリジン、アクリジンオレンジ、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾクサゾイリル）フェニル）メレイミド、ベンゾクサジアゾル、スチルベン及びファイレンを含むが、これに限定されるのではない。
【００４９】
本発明の最も大きい特徴の１つは、ナノ運搬体に運搬対象の物質を捕集する過程で単純に前記２つの物質を混合すると、自然的に捕集（spontaneous encapsulation）されるということである。即ち、いかなる追加的な処理なしに、ナノ運搬体と運搬対象の物質が接触（contacting）することができるイベントのみを与えると、運搬対象の物質が自然的にナノ運搬体にローディングされるのである。
【００５０】
本発明の好ましい具現例によると、薬物をナノ運搬体に捕集させる場合、遺棄分散相を用いずに、水溶液分散相で実施する。
【００５１】
本発明の好ましい具現例によると、捕集させる段階は０−２０℃、より好ましくは４−１０℃、最も好ましくは４−６℃の温度条件で実施する。
【００５２】
本発明の徐放性薬物送達システムによる水溶液上での自然的捕集は、ローディングされる薬物、特に蛋白質医薬の安定性を大きく増加させることができる利点がある。自然的捕集によって本発明の薬物送達システムに薬物がローディングされるが、捕集効率（encapsulation efficiency）は９０％以上で非常に高い。さらに、薬物がローディングされる過程において有機溶媒が用いられず、高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明の方法はローディングされる薬物の変成または凝集を避けることができる。
【００５３】
本発明のまた別の態様によると、本発明は、末端にある光架橋結合性作用基を通じて、架橋結合されている水溶性の生体適合性重合体を含み、前記重合体は温度変化により直径が変わり、ヒドロゲルでないナノ粒子形態 （nanoparticulate form）を有することを特徴とする温度敏感性徐放性ナノ運搬体を提供する。
【００５４】
本発明の徐放性薬物送達システムは、上述した本発明の方法と共通する内容を有し、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００５５】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基はアクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩である。
【００５６】
本発明の好ましい具現例によると、前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基である。
【００５７】
本発明の好ましい具現例によると、前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体である。
【００５８】
より好ましくは、水溶性の生体適合性重合体は、下記化学式１で表される重合体である：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【００５９】
本発明の好ましい具現例によると、前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従ってその直径が増加する。
【００６０】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は水溶液分散に分散されていることである。本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍである。
【００６１】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体は、他の種類の生体適合性重合体で官能化されている。
【００６２】
本発明の好ましい具現例によると、ナノ運搬体はその内部に蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質を含む。
【００６３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のナノ運搬体の表面には、ターゲッティングリガンドが結合されている。前記ターゲッティングリガンドの例は、ホルモン、抗体、細胞−接着蛋白質、糖類及び神経伝達者を含むが、これに限定されるのではない。
【発明の効果】
【００６４】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次のとおりである：
（i）本発明のナノ運搬体は温度敏感性を有し、温度変化に対応して可逆的に直径及び瞳孔の大きさが変わる。
（ii）本発明の方法によると、ナノ運搬体をワン−ポット単一相で製造することができる。
（iii）本発明のナノ運搬体に薬物が自然的に捕集されることができる。
（iv）本発明のナノ運搬体は、人体内の温度条件で瞳孔の大きさが減少して徐放性薬物送達システムとして用いられ得る。
（v）本発明によると、従来技術の問題点、例えば有害な有機溶媒の利用、複雑な過程、高い生産単価及び低いローディング能力などを解決することができる。
（vi）また、従来技術において通常的に用いられる高速均質化過程または超音波処理過程を必要としないので、本発明はローディングされる薬物の安定性を担保することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の単一相光重合反応によるプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造過程を示す概略図である。
【図２】ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣ分析（パイレン利用）結果を示すグラフである。
【図３ａ】４℃から４０℃までの温度変化によるうプルロニック−基盤ナノ運搬体の大きさの変化を示すグラフである。
【図３ｂ】４℃で測定したナノ運搬体の単分散分布図を示すグラフである。
【図３ｃ】３７℃で測定したナノ運搬体の単分散分布図を示すグラフである。
【図４】２０℃と３７℃との間での温度スイングによる本発明のナノ運搬体の可逆的大きさの変化を示すことであって、ＤＬＳで測定されたものである。
【図５】プルロニック−基盤ナノ運搬体のイメージである。（ａ）４℃及び（ｂ）３７℃で前平衡な（pre−equilibrated）試料、（ｃ）５ｎｍ金ナノ粒子をローディングした以後の試料に対する透過電子顕微鏡（Transmission electron microscopy）イメージである。パネルｄはＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングされたプルロニック−基盤ナノ運搬体に対する逆象蛍光顕微鏡のイメージである。
【図６】プルロニックＦ １２７（ＰＦ １２７）、ジアクリル化プルロニックＦ １２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）及びＤＡ−ＰＦ １２７の光架橋結合によって製造されたナノ運搬体のＦＴ−ＩＲスペクトラムである。
【図７】３７−４℃の温度変化で本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体からＦＩＴＣ−ＢＳＡが放出されるパターンを示す。
【図８】プルロニック−基盤ナノ運搬体から金ナノ粒子（５ｎｍ及び１０ｎｍ大きさ）が放出されるパターンを示す。
【図９】プルロニックの基本構造及び多様なプルロニック中、プルロニックＦ−１２７（ＰＦ １２７）とプルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）の構造的な特性を示す。
【図１０】４℃から４０℃までの温度変化による０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）の大きさの変化を示すグラフである。
【図１１】水溶液で、時間による金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を示したグラフである。
【図１２】水溶液で、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７）にローディングされた金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を、時間によって観察したグラフである。
【図１３】水溶液で、０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）にローディングされた金ナノロッドの吸収波長スペクトラムの変化を、時間によって観察したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳細に説明しようとする。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨から、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
【実施例】
【００６７】
実験材料
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７（E100P65E100，MW12,600）（ＰＦ １２７）をＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．（Seoul，Korea）から入手した。アクリロイルクロライド、トリエチルアミン及び無水トルエンはＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee，WI，USA）から購入した。４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル−（２−ヒドロキシ−２−プロピル）ケトン（Irgacure 2959）はＣｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Basel，Switzerland）から購入した。ポタシウムブロマイド、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（fluorescein isothiocyanate−labelled bovine serum albumin）、ポタシウムフォスフェイトモノベイシック、ソジウムフォスフェイトジベイシック及びソジウムアジドはＳｉｇｍａ（St. Louis，MO，USA）から購入した。ソジウムクロライド及びポタシウムクロライドはＭｅｒｋ（Darmstadt，Germany）から購入した。ＮａｎｏｓｅｐＴＭ遠心分離装置（MWCO 300 000）は、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ann Arbor，MI，USA）から購入した。透過膜[セルロースエステル（CE）、MWCO 300000 with a nominal pore size of 35nm]はＳｐｅｃｔｒｕｍ（Houston、TＸ、USA）の製品である。０．２μmセルロース滅菌シリンジフィルターはＷｈａｔｍａｎ（Florham Park、Ｎew Jersey、USA）から購入したものである。
【００６８】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の製造
図１で図示したような方法に従って、本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。プルロニックF−１２７（ＰＦ １２７）５ｇ及び１０倍モールのアクリロイルクロライドとトリエチルアミンを５０ｍＬ無水トルエンで一夜の間アルゴン大気下で攪拌させ、ＰＦ １２７のヒドロキシル基をアクリル化した。収得した重合体を無水ジエチルエーテルで沈殿させて濾過した後、真空下で３日間乾燥させた。アクリル化程度は、３００ ＭＨｚ１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピー（JNM−LA300WB FT−NMR Spectrometer、JEOL、Japan）を用いて測定し、９８％以上アクリル作用基で置換されたジアクリレートプルロニックＦ−１２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）が製造されることを確認した。
【００６９】
ＤＡ−ＰＦ １２７を脱イオン水に溶解し、１０．０％（ｗ／ｗ）の前駆体溶液を製造した後、該溶液を常温で蒸溜水に希釈することによって、多様な濃度（１．４，０．７７，０．５０，０．３３，０．２０％（ｗ／ｗ））を有する溶液を製造した。希釈された前駆体溶液に７０％エタノールに溶かした光開始剤Irgacure ２９５９を０．０５％（ｗ／ｗ）量で添加した。引き続き、フィルターを除去した１．３ｍＷ／ｃｍ２紫外線ランプ（VL−4.LC，8W，Vilber Lourmat，France）を光源にて一定時間５、１０、１５分間、光照射してプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。ナノ運搬体溶液に存在する不純物は、ＮａｎｏｓｅｐＴＭでスピン濾過（１４，０００ｒｐｍ、１０分）を通じて除去され、回収されたナノ運搬体を蒸溜水に再分散した。
【００７０】
CMC（critical micelle concentration）の測定
ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣは、ピレンを蛍光プローブで用いて測定した（K. C. Cho，et al.，Macromol. Res.，2006，14，348）。アセトンに溶解したピレン（Aldrich，Milwaukee，WI，USA）を脱イオン水に添加して、６ｘ１０−６Ｍの溶液を製造し、引き続き５時間真空乾燥してアセトンを除去した。ＤＡ−ＰＦ １２７の濃度を０．０００１〜１ｗｔ％で多様にし、ピレン溶液（最終濃度：６ｘ１０−７Ｍ）と反応させた。ＤＡ−ＰＦ １２７及びピレンの混合溶液を暗条件下で３０分間室温で反応させた。スペクトロフルオロフォトメーター（Shimadzu，RF−5301PC，Kyoto，Japan）を用い、３３９ｎｍの勵起波長及び３９０ｎｍの放出波長で蛍光スペクトラムを測定した。
【００７１】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性研究
本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体の水力学的直径及び表面電荷は１０ｍＷ Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３２．８ｎｍ）が装着された電気泳動（Electrophoretic）光スキャタリングスペックトロフォトメーター（ELS−8000、Otsuka Electronics Co.，Japan）を用いて試料に対して９０゜の散乱角度にして測定した。温度を調節し、測定は３回反復実施した。また、温度サイクリングの間のナノ運搬体の熱−可逆性は、２０℃及び３７℃で反復的にサイクリングして分析した。２００ｋＶ電圧で作動する透過電子顕微鏡（JEM−2100，JEOL，Japan）を用いてプルロニック−基盤ナノ運搬体のイメージを得た。４℃、２５℃または３７℃で前−平衡なプルロニック−基盤ナノ運搬体懸濁液（０．７７ｗｔ％ ｗｉｔｈ １５ ｍｉｎ ＵＶ−照射）２０μＬを２００−メッシュ炭素コーティングされた銅グリッド上に室温でドロップ−乾燥させてＴＥＭ試料を準備した。ＴＥＭイメージの最小５０ヶのナノ運搬体をカウンティングしてプルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径を決めた。金粒子（５ｎｍ）とナノ運搬体を４℃で反応させ、金粒子（５ｎｍ）−ローディングナノ運搬体を準備し、ＴＥＭイメージを得た。
【００７２】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の光−架橋程度を評価するためにＦＴ−ＩＲスペクトロフォトメーター（SPECTRUM 2000，Perkin−Elmer，USA）を用いた。プルロニック−基盤ナノ運搬体（０．７７ｗｔ％ ｗｉｔｈ １５ ｍｉｎ ＵＶ−照射で製造される）を凍結乾燥し、クラインディングで粉末化した後、ＫＢr薄膜にマウンティングした。４０００ to ４００ｃｍ−１の波長範囲で２０スキャンで１ｃｍ−１の解像度でＩＲスペクトラムを得た。光−架橋後プルロニック−基盤ナノ運搬体に残存する二重結合は、１６３５ｃｍ−１（二重結合のＣ＝Ｃストレッチング）付近のＩＲピークによって分析した。
【００７３】
モデル蛋白質充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中に０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて、モデル蛋白質のＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Fluorescein isothiocyanate−labelled bovine serum albumin）を充填した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ｍＬ）にモデル蛋白質のＦＩＴＣ−ＢＳＡ ２００μｇを添加し、４℃で１２時間放置しながら、モデル蛋白質が自発的に膨張したナノ運搬体内に充填されるようにした。充填されないモデル蛋白質を常温でスピンフィルターを用いて除去した。
【００７４】
プルロニック−基盤ナノ運搬体のＦＩＴＣ−ＢＳＡ捕集効率及びローディング量は、室温で１４,０００ｒｐｍで１０分間スピン濾過した後、Ｆ．Ｑ．Ｌｉ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ.，２００８，３４９，２７４に記載の方法により計算した。ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングフラックサマナノ運搬体を逆象蛍光顕微鏡（TE2000−U，Nikon，Melville，NY，USA）で可視化した。
【００７５】
本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体から放出されるＦＩＴＣ−ＢＳＡを分析するために、ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングナノ運搬体懸濁液（０．５ｍＬ）を透過膜チューブに入れた。０．０５％ＮａＮ３があるＰＢＳ（phosphate buffered saline）５ｍＬに前記チューブを入れ、３７℃または４℃で３０ｒｐｍで攪拌しながら特定温度での放出パターンを分析した。それぞれの時点で全体放出ミディアムを新たなものと交替した。それぞれの時点での放出されたＦＩＴＣ−ＢＳＡの量はＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ−ＢｒａｄｆｏｒｄＴＭ ａｓｓａｙ（PIERCE，Rockford，IL，USA）を用いて分析した。全ての測定は３回反復的に実施した。
【００７６】
金ナノ粒子充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中に０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて、金ナノ粒子を充填した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ｍＬ）及び金ナノ粒子（５ and １０ｎｍ in size，Sigma，St. Louis，MO，USA）０．５ｍＬを混合して４℃で１２時間反応させた。ローディングされない金ナノ粒子を除去するために、スピン濾過を１４,０００ｒｐｍで１０分間室温で実施した。異なる大きさを有する金ナノ粒子の放出をＢＳＡと同様に実施し、放出量はCary １Ｅ ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅスペックトロフォトメーター（Varian，Melbourne，Australia）を用いて測定した。全ての測定は、３回反復的に実施した。
【００７７】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の製造（ＮＣ−ＰＦ６８）及び特性研究
米国ＦＤＡより承認を受けた多様なプルロニック中、前記実施例で製造したプルロニックＦ−１２７（ＰＦ １２７）のみならず、図９にて示すように構造的に特性において若干異なるプルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）を使用してプルロニック−基盤ナノ運搬体を製造した。プルロニックＦ−６８（ＰＦ ６８）も前記実施例で提示した方法と同方法で９８％以上アクリル作用基で置換されたジアクリレートプルロニックＦ−６８（ＤＡ−ＰＦ ６８）を製造した。製造されたＤＡ−ＰＦ ６８を脱イオン水に溶解して１０．０％（ｗ/ｗ）の前駆体溶液を製造した後、該溶液を常温で蒸溜水に希釈することによって０．０５％（ｗ/ｗ）を有する溶液を製造し、前記実施例で示した光重合反応条件（光開始剤濃度：０．０５％（ｗ/ｗ）、光照射時間：１５分）を通じてナノ運搬体を製造した。前記実施例の結果として、図３（ａ）にて示すように、温度敏感性プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性を確認するために４℃から４０℃まで温度変化を与えることによりナノ運搬体の大きさの変化を観察した。
【００７８】
金ナノロッドが充填されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造及び特性研究
前記実施例で製造したナノ運搬体中、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７）と０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８）、即ち、プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）を用いて金ナノロッドを充電した。プルロニック−基盤ナノ運搬体溶液（１ ｍＬ）と金ナノロッド（平均大きさ：４０ ｎｍ、aspect ratio：３．９）０．５ｍＬを混合して４℃で１２時間反応させた。ロディングされていない金ナノロッドを除去するために、スピン濾過を１０ ０００ ｒｐｍで５分間実温で実施した。金ナノロッドが充電されたプルロニック−基盤ナノ運搬体は蒸留水に再分散させた後、実温で、時間による吸収波長スペクトラムの変化を８４５３ ＵＶ−ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計（Agilent）を用いて分析した。全ての測定は３回反復的に実施した。
【００７９】
実験結果
光−架橋によるプルロニック−基盤ナノ運搬体の製造
ＤＡ−ＰＦ １２７及び開始剤のみを含む水溶液を多様な条件で光−架橋させ、未反応電球重合体を除去するためにスピンフィルタリングを実施した。表１に記載されているように、簡単な光−架橋処理によって、比較的狭い大きさの分布を有するナノ粒子が形成された。開始剤の特定濃度（０．０５ｗｔ％）及び特定ＵＶ照射の強度（１．３ｍＷｃｍ−２）で０．５乃至１．４ｗｔ％の濃度範囲で光−架橋ナノ運搬体を収得した。２ｗｔ％以上ではマイクロメーターの大きさの凝集体が形成された。０．３３ｗｔ％濃度では１５分以上のＵＶ照射によって、光−架橋ナノ運搬体が製造された。前駆体濃度を０．２ｗｔ％以下にした場合には、ナノ粒子が検出されなかった。光−架橋ナノ運搬体を生成することができる前駆体の濃度範囲（０．３３〜１．４ｗｔ％）でナノ運搬体の平均径は、１１１±１９ｎｍから２１３±３２ｎｍまで徐々に増加した。逆に、特定前駆体の濃度で、光−架橋ナノ運搬体の平均の大きさは、ＵＶ照射時間を増やしても大きく増加しなかった。面白いことは、ＵＶ照射前には３０ｎｍ大きさ以上の粒子が観察されなかった。従って、ＤＡ−ＰＦ １２７の光−架橋によって、ナノ運搬体は形成された。また、ＤＡ−ＰＦ １２７のＣＭＣ（0.038wt％）以下の濃度では光−架橋ナノ運搬体が形成されなかった（図２）。結論的に、ＤＡ−ＰＦ １２７マイセルで、光重合反応によってナノ運搬体が形成されたことが分かる（図１）。下記表１は、多様な濃度の前駆体を用いて、製造（ＵＶの強度：１．３ｍＷｃｍ−２）されたプルロニック−基盤ナノ運搬体の大きさを示すものであって、２５℃でＤＬＳにて測定したのである（平均±標準偏差ｎ＝３）。
【００８０】
【表１】
【００８１】
プルロニック−基盤ナノ運搬体の特性研究
図３ａから分かるように、０．７７％（ｗ／ｗ）温度敏感性プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）は、４℃から４０℃まで温度を変化させることによって、４６０±３７ｎｍから５５±５ｎｍまでナノ運搬体の大きさの変化を見せ、また図３ｂと図３ｃに示しているように、４℃と３７℃で測定したナノ運搬体の単分散分布度は、製造されたナノ運搬体が均一であるということを見せる。一方、２０℃と３７℃との温度スイングにおける可逆的大きさ変化に関するデータ（図４）も本発明のナノ運搬体が安定性を有するということを裏付ける。
【００８２】
図５は、０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）の構造的な形態と大きさを透過電子顕微鏡で測定した結果であって、ナノ運搬体中に空間が存在することを示す。図５のＴＥＭイメージで、本発明のナノ運搬体は丸い状を有し、温度によって大きさが変わるということが分かる（図５のパネルａ及びｂ）。室温でプルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径は１６０±２０ｎｍであり、これは５０ヶ以上のナノ運搬体をカウンティングして決定したことであって、表１のＤＬＳデータと一致する。
【００８３】
図６で示したように、ジアクリレート作用基を有するプルロニックＦ−１２７（ＤＡ−ＰＦ １２７）の光重合反応を通じて製造された０．７７％（ｗ／ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（光照射時間：１５分）の架橋程度を赤外線分光器（Fourier Transform Infrared Spectroscopy、FT−IR）で測定した。アクリレート作用基の二重結合は、１６３５ｃｍ−１ ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒで測定されるが、光重合反応後、ナノ運搬体に存在する二重結合が完全に消えたことから１００％架橋されたことが分かる。
【００８４】
結論的に、本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体は、ＤＡ−ＰＦ １２７の完全な光重合によって形成され、これによって、十分な構造的安定性を有することが把握できる。
図１０にて示すように、０．５０％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ ６８、光照射時間：１５分）は、０．７７％（ｗ/ｗ）プルロニック−基盤ナノ運搬体（ＮＣ−ＰＦ １２７、光照射時間：１５分）と同じ方法で４℃から４０℃まで温度変化を与えることにより、３８４±５１ ｎｍから９９±５ ｎｍまでナノ運搬体の大きさの変化を見せた。温度変化による特性はほぼ類似しているが、大きさにおいてＮＣ−ＰＦ ６８がＮＣ−ＰＦ １２７より多少大きいので、使用する物質によって大きさの調節が可能であることが把握できる。
【００８５】
モデル蛋白質及びモデルナノ粒子のローディング及び放出
ＦＩＴＣ−結合ＢＳＡを本発明のプルロニック−基盤ナノ運搬体のインビトロ放出実験に対するモデル蛋白質で選択しているが、これはＦＩＴＣ−ＢＳＡを含むナノ運搬体を蛍光顕微鏡で明確に観察することができるからである。ＦＩＴＣ−ＢＳＡをローディングするために、ナノ運搬体及びＦＩＴＣ−ＢＳＡを４℃で単純に混合だけをし、このような簡単な処理によってローディングが可能な理由は、低い温度でナノ運搬体の体積膨張が成り立って、ナノ運搬体がオープン、瞳孔性構造を有するようになるからである。プルロニック−基盤ナノ運搬体の平均径及び大きさの分布は、ＦＩＴＣ−ＢＳＡが内包されても変化は殆どなかった。本発明によって、ナノ運搬体にＦＩＴＣ−ＢＳＡを捕集する効率は９０％以上で非常に高かった。図５のパネルｄは、ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディングされたプルロニック−基盤ナノ運搬体の蛍光顕微鏡イメージであって、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（ＭＷ ６７，０００）がナノ運搬体の内部によく捕集されていることを示し、これは小さい緑色の蛍光点から確認することができる。
【００８６】
同様に、金ナノ粒子（５ｎｍ及び１０ｎｍの大きさ）も、４℃で本発明のナノ運搬体との簡単な混合によって容易にローディングされた。金ナノ粒子−ローディングナノ運搬体のTEMイメージは、運搬体内部に捕集された金ナノ粒子を示す（図５のパネルｃ）。ＦＩＴＣ−ＢＳＡローディング蛍光イメージと共に、金ナノ粒子−ローディングＴＥＭイメージ及びプルロニック−基盤ナノ運搬体の高いローディング能力は、本発明の運搬体が貯蔵所の特性を有し、これによりターゲット薬物の運搬体で用いられ得ることを示す。
【００８７】
プルロニック−基盤ナノ運搬体からＦＩＴＣ−ＢＳＡが放出されるプロファイルを温度変化によって分析した。期待したように、４℃でプルロニック−基盤ナノ運搬体は膨張するため、充填されたＦＩＴＣ−ＢＳＡが急激に放出されるのに対し、３７℃ではナノ運搬体の収縮現象が発生して、モデル蛋白質または金ナノ粒子の放出速度が大きく減少した。このような温度−依存性放出パターン（図７）は反復的に維持され、且つ可逆的であった。また、３７℃で開始された蛋白質放出は、初期バースト（burst）が殆どなしに発生した。本発明のナノ運搬体の瞳孔の大きさ情報を得るために、５ｎｍまたは１０ｎｍ大きさの金ナノ粒子をナノ運搬体にローディングし、放出プロファイルを照射した。前記二つの金ナノ粒子のいずれも４℃で９０％以上の高い効率でナノ運搬体にローディングされた。しかし、５ｎｍ金ナノ粒子は３７℃で遅く放出されたが、１０ｎｍ粒子は３７℃で放出が観察されなかった（図８）。従って、本発明のナノ運搬体の３７℃での有効瞳孔の大きさは５−１０ｎｍであることが分かる。
【００８８】
金ナノロッドのローディング及び安定性の評価
金ナノロッドも４℃で本発明のナノ運搬体との簡単な混合により前記例で提示された他のモデルタンパク質のように、容易にローディングされた。図１１にて示すように、ナノ運搬体を使用せず、金ナノロッドのみを使用した場合、水溶液で保管する時に不安定であり、吸収波長スペクトラムが時間の経過によって急激に変化することが観察され、一方、図１２と１３にて示したように、金ナノロッドをプルロニック−基盤ナノ運搬体の中にローディングすると、時間が経ても水溶液で安定した状態が維持されるので、金ナノロッドの特性を維持させることができるのが把握できる。
【００８９】
以上で、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術はただ望ましい具現例であるだけであり、これに本発明の範囲が制限されるのではないことは明白である。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；
（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射して前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、
前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法。
【請求項２】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項３に記載の方法：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）ｚ−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項６】
前記段階（ｃ）の光は、紫外線であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記段階（ａ）−（ｃ）は有機分散相を用いずに、水溶液分散相単独で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、段階（ｃ）のナノ運搬体を段階（ａ）の重合体と異なる種類の生体適合性重合体で官能化させる段階（ｄ）を追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）温度敏感性生体適合性重合体からなるナノ運搬体及び運搬対象の物質を混合する段階；及び
（ｂ）前記混合物をインキュベートして、運搬対象の物質をナノ運搬体の内部に自然的に捕集させる段階を含む徐放性薬物送達システムの製造方法。
【請求項１３】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項１４】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、交差結合されたことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記運搬対象の物質は、蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、有機分散相を用いずに、水溶液分散相で実施されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ｂ）は、０−２０℃の温度条件下で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ｂ）は、４−１０℃の温度条件下で実施することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
末端にある光架橋結合性作用基を通じて架橋結合されている水溶性の生体適合性重合体を含み、前記重合体は、温度変化によって直径が変わり、ヒドロゲルでないナノ粒子形態を有することを特徴とする温度敏感性徐放性ナノ運搬体。
【請求項２５】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２６】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有するグループであることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２７】
前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体であることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２８】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項２７に記載のナノ運搬体：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項２９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３０】
前記ナノ運搬体は、水溶液分散相に分散されていることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３１】
前記ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３２】
前記ナノ運搬体は、異なる種類の生体適合性重合体で官能化されていることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３３】
前記ナノ運搬体は、その内部に蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質を含むことを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項１】
（ａ）光架橋結合性作用基を有する水溶性の生体適合性重合体の分散液を準備する段階；
（ｂ）前記重合体分散液に開始剤を添加する段階；及び
（ｃ）前記（ｂ）の結果物に光を照射して前記重合体を架橋結合させてナノ運搬体を製造する段階を含み、
前記ナノ運搬体は温度変化によって直径が変わることを特徴とする生体適合性、温度敏感性ナノ運搬体を製造する方法。
【請求項２】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項３に記載の方法：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）ｚ−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項６】
前記段階（ｃ）の光は、紫外線であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記段階（ａ）−（ｃ）は有機分散相を用いずに、水溶液分散相単独で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法は、段階（ｃ）のナノ運搬体を段階（ａ）の重合体と異なる種類の生体適合性重合体で官能化させる段階（ｄ）を追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）温度敏感性生体適合性重合体からなるナノ運搬体及び運搬対象の物質を混合する段階；及び
（ｂ）前記混合物をインキュベートして、運搬対象の物質をナノ運搬体の内部に自然的に捕集させる段階を含む徐放性薬物送達システムの製造方法。
【請求項１３】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項１２に記載の方法：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項１４】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有する作用基であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、ヒドロゲルでないナノ粒子であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、交差結合されたことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記運搬対象の物質は、蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、有機分散相を用いずに、水溶液分散相で実施されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記段階（ｂ）は、０−２０℃の温度条件下で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記段階（ｂ）は、４−１０℃の温度条件下で実施することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
末端にある光架橋結合性作用基を通じて架橋結合されている水溶性の生体適合性重合体を含み、前記重合体は、温度変化によって直径が変わり、ヒドロゲルでないナノ粒子形態を有することを特徴とする温度敏感性徐放性ナノ運搬体。
【請求項２５】
前記光架橋結合性作用基は、アクリレート、ジアクリレート、オリゴアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴメタクリレート、クマリン、チミンまたはケイ皮酸塩であることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２６】
前記光架橋結合性作用基は、Ｃ＝Ｃ二重結合を有するグループであることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２７】
前記水溶性の生体適合性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドブロック共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、キト酸、デキストランまたはアルギン酸塩構造を有する重合体であることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項２８】
前記水溶性の生体適合性重合体は、下記の化学式１で表される重合体であることを特徴とする請求項２７に記載のナノ運搬体：
化学式１
（ＰＣ１）−（ＰＥ）ｘ−（ＰＰＯ）y−（ＰＥ）z−（ＰＣ２）
前記化学式でＰＥはエチレンオキサイド、ＰＰＯはプロピレンオキサイド、ＰＣ１及びＰＣ２は光架橋結合性作用基を示し、ｘ、ｙ及びｚは夫々独立的に１−１０，０００の定数である。
【請求項２９】
前記温度敏感性ナノ運搬体は、温度が下がるに従って、その直径が増加することを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３０】
前記ナノ運搬体は、水溶液分散相に分散されていることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３１】
前記ナノ運搬体は、３７℃での瞳孔の大きさが３−２０ｎｍであることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３２】
前記ナノ運搬体は、異なる種類の生体適合性重合体で官能化されていることを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【請求項３３】
前記ナノ運搬体は、その内部に蛋白質、核酸分子、ナノ粒子または蛍光物質を含むことを特徴とする請求項２４に記載のナノ運搬体。
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１７３６５４（Ｐ２００９−１７３６５４Ａ）
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１４４０（Ｐ２００９−１１４４０）
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【出願人】（５０２２２３５９６）光州科学技術院 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２１日（２００９．１．２１）
【出願人】（５０２２２３５９６）光州科学技術院 (7)
【Ｆターム（参考）】
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