生体分子間の細胞内相互作用の検出方法
本発明は、蛍光ドナー/アクセプター対の2つのメンバー間の時分割蛍光エネルギー移動効果による、生物学的又は薬理学的刺激に応答して、生細胞における生体分子間の細胞内相互作用を検出する定量的な非顕微鏡的方法に関する。本発明は、分子のハイ-スループットスクリーニング及び細胞内シグナル伝達経路の検出に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光ドナー/アクセプター対の2つのメンバー間の時分割蛍光エネルギー移動効果による、生物学的又は薬理学的刺激に応答して、生細胞における生体分子間の細胞内相互作用を検出する定量的な非顕微鏡的方法に関し、並びにその適用、例えば具体的には、分子のハイ-スループットスクリーニング及び細胞内シグナル伝達経路の検出に関する。
【背景技術】
【0002】
薬理学的活性を有する分子(例えば、薬物)は、血漿膜上又は生細胞自身内のいずれかに存在する分子標的に作用する。製薬業の検索手法において候補分子を選択し、かつ最適化するためには、異なったパートナー間の相互作用によって導かれ得る調節を統合化するような天然の環境内でできるだけ、その分子作用を決定する必要がある。より基本的な点から、生理的又は病理学的条件では、細胞内シグナル伝達経路に関連する生体分子間の直接的な相互作用が容易に研究され、特徴付けられ、かつ定量化され得る細胞モデルを利用することが重要である(例えば、Takesono他, Journal of Cell Science, 115, 3039-3048 (2002)参照)。天然の条件での作用のメカニズムを理解しようとするこの要望は、なぜ細胞に対する試験が分子の一次スクリーニングにおいてますます使用されるかを説明するものである。しかしながら、現時点で、ハイ-スループットスクリーング法は、主に、生物的事象、例えば、第2メッセンジャーの産生、の最終産物の検出を可能にする。この場合には、細胞は、アッセイされるべき細胞内標的分子を利用できるようにするために、溶解されなければならない。速度論的観察は目下、ほとんど不可能であり、稀な事象は容易に検出されない。生細胞において顕微鏡又は画像化の技術を用いる新規な方法は、刺激に応答して、その天然環境における対象の1以上の分子の動的及び速度論的パラメータの利用を提供する。これらの技術は、刺激に応答した、これらの生体分子の挙動の研究に基いている。これらの移動の分析は、帰納的及び間接的方法を利用するための画像化処理、問題の生物的事象を定量化させる任意の値への画像化処理を含む。
【0003】
これらの顕微鏡的方法は、分子標的の位置、次いで位置の任意の変更を決定することにある。これらの方法のために、分子標的は、一般的に、GFPファミリーに属することがある蛍光タンパク質で融合されている。このような細胞内の直接的視覚化の方法は、慣用的な蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、又は顕微鏡及び画像化取得を統合化する新規のプラットフォームによって達成される。かかるプラットフォームは、例えば、TRNSFLUOR技術(分子デバイス)又は機器、例えばOPERA(Evotech Technologies)又はIn Cellアナライザー(GE Healthcare)(John Comley, DDW, summer 2005, 第31-53頁参照)で用いられる。
【0004】
しかしながら、かかる技術の使用は、多数の不利益によって制限されている:
−顕微鏡的研究は、扱いにくく、自動化するのが困難であり、複雑な画像分析ツール、特定のソフトウェア、及び経験の豊富なユーザーを必要とする;それらは、膨大な時間も必要とする。
−画像分析は、複雑であり、一般的にエラー源であり、これらの技術は、再現が難しく、むしろ信頼性がない(パラメータZ'の低い値)。
−それらは、一次的なスクリーニングステップにおける使用を限定する分子スクリーニングの適正なスループットで、生細胞内の生物的事象についていくことを可能にする。
−視覚化された効果は、一般的に、シグナル伝達カスケードのダウンストリームである。
【0005】
これらの主な理由によって、これらの技術は、ハイ-スループット分子スクリーニングと適合しない。
【0006】
これらの特徴とは別に、これらの技術は、ほとんどの場合、初期の事象のカスケードの結果である1以上の細胞事象を定量するために役立ち、測定することが望まれる事象への間接的なアクセスを与える。更に、これらの技術は、生体分子間の相互作用に関する直接的な情報、又は1つ及び同一分子内の構造的変化に関する直接的な情報を提供しない。これらの情報のいずれも、検出及び定量されることが望まれる生物的事象の直接的なインジケーターである。
【0007】
近頃、生体分子間の相互作用、又は1つ及び同一の生体分子内の構造的変化(これらのいずれも生物的事象の証拠である)を特徴付けることができる細胞内の技術は、異なった蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその様々な変異体間のエネルギー移動(FRET)の技術に基いている。例えば、GFPの2つのタンパク質変異体(CFP及びYFP)は、FRETを確立するための適合可能なペアを形成する。それらは、対象の標的タンパク質と融合され、生細胞内で発現され得る。このようにして標識されたタンパク質間の相互作用又は構造的変化に関連する多数の事象は、FRET法を用いて検出されている(Janetopoulos他, SCIENCE (2001) 291: 2408-2411, Vilardaga他, NATURE BIOTECH (2003) 21: 807-218、及びWO 2004 057333 A1)。
【0008】
GFP(CFP及びYFP)の2つの変異体はまた、1つ及び同一の標的タンパク質との融合産物として生細胞内で発現され得る。GFPの2つの変異体と二重に融合されたこの生体分子は、バイオセンサーとして定義されている。バイオセンサーは、生物的環境内の変化によって異なった構造を採用することができ、FRET法によってモニターされるべきこれらの構造的変化について可能である。かかる生体分子は、多数の細胞事象、例えばcAMP、IP3又はcGMPの産生、をモニターするために使用され得る(Nikolaev他, JBC, Vol.279, No.36, pp.3715-37218, 2004, Tanimura他, JBC, Vol.279, No.37, pp.38095-38098, 2004、米国特許第6.924.119 B2号明細書参照)。
【0009】
しかしながら、これらの蛍光タンパク質の使用は、ある主な不利益を有する:
−2つの蛍光分子(CFP及びYFP)の重複スペクトルは広く、ドナー(CFP)を励起するために使用される波長でアクセプター(YFP)の強力な寄生的(parasitic)励起を引き起こす。この寄生的汚染は、シグナル対ノイズを1.5未満の値に減少させる、強力なバックグラウンドノイズを誘導する。調節のかかる小さな差は、これらの技術が、ハイ-スループット分子スクリーニングにおいて満足に使用されないようにする。
−FRETをこれらの蛍光タンパク質で検出するために使用される波長において、細胞に固有の自己蛍光は、FRET読み値を混乱させる。
−顕微鏡的分析は、FRETシグナルの微妙な変化を明らかにするために必要であるかもしれない。その結果、かかる分析は、第1の検出法について上で述べたものと同一の不利益を示す。
−GFPの変異体の限定された数は、主な変化がCFP/YFPペアのフォスターの半径(Ro)と一致する適用に、かかるタンパク質の使用を制限する。
−これらのタンパク質は、標的タンパク質と融合される。これらのタンパク質の蛍光は、細胞がそれを発現すると直ちに検出され、はるかに複雑な発現系を与えることなく、実験者によって引き起こされ又は調節され得ない。
【0010】
実験者によって調節され得る、GFP又はその変異体を用いてFRETに替わるものとしては、BRETと称される生物発光を生じる分子の利用である。BRETプロセスは、ルシフェラーゼ及びGFPでそれぞれ標識されたタンパク質間で、生細胞において起こり得る。ルシフェラーゼをパートナーの1つと融合し、GFPを他のパートナーと融合することによって、いくつかの細胞内タンパク質相互作用を測定することが可能となった(Mulligan G., Eur. J. Pharm. Sci. 2004 Mar; 21(4): 397-405, Boute N.他, Trends Pharmacol. Sci. 2002 Aug; 23(8): 351-4、及びTrugnan G.他, Med Sci. (Paris), 2004 Nov; 20(11): 1027-34参照)。酵素ルシフェラーゼの基質が試験される細胞調製物に導入されるときに、エネルギー移動プロセスが開始される。2つのパートナーをかなり接近させるタンパク質相互作用の場合に、ルシフェラーゼは、GFPを励起する光を発生する。GFPによって発光される蛍光シグナルは次いで測定される。
【0011】
CFP/YFPペアと同様にして、多数の不利益は、ハイ-スループットスクリーニング(HTS)におけるルシフェラーゼ/GFPペアの使用を限定する:
−BRET試験のシグナル-ノイズ比はかなり低い。
−蛍光シグナルは、試験化合物の自己蛍光によって容易にマスクされる。ハイ-スループットスクリーニングと全く適合しない非常に短いリーディングウィンドゥを残すBRET法は、時間中のシグナルの低い安定性のために、スクリーニング分子にはあまり強力でない。
【0012】
生体分子間の相互作用を試験するための他の方法系は、機能的な相補性プロセスを用いる点にある。対象の生体分子は、第3の他の2つの不活性断片と融合される。対象の生体分子間の直接的な相互作用が起こる場合に、その後に第3の他の2つの不活性断片は、直接的な相互作用によって又はタンパク質スプライシングのより複雑なプロセスによって、活性が測定できる機能性の第3タンパク質を再構築する。対象の生体分子間の相互作用によって活性が保持されたこのタンパク質は、測定された活性が発光シグナルである場合には、
ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、例えばGFP(Ozawa T., Current Opinion in Chemical Biology, 2001, no.5, pp 578-586参照)、又は酵素活性が比色分析法(Eglen R., ASSAY and Drug Develop. Technologies, 2002, vol.1, pp 97-104参照)及びDISCOVER製のPath Hunter(登録商標)によって測定される酵素、例えばβ-ガラクトシダーゼ、でよい。
【0013】
機能的な相補性を用いるこれらの方法の主な不利益は、生体分子間の相互作用の測定が、第3のタンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼのその活性形態での完全な再構成に依拠し、そして、生体分子が通常相互作用する細胞コンパートメント以外の細胞コンパートメントへの相互作用複合体の移動を必要とする、という事実にある。最後に、相互作用が酵素活性の測定によって検出される場合に、機能的相補性は、対象の生体分子間の相互作用を特徴付ける間接的な方法である。機能的相補性の使用は、単一バイオセンサー型分子の場合にはより複雑である。
【0014】
これらのエネルギー移動プロセスで使用されるタンパク質の固有の性質によって、蛍光タンパク質、例えばGFP(又はその他の変異体)又は生物発光タンパク質、例えばルシフェラーゼを使用する方法は、エネルギー移動プロセスに関連するドナー/アクセプター対の選択に大きな柔軟性を許容しない。
【0015】
「量子」と称される特定の蛍光分子の使用は、非常に多くの可能なドナー/アクセプター対を与える。これは、広い範囲の励起波長に渡って機能させることができ、そして、異なったペアを組み合わせることによって、付随して測定される生体分子間の異なった相互作用を可能にする(多重技術)。しかしながら、細胞においてこれらの化合物で特異的に生体分子を標識することは困難である。
【0016】
細胞内FRET適用のための蛍光有機分子の使用は、例えば、生細胞におけるメッセンジャーRNAの視覚化のために記載されてきた。この場合に含まれる相互作用は、標的メッセンジャーRNAと蛍光有機化合物で標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとの一致に基いている(Dirks他, 2003, METHODS, Jan 29, no.1, pp 51-57、及びTsuji他, Biophys. J. 2001 Jul; 81(1): 501-15)。この場合に得られる情報は、顕微鏡による検出に依拠するので定量的ではない。更に、対象の2つの生体分子間の相互作用を定量するものではなく、対象のメッセンジャーRNAの存在を明らかにするために役立つにすぎない。
【0017】
生細胞内の生物学的現象を試験すると同時に、公知の方法の使用に関連する不利益を避けるための、新規なツール及び方法について科学協会では真の要求が存在する。
【発明の開示】
【0018】
発明の説明
顕微鏡の助けを借りない生細胞における細胞内相互作用の定量的及び直接的な分析の本発明の方法は、時分割FRET(TR-FRET)による検出を実行するために、長命蛍光化合物の性質を利用する。
【0019】
この方法は、第1の長命ドナー蛍光化合物、及び第1の蛍光化合物と適合すするスペクトル的性質を有する1以上のアクセプター蛍光化合物を使用する。
【0020】
この時分割FRET測定は、バックグランドノイズの問題、及び細胞及びおそらく試験分子の自己蛍光の問題を解決する、2つの方法を提供する:
−蛍光化合物の長命、好ましくは100ナノ秒超は、短命蛍光化合物の発光が存在しない測定用の時間ウィンドゥを定義ができるようにする;
−2つトレーサーの測定(そのうちの1つは対照)は、2つのトレーサー間の蛍光発光比を読み値として用いて、残りの自己蛍光の効果を補正できるようにする。
【0021】
その感度、その特異性、その信頼性及びその分子分割によって、TR-FRETは、本発明の方法において、ルシフェラーゼ及びGFPを用いて、CFP/YFPのFRET適用又はBRET適用の生細胞で観察される全ての不利益をなくすことができる。特に:
−蛍光化合物の幅広い選択及び時分割の読みは、ドナーを励起するために使用される波長でアクセプターの強い寄生的励起を排除することができる;
−時分割の読みは、細胞及び試験タンパク質の自己蛍光の効果を除くことができる;
−TR-FRETシグナルの振幅は、色素/蛍光タンパク質を用いるFRET法で測定されたものよりも大きい。
【0022】
TR-FRET法は、これまで、生細胞で使用されてこなかった。このことは、出願人が解消することができた多数の技術的障害に起因する。
【0023】
生細胞においてこの方法を実行することに関連する主な技術的問題の1つは、蛍光化合物のほとんどが通常、非常に親水性であり、血漿膜を通過しない、という事実にある。別の問題は、これら化合物がその環境に敏感であるという事実、特にその蛍光収率は生物学的媒体中で大きく影響され得るという事実に関連する。最後に、出願人は、細胞の生物学的全体性に影響を与えることなく、細胞外に導入された蛍光化合物で細胞中に存在する生体分子を標識するために、別の障害を克服しなければならなかった。
【0024】
本発明の方法は、これらの障害を回避することができ、よって、生細胞内の生物学的現象を研究する効果的な手段を提供する。
【0025】
本発明の方法は、特定の刺激に反応する生細胞における生体分子間の相互作用、又は構造的修飾を検出し、定量することができる。
【0026】
本発明の方法は、生体分子の相互作用、又は生細胞中の生体分子の転位もしくは構造的変化を検出する方法であって、以下のステップ:
1)生細胞中の第1生体分子を、長蛍光寿命を有する第1蛍光化合物で標識し;
2)当該生細胞中の少なくとも1つの第2生体分子を第2蛍光化合物で標識し;
3)試験分子バンク(bank)に属する化合物の存在下又は非存在下に、試験される生物的反応に適合した特定の刺激に当該生細胞を供し;
4)波長が第1の長命蛍光化合物を励起する光源に当該生細胞を供し;
5)当該第1及び第2蛍光化合物によって発光された蛍光の密度を測定し、次いで当該第1蛍光化合物の蛍光強度と当該第2蛍光化合物の蛍光強度との比を計算し、あるいは当該第1又は第2蛍光化合物の寿命を測定し;並びに
6)測定されたシグナルを、当該細胞の刺激前に得られたシグナルと比較すること、
を含む。
【0027】
生細胞の発光励起は、当業者に周知の方法、例えば、レーザー源、フラッシュ又はキセノンランプによって実行され得る。
【0028】
本発明の方法で使用される異なった蛍光化合物の発光、強度及び寿命の測定は、当業者に周知の慣用的方法を用いて、FRETシグナルの方法によって実行される。本発明の方法に従う時分割型FRETシグナルを検出するための好適なリーダーは、BMG Labtech製のRUBYスター又はPHERAスター型のもの、あるいは時分割測定と適合する他のリーダー、例えば、ULTRA、ULTRA Evolution又はTECAN製のGENios ProもしくはMolecular Devices製のアナリストである。第1の蛍光化合物の蛍光と第2の蛍光化合物又は他の蛍光化合物(複数分析の場合に)の蛍光との比は、特にEP 569 496 B1に記載されている当業者に公知の方法によって計算される。
【0029】
生体分子を標識するために使用されるフルオロフォアは、TR-FRETパートナー蛍光化合物である。本発明によれば、「TR-FRETパートナー蛍光化合物」は、蛍光スぺクトルが部分的に重複し、ドナーが長命蛍光化合物であり、アクセプターがドナーよりも短命蛍光化合物である、蛍光化合物のペアを意味するものと理解される。当業者は、本発明に従う方法を実行するための、TR-FRETパートナー蛍光化合物のペアを選択することができる。
【0030】
本発明に従う方法を実行するための別の形式において、及び細胞中の生体分子の構造的変化を研究するように望まれる場合には、2つの蛍光化合物は、1つ及び同一の生体分子を標識するために使用される。
【0031】
1つの具体的な変形では、本発明に従う方法は、他の蛍光化合物で生体分子を標識するための追加のステップを含み、より複雑な生物的現象を研究することができる。この場合には、系は、第1の長命ドナー蛍光化合物及び数個の他のTR-FRETパートナーアクセプター蛍光化合物を依然として含むだろう。それによって、1つ及び同一の細胞中のいくつかの相互作用、転位又は構造的変化を測定することができる。
【0032】
生体分子
「生体分子」は、生物に存在する意義のある分子として理解され、特に、生物の構造を構成する分子、及びエネルギーの生成及び変換、又は生物的シグナルの伝達に関連する分子として理解される。この定義は、核酸、タンパク質、糖類、脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、代謝物、中間体、酵素、ホルモン及び神経伝達物質を含む。
【0033】
本発明に従う方法の手段によって研究され得る生体分子は、当業者に公知の異種発現法によって培養中の生細胞中で発現される分子の全ての種類である。これらの生体分子は、例えば、生細胞によって人工的に産生された、任意のタンパク質、任意の脂質、糖類又はオリゴヌクレオチドでよく、例えば、膜受容体、例えば、チロシンキナーゼ受容体及びGタンパク質及びヘテロ三量体Gタンパク質のサブユニットに結合された7-ドメイン膜貫通型受容体、非-膜受容体、例えば、ホルモン受容体、イオンチャネル、膜上に存在するトランスポーター(アクアリン(aquarine)、ナトリウムトランスポーター、重炭酸(HCO3)トランスポーター)、イオンポンプ(ナトリウム/カリウムポンプ)、シグナル形質導入タンパク質、例えば単量体Gタンパク質、酵素、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスグルタミナーゼ、ヒドラーゼ、ハロゲナーゼ、リパーゼ、トランスフェラーゼ及び代謝酵素、スカフォールドタンパク質、例えばSOS、GRS、IRS及びHSP、脂質結合タンパク質、N-ミリスチル化、S-パルミトリル化、S-プレニル化又はゲラニルゲラニル化型の脂質固着による膜と関連するPH又はFYVEを含むタンパク質、Gタンパク質(単量体又は三量体)と結合された受容体に関連するタンパク質、例えばGEF、GAP及びRGS、ヘテロ六量体Gタンパク質のサブユニット及びGタンパク質と結合された7-ドメイン膜貫通型受容体、アダプタータンパク質、例えばSH2又はSH3ドメインを含むタンパク質、転写因子、例えばc-fos、c-jun及びCREB、ミトコンドリアタンパク質(例えば、呼吸タンパク質、チトクロームC、カスパーゼ、PBR等)、リン脂質、核タンパク質、例えばDNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ及びトポイソメラーゼ、「細胞死」受容体ファミリーのタンパク質、例えばFAS、アポトーシスタンパク質、例えばbcl-2ファミリーのタンパク質、並びに細胞周期タンパク質、例えばcdk及びサイクリンでよい。
【0034】
生細胞
本発明で使用される生細胞は、当業者に公知の方法によって培養される生細胞の全ての種類であり、例えば、原核生物細胞(バクテリア)、酵母、不死の真核生物細胞株、昆虫細胞、及び一次培養物、例えば哺乳動物の血液、組織又は臓器由来のものである。本発明の方法は、生細胞で働き、細胞内生化学メカニズムの全体を維持させることができる、ことを強調するのは重要である:細胞膜は、先行技術の他の方法の場合と同様に透過されず、細胞は固定される必要がない。
【0035】
本発明に従う方法によって明らかにされ得る分子間の相互作用は、多数あり、変動し、当該方法で使用される生体分子の性質による。これらの相互作用は、例えば、アンドロゲン受容体と細胞核への細胞質受容体の転位、細胞質の刺激の後に細胞血漿膜をつくる脂質への転位を経るPKC-γの転位、活性であるようにカルモジュリンとの結合を必要とするカルシニューリン複合体の転位、p65/p50の転位などを誘導するアンドロゲンとの間の相互作用でよい。
【0036】
生細胞内の生体分子の構造変化そのものは、ある刺激環境の下で起こり得る。これら修飾は、例えば、ベータ-アレスチン、EPAC(cAMP結合タンパク質)、小単量体Gタンパク質交換因子(GEF)、イオンチャネル、例えば迅速な不活性化能力に依拠したK+チャンネル等であり得る。
【0037】
蛍光化合物
フルオロフォアとも称されるいくつかの蛍光化合物が本発明の方法で使用されている。これらの化合物の内の1つは長い蛍光寿命を有しており、他の化合物は、短い蛍光寿命を有している。全ての場合において蛍光化合物は、R-FRETパートナーである。
【0038】
本発明の目的に特に好適な長命蛍光化合物は、好ましくは、100ナノ秒以上の寿命を有する。
【0039】
正確には、これらの好適な蛍光化合物は、希土類複合体、例えばクリプタート及びキレート、特に、1以上のピリジン単位を含むクリプタートである。かかる希土類クリプタートは、例えば、ヨーロッパ特許EP 180492、EP 321353、EP 601113及びWO 01/960877に記載されている。テルビウム(Tb3+)及びユウロピウム(Eu3+)のクリプタートは、特に、本発明の目的のために好適である。希土類キレートは、米国特許第4761481号明細書、同第5032677号明細書、同第5055578号明細書、同第5106957号明細書、同第5116989号明細書、同第4761481号明細書、同第4801722号明細書、同第4794191号明細書、同第4637988号明細書、同第4670572号明細書、同第4837169号明細書及び同第4859777号明細書に記載されている。他のキレートは、ノンアデンテート(nonadentate)リガンド、例えばテルピリジンからできている(ヨーロッパ特許EP 403593、EP 5324825、EP 5202423、EP 5316909)。
【0040】
本発明の目的に適合する希土類キレートの1つの具体的な例は、以下の式のキレートである:
【0041】
【化1】
【0042】
FRETパートナーのペアのドナーメンバーとして使用され得るこの化合物の合成は、Poole R.他のOrg. Biomol. Chem ., 2005, 3, 1019-1024 「セルロ(cellulo)の利用に好適な、高発光かつ速度論的に安定なラントニド複合体の合成及び特徴付け」によって記載されている。以下の実施例6は、この種の化合物が細胞内の時分割シグナルを定量するために使用され得る、ことを示している。
【0043】
短命蛍光化合物は、蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特に、CFP、YFP)、並びに100ナノ秒未満の寿命を有する蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及び蛍光分子、BODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている、アレクサフロオロとして知られている化合物、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコビリプロテイン、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、及び量子ドットから選ばれる。他の好適な蛍光化合物は、特許出願第FR 2840611に記載され、オリゴヌクレオチドと結合されたフルオロフォアを含む。
【0044】
蛍光化合物による生物分子の標識
生物分子を蛍光化合物で標識する別の方法を以下に詳細に記載する。
1)対象の生体分子(複数)と、固有の蛍光特性を有するタンパク質、例えばGFPのタンパク質、との融合タンパク質の生成。かかる融合タンパク質の発現は、当業者によく知られ、そして、例えば、生細胞、そのDNAが融合タンパク質をコードする発現ベクター、例えばプラスミドへの安定な又は一時的な形質転換にある、分子生物学の技術を採用する。
【0045】
2)対象の生体分子(複数)と、自殺酵素活性を有するタンパク質、例えば対象の生体分子(複数)上に蛍光化合物を共有結合的かつ不可逆的に移動するSnapTag(Covalys)又はHaloTag(Promega)との融合体の生成。この場合の蛍光化合物は、自殺酵素の基質に共結結合的に結合され、細胞外媒体に導入される。以下の方法は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない、蛍光化合物/基質の複合体を生じさせることができる。
【0046】
自殺酵素は、酵素活性が、基質と急速にかつ共有結合的に結合する能力をタンパク質に与える特定の変異によって修飾されているタンパク質である。これらの酵素は、各々が1つのみの蛍光分子と結合することができ、酵素活性が基質の結合によって妨害されているので、自殺酵素と呼ばれる。現在、自殺酵素の2つの公知のファミリーは、この種の標識を可能にする:
−基質の内の1つがベンジルグアミンであるアルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼの変異体(又はCovalysによって販売されているSnapTag)(Klepper A.他 (2003)参照) in Nature Biotechnology, vol.21, p.86及びWO 02/083937 A2);
−自殺型の酵素反応を生じ(WO 04/072232 A2)、基質の中にはクロロアルカンファミリーの化合物であるものがある、デハロゲナーゼの変異体(Promegaによって市販されているHaloTag)。
これらの2つの場合において、これらの自殺酵素によって取り込まれるだろう基質は、最初に蛍光有機化合物で標識されなければならないだろう。
【0047】
3)対象の生体分子(複数)と、対象の蛍光分子(複数)で予め標識された相補的配列との結合の後にタンパク質スプライシング活性を獲得する配列、例えばインテインドメインSsp DnaEをコードする配列、との融合タンパク質の生成、その結果、標的生体分子(複数)上にペプチド結合の手段によって蛍光化合物を共有結合的かつ不可逆的に移動させることができる。
【0048】
この方法は、タンパク質スプライシングと称される生物学的形質導入後の変異プロセスを利用する。このプロセスは、前駆体タンパク質に存在するインテインと称されるドメインを除き、そしてインテインドメインのいずれかの側に位置する2つのドメインをペプチド結合の手段によって結合するという、究極的な目的で一連の化学反応を触媒する。タンパク質-トランス-スプライシングは、相補的なインテインドメインの2つの半分を必要とする。第1の半分は、標的タンパク質と融合し、第2の半分は、蛍光分子と融合される。この方法は、Muir T. W.他 (2003) J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181によって記載される。以下に記載の方法は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない、「蛍光化合物/インテイン」複合体を生じる可能性がある。
【0049】
4)試験される生体分子(複数)と、特定の認識特性及び対象の蛍光化合物(複数)で予め標識された基質との高アフィニティ結合を有する、ペプチド配列、又は結合パートナーのペアのメンバー、との融合タンパク質の生成:例えば:
−二ヒ素化合物に結合する性質を有する、システイン-システイン-X-X-システイン-システイン配列(CCXXCC)。これらの二ヒ素化合物は、フルオレセイン又はローダミン型の有機分子で容易に標識できる(技術の詳細については。B. A. Griffin他 (1998) Science 1998, 281, 26-27、及びS. A. Adams他 (2002) J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 6063-6076参照)。
−ポリヒスチジン反復は、蛍光化合物の「クエンチャー」分子と結合できる金属イオンと結合する(E. G. Guignet他 (2004), Nature Biotech., 2004, 22, 440-444参照)。
−タグBTX(ブンガロトキシン)は、ブンガロトキシン(BTX)によって認識される13アミノ酸のペプチドからなっており、蛍光分子と予め結合できる(C. M. McCann他 (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952参照)。
−ストレプトアビジンの結合配列(SBP-タグ)は、ビオチンに高いアフィニティを有する38アミノ酸からなる配列であり、フルオロフォアにより予め標識できる(C. M. McCann他 (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952参照)。
【0050】
5)試験される生体分子(複数)と、酵素基質に予め結合された蛍光化合物を、Tag配列の特定のアミノ酸上へ移動させるある酵素、例えば、トランスグルタミナーゼ又はリガーゼ、によって認識されるペプチド配列、との融合タンパク質の生成。
【0051】
ペプチド配列PKPQQFM(プロリン-リジン-プロリン-グルタミン-グルタミン-フェニルアラニン-メチオニン)は、例えば、トランスグルタミナーゼと称される酵素によって認識される。トランスグルタミナーゼは、その基質(カダベリン)と結合された蛍光有機化合物を配列PKPQQFMの第1のグルタミン残基上に直接移動する(Taki他 (2004) Protein Engineering, Design Selection, 2004, 17, 119-12)。以下に記載の技術は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない蛍光化合物/基質の複合体を生じさせる。大腸菌酵素ジヒドロフォレートレダクターゼ(eDHFR)の配列は、高アフィニティで、リガンド、例えば、Active Motifの「リガンド連結普遍的標識法」として知られている技術に従って蛍光化合物が接ぎ合わされ得るトリメトプリム、に特異的に結合する。
【0052】
6)核酸配列はまた、トランスフェラーゼ活性を有する酵素によって特異的に認識され、補助因子又は基質に存在する蛍光有機分子を特定の配列に直接、共有結合的に結合させることができる。かかるプロセスは、特定の核酸配列5'-TCGA-3'によって説明されるだろう。当該核酸配列上では、メチルトランスフェラーゼTaq1が補助因子アジリジン上に予め接ぎ合わされた蛍光化合物を移動する(Pljevaljcic G.他 (2004) ChemBioChem, 5, 265-269参照)。
【0053】
従って、本発明に従う方法において、蛍光化合物/生体分子標識は、蛍光化合物及び生体分子の各々を、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるペアのメンバーと結合させることによって実行される。
【0054】
上記の標識法は、時には、本来、脂肪親和性でなく、細胞膜を通過するために細胞に本来侵入しない、化合物を生じることを含む。これらの化合物又は基質、あるいはタグ又は上記の結合パートナーのペアのメンバーとのその複合体は、例えば以下の方法の1つを用いて、細胞に導入される:
1)脂質二重層の通過中に荷電基をマスクするエステルの使用;これらのエステルは、プロドラッグと称される化合物のカテゴリーに入り、生理的条件下での加水分解の後に「親」化合物を与えるために、in vivoで急激に形質転換される化合物を意味する(T. Higuchi and V. Stellaの、"新規送達システムとしてのプロ-ドラッグ", 第14巻, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975))。例えば、主に、ピバロイルオキシメチル及びアセトキシメチル基、及びグリコール酸エステルを含む(Nielsen and Bundgaard, Int. J. of Pharmacy 39 (1984) 75-85)。この方法が使用されるときには、これらの基の1つはフルオロフォア上に共有結合的に接ぎ合わされる。
【0055】
2)フルオロフォアに共有結合的に接ぎ合わされたウイルスペプチドの使用:これらのペプチドの中には、現実には、フルオロフォアに細胞膜を通過させることができるものがある。かかるウイルスペプチドの例は、「ペネトラチン」及び「トランスポータン」(Langel他, Bioconj, Chem. (2000), 11, 619-626)、ポリアルギニン(Wender他, アルギニン型b分子トランスポーター, Org. Lett. (2003), 5(19), 3459-3462)又は他のペプトイドのアナログ、グアニジン基を有するペプチドアナログ(細胞取り込みを許容し又は亢進する分子のデザイン、合成及び評価:ペプトイド分子トランスポーター, Wender他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 13003-8)又はテトラ-グアニジニウム単位を含む非-加水分解性誘導体(Fernandez-Carneado, J.他, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874)が挙げられる。
【0056】
3)ウンデシルグリセロール又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖を用いてオリゴヌクレオチドで例証される方法に従う、コレステロール又はビタミンEの分子を含む側鎖、又は細胞膜と相互作用する脂肪族鎖の付加によって蛍光化合物の脂肪親和性及び極性の修飾(最小限のホスフォロチオエート-保護オリゴヌクレオチドと、1-O-ヘキサデシルグリセロールとの3'-末端複合体:合成及び放射線-抵抗性細胞中の抗-ras活性、Rait他 , Bioconj. Chem. (2000), 11, 153-160)。
【0057】
これらの修飾は、カチオン性界面活性剤(カチオン性「脂質」)よりも効果的であり、カチオン性界面活性剤は、核酸との超分子複合体を形成し、エンドサイトーシスを増加するが、毒性で、細胞膜を損傷する。
【0058】
有利なことに、本発明に従う方法では、少なくとも1つの蛍光化合物は、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む。当該単位は、以下の群:エステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び膜トランスポーターによって支配されるウイルス性ペプチド、例えば、ペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基例えばオリゴグアニジニウム基を有するペプトイド、コレステロール又はビタミンE基、あるいは脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる。
【0059】
本発明を実行する1つの別の形式では、少なくとも2つのTR-FRETパートナー蛍光化合物は、血漿膜を通過できるようにする単位を含む。
【0060】
有利なことに、自殺酵素の基質に蛍光化合物を結合させることができ、同時に、反応性の化学基、例えば特にアミン又は酸基を当該蛍光化合物上に発生させることができる。当該反応性の化学基は、次いで、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を蛍光化合物と結合させることができる。
【0061】
例えば、図7及び8を参照されたい。図7及び8は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられたベンジルグアニンとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する(この複合体は、以下「トリポッド」と称される)。
【0062】
血漿膜を通過できるようにする前記単位は、その後、この反応性化学基を介する共有結合によって導入され得る。
【0063】
NH2基を有するトリポッドは、COOH基を有するベクター系を統合することができ、COOH基を有するトリポッドは、NH2基を有するベクター系を統合することができるだろう。
【0064】
本発明は、本発明に従う、生体分子又は生細胞中の生体分子の転位もしくは構造的変化の相互作用を検出する方法を実行するための試薬を含む、パーツのキットを更に提供する。
【0065】
キットは以下を含む:
−第1の蛍光化合物及び第2の蛍光化合物、これらの化合物は、TR-FRETパートナーであり、これらの化合物の少なくとも1つは、血漿膜を通過できるようにする単位を含む;
−当該生体分子を含む生細胞;
−蛍光化合物で生体分子を標識する手段;並びに
−生体分子の相互作用の現象、又は生細胞における生体分子の転位又は構造的変化を試験するための教示。
【0066】
本キットに含まれる試薬は、生細胞中に存在する、試験される生体分子を、TR-FRETパートナー蛍光化合物で標識することができる:実際に、これは、蛍光化合物及び生体分子がそれぞれ、SnapTag基質、例えばベンジルグアニジン/酵素SnapTag、HaloTag基質、例えばクロロアルカン/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるペアのメンバーと結合される、ことを意味する。
【0067】
蛍光化合物の少なくとも1つは、血漿膜を通過できるようにする単位を更に含む。当該単位は、以下の化合物:エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、コレステロールもしくはビタミンE基、又は脂肪族鎖、あるいは脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる。
【0068】
本キットに含まれる生細胞は、相互作用が研究するには望ましい生体分子を発現するように遺伝子的に改変できる。これらの改変は、当業者によく知られた分子生物学の慣用的方法、生体分子又は対象の生体分子を含む融合タンパク質を発現するプラスミドによる細胞の安定的かつ一時的なトランスフェクション、を採用する。
【0069】
本発明に従うキットに含まれるTR-FRETパートナーフルオロフォアは、長命蛍光化合物であり、少なくとも1つの蛍光化合物が、以下:蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、100ナノ秒未満の寿命を有する有機蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及びBODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている蛍光分子、アレクサフルオロとして知られている化合物、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、から選ばれる。
【0070】
好ましくは、長命蛍光化合物は、100ナノ秒超の寿命を有し;特に好ましくは、希土類キレート又はクリプタートである。本発明に従うキットの1つの具体的な態様では、希土類は、テルビウム又はユウロピウムである。
【0071】
本発明を以下の実施例の方法によってより詳細に説明することができるが、いずれの場合にも本発明の適用を制限するものではない。
【実施例】
【0072】
実施例1:タンパク質キナーゼC-ガンマ(PKC-γ)の転位の測定(フローチャート、図1参照)
プロテインキナーゼCは、リン脂質依存型セリン/スレオニンキナーゼの群に属するタンパク質である。これらのタンパク質は、多数の細胞シグナル伝達経路において主な役割を果たす。生理学的にPKC-γは、ホスファチジルセリン(PS)によってカルシウム-依存型で活性化され、ジアシルグリセロール(DAG)と結合するが、PKC-γは、腫瘍-誘導ホルボールエステル(PMA)によってDAGの存在とは関係なく活性化され得る。
【0073】
刺激の後、PKC-γは、血漿膜への細胞質の転位を経る。この転位は、PMAによる刺激の後にGFPとの融合タンパク質の方法によって測定することができる(Sakai N. J., Cell Bio. (1997) 139, 1465-1476)。
【0074】
PKC-γをアクセプター蛍光有機化合物で標識するために、PKC-γとHaloTagと称される自殺酵素との融合タンパク質が作製され、標識されたPKC-γを有するFRETに加わることができるドナー蛍光有機化合物で特異的に血漿膜を標識するためのツールが開発された。
【0075】
血漿膜は、形質導入後の修飾の酵素によって認識される配列であるCys-Ala-Ala-X(Xは任意のアミノ酸である)と融合された、SnapTagと称される自殺酵素で、特異的に標識される。この配列は、SnapTag酵素のC-末端位のファルネシル基の結合を生じるだろう。このことは、血漿膜の内層にこの酵素を標的し及び固定化する結果を有する。COS-7細胞は、一時的に、リポフェクタミン2000を用いて又はエレクトロポレーションによって2つのプラスミド構築物でトランスフェクトした。
【0076】
一時的トランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な各基質5μMを含む細胞培地で、細胞を1時間インキュベートする。各基質は、FRETを形成する蛍光有機化合物を有する。
【0077】
培地で洗浄した3時間後に、異なった刺激の後、例えば、12-ミリスチン酸 13酢酸ホルボールエステル(PMA)の添加後に、TR-FRETによって転位を測定する。TR-FRETシグナルの増加は、転位プロセスの増加と相関する。
【0078】
PKC-γの転位経路を潜在的に阻害する分子は、転位の刺激に対する効果を試験するために培養培地に加えられる。
【0079】
実施例2:アンドロゲン受容体/コアクチベーター又はアンドロゲン受容体/コレプレッサー相互作用の解明(フローチャート、図2参照)
アンドロゲン及びその機能性レセプター(AR)は、外部の雄性表現型の通常の識別の原因となる。細胞質ゾルのアンドロゲンレセプターは、その不活性状態で、ヒートショックタンパク質と関連する。リガンドとの結合の後、レセプターは、二量化し、核への転位に供される。ARコレギュレーター(コアクチベーター又はコレプレッサー)は、レセプターと相互作用し、又は相互作用しないだろう。これらの相互作用の結果は、場合により、DNAと特定の配列で結合し(いわゆるAREは、アンドロゲンレセプター反応性因子)、その結果、転写を調節するための、複合体を生じるだろう。
【0080】
本発明に従う方法は、コレプレッサーと、コアクチベーターとARとの相互作用を明らかにするために使用される。このことは、細胞内媒体中に以下のものを発現するために、細胞に発現ベクターを導入することによって実行される:
−AR/SnapTag酵素融合タンパク質。SnapTag自殺酵素は、SnapTag基質で標識された蛍光化合物との結合を可能にする。
−HDAC1/HaloTag融合タンパク質。HDAC1(ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1)は、ARに結合できるコレプレッサーである。HaloTag自殺酵素は、HaloTag基質で標識された蛍光化合物との結合を可能にする。
−p160/インテイン断片融合タンパク質。p160は、ARに結合できるコアクチベーターである。インテイン断片は、タンパク質トランス-スプライシングによって、相補的インテイン断片を含む蛍光化合物との結合を可能にする。
【0081】
ARが、刺激(そのリガンドの結合)の後に核に存在する場合には、その最終的な効果は、TR-FRETシグナルを測定することによってアッセイできる:ARは、ドナー蛍光化合物で標識され、当該コアクチベーター及びコレプレッサーは、そのスペクトル特性が全く異なり、エネルギー移動後の発光波長が各々665及び780 nmである、2つのアクセプター蛍光化合物によって標識される。
【0082】
よって、665 nmでのTR-FRETシグナルの測定は、ARをそのコアクチベーターと結合する例であり、一方、780 nmでのTR-FRET測定は、AR/コレプレッサー相互作用の指標となるであろう。そのため、この試験形式は、単一の細胞試験における2種類の相互作用を検出することができる。この複数検出試験は、他の相互作用を同時に明らかにするために、他のアクセプター蛍光化合物を加えることによって更に改善される。
【0083】
実施例3:cAMPバイオセンサー:cAMP結合ドメインを含む融合タンパク質の構造的修飾の検出(フローチャート、図3参照)
本実施例では、ドナー/アクセプター蛍光化合物の一対のTR-FRETシグナルの変形は、これらのフルオロフォアとcAMP結合ドメイン(例えば、PKAのβII制御サブユニットの結合ドメイン、又はcAMP-活性化交換タンパク質の結合ドメイン、これらは、「CAMPS」として知られている)との結合によって測定される。これらの分子構築物は、Gタンパク質-結合レセプター(GPCR)の薬理学的刺激の後に、生細胞中で、cAMPのレベルを定量するために使用できる(Nikolaev他, JBC, vol.279, no.36, pp.37215-37218, 2004参照)。
【0084】
SnapTag/CAMPS/HaloTag型の融合タンパク質をコードするプラスミドは、HEK細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの24時間又は48時間後に、SnapTag及びHaloTag基質で(37℃で1時間)インキュベートされる。その各々は、TR-FRETドナー/アクセプターペアのメンバーと結合される。
【0085】
インキュベーションステップが完了すると、フルオロフォアは、SnapTag及びHaloTag酵素の自殺反応を介して共有結合的に結合され、CAMPSタンパク質は、TR-FRETに関連するフルオロフォアのぺアで標識される。
【0086】
基底状態では、TR-FRETシグナルが、フルオロフォアに近いために測定される。薬理学的刺激(例えば、HEK細胞で発現されるGタンパク質-結合レセプターのアゴニストによる刺激)の後に、cAMPの細胞内濃度は増加し、cAMPのCAMPSへの結合は後者のタンパク質の構造的変化を生じるだろう。次いで、測定されたTR-FRETシグナルの減少が観察される。
【0087】
本実施例は、TR-FRETシグナルの振幅が、cAMPのCAMPSタンパク質への結合と直接関連する、ことを示している。
【0088】
細胞内のcAMP濃度の減少、及びCAMPSタンパク質の構造の変形を引き起こし、TR-FRETシグナルの増加を測定することによって検出される、GPCRアンタゴニストを用いて、同一の実験を行うことができる。
【0089】
実施例4:カルシニューリン/カルモジュリン相互作用の測定(フローチャート、図4参照)
カルシニューリンは、ホスファターゼ活性を有し、細胞内カルシウムのレベルに関連する細胞シグナル伝達経路において基本的な役割を果たす。カルシニューリンは、2種類の転写因子:NFAT及びMEF2の方法によって哺乳動物におけるストレスの発生、及び当該ストレスへの適応に関連する。
【0090】
カルシニューリンは、2つのサブユニット、カルシニューリンA(CnA)及びカルシニューリンB(CnB)を含むヘテロダイマーである。この酵素は、そのヘテロダイマー形態で不活性であり、細胞内カルシウム濃度が増加すると、ホスファターゼ活性は、カルシニューリン/カルモジュリン複合体の形成によって刺激される。
【0091】
CnAサブユニット及びHaloTag酵素を含む融合タンパク質をコードするプラスミド、並びにカルモジュリン及びSnapTag酵素を含む融合タンパク質をコードするプラスミドは、リポフェクタミン2000を用いて又はエレクトロポレーションによって、細胞にコトランスフェクトされる。24時間又は48時間後に、SnapTag及びHaloTag酵素用の基質を含む培地中で、細胞は、37℃で1時間インキュベートされる。各々は、TR-FRETに適合するフルオロフォアの一対のメンバーと結合される。
【0092】
洗浄後、細胞はストレス(例えば、シクロスポリンA又は培地の酸性化)によって薬理学的に刺激される。測定されたTR-FRETシグナルは増加し、CnA/CnBへテロダイマーのカルモジュリンとの会合と関連する。
【0093】
試験をするのが望ましい、カルシニューリン-依存型シグナル経路の活性に影響を与える分子は、刺激の前に、測定培地に加えられる。本実施例は、本発明に従う方法が、生細胞内の、場合により試験化合物の存在下で、カルシニューリン-依存型シグナル伝達経路を試験できる、ことを示している。この種の試験は、このシグナル伝達経路を含む病理学的条件の処理を可能にすることがある候補化合物のハイ-スループットスクリーニングを可能にする。
【0094】
実施例5:抗-炎症活性を有する化合物のスクリーニング
TNF-アルファは、それが膜レセプターに結合すると、いくつかの細胞反応を起こす炎症性因子である。Bリンパ球内でTNF-アルファによって起こる反応の1つは、免疫反応の重要なステップである抗体の軽鎖の産生を調節する、転写因子NFκBの活性化である。よって、TNF-アルファインヒビターは、免疫反応を制御するために有用であり、例えば、感染性ショックの抑制において又は抗-炎症剤として使用できる。TNF-アルファ活性のこのようなインヒビターは、NFκB活性化レベルを測定することによって発見され、これは、本発明によって実行できる。
【0095】
図5は、細胞質ゾルタンパク質IκBによるNFκBの細胞質ゾル保持を説明する:NFκB(p65、p50)/IκB複合体が細胞質ゾル中で保持される。好適な刺激(T及びB細胞のマイトジェン、リポポリサッカライドおよびTNF-アルファ)は、IκBのリン酸化及びその分解を起こし、NFκBを遊離する。次いで、これは、細胞核を通過し、抗体の軽鎖の産生を活性化できる。
【0096】
本発明に従う方法は、分子生物学の慣用的方法によって、以下の構築物をBリンパ球に導入することにより適用される:
−IκB/SnapTag融合タンパク質を発現するベクター、これは、SnapTag基質と複合化されたドナ蛍光化合物で標識できる;及び
−p50/HaloTag融合タンパク質を発現するベクター、これは、HaloTag基質と複合化されたアクセプター蛍光化合物で標識できる。
【0097】
静止条件下に、NFκB(p65/p50)複合体はIκBとの複合体を形成し、TR-FRETシグナルが測定できる。細胞のTNF-アルファでの刺激の後に、IκBのリン酸化及び複合体のその分解は、TR-FRETシグナルを減少させるだろう。この減少の振幅は、NFκBの活性化の程度を表す。
【0098】
これらの細胞はマイクロウェルプレートで培養し、以下の処理の1つが異なったウェルに適用される:
−SnapTag及びHaloTag基質と結合されたドナー及びアクセプター蛍光化合物の添加、並びにTR-FRETシグナルの測定(高TR-FRET対照ウェル);
−SnapTag及びHaloTag基質と結合された蛍光化合物の添加、TNF-アルファの添加による細胞の刺激、並びにTR-FRETシグナルの測定(低TR-FRET対照ウェル);
−SnapTag及びHaloTag基質と結合された蛍光化合物の添加、試験化合物の添加、TNF-アルファの添加による細胞の刺激、並びにTR-FRETシグナルの測定(試験ウェル)。
【0099】
試験ウェルのシグナルは、高TR-FRET対照ウェルで測定したものと類似しているときには、試験化合物がTNF-アルファ活性に対する阻害効果を有すると結論できる。この値が、低TR-FRET対照ウェルで測定した値に近いときには、試験化合物がTNF-アルファ活性に対して効果を有さないと結論できる。
【0100】
本実施例は、薬物のスクリーニングについての本発明に従う方法の適用を説明するものであり、いわゆるハイ-スループットスクリーニングに特に好適である。
【0101】
実施例6:ユウロピウムキレートの時分割顕微鏡
本実施例は、本来、血漿膜を通過できる蛍光化合物の使用、及び時分割シグナルを細胞内で発光する能力を説明する。
【0102】
a)プロトコール
細胞をLABTEK培養チャンバーに接種し(密度 80,000 c/ml)、24時間培養し、培養培地で洗浄する。
以下の式のユウロピウムキレートを培養培地に加え(濃度20μM)、細胞を37℃で24時間インキュベートする。
【0103】
【化2】
【0104】
培養培地で洗浄した後、ヘキスト色素33342(濃度2μg/ml;供給者の文献:Sigma Aldrich B2261)を培養チャンバーに加え、次いで室温、暗闇で15分間インキュベートする。この色素は、細胞核を特異的に標識する性質を有する。
【0105】
培養チャンバーを、顕微鏡による画像の取得の前に、以下の装置を用いて「時分割」形式で、培養培地で再度洗浄する:Axiovert 200M顕微鏡(Zeiss)、UV励起源:パルス窒素レーザー(Spectra Physics)、及び以下のパラメータを有するPI-Max CCD(電荷結合装置)強化カメラ(Roper Scientific):
読み取り時間2ミリ秒:キレートからの全シグナルを回収するために、カメラは2ミリ秒間検出する;
遅延100マイクロ秒:時分割シグナルを拾う前に寄生的(parasitic)蛍光を削除するために課された遅延;
サイクル数/読み: 2ミリ秒間、30露光より多くシグナルを取得し、次いで適合する。
【0106】
b)結果
得られた画像を図6に示す。
透過画像(画像3)は、細胞の全体性及び細胞マットの密度を確かさを提供する。ヘキスト画像(画像2)は、細胞核の位置を見つけることができる。陰性対照(画像5)は、蛍光化合物の非存在下に時分割検出形式で得られたシグナルを示す。20μMの濃度で試験されたドナー蛍光化合物で得られた画像(画像1)は、FRETドナー化合物の細胞内の位置を明らかにすることができる。画像2及び1の重ね合わせは、蛍光が細胞内に存在することを示す。
【0107】
この種の時分割測定は、シグナル及びノイズゾーン上に対象の領域を指定し、測定されたシグナルの値からノイズの平均値を差し引くことによって、定量できる。
【0108】
本実施例は、血漿膜を通過できる希土類キレートが本発明を実行するために使用でき、かかる化合物によって発光されたシグナルが時分割顕微鏡によって測定できる、ことを示している。
【0109】
実施例7:ポリアルギニン単位及びベンジルグアニン基を含む蛍光複合体の合成、顕微鏡データ
a)BG-DY647及びDy647-R9-BGの合成
図9は、蛍光化合物DY647に共有結合的に結合された、ベンジルグアニンBG(SnapTag酵素の基質)を含む複合体の合成スキームを示す。
【0110】
図10は、一方でフルオロフォアDY647、他方でベンジルグアニンBGがその上に接ぎ合わされる(grafted)、9アルギニン(R9)を含む複合体の合成スキームを示す。
【0111】
b)CHO細胞は、5%のCO2を含む調節された空気の下で、F-12 HAM培地(Invitrogen)及び予め60℃で20分間不活性化された10%のウシ胎児血清(FCS)中で、37℃で培養する。
実験の前日に、細胞を分解し、75,000細胞/ウェルの密度でLABTEK培養チャンバー(Nunc)に接種する。
実験日に、試験化合物(BG-DY647又はDy647-R9-BG)を5μMの濃度に培養培地で調製し、1時間、細胞と接触させる。インキュベーション後に、培養培地で3回洗浄する。
顕微鏡的分析の前に、核染色をヘキスト色素で行う。
顕微鏡的分析は、Axiovert 200Mエピ蛍光顕微鏡(Zeiss)、40 Xレンズ、UV励起源:パルス窒素レーザー(Spectra Physics)及びCoolSNAP CCDカメラ(Photometrics)によって行う。
【0112】
図11は、複合体BG-DY647又は複合体DY647-R9-BGのいずれかによって得られた画像を示す。複合体DY647-R9-BGが細胞中に位置し、一方、複合体BG-DY647は、培養培地の溶液中に残っていることが明らかになった。そのため、DY647-R9-BGのような化合物は、特に、SnapTag酵素を含む細胞内タンパク質を標識するために血漿膜を通過できるアクセプター複合体として、本発明に従う方法において使用される。
【0113】
実施例8:培養中の細胞内へのフルオロフォアの侵入に対する、ポリアルギニン又はオリゴグアニジニウム修飾の効果の比較例、蛍光リーダーデータ
1)プロトコール
CHO細胞は、5%のCO2を含む調節された空気の下で、F-12 HAM培地(Invitrogen)及び予め60℃で20分間不活性化された10%のウシ胎児血清(FCS)中で、37℃で培養する。
実験の前日に、CHO-M1細胞を分解し、10,000細胞/ウェルの密度で96-ウェルプレートに接種する。
実験日に、培養培地を吸引し、濃度2.5μM又は5μMのKREBS緩衝液(Sigma)の試験化合物と交換する。1時間のインキュベーション後に、ウェルをKREBS緩衝液+0.05% Tween 20で洗浄する。細胞を次いでPBS緩衝液+0.1% Triton X100で溶解する。蛍光は、検出される化合物のスペクトル特異性に好適なフィルター及び二色性を有する、Analyst AD reader (LJL, Molecular Devices)で測定する。
【0114】
フルオレセインを有する化合物の例:
励起フィルター:パスバンド 485/22 nm
二色性:ハイ-パス 505 nm
発光フィルター:パスバンド 535/35 nm
希土類複合体を有する化合物の例:
励起フィルター:パスバンド 330/80 nm
二色性:BBUVm
発光フィルター:パス-バンド 620/10 nm
【0115】
b)結果
これらの条件下で4つの化合物を試験した:
−対照としての、血漿膜を本来通過できるフルオレセイン、及び血漿膜を本来通過できないカルボキシフルオレセイン;
−下記式:
【0116】
【化3】
【0117】
のR7-フルオレセイン誘導体、これは、図12に記載の合成スキームに従ってフルオレセイン構造に7アルギニン単位を含むポリアルギニン配列を接ぎ合わすことによって得られる;
−テトラグアニジニウム-フルオレセイン誘導体:テトラグアニジニウム配列(例えば、Fernandez-Carneado J. 他, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874によって記載されている)をカルボキシフルオレセイン構造:
【0118】
【化4】
【0119】
に接ぎ合わす。
【0120】
上記のプロトコールに従う化合物(図13)の各々について測定された蛍光強度は、ポリアルギニン及びテトラグアニジニウム配列が、FRETパートナーの1つを細胞に侵入させるために使用され、よって、FRETパートナーの1つが細胞膜を通過させることができるための単位として使用される、ことを示している。
【0121】
実施例9:構成的細胞内TR-FRET(HaloTag/SnapTagカメレオン)の例
本発明に従う方法は、生細胞中でFRETシグナルを明らかにするために使用される。これは、細胞内媒体中で、SnapTag及びHaloTagからなる融合タンパク質を発現するために、細胞中に発現ベクターを導入することによって実行される。SnapTag自殺酵素は、SnapTag基質(ベンジルグアニン)で標識した蛍光化合物との結合を可能にする。HaloTag自殺酵素は、HaloTag基質(クロロアルカン)で標識した蛍光化合物との結合を可能にする。
【0122】
SnapTag/HaloTag融合タンパク質の細胞発現のプラスミド構築物の入手:
HaloTag配列を有するプラスミドpHT2は、Promegaから入手できる。SnapTag配列を有するpSem-S1-ST26mプラスミドは、Covalysから入手できる。HaloTagのコーディング配列に相当するカセットは、EcoRV-NotI(Biolabs)を用いる酵素消化によってプラスミドpHT2から単離し、同一の酵素で予め消化されたプラスミドpCDNA3.1(Invitrogen)に移動される。
【0123】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。
配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0124】
SnapTagのコーディング配列に対応するカセットは、ClaI-XhoI(Biolabs)を用いる酵素消化によってpSEM-S1-ST26mから単離され、同一の酵素で予め消化されたプラスミドpBluescriptKS(Stratagene)に移動される。
【0125】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。
配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0126】
SnapTag/HaloTag融合タンパク質のコーディング配列を得ることができるプラスミドは、XbaI-KpneI(Biolabs)によるプラスミドpBluescriptKS-ST26mの消化によって単離された、SnapTag配列に対応するカセットを、NheI-KpneIによって予め消化されたプラスミドpCDNA3.1HaloTag移動することによって得られる。
プラスミドpBluescriptKS-ST26m-HaloTagに相当するプラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製によって得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0127】
COS-7細胞は、リポフェクタミン2000を用いて又は96-ウェルプレートでのエレクトロポレーションによって、プラスミド構築物pBluescriptKS-ST26m-HaloTagで一時的にトランスフェクトする。一時的なトランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な基質であって、その基質の各々は、FRETパートナーの一対のメンバー及び血漿膜を通過できるようにする単位に共有結合的に結合されている当該基質の各々を5μM含む細胞培地で、COS-7細胞を1時間インキュベートする(例えば、図7又は8のスキームに従って製造)。
【0128】
KREBS+0.05% Tween20での洗浄後、RubyStarリーダー(BMG)でFRETシグナルを測定する。これは、本発明に従う方法が、生細胞内で生じたFRETシグナルを測定するために使用できることを示す。
【0129】
実施例10:誘導された細胞内TR-FRET(FRB/FKBP)の例
使用されたモデル:
本発明に従う方法は、ラパマイシンが培養培地に添加されるときに、細胞内タンパク質FKBP12とタンパク質FRAPのFRBドメインとの相互作用を明らかにするために適用される。FKBP12は、イムノフィリンファミリーに属する12 kDaタンパク質である。ラパマイシンのFKBP12の結合は、これらのパートナーからFKBPを解離することによってタンパク質に細胞溶解性を付与する。タンパク質FRAP(又はmTOR)は、FRBドメインを含み:このドメインは、(mTOR E2015-Q2114の配列に相当する)99アミノ酸からなる。ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)菌から単離された分子であり、商業的に入手できる。それは、2つの異なった疎水性ポケットを有し、1つはFKBP上にあり、他の1つはFRB上にあり、2つのタンパク質と同時に結合する。
【0130】
【化5】
【0131】
−細胞発現プラスミド内のHaloTag/FRB融合タンパク質を得るための構築物
PCRは、以下のプライマー:
プライマーERV-Nco-HT-s:5' gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
プライマーHT-PstI-HT-as:5' acttaattaactgcaggccggccagc 3'
用いてプラスミドpHT2(Promega)で実行される。
【0132】
PCRは、72℃のハイブリダイゼーション温度で、ポリメラーゼPhusion(Finnzyme)で実行される。PCR産物は、37℃、1時間で、酵素NcoI-PstIで消化し、次いで酵素を80℃で20分間不活性化する。Covalysによって供給されるプラスミドpBAD-ST26-FRBは、SnapTag(ST26)に相当するカセットを単離するために、NcoI及びPstIで消化する。得られた直線状のプラスミド、pBAD-FRBは、上記のHaloTag PCR産物でライゲートされる。
【0133】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。
【0134】
得られたプラスミド、pBAD-HT-FRBは、カラム(QIAGEN)で精製され、シークエンシングによって確認される。HaloTag(HT)/FRB融合タンパク質のコーディング配列に相当するカセットは、以下のプライマー:
プライマーERV-Nco-HT-s:5' gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
プライマーpBAD rev:5' gttctgatttaatctgtatca 3'
を用いてpBAD-HT-FRBマトリックスからPCRによって増幅される。
【0135】
PCRは、72℃のハイブリダイゼーション温度で、ポリメラーゼPhusion(Finnzyme)で実行される。PCR産物は、37℃、1時間で、酵素EcoRV-AscIで消化し、次いで酵素を65℃で20分間不活性化する。消化されたPCR産物は、EcoRV及びAscIで消化された、細胞発現プラスミドpSEM-XT(Covalys)に移動する。
【0136】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0137】
−細胞発現プラスミド内のHaloTag/FKBP融合タンパク質を得るための構築物
FKBPタンパク質のコーディング配列に相当するカセットは、PstI-AscI消化によってプラスミドpBAD-ST-FKBP(Covalys)から単離され、細胞発現プラスミドpSEMXT-26(Covalys)に移動される。
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドを有する細菌の選択を可能にする。
プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0138】
COS-7細胞は、リポフェクタミン2000を用いて又は10,000細胞/ウェルの濃度で96-ウェルプレートでのエレクトロポレーションによって、2つのプラスミド構築物(HaloTag/FRB及びSnapTag/FKBP)で一時的にトランスフェクトする。
一時的なトランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な基質であって、その基質の各々は、FRETパートナーの一対のメンバー及び血漿膜を通過できるようにする単位に共有結合的に結合されている、当該基質の各々を5μM含む細胞培地で、COS-7細胞を1時間インキュベートする(例えば、図7又は8のスキームに従って製造)。
KREBS+0.05% Tween20での3回の洗浄後、100 nMのラパマイシン(Calbiochem)とのタンパク質相互作用の誘導の前後に、RubyStarリーダー(BMG)でFRETシグナルを測定する:TR-FRETシグナルは、ラパマイシンによるインキュベーション後には著しく高い。
【0139】
本実施例は、本発明に従う方法が、TR-FRET法を用いる生細胞内の生物的相互作用を明らかにすることができる、ことを示す。
【図面の簡単な説明】
【0140】
【図1】図1は、タンパク質キナーゼC-ガンマ(PKC-γ)の転位を示す。
【図2】図2は、アンドロゲン受容体/コアクチベーター又はアンドロゲン受容体/コレプレッサー相互作用を示す。
【図3】図3は、cAMP結合ドメインを含む融合タンパク質の構造的修飾を示す。
【図4】図4は、カルシニューリン/カルモジュリン相互作用を示す。
【図5】図5は、細胞質ゾルIκBによるNFκBの細胞質保持を説明する。
【図6】図6は、ユウロピウムキレートの時分割顕微鏡で得られた画像を示す。
【図7】図7は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられるベンジルグアニとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する。
【図8】図8は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられるベンジルグアニとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する。
【図9】図9は、蛍光化合物DY647に共有結合的に結合された、ベンジルグアニンBG(SnapTag酵素の基質)を含む複合体の合成スキームを示す。
【図10】図10は、一方でフルオロフォアDY647、他方でベンジルグアニンBGがその上に接ぎ合わされる、9アルギニン(R9)を含む複合体の合成スキームを示す。
【図11】図11は、複合体BG-DY647又は複合体DY647-R9-BGのいずれかによって得られた画像を示す。
【図12】図12は、フルオレセイン構造に7アルギニン単位を含むポリアルギニン配列を接ぎ合わすスキームを示す。
【図13】図13は、カルボキシフルオレセイン構造を示す。
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光ドナー/アクセプター対の2つのメンバー間の時分割蛍光エネルギー移動効果による、生物学的又は薬理学的刺激に応答して、生細胞における生体分子間の細胞内相互作用を検出する定量的な非顕微鏡的方法に関し、並びにその適用、例えば具体的には、分子のハイ-スループットスクリーニング及び細胞内シグナル伝達経路の検出に関する。
【背景技術】
【0002】
薬理学的活性を有する分子(例えば、薬物)は、血漿膜上又は生細胞自身内のいずれかに存在する分子標的に作用する。製薬業の検索手法において候補分子を選択し、かつ最適化するためには、異なったパートナー間の相互作用によって導かれ得る調節を統合化するような天然の環境内でできるだけ、その分子作用を決定する必要がある。より基本的な点から、生理的又は病理学的条件では、細胞内シグナル伝達経路に関連する生体分子間の直接的な相互作用が容易に研究され、特徴付けられ、かつ定量化され得る細胞モデルを利用することが重要である(例えば、Takesono他, Journal of Cell Science, 115, 3039-3048 (2002)参照)。天然の条件での作用のメカニズムを理解しようとするこの要望は、なぜ細胞に対する試験が分子の一次スクリーニングにおいてますます使用されるかを説明するものである。しかしながら、現時点で、ハイ-スループットスクリーング法は、主に、生物的事象、例えば、第2メッセンジャーの産生、の最終産物の検出を可能にする。この場合には、細胞は、アッセイされるべき細胞内標的分子を利用できるようにするために、溶解されなければならない。速度論的観察は目下、ほとんど不可能であり、稀な事象は容易に検出されない。生細胞において顕微鏡又は画像化の技術を用いる新規な方法は、刺激に応答して、その天然環境における対象の1以上の分子の動的及び速度論的パラメータの利用を提供する。これらの技術は、刺激に応答した、これらの生体分子の挙動の研究に基いている。これらの移動の分析は、帰納的及び間接的方法を利用するための画像化処理、問題の生物的事象を定量化させる任意の値への画像化処理を含む。
【0003】
これらの顕微鏡的方法は、分子標的の位置、次いで位置の任意の変更を決定することにある。これらの方法のために、分子標的は、一般的に、GFPファミリーに属することがある蛍光タンパク質で融合されている。このような細胞内の直接的視覚化の方法は、慣用的な蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、又は顕微鏡及び画像化取得を統合化する新規のプラットフォームによって達成される。かかるプラットフォームは、例えば、TRNSFLUOR技術(分子デバイス)又は機器、例えばOPERA(Evotech Technologies)又はIn Cellアナライザー(GE Healthcare)(John Comley, DDW, summer 2005, 第31-53頁参照)で用いられる。
【0004】
しかしながら、かかる技術の使用は、多数の不利益によって制限されている:
−顕微鏡的研究は、扱いにくく、自動化するのが困難であり、複雑な画像分析ツール、特定のソフトウェア、及び経験の豊富なユーザーを必要とする;それらは、膨大な時間も必要とする。
−画像分析は、複雑であり、一般的にエラー源であり、これらの技術は、再現が難しく、むしろ信頼性がない(パラメータZ'の低い値)。
−それらは、一次的なスクリーニングステップにおける使用を限定する分子スクリーニングの適正なスループットで、生細胞内の生物的事象についていくことを可能にする。
−視覚化された効果は、一般的に、シグナル伝達カスケードのダウンストリームである。
【0005】
これらの主な理由によって、これらの技術は、ハイ-スループット分子スクリーニングと適合しない。
【0006】
これらの特徴とは別に、これらの技術は、ほとんどの場合、初期の事象のカスケードの結果である1以上の細胞事象を定量するために役立ち、測定することが望まれる事象への間接的なアクセスを与える。更に、これらの技術は、生体分子間の相互作用に関する直接的な情報、又は1つ及び同一分子内の構造的変化に関する直接的な情報を提供しない。これらの情報のいずれも、検出及び定量されることが望まれる生物的事象の直接的なインジケーターである。
【0007】
近頃、生体分子間の相互作用、又は1つ及び同一の生体分子内の構造的変化(これらのいずれも生物的事象の証拠である)を特徴付けることができる細胞内の技術は、異なった蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその様々な変異体間のエネルギー移動(FRET)の技術に基いている。例えば、GFPの2つのタンパク質変異体(CFP及びYFP)は、FRETを確立するための適合可能なペアを形成する。それらは、対象の標的タンパク質と融合され、生細胞内で発現され得る。このようにして標識されたタンパク質間の相互作用又は構造的変化に関連する多数の事象は、FRET法を用いて検出されている(Janetopoulos他, SCIENCE (2001) 291: 2408-2411, Vilardaga他, NATURE BIOTECH (2003) 21: 807-218、及びWO 2004 057333 A1)。
【0008】
GFP(CFP及びYFP)の2つの変異体はまた、1つ及び同一の標的タンパク質との融合産物として生細胞内で発現され得る。GFPの2つの変異体と二重に融合されたこの生体分子は、バイオセンサーとして定義されている。バイオセンサーは、生物的環境内の変化によって異なった構造を採用することができ、FRET法によってモニターされるべきこれらの構造的変化について可能である。かかる生体分子は、多数の細胞事象、例えばcAMP、IP3又はcGMPの産生、をモニターするために使用され得る(Nikolaev他, JBC, Vol.279, No.36, pp.3715-37218, 2004, Tanimura他, JBC, Vol.279, No.37, pp.38095-38098, 2004、米国特許第6.924.119 B2号明細書参照)。
【0009】
しかしながら、これらの蛍光タンパク質の使用は、ある主な不利益を有する:
−2つの蛍光分子(CFP及びYFP)の重複スペクトルは広く、ドナー(CFP)を励起するために使用される波長でアクセプター(YFP)の強力な寄生的(parasitic)励起を引き起こす。この寄生的汚染は、シグナル対ノイズを1.5未満の値に減少させる、強力なバックグラウンドノイズを誘導する。調節のかかる小さな差は、これらの技術が、ハイ-スループット分子スクリーニングにおいて満足に使用されないようにする。
−FRETをこれらの蛍光タンパク質で検出するために使用される波長において、細胞に固有の自己蛍光は、FRET読み値を混乱させる。
−顕微鏡的分析は、FRETシグナルの微妙な変化を明らかにするために必要であるかもしれない。その結果、かかる分析は、第1の検出法について上で述べたものと同一の不利益を示す。
−GFPの変異体の限定された数は、主な変化がCFP/YFPペアのフォスターの半径(Ro)と一致する適用に、かかるタンパク質の使用を制限する。
−これらのタンパク質は、標的タンパク質と融合される。これらのタンパク質の蛍光は、細胞がそれを発現すると直ちに検出され、はるかに複雑な発現系を与えることなく、実験者によって引き起こされ又は調節され得ない。
【0010】
実験者によって調節され得る、GFP又はその変異体を用いてFRETに替わるものとしては、BRETと称される生物発光を生じる分子の利用である。BRETプロセスは、ルシフェラーゼ及びGFPでそれぞれ標識されたタンパク質間で、生細胞において起こり得る。ルシフェラーゼをパートナーの1つと融合し、GFPを他のパートナーと融合することによって、いくつかの細胞内タンパク質相互作用を測定することが可能となった(Mulligan G., Eur. J. Pharm. Sci. 2004 Mar; 21(4): 397-405, Boute N.他, Trends Pharmacol. Sci. 2002 Aug; 23(8): 351-4、及びTrugnan G.他, Med Sci. (Paris), 2004 Nov; 20(11): 1027-34参照)。酵素ルシフェラーゼの基質が試験される細胞調製物に導入されるときに、エネルギー移動プロセスが開始される。2つのパートナーをかなり接近させるタンパク質相互作用の場合に、ルシフェラーゼは、GFPを励起する光を発生する。GFPによって発光される蛍光シグナルは次いで測定される。
【0011】
CFP/YFPペアと同様にして、多数の不利益は、ハイ-スループットスクリーニング(HTS)におけるルシフェラーゼ/GFPペアの使用を限定する:
−BRET試験のシグナル-ノイズ比はかなり低い。
−蛍光シグナルは、試験化合物の自己蛍光によって容易にマスクされる。ハイ-スループットスクリーニングと全く適合しない非常に短いリーディングウィンドゥを残すBRET法は、時間中のシグナルの低い安定性のために、スクリーニング分子にはあまり強力でない。
【0012】
生体分子間の相互作用を試験するための他の方法系は、機能的な相補性プロセスを用いる点にある。対象の生体分子は、第3の他の2つの不活性断片と融合される。対象の生体分子間の直接的な相互作用が起こる場合に、その後に第3の他の2つの不活性断片は、直接的な相互作用によって又はタンパク質スプライシングのより複雑なプロセスによって、活性が測定できる機能性の第3タンパク質を再構築する。対象の生体分子間の相互作用によって活性が保持されたこのタンパク質は、測定された活性が発光シグナルである場合には、
ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、例えばGFP(Ozawa T., Current Opinion in Chemical Biology, 2001, no.5, pp 578-586参照)、又は酵素活性が比色分析法(Eglen R., ASSAY and Drug Develop. Technologies, 2002, vol.1, pp 97-104参照)及びDISCOVER製のPath Hunter(登録商標)によって測定される酵素、例えばβ-ガラクトシダーゼ、でよい。
【0013】
機能的な相補性を用いるこれらの方法の主な不利益は、生体分子間の相互作用の測定が、第3のタンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼのその活性形態での完全な再構成に依拠し、そして、生体分子が通常相互作用する細胞コンパートメント以外の細胞コンパートメントへの相互作用複合体の移動を必要とする、という事実にある。最後に、相互作用が酵素活性の測定によって検出される場合に、機能的相補性は、対象の生体分子間の相互作用を特徴付ける間接的な方法である。機能的相補性の使用は、単一バイオセンサー型分子の場合にはより複雑である。
【0014】
これらのエネルギー移動プロセスで使用されるタンパク質の固有の性質によって、蛍光タンパク質、例えばGFP(又はその他の変異体)又は生物発光タンパク質、例えばルシフェラーゼを使用する方法は、エネルギー移動プロセスに関連するドナー/アクセプター対の選択に大きな柔軟性を許容しない。
【0015】
「量子」と称される特定の蛍光分子の使用は、非常に多くの可能なドナー/アクセプター対を与える。これは、広い範囲の励起波長に渡って機能させることができ、そして、異なったペアを組み合わせることによって、付随して測定される生体分子間の異なった相互作用を可能にする(多重技術)。しかしながら、細胞においてこれらの化合物で特異的に生体分子を標識することは困難である。
【0016】
細胞内FRET適用のための蛍光有機分子の使用は、例えば、生細胞におけるメッセンジャーRNAの視覚化のために記載されてきた。この場合に含まれる相互作用は、標的メッセンジャーRNAと蛍光有機化合物で標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとの一致に基いている(Dirks他, 2003, METHODS, Jan 29, no.1, pp 51-57、及びTsuji他, Biophys. J. 2001 Jul; 81(1): 501-15)。この場合に得られる情報は、顕微鏡による検出に依拠するので定量的ではない。更に、対象の2つの生体分子間の相互作用を定量するものではなく、対象のメッセンジャーRNAの存在を明らかにするために役立つにすぎない。
【0017】
生細胞内の生物学的現象を試験すると同時に、公知の方法の使用に関連する不利益を避けるための、新規なツール及び方法について科学協会では真の要求が存在する。
【発明の開示】
【0018】
発明の説明
顕微鏡の助けを借りない生細胞における細胞内相互作用の定量的及び直接的な分析の本発明の方法は、時分割FRET(TR-FRET)による検出を実行するために、長命蛍光化合物の性質を利用する。
【0019】
この方法は、第1の長命ドナー蛍光化合物、及び第1の蛍光化合物と適合すするスペクトル的性質を有する1以上のアクセプター蛍光化合物を使用する。
【0020】
この時分割FRET測定は、バックグランドノイズの問題、及び細胞及びおそらく試験分子の自己蛍光の問題を解決する、2つの方法を提供する:
−蛍光化合物の長命、好ましくは100ナノ秒超は、短命蛍光化合物の発光が存在しない測定用の時間ウィンドゥを定義ができるようにする;
−2つトレーサーの測定(そのうちの1つは対照)は、2つのトレーサー間の蛍光発光比を読み値として用いて、残りの自己蛍光の効果を補正できるようにする。
【0021】
その感度、その特異性、その信頼性及びその分子分割によって、TR-FRETは、本発明の方法において、ルシフェラーゼ及びGFPを用いて、CFP/YFPのFRET適用又はBRET適用の生細胞で観察される全ての不利益をなくすことができる。特に:
−蛍光化合物の幅広い選択及び時分割の読みは、ドナーを励起するために使用される波長でアクセプターの強い寄生的励起を排除することができる;
−時分割の読みは、細胞及び試験タンパク質の自己蛍光の効果を除くことができる;
−TR-FRETシグナルの振幅は、色素/蛍光タンパク質を用いるFRET法で測定されたものよりも大きい。
【0022】
TR-FRET法は、これまで、生細胞で使用されてこなかった。このことは、出願人が解消することができた多数の技術的障害に起因する。
【0023】
生細胞においてこの方法を実行することに関連する主な技術的問題の1つは、蛍光化合物のほとんどが通常、非常に親水性であり、血漿膜を通過しない、という事実にある。別の問題は、これら化合物がその環境に敏感であるという事実、特にその蛍光収率は生物学的媒体中で大きく影響され得るという事実に関連する。最後に、出願人は、細胞の生物学的全体性に影響を与えることなく、細胞外に導入された蛍光化合物で細胞中に存在する生体分子を標識するために、別の障害を克服しなければならなかった。
【0024】
本発明の方法は、これらの障害を回避することができ、よって、生細胞内の生物学的現象を研究する効果的な手段を提供する。
【0025】
本発明の方法は、特定の刺激に反応する生細胞における生体分子間の相互作用、又は構造的修飾を検出し、定量することができる。
【0026】
本発明の方法は、生体分子の相互作用、又は生細胞中の生体分子の転位もしくは構造的変化を検出する方法であって、以下のステップ:
1)生細胞中の第1生体分子を、長蛍光寿命を有する第1蛍光化合物で標識し;
2)当該生細胞中の少なくとも1つの第2生体分子を第2蛍光化合物で標識し;
3)試験分子バンク(bank)に属する化合物の存在下又は非存在下に、試験される生物的反応に適合した特定の刺激に当該生細胞を供し;
4)波長が第1の長命蛍光化合物を励起する光源に当該生細胞を供し;
5)当該第1及び第2蛍光化合物によって発光された蛍光の密度を測定し、次いで当該第1蛍光化合物の蛍光強度と当該第2蛍光化合物の蛍光強度との比を計算し、あるいは当該第1又は第2蛍光化合物の寿命を測定し;並びに
6)測定されたシグナルを、当該細胞の刺激前に得られたシグナルと比較すること、
を含む。
【0027】
生細胞の発光励起は、当業者に周知の方法、例えば、レーザー源、フラッシュ又はキセノンランプによって実行され得る。
【0028】
本発明の方法で使用される異なった蛍光化合物の発光、強度及び寿命の測定は、当業者に周知の慣用的方法を用いて、FRETシグナルの方法によって実行される。本発明の方法に従う時分割型FRETシグナルを検出するための好適なリーダーは、BMG Labtech製のRUBYスター又はPHERAスター型のもの、あるいは時分割測定と適合する他のリーダー、例えば、ULTRA、ULTRA Evolution又はTECAN製のGENios ProもしくはMolecular Devices製のアナリストである。第1の蛍光化合物の蛍光と第2の蛍光化合物又は他の蛍光化合物(複数分析の場合に)の蛍光との比は、特にEP 569 496 B1に記載されている当業者に公知の方法によって計算される。
【0029】
生体分子を標識するために使用されるフルオロフォアは、TR-FRETパートナー蛍光化合物である。本発明によれば、「TR-FRETパートナー蛍光化合物」は、蛍光スぺクトルが部分的に重複し、ドナーが長命蛍光化合物であり、アクセプターがドナーよりも短命蛍光化合物である、蛍光化合物のペアを意味するものと理解される。当業者は、本発明に従う方法を実行するための、TR-FRETパートナー蛍光化合物のペアを選択することができる。
【0030】
本発明に従う方法を実行するための別の形式において、及び細胞中の生体分子の構造的変化を研究するように望まれる場合には、2つの蛍光化合物は、1つ及び同一の生体分子を標識するために使用される。
【0031】
1つの具体的な変形では、本発明に従う方法は、他の蛍光化合物で生体分子を標識するための追加のステップを含み、より複雑な生物的現象を研究することができる。この場合には、系は、第1の長命ドナー蛍光化合物及び数個の他のTR-FRETパートナーアクセプター蛍光化合物を依然として含むだろう。それによって、1つ及び同一の細胞中のいくつかの相互作用、転位又は構造的変化を測定することができる。
【0032】
生体分子
「生体分子」は、生物に存在する意義のある分子として理解され、特に、生物の構造を構成する分子、及びエネルギーの生成及び変換、又は生物的シグナルの伝達に関連する分子として理解される。この定義は、核酸、タンパク質、糖類、脂質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、代謝物、中間体、酵素、ホルモン及び神経伝達物質を含む。
【0033】
本発明に従う方法の手段によって研究され得る生体分子は、当業者に公知の異種発現法によって培養中の生細胞中で発現される分子の全ての種類である。これらの生体分子は、例えば、生細胞によって人工的に産生された、任意のタンパク質、任意の脂質、糖類又はオリゴヌクレオチドでよく、例えば、膜受容体、例えば、チロシンキナーゼ受容体及びGタンパク質及びヘテロ三量体Gタンパク質のサブユニットに結合された7-ドメイン膜貫通型受容体、非-膜受容体、例えば、ホルモン受容体、イオンチャネル、膜上に存在するトランスポーター(アクアリン(aquarine)、ナトリウムトランスポーター、重炭酸(HCO3)トランスポーター)、イオンポンプ(ナトリウム/カリウムポンプ)、シグナル形質導入タンパク質、例えば単量体Gタンパク質、酵素、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスグルタミナーゼ、ヒドラーゼ、ハロゲナーゼ、リパーゼ、トランスフェラーゼ及び代謝酵素、スカフォールドタンパク質、例えばSOS、GRS、IRS及びHSP、脂質結合タンパク質、N-ミリスチル化、S-パルミトリル化、S-プレニル化又はゲラニルゲラニル化型の脂質固着による膜と関連するPH又はFYVEを含むタンパク質、Gタンパク質(単量体又は三量体)と結合された受容体に関連するタンパク質、例えばGEF、GAP及びRGS、ヘテロ六量体Gタンパク質のサブユニット及びGタンパク質と結合された7-ドメイン膜貫通型受容体、アダプタータンパク質、例えばSH2又はSH3ドメインを含むタンパク質、転写因子、例えばc-fos、c-jun及びCREB、ミトコンドリアタンパク質(例えば、呼吸タンパク質、チトクロームC、カスパーゼ、PBR等)、リン脂質、核タンパク質、例えばDNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ及びトポイソメラーゼ、「細胞死」受容体ファミリーのタンパク質、例えばFAS、アポトーシスタンパク質、例えばbcl-2ファミリーのタンパク質、並びに細胞周期タンパク質、例えばcdk及びサイクリンでよい。
【0034】
生細胞
本発明で使用される生細胞は、当業者に公知の方法によって培養される生細胞の全ての種類であり、例えば、原核生物細胞(バクテリア)、酵母、不死の真核生物細胞株、昆虫細胞、及び一次培養物、例えば哺乳動物の血液、組織又は臓器由来のものである。本発明の方法は、生細胞で働き、細胞内生化学メカニズムの全体を維持させることができる、ことを強調するのは重要である:細胞膜は、先行技術の他の方法の場合と同様に透過されず、細胞は固定される必要がない。
【0035】
本発明に従う方法によって明らかにされ得る分子間の相互作用は、多数あり、変動し、当該方法で使用される生体分子の性質による。これらの相互作用は、例えば、アンドロゲン受容体と細胞核への細胞質受容体の転位、細胞質の刺激の後に細胞血漿膜をつくる脂質への転位を経るPKC-γの転位、活性であるようにカルモジュリンとの結合を必要とするカルシニューリン複合体の転位、p65/p50の転位などを誘導するアンドロゲンとの間の相互作用でよい。
【0036】
生細胞内の生体分子の構造変化そのものは、ある刺激環境の下で起こり得る。これら修飾は、例えば、ベータ-アレスチン、EPAC(cAMP結合タンパク質)、小単量体Gタンパク質交換因子(GEF)、イオンチャネル、例えば迅速な不活性化能力に依拠したK+チャンネル等であり得る。
【0037】
蛍光化合物
フルオロフォアとも称されるいくつかの蛍光化合物が本発明の方法で使用されている。これらの化合物の内の1つは長い蛍光寿命を有しており、他の化合物は、短い蛍光寿命を有している。全ての場合において蛍光化合物は、R-FRETパートナーである。
【0038】
本発明の目的に特に好適な長命蛍光化合物は、好ましくは、100ナノ秒以上の寿命を有する。
【0039】
正確には、これらの好適な蛍光化合物は、希土類複合体、例えばクリプタート及びキレート、特に、1以上のピリジン単位を含むクリプタートである。かかる希土類クリプタートは、例えば、ヨーロッパ特許EP 180492、EP 321353、EP 601113及びWO 01/960877に記載されている。テルビウム(Tb3+)及びユウロピウム(Eu3+)のクリプタートは、特に、本発明の目的のために好適である。希土類キレートは、米国特許第4761481号明細書、同第5032677号明細書、同第5055578号明細書、同第5106957号明細書、同第5116989号明細書、同第4761481号明細書、同第4801722号明細書、同第4794191号明細書、同第4637988号明細書、同第4670572号明細書、同第4837169号明細書及び同第4859777号明細書に記載されている。他のキレートは、ノンアデンテート(nonadentate)リガンド、例えばテルピリジンからできている(ヨーロッパ特許EP 403593、EP 5324825、EP 5202423、EP 5316909)。
【0040】
本発明の目的に適合する希土類キレートの1つの具体的な例は、以下の式のキレートである:
【0041】
【化1】
【0042】
FRETパートナーのペアのドナーメンバーとして使用され得るこの化合物の合成は、Poole R.他のOrg. Biomol. Chem ., 2005, 3, 1019-1024 「セルロ(cellulo)の利用に好適な、高発光かつ速度論的に安定なラントニド複合体の合成及び特徴付け」によって記載されている。以下の実施例6は、この種の化合物が細胞内の時分割シグナルを定量するために使用され得る、ことを示している。
【0043】
短命蛍光化合物は、蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特に、CFP、YFP)、並びに100ナノ秒未満の寿命を有する蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及び蛍光分子、BODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている、アレクサフロオロとして知られている化合物、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコビリプロテイン、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、及び量子ドットから選ばれる。他の好適な蛍光化合物は、特許出願第FR 2840611に記載され、オリゴヌクレオチドと結合されたフルオロフォアを含む。
【0044】
蛍光化合物による生物分子の標識
生物分子を蛍光化合物で標識する別の方法を以下に詳細に記載する。
1)対象の生体分子(複数)と、固有の蛍光特性を有するタンパク質、例えばGFPのタンパク質、との融合タンパク質の生成。かかる融合タンパク質の発現は、当業者によく知られ、そして、例えば、生細胞、そのDNAが融合タンパク質をコードする発現ベクター、例えばプラスミドへの安定な又は一時的な形質転換にある、分子生物学の技術を採用する。
【0045】
2)対象の生体分子(複数)と、自殺酵素活性を有するタンパク質、例えば対象の生体分子(複数)上に蛍光化合物を共有結合的かつ不可逆的に移動するSnapTag(Covalys)又はHaloTag(Promega)との融合体の生成。この場合の蛍光化合物は、自殺酵素の基質に共結結合的に結合され、細胞外媒体に導入される。以下の方法は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない、蛍光化合物/基質の複合体を生じさせることができる。
【0046】
自殺酵素は、酵素活性が、基質と急速にかつ共有結合的に結合する能力をタンパク質に与える特定の変異によって修飾されているタンパク質である。これらの酵素は、各々が1つのみの蛍光分子と結合することができ、酵素活性が基質の結合によって妨害されているので、自殺酵素と呼ばれる。現在、自殺酵素の2つの公知のファミリーは、この種の標識を可能にする:
−基質の内の1つがベンジルグアミンであるアルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼの変異体(又はCovalysによって販売されているSnapTag)(Klepper A.他 (2003)参照) in Nature Biotechnology, vol.21, p.86及びWO 02/083937 A2);
−自殺型の酵素反応を生じ(WO 04/072232 A2)、基質の中にはクロロアルカンファミリーの化合物であるものがある、デハロゲナーゼの変異体(Promegaによって市販されているHaloTag)。
これらの2つの場合において、これらの自殺酵素によって取り込まれるだろう基質は、最初に蛍光有機化合物で標識されなければならないだろう。
【0047】
3)対象の生体分子(複数)と、対象の蛍光分子(複数)で予め標識された相補的配列との結合の後にタンパク質スプライシング活性を獲得する配列、例えばインテインドメインSsp DnaEをコードする配列、との融合タンパク質の生成、その結果、標的生体分子(複数)上にペプチド結合の手段によって蛍光化合物を共有結合的かつ不可逆的に移動させることができる。
【0048】
この方法は、タンパク質スプライシングと称される生物学的形質導入後の変異プロセスを利用する。このプロセスは、前駆体タンパク質に存在するインテインと称されるドメインを除き、そしてインテインドメインのいずれかの側に位置する2つのドメインをペプチド結合の手段によって結合するという、究極的な目的で一連の化学反応を触媒する。タンパク質-トランス-スプライシングは、相補的なインテインドメインの2つの半分を必要とする。第1の半分は、標的タンパク質と融合し、第2の半分は、蛍光分子と融合される。この方法は、Muir T. W.他 (2003) J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7180-7181によって記載される。以下に記載の方法は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない、「蛍光化合物/インテイン」複合体を生じる可能性がある。
【0049】
4)試験される生体分子(複数)と、特定の認識特性及び対象の蛍光化合物(複数)で予め標識された基質との高アフィニティ結合を有する、ペプチド配列、又は結合パートナーのペアのメンバー、との融合タンパク質の生成:例えば:
−二ヒ素化合物に結合する性質を有する、システイン-システイン-X-X-システイン-システイン配列(CCXXCC)。これらの二ヒ素化合物は、フルオレセイン又はローダミン型の有機分子で容易に標識できる(技術の詳細については。B. A. Griffin他 (1998) Science 1998, 281, 26-27、及びS. A. Adams他 (2002) J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 6063-6076参照)。
−ポリヒスチジン反復は、蛍光化合物の「クエンチャー」分子と結合できる金属イオンと結合する(E. G. Guignet他 (2004), Nature Biotech., 2004, 22, 440-444参照)。
−タグBTX(ブンガロトキシン)は、ブンガロトキシン(BTX)によって認識される13アミノ酸のペプチドからなっており、蛍光分子と予め結合できる(C. M. McCann他 (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952参照)。
−ストレプトアビジンの結合配列(SBP-タグ)は、ビオチンに高いアフィニティを有する38アミノ酸からなる配列であり、フルオロフォアにより予め標識できる(C. M. McCann他 (2005), Biotechnique (2005), 38, 945-952参照)。
【0050】
5)試験される生体分子(複数)と、酵素基質に予め結合された蛍光化合物を、Tag配列の特定のアミノ酸上へ移動させるある酵素、例えば、トランスグルタミナーゼ又はリガーゼ、によって認識されるペプチド配列、との融合タンパク質の生成。
【0051】
ペプチド配列PKPQQFM(プロリン-リジン-プロリン-グルタミン-グルタミン-フェニルアラニン-メチオニン)は、例えば、トランスグルタミナーゼと称される酵素によって認識される。トランスグルタミナーゼは、その基質(カダベリン)と結合された蛍光有機化合物を配列PKPQQFMの第1のグルタミン残基上に直接移動する(Taki他 (2004) Protein Engineering, Design Selection, 2004, 17, 119-12)。以下に記載の技術は、細胞膜を通過するために、本来、脂肪親和性でない蛍光化合物/基質の複合体を生じさせる。大腸菌酵素ジヒドロフォレートレダクターゼ(eDHFR)の配列は、高アフィニティで、リガンド、例えば、Active Motifの「リガンド連結普遍的標識法」として知られている技術に従って蛍光化合物が接ぎ合わされ得るトリメトプリム、に特異的に結合する。
【0052】
6)核酸配列はまた、トランスフェラーゼ活性を有する酵素によって特異的に認識され、補助因子又は基質に存在する蛍光有機分子を特定の配列に直接、共有結合的に結合させることができる。かかるプロセスは、特定の核酸配列5'-TCGA-3'によって説明されるだろう。当該核酸配列上では、メチルトランスフェラーゼTaq1が補助因子アジリジン上に予め接ぎ合わされた蛍光化合物を移動する(Pljevaljcic G.他 (2004) ChemBioChem, 5, 265-269参照)。
【0053】
従って、本発明に従う方法において、蛍光化合物/生体分子標識は、蛍光化合物及び生体分子の各々を、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるペアのメンバーと結合させることによって実行される。
【0054】
上記の標識法は、時には、本来、脂肪親和性でなく、細胞膜を通過するために細胞に本来侵入しない、化合物を生じることを含む。これらの化合物又は基質、あるいはタグ又は上記の結合パートナーのペアのメンバーとのその複合体は、例えば以下の方法の1つを用いて、細胞に導入される:
1)脂質二重層の通過中に荷電基をマスクするエステルの使用;これらのエステルは、プロドラッグと称される化合物のカテゴリーに入り、生理的条件下での加水分解の後に「親」化合物を与えるために、in vivoで急激に形質転換される化合物を意味する(T. Higuchi and V. Stellaの、"新規送達システムとしてのプロ-ドラッグ", 第14巻, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society (1975))。例えば、主に、ピバロイルオキシメチル及びアセトキシメチル基、及びグリコール酸エステルを含む(Nielsen and Bundgaard, Int. J. of Pharmacy 39 (1984) 75-85)。この方法が使用されるときには、これらの基の1つはフルオロフォア上に共有結合的に接ぎ合わされる。
【0055】
2)フルオロフォアに共有結合的に接ぎ合わされたウイルスペプチドの使用:これらのペプチドの中には、現実には、フルオロフォアに細胞膜を通過させることができるものがある。かかるウイルスペプチドの例は、「ペネトラチン」及び「トランスポータン」(Langel他, Bioconj, Chem. (2000), 11, 619-626)、ポリアルギニン(Wender他, アルギニン型b分子トランスポーター, Org. Lett. (2003), 5(19), 3459-3462)又は他のペプトイドのアナログ、グアニジン基を有するペプチドアナログ(細胞取り込みを許容し又は亢進する分子のデザイン、合成及び評価:ペプトイド分子トランスポーター, Wender他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 13003-8)又はテトラ-グアニジニウム単位を含む非-加水分解性誘導体(Fernandez-Carneado, J.他, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874)が挙げられる。
【0056】
3)ウンデシルグリセロール又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖を用いてオリゴヌクレオチドで例証される方法に従う、コレステロール又はビタミンEの分子を含む側鎖、又は細胞膜と相互作用する脂肪族鎖の付加によって蛍光化合物の脂肪親和性及び極性の修飾(最小限のホスフォロチオエート-保護オリゴヌクレオチドと、1-O-ヘキサデシルグリセロールとの3'-末端複合体:合成及び放射線-抵抗性細胞中の抗-ras活性、Rait他 , Bioconj. Chem. (2000), 11, 153-160)。
【0057】
これらの修飾は、カチオン性界面活性剤(カチオン性「脂質」)よりも効果的であり、カチオン性界面活性剤は、核酸との超分子複合体を形成し、エンドサイトーシスを増加するが、毒性で、細胞膜を損傷する。
【0058】
有利なことに、本発明に従う方法では、少なくとも1つの蛍光化合物は、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む。当該単位は、以下の群:エステル、ピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び膜トランスポーターによって支配されるウイルス性ペプチド、例えば、ペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基例えばオリゴグアニジニウム基を有するペプトイド、コレステロール又はビタミンE基、あるいは脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる。
【0059】
本発明を実行する1つの別の形式では、少なくとも2つのTR-FRETパートナー蛍光化合物は、血漿膜を通過できるようにする単位を含む。
【0060】
有利なことに、自殺酵素の基質に蛍光化合物を結合させることができ、同時に、反応性の化学基、例えば特にアミン又は酸基を当該蛍光化合物上に発生させることができる。当該反応性の化学基は、次いで、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を蛍光化合物と結合させることができる。
【0061】
例えば、図7及び8を参照されたい。図7及び8は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられたベンジルグアニンとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する(この複合体は、以下「トリポッド」と称される)。
【0062】
血漿膜を通過できるようにする前記単位は、その後、この反応性化学基を介する共有結合によって導入され得る。
【0063】
NH2基を有するトリポッドは、COOH基を有するベクター系を統合することができ、COOH基を有するトリポッドは、NH2基を有するベクター系を統合することができるだろう。
【0064】
本発明は、本発明に従う、生体分子又は生細胞中の生体分子の転位もしくは構造的変化の相互作用を検出する方法を実行するための試薬を含む、パーツのキットを更に提供する。
【0065】
キットは以下を含む:
−第1の蛍光化合物及び第2の蛍光化合物、これらの化合物は、TR-FRETパートナーであり、これらの化合物の少なくとも1つは、血漿膜を通過できるようにする単位を含む;
−当該生体分子を含む生細胞;
−蛍光化合物で生体分子を標識する手段;並びに
−生体分子の相互作用の現象、又は生細胞における生体分子の転位又は構造的変化を試験するための教示。
【0066】
本キットに含まれる試薬は、生細胞中に存在する、試験される生体分子を、TR-FRETパートナー蛍光化合物で標識することができる:実際に、これは、蛍光化合物及び生体分子がそれぞれ、SnapTag基質、例えばベンジルグアニジン/酵素SnapTag、HaloTag基質、例えばクロロアルカン/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるペアのメンバーと結合される、ことを意味する。
【0067】
蛍光化合物の少なくとも1つは、血漿膜を通過できるようにする単位を更に含む。当該単位は、以下の化合物:エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、コレステロールもしくはビタミンE基、又は脂肪族鎖、あるいは脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる。
【0068】
本キットに含まれる生細胞は、相互作用が研究するには望ましい生体分子を発現するように遺伝子的に改変できる。これらの改変は、当業者によく知られた分子生物学の慣用的方法、生体分子又は対象の生体分子を含む融合タンパク質を発現するプラスミドによる細胞の安定的かつ一時的なトランスフェクション、を採用する。
【0069】
本発明に従うキットに含まれるTR-FRETパートナーフルオロフォアは、長命蛍光化合物であり、少なくとも1つの蛍光化合物が、以下:蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、100ナノ秒未満の寿命を有する有機蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及びBODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている蛍光分子、アレクサフルオロとして知られている化合物、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、から選ばれる。
【0070】
好ましくは、長命蛍光化合物は、100ナノ秒超の寿命を有し;特に好ましくは、希土類キレート又はクリプタートである。本発明に従うキットの1つの具体的な態様では、希土類は、テルビウム又はユウロピウムである。
【0071】
本発明を以下の実施例の方法によってより詳細に説明することができるが、いずれの場合にも本発明の適用を制限するものではない。
【実施例】
【0072】
実施例1:タンパク質キナーゼC-ガンマ(PKC-γ)の転位の測定(フローチャート、図1参照)
プロテインキナーゼCは、リン脂質依存型セリン/スレオニンキナーゼの群に属するタンパク質である。これらのタンパク質は、多数の細胞シグナル伝達経路において主な役割を果たす。生理学的にPKC-γは、ホスファチジルセリン(PS)によってカルシウム-依存型で活性化され、ジアシルグリセロール(DAG)と結合するが、PKC-γは、腫瘍-誘導ホルボールエステル(PMA)によってDAGの存在とは関係なく活性化され得る。
【0073】
刺激の後、PKC-γは、血漿膜への細胞質の転位を経る。この転位は、PMAによる刺激の後にGFPとの融合タンパク質の方法によって測定することができる(Sakai N. J., Cell Bio. (1997) 139, 1465-1476)。
【0074】
PKC-γをアクセプター蛍光有機化合物で標識するために、PKC-γとHaloTagと称される自殺酵素との融合タンパク質が作製され、標識されたPKC-γを有するFRETに加わることができるドナー蛍光有機化合物で特異的に血漿膜を標識するためのツールが開発された。
【0075】
血漿膜は、形質導入後の修飾の酵素によって認識される配列であるCys-Ala-Ala-X(Xは任意のアミノ酸である)と融合された、SnapTagと称される自殺酵素で、特異的に標識される。この配列は、SnapTag酵素のC-末端位のファルネシル基の結合を生じるだろう。このことは、血漿膜の内層にこの酵素を標的し及び固定化する結果を有する。COS-7細胞は、一時的に、リポフェクタミン2000を用いて又はエレクトロポレーションによって2つのプラスミド構築物でトランスフェクトした。
【0076】
一時的トランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な各基質5μMを含む細胞培地で、細胞を1時間インキュベートする。各基質は、FRETを形成する蛍光有機化合物を有する。
【0077】
培地で洗浄した3時間後に、異なった刺激の後、例えば、12-ミリスチン酸 13酢酸ホルボールエステル(PMA)の添加後に、TR-FRETによって転位を測定する。TR-FRETシグナルの増加は、転位プロセスの増加と相関する。
【0078】
PKC-γの転位経路を潜在的に阻害する分子は、転位の刺激に対する効果を試験するために培養培地に加えられる。
【0079】
実施例2:アンドロゲン受容体/コアクチベーター又はアンドロゲン受容体/コレプレッサー相互作用の解明(フローチャート、図2参照)
アンドロゲン及びその機能性レセプター(AR)は、外部の雄性表現型の通常の識別の原因となる。細胞質ゾルのアンドロゲンレセプターは、その不活性状態で、ヒートショックタンパク質と関連する。リガンドとの結合の後、レセプターは、二量化し、核への転位に供される。ARコレギュレーター(コアクチベーター又はコレプレッサー)は、レセプターと相互作用し、又は相互作用しないだろう。これらの相互作用の結果は、場合により、DNAと特定の配列で結合し(いわゆるAREは、アンドロゲンレセプター反応性因子)、その結果、転写を調節するための、複合体を生じるだろう。
【0080】
本発明に従う方法は、コレプレッサーと、コアクチベーターとARとの相互作用を明らかにするために使用される。このことは、細胞内媒体中に以下のものを発現するために、細胞に発現ベクターを導入することによって実行される:
−AR/SnapTag酵素融合タンパク質。SnapTag自殺酵素は、SnapTag基質で標識された蛍光化合物との結合を可能にする。
−HDAC1/HaloTag融合タンパク質。HDAC1(ヒストンアセチルトランスフェラーゼ1)は、ARに結合できるコレプレッサーである。HaloTag自殺酵素は、HaloTag基質で標識された蛍光化合物との結合を可能にする。
−p160/インテイン断片融合タンパク質。p160は、ARに結合できるコアクチベーターである。インテイン断片は、タンパク質トランス-スプライシングによって、相補的インテイン断片を含む蛍光化合物との結合を可能にする。
【0081】
ARが、刺激(そのリガンドの結合)の後に核に存在する場合には、その最終的な効果は、TR-FRETシグナルを測定することによってアッセイできる:ARは、ドナー蛍光化合物で標識され、当該コアクチベーター及びコレプレッサーは、そのスペクトル特性が全く異なり、エネルギー移動後の発光波長が各々665及び780 nmである、2つのアクセプター蛍光化合物によって標識される。
【0082】
よって、665 nmでのTR-FRETシグナルの測定は、ARをそのコアクチベーターと結合する例であり、一方、780 nmでのTR-FRET測定は、AR/コレプレッサー相互作用の指標となるであろう。そのため、この試験形式は、単一の細胞試験における2種類の相互作用を検出することができる。この複数検出試験は、他の相互作用を同時に明らかにするために、他のアクセプター蛍光化合物を加えることによって更に改善される。
【0083】
実施例3:cAMPバイオセンサー:cAMP結合ドメインを含む融合タンパク質の構造的修飾の検出(フローチャート、図3参照)
本実施例では、ドナー/アクセプター蛍光化合物の一対のTR-FRETシグナルの変形は、これらのフルオロフォアとcAMP結合ドメイン(例えば、PKAのβII制御サブユニットの結合ドメイン、又はcAMP-活性化交換タンパク質の結合ドメイン、これらは、「CAMPS」として知られている)との結合によって測定される。これらの分子構築物は、Gタンパク質-結合レセプター(GPCR)の薬理学的刺激の後に、生細胞中で、cAMPのレベルを定量するために使用できる(Nikolaev他, JBC, vol.279, no.36, pp.37215-37218, 2004参照)。
【0084】
SnapTag/CAMPS/HaloTag型の融合タンパク質をコードするプラスミドは、HEK細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの24時間又は48時間後に、SnapTag及びHaloTag基質で(37℃で1時間)インキュベートされる。その各々は、TR-FRETドナー/アクセプターペアのメンバーと結合される。
【0085】
インキュベーションステップが完了すると、フルオロフォアは、SnapTag及びHaloTag酵素の自殺反応を介して共有結合的に結合され、CAMPSタンパク質は、TR-FRETに関連するフルオロフォアのぺアで標識される。
【0086】
基底状態では、TR-FRETシグナルが、フルオロフォアに近いために測定される。薬理学的刺激(例えば、HEK細胞で発現されるGタンパク質-結合レセプターのアゴニストによる刺激)の後に、cAMPの細胞内濃度は増加し、cAMPのCAMPSへの結合は後者のタンパク質の構造的変化を生じるだろう。次いで、測定されたTR-FRETシグナルの減少が観察される。
【0087】
本実施例は、TR-FRETシグナルの振幅が、cAMPのCAMPSタンパク質への結合と直接関連する、ことを示している。
【0088】
細胞内のcAMP濃度の減少、及びCAMPSタンパク質の構造の変形を引き起こし、TR-FRETシグナルの増加を測定することによって検出される、GPCRアンタゴニストを用いて、同一の実験を行うことができる。
【0089】
実施例4:カルシニューリン/カルモジュリン相互作用の測定(フローチャート、図4参照)
カルシニューリンは、ホスファターゼ活性を有し、細胞内カルシウムのレベルに関連する細胞シグナル伝達経路において基本的な役割を果たす。カルシニューリンは、2種類の転写因子:NFAT及びMEF2の方法によって哺乳動物におけるストレスの発生、及び当該ストレスへの適応に関連する。
【0090】
カルシニューリンは、2つのサブユニット、カルシニューリンA(CnA)及びカルシニューリンB(CnB)を含むヘテロダイマーである。この酵素は、そのヘテロダイマー形態で不活性であり、細胞内カルシウム濃度が増加すると、ホスファターゼ活性は、カルシニューリン/カルモジュリン複合体の形成によって刺激される。
【0091】
CnAサブユニット及びHaloTag酵素を含む融合タンパク質をコードするプラスミド、並びにカルモジュリン及びSnapTag酵素を含む融合タンパク質をコードするプラスミドは、リポフェクタミン2000を用いて又はエレクトロポレーションによって、細胞にコトランスフェクトされる。24時間又は48時間後に、SnapTag及びHaloTag酵素用の基質を含む培地中で、細胞は、37℃で1時間インキュベートされる。各々は、TR-FRETに適合するフルオロフォアの一対のメンバーと結合される。
【0092】
洗浄後、細胞はストレス(例えば、シクロスポリンA又は培地の酸性化)によって薬理学的に刺激される。測定されたTR-FRETシグナルは増加し、CnA/CnBへテロダイマーのカルモジュリンとの会合と関連する。
【0093】
試験をするのが望ましい、カルシニューリン-依存型シグナル経路の活性に影響を与える分子は、刺激の前に、測定培地に加えられる。本実施例は、本発明に従う方法が、生細胞内の、場合により試験化合物の存在下で、カルシニューリン-依存型シグナル伝達経路を試験できる、ことを示している。この種の試験は、このシグナル伝達経路を含む病理学的条件の処理を可能にすることがある候補化合物のハイ-スループットスクリーニングを可能にする。
【0094】
実施例5:抗-炎症活性を有する化合物のスクリーニング
TNF-アルファは、それが膜レセプターに結合すると、いくつかの細胞反応を起こす炎症性因子である。Bリンパ球内でTNF-アルファによって起こる反応の1つは、免疫反応の重要なステップである抗体の軽鎖の産生を調節する、転写因子NFκBの活性化である。よって、TNF-アルファインヒビターは、免疫反応を制御するために有用であり、例えば、感染性ショックの抑制において又は抗-炎症剤として使用できる。TNF-アルファ活性のこのようなインヒビターは、NFκB活性化レベルを測定することによって発見され、これは、本発明によって実行できる。
【0095】
図5は、細胞質ゾルタンパク質IκBによるNFκBの細胞質ゾル保持を説明する:NFκB(p65、p50)/IκB複合体が細胞質ゾル中で保持される。好適な刺激(T及びB細胞のマイトジェン、リポポリサッカライドおよびTNF-アルファ)は、IκBのリン酸化及びその分解を起こし、NFκBを遊離する。次いで、これは、細胞核を通過し、抗体の軽鎖の産生を活性化できる。
【0096】
本発明に従う方法は、分子生物学の慣用的方法によって、以下の構築物をBリンパ球に導入することにより適用される:
−IκB/SnapTag融合タンパク質を発現するベクター、これは、SnapTag基質と複合化されたドナ蛍光化合物で標識できる;及び
−p50/HaloTag融合タンパク質を発現するベクター、これは、HaloTag基質と複合化されたアクセプター蛍光化合物で標識できる。
【0097】
静止条件下に、NFκB(p65/p50)複合体はIκBとの複合体を形成し、TR-FRETシグナルが測定できる。細胞のTNF-アルファでの刺激の後に、IκBのリン酸化及び複合体のその分解は、TR-FRETシグナルを減少させるだろう。この減少の振幅は、NFκBの活性化の程度を表す。
【0098】
これらの細胞はマイクロウェルプレートで培養し、以下の処理の1つが異なったウェルに適用される:
−SnapTag及びHaloTag基質と結合されたドナー及びアクセプター蛍光化合物の添加、並びにTR-FRETシグナルの測定(高TR-FRET対照ウェル);
−SnapTag及びHaloTag基質と結合された蛍光化合物の添加、TNF-アルファの添加による細胞の刺激、並びにTR-FRETシグナルの測定(低TR-FRET対照ウェル);
−SnapTag及びHaloTag基質と結合された蛍光化合物の添加、試験化合物の添加、TNF-アルファの添加による細胞の刺激、並びにTR-FRETシグナルの測定(試験ウェル)。
【0099】
試験ウェルのシグナルは、高TR-FRET対照ウェルで測定したものと類似しているときには、試験化合物がTNF-アルファ活性に対する阻害効果を有すると結論できる。この値が、低TR-FRET対照ウェルで測定した値に近いときには、試験化合物がTNF-アルファ活性に対して効果を有さないと結論できる。
【0100】
本実施例は、薬物のスクリーニングについての本発明に従う方法の適用を説明するものであり、いわゆるハイ-スループットスクリーニングに特に好適である。
【0101】
実施例6:ユウロピウムキレートの時分割顕微鏡
本実施例は、本来、血漿膜を通過できる蛍光化合物の使用、及び時分割シグナルを細胞内で発光する能力を説明する。
【0102】
a)プロトコール
細胞をLABTEK培養チャンバーに接種し(密度 80,000 c/ml)、24時間培養し、培養培地で洗浄する。
以下の式のユウロピウムキレートを培養培地に加え(濃度20μM)、細胞を37℃で24時間インキュベートする。
【0103】
【化2】
【0104】
培養培地で洗浄した後、ヘキスト色素33342(濃度2μg/ml;供給者の文献:Sigma Aldrich B2261)を培養チャンバーに加え、次いで室温、暗闇で15分間インキュベートする。この色素は、細胞核を特異的に標識する性質を有する。
【0105】
培養チャンバーを、顕微鏡による画像の取得の前に、以下の装置を用いて「時分割」形式で、培養培地で再度洗浄する:Axiovert 200M顕微鏡(Zeiss)、UV励起源:パルス窒素レーザー(Spectra Physics)、及び以下のパラメータを有するPI-Max CCD(電荷結合装置)強化カメラ(Roper Scientific):
読み取り時間2ミリ秒:キレートからの全シグナルを回収するために、カメラは2ミリ秒間検出する;
遅延100マイクロ秒:時分割シグナルを拾う前に寄生的(parasitic)蛍光を削除するために課された遅延;
サイクル数/読み: 2ミリ秒間、30露光より多くシグナルを取得し、次いで適合する。
【0106】
b)結果
得られた画像を図6に示す。
透過画像(画像3)は、細胞の全体性及び細胞マットの密度を確かさを提供する。ヘキスト画像(画像2)は、細胞核の位置を見つけることができる。陰性対照(画像5)は、蛍光化合物の非存在下に時分割検出形式で得られたシグナルを示す。20μMの濃度で試験されたドナー蛍光化合物で得られた画像(画像1)は、FRETドナー化合物の細胞内の位置を明らかにすることができる。画像2及び1の重ね合わせは、蛍光が細胞内に存在することを示す。
【0107】
この種の時分割測定は、シグナル及びノイズゾーン上に対象の領域を指定し、測定されたシグナルの値からノイズの平均値を差し引くことによって、定量できる。
【0108】
本実施例は、血漿膜を通過できる希土類キレートが本発明を実行するために使用でき、かかる化合物によって発光されたシグナルが時分割顕微鏡によって測定できる、ことを示している。
【0109】
実施例7:ポリアルギニン単位及びベンジルグアニン基を含む蛍光複合体の合成、顕微鏡データ
a)BG-DY647及びDy647-R9-BGの合成
図9は、蛍光化合物DY647に共有結合的に結合された、ベンジルグアニンBG(SnapTag酵素の基質)を含む複合体の合成スキームを示す。
【0110】
図10は、一方でフルオロフォアDY647、他方でベンジルグアニンBGがその上に接ぎ合わされる(grafted)、9アルギニン(R9)を含む複合体の合成スキームを示す。
【0111】
b)CHO細胞は、5%のCO2を含む調節された空気の下で、F-12 HAM培地(Invitrogen)及び予め60℃で20分間不活性化された10%のウシ胎児血清(FCS)中で、37℃で培養する。
実験の前日に、細胞を分解し、75,000細胞/ウェルの密度でLABTEK培養チャンバー(Nunc)に接種する。
実験日に、試験化合物(BG-DY647又はDy647-R9-BG)を5μMの濃度に培養培地で調製し、1時間、細胞と接触させる。インキュベーション後に、培養培地で3回洗浄する。
顕微鏡的分析の前に、核染色をヘキスト色素で行う。
顕微鏡的分析は、Axiovert 200Mエピ蛍光顕微鏡(Zeiss)、40 Xレンズ、UV励起源:パルス窒素レーザー(Spectra Physics)及びCoolSNAP CCDカメラ(Photometrics)によって行う。
【0112】
図11は、複合体BG-DY647又は複合体DY647-R9-BGのいずれかによって得られた画像を示す。複合体DY647-R9-BGが細胞中に位置し、一方、複合体BG-DY647は、培養培地の溶液中に残っていることが明らかになった。そのため、DY647-R9-BGのような化合物は、特に、SnapTag酵素を含む細胞内タンパク質を標識するために血漿膜を通過できるアクセプター複合体として、本発明に従う方法において使用される。
【0113】
実施例8:培養中の細胞内へのフルオロフォアの侵入に対する、ポリアルギニン又はオリゴグアニジニウム修飾の効果の比較例、蛍光リーダーデータ
1)プロトコール
CHO細胞は、5%のCO2を含む調節された空気の下で、F-12 HAM培地(Invitrogen)及び予め60℃で20分間不活性化された10%のウシ胎児血清(FCS)中で、37℃で培養する。
実験の前日に、CHO-M1細胞を分解し、10,000細胞/ウェルの密度で96-ウェルプレートに接種する。
実験日に、培養培地を吸引し、濃度2.5μM又は5μMのKREBS緩衝液(Sigma)の試験化合物と交換する。1時間のインキュベーション後に、ウェルをKREBS緩衝液+0.05% Tween 20で洗浄する。細胞を次いでPBS緩衝液+0.1% Triton X100で溶解する。蛍光は、検出される化合物のスペクトル特異性に好適なフィルター及び二色性を有する、Analyst AD reader (LJL, Molecular Devices)で測定する。
【0114】
フルオレセインを有する化合物の例:
励起フィルター:パスバンド 485/22 nm
二色性:ハイ-パス 505 nm
発光フィルター:パスバンド 535/35 nm
希土類複合体を有する化合物の例:
励起フィルター:パスバンド 330/80 nm
二色性:BBUVm
発光フィルター:パス-バンド 620/10 nm
【0115】
b)結果
これらの条件下で4つの化合物を試験した:
−対照としての、血漿膜を本来通過できるフルオレセイン、及び血漿膜を本来通過できないカルボキシフルオレセイン;
−下記式:
【0116】
【化3】
【0117】
のR7-フルオレセイン誘導体、これは、図12に記載の合成スキームに従ってフルオレセイン構造に7アルギニン単位を含むポリアルギニン配列を接ぎ合わすことによって得られる;
−テトラグアニジニウム-フルオレセイン誘導体:テトラグアニジニウム配列(例えば、Fernandez-Carneado J. 他, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 869-874によって記載されている)をカルボキシフルオレセイン構造:
【0118】
【化4】
【0119】
に接ぎ合わす。
【0120】
上記のプロトコールに従う化合物(図13)の各々について測定された蛍光強度は、ポリアルギニン及びテトラグアニジニウム配列が、FRETパートナーの1つを細胞に侵入させるために使用され、よって、FRETパートナーの1つが細胞膜を通過させることができるための単位として使用される、ことを示している。
【0121】
実施例9:構成的細胞内TR-FRET(HaloTag/SnapTagカメレオン)の例
本発明に従う方法は、生細胞中でFRETシグナルを明らかにするために使用される。これは、細胞内媒体中で、SnapTag及びHaloTagからなる融合タンパク質を発現するために、細胞中に発現ベクターを導入することによって実行される。SnapTag自殺酵素は、SnapTag基質(ベンジルグアニン)で標識した蛍光化合物との結合を可能にする。HaloTag自殺酵素は、HaloTag基質(クロロアルカン)で標識した蛍光化合物との結合を可能にする。
【0122】
SnapTag/HaloTag融合タンパク質の細胞発現のプラスミド構築物の入手:
HaloTag配列を有するプラスミドpHT2は、Promegaから入手できる。SnapTag配列を有するpSem-S1-ST26mプラスミドは、Covalysから入手できる。HaloTagのコーディング配列に相当するカセットは、EcoRV-NotI(Biolabs)を用いる酵素消化によってプラスミドpHT2から単離し、同一の酵素で予め消化されたプラスミドpCDNA3.1(Invitrogen)に移動される。
【0123】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。
配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0124】
SnapTagのコーディング配列に対応するカセットは、ClaI-XhoI(Biolabs)を用いる酵素消化によってpSEM-S1-ST26mから単離され、同一の酵素で予め消化されたプラスミドpBluescriptKS(Stratagene)に移動される。
【0125】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。
配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0126】
SnapTag/HaloTag融合タンパク質のコーディング配列を得ることができるプラスミドは、XbaI-KpneI(Biolabs)によるプラスミドpBluescriptKS-ST26mの消化によって単離された、SnapTag配列に対応するカセットを、NheI-KpneIによって予め消化されたプラスミドpCDNA3.1HaloTag移動することによって得られる。
プラスミドpBluescriptKS-ST26m-HaloTagに相当するプラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製によって得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0127】
COS-7細胞は、リポフェクタミン2000を用いて又は96-ウェルプレートでのエレクトロポレーションによって、プラスミド構築物pBluescriptKS-ST26m-HaloTagで一時的にトランスフェクトする。一時的なトランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な基質であって、その基質の各々は、FRETパートナーの一対のメンバー及び血漿膜を通過できるようにする単位に共有結合的に結合されている当該基質の各々を5μM含む細胞培地で、COS-7細胞を1時間インキュベートする(例えば、図7又は8のスキームに従って製造)。
【0128】
KREBS+0.05% Tween20での洗浄後、RubyStarリーダー(BMG)でFRETシグナルを測定する。これは、本発明に従う方法が、生細胞内で生じたFRETシグナルを測定するために使用できることを示す。
【0129】
実施例10:誘導された細胞内TR-FRET(FRB/FKBP)の例
使用されたモデル:
本発明に従う方法は、ラパマイシンが培養培地に添加されるときに、細胞内タンパク質FKBP12とタンパク質FRAPのFRBドメインとの相互作用を明らかにするために適用される。FKBP12は、イムノフィリンファミリーに属する12 kDaタンパク質である。ラパマイシンのFKBP12の結合は、これらのパートナーからFKBPを解離することによってタンパク質に細胞溶解性を付与する。タンパク質FRAP(又はmTOR)は、FRBドメインを含み:このドメインは、(mTOR E2015-Q2114の配列に相当する)99アミノ酸からなる。ラパマイシンは、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)菌から単離された分子であり、商業的に入手できる。それは、2つの異なった疎水性ポケットを有し、1つはFKBP上にあり、他の1つはFRB上にあり、2つのタンパク質と同時に結合する。
【0130】
【化5】
【0131】
−細胞発現プラスミド内のHaloTag/FRB融合タンパク質を得るための構築物
PCRは、以下のプライマー:
プライマーERV-Nco-HT-s:5' gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
プライマーHT-PstI-HT-as:5' acttaattaactgcaggccggccagc 3'
用いてプラスミドpHT2(Promega)で実行される。
【0132】
PCRは、72℃のハイブリダイゼーション温度で、ポリメラーゼPhusion(Finnzyme)で実行される。PCR産物は、37℃、1時間で、酵素NcoI-PstIで消化し、次いで酵素を80℃で20分間不活性化する。Covalysによって供給されるプラスミドpBAD-ST26-FRBは、SnapTag(ST26)に相当するカセットを単離するために、NcoI及びPstIで消化する。得られた直線状のプラスミド、pBAD-FRBは、上記のHaloTag PCR産物でライゲートされる。
【0133】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドpBluescriptKS-ST26mを有する細菌の選択を可能にする。
【0134】
得られたプラスミド、pBAD-HT-FRBは、カラム(QIAGEN)で精製され、シークエンシングによって確認される。HaloTag(HT)/FRB融合タンパク質のコーディング配列に相当するカセットは、以下のプライマー:
プライマーERV-Nco-HT-s:5' gcggatatcgccaccatgggatcc 3'
プライマーpBAD rev:5' gttctgatttaatctgtatca 3'
を用いてpBAD-HT-FRBマトリックスからPCRによって増幅される。
【0135】
PCRは、72℃のハイブリダイゼーション温度で、ポリメラーゼPhusion(Finnzyme)で実行される。PCR産物は、37℃、1時間で、酵素EcoRV-AscIで消化し、次いで酵素を65℃で20分間不活性化する。消化されたPCR産物は、EcoRV及びAscIで消化された、細胞発現プラスミドpSEM-XT(Covalys)に移動する。
【0136】
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドを有する細菌の選択を可能にする。プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0137】
−細胞発現プラスミド内のHaloTag/FKBP融合タンパク質を得るための構築物
FKBPタンパク質のコーディング配列に相当するカセットは、PstI-AscI消化によってプラスミドpBAD-ST-FKBP(Covalys)から単離され、細胞発現プラスミドpSEMXT-26(Covalys)に移動される。
ライゲーションは、T4リガーゼ(Invitrogen)で実行される。Turbo細胞(GenetherapySystem)と称される化学コンピテント細菌は、ライゲーション産物で形質転換される。形質転換された細菌を、LB-アガー培地(Sigma)+0.1 mg/mlアンピシリン(Eurogentec)上に播いて、プラスミドを有する細菌の選択を可能にする。
プラスミドDNAは、カラム(QIAGEN)での精製により得られる。配列の全体性は、シークエンシングによって確認される。
【0138】
COS-7細胞は、リポフェクタミン2000を用いて又は10,000細胞/ウェルの濃度で96-ウェルプレートでのエレクトロポレーションによって、2つのプラスミド構築物(HaloTag/FRB及びSnapTag/FKBP)で一時的にトランスフェクトする。
一時的なトランスフェクションの24時間又は48時間後に、HaloTag及びSnapTag酵素に特異的な基質であって、その基質の各々は、FRETパートナーの一対のメンバー及び血漿膜を通過できるようにする単位に共有結合的に結合されている、当該基質の各々を5μM含む細胞培地で、COS-7細胞を1時間インキュベートする(例えば、図7又は8のスキームに従って製造)。
KREBS+0.05% Tween20での3回の洗浄後、100 nMのラパマイシン(Calbiochem)とのタンパク質相互作用の誘導の前後に、RubyStarリーダー(BMG)でFRETシグナルを測定する:TR-FRETシグナルは、ラパマイシンによるインキュベーション後には著しく高い。
【0139】
本実施例は、本発明に従う方法が、TR-FRET法を用いる生細胞内の生物的相互作用を明らかにすることができる、ことを示す。
【図面の簡単な説明】
【0140】
【図1】図1は、タンパク質キナーゼC-ガンマ(PKC-γ)の転位を示す。
【図2】図2は、アンドロゲン受容体/コアクチベーター又はアンドロゲン受容体/コレプレッサー相互作用を示す。
【図3】図3は、cAMP結合ドメインを含む融合タンパク質の構造的修飾を示す。
【図4】図4は、カルシニューリン/カルモジュリン相互作用を示す。
【図5】図5は、細胞質ゾルIκBによるNFκBの細胞質保持を説明する。
【図6】図6は、ユウロピウムキレートの時分割顕微鏡で得られた画像を示す。
【図7】図7は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられるベンジルグアニとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する。
【図8】図8は、蛍光化合物、すなわち化合物DY647(DYOMICS製)と自殺酵素の基質(酵素「SnapTag」の基質)、すなわちアミン官能基が加えられるベンジルグアニとの複合体の合成、及び当該蛍光化合物への反応性化学基の導入を説明する。
【図9】図9は、蛍光化合物DY647に共有結合的に結合された、ベンジルグアニンBG(SnapTag酵素の基質)を含む複合体の合成スキームを示す。
【図10】図10は、一方でフルオロフォアDY647、他方でベンジルグアニンBGがその上に接ぎ合わされる、9アルギニン(R9)を含む複合体の合成スキームを示す。
【図11】図11は、複合体BG-DY647又は複合体DY647-R9-BGのいずれかによって得られた画像を示す。
【図12】図12は、フルオレセイン構造に7アルギニン単位を含むポリアルギニン配列を接ぎ合わすスキームを示す。
【図13】図13は、カルボキシフルオレセイン構造を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体分子間の相互作用、又は生細胞内の生体分子の転位もしくは構造変化を検出するための方法であって、以下のステップ:
1)生細胞中の第1生体分子を、長蛍光寿命を有する第1蛍光化合物で標識し;
2)当該生細胞中の少なくとも1つの第2生体分子を第2蛍光化合物で標識し;
3)試験分子バンクに属する化合物の存在下又は非存在下に、試験される生物的反応に適合した特定の刺激に当該生細胞を供し;
4)波長が第1の長命蛍光化合物を励起する光源に当該生細胞を供し;
5)当該第1及び第2蛍光化合物によって発光された蛍光の密度を測定し、次いで当該第1蛍光化合物の蛍光強度と当該第2蛍光化合物の蛍光強度との比を計算し、又は当該第1もしくは第2蛍光化合物の寿命を測定し;並びに
6)測定されたシグナルを、当該細胞の刺激前に得られたシグナルと比較すること、
を含み、当該第1及び少なくとも第2蛍光化合物は、TR-FRETパートナーである、前記方法。
【請求項2】
生体分子の構造変化が試験され、前記蛍光化合物が同一の生体分子と結合される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記生体分子が、自殺酵素の作用による共有結合性標識、タンパク質スプライシングによる共有結合性標識、生体分子及び蛍光化合物としての蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の発現による標識、及び結合パートナーを介する高アフィニティ非共有結合性標識から選ばれる技術を用いて蛍光化合物で標識される、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】
前記蛍光化合物/生体分子標識が、蛍光化合物及び生体分子の各々と、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるぺアのメンバーとの結合によって行われる、請求項1又は2記載の方法。
【請求項5】
前記蛍光化合物の少なくとも1つが、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】
蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする前記単位が、エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、テトラグアニジニウム単位、コレステロールもしくはビタミンE基を含む非-加水分解性誘導体、又は脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる、請求項5記載の方法。
【請求項7】
前記第1蛍光化合物の寿命が、100ナノ秒超である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項8】
前記第1蛍光化合物が、希土類キレート又はクリプタートから選ばれる、請求項7記載の方法。
【請求項9】
前記第1蛍光化合物が、ピリジン単位を含む希土類クリプタートである、請求項7記載の方法。
【請求項10】
前記希土類がテルビウム又はユウロピウムである、請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】
前記第2蛍光化合物が、蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、又は100ナノ秒未満の寿命を有する有機蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及びBODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている蛍光分子、及びアレクサフルオロとして知られている化合物から選ばれる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
前記第2蛍光化合物が、第2蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む有機蛍光化合物である、請求項11記載の方法。
【請求項13】
以下:
−第1蛍光化合物及び少なくとも1つの第2蛍光化合物、これらの化合物は、TR-FRETパートナーであり、これらの化合物の少なくとも1つは、これらの化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を有する;
−生体分子を含む生細胞;
−生体分子を当該蛍光化合物で標識する手段;及び
−生体分子間の相互作用の現象、又は生細胞内の生体分子の転位もしくは構造変化を試験するための教示、
を含むパーツのキット。
【請求項14】
生体分子を蛍光化合物で標識する前記手段が、蛍光化合物及び生体分子の各々と、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGA、酵素ジフルオロフォレートレダクターゼ/トリメトプリムから選ばれるぺアのメンバーとの結合によって行われることにある、請求項13記載のキット。
【請求項15】
蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする前記単位が、エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、テトラグアニジニウム単位、コレステロールもしくはビタミンE基を含む
非-加水分解性誘導体、又は脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる、請求項13記載のキット。
【請求項16】
前記細胞が、試験される生体分子、又は試験される当該分子を含む融合タンパク質を発現するように、遺伝子的に改変される、請求項13記載のキット。
【請求項17】
長命蛍光化合物、並びに蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているものから選ばれる、少なくとも1つの他の蛍光化合物、を含む、請求項13記載のキット。
【請求項18】
前記長命蛍光化合物が、100ナノ秒超の寿命を有する、請求項17記載のキット。
【請求項19】
前記長命蛍光化合物が、希土類キレート又は希土類クリプタートである、請求項18記載のキット。
【請求項20】
前記長命蛍光化合物が、テルビウム又はユウロピウムである、請求項18記載のキット。
【請求項1】
生体分子間の相互作用、又は生細胞内の生体分子の転位もしくは構造変化を検出するための方法であって、以下のステップ:
1)生細胞中の第1生体分子を、長蛍光寿命を有する第1蛍光化合物で標識し;
2)当該生細胞中の少なくとも1つの第2生体分子を第2蛍光化合物で標識し;
3)試験分子バンクに属する化合物の存在下又は非存在下に、試験される生物的反応に適合した特定の刺激に当該生細胞を供し;
4)波長が第1の長命蛍光化合物を励起する光源に当該生細胞を供し;
5)当該第1及び第2蛍光化合物によって発光された蛍光の密度を測定し、次いで当該第1蛍光化合物の蛍光強度と当該第2蛍光化合物の蛍光強度との比を計算し、又は当該第1もしくは第2蛍光化合物の寿命を測定し;並びに
6)測定されたシグナルを、当該細胞の刺激前に得られたシグナルと比較すること、
を含み、当該第1及び少なくとも第2蛍光化合物は、TR-FRETパートナーである、前記方法。
【請求項2】
生体分子の構造変化が試験され、前記蛍光化合物が同一の生体分子と結合される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記生体分子が、自殺酵素の作用による共有結合性標識、タンパク質スプライシングによる共有結合性標識、生体分子及び蛍光化合物としての蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の発現による標識、及び結合パートナーを介する高アフィニティ非共有結合性標識から選ばれる技術を用いて蛍光化合物で標識される、請求項1又は2記載の方法。
【請求項4】
前記蛍光化合物/生体分子標識が、蛍光化合物及び生体分子の各々と、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGAから選ばれるぺアのメンバーとの結合によって行われる、請求項1又は2記載の方法。
【請求項5】
前記蛍光化合物の少なくとも1つが、蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】
蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする前記単位が、エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、テトラグアニジニウム単位、コレステロールもしくはビタミンE基を含む非-加水分解性誘導体、又は脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる、請求項5記載の方法。
【請求項7】
前記第1蛍光化合物の寿命が、100ナノ秒超である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
【請求項8】
前記第1蛍光化合物が、希土類キレート又はクリプタートから選ばれる、請求項7記載の方法。
【請求項9】
前記第1蛍光化合物が、ピリジン単位を含む希土類クリプタートである、請求項7記載の方法。
【請求項10】
前記希土類がテルビウム又はユウロピウムである、請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】
前記第2蛍光化合物が、蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているもの、又は100ナノ秒未満の寿命を有する有機蛍光化合物、例えばシアニン、ローダミン、フルオレセイン、スクアレン及びBODIPY(ジフルオロボラジアザインダセン)として知られている蛍光分子、及びアレクサフルオロとして知られている化合物から選ばれる、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
前記第2蛍光化合物が、第2蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を含む有機蛍光化合物である、請求項11記載の方法。
【請求項13】
以下:
−第1蛍光化合物及び少なくとも1つの第2蛍光化合物、これらの化合物は、TR-FRETパートナーであり、これらの化合物の少なくとも1つは、これらの化合物が血漿膜を通過できるようにする単位を有する;
−生体分子を含む生細胞;
−生体分子を当該蛍光化合物で標識する手段;及び
−生体分子間の相互作用の現象、又は生細胞内の生体分子の転位もしくは構造変化を試験するための教示、
を含むパーツのキット。
【請求項14】
生体分子を蛍光化合物で標識する前記手段が、蛍光化合物及び生体分子の各々と、SnapTag基質/酵素SnapTag、HaloTag基質/酵素HaloTag、インテイン部分、例えばSsp DnaEのインテイン/機能性インテインを再構築するための相補的インテイン部分、二ヒ素単位/配列Cys-Cys-X-X-Cys-Cys(Xは、アミノ酸を示す)、金属イオン/ポリヒスチジン配列、ビオチン/ストレプトアビジン、ストレプトアビジン/ビオチン、ブンガロトキシン/タグBTX、カダベリン/タンパク質配列PKPQQFM、アジリジン/核酸配列TCGA、酵素ジフルオロフォレートレダクターゼ/トリメトプリムから選ばれるぺアのメンバーとの結合によって行われることにある、請求項13記載のキット。
【請求項15】
蛍光化合物が血漿膜を通過できるようにする前記単位が、エステル、例えばピバロイルオキシメチルエステル、アセトキシメチルエステル又はグリコール酸エステル;及び、膜トランスポーターによって支配されるウイルスペプチド、例えばペネトラチン及びそのアナログ、トランスポータン及びそのアナログ、ポリアルギニン基、グアニジン基を有するペプトイド、テトラグアニジニウム単位、コレステロールもしくはビタミンE基を含む
非-加水分解性誘導体、又は脂肪族鎖、例えばウンデシル又は1,2-ジ-O-ヘキサデシルグリセロール鎖から選ばれる、請求項13記載のキット。
【請求項16】
前記細胞が、試験される生体分子、又は試験される当該分子を含む融合タンパク質を発現するように、遺伝子的に改変される、請求項13記載のキット。
【請求項17】
長命蛍光化合物、並びに蛍光タンパク質、例えば緑蛍光タンパク質(GFP)及びその誘導体(特にCFP、YFP)、サンゴから抽出された蛍光タンパク質、フィコブリタンパク質、例えばB-フィコエリスリン、R-フィコエリスリン、C-フィコシアニン及びアロフィコシアニン、特にXL665として知られているものから選ばれる、少なくとも1つの他の蛍光化合物、を含む、請求項13記載のキット。
【請求項18】
前記長命蛍光化合物が、100ナノ秒超の寿命を有する、請求項17記載のキット。
【請求項19】
前記長命蛍光化合物が、希土類キレート又は希土類クリプタートである、請求項18記載のキット。
【請求項20】
前記長命蛍光化合物が、テルビウム又はユウロピウムである、請求項18記載のキット。
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【公表番号】特表2009−506784(P2009−506784A)
【公表日】平成21年2月19日(2009.2.19)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2008−529668(P2008−529668)
【出願日】平成18年9月4日(2006.9.4)
【国際出願番号】PCT/FR2006/050838
【国際公開番号】WO2007/028921
【国際公開日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【出願人】(507179726)シ ビオ アンテルナショナル (9)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年2月19日(2009.2.19)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年9月4日(2006.9.4)
【国際出願番号】PCT/FR2006/050838
【国際公開番号】WO2007/028921
【国際公開日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【出願人】(507179726)シ ビオ アンテルナショナル (9)
【Fターム(参考)】
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