生体組織をマルチモーダルにイメージングするための方法及び装置
本発明は、領域内の組織型の正確な同定とともに組織領域の迅速な画像化が可能な新規な多波長画像化方法及び装置を対象とする。共通偏光又は交差偏光した蛍光又は反射強度、光学密度及び／又は反射率のような、光学特性を組織領域内の複数部位においてそれぞれの波長について確認することができる。波長に関する光学特性の算出した導関数を包含している、２つの波長における当該特性を解析して、単一波長において測定された特性に基づいて得られるものよりも正確に、組織構造の画像化及び組織領域内の組織型の同定ができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年４月１４日に出願した米国仮特許出願第６１／１６９，２５８号の優先権を主張し、その開示は、参照により、その全てが本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（技術分野）
２つ又はそれ以上の特定波長における、異なった組織型による色素の吸収特性及び／又はその他の光学的相互作用を比較することによって、組織サンプル中の癌組織又は生体組織のその他の特定な型の正確な輪郭付けを容易にする方法及び装置を特徴としている。この方法及び装置は、とりわけ、手術中リアルタイムに、非黒色腫皮膚癌（例えば、基底細胞癌）の輪郭又は境界を提供するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
非黒色腫皮膚癌はヒトの癌の非常に一般的な形態である。統計的に、白人の約４人に１人が彼らの生涯の内に少なくとも１つの病班を発症することになる。基底細胞癌（ＢＣＣ）は総非黒色腫癌の約８０％を構成し、そしてその発生率はめざましく増大している。これらは、一般に、頭及び頸のような体の日光露出部上に現れるので、これらの腫瘍の周りの正常な皮膚を保護する必要がある。ＢＣＣは外観を損なうが殆ど死に至らない（例えば、これらは年に約３０００人の死因となる）。しかしながら、その有病率により、これらの治療費は１年当たり６億ドルを超えている。
【０００４】
ＢＣＣは通常手術によって治療される。これらの腫瘍はよく顔に発症してめったに転移しないので、それを切除する際にはできるだけ多くの健常組織を保護することが重要である。しかしながら、多くの場合、病変部の明暗差は乏しく、そしてこれらの腫瘍は明確な境界を有しておらず、これは目視的な腫瘍局在診断及び正確な切除を困難にしている。
【０００５】
モース顕微鏡手術（ＭＭＳ）は、手術中に切除縁部を完全にコントロールできる臨床技術である。この技術は、切除する病変部の詳細なマッピング及び顕微鏡的コントロールを用い、裸眼では見えない腫瘍に関わっている手術切除縁の領域を正確に示すことができる。正確で精密であるが、ＭＭＳは時間がかかり、そして通常皮膚病理学の訓練を積んでいる外科医、専用の実験室及び凍結切片を調製して評価する技術者を必要とする、人材集約的な手法である。これらの欠点のために、ＭＭＳは少数の症例でしか用いられていない。従って、手術中の縁部コントロール問題に取り組むために、新規な技術及び治療手順を導入しなければならない。
【０００６】
光学的画像法の最近の進歩が、完全なＢＢＣ腫瘍境界の、精密でリアルタイムで費用効率が高い手術中検査を技術的に可能にしている。しかしながら、これらの技術は、一般に臨床の場における実用的用途に必要な要素の１つ又はそれ以上が不足している。インビボでの使用に適しているＦＤＡに承認されている造影剤又は色素、例えばメチレンブルー（ＭＢ）は病変部によく適用されているが、正常組織及び病的組織由来の光信号の本質的な相違が希薄であることが多い。ＭＢは、膀胱の新生腫瘍、膵臓の腫瘍、及びバレット食道異形性を大まかに境界付けるために成功裏に適用されている。ＭＢ色素は、正常細胞と比べると、癌細胞のミトコンドリアに非常に多く蓄積される傾向があるが、１００％特異的ではない。毛嚢、皮脂腺及び表皮のような、健常な皮膚組織構造も幾つかの色素を保持できる。しかしながら、これらの組織の外観及び色素濃度は、癌のそれとはかなり異なっている。
【０００７】
色素によって強化された反射率及び蛍光偏光画像化（ＲＦＰＩ）を包含する、幾つかの補完的技術は、９４％を越える成功率でリアルタイムの高コントラスト画像を提供できる。このような技術は、例えば、米国特許第７，２８９，２０５号に記載されている。しかしながら、このような技術は癌組織と、類似の光学密度を示す、ある特定の組織、例えば、毛嚢等を明確に区別できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、上記の欠陥を考慮して、単純で、より正確で、そして／又は時間効率のよい方法は腫瘍の境界をマッピングするために、そして腫瘍組織と健常組織の識別を向上させるために好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の必要性を満たすこと、及び特に上で検討した欠陥並びに通常の当該技術分野における欠陥に対処することに関している。
本発明の実施態様は、健常組織構造及びその他の組織構造（例えば、ＢＣＣのような癌組織）の両方を含有する組織サンプル内の複数の地点における、ある特定の波長に依存する光学特性、及び随意に、そのような光学特性の対応する波長導関数(derivative)の分析を包含する方法及び装置を提供する。光学特性は、造影剤、例えば、メチレンブルー（ＭＢ）のような色素で処理されている組織の局所的な反射率及び光学密度を包含できる。各波長における偏光情報も用いることができる。このような方法及び装置は、例えば、色素で増強した反射率及び／又は蛍光偏光画像化方法と組合せて用いたときに、非黒色腫皮膚癌領域の輪郭付けを容易にすることができる。
【００１０】
本発明の一実施態様では、本発明は、２つ又はそれ以上の特定波長において、色素のような造影剤で処理した組織領域又はサンプルを画像化することを包含する、腫瘍境界付け技術を提供する。画像化用の光は、単色光源によって、又は広帯域光源及び２つ又はそれ以上の単色フィルター（偏光フィルターであってもよい）によって提供できる。
異なった組織構造、例えば、各種の健常皮膚構造及び癌組織に関連する局所的な光学密度、反射率、又はその他の光学特性は、そのような特性の値がある特定の組織型又は構造に関して類似している場合であっても、異なった構造に対する波長に関しては異なった変化率を示しうる。従って、この技術を用いる組織の画像分析のための方法及び装置は、周囲の健常組織から、癌組織のような構造をより正確に区別するのに十分である、たった２つの監視波長で迅速な分光分析を提供することができる。
従って、本発明の実施態様は、癌組織又はその他の組織構造の手術中のリアルタイムで正確な同定及び輪郭付けを容易にする方法及び装置を提供することができる。
【００１１】
本発明の別の実施態様では、このような光学特性の波長依存導関数を確認して、組織領域を画像化するために及び／又は組織内の異なった組織を区別するために用いることができる。このような導関数は、少なくとも５ｎｍ異なっている波長、例えば、約５ｎｍ〜３０ｎｍ、又は約１０ｎｍ〜２０ｎｍ異なっている波長で得た測定値に基づいて見積ることが好ましい。
【００１２】
更なる実施態様では、インビボ画像を実施する場合は、造影剤はメチレンブルーであってよい。この造影剤で用いられる少なくとも１つの波長は、約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍが好ましい。例えば、約６１５ｎｍ及び／又は６６５ｎｍの波長を用いることができる。これらの波長はメチレンブルーの吸収極大に一致するので、異なった組織型の同定及び／又は輪郭付けを容易にする大きい信号を提供できるからである。エクスビボで組織を画像化する場合は、トルイジンブルーのような造影剤を用いることができる。
【００１３】
本発明の更なる実施態様では、試験する組織に基づいて別の波長を用いることができる。例えば、画像化又は区別すべき組織の血液含量のレベルが有意に異なっているならば、約４１０ｎｍに近い波長を用いることができる。画像が主に散乱挙動に基づいていることが望ましいならば、約１１００ｎｍ〜約１３００ｎｍの波長も用いることができる。
【００１４】
また本発明の更なる実施態様では、蛍光偏光及び／又は反射率偏光情報を、２つ又はそれ以上の波長で、組織領域内の複数の地点で得ることができる。このような情報も、組織領域内の異なった組織構造及び型を画像化及び／又は輪郭付けるために用いることができる。
【００１５】
本発明の更に別の実施態様では、組織領域内の２つ又はそれ以上の波長で測定された光学特性を、各種組織型に関するそのような特性の既定波長依存値と比較することができる。１つ以上の波長における局所的光学特性のこのような比較は、単一波長で得られた光学特性の測定値と比較して、組織型のより正確な同定及び輪郭付けをもたらすことができる。組織サンプルで検出又は測定された値と比較するために用いられるこのような既定光学特性は、波長に関する測定された光学特性の導関数も包含する。
【００１６】
本発明の別の実施態様では、少なくとも２つの異なった波長を有する光で組織サンプルを照射するように作られている光源、それぞれの波長で組織サンプルから送られた光を検出するように作られている１つ又はそれ以上の検出器、及び本明細書に記載されているような組織サンプル中の異なった組織型又は構造を画像化、同定及び／又は輪郭付けるように作られているアナライザーを包含している装置が提供される。装置は、偏光特性を組織サンプルの画像化のために用いる場合は、偏光フィルターを包含していてもよい。
【００１７】
本発明に従って提供される方法、システム及び装置は、非黒色腫皮膚癌の境界をリアルタイムに手術中に画像化及び輪郭付けるために、腫瘍切除術を加速するために、そして実施できる外科手術の数を増やすために特に有用である。例えば、本発明の実施態様を実際の腫瘍切除手術を誘導するために用いることができる。このような改善は、スペクトル解析をＲＦＰＩ手法及びリアルタイム腫瘍輪郭付け手法を容易にするシステムに組み込むことによってもたらされる。
【００１８】
本発明のこれらの及び別の目的、特徴及び利益は、図面を同時に用いて以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
【００１９】
本発明に関わる当業者が、如何にこれを作成してこれを使用するかをより容易に理解するために、言及は図面を有すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、反射率及び蛍光偏光画像化を実施できるように作られている例示的な装置の略図である。
【図２】図２ａは、基底細胞癌を含有している１６×７ｍｍの頭皮組織試料画像の６６５ｎｍにおける例示的なグレイスケール表面反射率画像である。 図２ｂは、図２ａに示されている組織試料の６１５ｎｍで励起して、及び６６０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲で記録した蛍光偏光画像である。 図２ｃは、有資格病理学者によって腫瘍境界が描かれている、図２ａに示されている組織試料のＨ＆Ｅ凍結組織構造の画像である。 図２ｄは、癌組織及び健常組織構造について得た平均化した光学密度スペクトルのグラフである。
【図３】図３ａ〜３ｅは、ＢＣＣ−健常組織構造の対についての、２０以上のサンプルを平均した、光学密度スペクトルのプロットである。（ａ）ＢＣＣと皮脂腺、（ｂ）ＢＣＣと毛嚢、（ｃ）ＢＢＣと表皮、（ｄ）ＢＢＣとコラーゲン、そして（ｅ）ＢＢＣと皮下脂肪。
【図４】図４ａ〜４ｅは、ＢＣＣ−健常組織構造の対についての、２０以上のサンプルを平均した、波長依存的光学密度導関数のプロットである。（ａ）ＢＣＣと皮脂腺、（ｂ）ＢＣＣと毛嚢、（ｃ）ＢＢＣと表皮、（ｄ）ＢＢＣとコラーゲン、そして（ｅ）ＢＢＣと皮下脂肪。
【００２１】
ここで本発明を図面を参照して詳細に記載するが、これは説明的な実施態様に関連するものであって、図に例示している特定の実施態様によって限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
生物造影剤、例えば、ＭＢのような染色剤又は色素を、異なった型の組織内に別々に分布させることができる。色素分布のこのような変化は、局所的な色素濃度の違いに部分的に依存している、スペクトル吸収及びその他の光学特性の変化をもたらす。その他の因子も、組織中の血液／ヘモグロビン又はその他の光吸収物質の局所濃度のような、観察される光学特性に影響を及ぼす。従来の組織同定技術では、広帯域光源又は単一波長を用いて測定された染色組織の光学特性を比較して、色素分布の変化に基づく組織型の相違を同定できる。しかしながら、ある特定の区別しうる組織型が、このような測定で類似の光学特性を示すかもしれず、これはサンプル中の組織型の同定又は区別化に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００２３】
２つ又はそれ以上の波長におけるある特定の光学特性を、組織サンプルの領域内の複数の位置で測定できる。それぞれの波長における特性の差異を、領域内の異なった位置におけるそのような特性の差異と共に、比較又は分析できて、組織領域の画像化及びサンプル内の組織型のより正確且つ／又は信頼性のある同定を提供するために用いることができる。
【００２４】
測定された光学特性は、例えば、組織サンプルの領域の反射率（例えば、絶対反射率スペクトル）、光学密度、等、又はこれらの組み合わせを包含できる。特定の光学特性を、試験する組織に基づいて選択することができる。例えば、反射率は直接測定できるが、反射率の値は通常、サンプルの厚さに部分的に依存する。対照的に、光学密度は組織の固有の特性であるが、その測定は組織自体に関するある特定の前提に基づいている。光の多種偏光、非偏光、又はこれらの組み合わせを本明細書に記載のような組織型の輪郭付けを容易にするために用いることができる。光学分析に用いる画像の型を、例えば、非偏光、又は共通偏光強度（Ｉｃｏ）及び交差偏光強度（Ｉｃｒｏｓｓ）の各種組み合わせを基にすることができる。このような組み合わせは、信号差（例えば、Ｉｃｏ−Ｉｃｒｏｓｓ）、比（例えば、Ｉｃｏ／Ｉｃｒｏｓｓ）、相対的差（例えば、（Ｉｃｏ−Ｉｃｒｏｓｓ）／（Ｉｃｏ＋Ｉｃｒｏｓｓ））等に基づくスペクトルデータを包含できる。典型的な適用において、交差偏光に基づく信号を用いると深部組織の輪郭付けが改善されるのに対して、共通偏光及び交差偏光強度の間の差を用いるとより表面の組織がより良く輪郭付けられる。
【００２５】
多種の色素又は染色剤を用いることができる。メチレンブルー（ＭＢ）は、インビボでもエクスビボの組織サンプルでも用いることができる、ＦＤＡに承認された染色剤である。その他の色素も、特にエクスビボの組織分析のために用いることができる。例えば、トルイジンブルー（ＴＢ）は、本明細書に記載されている分析のためにエクスビボの組織サンプルを染色するために用いることができる。ＴＢは吸収スペクトルをＭＢと比べてスペクトルの黄色領域の方向にシフトさせることができ、これは一般に血液の吸収領域により近い。従って、血液を大量には含有していない組織の分析に好ましい。
【００２６】
組織サンプルのある特定の領域の光学特性は、本明細書に記載のように、２つ又はそれ以上の波長で測定することができる。用いられる波長のうちの１つは、色素吸収スペクトル内の極大値又はピーク値、或いはその近くでよい。例えば、ＭＢ色素を用いる場合は、波長の一方は、ＭＢについての吸収極大値にほぼ対応する、６１５ｎｍ又は６６５ｎｍ或いはその近くでよい。一般に、そのような最大値の近辺（例えば、ＭＢに対して、約６００ｎｍと約６８５〜７００ｎｍの間）の波長が、差別化を促進する、より大きな信号及び対応する信号間の大きな差をもたらすので、好ましい。その他の色素を用いる場合は、特定の色素に対応する吸収ピーク値又はその近くの異なった波長を用いることができる。吸収最大値に近い少なくとも１つの波長の使用は測定する強度に対してより大きな信号を提供でき、これはサンプル内の異なった組織型及び領域に対するそのような信号間の区別化を促進できる。
【００２７】
光学特性（例えば、吸収強度）はこれらの波長で又はその近辺でも得られる。従って、異なった組織領域に対して、単一の波長における吸収強度（又は広帯域光源由来の単一波長分布）を単に比較するよりむしろ、２つ又はそれ以上の波長における相対的な吸収動態を比較できる。異なった波長における組織の色素との相対的光学相互作用のこのような分析は、サンプルの異なった組織領域内の組織型の間のより詳細且つ／又は正確な差別化をもたらすことができる。
【００２８】
本明細書に記載されているような波長依存的光学特性の導関数の分析も、サンプル領域内の組織型の輪郭付けを提供するか或いは改善することができる。例えば、波長に関連するある特定の光学特性の値についての導関数を、特定の波長で見積ることができる。このような特性導関数は、異なった組織型に対してそのような光学特性の絶対値が同一又類似していても、組織型又は領域間の差別化をもたらすことができる。
【００２９】
光学特性に対する波長導関数情報は、通常の数学的技法を用いて算出できる。例えば、本明細書に記載されているような特定の光学特性は、組織サンプル内の特定位置において、２つの異なった波長で測定できる。導関数情報を見積るために用いられる波長間の差は約５ｎｍより大きいこと、例えば約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば１０ｎｍであることが好ましい。本明細書に記載されているような導関数情報を算出するために用いられる波長の差は、異なった波長で測定される光学特性の区別可能な値を作成するのに十分大きくて、波長に関する特性の局所的導関数の正確な見積りをもたらすのに十分に小さいことが好ましい。
【００３０】
第１導関数は通常の線形方程式を用いて、例えば、各波長における特性の測定値間の差を取って、この差を、特性を測定した波長の差で割ることによって、見積ることができる。例えば、波長ｂにおける導関数は、２つの波長ｂ及びｃにおける光学特性ｐを測定して見積ることができ、ここで、ｃ＝ｂ＋δである。好ましくは、δは少なくとも約５ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば１０ｎｍである。ｄＰ（ｂ）／ｄλ（ここでλは波長を示す）で表される、波長ｂにおいて測定された光学特性Ｐの導関数の概略値は、［Ｐ（ｃ）−Ｐ（ｂ）］／（ｃ−ｂ）で表すことができる。この手法は、波長ｂ＋δ／２（これはδが小さいときにｂに近い）における波長に関する光学特性値の第１導関数の見積値をもたらす。
【００３１】
更なる態様では、波長に関する光学特性の第２導関数情報も組織の画像化及び／又は特定組織構造の同定に用いることができる。波長に関する光学特性の第２導関数は、通常の３点技法を用いて見積ることができる。波長ｂにおける導関数は、３つの波長ａ、ｂ、及びｃ（ここでａ＝ｂ−δそしてｃ＝ｂ＋δである）における光学特性Ｐを測定することによって、見積ることができる。好ましくは、δは少なくとも約５ｎｍ、例えば約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば、約１０ｎｍである。ｄ２Ｐ（ｂ）／ｄλ２として表される、波長ｂにおけるＰの第２導関数は、［Ｐ（ａ）−２＊Ｐ（ｂ）＋Ｐ（ｃ）］／δ２として概算できる。この式は、波長ｂにおける波長に関する光学特性の第２導関数の見積をもたらす。
【００３２】
組織サンプル内の組織構造を画像化及び／又は同定するために用いられる導関数情報は、第１導関数情報、第２導関数情報、又は両者を包含できる。導関数情報は、上記のようにして、異なった波長における特定の位置で実施された光学特性の測定値から算出できる。
【００３３】
複数の波長において組織型のサンプルの光学特性を最初に測定し、次いで上記のようにして導関数情報を算出することによって、特定の組織構造又は組織型（例えば、毛嚢、腫瘍、皮脂腺等）に関するそのような導関数情報のデータベース又は表を作成することもできる。このような導関数情報をコンピューターで読み込み可能な媒体内に記憶でき、次に組織サンプル内の特定位置で得たこのような導関数情報と比較でき、サンプル内の組織型の正確な同定及び／又は画像化を促進することができる。このような導関数情報は、例えば、特性を測定する波長に関する光学特性の第１導関数及び第２導関数を包含できる。このような手法の更なる詳細を以下に記載する。
【００３４】
偏光増強反射率及び蛍光画像化に使用できる例示的なシステムの概略図は図１に示される。ＭＳ２７５回析格子単色光分光器２(Oriel Instruments, Stratfold,CT）に接続している５００ＷのＸｅ−Ａｒｃランプ１（Spectra Physics Oriel, Stratfold,CT）を光源として用いた。この光源１からの光を光誘導管３（Oriel Instruments, Stratfold,CT）を介してサンプルステージ上の組織試料１１に送達した。ホログラフィック拡散器４（１５°、Edmund Optics, Barrington, NJ）及び直線偏光フィルター５（Meadowlark Optics, Frederick, Co）を入射光の通路に導入して試料への均一直線偏光照明をもたらした。
【００３５】
無彩色ＣＣＤレンズ８（Linos Photonics Inc., Milford, MA）及び回転直線偏光フィルター６（Meadowlark Optics, Frederick, CO）を装着した CCD CoolSnap HQ カメラ９（Roper Scientific, Tucson, AZ）を、試料の共通及び交差偏光反射率画像を捕らえるために用いた。蛍光画像化のために、追加のロングパスフィルター７（660AELP, Omega Optical, Brattleboro, VT）をカメラレンズに取り付けた。ＣＣＤカメラ９を画像データを記憶、処理及び／又は表示できるように、さらに本明細書に記載されているように分光分析を実施できるように構成されているコンピュータ１０又はその他の処理配置と連動して提供されている。
【００３６】
励起及び放出偏光子の間の角度は約５５°であった。システムが提供する最大視野は３．３×２．９ｃｍであって、観察された方位分解能は２５μｍより優れていた。距離分解能は７０〜２００μｍの間で変化した。組織上への光の出力密度は０．３ｍＷ／ｃｍ２を越えなかった。照明、捕捉及び画像処理を、Metamorph 6.0 rl 画像ソフトウェア（Molecular Devices Corporation, CA）を用いて開発されたコードによってコントロールした。反射率測定は両偏光について約３秒又はそれ以内に得て、蛍光画像は約５秒又はそれ以内に得た。
【００３７】
図１に示した装置は、例えば、米国特許第７，２８９，２０５号に記載されているように、皮膚癌等の高コントラスト反射率及び蛍光偏光画像を得るために用いることができる。単色光分光器２を更に、Ｘｅ−Ａｒｃランプ１からの光を特定の波長で組織試料１１上に提供するように構成してもよい。これらの特定の波長で反射した光をＣＣＤカメラ９で検出してＣＣＤカメラ９からの信号をコンピュータ１０に提供することができる。コンピュータ１０は、本明細書に記載されている典型的なデータ及び手法を用いて、ある特定の波長で試料１１のある特定の領域から反射された光の強度を分析して、例えば組織サンプル１１のこれらの領域内の癌組織から健常な組織をうまく区別）できるように構成されていてよい。
【００３８】
残留非黒色腫皮膚癌を有する２０の新たに切除した厚い皮膚試料を、Dermatologic Surgery Unit of Massachusetts General Hospital で実施されたモース顕微鏡手術によりＩＲＢに承認されたプロトコルの下で、２０人の患者から得た。病変の特性を表１に要約している。
【００３９】
市販のＭＢ色素（メチレンブルー注射液、１％、American Regent Inc., Shirley, NY）を本技法に用いた。ＭＢ色素をダルベッコのリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、１Ｘ、ｐＨ７．４、Mediatech, Herndon, VA）を用いて０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、３７℃の温度で保持した。試料を最大２分間希釈したＭＢ色素に浸した。過剰な色素を除去するため、試料をｐＨ７．４を有する生理食塩水で軽く洗浄した。次いで、各組織試料を、皮膚面を上にして、ペトリ皿内、生理食塩水で湿らせたガーゼの上に載せ、顕微鏡スライドガラスで覆って、画像化した。全ての組織試料の画像処理は室温で実施した。
【００４０】
表皮反射率画像を、３９５ｎｍ〜７３５ｎｍの範囲で１０ｎｍごとに実験的に得られた共通及び交差偏光画像の差として算出した。組織の蛍光偏光画像を：
Ｆ＝（Ｆｃｏ−Ｆｃｒｏｓｓ）＊１００／（Ｆｃｏ＋Ｆｃｒｏｓｓ） （１）：
として算出した。ここにおいて、Ｆは蛍光偏光画像であり、Ｆｃｏ及びＦｃｒｏｓｓはそれぞれ、共通及び交差偏光蛍光エミッション画像である。画像処理はリアルタイムに行った。
【００４１】
共通偏光反射率画像を得て、画像中のそれぞれの皮膚構造についての特定波長における拡散反射率及び光学密度の値を確認するために用いた。以下の構造のスペクトル応答、例えば、光学密度及び対応する波長導関数を分析してデータベースに記憶した：癌性腫瘍、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン、及び皮下脂肪。
【００４２】
３５の共通偏光反射率光画像のスタックを、３９５ｎｍ〜７３５ｎｍ範囲の波長で、１０ｎｍ間隔で取得した。目盛り付きのグレイ基準（３９５ｎｍ〜７３５ｎｍ範囲において約３５％の反射率を有している）をカメラの視野に置いて拡散反射率の絶対的定量を促進した。それぞれの実験スペクトルを７３５ｎｍで測定した拡散反射率の値で割った。この波長はＭＢ色素の吸収バンドの外に存在するので、この正規化はバックグラウンド吸収の可能性のある影響及びスペクトル分析上の分散に対する補償をもたらす。ＢＣＣの典型的なグレイスケールでコード化した量的反射率及び蛍光偏光画像を、それぞれ図２ａ及び２ｂに示した。
【００４３】
それぞれの波長で取得したそれぞれの共通偏光反射率画像について、皮膚構造の絶対拡散反射率及び光学密度を以下の式を用いて算出した：
Ｒλ＝０．３５＊ＲλＳ／Ｒλｒｅｆ （２）、
及び
ＯＤλ＝ｌｏｇ（１／Ｒλ） （３）、
ここで、Ｒλは皮膚構造の絶対拡散反射率を示し、Ｒλｒｅｆはグレイ基準の相対拡散反射率を示し、ＲλＳは皮膚構造の相対拡散反射率を示し、そしてＯＤλは皮膚構造の光学密度を示す。それぞれは特定波長におけるものである。次いで、観察した光学密度の波長導関数を算出した。
【００４４】
スチューデント両側ｔ−検定（Satistica 6.0, StatSoft, Inc, Tulsa, OK）を用いて、選択された一連の波長について、正常皮膚構造と癌組織の間の、得られた光学密度及びそれらの波長導関数の差異の有意性を評価した。健常と癌性組織の間の光学密度及び対応する波長導関数における差を、算出した有意確率（ｐ−値）が０．０５に等しいかそれ以下である場合に、統計的に有意差があると考えた。この解析の結果を表に要約して、光学密度及びそれらの波長導関数が正常と癌性組織間で有意に差があるスペクトル領域の同定を促進した。
【００４５】
Ｅｎ ｆａｃｅ Ｈ＆Ｅ染色凍結切片を、標準的なモース顕微鏡手術法を用いて、画像化した組織ブロックから加工した。Axiophoto 顕微鏡（Carl Zeiss, Thornwood, NY）と連動しているSPOT RT 顕微鏡デジタルカメラ（Diagnostic Instruments, Inc. Sterling Heights, MI）を用いて切片の高分解能画像を得た。Ｈ＆Ｅ切片中の腫瘍境界を光学画像にアクセスしていない認定病理学者が確認した。次いで、定量的反射率（６６５ｎｍにおける）及び蛍光偏光光画像を著明な組織構造と比較した。
【００４６】
図２ｃに示されている、典型的なＨ＆Ｅ病理組織を、図２ａ及び２ｂに示されている反射率及び蛍光偏光画像とそれぞれ、比較することができる。図２ｃの腫瘍は認定病理学者によって輪郭が描かれている。腫瘍の位置、大きさ、及び形状は、図２ｃの病理組織で同定された腫瘍境界とよく相関している。図２ａ及び２ｂの光学画像に示されているＢＣＣは、図２ｃの同じ倍率で作成された病理組織と比較してより高いコントラストを示している。
【００４７】
図２ａに示されている、表面反射率画像は、ダークグレイにコード化されている最も高い光学密度部分が、腫瘍の位置に対応することを示している。しかしながら、表皮（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色実線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色実線矢印で示されている）、毛嚢（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色点線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色点線矢印で示されている）、及び皮脂腺（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色破線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色破線矢印で示されている）のある部分は相当量の色素を蓄積していて腫瘍と混同するかもしれない。
【００４８】
光学画像（図２ａ及び２ｂ）の対応する病理組織（図２ｃ）との直接定性的比較は、表皮、毛嚢及び皮脂腺は、それらの形態学的外観によって腫瘍から区別できることを示唆している。しかしながら、組織構造が腫瘍に関連しているかもしれないので、小さい癌巣を確実に検出できて反射率偏光画像に適合している時間効率の良い方法が有益だろう。図２ｂの蛍光偏光画像において、腫瘍は、サンプルの正常組織と比べて、高い蛍光偏光（グレイの明るい影で示している）を示している。毛嚢、及び皮脂腺のような、皮膚付随物はこの画像で容易に区別できない。しかしながら、蛍光偏光画像においてさえも、表皮に沿って（図２ｂにおいて白色実線矢印で示してあり、これは図２ａの同じ位置の暗いピクセルにほぼ対応する）そして毛嚢の近辺に（白色点線矢印で示してある）悪性を明示する幾つかの明るいピクセルがある。表皮に沿った明るいピクセルは図２ｂの白いバックグラウンドに対して容易に区別できないが、このような特徴は、同じ画像データを用いて作成できるカラーコード化画像において、より容易に識別することができる。
【００４９】
従って、毛嚢、皮脂腺及び表皮のような、幾つかの通常の皮膚組織構造は、組織の光学画像化に適用できる幾つかの色素を保持することができる。これらの構造の幾つかは、カラーコード化反射率画像では赤く見えて、カラーコード化蛍光画像では緑色に見える。このような組織構造の特性化における曖昧さを解決するために、反射率画像に存在するこれら皮膚構造のスペクトル応答を特性化した。
【００５０】
図２ｄは、腫瘍及びその他の構造を含有しているＭＢ色素で染色した皮膚組織の光学密度の波長依存性を示し、ここではこのような密度をサンプルの間で平均している。図２ｄの曲線は、最も右のピーク（例えば、約６８０ｎｍにおける）の上から下への順に、以下の構造に対応している：腫瘍、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン、及び皮下脂肪。
【００５１】
ＭＢ色素の濃度は腫瘍で最も高く、これはおよそ６１５ｎｍ及び６６５ｎｍのメチレンブルーの２つの吸収極大値に対応するスペクトル領域における光学密度の増大をもたらしている。毛嚢において色素の濃度はいくらか低いように見えるが、これら２つの構造（腫瘍及び毛嚢）のスペクトル応答はかなり似ている。皮脂腺のスペクトル応答は、ＭＢ色素吸収波長の範囲５７０ｎｍ〜７１０ｎｍにおけるこれら皮膚付随物の光学密度が、癌性腫瘍と比較すると非常に低いことを示唆している。
【００５２】
表皮の光学密度スペクトルにおいて、約６１５ｎｍのＭＢ色素吸収ピークは、約６６５ｎｍの第２吸収ピークよりもより明確に現れる。この特性は、癌性腫瘍組織と表皮の間の輪郭付けにおいて、前者が後者のこの２つの吸収ピーク光度と反対の相対振幅を示すので、両者の間の輪郭付けを容易にする。また、表皮と腫瘍の光学密度曲線の比較は、腫瘍がより多くの色素を蓄積して、６６５ｎｍのＭＢ吸収バンド付近で相当に高い光学密度を示すことを表示している。
【００５３】
コラーゲン及び脂肪は相当量の色素を蓄積するとは見られないので、腫瘍とより容易に区別することができる。更に、皮下脂肪のスペクトルは、他の皮膚構造と比較して、３９５ｎｍ〜５６０ｎｍの波長範囲でより高い光学密度を示す。この所見は、皮下脂肪のより高いヘモグロブリン含量と関連しているのかもしれない。
【００５４】
従って、図２ｄに示すように、検討した皮膚構造それぞれは、一部は各種皮膚構造による色素の異なった取り込みに基づいて、ＭＢ色素の吸収バンド内で異なったスペクトル応答を示す。ＭＢ色素で染色した皮膚構造のスペクトル特徴を、良性組織から癌を確実に区別するために用いることができるということを確認するために、ＢＣＣを含有している２０の新鮮な厚いサンプルから収集した癌、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン及び脂肪の光学密度を測定して統計学的に解析した。検討した皮膚構造全てについて光学密度の波長への平均依存度を図３ａ〜３ｅに示す。
【００５５】
図３ａ〜３ｅに示すデータは、ＭＢ色素の吸収バンド内で、癌組織の光学密度が他の皮膚組織より実質的により高いようであるということを示している。また、３９０ｎｍ〜４８５ｎｍの波長に対する、表皮と癌の光学密度の差が相当あると観察された（例えば、図３ｃを参照されたい）。このスペクトル領域はヘモグロビンのソーレー吸収バンドにほぼ対応している。例えば、癌組織は一般に血液を含有しているのに対して、健常な表皮は一般に無血であることが観察されている。従って、観察された光学密度の差異はある程度腫瘍と表皮の血液含量の差に基づいているのだろう。
【００５６】
ヘモグロビン含量の差及びコラーゲン及び脂肪の比較的低い色素取り込みによって、コラーゲン−腫瘍、及び脂肪−腫瘍の対の光学密度の差異は、図３ｄ及び３ｅに示すように、実質的に検討した全てのスペクトル領域にわたって有意であった。
【００５７】
癌と近接の正常皮膚組織の間には血液含量の差にかなりのばらつきがある。更に、反射率の測定は、血液の酸化によって、更には身体の病変の部位によっても影響を受けるだろう。従ってヘモグロブリン吸収のスペクトル領域において確認された差異は、組織識別に対する一般的な信頼できる基礎をもたらせない。本明細書に提示されている組織構造光学密度のスペクトル解析は、毛嚢の可能性を除いて（図３ｂを参照されたい）、検討した各種組織構造について、６１５ｎｍ〜７００ｎｍの波長に対する腫瘍と健常皮膚構造の間の光学密度の差異が有意であったことを示している。（図３ａ、３ｃ、３ｄ及び３ｅを参照されたい）。従って、光学画像解析に関するスペクトル変動の更なる解析は、６００ｎｍ〜７３５ｎｍのスペクトル領域に焦点を合わせることができる。
【００５８】
腫瘍と毛嚢の間の確実な分光学的区別を達成することについての課題に対処するために、癌及び正常組織について光学密度の波長導関数を算出して解析した。例えば、メチレンブルー色素は、局所の生物化学環境に応じて、異なった吸収特性を示すことが観察されている。従って、ＭＢで染色した癌と毛嚢の光学密度曲線の勾配において観察された僅かな偏差はこれら２つの構造の生物化学環境における差異によって引き起こされたのかもしれない。再現可能なら、このような偏差は、癌の周辺健常組織からの明確な区別を促進するために用いることができる。
【００５９】
波長に対する異なった組織の光学特性の導関数は、好ましくは５ｎｍ以上離れて大きい波長で実施した測定値に基づいて算出できる。一般に、５ｎｍ未満異なっている２つの波長における組織の光学特性に有意な或いは課題解決を容易にするような変化は見られないだろう。具体的には、組織の光学特性に関する導関数情報は、少なくとも約５ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば約１０ｎｍ異なっている２つ又はそれ以上の波長における光学特性を測定して得ることができる。このような導関数情報を確認するために用いられる波長は、このような導関数を算出するときに、波長依存性光学特性における局所最大値又は最小値を越えることを避けるために、約３０ｎｍ未満異なっていることが好ましい。このような導関数を算出するための本明細書に記載されている実施例で用いられている約１０ｎｍの典型的な波長差は、光学特性変化の解明と局所波長依存性導関数の正確な概算の間の良好な妥協をもたらす。
【００６０】
腫瘍組織と比較した各種健常組織構造に関する光学密度の波長導関数についての得られた依存性を図４ａ〜４ｅに示した。正常（健常）組織構造と癌組織との対の光学密度及び対応する波長導関数の間の差異の有意性を評価するために、非対の両側ｔ−検定を用いた。癌組織とその他の正常皮膚型組織の間の相違領域をより良く確認するためには、標準的なＡＮＯＶＡ分析で開始するよりむしろ、対のｔ−検定を利用した。従って、単独の健常皮膚型組織を個々に癌組織サンプルに対して試験した。
【００６１】
比較試験の結果を表２に要約している。これらのデータは、毛嚢を除いて（図４ｂに示してある）、全ての癌−正常組織の対の、ＭＢ色素の吸収最大値の１つに対応する、６６５ｎｍの波長における光学密度に統計的な有意差があることを示している。癌と毛嚢の間の光学密度の波長導関数における最も大きな統計学的に有意な差が６１５ｎｍ、７０５ｎｍ、及び７３５ｎｍ（ここで６１５ｎｍはＭＢ色素の別の局所吸収最大値にほぼ対応している）の波長で観察された（図４ｂを参照されたい）。
【００６２】
光学密度の波長導関数の差が、試験した全ての癌−正常組織の対において７０５ｎｍで有意に観察された。従って、癌及び正常皮膚組織の明確な区別に適している特定のスペクトル領域が、反射率画像のスペクトル解析を用いて確認された。これらの波長領域は、ＭＢ色素の局所最大値にほぼ対応している、６１５ｎｍ及び６６５ｎｍの波長を包含している。
【００６３】
従って、組織画像のスペクトル解析を、画像収集手法を著しく変更せず、或いは手法を実施するために必要な時間及び複雑さを増大せずに、癌検出手法に組み込むことができる。例えば、図１に示す典型的な装置を、本明細書に記載されている画像収集及び分析手法の実施に適合することができる。単色光分光器２を、癌及び正常組織の間の光学密度の波長導関数に有意な差が見出された本明細書に記載の１つ又はそれ以上の特定波長で光をＸｅ−Ａｒｃランプ１から提供するように構成することができる。コンピュータ１０を、特定の試料１１から反射するこの光の強度を解析してＣＣＤカメラ９によってこれらの波長で検出するように設定することができる。これらの波長における画像の領域の光学密度を本明細書で提供されるデータと比較することは、組織サンプル１１のこれらの領域における健常組織と癌組織の間のより正確な区別を促進できる。
【００６４】
全可視スペクトル領域に関する画像中の各ピクセルの完全な分光分析を実施することは可能であるが、この包括的なアプローチは本明細書に記載されている組織同定分析を実施するための最適な又は望ましいアプローチではないだろう。例えば、１１００×１３００ピクセルを含有している画像についてのわずか１０の波長の分析には、極めて長い時間を必要とし、このアプローチを手術中の使用に不適切なものとしている。更に、反射率及び蛍光偏光画像は一般に、組織画像における大部分のピクセルについて十分正確な情報をもたらすので、そのような詳細なアプローチはかなり冗長となるであろう。それに対して、ＲＦＰＩ技術と、手術中に画像を精査している外科医にとって疑わしいと思われる画像の領域（例えば、数本又はそれ以上のピクセル）の２波長スペクトル分析との組み合わせは、臨床診療に適しているより現実的なアプローチを提供するだろう。
【００６５】
従って、癌性組織及び健常組織構造の両方につぃての光学密度及び対応する波長依存性導関数の解析は、ＲＦＰＩ手法を実施する場合に、非黒色腫皮膚癌のより正確な輪郭付けを容易にできる。ＭＢ色素の吸収バンドに対応しているスペクトル領域を、癌組織、例えばＢＣＣの正確な区別化のために用いることができる。本明細書に記載されている腫瘍輪郭付け技術は、例えば、複数の波長での画像化を包含する。例えば、２つの監視波長、例えば、約６１５ｎｍ及び約６６５ｎｍにおける分光分析は、ある特定の正常皮膚構造の観察される光学密度及び対応する波長依存性導関数がこれら波長における癌組織のそれとは有意に異なっているので、このような区別化を有意に改善する。従って、本発明の実施態様は、リアルタイムで正確な癌の輪郭付けを容易にする、反射率及び蛍光偏光画像とこのようなスペクトル分析を組み合わせる方法及び装置を提供する。このような輪郭付けは、例えば、手術前、手術中、及び／又は手術後に実施でき、インビボ又はエクスビボでも実施できる。
【００６６】
特定組織の分析に用いる波長は、様々な基準に基づいて選択できる。例えば、サンプル中に血液が存在しているならば、血液により強く吸収される４１０ｎｍ又はその近くの波長を使用して、血液吸収の影響を評価及び／又は除去を促進すること、及び／又はスペクトル分析手法において血液と色素の影響を区別することができる。約１１００ｎｍ〜約１３００ｎｍの参照波長も、例えば、組織構造のある特定の型を区別するために用いることができる。散乱効果を優先するように、この波長領域内にあまり強くない吸収体が存在してもよい。一方、約１４００ｎｍの波長付近で水の吸収が比較的強いので、この波長領域は散乱効果を試験するためには望ましくない。
【００６７】
前述は発明の本質を説明したにすぎない。記載された実施態様に対する多くの修正及び変更は、本明細書の教示を考慮すると当業者に明らかであろう。従って、当然のことながら、当業者は、本明細書に明確に記載されていないが、本発明の本質の具体化であって従って本発明の精神及び範囲の内である多くの方法を見出すことができるだろう。本明細書で引用されている全ての特許及び刊行物は、参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年４月１４日に出願した米国仮特許出願第６１／１６９，２５８号の優先権を主張し、その開示は、参照により、その全てが本明細書に取り込まれている。
【０００２】
（技術分野）
２つ又はそれ以上の特定波長における、異なった組織型による色素の吸収特性及び／又はその他の光学的相互作用を比較することによって、組織サンプル中の癌組織又は生体組織のその他の特定な型の正確な輪郭付けを容易にする方法及び装置を特徴としている。この方法及び装置は、とりわけ、手術中リアルタイムに、非黒色腫皮膚癌（例えば、基底細胞癌）の輪郭又は境界を提供するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
非黒色腫皮膚癌はヒトの癌の非常に一般的な形態である。統計的に、白人の約４人に１人が彼らの生涯の内に少なくとも１つの病班を発症することになる。基底細胞癌（ＢＣＣ）は総非黒色腫癌の約８０％を構成し、そしてその発生率はめざましく増大している。これらは、一般に、頭及び頸のような体の日光露出部上に現れるので、これらの腫瘍の周りの正常な皮膚を保護する必要がある。ＢＣＣは外観を損なうが殆ど死に至らない（例えば、これらは年に約３０００人の死因となる）。しかしながら、その有病率により、これらの治療費は１年当たり６億ドルを超えている。
【０００４】
ＢＣＣは通常手術によって治療される。これらの腫瘍はよく顔に発症してめったに転移しないので、それを切除する際にはできるだけ多くの健常組織を保護することが重要である。しかしながら、多くの場合、病変部の明暗差は乏しく、そしてこれらの腫瘍は明確な境界を有しておらず、これは目視的な腫瘍局在診断及び正確な切除を困難にしている。
【０００５】
モース顕微鏡手術（ＭＭＳ）は、手術中に切除縁部を完全にコントロールできる臨床技術である。この技術は、切除する病変部の詳細なマッピング及び顕微鏡的コントロールを用い、裸眼では見えない腫瘍に関わっている手術切除縁の領域を正確に示すことができる。正確で精密であるが、ＭＭＳは時間がかかり、そして通常皮膚病理学の訓練を積んでいる外科医、専用の実験室及び凍結切片を調製して評価する技術者を必要とする、人材集約的な手法である。これらの欠点のために、ＭＭＳは少数の症例でしか用いられていない。従って、手術中の縁部コントロール問題に取り組むために、新規な技術及び治療手順を導入しなければならない。
【０００６】
光学的画像法の最近の進歩が、完全なＢＢＣ腫瘍境界の、精密でリアルタイムで費用効率が高い手術中検査を技術的に可能にしている。しかしながら、これらの技術は、一般に臨床の場における実用的用途に必要な要素の１つ又はそれ以上が不足している。インビボでの使用に適しているＦＤＡに承認されている造影剤又は色素、例えばメチレンブルー（ＭＢ）は病変部によく適用されているが、正常組織及び病的組織由来の光信号の本質的な相違が希薄であることが多い。ＭＢは、膀胱の新生腫瘍、膵臓の腫瘍、及びバレット食道異形性を大まかに境界付けるために成功裏に適用されている。ＭＢ色素は、正常細胞と比べると、癌細胞のミトコンドリアに非常に多く蓄積される傾向があるが、１００％特異的ではない。毛嚢、皮脂腺及び表皮のような、健常な皮膚組織構造も幾つかの色素を保持できる。しかしながら、これらの組織の外観及び色素濃度は、癌のそれとはかなり異なっている。
【０００７】
色素によって強化された反射率及び蛍光偏光画像化（ＲＦＰＩ）を包含する、幾つかの補完的技術は、９４％を越える成功率でリアルタイムの高コントラスト画像を提供できる。このような技術は、例えば、米国特許第７，２８９，２０５号に記載されている。しかしながら、このような技術は癌組織と、類似の光学密度を示す、ある特定の組織、例えば、毛嚢等を明確に区別できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、上記の欠陥を考慮して、単純で、より正確で、そして／又は時間効率のよい方法は腫瘍の境界をマッピングするために、そして腫瘍組織と健常組織の識別を向上させるために好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の必要性を満たすこと、及び特に上で検討した欠陥並びに通常の当該技術分野における欠陥に対処することに関している。
本発明の実施態様は、健常組織構造及びその他の組織構造（例えば、ＢＣＣのような癌組織）の両方を含有する組織サンプル内の複数の地点における、ある特定の波長に依存する光学特性、及び随意に、そのような光学特性の対応する波長導関数(derivative)の分析を包含する方法及び装置を提供する。光学特性は、造影剤、例えば、メチレンブルー（ＭＢ）のような色素で処理されている組織の局所的な反射率及び光学密度を包含できる。各波長における偏光情報も用いることができる。このような方法及び装置は、例えば、色素で増強した反射率及び／又は蛍光偏光画像化方法と組合せて用いたときに、非黒色腫皮膚癌領域の輪郭付けを容易にすることができる。
【００１０】
本発明の一実施態様では、本発明は、２つ又はそれ以上の特定波長において、色素のような造影剤で処理した組織領域又はサンプルを画像化することを包含する、腫瘍境界付け技術を提供する。画像化用の光は、単色光源によって、又は広帯域光源及び２つ又はそれ以上の単色フィルター（偏光フィルターであってもよい）によって提供できる。
異なった組織構造、例えば、各種の健常皮膚構造及び癌組織に関連する局所的な光学密度、反射率、又はその他の光学特性は、そのような特性の値がある特定の組織型又は構造に関して類似している場合であっても、異なった構造に対する波長に関しては異なった変化率を示しうる。従って、この技術を用いる組織の画像分析のための方法及び装置は、周囲の健常組織から、癌組織のような構造をより正確に区別するのに十分である、たった２つの監視波長で迅速な分光分析を提供することができる。
従って、本発明の実施態様は、癌組織又はその他の組織構造の手術中のリアルタイムで正確な同定及び輪郭付けを容易にする方法及び装置を提供することができる。
【００１１】
本発明の別の実施態様では、このような光学特性の波長依存導関数を確認して、組織領域を画像化するために及び／又は組織内の異なった組織を区別するために用いることができる。このような導関数は、少なくとも５ｎｍ異なっている波長、例えば、約５ｎｍ〜３０ｎｍ、又は約１０ｎｍ〜２０ｎｍ異なっている波長で得た測定値に基づいて見積ることが好ましい。
【００１２】
更なる実施態様では、インビボ画像を実施する場合は、造影剤はメチレンブルーであってよい。この造影剤で用いられる少なくとも１つの波長は、約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍが好ましい。例えば、約６１５ｎｍ及び／又は６６５ｎｍの波長を用いることができる。これらの波長はメチレンブルーの吸収極大に一致するので、異なった組織型の同定及び／又は輪郭付けを容易にする大きい信号を提供できるからである。エクスビボで組織を画像化する場合は、トルイジンブルーのような造影剤を用いることができる。
【００１３】
本発明の更なる実施態様では、試験する組織に基づいて別の波長を用いることができる。例えば、画像化又は区別すべき組織の血液含量のレベルが有意に異なっているならば、約４１０ｎｍに近い波長を用いることができる。画像が主に散乱挙動に基づいていることが望ましいならば、約１１００ｎｍ〜約１３００ｎｍの波長も用いることができる。
【００１４】
また本発明の更なる実施態様では、蛍光偏光及び／又は反射率偏光情報を、２つ又はそれ以上の波長で、組織領域内の複数の地点で得ることができる。このような情報も、組織領域内の異なった組織構造及び型を画像化及び／又は輪郭付けるために用いることができる。
【００１５】
本発明の更に別の実施態様では、組織領域内の２つ又はそれ以上の波長で測定された光学特性を、各種組織型に関するそのような特性の既定波長依存値と比較することができる。１つ以上の波長における局所的光学特性のこのような比較は、単一波長で得られた光学特性の測定値と比較して、組織型のより正確な同定及び輪郭付けをもたらすことができる。組織サンプルで検出又は測定された値と比較するために用いられるこのような既定光学特性は、波長に関する測定された光学特性の導関数も包含する。
【００１６】
本発明の別の実施態様では、少なくとも２つの異なった波長を有する光で組織サンプルを照射するように作られている光源、それぞれの波長で組織サンプルから送られた光を検出するように作られている１つ又はそれ以上の検出器、及び本明細書に記載されているような組織サンプル中の異なった組織型又は構造を画像化、同定及び／又は輪郭付けるように作られているアナライザーを包含している装置が提供される。装置は、偏光特性を組織サンプルの画像化のために用いる場合は、偏光フィルターを包含していてもよい。
【００１７】
本発明に従って提供される方法、システム及び装置は、非黒色腫皮膚癌の境界をリアルタイムに手術中に画像化及び輪郭付けるために、腫瘍切除術を加速するために、そして実施できる外科手術の数を増やすために特に有用である。例えば、本発明の実施態様を実際の腫瘍切除手術を誘導するために用いることができる。このような改善は、スペクトル解析をＲＦＰＩ手法及びリアルタイム腫瘍輪郭付け手法を容易にするシステムに組み込むことによってもたらされる。
【００１８】
本発明のこれらの及び別の目的、特徴及び利益は、図面を同時に用いて以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
【００１９】
本発明に関わる当業者が、如何にこれを作成してこれを使用するかをより容易に理解するために、言及は図面を有すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、反射率及び蛍光偏光画像化を実施できるように作られている例示的な装置の略図である。
【図２】図２ａは、基底細胞癌を含有している１６×７ｍｍの頭皮組織試料画像の６６５ｎｍにおける例示的なグレイスケール表面反射率画像である。 図２ｂは、図２ａに示されている組織試料の６１５ｎｍで励起して、及び６６０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲で記録した蛍光偏光画像である。 図２ｃは、有資格病理学者によって腫瘍境界が描かれている、図２ａに示されている組織試料のＨ＆Ｅ凍結組織構造の画像である。 図２ｄは、癌組織及び健常組織構造について得た平均化した光学密度スペクトルのグラフである。
【図３】図３ａ〜３ｅは、ＢＣＣ−健常組織構造の対についての、２０以上のサンプルを平均した、光学密度スペクトルのプロットである。（ａ）ＢＣＣと皮脂腺、（ｂ）ＢＣＣと毛嚢、（ｃ）ＢＢＣと表皮、（ｄ）ＢＢＣとコラーゲン、そして（ｅ）ＢＢＣと皮下脂肪。
【図４】図４ａ〜４ｅは、ＢＣＣ−健常組織構造の対についての、２０以上のサンプルを平均した、波長依存的光学密度導関数のプロットである。（ａ）ＢＣＣと皮脂腺、（ｂ）ＢＣＣと毛嚢、（ｃ）ＢＢＣと表皮、（ｄ）ＢＢＣとコラーゲン、そして（ｅ）ＢＢＣと皮下脂肪。
【００２１】
ここで本発明を図面を参照して詳細に記載するが、これは説明的な実施態様に関連するものであって、図に例示している特定の実施態様によって限定されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
生物造影剤、例えば、ＭＢのような染色剤又は色素を、異なった型の組織内に別々に分布させることができる。色素分布のこのような変化は、局所的な色素濃度の違いに部分的に依存している、スペクトル吸収及びその他の光学特性の変化をもたらす。その他の因子も、組織中の血液／ヘモグロビン又はその他の光吸収物質の局所濃度のような、観察される光学特性に影響を及ぼす。従来の組織同定技術では、広帯域光源又は単一波長を用いて測定された染色組織の光学特性を比較して、色素分布の変化に基づく組織型の相違を同定できる。しかしながら、ある特定の区別しうる組織型が、このような測定で類似の光学特性を示すかもしれず、これはサンプル中の組織型の同定又は区別化に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００２３】
２つ又はそれ以上の波長におけるある特定の光学特性を、組織サンプルの領域内の複数の位置で測定できる。それぞれの波長における特性の差異を、領域内の異なった位置におけるそのような特性の差異と共に、比較又は分析できて、組織領域の画像化及びサンプル内の組織型のより正確且つ／又は信頼性のある同定を提供するために用いることができる。
【００２４】
測定された光学特性は、例えば、組織サンプルの領域の反射率（例えば、絶対反射率スペクトル）、光学密度、等、又はこれらの組み合わせを包含できる。特定の光学特性を、試験する組織に基づいて選択することができる。例えば、反射率は直接測定できるが、反射率の値は通常、サンプルの厚さに部分的に依存する。対照的に、光学密度は組織の固有の特性であるが、その測定は組織自体に関するある特定の前提に基づいている。光の多種偏光、非偏光、又はこれらの組み合わせを本明細書に記載のような組織型の輪郭付けを容易にするために用いることができる。光学分析に用いる画像の型を、例えば、非偏光、又は共通偏光強度（Ｉｃｏ）及び交差偏光強度（Ｉｃｒｏｓｓ）の各種組み合わせを基にすることができる。このような組み合わせは、信号差（例えば、Ｉｃｏ−Ｉｃｒｏｓｓ）、比（例えば、Ｉｃｏ／Ｉｃｒｏｓｓ）、相対的差（例えば、（Ｉｃｏ−Ｉｃｒｏｓｓ）／（Ｉｃｏ＋Ｉｃｒｏｓｓ））等に基づくスペクトルデータを包含できる。典型的な適用において、交差偏光に基づく信号を用いると深部組織の輪郭付けが改善されるのに対して、共通偏光及び交差偏光強度の間の差を用いるとより表面の組織がより良く輪郭付けられる。
【００２５】
多種の色素又は染色剤を用いることができる。メチレンブルー（ＭＢ）は、インビボでもエクスビボの組織サンプルでも用いることができる、ＦＤＡに承認された染色剤である。その他の色素も、特にエクスビボの組織分析のために用いることができる。例えば、トルイジンブルー（ＴＢ）は、本明細書に記載されている分析のためにエクスビボの組織サンプルを染色するために用いることができる。ＴＢは吸収スペクトルをＭＢと比べてスペクトルの黄色領域の方向にシフトさせることができ、これは一般に血液の吸収領域により近い。従って、血液を大量には含有していない組織の分析に好ましい。
【００２６】
組織サンプルのある特定の領域の光学特性は、本明細書に記載のように、２つ又はそれ以上の波長で測定することができる。用いられる波長のうちの１つは、色素吸収スペクトル内の極大値又はピーク値、或いはその近くでよい。例えば、ＭＢ色素を用いる場合は、波長の一方は、ＭＢについての吸収極大値にほぼ対応する、６１５ｎｍ又は６６５ｎｍ或いはその近くでよい。一般に、そのような最大値の近辺（例えば、ＭＢに対して、約６００ｎｍと約６８５〜７００ｎｍの間）の波長が、差別化を促進する、より大きな信号及び対応する信号間の大きな差をもたらすので、好ましい。その他の色素を用いる場合は、特定の色素に対応する吸収ピーク値又はその近くの異なった波長を用いることができる。吸収最大値に近い少なくとも１つの波長の使用は測定する強度に対してより大きな信号を提供でき、これはサンプル内の異なった組織型及び領域に対するそのような信号間の区別化を促進できる。
【００２７】
光学特性（例えば、吸収強度）はこれらの波長で又はその近辺でも得られる。従って、異なった組織領域に対して、単一の波長における吸収強度（又は広帯域光源由来の単一波長分布）を単に比較するよりむしろ、２つ又はそれ以上の波長における相対的な吸収動態を比較できる。異なった波長における組織の色素との相対的光学相互作用のこのような分析は、サンプルの異なった組織領域内の組織型の間のより詳細且つ／又は正確な差別化をもたらすことができる。
【００２８】
本明細書に記載されているような波長依存的光学特性の導関数の分析も、サンプル領域内の組織型の輪郭付けを提供するか或いは改善することができる。例えば、波長に関連するある特定の光学特性の値についての導関数を、特定の波長で見積ることができる。このような特性導関数は、異なった組織型に対してそのような光学特性の絶対値が同一又類似していても、組織型又は領域間の差別化をもたらすことができる。
【００２９】
光学特性に対する波長導関数情報は、通常の数学的技法を用いて算出できる。例えば、本明細書に記載されているような特定の光学特性は、組織サンプル内の特定位置において、２つの異なった波長で測定できる。導関数情報を見積るために用いられる波長間の差は約５ｎｍより大きいこと、例えば約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば１０ｎｍであることが好ましい。本明細書に記載されているような導関数情報を算出するために用いられる波長の差は、異なった波長で測定される光学特性の区別可能な値を作成するのに十分大きくて、波長に関する特性の局所的導関数の正確な見積りをもたらすのに十分に小さいことが好ましい。
【００３０】
第１導関数は通常の線形方程式を用いて、例えば、各波長における特性の測定値間の差を取って、この差を、特性を測定した波長の差で割ることによって、見積ることができる。例えば、波長ｂにおける導関数は、２つの波長ｂ及びｃにおける光学特性ｐを測定して見積ることができ、ここで、ｃ＝ｂ＋δである。好ましくは、δは少なくとも約５ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば１０ｎｍである。ｄＰ（ｂ）／ｄλ（ここでλは波長を示す）で表される、波長ｂにおいて測定された光学特性Ｐの導関数の概略値は、［Ｐ（ｃ）−Ｐ（ｂ）］／（ｃ−ｂ）で表すことができる。この手法は、波長ｂ＋δ／２（これはδが小さいときにｂに近い）における波長に関する光学特性値の第１導関数の見積値をもたらす。
【００３１】
更なる態様では、波長に関する光学特性の第２導関数情報も組織の画像化及び／又は特定組織構造の同定に用いることができる。波長に関する光学特性の第２導関数は、通常の３点技法を用いて見積ることができる。波長ｂにおける導関数は、３つの波長ａ、ｂ、及びｃ（ここでａ＝ｂ−δそしてｃ＝ｂ＋δである）における光学特性Ｐを測定することによって、見積ることができる。好ましくは、δは少なくとも約５ｎｍ、例えば約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば、約１０ｎｍである。ｄ２Ｐ（ｂ）／ｄλ２として表される、波長ｂにおけるＰの第２導関数は、［Ｐ（ａ）−２＊Ｐ（ｂ）＋Ｐ（ｃ）］／δ２として概算できる。この式は、波長ｂにおける波長に関する光学特性の第２導関数の見積をもたらす。
【００３２】
組織サンプル内の組織構造を画像化及び／又は同定するために用いられる導関数情報は、第１導関数情報、第２導関数情報、又は両者を包含できる。導関数情報は、上記のようにして、異なった波長における特定の位置で実施された光学特性の測定値から算出できる。
【００３３】
複数の波長において組織型のサンプルの光学特性を最初に測定し、次いで上記のようにして導関数情報を算出することによって、特定の組織構造又は組織型（例えば、毛嚢、腫瘍、皮脂腺等）に関するそのような導関数情報のデータベース又は表を作成することもできる。このような導関数情報をコンピューターで読み込み可能な媒体内に記憶でき、次に組織サンプル内の特定位置で得たこのような導関数情報と比較でき、サンプル内の組織型の正確な同定及び／又は画像化を促進することができる。このような導関数情報は、例えば、特性を測定する波長に関する光学特性の第１導関数及び第２導関数を包含できる。このような手法の更なる詳細を以下に記載する。
【００３４】
偏光増強反射率及び蛍光画像化に使用できる例示的なシステムの概略図は図１に示される。ＭＳ２７５回析格子単色光分光器２(Oriel Instruments, Stratfold,CT）に接続している５００ＷのＸｅ−Ａｒｃランプ１（Spectra Physics Oriel, Stratfold,CT）を光源として用いた。この光源１からの光を光誘導管３（Oriel Instruments, Stratfold,CT）を介してサンプルステージ上の組織試料１１に送達した。ホログラフィック拡散器４（１５°、Edmund Optics, Barrington, NJ）及び直線偏光フィルター５（Meadowlark Optics, Frederick, Co）を入射光の通路に導入して試料への均一直線偏光照明をもたらした。
【００３５】
無彩色ＣＣＤレンズ８（Linos Photonics Inc., Milford, MA）及び回転直線偏光フィルター６（Meadowlark Optics, Frederick, CO）を装着した CCD CoolSnap HQ カメラ９（Roper Scientific, Tucson, AZ）を、試料の共通及び交差偏光反射率画像を捕らえるために用いた。蛍光画像化のために、追加のロングパスフィルター７（660AELP, Omega Optical, Brattleboro, VT）をカメラレンズに取り付けた。ＣＣＤカメラ９を画像データを記憶、処理及び／又は表示できるように、さらに本明細書に記載されているように分光分析を実施できるように構成されているコンピュータ１０又はその他の処理配置と連動して提供されている。
【００３６】
励起及び放出偏光子の間の角度は約５５°であった。システムが提供する最大視野は３．３×２．９ｃｍであって、観察された方位分解能は２５μｍより優れていた。距離分解能は７０〜２００μｍの間で変化した。組織上への光の出力密度は０．３ｍＷ／ｃｍ２を越えなかった。照明、捕捉及び画像処理を、Metamorph 6.0 rl 画像ソフトウェア（Molecular Devices Corporation, CA）を用いて開発されたコードによってコントロールした。反射率測定は両偏光について約３秒又はそれ以内に得て、蛍光画像は約５秒又はそれ以内に得た。
【００３７】
図１に示した装置は、例えば、米国特許第７，２８９，２０５号に記載されているように、皮膚癌等の高コントラスト反射率及び蛍光偏光画像を得るために用いることができる。単色光分光器２を更に、Ｘｅ−Ａｒｃランプ１からの光を特定の波長で組織試料１１上に提供するように構成してもよい。これらの特定の波長で反射した光をＣＣＤカメラ９で検出してＣＣＤカメラ９からの信号をコンピュータ１０に提供することができる。コンピュータ１０は、本明細書に記載されている典型的なデータ及び手法を用いて、ある特定の波長で試料１１のある特定の領域から反射された光の強度を分析して、例えば組織サンプル１１のこれらの領域内の癌組織から健常な組織をうまく区別）できるように構成されていてよい。
【００３８】
残留非黒色腫皮膚癌を有する２０の新たに切除した厚い皮膚試料を、Dermatologic Surgery Unit of Massachusetts General Hospital で実施されたモース顕微鏡手術によりＩＲＢに承認されたプロトコルの下で、２０人の患者から得た。病変の特性を表１に要約している。
【００３９】
市販のＭＢ色素（メチレンブルー注射液、１％、American Regent Inc., Shirley, NY）を本技法に用いた。ＭＢ色素をダルベッコのリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、１Ｘ、ｐＨ７．４、Mediatech, Herndon, VA）を用いて０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、３７℃の温度で保持した。試料を最大２分間希釈したＭＢ色素に浸した。過剰な色素を除去するため、試料をｐＨ７．４を有する生理食塩水で軽く洗浄した。次いで、各組織試料を、皮膚面を上にして、ペトリ皿内、生理食塩水で湿らせたガーゼの上に載せ、顕微鏡スライドガラスで覆って、画像化した。全ての組織試料の画像処理は室温で実施した。
【００４０】
表皮反射率画像を、３９５ｎｍ〜７３５ｎｍの範囲で１０ｎｍごとに実験的に得られた共通及び交差偏光画像の差として算出した。組織の蛍光偏光画像を：
Ｆ＝（Ｆｃｏ−Ｆｃｒｏｓｓ）＊１００／（Ｆｃｏ＋Ｆｃｒｏｓｓ） （１）：
として算出した。ここにおいて、Ｆは蛍光偏光画像であり、Ｆｃｏ及びＦｃｒｏｓｓはそれぞれ、共通及び交差偏光蛍光エミッション画像である。画像処理はリアルタイムに行った。
【００４１】
共通偏光反射率画像を得て、画像中のそれぞれの皮膚構造についての特定波長における拡散反射率及び光学密度の値を確認するために用いた。以下の構造のスペクトル応答、例えば、光学密度及び対応する波長導関数を分析してデータベースに記憶した：癌性腫瘍、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン、及び皮下脂肪。
【００４２】
３５の共通偏光反射率光画像のスタックを、３９５ｎｍ〜７３５ｎｍ範囲の波長で、１０ｎｍ間隔で取得した。目盛り付きのグレイ基準（３９５ｎｍ〜７３５ｎｍ範囲において約３５％の反射率を有している）をカメラの視野に置いて拡散反射率の絶対的定量を促進した。それぞれの実験スペクトルを７３５ｎｍで測定した拡散反射率の値で割った。この波長はＭＢ色素の吸収バンドの外に存在するので、この正規化はバックグラウンド吸収の可能性のある影響及びスペクトル分析上の分散に対する補償をもたらす。ＢＣＣの典型的なグレイスケールでコード化した量的反射率及び蛍光偏光画像を、それぞれ図２ａ及び２ｂに示した。
【００４３】
それぞれの波長で取得したそれぞれの共通偏光反射率画像について、皮膚構造の絶対拡散反射率及び光学密度を以下の式を用いて算出した：
Ｒλ＝０．３５＊ＲλＳ／Ｒλｒｅｆ （２）、
及び
ＯＤλ＝ｌｏｇ（１／Ｒλ） （３）、
ここで、Ｒλは皮膚構造の絶対拡散反射率を示し、Ｒλｒｅｆはグレイ基準の相対拡散反射率を示し、ＲλＳは皮膚構造の相対拡散反射率を示し、そしてＯＤλは皮膚構造の光学密度を示す。それぞれは特定波長におけるものである。次いで、観察した光学密度の波長導関数を算出した。
【００４４】
スチューデント両側ｔ−検定（Satistica 6.0, StatSoft, Inc, Tulsa, OK）を用いて、選択された一連の波長について、正常皮膚構造と癌組織の間の、得られた光学密度及びそれらの波長導関数の差異の有意性を評価した。健常と癌性組織の間の光学密度及び対応する波長導関数における差を、算出した有意確率（ｐ−値）が０．０５に等しいかそれ以下である場合に、統計的に有意差があると考えた。この解析の結果を表に要約して、光学密度及びそれらの波長導関数が正常と癌性組織間で有意に差があるスペクトル領域の同定を促進した。
【００４５】
Ｅｎ ｆａｃｅ Ｈ＆Ｅ染色凍結切片を、標準的なモース顕微鏡手術法を用いて、画像化した組織ブロックから加工した。Axiophoto 顕微鏡（Carl Zeiss, Thornwood, NY）と連動しているSPOT RT 顕微鏡デジタルカメラ（Diagnostic Instruments, Inc. Sterling Heights, MI）を用いて切片の高分解能画像を得た。Ｈ＆Ｅ切片中の腫瘍境界を光学画像にアクセスしていない認定病理学者が確認した。次いで、定量的反射率（６６５ｎｍにおける）及び蛍光偏光光画像を著明な組織構造と比較した。
【００４６】
図２ｃに示されている、典型的なＨ＆Ｅ病理組織を、図２ａ及び２ｂに示されている反射率及び蛍光偏光画像とそれぞれ、比較することができる。図２ｃの腫瘍は認定病理学者によって輪郭が描かれている。腫瘍の位置、大きさ、及び形状は、図２ｃの病理組織で同定された腫瘍境界とよく相関している。図２ａ及び２ｂの光学画像に示されているＢＣＣは、図２ｃの同じ倍率で作成された病理組織と比較してより高いコントラストを示している。
【００４７】
図２ａに示されている、表面反射率画像は、ダークグレイにコード化されている最も高い光学密度部分が、腫瘍の位置に対応することを示している。しかしながら、表皮（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色実線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色実線矢印で示されている）、毛嚢（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色点線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色点線矢印で示されている）、及び皮脂腺（図２ａ及び２ｂの光学画像では白色破線矢印で、図２ｃの病理組織画像では黒色破線矢印で示されている）のある部分は相当量の色素を蓄積していて腫瘍と混同するかもしれない。
【００４８】
光学画像（図２ａ及び２ｂ）の対応する病理組織（図２ｃ）との直接定性的比較は、表皮、毛嚢及び皮脂腺は、それらの形態学的外観によって腫瘍から区別できることを示唆している。しかしながら、組織構造が腫瘍に関連しているかもしれないので、小さい癌巣を確実に検出できて反射率偏光画像に適合している時間効率の良い方法が有益だろう。図２ｂの蛍光偏光画像において、腫瘍は、サンプルの正常組織と比べて、高い蛍光偏光（グレイの明るい影で示している）を示している。毛嚢、及び皮脂腺のような、皮膚付随物はこの画像で容易に区別できない。しかしながら、蛍光偏光画像においてさえも、表皮に沿って（図２ｂにおいて白色実線矢印で示してあり、これは図２ａの同じ位置の暗いピクセルにほぼ対応する）そして毛嚢の近辺に（白色点線矢印で示してある）悪性を明示する幾つかの明るいピクセルがある。表皮に沿った明るいピクセルは図２ｂの白いバックグラウンドに対して容易に区別できないが、このような特徴は、同じ画像データを用いて作成できるカラーコード化画像において、より容易に識別することができる。
【００４９】
従って、毛嚢、皮脂腺及び表皮のような、幾つかの通常の皮膚組織構造は、組織の光学画像化に適用できる幾つかの色素を保持することができる。これらの構造の幾つかは、カラーコード化反射率画像では赤く見えて、カラーコード化蛍光画像では緑色に見える。このような組織構造の特性化における曖昧さを解決するために、反射率画像に存在するこれら皮膚構造のスペクトル応答を特性化した。
【００５０】
図２ｄは、腫瘍及びその他の構造を含有しているＭＢ色素で染色した皮膚組織の光学密度の波長依存性を示し、ここではこのような密度をサンプルの間で平均している。図２ｄの曲線は、最も右のピーク（例えば、約６８０ｎｍにおける）の上から下への順に、以下の構造に対応している：腫瘍、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン、及び皮下脂肪。
【００５１】
ＭＢ色素の濃度は腫瘍で最も高く、これはおよそ６１５ｎｍ及び６６５ｎｍのメチレンブルーの２つの吸収極大値に対応するスペクトル領域における光学密度の増大をもたらしている。毛嚢において色素の濃度はいくらか低いように見えるが、これら２つの構造（腫瘍及び毛嚢）のスペクトル応答はかなり似ている。皮脂腺のスペクトル応答は、ＭＢ色素吸収波長の範囲５７０ｎｍ〜７１０ｎｍにおけるこれら皮膚付随物の光学密度が、癌性腫瘍と比較すると非常に低いことを示唆している。
【００５２】
表皮の光学密度スペクトルにおいて、約６１５ｎｍのＭＢ色素吸収ピークは、約６６５ｎｍの第２吸収ピークよりもより明確に現れる。この特性は、癌性腫瘍組織と表皮の間の輪郭付けにおいて、前者が後者のこの２つの吸収ピーク光度と反対の相対振幅を示すので、両者の間の輪郭付けを容易にする。また、表皮と腫瘍の光学密度曲線の比較は、腫瘍がより多くの色素を蓄積して、６６５ｎｍのＭＢ吸収バンド付近で相当に高い光学密度を示すことを表示している。
【００５３】
コラーゲン及び脂肪は相当量の色素を蓄積するとは見られないので、腫瘍とより容易に区別することができる。更に、皮下脂肪のスペクトルは、他の皮膚構造と比較して、３９５ｎｍ〜５６０ｎｍの波長範囲でより高い光学密度を示す。この所見は、皮下脂肪のより高いヘモグロブリン含量と関連しているのかもしれない。
【００５４】
従って、図２ｄに示すように、検討した皮膚構造それぞれは、一部は各種皮膚構造による色素の異なった取り込みに基づいて、ＭＢ色素の吸収バンド内で異なったスペクトル応答を示す。ＭＢ色素で染色した皮膚構造のスペクトル特徴を、良性組織から癌を確実に区別するために用いることができるということを確認するために、ＢＣＣを含有している２０の新鮮な厚いサンプルから収集した癌、毛嚢、皮脂腺、表皮、コラーゲン及び脂肪の光学密度を測定して統計学的に解析した。検討した皮膚構造全てについて光学密度の波長への平均依存度を図３ａ〜３ｅに示す。
【００５５】
図３ａ〜３ｅに示すデータは、ＭＢ色素の吸収バンド内で、癌組織の光学密度が他の皮膚組織より実質的により高いようであるということを示している。また、３９０ｎｍ〜４８５ｎｍの波長に対する、表皮と癌の光学密度の差が相当あると観察された（例えば、図３ｃを参照されたい）。このスペクトル領域はヘモグロビンのソーレー吸収バンドにほぼ対応している。例えば、癌組織は一般に血液を含有しているのに対して、健常な表皮は一般に無血であることが観察されている。従って、観察された光学密度の差異はある程度腫瘍と表皮の血液含量の差に基づいているのだろう。
【００５６】
ヘモグロビン含量の差及びコラーゲン及び脂肪の比較的低い色素取り込みによって、コラーゲン−腫瘍、及び脂肪−腫瘍の対の光学密度の差異は、図３ｄ及び３ｅに示すように、実質的に検討した全てのスペクトル領域にわたって有意であった。
【００５７】
癌と近接の正常皮膚組織の間には血液含量の差にかなりのばらつきがある。更に、反射率の測定は、血液の酸化によって、更には身体の病変の部位によっても影響を受けるだろう。従ってヘモグロブリン吸収のスペクトル領域において確認された差異は、組織識別に対する一般的な信頼できる基礎をもたらせない。本明細書に提示されている組織構造光学密度のスペクトル解析は、毛嚢の可能性を除いて（図３ｂを参照されたい）、検討した各種組織構造について、６１５ｎｍ〜７００ｎｍの波長に対する腫瘍と健常皮膚構造の間の光学密度の差異が有意であったことを示している。（図３ａ、３ｃ、３ｄ及び３ｅを参照されたい）。従って、光学画像解析に関するスペクトル変動の更なる解析は、６００ｎｍ〜７３５ｎｍのスペクトル領域に焦点を合わせることができる。
【００５８】
腫瘍と毛嚢の間の確実な分光学的区別を達成することについての課題に対処するために、癌及び正常組織について光学密度の波長導関数を算出して解析した。例えば、メチレンブルー色素は、局所の生物化学環境に応じて、異なった吸収特性を示すことが観察されている。従って、ＭＢで染色した癌と毛嚢の光学密度曲線の勾配において観察された僅かな偏差はこれら２つの構造の生物化学環境における差異によって引き起こされたのかもしれない。再現可能なら、このような偏差は、癌の周辺健常組織からの明確な区別を促進するために用いることができる。
【００５９】
波長に対する異なった組織の光学特性の導関数は、好ましくは５ｎｍ以上離れて大きい波長で実施した測定値に基づいて算出できる。一般に、５ｎｍ未満異なっている２つの波長における組織の光学特性に有意な或いは課題解決を容易にするような変化は見られないだろう。具体的には、組織の光学特性に関する導関数情報は、少なくとも約５ｎｍ、例えば、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、又は約５ｎｍ〜約１５ｎｍ、例えば約１０ｎｍ異なっている２つ又はそれ以上の波長における光学特性を測定して得ることができる。このような導関数情報を確認するために用いられる波長は、このような導関数を算出するときに、波長依存性光学特性における局所最大値又は最小値を越えることを避けるために、約３０ｎｍ未満異なっていることが好ましい。このような導関数を算出するための本明細書に記載されている実施例で用いられている約１０ｎｍの典型的な波長差は、光学特性変化の解明と局所波長依存性導関数の正確な概算の間の良好な妥協をもたらす。
【００６０】
腫瘍組織と比較した各種健常組織構造に関する光学密度の波長導関数についての得られた依存性を図４ａ〜４ｅに示した。正常（健常）組織構造と癌組織との対の光学密度及び対応する波長導関数の間の差異の有意性を評価するために、非対の両側ｔ−検定を用いた。癌組織とその他の正常皮膚型組織の間の相違領域をより良く確認するためには、標準的なＡＮＯＶＡ分析で開始するよりむしろ、対のｔ−検定を利用した。従って、単独の健常皮膚型組織を個々に癌組織サンプルに対して試験した。
【００６１】
比較試験の結果を表２に要約している。これらのデータは、毛嚢を除いて（図４ｂに示してある）、全ての癌−正常組織の対の、ＭＢ色素の吸収最大値の１つに対応する、６６５ｎｍの波長における光学密度に統計的な有意差があることを示している。癌と毛嚢の間の光学密度の波長導関数における最も大きな統計学的に有意な差が６１５ｎｍ、７０５ｎｍ、及び７３５ｎｍ（ここで６１５ｎｍはＭＢ色素の別の局所吸収最大値にほぼ対応している）の波長で観察された（図４ｂを参照されたい）。
【００６２】
光学密度の波長導関数の差が、試験した全ての癌−正常組織の対において７０５ｎｍで有意に観察された。従って、癌及び正常皮膚組織の明確な区別に適している特定のスペクトル領域が、反射率画像のスペクトル解析を用いて確認された。これらの波長領域は、ＭＢ色素の局所最大値にほぼ対応している、６１５ｎｍ及び６６５ｎｍの波長を包含している。
【００６３】
従って、組織画像のスペクトル解析を、画像収集手法を著しく変更せず、或いは手法を実施するために必要な時間及び複雑さを増大せずに、癌検出手法に組み込むことができる。例えば、図１に示す典型的な装置を、本明細書に記載されている画像収集及び分析手法の実施に適合することができる。単色光分光器２を、癌及び正常組織の間の光学密度の波長導関数に有意な差が見出された本明細書に記載の１つ又はそれ以上の特定波長で光をＸｅ−Ａｒｃランプ１から提供するように構成することができる。コンピュータ１０を、特定の試料１１から反射するこの光の強度を解析してＣＣＤカメラ９によってこれらの波長で検出するように設定することができる。これらの波長における画像の領域の光学密度を本明細書で提供されるデータと比較することは、組織サンプル１１のこれらの領域における健常組織と癌組織の間のより正確な区別を促進できる。
【００６４】
全可視スペクトル領域に関する画像中の各ピクセルの完全な分光分析を実施することは可能であるが、この包括的なアプローチは本明細書に記載されている組織同定分析を実施するための最適な又は望ましいアプローチではないだろう。例えば、１１００×１３００ピクセルを含有している画像についてのわずか１０の波長の分析には、極めて長い時間を必要とし、このアプローチを手術中の使用に不適切なものとしている。更に、反射率及び蛍光偏光画像は一般に、組織画像における大部分のピクセルについて十分正確な情報をもたらすので、そのような詳細なアプローチはかなり冗長となるであろう。それに対して、ＲＦＰＩ技術と、手術中に画像を精査している外科医にとって疑わしいと思われる画像の領域（例えば、数本又はそれ以上のピクセル）の２波長スペクトル分析との組み合わせは、臨床診療に適しているより現実的なアプローチを提供するだろう。
【００６５】
従って、癌性組織及び健常組織構造の両方につぃての光学密度及び対応する波長依存性導関数の解析は、ＲＦＰＩ手法を実施する場合に、非黒色腫皮膚癌のより正確な輪郭付けを容易にできる。ＭＢ色素の吸収バンドに対応しているスペクトル領域を、癌組織、例えばＢＣＣの正確な区別化のために用いることができる。本明細書に記載されている腫瘍輪郭付け技術は、例えば、複数の波長での画像化を包含する。例えば、２つの監視波長、例えば、約６１５ｎｍ及び約６６５ｎｍにおける分光分析は、ある特定の正常皮膚構造の観察される光学密度及び対応する波長依存性導関数がこれら波長における癌組織のそれとは有意に異なっているので、このような区別化を有意に改善する。従って、本発明の実施態様は、リアルタイムで正確な癌の輪郭付けを容易にする、反射率及び蛍光偏光画像とこのようなスペクトル分析を組み合わせる方法及び装置を提供する。このような輪郭付けは、例えば、手術前、手術中、及び／又は手術後に実施でき、インビボ又はエクスビボでも実施できる。
【００６６】
特定組織の分析に用いる波長は、様々な基準に基づいて選択できる。例えば、サンプル中に血液が存在しているならば、血液により強く吸収される４１０ｎｍ又はその近くの波長を使用して、血液吸収の影響を評価及び／又は除去を促進すること、及び／又はスペクトル分析手法において血液と色素の影響を区別することができる。約１１００ｎｍ〜約１３００ｎｍの参照波長も、例えば、組織構造のある特定の型を区別するために用いることができる。散乱効果を優先するように、この波長領域内にあまり強くない吸収体が存在してもよい。一方、約１４００ｎｍの波長付近で水の吸収が比較的強いので、この波長領域は散乱効果を試験するためには望ましくない。
【００６７】
前述は発明の本質を説明したにすぎない。記載された実施態様に対する多くの修正及び変更は、本明細書の教示を考慮すると当業者に明らかであろう。従って、当然のことながら、当業者は、本明細書に明確に記載されていないが、本発明の本質の具体化であって従って本発明の精神及び範囲の内である多くの方法を見出すことができるだろう。本明細書で引用されている全ての特許及び刊行物は、参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１波長を有する第１の光及び第２波長を有する第２の光を組織領域に発することができる光エミッター；
第１の光に基づいて組織領域から送られる第３の光及び第２の光に基づいて組織領域から送られる第４の光を検出して、第３及び第４の光に基づいて信号を作成することができる光検出器；及び
当該光検出器によってもたらされた信号に基づいて当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造を画像化できるアナライザー：
を含有してなる、組織領域を画像化する装置。
【請求項２】
当該第３の光及び当該第４の光が、組織領域にもたらされた色素と当該第１及び第２の光の間の相互作用に少なくとも一部分が基づいている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
色素がメチレンブルー又はトルイジンブルーのうちの少なくとも１つを含有している、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
色素がメチレンブルーを含有し、そして少なくとも１つの当該第１波長又は当該第２波長が約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍである、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、約６１５ｎｍ〜約６６５ｎｍである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、当該色素に関する局所吸収最大値にある波長とほぼ同一である、請求項２に記載の装置。
【請求項７】
当該第１の光又は当該第２の光の少なくとも１つが偏光されていて、そして当該光検出器がさらに、当該組織領域内の複数の特定部位における少なくとも１つの当該第３の光及び当該第４の光の偏光方向を検出できる、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
当該アナライザーがさらに、当該第１、第２、第３、及び第４の光偏光方向に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
当該少なくとも１つの画像が、少なくとも１つの反射率偏光画像又は蛍光偏光画像である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
当該アナライザーがさらに、当該少なくとも１つの画像に基づいて、少なくとも１つの当該組織構造の型を同定できる、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
当該アナライザーが、コンピュータ可読媒体を更に含有していて、そこで
複数の組織構造に関連している複数の波長依存性光学相互作用パラメータが当該コンピュータ可読媒体に提供され；そして
当該アナライザーが、当該信号を当該パラメータと比較して当該組織領域内の当該少なくとも１つの組織構造を同定するように構成されている：
請求項２に記載の装置。
【請求項１２】
当該コンピュータ可読媒体が、揮発性メモリー配列、非揮発性メモリー配列、光学記憶媒体、磁気記憶媒体、又はネットワークを通じて当該アナライザーによってアクセスできる媒体の少なくとも１つを含有している、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
アナライザーがさらに、当該組織領域内の複数の特定位置における当該第１及び第２波長についての少なくとも１つの反射率又は光学密度を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて確認できる、請求項２に記載の装置。
【請求項１４】
当該アナライザーがさらに、当該反射率又は当該光学密度に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
当該アナライザーがさらに、当該少なくとも１つの画像に基づいて当該少なくとも１つの組織構造を確認できる、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
アナライザーがさらに、ある特定の波長におけるそして当該組織領域内の少なくとも１つの特定部位における波長に関する少なくとも１つの反射率又は光学密度に関する導関数情報を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて確認でき、そして導関数情報に基づいて少なくとも１つの組織構造を画像化できる、請求項２に記載の装置。
【請求項１７】
導関数情報が少なくとも１つの第１導関数又は第２導関数を含有している、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
第１及び第２の光の波長間差異が、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍである、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
当該アナライザーがさらに、組織領域内の複数部位における当該導関数情報を確認でき、そして当該導関数情報に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項１７に記載の装置
【請求項２０】
当該アナライザーがさらに、当該導関数情報に基づいて当該少なくとも１つの組織領域を確認できる、請求項１７に記載の装置。
【請求項２１】
当該少なくとも１つの組織構造が癌組織を含有している、請求項１〜２０の何れか一項に記載の装置。
【請求項２２】
当該装置が実質的にリアルタイムに、少なくとも１つの当該組織構造の画像化又は同定の少なくとも１つができる、請求項１〜２０の何れか一項に記載の装置。
【請求項２３】
工程：
当該組織領域を造影剤で処理すること；
第１波長を有する第１の光を組織領域へ誘導すること；
第２波長を有する第２の光を組織領域へ誘導すること；
第１の光に基づいて組織領域から送られる第３の光及び第２の光に基づいて組織領域から送られる第４の光を検出すること；及び
当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造の画像を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて作成すること：
を含有してなる、組織領域を画像化する方法。
【請求項２４】
当該造影剤が、メチレンブルー又はトルイジンブルーのうちの少なくとも一つを含有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
色素がメチレンブルーを含有し、そして当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが約６１５ｎｍ又は約６６５ｎｍである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、当該造影剤に関する局所吸収最大値にある波長とほぼ同一である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
当該第１の光又は当該第２の光の少なくとも１つが偏光されていて、そして当該作成工程が、当該組織領域内の複数の特定部位における当該第３の光又は当該第４の光の少なくとも１つの偏光方向に基づいて当該画像を作成することを包含している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
当該作成工程が、当該第１、第２、第３、及び第４の光の偏光方向に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成することを含有している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
当該少なくとも１つの画像が、少なくとも１つの反射率偏光画像又は蛍光偏光画像である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの当該特定部位における組織構造の少なくとも１つの型を、当該少なくとも１つの画像に基づいて同定する工程をさらに含有している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組織構造の当該少なくとも１つの型を、複数の組織構造に関する所定の波長依存性光学相互作用パラメータを当該第１、第２、第３、及び第４の光で比較することに基づいて同定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
当該組織領域内の複数の特定部位における当該第１及び第２波長についての反射率又は光学密度の少なくとも１つを当該第１、第２、第３及び第４の光に基づいて測定する工程をさらに含有していて、ここで画像を当該第１及び第２波長で測定した当該反射率又は光学密度に基づいて作成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの特定波長における波長に関する少なくとも１つの反射率又は光学密度の導関数情報を確認する工程；
ここにおいて、当該導関数情報が、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて当該組織領域内の複数の特定部位において確認され、そして
画像が、当該導関数情報に基づいて作成される；
をさらに含有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
当該導関数情報が、第１導関数又は第２導関数の少なくとも１つを含有している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
当該方法がさらに、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造を同定することを含有している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
当該少なくとも１つの組織構造が癌組織を含有している、請求項２３〜３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
当該画像の作成が、実質的にリアルタイムに実施される、請求項２３〜３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１】
第１波長を有する第１の光及び第２波長を有する第２の光を組織領域に発することができる光エミッター；
第１の光に基づいて組織領域から送られる第３の光及び第２の光に基づいて組織領域から送られる第４の光を検出して、第３及び第４の光に基づいて信号を作成することができる光検出器；及び
当該光検出器によってもたらされた信号に基づいて当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造を画像化できるアナライザー：
を含有してなる、組織領域を画像化する装置。
【請求項２】
当該第３の光及び当該第４の光が、組織領域にもたらされた色素と当該第１及び第２の光の間の相互作用に少なくとも一部分が基づいている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
色素がメチレンブルー又はトルイジンブルーのうちの少なくとも１つを含有している、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
色素がメチレンブルーを含有し、そして少なくとも１つの当該第１波長又は当該第２波長が約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍである、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、約６１５ｎｍ〜約６６５ｎｍである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、当該色素に関する局所吸収最大値にある波長とほぼ同一である、請求項２に記載の装置。
【請求項７】
当該第１の光又は当該第２の光の少なくとも１つが偏光されていて、そして当該光検出器がさらに、当該組織領域内の複数の特定部位における少なくとも１つの当該第３の光及び当該第４の光の偏光方向を検出できる、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
当該アナライザーがさらに、当該第１、第２、第３、及び第４の光偏光方向に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
当該少なくとも１つの画像が、少なくとも１つの反射率偏光画像又は蛍光偏光画像である、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
当該アナライザーがさらに、当該少なくとも１つの画像に基づいて、少なくとも１つの当該組織構造の型を同定できる、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
当該アナライザーが、コンピュータ可読媒体を更に含有していて、そこで
複数の組織構造に関連している複数の波長依存性光学相互作用パラメータが当該コンピュータ可読媒体に提供され；そして
当該アナライザーが、当該信号を当該パラメータと比較して当該組織領域内の当該少なくとも１つの組織構造を同定するように構成されている：
請求項２に記載の装置。
【請求項１２】
当該コンピュータ可読媒体が、揮発性メモリー配列、非揮発性メモリー配列、光学記憶媒体、磁気記憶媒体、又はネットワークを通じて当該アナライザーによってアクセスできる媒体の少なくとも１つを含有している、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
アナライザーがさらに、当該組織領域内の複数の特定位置における当該第１及び第２波長についての少なくとも１つの反射率又は光学密度を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて確認できる、請求項２に記載の装置。
【請求項１４】
当該アナライザーがさらに、当該反射率又は当該光学密度に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
当該アナライザーがさらに、当該少なくとも１つの画像に基づいて当該少なくとも１つの組織構造を確認できる、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
アナライザーがさらに、ある特定の波長におけるそして当該組織領域内の少なくとも１つの特定部位における波長に関する少なくとも１つの反射率又は光学密度に関する導関数情報を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて確認でき、そして導関数情報に基づいて少なくとも１つの組織構造を画像化できる、請求項２に記載の装置。
【請求項１７】
導関数情報が少なくとも１つの第１導関数又は第２導関数を含有している、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
第１及び第２の光の波長間差異が、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍである、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
当該アナライザーがさらに、組織領域内の複数部位における当該導関数情報を確認でき、そして当該導関数情報に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成できる、請求項１７に記載の装置
【請求項２０】
当該アナライザーがさらに、当該導関数情報に基づいて当該少なくとも１つの組織領域を確認できる、請求項１７に記載の装置。
【請求項２１】
当該少なくとも１つの組織構造が癌組織を含有している、請求項１〜２０の何れか一項に記載の装置。
【請求項２２】
当該装置が実質的にリアルタイムに、少なくとも１つの当該組織構造の画像化又は同定の少なくとも１つができる、請求項１〜２０の何れか一項に記載の装置。
【請求項２３】
工程：
当該組織領域を造影剤で処理すること；
第１波長を有する第１の光を組織領域へ誘導すること；
第２波長を有する第２の光を組織領域へ誘導すること；
第１の光に基づいて組織領域から送られる第３の光及び第２の光に基づいて組織領域から送られる第４の光を検出すること；及び
当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造の画像を、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて作成すること：
を含有してなる、組織領域を画像化する方法。
【請求項２４】
当該造影剤が、メチレンブルー又はトルイジンブルーのうちの少なくとも一つを含有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
色素がメチレンブルーを含有し、そして当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが約６００ｎｍ〜約７３５ｎｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが約６１５ｎｍ又は約６６５ｎｍである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
当該第１波長又は当該第２波長の少なくとも１つが、当該造影剤に関する局所吸収最大値にある波長とほぼ同一である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
当該第１の光又は当該第２の光の少なくとも１つが偏光されていて、そして当該作成工程が、当該組織領域内の複数の特定部位における当該第３の光又は当該第４の光の少なくとも１つの偏光方向に基づいて当該画像を作成することを包含している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
当該作成工程が、当該第１、第２、第３、及び第４の光の偏光方向に基づいて組織領域の少なくとも１つの画像を作成することを含有している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
当該少なくとも１つの画像が、少なくとも１つの反射率偏光画像又は蛍光偏光画像である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの当該特定部位における組織構造の少なくとも１つの型を、当該少なくとも１つの画像に基づいて同定する工程をさらに含有している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組織構造の当該少なくとも１つの型を、複数の組織構造に関する所定の波長依存性光学相互作用パラメータを当該第１、第２、第３、及び第４の光で比較することに基づいて同定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
当該組織領域内の複数の特定部位における当該第１及び第２波長についての反射率又は光学密度の少なくとも１つを当該第１、第２、第３及び第４の光に基づいて測定する工程をさらに含有していて、ここで画像を当該第１及び第２波長で測定した当該反射率又は光学密度に基づいて作成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの特定波長における波長に関する少なくとも１つの反射率又は光学密度の導関数情報を確認する工程；
ここにおいて、当該導関数情報が、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて当該組織領域内の複数の特定部位において確認され、そして
画像が、当該導関数情報に基づいて作成される；
をさらに含有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
当該導関数情報が、第１導関数又は第２導関数の少なくとも１つを含有している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
当該方法がさらに、当該第１、第２、第３、及び第４の光に基づいて当該組織領域内の少なくとも１つの組織構造を同定することを含有している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
当該少なくとも１つの組織構造が癌組織を含有している、請求項２３〜３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項３８】
当該画像の作成が、実質的にリアルタイムに実施される、請求項２３〜３７の何れか一項に記載の方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【公表番号】特表２０１２−５２４２７６（Ｐ２０１２−５２４２７６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６１２６（Ｐ２０１２−５０６１２６）
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０８８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０７６９
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０６２８６９７３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション (27)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５５ Ｆｒｕｉｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ０２１１４ （ＵＳ）．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１３日（２０１０．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３０８８０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０７６９
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０６２８６９７３）ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション (27)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＧＥＮＥＲＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】５５ Ｆｒｕｉｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ０２１１４ （ＵＳ）．
【Ｆターム（参考）】
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