生化学分析のための酵素反応を促進する発熱試験片
【課題】酵素反応を利用した生化学分析において、外気温環境による測定精度の変動を改善するための生化学分析用試験片を提供する。
【解決手段】吸湿発熱性繊維を用いる、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である。吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である。酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる。
【解決手段】吸湿発熱性繊維を用いる、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である。吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である。酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分析用試験片に関する。更に詳しくは、血液、血液由来試料、その他生体由来試料の生化学分析をより正確かつ効率的に行うための、生化学分析用試験片の素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の分野においてＰＯＣ（ポイントオブケア）が注目されている。ＰＯＣとは、患者の自宅での自己検査、病院でのベッドサイド検査や中央検査室以外での検査など、患者のそばで行われる若しくは患者本人が行う検査を意味するものであり、これにより、医師又は患者は検査結果を即座に知ることができるので、迅速な処置が可能になり、治療の質の向上に大きく役立つことが期待されている。
【０００３】
ＰＯＣ装置の一例としては、例えば自己血糖値測定装置（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）が既に普及している。糖尿病の診断やその予防、治療には日々の血糖値を把握することが重要であり、患者が自ら血糖値を測定し自己管理することが推奨されるなか、数μＬの血液（全血）から簡便かつ迅速に血糖値を測定できるＰＯＣ装置は非常に有用である。このようなＳＭＢＧの例として、血液中のグルコースをグルコース酸化酵素等の酵素で反応させて発色させ、その発色の程度を吸光度によって検知してグルコース量に換算する方法（酵素比色法）を利用したものが用いられてきた。また近年では、血液中のグルコースをグルコース脱水素酵素等の酵素で反応させて電流を生じさせ、流れた電流値をグルコース量に換算する方法（酵素電極法）を利用したものが主流になっている。
【０００４】
一般に、酵素反応を用いた生化学分析の特徴として、酵素には至適温度が存在し、温度によって酵素活性に差が現れるため、温度間での測定精度に差が生じるという問題がある。多くの酵素はヒトの体温付近である３７℃付近が至適温度であり、酵素活性が高いと言われている。そのため外気温もしくは室内気温が低温での測定時には、酵素活性が低下し測定値にバラツキが生じるため精度が悪くなることは避けられない。
【０００５】
ＳＭＢＧを代表とするＰＯＣに用いられる検査機器は、主に日常生活やベッドサイドでの検査で用いられるため、想定される使用温度範囲が５℃から４０℃付近であり、この温度範囲で常に一定の精度の高い測定が求められている。
【０００６】
そこで、この問題を解決するために温度センサを搭載したＳＭＢＧが検討された（特許文献１）。しかしこの方法によれば、温度センサや様々な配線等の複雑な装置を必要とし、かつ測定と同時に測定時温度の検出を行い温度補正することが難しく、特に低温時の測定精度が十分ではなかった。
【０００７】
また低温での酵素特性を改良する試みもなされた（非特許文献１）。しかしながら、酵素の遺伝子改変が必要であり、低温での酵素活性の向上は容易ではなく、生化学分析に用いられる診断用酵素での改良は進んでいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１０３１７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２００８ Ｄｅｃ；２１(１２)：７２１−７．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、酵素反応を利用した生化学分析において、酵素反応の温度依存性、特に低温環境下における酵素活性の低下を小さくし、外気温環境による測定精度の変動を改善するための生化学分析用試験片を提供することにある。さらに、特に低温環境下での測定精度が改善された生化学分析用試験片を用いたＳＭＢＧ装置およびその他生化学自動分析ＰＯＣ用装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、酵素反応を行うための基材となる試験片に、吸湿作用により発熱する繊維素材を用いることにより、酵素反応時における試験片の温度を酵素の至適温度に近づけることができ、とりわけ低温環境下であっても安定した酵素反応が得られることにより測定精度が向上することを見出し、本発明を発明するに至った。本発明は、低温環境下における酵素反応の安定性を改良した生化学分析用試験片、本試験片を用いて生化学分析を行う生化学分析装置、および本試験片を用いて生化学分析を行う方法に関する。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（生化学分析用試験片）
（１）吸湿発熱性繊維を用いることを特徴とする、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。
（２）吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である、（１）に記載の生化学分析用試験片。
（３）吸湿発熱性繊維が吸湿発熱性アクリレート系繊維である、（２）に記載の生化学分析用試験片。
（４）吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である、（３）に記載の生化学分析用試験片。
（５）乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１００Ｊ／ｇ以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（６）乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１５０Ｊ／ｇ以上である、（５）に記載の生化学分析用試験片。
（７）酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、（１）〜（６）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（８）酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、（７）に記載の生化学分析用試験片。
（９）５℃〜４０℃の間で酵素反応を行うことを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（生化学試験片を用いて生化学分析を行う生化学分析装置）
（１０） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行うことにより生化学分析を行う、生化学分析装置。
（生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法）
（１１） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行う方法。
（１２） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による生化学分析用試験片を用いることにより、広い温度範囲で酵素活性を上げることができ、より精度の高い測定結果を得ることができる。すなわち、室内気温環境下では、試験片が発熱することにより酵素の至適温度に近い温度で酵素反応を行うことができ、より正確な生化学分析を行うことができる。また、外気温環境下、とりわけ冬場や寒冷地における外気温環境下での使用に際しては、試験片の発熱により酵素反応が促進され、使用時の外気温度の影響を受けにくい。本発明により、低温環境を含むさまざまな温度環境に対して安定した測定精度を得ることができ、精度の高いＳＭＢＧもしくは生化学分析ＰＯＣ装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１〜８における、生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度変化を示すグラフ図である。
【図２】比較例１〜４における、生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度変化を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳述するが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明による吸湿発熱性繊維とは、水分（湿気）を吸着することによっておこる凝集熱もしくは吸着熱を利用して発熱する繊維のことである。繊維が発熱する仕組みは、まず繊維のもつ官能基が吸着活性点となり空気中の水分子が引き寄せられ、化学結合等によって凝集もしくは吸着すると考えられている。そして空気中の水分子が繊維表面に凝集もしくは吸着した際に、全体的にエネルギーが上昇すると同時に自由運動していた水分子の運動エネルギーが熱エネルギーに変換されて発熱し、温度が一時的に上昇するものと考えられている。
【００１７】
吸湿発熱性繊維は、水分（湿気）を吸収することが知られている繊維であれば特に限定されない。このような吸湿発熱性繊維の種類として、動物性天然繊維、植物性天然繊維、化学合成繊維、再生繊維が挙げられる。動物性天然繊維としてはダウン、ウール、カシミヤ等の動物の体毛由来の繊維、絹等の動物生産性繊維構造体が例示され、動物の種類は特に限定されない。植物性天然繊維としては、綿花、麻由来の繊維が例示される。化学合成繊維としては、アクリル系合成繊維等の吸湿性を示す繊維が例示される。再生繊維とは、本発明では再生セルロース繊維を意図しており、木材やコットンリンターに含まれるセルロースを原料とし、化学処理を経てセルロースと同じ化学構造を持つ繊維に再生するものである。具体的には、レーヨン（ビスコースレーヨン）、ポリノジック、キュプラ（銅アンモニアレーヨン）、リヨセル（精製セルロース）が例示される。発熱量の点からは吸湿率の高い繊維が好ましく、ウール、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、絹、アクリル系合成繊維が好ましい。より好ましくはアクリル系合成繊維であり、アクリル系合成繊維のなかでも吸湿による発熱性を示すアクリレート系繊維（吸湿発熱性アクリレート系繊維）が更に好ましい。さらに、吸湿発熱性アクリレート系繊維の中でも、親水基を高密度で強架橋してなる化学変性体を有するアクリル酸系合成繊維が特に好ましい。アクリル酸系合成繊維の具体例としては、親水基であるカルボン酸を高密度で強架橋した化学変性体であるアクリル酸系合成繊維が挙げられる。
【００１８】
吸湿発熱性繊維の発熱量に関しては、特に限定されないが、酵素反応時の試験片温度を上昇させる目的から、１０μLの１２０ｍｇ／dＬグルコース水溶液を滴下し、C −８０熱量計を用いて水分吸着熱を２５℃、相対湿度（ＲＨ）８０．５％の条件で測定を行った場合の乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱量（発熱量）が１００J／ｇ以上であることが好ましい。より好ましくは１５０J／ｇ以上であり、さらに好ましくは４００J／ｇ以上である。特に好ましくは７００Ｊ／ｇ以上である。上限は特に規定されないが、通常１５００Ｊ／ｇ以下であり、好ましくは１０００Ｊ／ｇ以下である。吸湿発熱性繊維がアクリル酸系合成繊維である場合、相対湿度８０．５％、２５℃の条件の測定条件で、絹に比べ吸湿率及び吸着熱による発熱量が約１．６倍から約７倍以上であり好適に使用される。
【００１９】
吸湿発熱性繊維は、１種類の吸湿発熱性繊維のみで構成されていてもよいし、２種類以上の吸湿発熱性繊維を混合したものであってもよい。また、１種類以上の吸湿発熱性繊維と１種類以上の吸湿発熱繊維でない繊維との混合繊維であってもよい。複数の種類の繊維を混合して用いる場合、混合比率は適宜設定しうる。混合繊維は複数種のモノフィラメントの集合体でもよいし、マルチフィラメントにしてもよい。
【００２０】
吸湿発熱性繊維の繊度は特に限定されず、当業者が製造しうるものであればいずれであっても使用できる。また、繊維の使用態様は織物、編物、不織布状構造のいずれを使用することもでき、目付けや厚みは、酵素反応が妨げられず、十分な発熱量を得ることができる範囲であれば適宜設定しうる。
【００２１】
本発明における生化学分析用試験片とは、酵素反応により目的測定物を定量もしくは定性するための、高分子材料からなる反応基材であり、チップ、スライドもしくはストリップと呼ばれることもある。
【００２２】
本発明の生化学分析用試験片に用いられる生化学分析の方法としては、試験片に酵素と色素を少なくとも含み、測定対象検体試料の酵素反応量を色素の発色差により定性化もしくは定量化する酵素比色法を採用する方法と、試験片に酵素と補酵素やメディエーターおよび電極を含み、酸化還元反応による電子の移動により電流を測定して、定性もしくは濃度を定量化する酵素電極法を採用する方法がある。実際の生化学分析用試験片の使用においては、生化学分析用試験片が採用する方法に対応した測定機器を用いる。測定機器により差異があるが、本生化学分析用試験片を用いた代表的な生化学分析方法は、（１）生化学分析用試験片に検体試料を滴下し、次いで（２）該試験片を測定機器に装着し、（３）測定機器内で発光の検出もしくは電流の検出を行う。そして（４）機器内で測定値を演算により濃度に換算され、（５）測定結果が画面もしくは音声により通知される、という方法である。
【００２３】
本発明の生化学分析用試験片は、少なくとも酵素を含有する。含有するとは、乾燥状態において試験片の内部もしくは外表面に酵素が担持もしくは保持されている状態をいう。試験片に酵素を含有させる方法は種々あるが、例えば、酵素を含む溶液に試験片を含浸させ、自然乾燥もしくは温風乾燥させることにより試験片に酵素を固定させる方法により行うことができる。
【００２４】
本発明における酵素とは、基質から生成物を生成する化学反応の際に触媒作用の働きをするタンパク質のことである。酵素反応とは、酵素によって触媒される化学反応のことをいう。酵素によって触媒される反応としては、酸化反応、脱水素反応、エステル加水分解反応、ペプチド加水分解反応、リン酸化反応、脱リン酸化反応、合成反応、異性化反応が例示される。
【００２５】
本発明における生化学分析とは、生体由来の検体に存在する有機・無機化合物を測定するために行われる分析のことをいい、臨床検査に用いられる測定項目の分析を指しても用いられる。生化学分析が用いられる臨床検査としては、血液検査、尿・糞便検査等があり、本発明は、血液検査に属する生化学分析に好適に使用される。血液検査における生化学分析において本発明の生化学分析用試験片を用いることができる分析対象項目の例としては、血糖（グルコース）、ヘモグロビンＡ１ｃ、グリコアルブミン、インスリン、総タンパク質、アルブミン、コリンエステラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ＝ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトラスフェラーゼ（ＡＳＴ＝ＧＯＴ）、γ−グルタミントランスペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビルビリン、アミラーゼ、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、尿酸がある。
【００２６】
生化学分析用試験片に含有される酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）が例示される。試験片にはこれらの酵素のうち１種類のみが含有されていてもよいが、２種類以上の酵素が含有されていてもよい。好ましくはグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１もしくは２以上の酵素であり、より好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼとペルオキシダーゼである。
【００２７】
本発明が利用される分野における実施態様の一つは、血糖（グルコース）を、酵素比色法を用いて分析するための生化学分析用試験片である。本実施態様における具体例の一例として、試験片には少なくともグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼおよび色素が含有されている。血液検体が試験片に滴下されると、血液の血しょう内のグルコースにグルコースオキシダーゼが反応し、グルコースが酸化されてグルコン酸と過酸化水素を発生させる。次に、過酸化水素と色素の存在下でペルオキシダーゼが反応し、発色反応が起きる。この発色反応を試験片とは別の測定機器により測定し、血糖値が算出される。
【００２８】
本発明が利用される分野における実施態様の別の例は、血糖（グルコース）を、酵素電極法を用いて分析するための生化学分析用試験片である。本実施態様における具体例の一例として、試験片には少なくとも補酵素結合型グルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターが含有されている。補酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が例示され、メディエーターは、２，６−ジクロロフェノール・インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）またはフェロセンもしくはフェロシアンカリウムを使用できる。血液検体が試験片に滴下されると、血液の血しょう中のグルコースに補酵素結合型グルコースデヒドロゲナーゼが反応し、グルコースから脱水素反応が起こると共に、水素（プロトン）がメディエーターを介してＦＡＤをＦＡＤＨに還元する。この反応中の電子の流れを試験片に設けた電極を介して試験片とは別の測定機器により測定し、血糖値が算出される。
【００２９】
生化学分析用試験片は、１層構造からなるものと多層構造からなるものの双方を含む。１層構造からなる場合、試験片には酵素のほかに色素もしくは電極を含有させることがきる。加えて安定剤、ｐH調整剤、界面活性剤、その他の添加剤を含有させることができる。多層構造からなる場合、例えば酵素を含有し酵素反応が行われる層、色素もしくは電極を含む層を設けることができる。さらに、血液などの測定対象検体の展開を促進する展開層を設けても良い。各層には、さらに安定剤、ｐH調整剤、界面活性剤、その他の添加剤を含有させることができる。本発明による生化学分析用試験片が多層構造からなる場合において、少なくとも酵素を含有するとは、少なくとも１つの層に酵素が含有されていることを指す。
【００３０】
生化学分析用試験片が１層構造からなる場合、試験片は吸湿発熱性繊維のみからなる繊維構造体であってもよいし、吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体であってもよい。吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体の場合、検体（液体量）が一定の場合、吸湿発熱性繊維の使用混率が多いほど単位面積あたりの発熱量が多いため、吸湿発熱性繊維の使用混率は出来るだけ多いほうが好ましい。３０ｗｔ％含有する場合には試験片が約２℃発熱し、５０ｗｔ％で約３℃、７０ｗｔ％で約４℃の発熱が見られるため酵素反応を促進させることができる。３０ｗｔ％未満では発熱量が少なく温度上昇も少ないため好ましくない。したがって、吸湿発熱性繊維が３０ｗｔ％以上含まれることが好ましく、より好ましくは、５０ｗｔ％以上であり、さらに好ましくは７０ｗｔ％である。繊維構造体としては、織物、編物、不織布があげられ、織物の種類、編物の種類、不織布の種類は限定されない。
【００３１】
生化学分析用試験片が２層以上の多層構造からなる場合、少なくとも酵素を含有する層に吸湿発熱性繊維を含む繊維構造体が使用される。吸湿発熱性繊維を含む繊維構造体は、吸湿発熱性繊維のみからなる繊維構造体であってもよいし、吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体であってもよい。酵素を含有する層以外の層においては、任意の繊維を用いた繊維構造体を使用することができる。また、最下層にはプラスチック材料を用いることができ、例えばＰＥＴフィルムを用いることができる。
【００３２】
本発明は使用環境が５℃〜４０℃の間で使用されることが好ましい。５℃未満の温度での使用は、吸湿発熱性繊維の発熱量が足りないため、酵素の酵素活性が低いままであり酵素反応性が悪く、好ましくない。また４０℃以上の温度では酵素活性が低下し、さらに吸湿発熱性繊維の発熱により温度が上昇するため、酵素活性の低下により酵素反応性が悪く好ましくない。
【００３３】
本発明の使用態様では、医療従事者が診断用途で使用するだけでなく、患者本人が自己診断を行うために使用されることもある。したがって、測定場所として温度管理のされていない様々な雰囲気温度下で測定されることが予想されるが、本発明によれば、試験片に吸湿発熱性素材を用いることで、より酵素の至適温度に近づく温度で反応を行うことができ、測定精度向上につながるため有利である。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
なお明細中の物性評価は以下の方法で測定した。
【００３５】
（試験片作成方法）
繊維構造体（編物）から１ｃｍ２の試験片を作成した。酵素（グルコースオキシダーゼ３８Ｕとペルオキシダーゼ４６Ｕ）と色素（４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）６０μｇ及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナトリウム９０μｇ（ＴＯＯＳ））をバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ５０℃の熱風で１０分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３６】
（吸光度評価）
上記の方法で作成した試験片に１０μＬの１２０ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を滴下し、その反応状態を反射光測定装置（島津製作所社製クロマトスキャナー ＣＳ−９３００ＰＣ）によって、測定温度は２０℃で、光源としては１ｍｍ×５ｍｍで行い、色素のλｍａｘ＝５５５ｎｍの吸光度を滴下開始を０秒として１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒と１０秒毎の吸光度を測定した。また測定した吸光度は反応後の吸光度から反応前の吸光度を引き、酵素反応により変化した吸光度量を評価した。
【００３７】
（発熱評価）
上記の方法で作成した試験片１０μＬの１２０ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を滴下し、その反応状態をサーモグラフィー（ＮＥＣ Ａｖｉｏ赤外線テクノロジー社製赤外線サーモグラフィー装置 ＴＨ９１００）によって、滴下開始を０秒として０．１秒ごとの温度変化を測定した。なお測定条件は雰囲気温度を２７℃、１０℃、３７℃の３水準、湿度５０％として測定を行った。
また発熱量の評価については、Ｃ−８０熱量計（リガク社製）を用いて水分吸着熱を２５℃、ＲＨ８０．５％の条件で測定を行った。
【００３８】
（発熱時間）
上記の方法で測定した０．１秒ごとの温度測定結果から発熱が持続した時間を発熱時間とした。
【００３９】
（実施例１）
上記の方法で作成した試験片に１２０ｍｇ／ｄＬの濃度のグルコース水溶液１０μＬを試験片に滴下した。具体的な試験片の構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より７．５秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
なお、表１、表２および表４中の評価欄において、記号の表す意味は以下の通りである。
◎ 酵素反応を向上させる十分な発熱効果が見られた。
○ 酵素反応を向上させる発熱効果が見られた。
△ 発熱効果は見られたが不十分である。
× 発熱効果が見られなかった。
【００４０】
（実施例２）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４１】
（実施例３）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より５．３秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４２】
（実施例４）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を１０℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４３】
（実施例５）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を３７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４４】
（実施例６）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より３．５秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４５】
（実施例７）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より３秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４６】
（実施例８）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より２．８秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４７】
【表１】
【表２】
【表３】
【００４８】
（比較例１）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００４９】
（比較例２）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００５０】
（比較例３）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００５１】
（比較例４）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価より滴下開始より２．０秒間発熱されている結果が確認できたが、発熱効果は不十分であった。
【００５２】
【表４】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、生化学分析用試験片の酵素反応時に試験片自身が発熱するため使用温度の影響を受けにくく特に冬場など低温時に反応が促進され、安定した酵素反応性が得られ、精度良く測定可能な試験片を提供することができる。そのため糖尿病診断や様々な病気の診断時に測定精度の向上が可能になり、病気の予防や診断など産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分析用試験片に関する。更に詳しくは、血液、血液由来試料、その他生体由来試料の生化学分析をより正確かつ効率的に行うための、生化学分析用試験片の素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療の分野においてＰＯＣ（ポイントオブケア）が注目されている。ＰＯＣとは、患者の自宅での自己検査、病院でのベッドサイド検査や中央検査室以外での検査など、患者のそばで行われる若しくは患者本人が行う検査を意味するものであり、これにより、医師又は患者は検査結果を即座に知ることができるので、迅速な処置が可能になり、治療の質の向上に大きく役立つことが期待されている。
【０００３】
ＰＯＣ装置の一例としては、例えば自己血糖値測定装置（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ）が既に普及している。糖尿病の診断やその予防、治療には日々の血糖値を把握することが重要であり、患者が自ら血糖値を測定し自己管理することが推奨されるなか、数μＬの血液（全血）から簡便かつ迅速に血糖値を測定できるＰＯＣ装置は非常に有用である。このようなＳＭＢＧの例として、血液中のグルコースをグルコース酸化酵素等の酵素で反応させて発色させ、その発色の程度を吸光度によって検知してグルコース量に換算する方法（酵素比色法）を利用したものが用いられてきた。また近年では、血液中のグルコースをグルコース脱水素酵素等の酵素で反応させて電流を生じさせ、流れた電流値をグルコース量に換算する方法（酵素電極法）を利用したものが主流になっている。
【０００４】
一般に、酵素反応を用いた生化学分析の特徴として、酵素には至適温度が存在し、温度によって酵素活性に差が現れるため、温度間での測定精度に差が生じるという問題がある。多くの酵素はヒトの体温付近である３７℃付近が至適温度であり、酵素活性が高いと言われている。そのため外気温もしくは室内気温が低温での測定時には、酵素活性が低下し測定値にバラツキが生じるため精度が悪くなることは避けられない。
【０００５】
ＳＭＢＧを代表とするＰＯＣに用いられる検査機器は、主に日常生活やベッドサイドでの検査で用いられるため、想定される使用温度範囲が５℃から４０℃付近であり、この温度範囲で常に一定の精度の高い測定が求められている。
【０００６】
そこで、この問題を解決するために温度センサを搭載したＳＭＢＧが検討された（特許文献１）。しかしこの方法によれば、温度センサや様々な配線等の複雑な装置を必要とし、かつ測定と同時に測定時温度の検出を行い温度補正することが難しく、特に低温時の測定精度が十分ではなかった。
【０００７】
また低温での酵素特性を改良する試みもなされた（非特許文献１）。しかしながら、酵素の遺伝子改変が必要であり、低温での酵素活性の向上は容易ではなく、生化学分析に用いられる診断用酵素での改良は進んでいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１０３１７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． ２００８ Ｄｅｃ；２１(１２)：７２１−７．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ１４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、酵素反応を利用した生化学分析において、酵素反応の温度依存性、特に低温環境下における酵素活性の低下を小さくし、外気温環境による測定精度の変動を改善するための生化学分析用試験片を提供することにある。さらに、特に低温環境下での測定精度が改善された生化学分析用試験片を用いたＳＭＢＧ装置およびその他生化学自動分析ＰＯＣ用装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは鋭意検討した結果、酵素反応を行うための基材となる試験片に、吸湿作用により発熱する繊維素材を用いることにより、酵素反応時における試験片の温度を酵素の至適温度に近づけることができ、とりわけ低温環境下であっても安定した酵素反応が得られることにより測定精度が向上することを見出し、本発明を発明するに至った。本発明は、低温環境下における酵素反応の安定性を改良した生化学分析用試験片、本試験片を用いて生化学分析を行う生化学分析装置、および本試験片を用いて生化学分析を行う方法に関する。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（生化学分析用試験片）
（１）吸湿発熱性繊維を用いることを特徴とする、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。
（２）吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である、（１）に記載の生化学分析用試験片。
（３）吸湿発熱性繊維が吸湿発熱性アクリレート系繊維である、（２）に記載の生化学分析用試験片。
（４）吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である、（３）に記載の生化学分析用試験片。
（５）乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１００Ｊ／ｇ以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（６）乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１５０Ｊ／ｇ以上である、（５）に記載の生化学分析用試験片。
（７）酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、（１）〜（６）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（８）酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、（７）に記載の生化学分析用試験片。
（９）５℃〜４０℃の間で酵素反応を行うことを特徴とする、（１）〜（８）のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
（生化学試験片を用いて生化学分析を行う生化学分析装置）
（１０） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行うことにより生化学分析を行う、生化学分析装置。
（生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法）
（１１） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行う方法。
（１２） （１）〜（９）のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による生化学分析用試験片を用いることにより、広い温度範囲で酵素活性を上げることができ、より精度の高い測定結果を得ることができる。すなわち、室内気温環境下では、試験片が発熱することにより酵素の至適温度に近い温度で酵素反応を行うことができ、より正確な生化学分析を行うことができる。また、外気温環境下、とりわけ冬場や寒冷地における外気温環境下での使用に際しては、試験片の発熱により酵素反応が促進され、使用時の外気温度の影響を受けにくい。本発明により、低温環境を含むさまざまな温度環境に対して安定した測定精度を得ることができ、精度の高いＳＭＢＧもしくは生化学分析ＰＯＣ装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１〜８における、生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度変化を示すグラフ図である。
【図２】比較例１〜４における、生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度変化を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳述するが、これに限定されるものではない。
【００１６】
本発明による吸湿発熱性繊維とは、水分（湿気）を吸着することによっておこる凝集熱もしくは吸着熱を利用して発熱する繊維のことである。繊維が発熱する仕組みは、まず繊維のもつ官能基が吸着活性点となり空気中の水分子が引き寄せられ、化学結合等によって凝集もしくは吸着すると考えられている。そして空気中の水分子が繊維表面に凝集もしくは吸着した際に、全体的にエネルギーが上昇すると同時に自由運動していた水分子の運動エネルギーが熱エネルギーに変換されて発熱し、温度が一時的に上昇するものと考えられている。
【００１７】
吸湿発熱性繊維は、水分（湿気）を吸収することが知られている繊維であれば特に限定されない。このような吸湿発熱性繊維の種類として、動物性天然繊維、植物性天然繊維、化学合成繊維、再生繊維が挙げられる。動物性天然繊維としてはダウン、ウール、カシミヤ等の動物の体毛由来の繊維、絹等の動物生産性繊維構造体が例示され、動物の種類は特に限定されない。植物性天然繊維としては、綿花、麻由来の繊維が例示される。化学合成繊維としては、アクリル系合成繊維等の吸湿性を示す繊維が例示される。再生繊維とは、本発明では再生セルロース繊維を意図しており、木材やコットンリンターに含まれるセルロースを原料とし、化学処理を経てセルロースと同じ化学構造を持つ繊維に再生するものである。具体的には、レーヨン（ビスコースレーヨン）、ポリノジック、キュプラ（銅アンモニアレーヨン）、リヨセル（精製セルロース）が例示される。発熱量の点からは吸湿率の高い繊維が好ましく、ウール、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、絹、アクリル系合成繊維が好ましい。より好ましくはアクリル系合成繊維であり、アクリル系合成繊維のなかでも吸湿による発熱性を示すアクリレート系繊維（吸湿発熱性アクリレート系繊維）が更に好ましい。さらに、吸湿発熱性アクリレート系繊維の中でも、親水基を高密度で強架橋してなる化学変性体を有するアクリル酸系合成繊維が特に好ましい。アクリル酸系合成繊維の具体例としては、親水基であるカルボン酸を高密度で強架橋した化学変性体であるアクリル酸系合成繊維が挙げられる。
【００１８】
吸湿発熱性繊維の発熱量に関しては、特に限定されないが、酵素反応時の試験片温度を上昇させる目的から、１０μLの１２０ｍｇ／dＬグルコース水溶液を滴下し、C −８０熱量計を用いて水分吸着熱を２５℃、相対湿度（ＲＨ）８０．５％の条件で測定を行った場合の乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱量（発熱量）が１００J／ｇ以上であることが好ましい。より好ましくは１５０J／ｇ以上であり、さらに好ましくは４００J／ｇ以上である。特に好ましくは７００Ｊ／ｇ以上である。上限は特に規定されないが、通常１５００Ｊ／ｇ以下であり、好ましくは１０００Ｊ／ｇ以下である。吸湿発熱性繊維がアクリル酸系合成繊維である場合、相対湿度８０．５％、２５℃の条件の測定条件で、絹に比べ吸湿率及び吸着熱による発熱量が約１．６倍から約７倍以上であり好適に使用される。
【００１９】
吸湿発熱性繊維は、１種類の吸湿発熱性繊維のみで構成されていてもよいし、２種類以上の吸湿発熱性繊維を混合したものであってもよい。また、１種類以上の吸湿発熱性繊維と１種類以上の吸湿発熱繊維でない繊維との混合繊維であってもよい。複数の種類の繊維を混合して用いる場合、混合比率は適宜設定しうる。混合繊維は複数種のモノフィラメントの集合体でもよいし、マルチフィラメントにしてもよい。
【００２０】
吸湿発熱性繊維の繊度は特に限定されず、当業者が製造しうるものであればいずれであっても使用できる。また、繊維の使用態様は織物、編物、不織布状構造のいずれを使用することもでき、目付けや厚みは、酵素反応が妨げられず、十分な発熱量を得ることができる範囲であれば適宜設定しうる。
【００２１】
本発明における生化学分析用試験片とは、酵素反応により目的測定物を定量もしくは定性するための、高分子材料からなる反応基材であり、チップ、スライドもしくはストリップと呼ばれることもある。
【００２２】
本発明の生化学分析用試験片に用いられる生化学分析の方法としては、試験片に酵素と色素を少なくとも含み、測定対象検体試料の酵素反応量を色素の発色差により定性化もしくは定量化する酵素比色法を採用する方法と、試験片に酵素と補酵素やメディエーターおよび電極を含み、酸化還元反応による電子の移動により電流を測定して、定性もしくは濃度を定量化する酵素電極法を採用する方法がある。実際の生化学分析用試験片の使用においては、生化学分析用試験片が採用する方法に対応した測定機器を用いる。測定機器により差異があるが、本生化学分析用試験片を用いた代表的な生化学分析方法は、（１）生化学分析用試験片に検体試料を滴下し、次いで（２）該試験片を測定機器に装着し、（３）測定機器内で発光の検出もしくは電流の検出を行う。そして（４）機器内で測定値を演算により濃度に換算され、（５）測定結果が画面もしくは音声により通知される、という方法である。
【００２３】
本発明の生化学分析用試験片は、少なくとも酵素を含有する。含有するとは、乾燥状態において試験片の内部もしくは外表面に酵素が担持もしくは保持されている状態をいう。試験片に酵素を含有させる方法は種々あるが、例えば、酵素を含む溶液に試験片を含浸させ、自然乾燥もしくは温風乾燥させることにより試験片に酵素を固定させる方法により行うことができる。
【００２４】
本発明における酵素とは、基質から生成物を生成する化学反応の際に触媒作用の働きをするタンパク質のことである。酵素反応とは、酵素によって触媒される化学反応のことをいう。酵素によって触媒される反応としては、酸化反応、脱水素反応、エステル加水分解反応、ペプチド加水分解反応、リン酸化反応、脱リン酸化反応、合成反応、異性化反応が例示される。
【００２５】
本発明における生化学分析とは、生体由来の検体に存在する有機・無機化合物を測定するために行われる分析のことをいい、臨床検査に用いられる測定項目の分析を指しても用いられる。生化学分析が用いられる臨床検査としては、血液検査、尿・糞便検査等があり、本発明は、血液検査に属する生化学分析に好適に使用される。血液検査における生化学分析において本発明の生化学分析用試験片を用いることができる分析対象項目の例としては、血糖（グルコース）、ヘモグロビンＡ１ｃ、グリコアルブミン、インスリン、総タンパク質、アルブミン、コリンエステラーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ＝ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトラスフェラーゼ（ＡＳＴ＝ＧＯＴ）、γ−グルタミントランスペプチダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ビルビリン、アミラーゼ、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、総コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、尿酸がある。
【００２６】
生化学分析用試験片に含有される酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）が例示される。試験片にはこれらの酵素のうち１種類のみが含有されていてもよいが、２種類以上の酵素が含有されていてもよい。好ましくはグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１もしくは２以上の酵素であり、より好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼとペルオキシダーゼである。
【００２７】
本発明が利用される分野における実施態様の一つは、血糖（グルコース）を、酵素比色法を用いて分析するための生化学分析用試験片である。本実施態様における具体例の一例として、試験片には少なくともグルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼおよび色素が含有されている。血液検体が試験片に滴下されると、血液の血しょう内のグルコースにグルコースオキシダーゼが反応し、グルコースが酸化されてグルコン酸と過酸化水素を発生させる。次に、過酸化水素と色素の存在下でペルオキシダーゼが反応し、発色反応が起きる。この発色反応を試験片とは別の測定機器により測定し、血糖値が算出される。
【００２８】
本発明が利用される分野における実施態様の別の例は、血糖（グルコース）を、酵素電極法を用いて分析するための生化学分析用試験片である。本実施態様における具体例の一例として、試験片には少なくとも補酵素結合型グルコースデヒドロゲナーゼとメディエーターが含有されている。補酵素は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が例示され、メディエーターは、２，６−ジクロロフェノール・インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）またはフェロセンもしくはフェロシアンカリウムを使用できる。血液検体が試験片に滴下されると、血液の血しょう中のグルコースに補酵素結合型グルコースデヒドロゲナーゼが反応し、グルコースから脱水素反応が起こると共に、水素（プロトン）がメディエーターを介してＦＡＤをＦＡＤＨに還元する。この反応中の電子の流れを試験片に設けた電極を介して試験片とは別の測定機器により測定し、血糖値が算出される。
【００２９】
生化学分析用試験片は、１層構造からなるものと多層構造からなるものの双方を含む。１層構造からなる場合、試験片には酵素のほかに色素もしくは電極を含有させることがきる。加えて安定剤、ｐH調整剤、界面活性剤、その他の添加剤を含有させることができる。多層構造からなる場合、例えば酵素を含有し酵素反応が行われる層、色素もしくは電極を含む層を設けることができる。さらに、血液などの測定対象検体の展開を促進する展開層を設けても良い。各層には、さらに安定剤、ｐH調整剤、界面活性剤、その他の添加剤を含有させることができる。本発明による生化学分析用試験片が多層構造からなる場合において、少なくとも酵素を含有するとは、少なくとも１つの層に酵素が含有されていることを指す。
【００３０】
生化学分析用試験片が１層構造からなる場合、試験片は吸湿発熱性繊維のみからなる繊維構造体であってもよいし、吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体であってもよい。吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体の場合、検体（液体量）が一定の場合、吸湿発熱性繊維の使用混率が多いほど単位面積あたりの発熱量が多いため、吸湿発熱性繊維の使用混率は出来るだけ多いほうが好ましい。３０ｗｔ％含有する場合には試験片が約２℃発熱し、５０ｗｔ％で約３℃、７０ｗｔ％で約４℃の発熱が見られるため酵素反応を促進させることができる。３０ｗｔ％未満では発熱量が少なく温度上昇も少ないため好ましくない。したがって、吸湿発熱性繊維が３０ｗｔ％以上含まれることが好ましく、より好ましくは、５０ｗｔ％以上であり、さらに好ましくは７０ｗｔ％である。繊維構造体としては、織物、編物、不織布があげられ、織物の種類、編物の種類、不織布の種類は限定されない。
【００３１】
生化学分析用試験片が２層以上の多層構造からなる場合、少なくとも酵素を含有する層に吸湿発熱性繊維を含む繊維構造体が使用される。吸湿発熱性繊維を含む繊維構造体は、吸湿発熱性繊維のみからなる繊維構造体であってもよいし、吸湿発熱性繊維と非吸湿発熱性繊維との複数の繊維からなる繊維構造体であってもよい。酵素を含有する層以外の層においては、任意の繊維を用いた繊維構造体を使用することができる。また、最下層にはプラスチック材料を用いることができ、例えばＰＥＴフィルムを用いることができる。
【００３２】
本発明は使用環境が５℃〜４０℃の間で使用されることが好ましい。５℃未満の温度での使用は、吸湿発熱性繊維の発熱量が足りないため、酵素の酵素活性が低いままであり酵素反応性が悪く、好ましくない。また４０℃以上の温度では酵素活性が低下し、さらに吸湿発熱性繊維の発熱により温度が上昇するため、酵素活性の低下により酵素反応性が悪く好ましくない。
【００３３】
本発明の使用態様では、医療従事者が診断用途で使用するだけでなく、患者本人が自己診断を行うために使用されることもある。したがって、測定場所として温度管理のされていない様々な雰囲気温度下で測定されることが予想されるが、本発明によれば、試験片に吸湿発熱性素材を用いることで、より酵素の至適温度に近づく温度で反応を行うことができ、測定精度向上につながるため有利である。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
なお明細中の物性評価は以下の方法で測定した。
【００３５】
（試験片作成方法）
繊維構造体（編物）から１ｃｍ２の試験片を作成した。酵素（グルコースオキシダーゼ３８Ｕとペルオキシダーゼ４６Ｕ）と色素（４−アミノアンチピリン（４ＡＡ）６０μｇ及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン・ナトリウム９０μｇ（ＴＯＯＳ））をバッファー１０μＬ（５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ）に溶解し試薬を調整した。この試薬を繊維構造体へ含浸させ５０℃の熱風で１０分間乾燥させ生化学分析用試験片を作成した。
【００３６】
（吸光度評価）
上記の方法で作成した試験片に１０μＬの１２０ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を滴下し、その反応状態を反射光測定装置（島津製作所社製クロマトスキャナー ＣＳ−９３００ＰＣ）によって、測定温度は２０℃で、光源としては１ｍｍ×５ｍｍで行い、色素のλｍａｘ＝５５５ｎｍの吸光度を滴下開始を０秒として１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒と１０秒毎の吸光度を測定した。また測定した吸光度は反応後の吸光度から反応前の吸光度を引き、酵素反応により変化した吸光度量を評価した。
【００３７】
（発熱評価）
上記の方法で作成した試験片１０μＬの１２０ｍｇ／ｄＬのグルコース水溶液を滴下し、その反応状態をサーモグラフィー（ＮＥＣ Ａｖｉｏ赤外線テクノロジー社製赤外線サーモグラフィー装置 ＴＨ９１００）によって、滴下開始を０秒として０．１秒ごとの温度変化を測定した。なお測定条件は雰囲気温度を２７℃、１０℃、３７℃の３水準、湿度５０％として測定を行った。
また発熱量の評価については、Ｃ−８０熱量計（リガク社製）を用いて水分吸着熱を２５℃、ＲＨ８０．５％の条件で測定を行った。
【００３８】
（発熱時間）
上記の方法で測定した０．１秒ごとの温度測定結果から発熱が持続した時間を発熱時間とした。
【００３９】
（実施例１）
上記の方法で作成した試験片に１２０ｍｇ／ｄＬの濃度のグルコース水溶液１０μＬを試験片に滴下した。具体的な試験片の構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より７．５秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
なお、表１、表２および表４中の評価欄において、記号の表す意味は以下の通りである。
◎ 酵素反応を向上させる十分な発熱効果が見られた。
○ 酵素反応を向上させる発熱効果が見られた。
△ 発熱効果は見られたが不十分である。
× 発熱効果が見られなかった。
【００４０】
（実施例２）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４１】
（実施例３）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より５．３秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４２】
（実施例４）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表１に示す。また試験時の雰囲気温度を１０℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４３】
（実施例５）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を３７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より９秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４４】
（実施例６）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より３．５秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４５】
（実施例７）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より３秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４６】
（実施例８）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表２に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表３に示し、その吸光度変化を図１に示した。
表３および図１の吸光度測定結果から明らかな通り、吸光度上昇が確認され、酵素反応性が向上したことが示された。また発熱評価より滴下開始より２．８秒間発熱されている結果が確認できた。この結果から吸湿発熱性繊維の使用の効果により酵素反応が促進されていることがわかった。
【００４７】
【表１】
【表２】
【表３】
【００４８】
（比較例１）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００４９】
（比較例２）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００５０】
（比較例３）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価では発熱効果が見られなかった。
【００５１】
（比較例４）
試験片作成方法や試験方法は実施例１と同様に行った。試験片の素材構成については表４に示す。また試験時の雰囲気温度を２７℃で行った。
生化学分析用試験片への液体滴下時から液体滴下後６０秒までの吸光度の結果を表５に示し、その吸光度変化を図２に示した。
表５および図２に結果を示すとおり、実施例１〜８に比べ、時間経過に伴う吸光度の上昇はほとんど観察されず、本比較例に用いた繊維の使用によっては酵素反応性が向上しない結果となった。また発熱評価より滴下開始より２．０秒間発熱されている結果が確認できたが、発熱効果は不十分であった。
【００５２】
【表４】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により、生化学分析用試験片の酵素反応時に試験片自身が発熱するため使用温度の影響を受けにくく特に冬場など低温時に反応が促進され、安定した酵素反応性が得られ、精度良く測定可能な試験片を提供することができる。そのため糖尿病診断や様々な病気の診断時に測定精度の向上が可能になり、病気の予防や診断など産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸湿発熱性繊維を用いることを特徴とする、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。
【請求項２】
吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である、請求項１に記載の生化学分析用試験片。
【請求項３】
吸湿発熱性繊維が吸湿発熱性アクリレート系繊維である、請求項２に記載の生化学分析用試験片。
【請求項４】
吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である、請求項３に記載の生化学分析用試験片。
【請求項５】
乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１００Ｊ／ｇ以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項６】
乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１５０Ｊ／ｇ以上である、請求項５に記載の生化学分析用試験片。
【請求項７】
酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、請求項１〜６のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項８】
酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、請求項７に記載の生化学分析用試験片。
【請求項９】
５℃〜４０℃の間で酵素反応を行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行うことにより生化学分析を行う、生化学分析装置。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行う方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法。
【請求項１】
吸湿発熱性繊維を用いることを特徴とする、少なくとも酵素を含有する生化学分析用試験片。
【請求項２】
吸湿発熱性繊維がウール、再生セルロース繊維、絹、吸湿発熱性アクリレート系繊維およびこれらの混合物からなる群より選ばれる繊維である、請求項１に記載の生化学分析用試験片。
【請求項３】
吸湿発熱性繊維が吸湿発熱性アクリレート系繊維である、請求項２に記載の生化学分析用試験片。
【請求項４】
吸湿発熱性アクリレート系繊維がアクリル酸系合成繊維である、請求項３に記載の生化学分析用試験片。
【請求項５】
乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１００Ｊ／ｇ以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項６】
乾燥繊維１ｇ当たりの吸着熱（発熱量）が１５０Ｊ／ｇ以上である、請求項５に記載の生化学分析用試験片。
【請求項７】
酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、クレアチンアミドヒドロラーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、リパーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、および糖化アミノ酸オキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、請求項１〜６のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項８】
酵素が、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、糖化アミノ酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群より選ばれる１種もしくは２種以上の酵素である、請求項７に記載の生化学分析用試験片。
【請求項９】
５℃〜４０℃の間で酵素反応を行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の生化学分析用試験片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行うことにより生化学分析を行う、生化学分析装置。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて酵素反応を行う方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の生化学分析用試験片を用いて生化学分析を行う方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１８３０３４（Ｐ２０１２−１８３０３４Ａ）
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４８７８２（Ｐ２０１１−４８７８２）
【出願日】平成２３年３月７日（２０１１．３．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月７日（２０１１．３．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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