生物学的インジケータ
試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるように設計された処理プロセスを検証するための生物学的インジケータに、キナーゼが使用される。指標は、滅菌処理の検証に使用され得る。ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成は、ルミノメーターでルシフェリン／ルシフェラーゼシステムを介して測定される。Sulfolobus acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼは、伝染性海綿状脳症因子を不活性化するための手順の検証に特に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、熱による不活性化プロセスおよび不活性化手順を含むプロセスの検証、およびより詳細には、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子を不活性化する手順の検証に適した生物学的インジケータに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）は、人口１００万人当たりに約１症例の頻度で家族性、散発性、または医原性疾患のいずれかとして現れる、比較的に稀な形態のヒト神経変性障害である。主に若年群でのそしておそらくウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）感染肉製品の摂取に起因する、この疾患の新規変異体形態（ｖＣＪＤ）の出現は、症例数が大いに増大する可能性を引き起こした。これらの要因は、公衆衛生への重要な影響を有する。１９８０年代後半の間に、英国人口の大部分が、食品を介してこの疾患に曝露された可能性がある。これまでの症例数は比較的低かった（２００４年２月までに149症例）が、全てのＣＪＤ形態から、他の伝染経路（外科手術、移植、輸血、または汚染された医薬製品を含む）を介する重大な危険性が残されている。これらの経路のいくつかは、臨床環境でのこの疾患の医原性の蔓延の際に示され、他は、動物モデルで定義された。
【０００３】
ヒトにおいて全てのＣＪＤ形態を引き起こす原因となる因子は、標準的な方法による不活性化に対して非常に耐性がある。手術器具の汚染除去のために検証済みの方法が緊急に必要とされている。種々の処理（化学処理、ならびに湿潤または乾燥加熱での高温および高圧の使用を含む）が試験されているが、いずれも十分ではない［Taylor, D.M., (1999), Principles and practice of disinfection, preservation and sterilisation. (Russell, A.D., Hugo, W.B.およびAyliffe, G.A.J., 編):222-236頁, Blackwell Scientific Publications, Oxford；Taylor, D.M., (2001) Contrib Microbiol. 7, 58-67；Taylor, D.M., Fernie, K, Steele, P.J., McConnell, I.およびSomerville, R.A., (2002) J Gen Virol. 83,3199-3294］。焼却が有効であるが、原料または装置の回収または再利用ができなくなる。高濃度の水酸化ナトリウム（２Ｍまで）または高レベルの次亜塩素酸ナトリウム（20000ppmまで）の使用は、ＴＳＥ因子のレベルを有意に減少させることが示されているが、手術器具に有害な影響を有しており、そして術者にとって有害であり得る。手術器具についてＴＳＥ因子を不活性化する手段として、広範に種々の他の方法が提案され、現在開発中である。これらには、蒸気相過酸化水素、オゾン、およびエチレンオキサイドを含む種々の気相滅菌剤が含まれる。他の方法は、慣用的な滅菌前の特定の抗ＴＳＥ前処理として提案されており、そしてこれらには、規定のｐＨおよび温度条件下で熱安定性プロテアーゼを用いる手術器具の処理が含まれる。
【０００４】
Bacillus stearothermophilus胞子の不活性化は、オートクレーブの正確な性能を検証するために慣用的に用いられる方法である。このようなインジケータは、細菌またはウイルスがそのプロセスによって不活性化されたという関連の指標を表し得、このプロセスでは、通常、１０６の桁で感染性因子のレベルを減少させることが検証される。しかし、ＴＳＥ因子の独特の安定な特性は、このような因子を不活性化するというプロセスの性能の関連した指標を提供するために、ずっとより強健なインジケータが必要であることを意味する。
【０００５】
熱安定性胞子または酵素調製物に基づく他の生物学的インジケータは、当業者に周知である。全てが、それらが活性の１０６減少を超えた感染性因子の不活性化を検証することができないという欠点を有する。
【０００６】
ＴＳＥ因子の不活性化はまた、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）感染材料の処分のために、および動物起源の原料の調製に際して重大な問題である。現在、ＢＳＥの出現および蔓延が、高感染性神経組織が肉骨粉補給を介してウシにフィードバックされるレンダリング実践の変化によるものであったという有効な科学的証拠がある。ほぼ確実には汚染牛肉製品を食べた結果、ＢＳＥがｖＣＪＤの原因となったという有効な証拠もある。この理由のために、ＢＳＥで死んだウシは、現在、全てのウシに由来する脊髄および脳組織と共に、食物連鎖から排除され、代替経路によって処分される。これは、現在、莫大量の動物廃棄物が蓄積されつつあるか、または焼却によって処分されつつあるという結果を有する。熱安定性プロテアーゼによるこのような材料の処理は、１つの可能な解決である。また、いかなる感染材料も適切なプロセスで破壊されることを確実にする検証手順の必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、代替のおよび／または改善された生物学的インジケータおよびそれらの使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の第一の局面では、キナーゼを含む、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータが提供される。好ましい実施態様では、インジケータは、さらに固体支持体を含み、キナーゼは、この固体支持体中に固定化されているか、または固体支持体上に固定化されている。特に好ましい実施態様では、キナーゼは熱安定性キナーゼである。
【０００９】
本発明の使用に際して、生物学的インジケータは、潜在汚染物（特に感染性因子）の含有量を減少させることを意図する処理に供せられる試料中に含有される。この処理によるインジケータであるキナーゼの活性の減少が、汚染物の量または活性の減少と相関させられ得ることは、事前の試験から知られている。汚染物の量／活性が受容可能なレベル以下に減少したか否かを決定するために、インジケータであるキナーゼの活性が、処理の前および後、または処理の間に測定される。汚染物における受容可能な減少と相関することが知られる活性のレベルに達すると、その処理は検証されたとみなされる。汚染物が感染性因子である場合、試料は無菌であるとみなされ得る。
【００１０】
本発明の特定の使用に際して、熱安定性キナーゼは、清浄または不活性化の手順後の因子（例えば、感染性因子）の存在可能性を示す方法におけるレポーターである。まず、熱安定性アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼを含有する試料を、清浄／不活性化手順（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度の１つ以上）に曝露する。次の工程は、熱処理、例えば、６０〜８０℃で少なくとも１０分間（すなわち、熱安定性キナーゼに顕著に影響しない条件下）によって、いかなる汚染の酵素活性も除去することである。次いで、熱安定性キナーゼを、３０℃と７０℃との間の温度で基質（例えば、ＡＤＰ）と反応させて、ＡＴＰを生成させる。ＡＴＰの形成は、２０〜３０℃で１０分〜１時間の間、ルシフェリン／ルシフェラーゼおよび適切なルミノメーターを用いる生物発光検出によって測定され得る。ルミノメーターからの読み取り値によって、残余キナーゼ活性（すなわち、清浄／不活性化処理への曝露後のキナーゼの活性）の読み取り値が与えられる。以前に別の実験から得られたデータに基づいて、この方法は、残余キナーゼ活性と、処理した試料内の感染性因子の存在可能性とを相関させることにより完了される。
【００１１】
１つの実施態様では、試料中の汚染酵素活性またはＡＴＰが、インジケータの添加前に、初期処理工程（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度）によって除去され得る。
【００１２】
キナーゼ酵素は、非常に広い範囲にわたって検出可能であるシグナルを生じ得ることが分かっている。一般に、キナーゼは、ＡＤＰを含む基質を用いて検出される。ＡＤＰは、ＡＴＰに変換され、ＡＴＰはそれ自体、例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼを用いて発光に用いられ、発光はルミノメーターを用いて検出される。この広範な範囲のために、キナーゼはその量／活性が多対数減少した後であっても検出可能なままであるので、インジケータは、検証のために特に適したものとなる。無菌性に関して、ほとんどの国立研究所は、無菌性が検証され得る前に、生物学的因子の量または活性の６対数減少が必要であるとみなしている。本発明のキナーゼは、因子の量または活性の減少が６対数を十分に超えて８対数以上であることを検証する可能性を与え、したがって、現時点で与えられているモニタリングの範囲を増大させる。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様では、キナーゼは熱安定性であり、したがって高温で実施されるプロセスの検証に用いるのに適している。熱安定性キナーゼはまた、他の極限的な環境に対して耐性であることが分かっており、そして例えば、ｐＨの極値に対して耐性であり、そしてタンパク質分解酵素への曝露に対して耐性であることもしばしば分かっている。そこで、本発明のキナーゼは、高ｐＨ、高温、およびプロテアーゼの１つまたは組み合わせまたは全部を用いる生物学的因子の処理のモニタリングに用いられ得る。
【００１４】
熱安定性であるとは、７０℃で３０分間の曝露後に、キナーゼの活性の少なくとも９５％が保持されていることを意味する。本発明の好ましい酵素は、非常に熱安定性であり、そして１０分間８０℃へ加熱した後に少なくとも９５％の活性を保持する。中温性生物由来のキナーゼおよび種々の好熱性生物、例えば、Bacillus stearothermophilus（生物学的インジケータとして広範に使用される）由来のキナーゼさえもこれらの基準に適合しないが、それにも関わらず、より低い温度で実施される処理のためのインジケータとして適切であり得る。
【００１５】
本発明の特定の実施態様で使用されるキナーゼは、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼ、またはそれらの組み合わせである。さらに、これらのアデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼの酵素は、Pyrococcus furiousus、P. abyssi、P. horikoshii、P. woesii、Sulfolobus solfataricus、S. acidocaldarius、S. shibatae、Rhodothermus marinus、Thermococcus litoralis、Thermatoga maritima、Thermatoga neapolitana、およびMethanococcus spp.から得られ得る。アデニル酸キナーゼは、特に特に好ましく、そして以下に詳述する本発明の実施例において使用されている。キナーゼは、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒し、次いで、このＡＴＰは、公知の方法および試薬を用いて容易に検出される。本発明に適した特定のキナーゼは、配列番号１〜３０に記載される。
【００１６】
ＡＴＰ生物発光検出は、キナーゼ活性を検出する好ましい手段である。標準的なルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ方法は、10-15モル程度の少ない量のＡＴＰも検出し得る。酵素的増幅を生物発光検出方法と組み合わせることにより、10-2０モル程度の少ないキナーゼも検出することが可能である。したがって、このタイプのフォーマットは、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）に連結した結合種を用いる分子の検出に顕著な感度を与える。
【００１７】
生物発光検出を組み合わせたキナーゼ（例えばＡＫ）の使用は、いくつかの他の顕著な利点を有する。このアッセイは、他の匹敵するアッセイフォーマットに比べてよりずっと大きな範囲にわたって、酵素活性と光生成との間の直接的な関連を与える。したがって、伝統的なレポーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を用いるアッセイは５〜６対数希釈で比例応答を与えるが、ＡＫ−ルシフェラーゼアッセイは、少なくとも８対数のダイナミックレンジを提供し得る。直接的なインジケータとして、これは、標準の６対数範囲よりも大きな不活性化のレベルを必要とするプロセスにとって特に有用になる。なぜなら、そのシグナルが、アッセイの全範囲にわたって意味があるものになり得るからである。このようなことは、他のアッセイフォーマットを用いても可能ではない。これは、より悪い場合の筋書きで、８対数もの多くの感染度が手術器具の表面に存在する場合のＴＳＥ不活性化に特に関連し、これは、１ｍｇ当たり１０８ＴＳＥ感染単位までのレベルで１ｍｇの脳組織が存在すると仮定される。これらの状況下で、本発明のインジケータは、８対数範囲のシグナルを提供する場合に特に有益である。
【００１８】
ＴＳＥインジケータが必要とされるプロセスのタイプを考慮すると、熱的および物理的の両方について高レベルの安定性が好ましい。以下の実施例において、好熱性生物由来のＡＫ酵素の範囲の特性を比較した。インジケータ株であるB. Stearothermophilusのような好熱性生物由来のＡＫでさえも、比較的に低い温度ではそれらの活性の大部分を喪失する。例えばオートクレームサイクルに含まれるキナーゼベースのインジケータのために、例えば、Sulfolobus種またはPyrococcus furiosus由来の酵素によって示されるような有意により大きな熱安定度が、使用される。
【００１９】
熱不活性化に対する酵素（例えば、キナーゼ）の安定性を増大させる多数の添加剤および処方変更は、当業者に公知である。本発明の実施態様で使用される熱安定性キナーゼは、それらが既にこのタイプのプロセスに用いられる他の酵素よりも有意に安定である場合、安定性をあまり必要としない。本明細書中に記載のＡＫ酵素、特にSulfolobus acidocaldarius、S. solfataricus、S. shibatae、Pyrococcus furiosus、Rhodothermus marinus、およびThermococcus litoralis由来のＡＫ酵素は、８０℃と９０℃との両方で、Bacillus stearothermophilusのようなプロセス滅菌のインジケータとして通常使用される生物由来の酵素に比べてさえも顕著に安定である。多くの場合、固体支持体上に安定化されたこれらのＡＫ酵素は、例えばオートクレーブ滅菌、低温殺菌、または等価の殺菌後に測定される必要な範囲の活性を提供するために、さらなる安定化を必要とし得ない。
【００２０】
安定化剤（例えば、４Ｍの濃度までのソルビトール、または２Ｍまでの濃度のエチレングリコール、グリセロール、もしくはマンニトールのような他のポリオール）の添加により、酵素の熱安定性が改善され得る。他の添加剤（例えば、キシラン、トレハロース、ゼラチン）もまた、個別または組み合わせでのいずれかで、さらなる安定化効果を提供し得る。種々の二価金属イオン（最も著しくはCa2+、Mg2+、またはMn2+）の添加によっても、酵素の安定性は改善され得る。
【００２１】
酵素の化学的改変もまた、それらの熱安定性を改善するために使用され得る。グリオキシル酸による表面露出したアミノ基の還元アルキル化（例えば、Melik-Nubarov (1987) Biotech letts 9: 725-730）、タンパク質表面への糖質の付加（例えば、Klibanov (1979) Anal. Biochem. 93: 1-25）、およびアミド化（例えば、Klibanov (1983) Adv. Appl. Microbiol. 29: 1-28）は全て、酵素の安定性を増大させ得る。酵素固定化のための化学架橋剤の使用および種々の重合支持体の使用を含むさらなる方法もまた、酵素の熱安定性を増大させるのに関連した方法である（Gupta (1991) Biotech. Appl. Biochem. 14: 1-11に概説される）。
【００２２】
同様の改変はまた、過酸化水素またはオゾンのような他の滅菌プロセスに対するインジケータの安定化にも関連している。特に、酵素への気相滅菌剤の接近が制限されるプロセス（例えば、適切なポリマー中のカプセル化またはガスの透過を減少させる添加剤を用いた処方による）は、必要に応じて酵素の安定化を増大させるために有用な方法を提供する。
【００２３】
酵素の熱安定性を増大させるのに有効である処理の多くはまた、プロテアーゼ処理のための、例えば、プロテアーゼ処理によるＴＳＥ因子の有効な不活性化についてのインジケータの開発のための安定化にも関連している。一般に、高レベルの熱安定性を示すタンパク質は、変性またはプロテアーゼ処理のような分解プロセスに対しても高度の安定性を示すと考えられる（例えば、以下を参照のこと：Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP, 「A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis」, Biochem J. 1982 207: 641-4；Rees DC, Robertson AD, 「Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins」, Protein Sci. 2001 10: 1187-94；Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG.「Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity」, Enzyme Microb Technol. 2000 27: 11-18；Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC.,「Protein thermostability in extremophiles」, Biochimie. 1998 Nov; 80 (11): 933-41；およびLiao HH.,「Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents」, Enzyme Microb Technol. 1993 Apr;15 (4):286-92）。したがって、熱安定性キナーゼは、一般に、ＴＳＥ因子を不活性化するように設計されたプロテアーゼ処理による作用に対して、等価の中温性キナーゼよりも高度の安定性を示す。用いたプロセスのタイプに依存して、キナーゼは、プロセスの他の特徴に有利であるようにも選択され得る。したがって、酸性ｐＨでのプロテアーゼ処理がS. acidocaldariusまたはS. solfotaricusのような好酸性生物に由来するキナーゼを使用するのに対し、アルカリ性ｐＨでのプロテアーゼ処理のためには、このプロトコルは、P. furiosusのような中程度に好アルカリ性の生物に由来する熱安定性キナーゼを使用する傾向がある。
【００２４】
プロテアーゼ処理に対するキナーゼインジケータの安定性を改善するために必要であれば、多くの他の選択肢が存在する。これらの多くは、熱処理に対する酵素の安定化について上述したものと同じである。
【００２５】
例えば、ソルビトール、マンニトール、または他の複合ポリマーを含有する処方物は、インジケータ表面上での酵素の不活性化のレベルを減少させる。さらに、プロテアーゼ基質が分解される速度を特異的に減少させる処理は、この適用に特に関連している。例えば、プロテアーゼの代替基質として作用する適切なキャリアタンパク質（例えば、カゼインまたはアルブミン）を約10mg/ml（インジケータの好ましい濃度に比べて10倍過剰）までで含有する溶液中のキナーゼの処方物は、キナーゼインジケータの消化の速度を特異的に減少させる。同様に、処方物への遊離アミノ酸（例えば、グリシン、チロシン、トリプトファン）またはジペプチドの添加は、酵素の基質レベル阻害の手段を提供し、キナーゼインジケータの局所的な不活性化を減少させる。
【００２６】
本発明は、生物学的インジケータとして使用するための、細菌での組換え発現による種々の熱安定性キナーゼの生産のための方法をさらに提供する。
【００２７】
酵素の遺伝的改変は、熱安定性の顕著な増大を提供することが示されており、そして類似性により、このような変異はまた、他のプロセス（例えば、プロテアーゼ処理または気相「滅菌」）におけるインジケータ酵素の安定性を顕著に増大させると考えられている。三量体（古細菌）ＡＫの規定の三次元構造（Vonrheinら(1998) J. Mol. Biol. 282:167-179およびCriswellら (2003) J. Mol. Biol. 330:1087-1099）と取得した図１に示すキナーゼ酵素の熱安定性との比較により、酵素の安定性に影響するアミノ酸が同定された。
【００２８】
改善された熱安定性を示すキナーゼの遺伝子操作改変体もまた、本発明により提供され、そして本発明において使用され、そして多数の方法で生成され得る。本質的には、これらは、三量体分子の中央コアのパッキング領域の部分を形成すると考えられるアミノ酸の特定の部位特異的変異誘発、およびランダム「定方向進化」法（分子全体が、改善された特性を有する分子の変異誘発および選択／スクリーニングの引き続くラウンドに供せられる）を含む。本明細書中（例えば、実施例８〜１０）で概説した改変は、コンセンサスベースのアプローチを用いるハイブリッドアプローチに基づいて、構造上関連した分子間で観察された差異に基づく酵素の熱安定性に影響すると考えられる領域が決定される。この後、規定の変更を行って最良の熱安定性と相関するアミノ酸が組み込まれるか、あるいはランダム置換を行って、熱安定性に必須であることが決定された位置に全ての利用可能なアミノ酸が組み込まれる。
【００２９】
本発明の特定の改変酵素は、実施例８〜１０に記載の種々の改変体であり、そして、配列番号１７〜１９に集合的に表される（いくつかの改変体は各参照によって包含される）。
【００３０】
生物学的インジケータは、試料が処理される容器中での使用に適合され得る。例えば、インジケータは、固体支持体を含み、この固体支持体はマトリックスであり、そしてキナーゼがこのマトリックス内に分散されている。このマトリックスは、プロセス条件に対して耐性であるべきであり、そしてプロセスからのキナーゼの保護を提供するように補助し得る。これにより、インジケータに幾分かの安定化が提供される。キナーゼは、ポリマーマトリックス内に局在され得る。支持体は、処理容器中に突き出るように、または該容器に付加されるように設計され得、そしてインジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズであり得る。
【００３１】
種々の処方物中に化学的改変を有するかまたは有さず、そして１つ以上のキナーゼインジケータを有する種々の固体支持体が、例えば、検証されるプロセスの要件に依存して、本発明によって包含される。１つの形態では、支持体は、プラスチック、セラミック、スチール、または他の金属もしくはポリマーの表面であり、その上には、キナーゼが固定化の手段として乾燥されている。支持体は、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはポリプロピレンのストリップまたはディップスティックであり得、おそらく平坦な表面を有し、その上にキナーゼが塗布されている。キナーゼの付着のために多孔質の表面を有するさらなるタイプの支持体もまた、ガス状プロセスのためのインジケータとして特に有用である。キナーゼをコーティングしたプラスチック、金属、またはセラミックのビーズもまた、インジケータに有益なフォーマットを提供し得、これらもまた、特にガス状プロセスをモニタリングするのに適している。このような支持体は、インジケータの付着のための顕著に大きな表面面積を提供するため、特定の適用に対しては固体支持体を超える利点を有する。
【００３２】
ＴＳＥ不活性化プロセスの検証のために案出されたデバイスの特定の例について、ロッド、ディスク、またはクーポンのようなスチール表面は、手術器具の汚染除去のための有効なインジケータである。熱安定性アデニル酸キナーゼの結合は、例えば、疾患関連プリオンイソ型の凝集形態（ＰｒＰＳｃ）の非常に良好なモデルであり、したがって、ＰｒＰＳｃと手術用スチールの表面との相互作用の顕著に良好なインジケータを提供する。
【００３３】
インジケータの支持体上または支持体へのキナーゼの結合は、表面にタンパク質を連結させるために慣用的に使用される方法、例えば、約pH9.6の0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液中で室温にての約１時間のタンパク質のインキュベーションによって達成され得る。あるいは、タンパク質は、当業者に知られる広範な範囲のカップリング化学法を用いて、表面に共有結合される。例えば、ＳＰＤＰ（Pierce chemicals；製造者の指示を用いる）で誘導体化し、ＤＴＴで還元して架橋用の遊離スルフヒドリル基を提供したアデニル酸キナーゼが、マレイミド表面を有するポリスチレン支持体に共有結合される。このようなスルフヒドリル結合表面を有するプラスチック表面は、文献に十分に記載されている。このカップリング方法のさらなる利点は、必要に応じて、例えば、ＤＴＴまたはＭＥＳＮＡでの還元によって酵素が支持体から切断され得、アッセイがインジケータ支持体とは別に実施できるようになることである。アデニル酸キナーゼ酵素および本発明によって記載される他のインジケータキナーゼは、誘導体化およびそのような支持体への架橋の際にそれらの活性が保持されるという特性を有する。
【００３４】
あるいは、ポリスチレンまたはポリカーボネートの支持体上のアミン反応性表面が、二官能基型の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドモノマー）と共に使用されて、タンパク質上の遊離アミン基を介するキナーゼの直接的な非切断性の架橋を提供する。ＵＶ処理もまた、適切な支持体にインジケータを直接的に連結させるために使用され得る。スチール表面は、インジケータキナーゼの共有結合付着を媒介するために、プラスチック表面と同様の方法で処理され得る。
【００３５】
広範に種々のタンパク質架橋試薬は、Pierce chemical company (Perbio)のような企業から入手可能である。スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、およびカルボキシル基に対して反応性の試薬が、タンパク質のカップリングのために設計されるが、それらは、天然に反応性であるかまたはコーティングされたかのいずれかの固体支持体（例えば、プラスチック、他のポリマー、ガラス、および金属）へタンパク質を架橋するためにも同等に使用され得る。反応性の化学物質もまた、糖質に酵素を架橋させるために利用可能である。例えば、試薬ＢＭＰＨ（N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA）、ＫＭＵＨ（N-[k-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド）、およびＭＰＢＨ（4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド塩酸塩）が、システイン残基の形態、またはスルフヒドリル反応基を生成するように還元された化学誘導体化タンパク質の形態のいずれかで遊離スルフヒドリルを含むキナーゼを、糖質に架橋させるために使用され得る。これは、固体支持体に特に重要であり得、固体支持体は、複合糖質（例えば、紙、セルロースベースの膜、ゲルまたは樹脂）であるか、または適切な反応性の表面を生成するように糖質溶液でコーティングまたは処理され得る。
【００３６】
支持体の各タイプについて、キナーゼは、好ましくは、結合を増強する、および／または結合したタンパク質を安定化させる溶液中に処方される。このような処方物としては、スクロース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を10%(w/v)までで含有する溶液が挙げられる。さらに、キナーゼは、適切な支持体の表面または内腔に塗布されるゲルの一部として処方され得る。例としては、アルギン酸マトリックス、寒天マトリックス、またはポリアクリルアミドマトリックスが挙げられる。
【００３７】
インジケータはまた、キナーゼを安定化させる薬剤を含み得、そして適切な安定化剤は、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される。
【００３８】
インジケータの使用を容易にするために、それは、インジケータを表面に取り付ける手段をさらに含み得、そのような手段は、例えば、ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって支持体を表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部である。
【００３９】
本発明の特定の実施態様では、精製したキナーゼ、例えば、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）が、１mg/mlまでの濃度で処方され、そして固体支持体上にコーティングされる。好ましくは、1〜2mg、または0.5〜1mg、または0.1〜0.5mg、または0.1mgのキナーゼが、固体支持体上にコーティングされる。プロテアーゼ処理のために、キナーゼは、マイクロタイタープレートと同様にポリプロピレン、ポリカーボネート、またはポリスチレンの表面上で乾燥され得る。１２１℃にて１５〜２０分間の標準的なオートクレーブ滅菌または１３４℃にて１８分間の「プリオンサイクル」オートクレーブ滅菌のいずれかについては、ステンレススチールのような熱安定性支持体が使用され得る。過酸化水素またはオゾンのような気相不活性化手順については、ポリカーボネート固体支持体が使用され得、そしてまた必要に応じて、不活性化剤に対してより大きな耐性を提供するように、多孔質マトリックスとしても製造され得る。
【００４０】
好都合な固体支持体は、不活性化手順から、必要なアッセイ成分全てを含むチューブに直接移されるディップスティックの形態をとる。これは、食品産業および製薬産業で既に市販されている種々の「迅速読み取り」衛生モニターの１つに取り付けられたチューブ用ルミノメーターであり得る。あるいは、それは、当のインジケータ用に設計された特殊な装置の形態をとり得、熱安定性酵素により要求される至適温度を維持することが特に強調される（実施例２４を参照のこと）。
【００４１】
本発明はまた、生物学的因子の異なるのレベルの不活性化後に検出可能な、複数の酵素を含む生物学的インジケータを提供する。１つの実施態様の生物学的インジケータは、支持体、第一の位置に配置された第一の酵素、および第一の位置とは離れた第二の位置に配置された第二の酵素を含む。第一の酵素および第二の酵素は共に、生成物を基質に変換する際に活性を有し、そして初期期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、両酵素の活性が検出され得る。後続期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第一の酵素の活性は検出され得ないが、第二の酵素の活性は検出され得る。第二の後続期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第二の酵素の活性は検出され得ない。
【００４２】
この実施態様の利点は、インジケータを用いることにより、正確に測定が行われる必要なく、プロセスによって達成される生物学的因子のおよその不活性化のレベルを示し得ることである。したがって、例えば、両酵素とも検出可能である場合、これは、不活性化が特定の閾値に達していないことを示し得る。第二の酵素のみが検出され得る場合、これは、第一の不活性化閾値には達しているが、第二の閾値は達していないことを示す。最後に、両酵素とも検出され得ない場合、これは、不活性化が第二の閾値を通過したことを示す。第一の酵素が６対数までの活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素が８対数までの活性の減少で検出可能である場合、両方の酵素を検出できることは、不活性化が６対数に達していないことを示し、第二の酵素のみを検出できることは、不活性化が６対数と８対数との間まで減少したことを示し、どちらも検出できないことは、少なくとも８対数の活性の減少が達成されたことを示す。
【００４３】
第一の酵素は、適切には、５対数と８対数との間までの活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素は、適切には、６対数以上の活性の減少で検出可能である。第一の酵素は、好ましくは、６対数と７対数との間の活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素は、好ましくは、７対数と８対数との間の活性減少で検出可能である。生物学的インジケータは、（第一の位置および第二の位置とは離れた）第三の位置に配置された第三の酵素をさらに含み得、第二の後続期間について生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第三の酵素が検出され得、そして第三の後続期間について生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第三の酵素は検出され得ない。第三の酵素は、適切には、８対数以上の活性の減少で検出可能である。
【００４４】
異なるレベル処理（例えば、異なる曝露時間）で検出可能である複数の酵素を有するこのタイプの生物学的インジケータを用いて、不活性化経過の進行は監視され得、その終点が容易に予想され得る。
【００４５】
多酵素インジケータの好ましい酵素は、キナーゼであり、より好ましくは熱安定性であり、そしてより好ましくは、本発明の他の実施態様に関連して本明細書中に開示および記載されているものである。
【００４６】
本発明の第二の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証する際に用いられるキット（必要に応じて、携行用キット）が提供され、このキットは、
（ｉ）本発明の第一の局面による生物学的プロセスインジケータ、および
（ii）キナーゼに対する基質
を備える。
【００４７】
キナーゼ量／活性の測定を実施するために、キットは、ＡＴＰを検出する手段（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼ）および必要に応じてルミノメーターを備え得る。基質は、好ましくは、ＡＤＰである。
【００４８】
公知の生物学的因子を用いた以前の試験から、生物学的因子の量または活性の減少とキナーゼ活性とを相関させるデータが作成され得、したがって、キットは、キナーゼ活性と一連の記載の生物学的因子の量または活性の減少との相関を示す、１つ以上の照合表もまた備え得る。好ましい実施態様では、キットは、ＴＳＥ不活性化のモニタリング用である。
【００４９】
本発明の第三の局面では、処理プロセスを検証する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
（ii）試料を、規定量のキナーゼの存在下で処理に供する工程であって、この処理が、生物学的因子の量または活性を減少させる、工程；
（iii）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
（iv）残余活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、またはキナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ処理条件下での生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む。
【００５０】
このような情況では、キナーゼは、本明細書中に記載のキナーゼの任意の１つであり得、および／または本明細書中に記載のキナーゼの特性のいずれかを有し得る。好ましくは、キナーゼは、本発明の第一の局面によるインジケータとして処方される。
【００５１】
試料は、一般に、いかなるキナーゼも存在することなく提供される。そこで、この方法は、生物学的因子を含むと考えられる試料を得る工程、および規定量のキナーゼを添加する工程を包含し得る。この因子は全く存在しないこともある（しかし好ましくは、試料は、生物学的因子を含むことが知られている）。検証の論点は、処理を行った後、存在していたはずである因子が、受容可能な程度に除去／不活性化されたことが確認されることである。
【００５２】
代表的には、操作者は、試料を処理する前および試料を処理した後にキナーゼ活性を測定する。また、キナーゼ活性についてアッセイする前に、夾雑する（通常、中温性の）キナーゼが試料中に入り込んでいることもあり得る。したがって、試料に添加されるキナーゼは熱安定性であり、そしてアッセイ工程は、残余キナーゼ活性を測定する前に、（例えば、７０℃で少なくとも３０分間、好ましくは８０℃で少なくとも１０分間試料を処理することにより）中温性のキナーゼを不活性化する工程を含むことが好ましい。
【００５３】
好ましい実施態様では、キナーゼは、処理前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に、１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも10,000,000相対発光量（ＲＬＵ）、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも8,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも5,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも3,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも1,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも500,000ＲＬＵの活性を有する。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、所定のキナーゼ活性は、１ｍｇキナーゼ当たり10,000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり500ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり250ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり100ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり10ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり0ＲＬＵである。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼ活性の１対数減少、または２対数減少、または３対数減少、または４対数減少、または５対数減少、または６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に等しいかそれより大きい。
【００５６】
他の実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼの量または濃度の少なくとも６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に相当する。さらなる実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、少なくとも800,000ＲＬＵ、または少なくとも900,000ＲＬＵ、または少なくとも950,000ＲＬＵ、または少なくとも990,000ＲＬＵ、または少なくとも999,000ＲＬＵ、または少なくとも999,900ＲＬＵ、または少なくとも999,990ＲＬＵ、または少なくとも999,999ＲＬＵの減少に相当する。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様では、試料中の生物学的因子の量または活性の確認された減少は、少なくとも６対数、好ましくは少なくとも７対数、より好ましくは少なくとも８対数、最も好ましくは少なくとも９対数である。
【００５８】
特に好ましい実施態様では、残余キナーゼ活性またはキナーゼ活性の減少が、少なくとも６対数、または少なくとも７対数、または少なくとも８対数、または少なくとも９対数の生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、処理が続けられる。
【００５９】
本発明の第四の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性の減少と、本発明の第一の局面によるインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）規定量の生物学的因子を含有する試料および規定量のキナーゼを含有する試料を調製する工程；
（ii）試料を処理に供する工程；
（iii）キナーゼの残余活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；
（iv）生物学的因子の残余量または活性を測定し、そして必要に応じて、生物学的因子の量または活性の減少を算定する工程；
（v）処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（v）を繰り返す工程
を含む。
【００６０】
一実施態様では、生物学的因子およびキナーゼは、同じ試料中に存在し得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、処理パラメーターは、時間、温度、ｐＨ、圧力、プロテアーゼ濃度、および滅菌剤または界面活性剤の濃度の１つ以上を含む。
【００６２】
特定の実施態様では、処理は、５０〜１４０℃、好ましくは８０〜１００℃、より好ましくは１３４〜１３８℃で試料を加熱する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６３】
さらなる実施態様では、処理は、９〜１４のｐＨ、好ましくはｐＨ１２以上、より好ましくは約ｐＨ１２に試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６４】
別の実施態様では、処理は、0.5〜２mg/ml、好ましくは約１mg/ml、より好ましくは約２mg/mlの濃度のプロテアーゼに試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６５】
上記方法により、生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料に対する処理の検証のためのインジケータを将来的に使用するための較正データの調製が可能になる。多くの処理プロセスの較正は、実施例２１〜２３に記載される。
【００６６】
本発明の第五の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するためのインジケータとしてのキナーゼの使用が提供される。このような情況では、キナーゼは、本明細書中に記載のキナーゼの任意の１つであり得、および／または本明細書中に記載のキナーゼの特性のいずれかを有し得る。好ましくは、キナーゼは、本発明の第一の局面によるインジケータとして処方される。
【００６７】
ここで、種々のプロセスをモニタリング／検証するための本発明のインジケータの使用を説明する。
【００６８】
一実施態様では、インジケータは、洗浄サイクルにおける生物学的洗浄調製物の性能を検証するために使用される（実施例１４を参照のこと）。洗浄サイクルの検証は家庭環境にて用いられる可能性があるが、その最も有益な使用は、ヘルスケア、製薬、または食品製造環境内にあり、例えば、寝具、室内着、または感染患者または感染因子に曝露された患者（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはノーウォーク／ノーウォーク様ウイルスの集団発生）と関連した他の品目の汚染除去を検証するためである。このような情況では、本発明のインジケータは、血液または他の体液のような生物学的材料に関連しているという利点を有する。
【００６９】
洗浄サイクルの検証のために、インジケータは、可撓性の細棒、布のストリップ、またはサイクル内に取り込むのに適した他の材料の表面上に適切なキナーゼを架橋させることにより調製される。インジケータは、投入物の残りと共に洗浄機に入れられる。好ましくは、インジケータは、その回収を容易にするために、洗浄機内部の適切なホルダー内に固定され得る。
【００７０】
次いで、洗浄サイクルが実施され、そしてインジケータが取り出されて、投入物のさらなる取り扱いまたは処理の前に「読み取り機」を用いて評価される。この「読み取り機」は、インジケータ内に受容可能なレベルの残余キナーゼ活性を示すように較正されており、この受容可能なレベルは、プロセス内の適切な洗浄性能の以前の較正および評価から導き出される。このような評価は、汚れの総レベルおよび微生物の生存数（当業者に公知の適切なモデル生物を用いて評価される）を含み得る。読み取り較正値に基づいて、投入物をさらなる処理に通すか、または洗浄サイクルを繰り返す。
【００７１】
第二の実施態様では、インジケータは、ウイルスの不活性化のためのプロセスを検証するために使用される（実施例１５を参照のこと)。環境中の生存ウイルス単離株の検出は、特に、スピードおよび精度が重要になり得る緊急事態が伴う場合に問題である。本発明は、本質的にリアルタイムに汚染除去手順をモニタリングすることを可能にするインジケータシステムの開発の可能性を提供する。これは、ヘルスケアおよび関連施設において、集団発生（例えば、ノーウォーク様ウイルスの発生）またはウイルス因子（例えば、天然痘）の故意の放出のいずれかの後での表面汚染除去に特に有用である。
【００７２】
ウイルス不活性化プロセスを検証するためのインジケータは、種々の異なる形態（例えば、殺ウイルス剤を噴霧または浸漬した領域をモニタリングするための細棒またはディップスティック、または気相汚染除去プロセスをモニタリングするための懸架式インジケータ）をとり得る。あるいは、インジケータキナーゼが、汚染除去前に表面に噴霧され、そして残余キナーゼ活性のレベルが、表面のふき取りによって引き続き評価され得る。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、細菌タンパク質毒素、植物毒素（例えば、リシン）、および他の毒素タンパク質、ペプチド、またはペプチドアナログのプロテアーゼ分解を検証するために使用される（実施例１６を参照のこと）。
【００７４】
プロテアーゼは、細菌戦争／細菌テロリズムの脅威となる可能性のある因子である広範なタンパク質毒素（ボツリヌス菌毒素、炭疽菌毒素、およびリシンを含む）の分解の重要な可能性を示す。それらはまた、広範な他の潜在的に毒性または有害なタンパク質またはペプチド因子を不活性化して、表面／施設の汚染除去または材料の安全な廃棄を可能にする能力を有する。このような情況では、本発明のインジケータは、汚染除去される表面／材料と一緒に、プロテアーゼ汚染除去手順に供される。この手順の終了時に、インジケータは取り出され、そして残余キナーゼ活性のレベルが、本発明の方法に従って評価される。次いで、この残余キナーゼ活性のレベルが、特定のタンパク質毒素または毒素群の不活性化指数と相関される。このレベル活性が規定の指数値以下であると、材料は安全に廃棄され得、または表面／施設は元通りに使用し得る。
【００７５】
好ましくは、適切な安全性余裕が、プロセス性能のいかなる変動も可能にするように、不活性化指数の較正に組み込まれる。本発明で使用される酵素の付加的な安定性により、これは、好熱性生物由来のＡＫの相対熱安定性を示すデータ（図１、実施例２）により示されるように、広範な他の酵素インジケータ（「熱安定性」生物、例えば、Bacillus stearothermophilus由来の酵素を含む）よりも確実にかつより大きなダイナミックレンジで行われるようになる。
【００７６】
インジケータはまた、薬剤製造装置をきれいに清浄するためのプロテアーゼ汚染除去手順を検証するために使用され得る。広範な種々の薬剤製品は、ヒトまたは動物由来の材料を使用し、これらは、プリオン（ＴＳＥ）因子およびウイルス（例えば、西ナイルウイルス、肝炎、ＨＩＶ）を含む広範な種々の因子で汚染され得る。材料の供給源が動物起源である場合（例えば、ウシ胎児血清、ウマ免疫グロブリン）および中間処理段階が、特定の試料中の未同定の病原体の濃度を増大させる危険性を有し得る場合、危険性は悪化され得る。製造バッチ間の製造施設および装置（例えば、クロマトグラフィーカラム、容器、配管）をきれいに清浄するためにプロテアーゼを使用する可能性は、汚染物が事前に同定されていない場合であっても、そのような危険性を減少または排除する可能性を有する。これは、感染危険性を蓄積し、そして最終製品に持ち込む重大な危険性がある、例えば、血液分画装置中のプリオン因子に特に当てはまる。
【００７７】
このタイプの手順を検証するために、本発明のインジケータは、理想的には、プロテアーゼ処理溶液中に浸漬されるディップスティックとして、または清浄される装置とともに一列に取り付けられるカートリッジとして設計される。処理後のインジケータデバイス中の残余キナーゼ活性のレベルを評価し、そしてこれを受容可能な清浄レベルと相関させることにより、性能の迅速かつ信頼性のあるモニターが開発され得る。
【００７８】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、生物学的因子（例えばＴＳＥ）の気相不活性化を検証するために用いられる（実施例１７を参照のこと）。
【００７９】
オゾンまたは他の気相滅菌剤がこのような因子を不活性化する可能性は、広範な刊行物および論文によって示唆されているが、なおも、有効であることが明白に示された方法はない。この気相技術のヘルスケアへの開発および導入を支持するために、この技術の性能を検証する手段が必要である。ＴＳＥのような因子は、従来のウイルスまたは細菌因子よりもこの形態の不活性化に対してずっと耐性であることが既に示されているので、気相不活性化を検証するために現在利用可能な方法は、適切であるとは考えられない。本発明は、この課題に取り組んでいる。
【００８０】
このタイプの検証のために、インジケータキナーゼは、任意の適切な方法、例えば、一般的な吸着およびアミド、ペプチド、カルボニル、またはシステイン結合を介する化学架橋によって、固体支持体上に付着される。例えば、オゾン滅菌については、剛性ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ガラス、スチール、ポリアミド、またはポリプロピレンの支持体が使用され得、支持体には、キナーゼが、先に記載した化学方法の任意の１つによってカップリングされている。次いで、インジケータが、材料／器具の滅菌バッチ中に入れられ、オゾンに曝露され、そして当の因子の対応する不活性化を評価するために設計した適切に較正した不活性化指数に対して評価される。好結果の不活性化が、材料／器具の処理または使用の前に可能になる。
【００８１】
インジケータは、気体の透過が制限されるように、必要に応じて、チューブの内面または等価の内部空隙部に付着され得る。これは、管腔を有する器具中の等価な空隙中への、または充填された材料を通る、気体の透過を評価するのに適しているモニターを提供する。あるいは、キナーゼは、ポリスチレンビーズのような多孔質材料に付着され得るか、またはゲルもしくは樹脂内に固定化され得る。
【００８２】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、内視鏡および関連装置の処理に用いられるような液体化学滅菌システム（例えば、Endoclens）を検証するために使用される（実施例１８を参照のこと）。
【００８３】
広範な内視鏡が医療において慣用的に使用され、そしてこれは、医学的診断および処置の重要な部分となる。これらの器具は、非常に感度が高く、慣用的な清浄および消毒に非常に重要な問題を提起している。従来、および現行の実施でも変わらず、内視鏡は、低温法を用いて汚染除去される前に、手で清浄される。従来のオートクレーブ滅菌ができない内視鏡のような装置の感度の高い部分の汚染除去の特定の問題に取り組むために、種々の化学消毒剤および自動化再処理装置が開発されている。これらの方法は、器具の洗浄化が困難である際に、広範なウイルスおよび細菌病原体の医原性伝染と関連している汚染のレベルを下げるのに役立っている。このようなプロセスを検証する現行の方法は、洗浄溶液の流速および温度をモニタリングすることである。本発明のインジケータは、内視鏡管腔内の実際の清浄有効性の読み取りを提供する検証のさらなる手段を提供する。
【００８４】
このタイプの検証のために、インジケータは、内視鏡チューブと同様の総内径であるように設計されたチューブの内表面に付着される。このインジケータ装置は、自動化再処理装置において内視鏡と直列に連結されている。次いで、内視鏡は、通常通りに処理される。このプロセスの終了時に、好ましくは内視鏡が装置から取り出される前に、インジケータは取り外され、そして残存するキナーゼ活性のレベルについて評価される。活性のレベルは、プロセスの受容可能な性能について予め規定された閾値と相関させられ得、そしてこの評価に基づいて、内視鏡は、追加の清浄もしくは汚染除去に移され得るか、または使用するために準備され得る。性能のレベルが十分でない場合、器具は、前と同様に付着させた新たなインジケータを用いて（同じ条件またはより厳しい条件を用いて）再処理され得る。このインジケータ装置はまた、内視鏡および／または管腔を有する任意の他の器具の手動清浄を検証するのにも適している。
【００８５】
上記検証のためのインジケータを調製するには、キナーゼが、酵素の疎水性に基づく非特異的タンパク質吸着法によってその支持体に接着していることが好ましい。図５は、種々の組換えキナーゼがこのようにしてポリスチレンに接着できることを示している。図５はまた、特定のキナーゼが、このタイプの適用のためにより望ましい特性を有すること、例えば、S. acidocaldariusキナーゼが、T. maritimaおよびA. fulgidusに由来するキナーゼと比較した場合、このタイプの表面に有意により接着性であることを示している。これは、他のタイプの表面について、特に表面に対する付着が荷電アミノ酸残基を介し得る場合、異なり得る。このタイプのインジケータにおいて、表面からキナーゼを簡単に取り出せることは、キナーゼに対するいかなる変更または改変よりも、清浄性能の評価において決定的な特徴である。したがって、このタイプの「吸着」インジケータは、洗浄性能の評価において非常に広範囲の使用を有する。これは、そのプロセスが内視鏡のようなデバイスの管腔からバイオフィルムを効果的に取り出すことができることを検証するために、特に重要である。なぜなら、これは、性能に影響する鍵となる要因の１つであると考えられるからである。したがって、適切な非感染バイオフィルムは、キナーゼのためのマトリックスとして、好ましくは、血清、スクロース溶液、水性ゲル、またはバイオフィルムを刺激する他の手段を用いて、プロセスがこの汚染形態に対して有効であることを確実にするように用いられ得る。このようなプロセスを検証するのに適した他のタイプのインジケータは、前に記載したものと同様であり、ここでは、キナーゼが、化学結合（例えば、ジスルフィド結合、アミド結合、またはカルボニル結合）を生じるように支持体表面に共有結合されている。これらの場合、洗浄および／または滅菌剤の効果は、キナーゼを、それがもはや活性でないように改変することにより発揮される。このことは、ペプチド結合の破壊、タンパク質の架橋、またはタンパク質の構造をかき乱す関連方法により作用する化学滅菌剤に特に関連している。
【００８６】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、洗浄消毒器（例えば、病院で使用されるもの）で慣用の清浄性能をモニタリングするために使用される（実施例１９を参照のこと）。
【００８７】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、グルタルアルデヒドまたはオルトフタルデヒド（ＯＰＡ）処理をモニタリングするために使用される。グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドが、長年にわたって滅菌剤として広範に使用されている。化学消毒剤は、それらの機能を破壊するために非特異的様式でタンパク質を多架橋させることにより作用する。オルトフタルデヒド（ＯＰＡ）は、このファミリーにおいて新規な消毒剤として近年見出され、そしてこれはグルタルアルデヒドと関連した毒性問題のいくつかを回避するので広範に使用されつつある。本発明のインジケータは、このクラスの化学消毒剤の全てをモニタリングするのに適している。これは、キナーゼが、この種の非特異的架橋に感受性であるからである。このタイプのインジケータでは、キナーゼは、適切な表面に共有結合され、滅菌されるべき他の品目と共に化学滅菌剤に曝露される。プロセスの有効性は、インジケータを取り出して残余酵素活性を測定することによって評価される。この活性は、プロセスの正確な性能を示す規定の閾値と比較される。
【００８８】
異なるタイプのキナーゼの使用は、種々の適用に必要とされ得るように、プロセスに対する付加的な感度または感受性を提供し得る。本明細書中に記載の熱安定性アデニル酸キナーゼは、それらの分子構造に基づいて、２つの群に広範に分類され得る。したがって、Sulfolobus種由来の酵素は、高温でそれらの活性を維持するのに主要な決定基である中心の疎水性コアを有する三量体構造を有する酵素の例である。第二の群の酵素は、Thermotoga種由来のアデニル酸キナーゼにより例示される、単量体であるが、活性部位に影響する付加的な「蓋形」ドメインを有するわずかにより長いポリペプチド鎖を有する。これらの異なるタイプの熱安定性酵素は、酵素作用の間のそれらのペプチド鎖の可変的なフレキシビリティーに起因して、このタイプの化学滅菌剤に対して差異のある感度を示す。任意の特定の滅菌剤および／または濃度について、経験的スクリーンにより、これらのタイプの化学物質をモニタリングおよび検証するために適切な感受性を有する酵素が同定される。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、エチレンオキサイド、過酸化水素、または他の気相プロセスについての超高速読み取りモニターとして使用される。
【００９０】
現在、広範な気相滅菌剤は、細菌およびウイルス因子の慣用的な消毒のために、種々の製造業者によって使用されつつある。現行の方法は、気体の酸化特性を利用して、ペプチド結合を破壊している。したがって、本発明のキナーゼは、それらの強い物理化学特性から、不活性化の非常に迅速な読み取りを提供するのに理想的である。本実施例におけるインジケータは、例えば、ＴＳＥのような因子のオゾン不活性化に関して、前に記載したものと同様である。
【００９１】
滅菌および汚染除去のプロセスについて特に興味深い点は、種々の医薬または他の薬剤製品の製造で必要とされ得るような、大量のバルク液の滅菌を検証する能力である。現行の方法は、特定プロセスの温度、時間、および／または圧力のパラメーターを（その正確な性質に依存して）モニタリングするが、バルク液内で現実の滅菌を検証するために利用可能な方法は、あるとしてもほとんどない。これは、約１リットルの容量内でさえも難しいが、より多い容量ではほぼ不可能である。
【００９２】
本発明は、この問題に取り組む多数の可能な溶液を提供する（実施例２０を参照のこと）。その最も簡易な形態では、キナーゼが、プロセスの終了時にキナーゼ不活性化の規定のレベルを測定しそしてこれを滅菌のレベルと同一視するのに適した濃度で、滅菌される液体に添加され得る。これは、特定のタイプのプロセスにおいては望ましくはないが、キナーゼの不活性な性質および全ての生物における等価な酵素活性の遍在的な存在によって受容可能になり得る。この受容可能性は、多くの熱安定性酵素が非常に濃縮され、したがって、動物への接種後の免疫原性が非常に低くなることにより、改善され得る。
【００９３】
このような直接的な添加が受容可能でない場合、キナーゼは、透析袋、多孔質コンテナ中のバルク液に添加され得るか、または酵素が一部分もバルク液に放出されないように適切な支持体に固定化され得るが、滅菌条件は、試料全体についてと同様にインジケータで作用し得る。液体試料の一般的な拡散を可能にするが、インジケータ試料の動きを制限するように、タンパク質を含有するかまたは固定化する広範に種々の可能な方法が、当業者に公知である。可能な例としては、透析膜、ビスキングチューブ（Visking tubing）、多孔質膜、タンパク質結合樹脂、剛性ゲル、または議論した他のインジケータについて記載したような固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない。インジケータは、前に記載した方法のいずれか１つによって表面に付着され得るか、または付着させることなく適切な膜内に単に入れられ得る。これにより、インジケータは、プロセスの完了時にバルク液から簡単に取り出され得る。
【００９４】
（定義の項）
用語「生物学的因子」とは、感染因子および非感染因子の両方を含む。本発明に関連した生物学的因子の特定の例としては、細菌、ウイルス、胞子、タンパク質、ペプチド、およびプリオン（感染性ＰｒＰＳｃ型および非感染性ＰｒＰＣ型の両方）、ならびにまた実施例１４〜２０に記載した特定の因子が挙げられる。本発明の好ましい実施態様では、生物学的因子は、伝染性海綿状脳症である。
【００９５】
用語「処理」または「処理プロセス」は、試料中の生物学的因子の量または活性を減少するように設計される任意のプロセスを含む。
【００９６】
適切な処理は、以下の１つ以上を含む：選択されたｐＨ、温度、または圧力、プロテアーゼもしくは他の酵素への試料の曝露、界面活性剤、化学滅菌剤もしくは気相滅菌剤への試料の曝露。好ましい実施態様では、処理は、感染性生物学的因子（例えば、ＴＳＥ）の感染活性（infectious activity）（感染度（infectivity）としても知られる）を減少させるように設計される。特に好ましい実施態様では、処理は、５０〜１２０℃の間、好ましくは６０℃以上、より好ましくは１００℃以上の温度で試料をプロテアーゼに曝露する工程、および／または少なくとも９のｐＨに、好ましくは少なくとも１２のｐＨに試料を曝露する工程を含む。用語「処理」はまた、湿流または乾流の高温オートクレーブ滅菌、オゾン滅菌、Ｈ２Ｏ２滅菌、レンダリング、または生物学的因子を除去または不活性化するように設計された他の方法のような清浄プロセスおよび不活性化プロセスを含む。
【００９７】
用語「試料」は、任意の品目、器具、表面、流体、または材料を含む。例としては、手術器具および医療器具、院内室内着、寝具、バルク液、廃棄動物由来材料、薬剤、作業台、壁、および床が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
用語「ＲＬＵ」とは、相対発光量を意味する。当業者は、相対発光量は、信頼性のある（絶対的ではない）測定値であることを認識する。本明細書に示した数値は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬の添加直後の２秒間の光測定の「フラッシュ」法を用いるインジェクターシステムを備えたBerthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーター（300〜650nmの波長で放射された光を測定する技術仕様光電子増倍管）を用いて求めた測定値に関する。この点に取り組むために、製造業者は、ＲＬＵ「係数」についてのデータを作成しており、所定のルミノメーターにより生じたデータを、較正標準に対して正規化させる。したがって、異なる器具間で、比較がなされ得る。本明細書中に記載した実験で使用したBerthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーターについてのＲＬＵ係数は１である。したがって、本明細書中で示されたＲＬＵ値は、標準化／正規化されたＲＬＵ値としてみなされ得る。
【００９９】
絶対値の点では、ＲＬＵ値は、本方法（例えば、実施例１の方法）に記載されるような試薬を用いて該値を得るのに必要なＡＴＰ濃度に関連し得る。適切な変換として、そしてＲＬＵ値とＡＴＰ濃度との間の線形関係を考慮すると、以下の値が用いられ得る：
【０１００】
【数１】
【０１０１】
ここで、本発明を、以下の実施例でおよび添付の図面を参照して、特定の実施態様において記載する。
【０１０２】
図１は、７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、および９０℃（Ｃ）での処理後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す。
【０１０３】
図２は、種々の濃度のアルカリプロテアーゼによるアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）消化後の残余酵素活性を示す；および
【０１０４】
図３は、酵素活性とアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の残余濃度との相関を示す標準曲線を示す。
【０１０５】
図４は、E. coliで組換え発現した種々のＡＫ酵素の熱安定性を示す。実施例４に記載するように、ＡＫ酵素をコードする遺伝子をクローニングし、そして発現させた。S. acidocaldariusクローンＩを除いて、全ての遺伝子をベクターpET28aから発現させた。S. acidocaldariusクローンＩは、前に記載したように、pET3aから発現させた。発現レベルは、各クローンについて同様であったが、Pyrococcus furiosus (P.fu)酵素の一部は、不溶性画分中にあった。このことは、この酵素のアッセイされる量を減少させたと考えられる。１mg/ml総細胞タンパク質からの１０倍系列希釈で（これにより、カラム１２は、１fg/mlの総タンパク質に等価となる）、E. coli粗溶解物中で８０℃にて３０分間インキュベートした後に、組換え酵素の熱安定性を測定した。Thermotoga maritimaおよびArchaeoglobus fulgidus由来の酵素は、試験した他の酵素よりも有意に大きな安定性を示したが、残りの酵素（Sulfolobus solfataricus（S.so P2）、Aeropyrum pernix、およびP.fu）は、以前のアッセイの基準として用いたS. acidocaldarius酵素（S.ac Iと記載したデータ）と同様の活性を示した。
【０１０６】
図５は、固体支持体への熱安定性アデニル酸キナーゼ（ｔＡＫ）の結合差異を示す。固体支持体への精製組換え熱安定性アデニル酸キナーゼの相対結合を評価するために、ブロックしたプレートへの酵素の結合を評価し、このことにより、直接吸光度タイプのインジケータに対するそれらの使用可能性が示される。標準ポリスチレンマイクロタイタープレートの表面を、５％スキムミルクの添加によりブロックした。このミルクを除去し、そしてArchaeoglobus fulgidus（Ａｆｕ）、Thermotoga maritima（Ｔｍａ）、およびSulfolobus acidocaldarius（Ｓａｃ）由来のｔＡＫの希釈液をプレートに塗布した。洗浄後、結合したｔＡＫの量を、標準アッセイ法について記載のようにして測定した（実施例１）。この結果は、Ｓａｃ ｔＡＫが、２つの別のｔＡＫのいずれよりも、ブロックしたプレートに対して有意に高い結合を示したことを示している。これらの酵素の比活性は同一ではなかったが、ＡｆｕおよびＴｍａのｔＡＫはともに、Ｓａｃ由来の酵素よりも高い活性を示し、そのため結合における現実の差は、図面に示したよりもずっと大きい。スキムミルクは、プレートへ結合するタンパク質を減少させるために一般に用いられるブロッキング剤であるので、これらの結果は、Ｓａｃ ｔＡＫが、これらの実験において使用した表面（ポリスチレン）への疎水性吸着に非常に強い傾向を有することを示している。酵素のこの特性は、スチール表面へのプリオン分子について観察されたものと同様であり、それが、広範なＴＳＥ不活性化および／または除去プロセスを評価するための非常に有効なインジケータであることを意味する。
【０１０７】
図６は、プリオンを不活性化するためのプロテアーゼ消化処理についての較正曲線の作成を示す。
【０１０８】
図７は、プリオンを不活性化するための気相オゾン処理についての較正曲線の作成を示す。
【０１０９】
図８は、標準的な汚れを除去するための院内用洗浄消毒器についての較正曲線の作成を示す。
【０１１０】
図９は、ｔＡＫインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持形衛生モニターの改変を示す。
【０１１１】
配列番号１：Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３：Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４：Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５：Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号７：Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８：Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号９：Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１０：Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１１：Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１２：Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１３：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１４：Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１５：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ（単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ））のタンパク質配列
配列番号１７：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１８：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１９：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２０：Thermatoga maritima由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２１：Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２２：Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２３：Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２４：Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２５：Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２６：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２７：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号２８：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２９：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号３０：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（Sulfolobus acidocaldarius ＡＫのためのアッセイプロトコル）
適切な固体支持体上の１mg/mlのアデニル酸キナーゼの100μl処方物がインジケータであり、そしてこれを、必要とされる処理プロセスに供する。
【０１１３】
熱不活性化工程は任意である。これは、試料を、インジケータのＡＫには許容であるが、いずれの中温性ＡＫも変性される温度を上回る温度に加熱することを含む。代表的には、これは、８０℃にて１０分間のインキュベーションによる。
【０１１４】
洗浄工程は任意である。これは、処理を実施するために用いられる材料が微量であってもアッセイを妨害することが分かっている場合、それらを除くために組み込まれ得る。
【０１１５】
次いで、インジケータを、15mM MgAc、1mM EDTA緩衝液、pH6.8で13.5μMの濃度に希釈したＡＤＰ基質（例えば、Celsis, Biothema, Promegaからの試薬）を含むチューブに添加し、そして７０℃にて２０分間インキュベートする。
【０１１６】
試料を室温まで冷却し、そしてルシフェリン／ルシフェラーゼ基質（ＡＴＰ試薬、Thermo Life Science）を添加する。アッセイを必要な長さの時間インキュベートし、ルミノメーターを用いて試料を読み取る。
【０１１７】
（実施例２）
（天然型アデニル酸キナーゼ酵素の精製）
２４の種々の好熱性微生物および超好熱性微生物からバイオマスを生成した（表１）。
【０１１８】
古細菌の８つのメンバーを、１６の種々の好気性細菌および嫌気性細菌とともに表した。これらの生物の各々に由来するＡＫを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。全ての酵素をさらに特徴付け、そしてゲル濾過（Superdex G200）によって精製した。これは、主要なＡＫ画分の同定および分子量の推定を可能にした。
【０１１９】
（実施例３）
（天然型アデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
好熱性生物に由来するバイオマスから単離したアデニル酸キナーゼの７０℃、８０℃、および９０℃での熱安定性を評価し、そしてそれらの結果を図１に示した。
【０１２０】
アデニル酸キナーゼを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによってバイオマスから単離した。カラムから溶出した試料を1:10000希釈し、次いで各々１０μlをマイクロタイターウェルに添加した。2.5μlのアピラーゼを各ウェルに添加し、溶出緩衝液から存在するＡＴＰを破壊し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。アピラーゼを６５℃にて２０分間の熱処理によって不活性化した。
【０１２１】
ＡＤＰ基質を添加し、そして７０℃（パネルＡ）、８０℃（パネルＢ）、または９０℃（パネルＣ）のいずれかにて３０分間インキュベートし、そして２５℃まで冷却し、その後１０μlのＤ−ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添加した。生じたＡＴＰを、プレートルミノメーターでＲＬＵとして測定した。
【０１２２】
（実施例４）
（組換えアデニル酸キナーゼの発現および精製）
代表的な熱安定性ＡＫを発現するクローンを獲得し、そして好熱酸性古細菌Sulfolobusacidocaldariusおよび好熱性細菌Bacillus stearothermophilus由来の組換え熱安定性ＡＫを生成した。プラスミドをE. coliに形質転換し、そして細胞抽出物は、ＡＫの予測分子量に相当する電気泳動でのタンパク質バンドを含有することが示された。適切な温度（Sulfolobus acidocaldarius ＡＫは８０℃およびBacillus stearothermophilus ＡＫは６０℃）でのインキュベーション後に、熱安定性ＡＫ活性を測定した。
【０１２３】
両方の熱安定性ＡＫについての精製方法は確立されている。この方法には、８０℃で２０分間のインキュベーションの初期熱処理によりE. coli由来のタンパク質を不活性化して凝集し、その後アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過を行うことが含まれた。アフィニティークロマトグラフィーは、Blue Sepharoseへの酵素の吸着、次いで低濃度のＡＫ補因子（ＡＭＰ＋ＡＴＰおよびマグネシウムイオン）を用いる特異的溶出を含んだ。溶出緩衝液中のＡＴＰおよびＡＭＰ（Sigma）を、中温性アピラーゼとのインキュベーションにより分解した。中温性アピラーゼは引き続く熱処理によって容易に不活性化される。ゲル濾過クロマトグラフィーをスケールアップし、分取用Superdexカラムを使用して、両酵素を大量に調製できるようにした。
【０１２４】
候補の天然型酵素のスクリーニングの間に同定された好熱性生物由来のＡＫ遺伝子のＰＣＲ増幅のために、プライマーを設計した。
【０１２５】
熱安定性微生物を個々に既定されている増殖条件を用いて増殖させ、そしてゲノムＤＮＡを単離し、そして各生物由来のアデニル酸キナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。好熱性生物であるThermotoga maritima、Aeropyrum pernix、Sulfolobus acidocaldariusおよびSulfolobus solfataricus由来のＰＣＲ増幅したアデニル酸キナーゼ遺伝子をベクターpET28aにサブクローニングし、そして稀なtRNA（rare tRNA）を発現するコドン増強E. coli株（Zdanovskyら、2000）に形質転換した。このE. coli株は、ＡＴリッチ遺伝子の発現レベルの増強に適している。
【０１２６】
形質転換の成功をミニ発現試験によって評価し、そしてこの結果を、ＩＰＴＧでの誘導の前および後に、培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、熱処理工程を含んだ後の上清の分析にも使用した。この熱処理工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流す前に試料を８０℃まで２０分間加熱して、試料中に存在する熱不安定タンパク質を除去することからなる。
【０１２７】
配列：
配列番号
１−Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＴＴＶＬＳＦ ＡＤＫＩＬＴＥＫＧＩ
ＳＨＫＩＶＮＹＧＤＹ ＭＬＮＴＡＬＫＥＧＹ ＶＫＳＲＤＥＩＲＫＬ
ＱＩＥＫＱＲＥＬＱＡ ＬＡＡＲＲＩＶＥＤＬ ＳＬＬＧＤＥＧＩＧＬ
ＩＤＴＨＡＶＩＲＴＰ ＡＧＹＬＰＧＬＰＲＨ ＶＩＥＶＬＳＰＫＶＩ
ＦＬＬＥＡＤＰＫＩＩ ＬＥＲＱＫＲＤＳＳＲ ＡＲＴＤＹＳＤＴＡＶ
ＩＮＥＶＩＱＦＡＲＹ ＳＡＭＡＳＡＶＬＶＧ ＡＳＶＫＶＶＶＮＱＥ
ＧＤＰＳＩＡＡＳＥＩ ＩＮＳＬＭ
【０１２８】
２−Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＳＴＶＬＡＫ ＶＫＥＩＬＤＮＱＧＩ
ＮＮＫＩＩＮＹＧＤＦ ＭＬＡＴＡＬＫＬＧＹ ＡＫＤＲＤＥＭＲＫＬ
ＳＶＥＫＱＫＫＬＱＩ ＤＡＡＫＧＩＡＥＥＡ ＲＡＧＧＥＧＹＬＦＩ
ＤＴＨＡＶＩＲＴＰＳ ＧＹＬＰＧＬＰＳＹＶ ＩＴＥＩＮＰＳＶＩＦ
ＬＬＥＡＤＰＫＩＩＬ ＳＲＱＫＲＤＴＴＲＮ ＲＮＤＹＳＤＥＳＶＩ
ＬＥＴＩＮＦＡＲＹＡ ＡＴＡＳＡＶＬＡＧＳ ＴＶＫＶＩＶＮＶＥＧ
ＤＰＳＩＡＡＮＥＩＩ ＲＳＭＫ
【０１２９】
３−Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＫＭＫＩＧＩＶＴ ＧＩＰＧＶＧＫＴＴＶ ＬＳＫＶＫＥＩＬＥＥ
ＫＫＩＮＮＫＩＶＮＹ ＧＤＹＭＬＭＴＡＭＫ ＬＧＹＶＮＮＲＤＥＭ
ＲＫＬＰＶＥＫＱＫＱ ＬＱＩＥＡＡＲＧＩＡ ＮＥＡＫＥＧＧＤＧＬ
ＬＦＩＤＴＨＡＶＩＲ ＴＰＳＧＹＬＰＧＬＰ ＫＹＶＩＥＥＩＮＰＲ
ＶＩＦＬＬＥＡＤＰＫ ＶＩＬＤＲＱＫＲＤＴ ＳＲＳＲＳＤＹＳＤＥ
ＲＩＩＳＥＴＩＮＦＡ ＲＹＡＡＭＡＳＡＶＬ ＶＧＡＴＶＫＩＶＩＮ
ＶＥＧＤＰＡＶＡＡＮ ＥＩＩＮＳＭＬ
【０１３０】
４−Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＲＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＫＩＱＲＥＬＱＭＫＡ ＡＫＫＩＴＥＭＡＫＥ ＨＰＩＬＶＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＭＬＧ ＬＰＹＥＶＶＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＮＥＹＡ
【０１３１】
５−Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＫ ＬＡＬＱＲＴＲＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＬＫＬＫＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＶＱＲＥＬＱＭＮＡ ＡＫＫＩＡＥＭＡＫＮ ＹＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＩＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＴＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１３２】
６−Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＮ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＩＱＲＤＬＱＭＫＶ ＡＫＫＩＳＥＭＡＲＱ ＱＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＥＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１３３】
７−Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＬＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＧＴＴＩＴ ＱＫＡＭＥＫＬＳＥＥ
ＧＩＮＹＫＭＶＮＦＧ ＴＶＭＦＥＶＡＱＥＥ ＮＬＶＥＤＲＤＱＭＲ
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ ＭＶＫＥＳＰＶＶＶＤ
ＴＨＳＴＩＫＴＰＫＧ ＹＬＰＧＬＰＶＷＶＬ ＮＥＬＮＰＤＩＩＩＶ
ＶＥＴＳＧＤＥＩＬＩ ＲＲＬＮＤＥＴＲＮＲ ＤＬＥＴＴＡＧＩＥＥ
ＨＱＩＭＮＲＡＡＡＭ ＴＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＩＱＮＫＮＮＬＬ
ＤＹＡＶＥＥＬＩＳＶ ＬＲ
【０１３４】
８−Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＳＴＴＳＳ ＱＬＡＭＤＮＬＲＫＥ
ＧＶＮＹＫＭＶＳＦＧ ＳＶＭＦＥＶＡＫＥＥ ＮＬＶＳＤＲＤＱＭＲ
ＫＭＤＰＥＴＱＫＲＩ ＱＫＭＡＧＲＫＩＡＥ ＭＡＫＥＳＰＶＡＶＤ
ＴＨＳＴＶＳＴＰＫＧ ＹＬＰＧＬＰＳＷＶＬ ＮＥＬＮＰＤＬＩＩＶ
ＶＥＴＴＧＤＥＩＬＭ ＲＲＭＳＤＥＴＲＶＲ ＤＬＤＴＡＳＴＩＥＱ
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ ＳＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＶＱＮＲＮＧＬＬ
ＤＱＡＶＥＥＬＴＮＶ ＬＲ
【０１３５】
９−Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＭＭＫＮＫＶＶＶ ＩＶＧＶＰＧＶＧＳＴ ＴＶＴＮＫＡＩＥＥＬ
ＫＫＥＧＩＥＹＫＩＶ ＮＦＧＴＶＭＦＥＩＡ ＫＥＥＧＬＶＥＨＲＤ
ＱＬＲＫＬＰＰＥＥＱ ＫＲＩＱＫＬＡＧＫＫ ＩＡＥＭＡＫＥＦＮＩ
ＶＶＤＴＨＳＴＩＫＴ ＰＫＧＹＬＰＧＬＰＡ ＷＶＬＥＥＬＮＰＤＩ
ＩＶＬＶＥＡＥＮＤＥ ＩＬＭＲＲＬＫＤＥＴ ＲＱＲＤＦＥＳＴＥＤ
ＩＧＥＨＩＦＭＮＲＣ ＡＡＭＴＹＡＶＬＴＧ ＡＴＶＫＩＩＫＮＲＤ
ＦＬＬＤＫＡＶＱＥＬ ＩＥＶＬＫ
【０１３６】
１０−Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＧＹＶＩＶＡＴＧＶ ＰＧＶＧＡＴＴＶＴＴ ＥＡＶＫＥＬＥＧＹＥ
ＨＶＮＹＧＤＶＭＬＥ ＩＡＫＥＥＧＬＶＥＨ ＲＤＥＩＲＫＬＰＡＥ
ＫＱＲＥＩＱＲＬＡＡ ＲＲＩＡＫＭＡＥＥＫ ＥＧＩＩＶＤＴＨＣＴ
ＩＫＴＰＡＧＹＬＰＧ ＬＰＩＷＶＬＥＥＬＱ ＰＤＶＩＶＬＩＥＡＤ
ＰＤＥＩＭＭＲＲＶＫ ＤＳＥＥＲＱＲＤＹＤ ＲＡＨＥＩＥＥＨＱＫ
ＭＮＲＭＡＡＭＡＹＡ ＡＬＴＧＡＴＶＫＩＩ ＥＮＨＤＤＲＬＥＥＡ
ＶＲＥＦＶＥＴＶＲＳ Ｌ
【０１３７】
１１−Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＧＴＴＬＴ ＱＫＴＩＥＫＬＫＥＥ
ＧＩＥＹＫＭＶＮＦＧ ＴＶＭＦＥＶＡＫＥＥ ＧＬＶＥＤＲＤＱＭＲ
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ ＭＡＫＥＳＮＶＩＶＤ
ＴＨＳＴＶＫＴＰＫＧ ＹＬＡＧＬＰＩＷＶＬ ＥＥＬＮＰＤＩＩＶＩ
ＶＥＴＳＳＤＥＩＬＭ ＲＲＬＧＤＡＴＲＮＲ ＤＩＥＬＴＳＤＩＤＥ
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ ＡＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＩＫＮＲＤＧＬＬ
ＤＫＡＶＥＥＬＩＳＶ ＬＫ
【０１３８】
１２−Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＶＩＶＡＬＰＧ ＳＧＫＴＴＩＬＮＦＶ ＫＱＫＬＰＤＶＫＩＶ
ＮＹＧＤＶＭＬＥＩＡ ＫＫＲＦＧＩＱＨＲＤ ＥＭＲＫＫＩＰＶＤＥ
ＹＲＫＶＱＥＥＡＡＥ ＹＩＡＳＬＴＧＤＶＩ ＩＤＴＨＡＳＩＫＩＧ
ＧＧＹＹＰＧＬＰＤＲ ＩＩＳＫＬＫＰＤＶＩ ＬＬＬＥＹＤＰＫＶＩ
ＬＥＲＲＫＫＤＰＤＲ ＦＲＤＬＥＳＥＥＥＩ ＥＭＨＱＱＡＮＲＹＹ
ＡＦＡＡＡＮＡＧＥＳ ＴＶＨＶＬＮＦＲＧＫ ＰＥＳＲＰＦＥＨＡＥ
ＶＡＡＥＹＩＶＮＬＩ ＬＲＴＲＱＫＳ
【０１３９】
１３−Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＡＹＬＶＦＬＧＰ ＰＧＡＧＫＧＴＹＡＫ ＲＩＱＥＫＴＧＩＰＨ
ＩＳＴＧＤＩＦＲＤＩ ＶＫＫＥＮＤＥＬＧＫ ＫＩＫＥＩＭＥＫＧＥ
ＬＶＰＤＥＬＶＮＥＶ ＶＫＲＲＬＳＥＫＤＣ ＥＫＧＦＩＬＤＧＹＰ
ＲＴＶＡＱＡＥＦＬＤ ＳＦＬＥＳＱＮＫＱＬ ＴＡＡＶＬＦＤＶＰＥ
ＤＶＶＶＱＲＬＴＳＲ ＲＩＣＰＫＣＧＲＩＹ ＮＭＩＳＬＰＰＫＥＤ
ＥＬＣＤＤＣＫＶＫＬ ＶＱＲＤＤＤＫＥＥＴ ＶＲＨＲＹＫＶＹＬＥ
ＫＴＱＰＶＩＤＹＹＧ ＫＫＧＩＬＫＲＶＤＧ ＴＩＧＩＤＮＶＶＡＥ
ＶＬＫＩＩＧＷＳＤＫ
【０１４０】
１４−Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＶＲＨＰＦＫＶＶ ＶＶＴＧＶＰＧＶＧＫ ＴＴＶＩＫＥＬＱＧＬ
ＡＥＫＥＧＶＫＬＨＩ ＶＮＦＧＳＦＭＬＤＴ ＡＶＫＬＧＬＶＥＤＲ
ＤＫＩＲＴＬＰＬＲＲ ＱＬＥＬＱＲＥＡＡＫ ＲＩＶＡＥＡＳＫＡＬ
ＧＧＤＧＶＬＩＩＤＴ ＨＡＬＶＫＴＶＡＧＹ ＷＰＧＬＰＫＨＶＬＤ
ＥＬＫＰＤＭＩＡＶＶ ＥＡＳＰＥＥＶＡＡＲ ＱＡＲＤＴＴＲＹＲＶ
ＤＩＧＧＶＥＧＶＫＲ ＬＭＥＮＡＲＡＡＳＩ ＡＳＡＩＱＹＡＳＴＶ
ＡＩＶＥＮＲＥＧＥＡ ＡＫＡＡＥＥＬＬＲＬ ＩＫＮＬ
【０１４１】
１５−Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＮＬＩＦＬＧＰＰＧ ＡＧＫＧＴＱＡＫＲＶ ＳＥＫＹＧＩＰＱＩＳ
ＴＧＤＭＬＲＥＡＶＡ ＫＧＴＥＬＧＫＫＡＫ ＥＹＭＤＫＧＥＬＶＰ
ＤＥＶＶＩＧＩＶＫＥ ＲＬＱＱＰＤＣＥＫＧ ＦＩＬＤＧＦＰＲＴＬ
ＡＱＡＥＡＬＤＥＭＬ ＫＥＬＮＫＫＩＤＡＶ ＩＮＶＶＶＰＥＥＥＶ
ＶＫＲＩＴＹＲＲＴＣ ＲＮＣＧＡＶＹＨＬＩ ＹＡＰＰＫＥＤＮＫＣ
ＤＫＣＧＧＥＬＹＱＲ ＤＤＫＥＥＴＶＲＥ ＲＹＲＶＹＫＱＮＴＥ
ＰＬＩＤＹＹＲＫＫＧ ＩＬＹＤＶＤＧＴＫＤ ＩＥＧＶＷＫＥＩＥＡ
ＩＬＥＫＩＫＳ
【０１４２】
１６−Pyrococcus abyssi由来の単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ）
ＭＮＩＬＩＦＧＰＰＧ ＳＧＫＳＴＱＡＲＲＩ ＴＥＲＹＧＬＴＹＩＡ
ＳＧＤＩＩＲＡＥＩＫ ＡＲＴＰＬＧＩＥＭＥ ＲＹＬＳＲＧＤＬＩＰ
ＤＴＩＶＮＴＬＩＩＳ ＫＬＲＲＶＲＥＮＦＩ ＭＤＧＹＰＲＴＰＥＱ
ＶＩＴＬＥＮＹＬＹＤ ＨＧＩＫＬＤＶＡＩＤ ＩＹＩＴＫＥＥＳＶＲ
ＲＩＳＧＲＲＩＣＳＫ ＣＧＡＶＹＨＶＥＦＮ ＰＰＫＶＰＧＫＣＤＩ
ＣＧＧＥＬＩＱＲＰＤ ＤＲＰＥＩＶＥＫＲＹ ＤＩＹＳＫＮＭＥＰＩ
ＩＫＦＹＱＫＱＧＩＹ ＶＲＩＤＧＨＧＳＩＤ ＥＶＷＥＲＩＲＰＬＬ
ＤＹＩＹＮＱＥＮＲＲ
【０１４３】
（実施例５）
（組換えアデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
組換えｔＡＫ酵素の熱安定性をE. coli粗細胞溶解物で評価した。
【０１４４】
細胞を、本質的に実施例４に記載と同様に増殖させ、そして超音波処理によって溶解した。粗抽出物のＡＫ活性を８０℃にて３０分間の熱処理の前および後の両方で決定し、引き続き１０倍系列希釈を行った。
【０１４５】
結果（図４を参照のこと）は、広範な種々の組換え酵素が本発明の方法での使用に適していることを示している。特に好ましいＡＫは、T. maritima、A. fulgidus、およびS. solfataricus由来の酵素である。このような酵素は、生物発光アッセイについてより大きなダイナミックレンジを提供し、必要な場合、なおさらなる感度を提供すると思われる。
【０１４６】
（実施例６）
（特定の熱安定性アデニル酸キナーゼの特性はＴＳＥ不活性化についてのインジケータとしての価値を示す）
プリオン分子は、スチール表面に固着する顕著に高い性質を示す。
【０１４７】
プリオン汚染除去手順の検証のためのインジケータを開発するために、プリオン分子と同様の特性を有するキナーゼが有益である。この概念を探求するために、所定の表面への種々の組換え熱安定性アデニル酸キナーゼの結合を評価した（図５を参照のこと）。
【０１４８】
予めブロックしたプレートへのキナーゼの結合を評価した。標準のポリスチレンマイクロタイタープレートの表面を５％スキムミルクの添加によりブロックした。このミルクを除去し、そしてArchaeoglobus fulgidus（Afu）、Thermotoga maritime（Tma）およびSulfolobus acidocaldarius（Sac）由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの希釈物をプレートに塗布した。洗浄後、結合したキナーゼの量を、標準的なアッセイ方法（実施例１）について記載のようにして測定した。結果は、Sacキナーゼが、ブロックされたプレートに対して、２つの別のキナーゼのいずれよりも有意に高い結合を示したことを示している。酵素の比活性は同一ではないが、AfuキナーゼおよびTmaキナーゼはともにSac由来のキナーゼよりも高い活性を示し、このため、結合における現実の差異は、図に示すよりもずっとさらに大きい。
【０１４９】
スキムミルクは、プレートに結合するタンパク質を減少させるためのブロッキング剤として一般に用いられるので、これらの結果は、Sacキナーゼが、これらの実験で使用した表面（ポリスチレン）への疎水性吸着に非常に強い傾向を有することを示している。酵素のこの特性は、スチール表面に対してプリオン分子について観察された特性と同様であり、それが、広範なＴＳＥ不活性化および／または除去プロセスを評価するための非常に有効なインジケータであることを意味している。Sacキナーゼは、ステンレススチールに対してまさに同様の様式で結合し、そして結合の協同性を示す（すなわち、結合活性と低濃度の酵素の量との間には（線形ではなく）対数形の関係があり、このことは、それが、プリオン分子について見られるのと同様に、この表面で凝集特性を有することを示唆している）。
【０１５０】
酵素のこの特徴は、キナーゼが、共有結合されているのではなく、適切な支持体上に直接吸着されている直接吸着型のインジケータである可能性を示している。この場合のインジケータは、プロセスが表面から材料を除去する能力を評価することによって機能し、そして洗浄および汚染除去プロセスのモニタリングに広範に適用可能である。
【０１５１】
（実施例７）
（安定性を改善するためのアデニル酸キナーゼの遺伝子改変）
当業者に公知の標準的な方法を用いて、P. furiosus、P. horikoshii、およびS. acidocaldarius由来のＡＫ遺伝子において、それぞれ実施例８〜１０および配列番号１７〜１９に示すように、部位特異的変異体を構築した。
【０１５２】
各遺伝子で同定した特定の変更に加えて、S. acidocaldarius配列で下線を付した領域は、古細菌アデニル酸キナーゼ三量体構造のコアパッキング領域を形成している。したがって、この領域のパッキングを妨げるアミノ酸置換は、酵素の熱安定性および物理的安定性を減少させるのに大きな効果を有していると思われる。逆に、コアパッキングを改善するアミノ酸置換（特に、大きな側鎖を有する疎水性残基）は、熱または他のプロセスに対して酵素を安定化させ得る。したがって、既に記載された特定の変異に加えて、これらの領域において関連した遺伝子配列の局在遺伝子シャッフリング（本質的にStemmer (1994) Nature 370: 389-391およびCrameriら (1996) Nature Biotech. 14: 315-319に記載のように）および縮重オリゴヌクレオチドまたは改変したヌクレオチド混合物を用いるランダムＰＣＲに基づく変異誘発（例えば、Vartanianら (1996) Nucleic Acid Res. 24: 2627-2633）を用いる、多くの「選択的」アプローチを使用した。これらの改変の多くは、E. coliでの組換え発現、および高温での溶解した細胞中のアデニル酸キナーゼ活性の迅速アッセイにより評価した場合に、変化した安定性を示している。
【０１５３】
（実施例８）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１７））
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＲＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
（ＫからＥ）ＩＱＲＥＬＱＭＫＡ ＡＫＫＩ（ＴからＡ）ＥＭＡＫＥ
ＨＰＩＬＶＤＴＨＡＴ ＩＫＴＰＨＧＹ（ＭからＬ）ＬＧ
ＬＰＹＥＶＶＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ
ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ
ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ
ＡＶＮＥＹＡ
【０１５４】
示した部位の１つ以上または全てでの変異が、酵素の熱安定性を改変する。強調した３つの規定の変更に加えて、１５７位のアラニンの別の小さな疎水性残基、例えば、Ｉ、Ｌまたはより大きな疎水性残基、例えば、Ｆへの改変は、組換えタンパク質の熱安定性を増大させる。したがって、これらの部位での改変の組み合わせによって可能な３５の改変体が存在する。アミノ酸１５７の極性残基、例えば、Ｔ（P. horikoshiiのＡｄｋＡでの等価な位置に見られる）、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒへの改変は、安定性の減少を生じる。
【０１５５】
（実施例９）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１８））
太字および下線で示した残基のいずれかまたは両方の改変は、酵素の熱安定性を増大さ
せる（３つの改変体が可能である）。
【０１５６】
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＫ ＬＡＬＱＲＴＲＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＬＫＬＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＶＱＲＥＬＱＭＮＡ ＡＫＫＩＡＥＭＡＫＮ ＹＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＩＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１５７】
（実施例１０）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１９））
示した下線の残基の改変は、酵素の熱安定性を増大させ得る。
【０１５８】
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＳＴＶＬＡＫ ＶＫＥＩＬＤＮＱＧＩ
ＮＮＫＩＩＮＹＧＤＦ ＭＬＡＴＡＬＫＬＧＹ ＡＫＤＲＤＥＭＲＫＬ
ＳＶＥＫＱＫＫＬＱＩ ＤＡＡＫＧＩＡＥＥＡ ＲＡＧＧＥＧＹＬＦＩ
ＤＴＨＡＶＩＲＴＰＳ ＧＹ（ＡからＭ）ＰＧＬＰＳＹＶ ＩＴＥＩＮＰＳＶＩＦ
ＬＬＥＡＤＰＫＩＩＬ ＳＲＱＫＲＤＴＴＲＮ ＲＮＤＹＳＤＥＳＶＩ
ＬＥＴＩＮＦＡＲＹＡ ＡＴＡＳＡＶＬＡＧＳ ＴＶＫＶＩＶＮＶＥＧ
ＤＰＳＩＡＡＮＥＩＩ ＲＳＭＫ
【０１５９】
（実施例１１）
（ＴＳＥの不活性化の検証のためのアデニル酸キナーゼインジケータ）
高い温度およびｐＨでのＴＳＥ材料のプロテアーゼ不活性化について使用するために、ＡＫベースのプリオンインジケータを開発した。
【０１６０】
（インジケータ１）
ポリカーボネート支持体を、精製組換えS. acidocaldarius ＡＫ（実施例４に記載）の処方物でコーティングした。この酵素を、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.4（ＰＢＳ）中に５％(w/v)ソルビトール、10mg/mlウシ血清アルブミン（Fraction V; Sigma chemical company）の存在下に１mg/mlの濃度で処方した。100μlの容量を、２２℃にて１時間支持体上で乾燥させた。
【０１６１】
（インジケータ２）
ポリスチレン支持体を、Tris緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）pH7.4中に１mg/mlのS. acidocaldarius ＡＫ、１ｍＭトリプトファン、５％(w/v)ソルビトールを含有する100μlの処方物でコーティングし、そして４℃にて２４時間乾燥させた。
【０１６２】
（インジケータ３）
第三のインジケータを、ジスルフィド結合形成に基づく方法を用いて、可撓性ポリスチレン細棒上でS. solfataricus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの１mg/mlの処方物の100μlを架橋させることにより調製した。組換え熱安定性アデニル酸キナーゼを、ヘテロ二官能剤のスルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＰＤＰ；Pierce chemical company, UK）を１：１〜３：１の間のＳＰＤＰ：タンパク質比で用いて誘導体化した。次いで、誘導体化したキナーゼを、還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）との反応により還元し、還元剤を透析により除去し、そしてキナーゼを、マレイミド誘導体化したポリスチレン細棒と反応させた。
【０１６３】
（プロテアーゼ処理）
器具洗浄浴を６０℃で作動するように設定し、そしてアルカリプロテアーゼ処方物を添加して、pH12（浴温で測定）に緩衝化された酵素1.5〜２mg/mlを得た。所望であれば、適切なアニオン性界面活性剤もまた処方物中に含まれ得る。インジケータを、記載の条件下で３０分間インキュベートした。次いで、インジケータを取り出し、そして蒸留水で１回リンスした。次いで、酵素活性を実施例１に記載のように測定し、そして蛍光をルミノメーターを用いて測定した。
【０１６４】
（アデニル酸キナーゼ酵素の標準曲線）
ＡＫ酵素の標準曲線を以下のようにして作成した。10μg/mlから１fg/mlまでの精製Sulfolobus acidocaldarius ＡＫの系列希釈を、50mM Tris、25mM MESNA、pH7.3中で調製した。100μlの酵素をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、そして100μlの135μM ＡＤＰ、15mM MgAc、１mM EDTAを各ウェルに添加した。３０℃、５０℃、および７０℃にて２０分間のアッセイプレートのインキュベーションについて、３つの別々の標準曲線を作成した。インキュベーション後、30μlのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Biothema）を添加し、そしてシグナルをルミノメーター（Orion, Berthold）で読み取り、そしてその結果を図３に示した。
【０１６５】
（ＴＳＥ不活性化の検証）
キナーゼ活性のレベルを、キナーゼの標準曲線に対して評価した。標準曲線から評価されるように、1,000,000相対発光量（ＲＬＵ）より大きな蛍光値を有する100μgのキナーゼを有するインジケータについては、4000ＲＬＵ未満の蛍光値はキナーゼ濃度の６対数減少に相当し、そして500ＲＬＵ未満の蛍光値はキナーゼ濃度の８対数減少に相当する。
【０１６６】
上記プロテアーゼ消化条件（pH12の緩衝液処方物中にＭＣ３と称するアルカリプロテアーゼを２mg/mlとし、６０℃で３０分間消化）下では、本発明者らは、ＶＭマウスでバイオアッセイしたBSE-301V株の感染度レベルで約８対数の減少を示した。同じ条件下で、上記のように処方したＡＫインジケータは、1,000,000超（未処理）から500未満のＲＬＵへのＲＬＵの減少を示した。したがって、キナーゼの濃度の８対数減少は、ＢＳＥの感染度の８対数減少に相当する。この事実を用いて、キナーゼ濃度をモニタリングし、この濃度をＢＳＥ感染度のレベルの減少と関連付けることが可能である。
【０１６７】
（検証された手順の使用）
いかなる型のＣＪＤが潜伏しているかが不明である患者に対して慣用の手術または神経手術で使用される手術器具のセットを、使用した後に院内滅菌サービスユニットに戻す。これらの器具を、アルカリプロテアーゼＭＣ３の処方物を用いて、６０℃にて３０分間作動するように設定した洗浄／消毒器中で、通常通り清浄を行うために準備する。１つ以上の上記ＡＫインジケータを処理浴中に入れておく。処理後、および器具が通常のオートクレーブ滅菌のために回送される前に、インジケータを取り出し、そして迅速アッセイを行い、プロセスが有効であることを確認する。プロセスのパラメーターとして規定された６対数または８対数の活性の減少を示すアッセイ結果が、器具がさらに処理される前に必要である。成功したプロセス後、器具は、必要に応じて、オートクレーブ滅菌のような他の滅菌手順に準備され得る。
【０１６８】
（実施例１２）
（酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼの発現）
実施例４の方法に従って、本発明者らは、酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼを発現させた：
【０１６９】
２０−Thermatoga maritima由来の酢酸キナーゼ
ＭＲＶＬＶＩＮＳＧＳ ＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭ ＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩ
ＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲ ＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨ ＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥ
ＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬ ＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤ ＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲ
ＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥ ＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫ ＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰ
ＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩ ＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶ ＰＮＶＡＶＦＤＴＡＦ
ＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬ ＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫ ＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧ
ＴＳＨＲＹＶＳＫＲＡ ＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥ ＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮ
ＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧ ＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴ ＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲ
ＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦ ＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰ ＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫ
ＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦ ＳＳＤＭＲＤＩＥＥＡ ＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬ
ＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡ ＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭ ＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡ
ＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲ ＥＤＶＣＳＹＬＥＦＬ ＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥ
ＥＴＩＲＧＫＥＧＩＩ ＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬ ＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩ
ＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫ ＩＧＲ
【０１７０】
２１−Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＭＫＬＰＳＨＫ ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ ＴＮＳＫＫＭＩＫＫＬ
ＩＥＡＧＭＮＶＡＲＩ ＮＦＳＨＧＴＦＥＥＨ ＡＫＩＩＥＭＶＲＥＱ
ＳＧＫＬＤＲＲＶＡＩ ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ
ＬＥＲＧＥＫＶＴＬＴ ＴＫＤＩＥＧＤＥＴＴ ＩＰＶＥＹＫＤＦＰＫ
ＬＶＳＫＧＤＶＩＹＬ ＳＤＧＹＩＶＬＲＶＥ ＤＶＫＥＮＥＶＥＡＶ
ＶＩＳＧＧＫＬＦＳＲ ＫＧＩＮＩＰＫＡＹＬ ＰＶＥＡＩＴＰＲＤＩ
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ ＮＶＹＤＶＬＫＡＫＳ
ＦＬＥＲＮＧＡＧＤＴ ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ ＡＶＲＮＦＮＥＩＬＮ
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ ＬＰＩＬＱＫＲＬＩＲ
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ ＭＥＫＶＰＴＲＡＥＶ
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ ＡＶＧＫＦＰＩＥＡＶ
ＥＭＭＡＲＩＡＫＶＴ ＥＥＹＲＥＳＦＧＩＴ ＲＭＲＥＦＬＥＧＴＫ
ＲＧＴＩＫＥＡＩＴＲ ＳＩＩＤＡＩＣＴＩＧ ＩＫＦＩＬＴＰＴＫＴ
ＧＲＴＡＲＬＩＳＲＦ ＫＰＫＱＷＩＬＡＦＳ ＴＲＥＫＶＣＮＮＬＭ
ＦＳＹＧＶＹＰＦＣＭ ＥＥＧＦＮＥＮＤＩＶ ＲＬＩＫＧＬＧＬＶＧ
ＳＤＤＩＶＬＭＴＥＧ ＫＰＩＥＫＴＶＧＴＮ ＳＩＫＩＦＱＩＡ
【０１７１】
２２−Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＫＴＫＩＶＡＴＬ ＧＰＳＳＥＥＫＶＫＥ ＬＡＥＹＶＤＶＦＲＩ
ＮＦＡＨＧＤＥＴＳＨ ＲＫＹＦＤＬＩＲＴＹ ＡＰＥＳＳＩＩＶＤＬ
ＰＧＰＫＬＲＬＧＥＬ ＫＥＰＩＥＶＫＫＧＤ ＫＩＶＦＳＱＫＤＧＩ
ＰＶＤＤＥＬＦＹＳＡ ＶＫＥＮＳＤＩＬＩＡ ＤＧＴＩＲＶＲＶＫＳ
ＫＡＫＤＲＶＥＧＴＶ ＩＥＧＧＩＬＬＳＲＫ ＧＩＮＩＰＮＶＮＬＫ
ＳＧＩＴＤＮＤＬＫＬ ＬＫＲＡＬＤＬＧＡＤ ＹＩＧＬＳＦＶＩＳＥ
ＮＤＶＫＫＶＫＥＦＶ ＧＤＥＡＷＶＩＡＫＩ ＥＫＳＥＡＬＫＮＬＴ
ＮＩＶＮＥＳＤＧＩＭ ＶＡＲＧＤＬＧＶＥＴ ＧＬＥＮＬＰＬＩＱＲ
ＲＩＶＲＴＳＲＶＦＧ ＫＰＶＩＬＡＴＱＶＬ ＴＳＭＩＮＳＰＩＰＴ
ＲＡＥＩＩＤＩＳＮＳ ＩＭＱＧＶＤＳＩＭＬ ＳＤＥＴＡＩＧＮＹＰ
ＶＥＳＶＲＴＬＨＮＩ ＩＳＮＶＥＫＳＶＫＨ ＲＰＩＧＰＬＮＳＥＳ
ＤＡＩＡＬＡＡＶＮＡ ＳＫＶＳＫＡＤＶＩＶ ＶＹＳＲＳＧＮＳＩＬ
ＲＶＳＲＬＲＰＥＲＮ ＩＩＧＶＳＰＤＰＲＬ ＡＫＫＦＫＬＣＹＧＶ
ＩＰＩＳＩＮＫＫＭＱ ＳＩＤＥＩＩＤＶＳＡ ＫＬＭＱＥＫＩＫＤＬ
ＫＦＫＫＩＶＩＶＧＧ ＤＰＫＱＥＡＧＫＴＮ ＦＶＩＶＫＴＬＥＱＱ
ＫＫ
【０１７２】
２３−Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＳＴＫＩＶＣＴＶ ＧＰＲＴＤＳＹＥＭＩ ＥＫＭＩＤＬＧＶＮＶ
ＦＲＩＮＴＳＨＧＤＷ ＮＥＱＥＱＫＩＬＫＩ ＫＤＬＲＥＫＫＫＫＰ
ＶＡＩＬＩＤＬＡＧＰ ＫＩＲＴＧＹＬＥＫＥ ＦＶＥＬＫＥＧＱＩＦ
ＴＬＴＴＫＥＩＬＧＮ ＥＨＩＶＳＶＮＬＳＳ ＬＰＫＤＶＫＫＧＤＴ
ＩＬＬＳＤＧＥＩＶＬ ＥＶＩＥＴＴＤＴＥＶ ＫＴＶＶＫＶＧＧＫＩ
ＴＨＲＲＧＶＮＶＰＴ ＡＤＬＳＶＥＳＩＴＤ ＲＤＲＥＦＩＫＬＧＴ
ＬＨＤＶＥＦＦＡＬＳ ＦＶＲＫＰＥＤＶＬＫ ＡＫＥＥＩＲＫＨＧＫ
ＥＩＰＶＩＳＫＩＥＴ ＫＫＡＬＥＲＬＥＥＩ ＩＫＶＳＤＧＩＭＶＡ
ＲＧＤＬＧＶＥＩＰＩ ＥＥＶＰＩＶＱＫＥＩ ＩＫＬＳＫＹＹＳＫＰ
ＶＩＶＡＴＱＩＬＥＳ ＭＩＥＮＰＦＰＴＲＡ ＥＶＴＤＩＡＮＡＩＦ
ＤＧＡＤＡＬＬＬＴＡ ＥＴＡＶＧＫＨＰＬＥ ＡＩＫＶＬＳＫＶＡＫ
ＥＡＥＫＫＬＥＦＦＲ ＴＩＥＹＤＴＳＤＩＳ ＥＡＩＳＨＡＣＷＱＬ
ＳＥＳＬＮＡＫＬＩＩ ＴＰＴＩＳＧＳＴＡＶ ＲＶＳＫＹＮＶＳＱＰ
ＩＶＡＬＴＰＥＥＫＴ ＹＹＲＬＳＬＶＲＫＶ ＩＰＶＬＡＥＫＣＳＱ
ＥＬＥＦＩＥＫＧＬＫ ＫＶＥＥＭＧＬＡＥＫ ＧＤＬＶＶＬＴＳＧＶ
ＰＧＫＶＧＴＴＮＴＩ ＲＶＬＫＶＤ
【０１７３】
２４−Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＶＫＬＰＳＨＫ ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ ＴＮＳＲＫＭＩＫＱＬ
ＩＫＡＧＭＮＶＡＲＩ ＮＦＳＨＧＳＦＥＥＨ ＡＲＶＩＥＩＩＲＥＥ
ＡＱＫＬＤＲＲＶＡＩ ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ
ＬＫＲＧＥＫＶＩＬＴ ＴＫＤＶＥＧＤＥＴＴ ＩＰＶＤＹＫＧＦＰＮ
ＬＶＳＫＧＤＩＩＹＬ ＮＤＧＹＩＶＬＫＶＥ ＮＶＲＥＮＥＶＥＡＶ
ＶＬＳＧＧＫＬＦＳＲ ＫＧＶＮＩＰＫＡＹＬ ＰＶＥＡＩＴＰＫＤＦ
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ ＳＶＹＤＶＬＫＡＫＳ
ＦＬＥＫＮＮＡＥＤＶ ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ ＡＶＲＮＦＤＥＩＬＮ
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ ＬＰＩＬＱＫＫＬＩＲ
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ ＴＥＫＶＰＴＲＡＥＶ
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ ＡＩＧＫＦＰＩＥＴＶ
ＥＭＭＧＫＩＡＫＶＴ ＥＥＹＲＥＳＦＧＬＳ ＲＩＲＥＦＭＥＩＫＫ
ＧＴＩＫＥＡＩＴＲＳ ＩＩＤＡＩＣＴＩＤＩ ＫＦＩＬＴＰＴＲＴＧ
ＲＴＡＲＬＩＳＲＦＫ ＰＫＱＷＩＬＡＦＳＴ ＮＥＲＶＣＮＮＬＭＦ
ＳＹＧＶＹＰＦＣＬＥ ＥＧＦＤＥＮＤＩＶＲ ＬＩＫＧＬＧＬＶＥＳ
ＤＤＭＶＬＭＴＥＧＫ ＰＩＥＫＴＶＧＴＮＳ ＩＫＩＦＱＩＡ
【０１７４】
２５−Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼ
ＭＫＶＬＶＩＮＡＧＳ ＳＳＬＫＹＱＬＩＤＭ ＴＮＥＳＡＬＡＶＧＬ
ＣＥＲＩＧＩＤＮＳＩ ＩＴＱＫＫＦＤＧＫＫ ＬＥＫＬＴＤＬＰＴＨ
ＫＤＡＬＥＥＶＶＫＡ ＬＴＤＤＥＦＧＶＩＫ ＤＭＧＥＩＮＡＶＧＨ
ＲＶＶＨＧＧＥＫＦＴ ＴＳＡＬＹＤＥＧＶＥ ＫＡＩＫＤＣＦＥＬＡ
ＰＬＨＮＰＰＮＭＭＧ ＩＳＡＣＡＥＩＭＰＧ ＴＰＭＶＩＶＦＤＴＡ
ＦＨＱＴＭＰＰＹＡＹ ＭＹＡＬＰＹＤＬＹＥ ＫＨＧＶＲＫＹＧＦＨ
ＧＴＳＨＫＹＶＡＥＲ ＡＡＬＭＬＧＫＰＡＥ ＥＴＫＩＩＴＣＨＬＧ
ＮＧＳＳＩＴＡＶＥＧ ＧＫＳＶＥＴＳＭＧＦ ＴＰＬＥＧＬＡＭＧＴ
ＲＣＧＳＩＤＰＡＩＶ ＰＦＬＭＥＫＥＧＬＴ ＴＲＥＩＤＴＬＭＮＫ
ＫＳＧＶＬＧＶＳＧＬ ＳＮＤＦＲＤＬＤＥＡ ＡＳＫＧＮＲＫＡＥＬ
ＡＬＥＩＦＡＹＫＶＫ ＫＦＩＧＥＹＳＡＶＬ ＮＧＡＤＡＶＶＦＴＡ
ＧＩＧＥＮＳＡＳＩＲ ＫＲＩＬＴＧＬＤＧＩ ＧＩＫＩＤＤＥＫＮＫ
ＩＲＧＱＥＩＤＩＳＴ ＰＤＡＫＶＲＶＦＶＩ ＰＴＮＥＥＬＡＩＡＲ
ＥＴＫＥＩＶＥＴＥＶ ＫＬＲＳＳＩＰＶ
【０１７５】
（実施例１３）
（ＴＳＥ因子のタンパク質分解不活性化のためのインジケータとしての熱安定性アデニル酸キナーゼ）
アルカリプロテアーゼの20mg/mlストックを緩衝化0.2M KCl（pH12）中の10μg/mlの組換えS. acidocaldarius ＡＫの溶液を用いて希釈し、２mg/mlから減少させて0.001μg/mlまでの範囲のプロテアーゼ濃度を生成した。100μlの容量の材料をポリスチレンサーモサイクラープレートに添加し、そして６０℃にて１０分間インキュベートし、アルカリプロテアーゼによってＡＫを消化した。10μlの10×リン酸緩衝液（pH7）の添加により、この溶液を中和した。15mM MgAc、１mM EDTA緩衝液中135μM ＡＤＰを100μl／ウェルで添加した。次いで、これらのウェルをサーモサイクラー中で７０℃にて２０分間インキュベートした。ルシフェリン／ルシフェラーゼ（ＡＴＰ）試薬（Biothema）を30μl／ウェルで添加し、そしてこれらのウェルをルミノメーターで即時に読み取った。アッセイの結果を図２に示す。
【０１７６】
これらの結果は、手術器具の汚染除去のために有用であると同定された条件下で、アルカリプロテアーゼによる消化に対するＡＫ酵素の顕著な安定性を示している。アルカリプロテアーゼでの消化後に見られた減少を処理後に残存する活性のレベルに関連付けるために、図３に示すような標準曲線を用いる。次に、これは、ＴＳＥの滴定曲線を用いて感染度のレベルの減少度に関連付けられる。インジケータとしての使用のために、アッセイは、酵素活性の標準曲線が、プロセスによる汚染除去の受容可能なレベルに相当する限界／閾値が明確に示されるように設計される。
【０１７７】
（実施例１４）
（生物学的界面活性剤を用いる衣服洗浄サイクルの性能の検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、ジスルフィド結合形成に基づく方法を用いて、可撓性ポリスチレン細棒上にS. solfataricus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼを架橋させることにより調製する。この方法では、熱安定性アデニル酸キナーゼを、スルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＰＤＰ；Pierce chemical company, UK）のようなヘテロ二官能剤を１：１〜３：１の間のＳＰＤＰ：タンパク質比で用いて誘導体化させる。次いで、誘導体化したキナーゼを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または2-メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）のような還元剤との反応により還元し、還元剤を透析により除去し、そしてキナーゼを、マレイミド誘導体化したポリスチレン表面と反応させる。代表的には、0.1mgのキナーゼがインジケータ上に存在する。
【０１７８】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、高タンパク質結合性ポリスチレンストリップ上へのS. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの非特異的接着により調製する。キナーゼを、必要に応じて安定化剤のソルビトールを0.1〜２％w/vで含む炭酸水素緩衝液(pH9.6)中で0.5〜２mg/mlの濃度で調製する。次いで、結合緩衝液中のキナーゼを高タンパク質結合性ポリスチレンストリップと２２℃にて１〜２時間（または４℃にて終夜）インキュベートする。残余キナーゼをリン酸緩衝化生理食塩水中での洗浄により除去する。代表的には、0.1mgのキナーゼがインジケータ上に存在する。
【０１７９】
（洗浄サイクルの検証）
洗浄機に洗浄する品目を入れ、そして洗浄機の内部にある適切なホルダー内にインジケータを固定する（その回収を容易にするため）。次いで、洗浄サイクルを行う。サイクルの完了後、インジケータを取り出し、そしてキナーゼの残余活性を、実施例１に記載のアッセイ方法に基づく「読み取り機」を用いて評価する。この読み取り機は、インジケータ内で受容可能な「閾値」レベルの残余キナーゼ活性を示すように較正される。この「閾値」レベルは、プロセス内での以前の較正および適切な性能の評価から導き出される。
【０１８０】
残余キナーゼ活性がこの閾値レベル以下であることを読み取り機が示す場合、投入物は清浄化されており、さらに処理される。
【０１８１】
（実施例１５）
（プロテアーゼ処方物を用いる硬質表面上でのノーウォーク様ウイルス（ノロウイルス、ノーウォークウイルス、または冬季嘔吐病とも呼ばれる）の不活性化のためのプロセスの検証）
（インジケータの調製）
実施例１４に記載のようなジスルフィド介在架橋を用いて、S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを薄片ポリスチレンストリップ上に固定化することにより、インジケータを調製する。
【０１８２】
（検証）
インジケータストリップを、汚染の可能性のある表面上に置く。次いで、表面およびインジケータストリップの両方を、ペースト中に処方された高活性アルカリプロテアーゼであるプロテイナーゼＫでコーティングする。（プロテイナーゼＫをペーストに処方することは、酵素と表面／インジケータとの間の接触を改善する。）このペーストを１〜２時間、表面／インジケータ上に放置する。
【０１８３】
処理の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、表面は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１８４】
（実施例１６）
（リシンのプロテアーゼ分解の検証）
（インジケータの調製）
テキストおよび実施例１４に記載される標準的なスルフヒドリル−マレイミドカップリング方法を用いて、Thermotoga maritima由来の熱安定性酢酸キナーゼ0.1mgをポリカーボネートストリップ上に固定化することにより、インジケータを調製する。
【０１８５】
（検証）
このインジケータストリップを、実施例１１と同様に、汚染除去される対象物と一緒にプロテアーゼ溶液中に浸漬するか、または実施例１５と同様に、汚染除去される表面に取り付けるかのいずれかを行う。
【０１８６】
次いで、対象物／表面を、必要な長さの時間、プロテアーゼ溶液で処理する。処理の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、対象物／表面は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１８７】
（実施例１７）
（ＴＳＥ因子の気相オゾン不活性化の検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、実施例１４に記載のようなＳＰＤＰ−マレイミド方法を用いて、S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを剛性ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）支持体上に共有結合架橋させることにより調製する。
【０１８８】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、アミン反応性ＰＶＣ表面の存在下でS. acidocaldariusアデニル酸キナーゼをビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ；Pierce chemicals）と反応させることにより調製する。これにより、キナーゼは、アミド結合を介して表面に迅速に共有結合される。
【０１８９】
（検証）
インジケータおよびＴＳＥ汚染物品を、気相オゾン不活性化プロセスに曝露する。プロセスの終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、この物品は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９０】
（実施例１８）
（内視鏡清浄のための液体化学滅菌システム（例えば、Endoclens）の検証）
（インジケータ１の調製）
A. fulgidus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを内視鏡チューブと同様の総内直径のチューブの内表面に（実施例１４に記載のＳＰＤＰベースの方法を用いて）化学架橋させることにより、インジケータを調製する。
【０１９１】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、アデニル酸キナーゼを誘導体化することなく調製する。Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼの遺伝子配列を、組換えタンパク質が、配列番号４に示すような配列のアミノ末端に付加システインを含むように改変する。組換えタンパク質を前に記載したように発現および精製し、そしてＤＴＴで還元し、スルフヒドリル基が利用可能であることを確定にする。次いで、これをマレイミド反応性プラスチックと直接反応させて、必要な架橋を生成し得る。約１〜２mg/mlのシステイン含有酵素の処方物は、実施例１４に記載の誘導体化方法に必要とした処方物と同様である。
【０１９２】
（検証）
インジケータ装置を、自動化再処理装置上で内視鏡に直列に連結し、そして次いで、内視鏡を通常通りに動かす。プロセスの終了時、インジケータを外し、そして残余キナーゼ活性のレベルについて、実施例１４に記載と同様に「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、内視鏡は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９３】
（実施例１９）
（院内洗浄消毒器での手術器具の清浄の検証）
（インジケータ１の調製）
S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgをステンレススチール表面に非共有結合にて付着させることにより、インジケータを調製する。本実施例では、インジケータが、プロセスによる表面汚れの除去を測定するように設計されるので、タンパク質をインジケータデバイスに共有結合によって連結させない。キナーゼを、好ましくは、約pH9.6の炭酸水素緩衝液中に、１〜２mg/mlで処方する。材料を、室温にて１〜２時間インキュベートすることにより、金属表面上に吸着させる。金属表面は、必要に応じて、より疎水性となるように改変され得る（例えば、厳しさの高い洗浄については、インジケータに十分なシグナルが保持されるのを確実にするために、さらなる付着が必要とされ得る）。付着されていないキナーゼは、接着したインジケータキナーゼの大部分を外すことのないような条件下でインジケータを洗浄することにより除去される。
【０１９４】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、このタイプの清浄プロセスを検証するために現在使用されている標準汚れを含む処方物の一部として、ステンレススチール表面に、S. acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ0.1mgを、（インジケータ１について記載の方法を用いて）接着させることにより調製する。このことにより、インジケータ技術を、洗浄消毒器の慣用的な検証および維持の一部として規制機関に受容可能な方法と相関させることが可能になる。
【０１９５】
（検証）
インジケータを、処理される手術器具のバッチに入れ、そして洗浄消毒器サイクルを実行する。実行の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルについて実施例１４に記載と同様に「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、器具は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９６】
（実施例２０）
（バルク液を滅菌するためのプロセスの検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼ0.1mgをポリスチレンストリップに共有結合で付着させることにより調製する。
【０１９７】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、A. fulgidus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを透析チューブのような半透過性膜の内表面に付着させることにより調製する。A. fulgidusキナーゼは、天然に存在する反応性システイン残基を含み（すなわち、天然型酵素内ではジスルフィド結合されていない）、これは、ＢＭＰＨ（Pierce）と反応し得る。これは、例えば、適切な酸化剤でのビスキングチューブの処理によって生じるような、酸化された糖質と反応し得る基を生じる。この酵素を実施例１４に記載のように処方し、そして酸化された膜表面と反応させて、共有結合したインジケータを生成する。
【０１９８】
（検証）
次いで、インジケータを、バルク液内に付着させ、そして滅菌プロセス（例えば、オートクレーブ処理、酸化ガスの通過、または他の化学滅菌）を行う。
【０１９９】
プロセスの完了時に、バルク液からインジケータを取り出し、そしてキナーゼの残余活性を実施例１４に記載のように規定の閾値と比較する。
【０２００】
（実施例２１）
（プロテアーゼ消化後の残余アデニル酸キナーゼ酵素活性の較正）
プリオン因子の不活性化の適切なレベルの評価のための較正曲線の図を、図６に示す。
【０２０１】
示した例は、pH12で３０℃にて３０分間として規定した条件下の手術器具のプロテアーゼ処理についてである。
【０２０２】
プロテアーゼ濃度は、記載の条件下で種々の濃度のプロテアーゼでプリオン不活性化のレベルを評価することにより規定される（パネルＡ）。図では、プロテアーゼＭＣ３は、規定された条件下で１mg/mlの濃度で、感染量の６対数減少に等価な不活性化のレベルを提供し得る。プロテアーゼの等価な濃度で、かつ同じ条件下で、本質的に実施例１１に記載したように調製したS. acidocaldariusインジケータに残っているアデニル酸キナーゼの残余活性は、10ＲＬＵの桁である（パネルＢ）。したがって、一バッチの器具を再利用のために通過させるには、10ＲＬＵ未満の値が必要である。
【０２０３】
必要に応じて、１未満のＲＬＵ値が必要であるように、さらなる安全性余裕が組み込まれる。これは、プリオン感染度の７対数減少（設定標準より１対数さらに不活性化）を示すプロテアーゼ濃度でのインジケータの処理後の残余アデニル酸キナーゼ活性のレベルに相関している。
【０２０４】
（実施例２２）
（オゾン処理後の残余アデニル酸キナーゼ酵素活性の較正）
オゾン処理方法によるプリオン因子の不活性化の適切なレベルの評価のための較正曲線の図を、図７に示す。
【０２０５】
示した例は、規定の時間にわたって滅菌チャンバー中に定速でオゾンを放出するオゾン処理についてである。次いで、時間を増減させることによりオゾンレベルを算定し、付随してオゾン濃度が増減する。
【０２０６】
パネルＡには、標準サイクル時間の分数または倍数によって、プリオン不活性化のレベルを示す。したがって、2.5標準サイクルは、プリオンの６対数不活性化を表す。等価倍数のオゾンサイクルでは、本質的に実施例１７に記載のように調製したインジケータに残っているアデニル酸キナーゼの残余レベルは、1000ＲＬＵの桁である。
【０２０７】
したがって、一バッチの器具を再利用のために通過させるには、1000ＲＬＵ未満の値が必要である。必要に応じて、100未満のＲＬＵ値が必要であるように、さらなる安全性余裕がインジケータについて組み込まれる。これは、プリオン感染度の７対数減少（設定標準より１対数さらに不活性化）を示すオゾン濃度でのインジケータの処理後の残余アデニル酸キナーゼ活性のレベルに相当している。
【０２０８】
（実施例２３）
（院内洗浄消毒器での手術器具の慣用の清浄をモニタリングするために設計されたインジケータについての較正）
図８は、生物学的（酵素含有）処方物または界面活性剤ベースの処方物のいずれかを用いる手術器具の慣用の清浄を評価するための較正曲線の図を示す。
【０２０９】
インジケータデバイスを、実施例１９に記載するように調製する。
【０２１０】
パネルＡは、規定の洗浄機用処方物を用いた洗浄消毒器実行による規定の医用器具からの標準汚れの除去率を示す。洗浄サイクルの時間は、適切な性能レベルを決定するために変更される。パネルＢは、実施例１７に記載のように調製し、そして標準的に汚れている器具に関して同じ条件下で洗浄したインジケータデバイスからの残余S. acidocaldariusキナーゼ活性を示す。
【０２１１】
汚れの残余レベルは、この試験における出発物の0.1％であると規定され、そしてこれは、２５分間の洗浄時間と相関している。２５分間洗浄したインジケータについてのＲＬＵ値は、約100ＲＬＵである。したがって、インジケータは、３０分洗浄サイクル内で使用され、100のＲＬＵ閾値を有する上記0.1％レベルまたは約２５のＲＬＵカットオフを有する0.05%レベルが、受容可能な「汚れ」除去であるとの指標を提供し得る。
【０２１２】
（実施例２４）
（キナーゼインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持型衛生モニターの改変）
本発明のインジケータに関連したキナーゼ活性のレベルを評価するために、多くのアッセイ形式が潜在的に利用可能である。これらには、チューブ状ルミノメーター、マイクロタイタープレートルミノメーター、および種々の他の形式が含まれる。
【０２１３】
本発明のインジケータ上のキナーゼ活性の評価に格別な実用性を有する１つの形式は、手持型衛生モニターである。現行の技術は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ酵素システムを介して、表面上で直接的にか、または表面から取り出した細菌または他の細胞を溶解することによるかのいずれかで、ＡＴＰを検出する。
【０２１４】
当業者は、システムがＡＴＰの存在に応じて光を生成および測定する能力を既に備えるので、このシステムがインジケータデバイス上でのキナーゼの検出用に適合可能であることを認識する。キナーゼについてのＡＤＰ基質を添加するように試薬処方を変更することにより、インジケータ上の酵素の存在を迅速に測定することが可能である。
【０２１５】
実施の際、インジケータを一バッチの材料に添加し、そして処理する。次いで、インジケータを取り出し、そして試薬チューブに入れ、ＡＴＰを生成させる。この試薬チューブの処方は、高純度ＡＤＰ試薬を用いて、本質的に実施例１の方法に記載の通りである。チューブを、モニタリングされるインジケータおよびプロセスのタイプについて規定されるように、規定の長さの時間インキュベートする。インキュベーションの終了時、残余ｔＡＫの存在により生成したＡＴＰを含む試薬試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼを含む第二のコンパートメントに放出し、そして測定可能な光を生じさせる。
【０２１６】
このデバイスは、第一のＡＴＰ生成工程がＡＴＰの検出に必要でないので、標準的な衛生モニターとは異なる。このようなデバイスを構築する最も簡易な方法は、図９に示すように、破断可能な隔膜によって分離された２つのコンパートメントを有するチューブを有することである。第一の位置（工程１）でチューブに挿入されたインジケータは、ＡＴＰ生成を可能にし、そしてインキュベーションの終了時に、自動的にまたは手動のいずれかで、工程２に示される位置に押し出され、そこで光生成が生じる。このようなデバイスの広範な種々の別の構築物も可能である。必要に応じて、内因性キナーゼ活性を除く熱変性工程および／または内因性ＡＴＰを除くアピラーゼ処理が実施され得る。ＡＴＰ生成工程は、必要とされる場合に高温で実施され得る。
【０２１７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、および９０℃（Ｃ）での処理後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す。
【図２】図２は、種々の濃度のアルカリプロテアーゼによるアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）消化後の残余酵素活性を示す。
【図３】図３は、酵素活性とアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の残余濃度との相関を示す標準曲線を示す。
【図４】図４は、E. coliで組換え発現した種々のＡＫ酵素の熱安定性を示す。
【図５】図５は、固体支持体への熱安定性アデニル酸キナーゼ（ｔＡＫ）の結合の差異を示す。
【図６】図６は、プリオンを不活性化するためのプロテアーゼ消化処理についての較正曲線の作成を示す。
【図７】図７は、プリオンを不活性化するための気相オゾン処理についての較正曲線の作成を示す。
【図８】図８は、標準的な汚れを除去するための院内用洗浄消毒器についての較正曲線の作成を示す。
【図９】図９は、ｔＡＫインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持形衛生モニターの改変を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、熱による不活性化プロセスおよび不活性化手順を含むプロセスの検証、およびより詳細には、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子を不活性化する手順の検証に適した生物学的インジケータに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）は、人口１００万人当たりに約１症例の頻度で家族性、散発性、または医原性疾患のいずれかとして現れる、比較的に稀な形態のヒト神経変性障害である。主に若年群でのそしておそらくウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）感染肉製品の摂取に起因する、この疾患の新規変異体形態（ｖＣＪＤ）の出現は、症例数が大いに増大する可能性を引き起こした。これらの要因は、公衆衛生への重要な影響を有する。１９８０年代後半の間に、英国人口の大部分が、食品を介してこの疾患に曝露された可能性がある。これまでの症例数は比較的低かった（２００４年２月までに149症例）が、全てのＣＪＤ形態から、他の伝染経路（外科手術、移植、輸血、または汚染された医薬製品を含む）を介する重大な危険性が残されている。これらの経路のいくつかは、臨床環境でのこの疾患の医原性の蔓延の際に示され、他は、動物モデルで定義された。
【０００３】
ヒトにおいて全てのＣＪＤ形態を引き起こす原因となる因子は、標準的な方法による不活性化に対して非常に耐性がある。手術器具の汚染除去のために検証済みの方法が緊急に必要とされている。種々の処理（化学処理、ならびに湿潤または乾燥加熱での高温および高圧の使用を含む）が試験されているが、いずれも十分ではない［Taylor, D.M., (1999), Principles and practice of disinfection, preservation and sterilisation. (Russell, A.D., Hugo, W.B.およびAyliffe, G.A.J., 編):222-236頁, Blackwell Scientific Publications, Oxford；Taylor, D.M., (2001) Contrib Microbiol. 7, 58-67；Taylor, D.M., Fernie, K, Steele, P.J., McConnell, I.およびSomerville, R.A., (2002) J Gen Virol. 83,3199-3294］。焼却が有効であるが、原料または装置の回収または再利用ができなくなる。高濃度の水酸化ナトリウム（２Ｍまで）または高レベルの次亜塩素酸ナトリウム（20000ppmまで）の使用は、ＴＳＥ因子のレベルを有意に減少させることが示されているが、手術器具に有害な影響を有しており、そして術者にとって有害であり得る。手術器具についてＴＳＥ因子を不活性化する手段として、広範に種々の他の方法が提案され、現在開発中である。これらには、蒸気相過酸化水素、オゾン、およびエチレンオキサイドを含む種々の気相滅菌剤が含まれる。他の方法は、慣用的な滅菌前の特定の抗ＴＳＥ前処理として提案されており、そしてこれらには、規定のｐＨおよび温度条件下で熱安定性プロテアーゼを用いる手術器具の処理が含まれる。
【０００４】
Bacillus stearothermophilus胞子の不活性化は、オートクレーブの正確な性能を検証するために慣用的に用いられる方法である。このようなインジケータは、細菌またはウイルスがそのプロセスによって不活性化されたという関連の指標を表し得、このプロセスでは、通常、１０６の桁で感染性因子のレベルを減少させることが検証される。しかし、ＴＳＥ因子の独特の安定な特性は、このような因子を不活性化するというプロセスの性能の関連した指標を提供するために、ずっとより強健なインジケータが必要であることを意味する。
【０００５】
熱安定性胞子または酵素調製物に基づく他の生物学的インジケータは、当業者に周知である。全てが、それらが活性の１０６減少を超えた感染性因子の不活性化を検証することができないという欠点を有する。
【０００６】
ＴＳＥ因子の不活性化はまた、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）感染材料の処分のために、および動物起源の原料の調製に際して重大な問題である。現在、ＢＳＥの出現および蔓延が、高感染性神経組織が肉骨粉補給を介してウシにフィードバックされるレンダリング実践の変化によるものであったという有効な科学的証拠がある。ほぼ確実には汚染牛肉製品を食べた結果、ＢＳＥがｖＣＪＤの原因となったという有効な証拠もある。この理由のために、ＢＳＥで死んだウシは、現在、全てのウシに由来する脊髄および脳組織と共に、食物連鎖から排除され、代替経路によって処分される。これは、現在、莫大量の動物廃棄物が蓄積されつつあるか、または焼却によって処分されつつあるという結果を有する。熱安定性プロテアーゼによるこのような材料の処理は、１つの可能な解決である。また、いかなる感染材料も適切なプロセスで破壊されることを確実にする検証手順の必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、代替のおよび／または改善された生物学的インジケータおよびそれらの使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の第一の局面では、キナーゼを含む、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータが提供される。好ましい実施態様では、インジケータは、さらに固体支持体を含み、キナーゼは、この固体支持体中に固定化されているか、または固体支持体上に固定化されている。特に好ましい実施態様では、キナーゼは熱安定性キナーゼである。
【０００９】
本発明の使用に際して、生物学的インジケータは、潜在汚染物（特に感染性因子）の含有量を減少させることを意図する処理に供せられる試料中に含有される。この処理によるインジケータであるキナーゼの活性の減少が、汚染物の量または活性の減少と相関させられ得ることは、事前の試験から知られている。汚染物の量／活性が受容可能なレベル以下に減少したか否かを決定するために、インジケータであるキナーゼの活性が、処理の前および後、または処理の間に測定される。汚染物における受容可能な減少と相関することが知られる活性のレベルに達すると、その処理は検証されたとみなされる。汚染物が感染性因子である場合、試料は無菌であるとみなされ得る。
【００１０】
本発明の特定の使用に際して、熱安定性キナーゼは、清浄または不活性化の手順後の因子（例えば、感染性因子）の存在可能性を示す方法におけるレポーターである。まず、熱安定性アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼを含有する試料を、清浄／不活性化手順（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度の１つ以上）に曝露する。次の工程は、熱処理、例えば、６０〜８０℃で少なくとも１０分間（すなわち、熱安定性キナーゼに顕著に影響しない条件下）によって、いかなる汚染の酵素活性も除去することである。次いで、熱安定性キナーゼを、３０℃と７０℃との間の温度で基質（例えば、ＡＤＰ）と反応させて、ＡＴＰを生成させる。ＡＴＰの形成は、２０〜３０℃で１０分〜１時間の間、ルシフェリン／ルシフェラーゼおよび適切なルミノメーターを用いる生物発光検出によって測定され得る。ルミノメーターからの読み取り値によって、残余キナーゼ活性（すなわち、清浄／不活性化処理への曝露後のキナーゼの活性）の読み取り値が与えられる。以前に別の実験から得られたデータに基づいて、この方法は、残余キナーゼ活性と、処理した試料内の感染性因子の存在可能性とを相関させることにより完了される。
【００１１】
１つの実施態様では、試料中の汚染酵素活性またはＡＴＰが、インジケータの添加前に、初期処理工程（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度）によって除去され得る。
【００１２】
キナーゼ酵素は、非常に広い範囲にわたって検出可能であるシグナルを生じ得ることが分かっている。一般に、キナーゼは、ＡＤＰを含む基質を用いて検出される。ＡＤＰは、ＡＴＰに変換され、ＡＴＰはそれ自体、例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼを用いて発光に用いられ、発光はルミノメーターを用いて検出される。この広範な範囲のために、キナーゼはその量／活性が多対数減少した後であっても検出可能なままであるので、インジケータは、検証のために特に適したものとなる。無菌性に関して、ほとんどの国立研究所は、無菌性が検証され得る前に、生物学的因子の量または活性の６対数減少が必要であるとみなしている。本発明のキナーゼは、因子の量または活性の減少が６対数を十分に超えて８対数以上であることを検証する可能性を与え、したがって、現時点で与えられているモニタリングの範囲を増大させる。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様では、キナーゼは熱安定性であり、したがって高温で実施されるプロセスの検証に用いるのに適している。熱安定性キナーゼはまた、他の極限的な環境に対して耐性であることが分かっており、そして例えば、ｐＨの極値に対して耐性であり、そしてタンパク質分解酵素への曝露に対して耐性であることもしばしば分かっている。そこで、本発明のキナーゼは、高ｐＨ、高温、およびプロテアーゼの１つまたは組み合わせまたは全部を用いる生物学的因子の処理のモニタリングに用いられ得る。
【００１４】
熱安定性であるとは、７０℃で３０分間の曝露後に、キナーゼの活性の少なくとも９５％が保持されていることを意味する。本発明の好ましい酵素は、非常に熱安定性であり、そして１０分間８０℃へ加熱した後に少なくとも９５％の活性を保持する。中温性生物由来のキナーゼおよび種々の好熱性生物、例えば、Bacillus stearothermophilus（生物学的インジケータとして広範に使用される）由来のキナーゼさえもこれらの基準に適合しないが、それにも関わらず、より低い温度で実施される処理のためのインジケータとして適切であり得る。
【００１５】
本発明の特定の実施態様で使用されるキナーゼは、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼ、またはそれらの組み合わせである。さらに、これらのアデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、およびピルビン酸キナーゼの酵素は、Pyrococcus furiousus、P. abyssi、P. horikoshii、P. woesii、Sulfolobus solfataricus、S. acidocaldarius、S. shibatae、Rhodothermus marinus、Thermococcus litoralis、Thermatoga maritima、Thermatoga neapolitana、およびMethanococcus spp.から得られ得る。アデニル酸キナーゼは、特に特に好ましく、そして以下に詳述する本発明の実施例において使用されている。キナーゼは、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒し、次いで、このＡＴＰは、公知の方法および試薬を用いて容易に検出される。本発明に適した特定のキナーゼは、配列番号１〜３０に記載される。
【００１６】
ＡＴＰ生物発光検出は、キナーゼ活性を検出する好ましい手段である。標準的なルシフェリン−ルシフェラーゼアッセイ方法は、10-15モル程度の少ない量のＡＴＰも検出し得る。酵素的増幅を生物発光検出方法と組み合わせることにより、10-2０モル程度の少ないキナーゼも検出することが可能である。したがって、このタイプのフォーマットは、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）に連結した結合種を用いる分子の検出に顕著な感度を与える。
【００１７】
生物発光検出を組み合わせたキナーゼ（例えばＡＫ）の使用は、いくつかの他の顕著な利点を有する。このアッセイは、他の匹敵するアッセイフォーマットに比べてよりずっと大きな範囲にわたって、酵素活性と光生成との間の直接的な関連を与える。したがって、伝統的なレポーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を用いるアッセイは５〜６対数希釈で比例応答を与えるが、ＡＫ−ルシフェラーゼアッセイは、少なくとも８対数のダイナミックレンジを提供し得る。直接的なインジケータとして、これは、標準の６対数範囲よりも大きな不活性化のレベルを必要とするプロセスにとって特に有用になる。なぜなら、そのシグナルが、アッセイの全範囲にわたって意味があるものになり得るからである。このようなことは、他のアッセイフォーマットを用いても可能ではない。これは、より悪い場合の筋書きで、８対数もの多くの感染度が手術器具の表面に存在する場合のＴＳＥ不活性化に特に関連し、これは、１ｍｇ当たり１０８ＴＳＥ感染単位までのレベルで１ｍｇの脳組織が存在すると仮定される。これらの状況下で、本発明のインジケータは、８対数範囲のシグナルを提供する場合に特に有益である。
【００１８】
ＴＳＥインジケータが必要とされるプロセスのタイプを考慮すると、熱的および物理的の両方について高レベルの安定性が好ましい。以下の実施例において、好熱性生物由来のＡＫ酵素の範囲の特性を比較した。インジケータ株であるB. Stearothermophilusのような好熱性生物由来のＡＫでさえも、比較的に低い温度ではそれらの活性の大部分を喪失する。例えばオートクレームサイクルに含まれるキナーゼベースのインジケータのために、例えば、Sulfolobus種またはPyrococcus furiosus由来の酵素によって示されるような有意により大きな熱安定度が、使用される。
【００１９】
熱不活性化に対する酵素（例えば、キナーゼ）の安定性を増大させる多数の添加剤および処方変更は、当業者に公知である。本発明の実施態様で使用される熱安定性キナーゼは、それらが既にこのタイプのプロセスに用いられる他の酵素よりも有意に安定である場合、安定性をあまり必要としない。本明細書中に記載のＡＫ酵素、特にSulfolobus acidocaldarius、S. solfataricus、S. shibatae、Pyrococcus furiosus、Rhodothermus marinus、およびThermococcus litoralis由来のＡＫ酵素は、８０℃と９０℃との両方で、Bacillus stearothermophilusのようなプロセス滅菌のインジケータとして通常使用される生物由来の酵素に比べてさえも顕著に安定である。多くの場合、固体支持体上に安定化されたこれらのＡＫ酵素は、例えばオートクレーブ滅菌、低温殺菌、または等価の殺菌後に測定される必要な範囲の活性を提供するために、さらなる安定化を必要とし得ない。
【００２０】
安定化剤（例えば、４Ｍの濃度までのソルビトール、または２Ｍまでの濃度のエチレングリコール、グリセロール、もしくはマンニトールのような他のポリオール）の添加により、酵素の熱安定性が改善され得る。他の添加剤（例えば、キシラン、トレハロース、ゼラチン）もまた、個別または組み合わせでのいずれかで、さらなる安定化効果を提供し得る。種々の二価金属イオン（最も著しくはCa2+、Mg2+、またはMn2+）の添加によっても、酵素の安定性は改善され得る。
【００２１】
酵素の化学的改変もまた、それらの熱安定性を改善するために使用され得る。グリオキシル酸による表面露出したアミノ基の還元アルキル化（例えば、Melik-Nubarov (1987) Biotech letts 9: 725-730）、タンパク質表面への糖質の付加（例えば、Klibanov (1979) Anal. Biochem. 93: 1-25）、およびアミド化（例えば、Klibanov (1983) Adv. Appl. Microbiol. 29: 1-28）は全て、酵素の安定性を増大させ得る。酵素固定化のための化学架橋剤の使用および種々の重合支持体の使用を含むさらなる方法もまた、酵素の熱安定性を増大させるのに関連した方法である（Gupta (1991) Biotech. Appl. Biochem. 14: 1-11に概説される）。
【００２２】
同様の改変はまた、過酸化水素またはオゾンのような他の滅菌プロセスに対するインジケータの安定化にも関連している。特に、酵素への気相滅菌剤の接近が制限されるプロセス（例えば、適切なポリマー中のカプセル化またはガスの透過を減少させる添加剤を用いた処方による）は、必要に応じて酵素の安定化を増大させるために有用な方法を提供する。
【００２３】
酵素の熱安定性を増大させるのに有効である処理の多くはまた、プロテアーゼ処理のための、例えば、プロテアーゼ処理によるＴＳＥ因子の有効な不活性化についてのインジケータの開発のための安定化にも関連している。一般に、高レベルの熱安定性を示すタンパク質は、変性またはプロテアーゼ処理のような分解プロセスに対しても高度の安定性を示すと考えられる（例えば、以下を参照のこと：Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP, 「A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis」, Biochem J. 1982 207: 641-4；Rees DC, Robertson AD, 「Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins」, Protein Sci. 2001 10: 1187-94；Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG.「Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity」, Enzyme Microb Technol. 2000 27: 11-18；Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC.,「Protein thermostability in extremophiles」, Biochimie. 1998 Nov; 80 (11): 933-41；およびLiao HH.,「Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents」, Enzyme Microb Technol. 1993 Apr;15 (4):286-92）。したがって、熱安定性キナーゼは、一般に、ＴＳＥ因子を不活性化するように設計されたプロテアーゼ処理による作用に対して、等価の中温性キナーゼよりも高度の安定性を示す。用いたプロセスのタイプに依存して、キナーゼは、プロセスの他の特徴に有利であるようにも選択され得る。したがって、酸性ｐＨでのプロテアーゼ処理がS. acidocaldariusまたはS. solfotaricusのような好酸性生物に由来するキナーゼを使用するのに対し、アルカリ性ｐＨでのプロテアーゼ処理のためには、このプロトコルは、P. furiosusのような中程度に好アルカリ性の生物に由来する熱安定性キナーゼを使用する傾向がある。
【００２４】
プロテアーゼ処理に対するキナーゼインジケータの安定性を改善するために必要であれば、多くの他の選択肢が存在する。これらの多くは、熱処理に対する酵素の安定化について上述したものと同じである。
【００２５】
例えば、ソルビトール、マンニトール、または他の複合ポリマーを含有する処方物は、インジケータ表面上での酵素の不活性化のレベルを減少させる。さらに、プロテアーゼ基質が分解される速度を特異的に減少させる処理は、この適用に特に関連している。例えば、プロテアーゼの代替基質として作用する適切なキャリアタンパク質（例えば、カゼインまたはアルブミン）を約10mg/ml（インジケータの好ましい濃度に比べて10倍過剰）までで含有する溶液中のキナーゼの処方物は、キナーゼインジケータの消化の速度を特異的に減少させる。同様に、処方物への遊離アミノ酸（例えば、グリシン、チロシン、トリプトファン）またはジペプチドの添加は、酵素の基質レベル阻害の手段を提供し、キナーゼインジケータの局所的な不活性化を減少させる。
【００２６】
本発明は、生物学的インジケータとして使用するための、細菌での組換え発現による種々の熱安定性キナーゼの生産のための方法をさらに提供する。
【００２７】
酵素の遺伝的改変は、熱安定性の顕著な増大を提供することが示されており、そして類似性により、このような変異はまた、他のプロセス（例えば、プロテアーゼ処理または気相「滅菌」）におけるインジケータ酵素の安定性を顕著に増大させると考えられている。三量体（古細菌）ＡＫの規定の三次元構造（Vonrheinら(1998) J. Mol. Biol. 282:167-179およびCriswellら (2003) J. Mol. Biol. 330:1087-1099）と取得した図１に示すキナーゼ酵素の熱安定性との比較により、酵素の安定性に影響するアミノ酸が同定された。
【００２８】
改善された熱安定性を示すキナーゼの遺伝子操作改変体もまた、本発明により提供され、そして本発明において使用され、そして多数の方法で生成され得る。本質的には、これらは、三量体分子の中央コアのパッキング領域の部分を形成すると考えられるアミノ酸の特定の部位特異的変異誘発、およびランダム「定方向進化」法（分子全体が、改善された特性を有する分子の変異誘発および選択／スクリーニングの引き続くラウンドに供せられる）を含む。本明細書中（例えば、実施例８〜１０）で概説した改変は、コンセンサスベースのアプローチを用いるハイブリッドアプローチに基づいて、構造上関連した分子間で観察された差異に基づく酵素の熱安定性に影響すると考えられる領域が決定される。この後、規定の変更を行って最良の熱安定性と相関するアミノ酸が組み込まれるか、あるいはランダム置換を行って、熱安定性に必須であることが決定された位置に全ての利用可能なアミノ酸が組み込まれる。
【００２９】
本発明の特定の改変酵素は、実施例８〜１０に記載の種々の改変体であり、そして、配列番号１７〜１９に集合的に表される（いくつかの改変体は各参照によって包含される）。
【００３０】
生物学的インジケータは、試料が処理される容器中での使用に適合され得る。例えば、インジケータは、固体支持体を含み、この固体支持体はマトリックスであり、そしてキナーゼがこのマトリックス内に分散されている。このマトリックスは、プロセス条件に対して耐性であるべきであり、そしてプロセスからのキナーゼの保護を提供するように補助し得る。これにより、インジケータに幾分かの安定化が提供される。キナーゼは、ポリマーマトリックス内に局在され得る。支持体は、処理容器中に突き出るように、または該容器に付加されるように設計され得、そしてインジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズであり得る。
【００３１】
種々の処方物中に化学的改変を有するかまたは有さず、そして１つ以上のキナーゼインジケータを有する種々の固体支持体が、例えば、検証されるプロセスの要件に依存して、本発明によって包含される。１つの形態では、支持体は、プラスチック、セラミック、スチール、または他の金属もしくはポリマーの表面であり、その上には、キナーゼが固定化の手段として乾燥されている。支持体は、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはポリプロピレンのストリップまたはディップスティックであり得、おそらく平坦な表面を有し、その上にキナーゼが塗布されている。キナーゼの付着のために多孔質の表面を有するさらなるタイプの支持体もまた、ガス状プロセスのためのインジケータとして特に有用である。キナーゼをコーティングしたプラスチック、金属、またはセラミックのビーズもまた、インジケータに有益なフォーマットを提供し得、これらもまた、特にガス状プロセスをモニタリングするのに適している。このような支持体は、インジケータの付着のための顕著に大きな表面面積を提供するため、特定の適用に対しては固体支持体を超える利点を有する。
【００３２】
ＴＳＥ不活性化プロセスの検証のために案出されたデバイスの特定の例について、ロッド、ディスク、またはクーポンのようなスチール表面は、手術器具の汚染除去のための有効なインジケータである。熱安定性アデニル酸キナーゼの結合は、例えば、疾患関連プリオンイソ型の凝集形態（ＰｒＰＳｃ）の非常に良好なモデルであり、したがって、ＰｒＰＳｃと手術用スチールの表面との相互作用の顕著に良好なインジケータを提供する。
【００３３】
インジケータの支持体上または支持体へのキナーゼの結合は、表面にタンパク質を連結させるために慣用的に使用される方法、例えば、約pH9.6の0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液中で室温にての約１時間のタンパク質のインキュベーションによって達成され得る。あるいは、タンパク質は、当業者に知られる広範な範囲のカップリング化学法を用いて、表面に共有結合される。例えば、ＳＰＤＰ（Pierce chemicals；製造者の指示を用いる）で誘導体化し、ＤＴＴで還元して架橋用の遊離スルフヒドリル基を提供したアデニル酸キナーゼが、マレイミド表面を有するポリスチレン支持体に共有結合される。このようなスルフヒドリル結合表面を有するプラスチック表面は、文献に十分に記載されている。このカップリング方法のさらなる利点は、必要に応じて、例えば、ＤＴＴまたはＭＥＳＮＡでの還元によって酵素が支持体から切断され得、アッセイがインジケータ支持体とは別に実施できるようになることである。アデニル酸キナーゼ酵素および本発明によって記載される他のインジケータキナーゼは、誘導体化およびそのような支持体への架橋の際にそれらの活性が保持されるという特性を有する。
【００３４】
あるいは、ポリスチレンまたはポリカーボネートの支持体上のアミン反応性表面が、二官能基型の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドモノマー）と共に使用されて、タンパク質上の遊離アミン基を介するキナーゼの直接的な非切断性の架橋を提供する。ＵＶ処理もまた、適切な支持体にインジケータを直接的に連結させるために使用され得る。スチール表面は、インジケータキナーゼの共有結合付着を媒介するために、プラスチック表面と同様の方法で処理され得る。
【００３５】
広範に種々のタンパク質架橋試薬は、Pierce chemical company (Perbio)のような企業から入手可能である。スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、およびカルボキシル基に対して反応性の試薬が、タンパク質のカップリングのために設計されるが、それらは、天然に反応性であるかまたはコーティングされたかのいずれかの固体支持体（例えば、プラスチック、他のポリマー、ガラス、および金属）へタンパク質を架橋するためにも同等に使用され得る。反応性の化学物質もまた、糖質に酵素を架橋させるために利用可能である。例えば、試薬ＢＭＰＨ（N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA）、ＫＭＵＨ（N-[k-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド）、およびＭＰＢＨ（4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド塩酸塩）が、システイン残基の形態、またはスルフヒドリル反応基を生成するように還元された化学誘導体化タンパク質の形態のいずれかで遊離スルフヒドリルを含むキナーゼを、糖質に架橋させるために使用され得る。これは、固体支持体に特に重要であり得、固体支持体は、複合糖質（例えば、紙、セルロースベースの膜、ゲルまたは樹脂）であるか、または適切な反応性の表面を生成するように糖質溶液でコーティングまたは処理され得る。
【００３６】
支持体の各タイプについて、キナーゼは、好ましくは、結合を増強する、および／または結合したタンパク質を安定化させる溶液中に処方される。このような処方物としては、スクロース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を10%(w/v)までで含有する溶液が挙げられる。さらに、キナーゼは、適切な支持体の表面または内腔に塗布されるゲルの一部として処方され得る。例としては、アルギン酸マトリックス、寒天マトリックス、またはポリアクリルアミドマトリックスが挙げられる。
【００３７】
インジケータはまた、キナーゼを安定化させる薬剤を含み得、そして適切な安定化剤は、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される。
【００３８】
インジケータの使用を容易にするために、それは、インジケータを表面に取り付ける手段をさらに含み得、そのような手段は、例えば、ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって支持体を表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部である。
【００３９】
本発明の特定の実施態様では、精製したキナーゼ、例えば、アデニル酸キナーゼ（ＡＫ）が、１mg/mlまでの濃度で処方され、そして固体支持体上にコーティングされる。好ましくは、1〜2mg、または0.5〜1mg、または0.1〜0.5mg、または0.1mgのキナーゼが、固体支持体上にコーティングされる。プロテアーゼ処理のために、キナーゼは、マイクロタイタープレートと同様にポリプロピレン、ポリカーボネート、またはポリスチレンの表面上で乾燥され得る。１２１℃にて１５〜２０分間の標準的なオートクレーブ滅菌または１３４℃にて１８分間の「プリオンサイクル」オートクレーブ滅菌のいずれかについては、ステンレススチールのような熱安定性支持体が使用され得る。過酸化水素またはオゾンのような気相不活性化手順については、ポリカーボネート固体支持体が使用され得、そしてまた必要に応じて、不活性化剤に対してより大きな耐性を提供するように、多孔質マトリックスとしても製造され得る。
【００４０】
好都合な固体支持体は、不活性化手順から、必要なアッセイ成分全てを含むチューブに直接移されるディップスティックの形態をとる。これは、食品産業および製薬産業で既に市販されている種々の「迅速読み取り」衛生モニターの１つに取り付けられたチューブ用ルミノメーターであり得る。あるいは、それは、当のインジケータ用に設計された特殊な装置の形態をとり得、熱安定性酵素により要求される至適温度を維持することが特に強調される（実施例２４を参照のこと）。
【００４１】
本発明はまた、生物学的因子の異なるのレベルの不活性化後に検出可能な、複数の酵素を含む生物学的インジケータを提供する。１つの実施態様の生物学的インジケータは、支持体、第一の位置に配置された第一の酵素、および第一の位置とは離れた第二の位置に配置された第二の酵素を含む。第一の酵素および第二の酵素は共に、生成物を基質に変換する際に活性を有し、そして初期期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、両酵素の活性が検出され得る。後続期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第一の酵素の活性は検出され得ないが、第二の酵素の活性は検出され得る。第二の後続期間に生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第二の酵素の活性は検出され得ない。
【００４２】
この実施態様の利点は、インジケータを用いることにより、正確に測定が行われる必要なく、プロセスによって達成される生物学的因子のおよその不活性化のレベルを示し得ることである。したがって、例えば、両酵素とも検出可能である場合、これは、不活性化が特定の閾値に達していないことを示し得る。第二の酵素のみが検出され得る場合、これは、第一の不活性化閾値には達しているが、第二の閾値は達していないことを示す。最後に、両酵素とも検出され得ない場合、これは、不活性化が第二の閾値を通過したことを示す。第一の酵素が６対数までの活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素が８対数までの活性の減少で検出可能である場合、両方の酵素を検出できることは、不活性化が６対数に達していないことを示し、第二の酵素のみを検出できることは、不活性化が６対数と８対数との間まで減少したことを示し、どちらも検出できないことは、少なくとも８対数の活性の減少が達成されたことを示す。
【００４３】
第一の酵素は、適切には、５対数と８対数との間までの活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素は、適切には、６対数以上の活性の減少で検出可能である。第一の酵素は、好ましくは、６対数と７対数との間の活性の減少で検出可能であり、そして第二の酵素は、好ましくは、７対数と８対数との間の活性減少で検出可能である。生物学的インジケータは、（第一の位置および第二の位置とは離れた）第三の位置に配置された第三の酵素をさらに含み得、第二の後続期間について生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第三の酵素が検出され得、そして第三の後続期間について生物学的インジケータを不活性化プロセスに曝露した後、第三の酵素は検出され得ない。第三の酵素は、適切には、８対数以上の活性の減少で検出可能である。
【００４４】
異なるレベル処理（例えば、異なる曝露時間）で検出可能である複数の酵素を有するこのタイプの生物学的インジケータを用いて、不活性化経過の進行は監視され得、その終点が容易に予想され得る。
【００４５】
多酵素インジケータの好ましい酵素は、キナーゼであり、より好ましくは熱安定性であり、そしてより好ましくは、本発明の他の実施態様に関連して本明細書中に開示および記載されているものである。
【００４６】
本発明の第二の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証する際に用いられるキット（必要に応じて、携行用キット）が提供され、このキットは、
（ｉ）本発明の第一の局面による生物学的プロセスインジケータ、および
（ii）キナーゼに対する基質
を備える。
【００４７】
キナーゼ量／活性の測定を実施するために、キットは、ＡＴＰを検出する手段（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼ）および必要に応じてルミノメーターを備え得る。基質は、好ましくは、ＡＤＰである。
【００４８】
公知の生物学的因子を用いた以前の試験から、生物学的因子の量または活性の減少とキナーゼ活性とを相関させるデータが作成され得、したがって、キットは、キナーゼ活性と一連の記載の生物学的因子の量または活性の減少との相関を示す、１つ以上の照合表もまた備え得る。好ましい実施態様では、キットは、ＴＳＥ不活性化のモニタリング用である。
【００４９】
本発明の第三の局面では、処理プロセスを検証する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
（ii）試料を、規定量のキナーゼの存在下で処理に供する工程であって、この処理が、生物学的因子の量または活性を減少させる、工程；
（iii）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
（iv）残余活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、またはキナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ処理条件下での生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む。
【００５０】
このような情況では、キナーゼは、本明細書中に記載のキナーゼの任意の１つであり得、および／または本明細書中に記載のキナーゼの特性のいずれかを有し得る。好ましくは、キナーゼは、本発明の第一の局面によるインジケータとして処方される。
【００５１】
試料は、一般に、いかなるキナーゼも存在することなく提供される。そこで、この方法は、生物学的因子を含むと考えられる試料を得る工程、および規定量のキナーゼを添加する工程を包含し得る。この因子は全く存在しないこともある（しかし好ましくは、試料は、生物学的因子を含むことが知られている）。検証の論点は、処理を行った後、存在していたはずである因子が、受容可能な程度に除去／不活性化されたことが確認されることである。
【００５２】
代表的には、操作者は、試料を処理する前および試料を処理した後にキナーゼ活性を測定する。また、キナーゼ活性についてアッセイする前に、夾雑する（通常、中温性の）キナーゼが試料中に入り込んでいることもあり得る。したがって、試料に添加されるキナーゼは熱安定性であり、そしてアッセイ工程は、残余キナーゼ活性を測定する前に、（例えば、７０℃で少なくとも３０分間、好ましくは８０℃で少なくとも１０分間試料を処理することにより）中温性のキナーゼを不活性化する工程を含むことが好ましい。
【００５３】
好ましい実施態様では、キナーゼは、処理前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に、１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも10,000,000相対発光量（ＲＬＵ）、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも8,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも5,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも3,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも1,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも500,000ＲＬＵの活性を有する。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様では、所定のキナーゼ活性は、１ｍｇキナーゼ当たり10,000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり500ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり250ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり100ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり10ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり0ＲＬＵである。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼ活性の１対数減少、または２対数減少、または３対数減少、または４対数減少、または５対数減少、または６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に等しいかそれより大きい。
【００５６】
他の実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼの量または濃度の少なくとも６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に相当する。さらなる実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、少なくとも800,000ＲＬＵ、または少なくとも900,000ＲＬＵ、または少なくとも950,000ＲＬＵ、または少なくとも990,000ＲＬＵ、または少なくとも999,000ＲＬＵ、または少なくとも999,900ＲＬＵ、または少なくとも999,990ＲＬＵ、または少なくとも999,999ＲＬＵの減少に相当する。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様では、試料中の生物学的因子の量または活性の確認された減少は、少なくとも６対数、好ましくは少なくとも７対数、より好ましくは少なくとも８対数、最も好ましくは少なくとも９対数である。
【００５８】
特に好ましい実施態様では、残余キナーゼ活性またはキナーゼ活性の減少が、少なくとも６対数、または少なくとも７対数、または少なくとも８対数、または少なくとも９対数の生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、処理が続けられる。
【００５９】
本発明の第四の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性の減少と、本発明の第一の局面によるインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）規定量の生物学的因子を含有する試料および規定量のキナーゼを含有する試料を調製する工程；
（ii）試料を処理に供する工程；
（iii）キナーゼの残余活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；
（iv）生物学的因子の残余量または活性を測定し、そして必要に応じて、生物学的因子の量または活性の減少を算定する工程；
（v）処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（v）を繰り返す工程
を含む。
【００６０】
一実施態様では、生物学的因子およびキナーゼは、同じ試料中に存在し得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、処理パラメーターは、時間、温度、ｐＨ、圧力、プロテアーゼ濃度、および滅菌剤または界面活性剤の濃度の１つ以上を含む。
【００６２】
特定の実施態様では、処理は、５０〜１４０℃、好ましくは８０〜１００℃、より好ましくは１３４〜１３８℃で試料を加熱する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６３】
さらなる実施態様では、処理は、９〜１４のｐＨ、好ましくはｐＨ１２以上、より好ましくは約ｐＨ１２に試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６４】
別の実施態様では、処理は、0.5〜２mg/ml、好ましくは約１mg/ml、より好ましくは約２mg/mlの濃度のプロテアーゼに試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【００６５】
上記方法により、生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料に対する処理の検証のためのインジケータを将来的に使用するための較正データの調製が可能になる。多くの処理プロセスの較正は、実施例２１〜２３に記載される。
【００６６】
本発明の第五の局面では、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するためのインジケータとしてのキナーゼの使用が提供される。このような情況では、キナーゼは、本明細書中に記載のキナーゼの任意の１つであり得、および／または本明細書中に記載のキナーゼの特性のいずれかを有し得る。好ましくは、キナーゼは、本発明の第一の局面によるインジケータとして処方される。
【００６７】
ここで、種々のプロセスをモニタリング／検証するための本発明のインジケータの使用を説明する。
【００６８】
一実施態様では、インジケータは、洗浄サイクルにおける生物学的洗浄調製物の性能を検証するために使用される（実施例１４を参照のこと）。洗浄サイクルの検証は家庭環境にて用いられる可能性があるが、その最も有益な使用は、ヘルスケア、製薬、または食品製造環境内にあり、例えば、寝具、室内着、または感染患者または感染因子に曝露された患者（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはノーウォーク／ノーウォーク様ウイルスの集団発生）と関連した他の品目の汚染除去を検証するためである。このような情況では、本発明のインジケータは、血液または他の体液のような生物学的材料に関連しているという利点を有する。
【００６９】
洗浄サイクルの検証のために、インジケータは、可撓性の細棒、布のストリップ、またはサイクル内に取り込むのに適した他の材料の表面上に適切なキナーゼを架橋させることにより調製される。インジケータは、投入物の残りと共に洗浄機に入れられる。好ましくは、インジケータは、その回収を容易にするために、洗浄機内部の適切なホルダー内に固定され得る。
【００７０】
次いで、洗浄サイクルが実施され、そしてインジケータが取り出されて、投入物のさらなる取り扱いまたは処理の前に「読み取り機」を用いて評価される。この「読み取り機」は、インジケータ内に受容可能なレベルの残余キナーゼ活性を示すように較正されており、この受容可能なレベルは、プロセス内の適切な洗浄性能の以前の較正および評価から導き出される。このような評価は、汚れの総レベルおよび微生物の生存数（当業者に公知の適切なモデル生物を用いて評価される）を含み得る。読み取り較正値に基づいて、投入物をさらなる処理に通すか、または洗浄サイクルを繰り返す。
【００７１】
第二の実施態様では、インジケータは、ウイルスの不活性化のためのプロセスを検証するために使用される（実施例１５を参照のこと)。環境中の生存ウイルス単離株の検出は、特に、スピードおよび精度が重要になり得る緊急事態が伴う場合に問題である。本発明は、本質的にリアルタイムに汚染除去手順をモニタリングすることを可能にするインジケータシステムの開発の可能性を提供する。これは、ヘルスケアおよび関連施設において、集団発生（例えば、ノーウォーク様ウイルスの発生）またはウイルス因子（例えば、天然痘）の故意の放出のいずれかの後での表面汚染除去に特に有用である。
【００７２】
ウイルス不活性化プロセスを検証するためのインジケータは、種々の異なる形態（例えば、殺ウイルス剤を噴霧または浸漬した領域をモニタリングするための細棒またはディップスティック、または気相汚染除去プロセスをモニタリングするための懸架式インジケータ）をとり得る。あるいは、インジケータキナーゼが、汚染除去前に表面に噴霧され、そして残余キナーゼ活性のレベルが、表面のふき取りによって引き続き評価され得る。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、細菌タンパク質毒素、植物毒素（例えば、リシン）、および他の毒素タンパク質、ペプチド、またはペプチドアナログのプロテアーゼ分解を検証するために使用される（実施例１６を参照のこと）。
【００７４】
プロテアーゼは、細菌戦争／細菌テロリズムの脅威となる可能性のある因子である広範なタンパク質毒素（ボツリヌス菌毒素、炭疽菌毒素、およびリシンを含む）の分解の重要な可能性を示す。それらはまた、広範な他の潜在的に毒性または有害なタンパク質またはペプチド因子を不活性化して、表面／施設の汚染除去または材料の安全な廃棄を可能にする能力を有する。このような情況では、本発明のインジケータは、汚染除去される表面／材料と一緒に、プロテアーゼ汚染除去手順に供される。この手順の終了時に、インジケータは取り出され、そして残余キナーゼ活性のレベルが、本発明の方法に従って評価される。次いで、この残余キナーゼ活性のレベルが、特定のタンパク質毒素または毒素群の不活性化指数と相関される。このレベル活性が規定の指数値以下であると、材料は安全に廃棄され得、または表面／施設は元通りに使用し得る。
【００７５】
好ましくは、適切な安全性余裕が、プロセス性能のいかなる変動も可能にするように、不活性化指数の較正に組み込まれる。本発明で使用される酵素の付加的な安定性により、これは、好熱性生物由来のＡＫの相対熱安定性を示すデータ（図１、実施例２）により示されるように、広範な他の酵素インジケータ（「熱安定性」生物、例えば、Bacillus stearothermophilus由来の酵素を含む）よりも確実にかつより大きなダイナミックレンジで行われるようになる。
【００７６】
インジケータはまた、薬剤製造装置をきれいに清浄するためのプロテアーゼ汚染除去手順を検証するために使用され得る。広範な種々の薬剤製品は、ヒトまたは動物由来の材料を使用し、これらは、プリオン（ＴＳＥ）因子およびウイルス（例えば、西ナイルウイルス、肝炎、ＨＩＶ）を含む広範な種々の因子で汚染され得る。材料の供給源が動物起源である場合（例えば、ウシ胎児血清、ウマ免疫グロブリン）および中間処理段階が、特定の試料中の未同定の病原体の濃度を増大させる危険性を有し得る場合、危険性は悪化され得る。製造バッチ間の製造施設および装置（例えば、クロマトグラフィーカラム、容器、配管）をきれいに清浄するためにプロテアーゼを使用する可能性は、汚染物が事前に同定されていない場合であっても、そのような危険性を減少または排除する可能性を有する。これは、感染危険性を蓄積し、そして最終製品に持ち込む重大な危険性がある、例えば、血液分画装置中のプリオン因子に特に当てはまる。
【００７７】
このタイプの手順を検証するために、本発明のインジケータは、理想的には、プロテアーゼ処理溶液中に浸漬されるディップスティックとして、または清浄される装置とともに一列に取り付けられるカートリッジとして設計される。処理後のインジケータデバイス中の残余キナーゼ活性のレベルを評価し、そしてこれを受容可能な清浄レベルと相関させることにより、性能の迅速かつ信頼性のあるモニターが開発され得る。
【００７８】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、生物学的因子（例えばＴＳＥ）の気相不活性化を検証するために用いられる（実施例１７を参照のこと）。
【００７９】
オゾンまたは他の気相滅菌剤がこのような因子を不活性化する可能性は、広範な刊行物および論文によって示唆されているが、なおも、有効であることが明白に示された方法はない。この気相技術のヘルスケアへの開発および導入を支持するために、この技術の性能を検証する手段が必要である。ＴＳＥのような因子は、従来のウイルスまたは細菌因子よりもこの形態の不活性化に対してずっと耐性であることが既に示されているので、気相不活性化を検証するために現在利用可能な方法は、適切であるとは考えられない。本発明は、この課題に取り組んでいる。
【００８０】
このタイプの検証のために、インジケータキナーゼは、任意の適切な方法、例えば、一般的な吸着およびアミド、ペプチド、カルボニル、またはシステイン結合を介する化学架橋によって、固体支持体上に付着される。例えば、オゾン滅菌については、剛性ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ガラス、スチール、ポリアミド、またはポリプロピレンの支持体が使用され得、支持体には、キナーゼが、先に記載した化学方法の任意の１つによってカップリングされている。次いで、インジケータが、材料／器具の滅菌バッチ中に入れられ、オゾンに曝露され、そして当の因子の対応する不活性化を評価するために設計した適切に較正した不活性化指数に対して評価される。好結果の不活性化が、材料／器具の処理または使用の前に可能になる。
【００８１】
インジケータは、気体の透過が制限されるように、必要に応じて、チューブの内面または等価の内部空隙部に付着され得る。これは、管腔を有する器具中の等価な空隙中への、または充填された材料を通る、気体の透過を評価するのに適しているモニターを提供する。あるいは、キナーゼは、ポリスチレンビーズのような多孔質材料に付着され得るか、またはゲルもしくは樹脂内に固定化され得る。
【００８２】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、内視鏡および関連装置の処理に用いられるような液体化学滅菌システム（例えば、Endoclens）を検証するために使用される（実施例１８を参照のこと）。
【００８３】
広範な内視鏡が医療において慣用的に使用され、そしてこれは、医学的診断および処置の重要な部分となる。これらの器具は、非常に感度が高く、慣用的な清浄および消毒に非常に重要な問題を提起している。従来、および現行の実施でも変わらず、内視鏡は、低温法を用いて汚染除去される前に、手で清浄される。従来のオートクレーブ滅菌ができない内視鏡のような装置の感度の高い部分の汚染除去の特定の問題に取り組むために、種々の化学消毒剤および自動化再処理装置が開発されている。これらの方法は、器具の洗浄化が困難である際に、広範なウイルスおよび細菌病原体の医原性伝染と関連している汚染のレベルを下げるのに役立っている。このようなプロセスを検証する現行の方法は、洗浄溶液の流速および温度をモニタリングすることである。本発明のインジケータは、内視鏡管腔内の実際の清浄有効性の読み取りを提供する検証のさらなる手段を提供する。
【００８４】
このタイプの検証のために、インジケータは、内視鏡チューブと同様の総内径であるように設計されたチューブの内表面に付着される。このインジケータ装置は、自動化再処理装置において内視鏡と直列に連結されている。次いで、内視鏡は、通常通りに処理される。このプロセスの終了時に、好ましくは内視鏡が装置から取り出される前に、インジケータは取り外され、そして残存するキナーゼ活性のレベルについて評価される。活性のレベルは、プロセスの受容可能な性能について予め規定された閾値と相関させられ得、そしてこの評価に基づいて、内視鏡は、追加の清浄もしくは汚染除去に移され得るか、または使用するために準備され得る。性能のレベルが十分でない場合、器具は、前と同様に付着させた新たなインジケータを用いて（同じ条件またはより厳しい条件を用いて）再処理され得る。このインジケータ装置はまた、内視鏡および／または管腔を有する任意の他の器具の手動清浄を検証するのにも適している。
【００８５】
上記検証のためのインジケータを調製するには、キナーゼが、酵素の疎水性に基づく非特異的タンパク質吸着法によってその支持体に接着していることが好ましい。図５は、種々の組換えキナーゼがこのようにしてポリスチレンに接着できることを示している。図５はまた、特定のキナーゼが、このタイプの適用のためにより望ましい特性を有すること、例えば、S. acidocaldariusキナーゼが、T. maritimaおよびA. fulgidusに由来するキナーゼと比較した場合、このタイプの表面に有意により接着性であることを示している。これは、他のタイプの表面について、特に表面に対する付着が荷電アミノ酸残基を介し得る場合、異なり得る。このタイプのインジケータにおいて、表面からキナーゼを簡単に取り出せることは、キナーゼに対するいかなる変更または改変よりも、清浄性能の評価において決定的な特徴である。したがって、このタイプの「吸着」インジケータは、洗浄性能の評価において非常に広範囲の使用を有する。これは、そのプロセスが内視鏡のようなデバイスの管腔からバイオフィルムを効果的に取り出すことができることを検証するために、特に重要である。なぜなら、これは、性能に影響する鍵となる要因の１つであると考えられるからである。したがって、適切な非感染バイオフィルムは、キナーゼのためのマトリックスとして、好ましくは、血清、スクロース溶液、水性ゲル、またはバイオフィルムを刺激する他の手段を用いて、プロセスがこの汚染形態に対して有効であることを確実にするように用いられ得る。このようなプロセスを検証するのに適した他のタイプのインジケータは、前に記載したものと同様であり、ここでは、キナーゼが、化学結合（例えば、ジスルフィド結合、アミド結合、またはカルボニル結合）を生じるように支持体表面に共有結合されている。これらの場合、洗浄および／または滅菌剤の効果は、キナーゼを、それがもはや活性でないように改変することにより発揮される。このことは、ペプチド結合の破壊、タンパク質の架橋、またはタンパク質の構造をかき乱す関連方法により作用する化学滅菌剤に特に関連している。
【００８６】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、洗浄消毒器（例えば、病院で使用されるもの）で慣用の清浄性能をモニタリングするために使用される（実施例１９を参照のこと）。
【００８７】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、グルタルアルデヒドまたはオルトフタルデヒド（ＯＰＡ）処理をモニタリングするために使用される。グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドが、長年にわたって滅菌剤として広範に使用されている。化学消毒剤は、それらの機能を破壊するために非特異的様式でタンパク質を多架橋させることにより作用する。オルトフタルデヒド（ＯＰＡ）は、このファミリーにおいて新規な消毒剤として近年見出され、そしてこれはグルタルアルデヒドと関連した毒性問題のいくつかを回避するので広範に使用されつつある。本発明のインジケータは、このクラスの化学消毒剤の全てをモニタリングするのに適している。これは、キナーゼが、この種の非特異的架橋に感受性であるからである。このタイプのインジケータでは、キナーゼは、適切な表面に共有結合され、滅菌されるべき他の品目と共に化学滅菌剤に曝露される。プロセスの有効性は、インジケータを取り出して残余酵素活性を測定することによって評価される。この活性は、プロセスの正確な性能を示す規定の閾値と比較される。
【００８８】
異なるタイプのキナーゼの使用は、種々の適用に必要とされ得るように、プロセスに対する付加的な感度または感受性を提供し得る。本明細書中に記載の熱安定性アデニル酸キナーゼは、それらの分子構造に基づいて、２つの群に広範に分類され得る。したがって、Sulfolobus種由来の酵素は、高温でそれらの活性を維持するのに主要な決定基である中心の疎水性コアを有する三量体構造を有する酵素の例である。第二の群の酵素は、Thermotoga種由来のアデニル酸キナーゼにより例示される、単量体であるが、活性部位に影響する付加的な「蓋形」ドメインを有するわずかにより長いポリペプチド鎖を有する。これらの異なるタイプの熱安定性酵素は、酵素作用の間のそれらのペプチド鎖の可変的なフレキシビリティーに起因して、このタイプの化学滅菌剤に対して差異のある感度を示す。任意の特定の滅菌剤および／または濃度について、経験的スクリーンにより、これらのタイプの化学物質をモニタリングおよび検証するために適切な感受性を有する酵素が同定される。
【００８９】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、エチレンオキサイド、過酸化水素、または他の気相プロセスについての超高速読み取りモニターとして使用される。
【００９０】
現在、広範な気相滅菌剤は、細菌およびウイルス因子の慣用的な消毒のために、種々の製造業者によって使用されつつある。現行の方法は、気体の酸化特性を利用して、ペプチド結合を破壊している。したがって、本発明のキナーゼは、それらの強い物理化学特性から、不活性化の非常に迅速な読み取りを提供するのに理想的である。本実施例におけるインジケータは、例えば、ＴＳＥのような因子のオゾン不活性化に関して、前に記載したものと同様である。
【００９１】
滅菌および汚染除去のプロセスについて特に興味深い点は、種々の医薬または他の薬剤製品の製造で必要とされ得るような、大量のバルク液の滅菌を検証する能力である。現行の方法は、特定プロセスの温度、時間、および／または圧力のパラメーターを（その正確な性質に依存して）モニタリングするが、バルク液内で現実の滅菌を検証するために利用可能な方法は、あるとしてもほとんどない。これは、約１リットルの容量内でさえも難しいが、より多い容量ではほぼ不可能である。
【００９２】
本発明は、この問題に取り組む多数の可能な溶液を提供する（実施例２０を参照のこと）。その最も簡易な形態では、キナーゼが、プロセスの終了時にキナーゼ不活性化の規定のレベルを測定しそしてこれを滅菌のレベルと同一視するのに適した濃度で、滅菌される液体に添加され得る。これは、特定のタイプのプロセスにおいては望ましくはないが、キナーゼの不活性な性質および全ての生物における等価な酵素活性の遍在的な存在によって受容可能になり得る。この受容可能性は、多くの熱安定性酵素が非常に濃縮され、したがって、動物への接種後の免疫原性が非常に低くなることにより、改善され得る。
【００９３】
このような直接的な添加が受容可能でない場合、キナーゼは、透析袋、多孔質コンテナ中のバルク液に添加され得るか、または酵素が一部分もバルク液に放出されないように適切な支持体に固定化され得るが、滅菌条件は、試料全体についてと同様にインジケータで作用し得る。液体試料の一般的な拡散を可能にするが、インジケータ試料の動きを制限するように、タンパク質を含有するかまたは固定化する広範に種々の可能な方法が、当業者に公知である。可能な例としては、透析膜、ビスキングチューブ（Visking tubing）、多孔質膜、タンパク質結合樹脂、剛性ゲル、または議論した他のインジケータについて記載したような固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない。インジケータは、前に記載した方法のいずれか１つによって表面に付着され得るか、または付着させることなく適切な膜内に単に入れられ得る。これにより、インジケータは、プロセスの完了時にバルク液から簡単に取り出され得る。
【００９４】
（定義の項）
用語「生物学的因子」とは、感染因子および非感染因子の両方を含む。本発明に関連した生物学的因子の特定の例としては、細菌、ウイルス、胞子、タンパク質、ペプチド、およびプリオン（感染性ＰｒＰＳｃ型および非感染性ＰｒＰＣ型の両方）、ならびにまた実施例１４〜２０に記載した特定の因子が挙げられる。本発明の好ましい実施態様では、生物学的因子は、伝染性海綿状脳症である。
【００９５】
用語「処理」または「処理プロセス」は、試料中の生物学的因子の量または活性を減少するように設計される任意のプロセスを含む。
【００９６】
適切な処理は、以下の１つ以上を含む：選択されたｐＨ、温度、または圧力、プロテアーゼもしくは他の酵素への試料の曝露、界面活性剤、化学滅菌剤もしくは気相滅菌剤への試料の曝露。好ましい実施態様では、処理は、感染性生物学的因子（例えば、ＴＳＥ）の感染活性（infectious activity）（感染度（infectivity）としても知られる）を減少させるように設計される。特に好ましい実施態様では、処理は、５０〜１２０℃の間、好ましくは６０℃以上、より好ましくは１００℃以上の温度で試料をプロテアーゼに曝露する工程、および／または少なくとも９のｐＨに、好ましくは少なくとも１２のｐＨに試料を曝露する工程を含む。用語「処理」はまた、湿流または乾流の高温オートクレーブ滅菌、オゾン滅菌、Ｈ２Ｏ２滅菌、レンダリング、または生物学的因子を除去または不活性化するように設計された他の方法のような清浄プロセスおよび不活性化プロセスを含む。
【００９７】
用語「試料」は、任意の品目、器具、表面、流体、または材料を含む。例としては、手術器具および医療器具、院内室内着、寝具、バルク液、廃棄動物由来材料、薬剤、作業台、壁、および床が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
用語「ＲＬＵ」とは、相対発光量を意味する。当業者は、相対発光量は、信頼性のある（絶対的ではない）測定値であることを認識する。本明細書に示した数値は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬の添加直後の２秒間の光測定の「フラッシュ」法を用いるインジェクターシステムを備えたBerthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーター（300〜650nmの波長で放射された光を測定する技術仕様光電子増倍管）を用いて求めた測定値に関する。この点に取り組むために、製造業者は、ＲＬＵ「係数」についてのデータを作成しており、所定のルミノメーターにより生じたデータを、較正標準に対して正規化させる。したがって、異なる器具間で、比較がなされ得る。本明細書中に記載した実験で使用したBerthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーターについてのＲＬＵ係数は１である。したがって、本明細書中で示されたＲＬＵ値は、標準化／正規化されたＲＬＵ値としてみなされ得る。
【００９９】
絶対値の点では、ＲＬＵ値は、本方法（例えば、実施例１の方法）に記載されるような試薬を用いて該値を得るのに必要なＡＴＰ濃度に関連し得る。適切な変換として、そしてＲＬＵ値とＡＴＰ濃度との間の線形関係を考慮すると、以下の値が用いられ得る：
【０１００】
【数１】
【０１０１】
ここで、本発明を、以下の実施例でおよび添付の図面を参照して、特定の実施態様において記載する。
【０１０２】
図１は、７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、および９０℃（Ｃ）での処理後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す。
【０１０３】
図２は、種々の濃度のアルカリプロテアーゼによるアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）消化後の残余酵素活性を示す；および
【０１０４】
図３は、酵素活性とアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の残余濃度との相関を示す標準曲線を示す。
【０１０５】
図４は、E. coliで組換え発現した種々のＡＫ酵素の熱安定性を示す。実施例４に記載するように、ＡＫ酵素をコードする遺伝子をクローニングし、そして発現させた。S. acidocaldariusクローンＩを除いて、全ての遺伝子をベクターpET28aから発現させた。S. acidocaldariusクローンＩは、前に記載したように、pET3aから発現させた。発現レベルは、各クローンについて同様であったが、Pyrococcus furiosus (P.fu)酵素の一部は、不溶性画分中にあった。このことは、この酵素のアッセイされる量を減少させたと考えられる。１mg/ml総細胞タンパク質からの１０倍系列希釈で（これにより、カラム１２は、１fg/mlの総タンパク質に等価となる）、E. coli粗溶解物中で８０℃にて３０分間インキュベートした後に、組換え酵素の熱安定性を測定した。Thermotoga maritimaおよびArchaeoglobus fulgidus由来の酵素は、試験した他の酵素よりも有意に大きな安定性を示したが、残りの酵素（Sulfolobus solfataricus（S.so P2）、Aeropyrum pernix、およびP.fu）は、以前のアッセイの基準として用いたS. acidocaldarius酵素（S.ac Iと記載したデータ）と同様の活性を示した。
【０１０６】
図５は、固体支持体への熱安定性アデニル酸キナーゼ（ｔＡＫ）の結合差異を示す。固体支持体への精製組換え熱安定性アデニル酸キナーゼの相対結合を評価するために、ブロックしたプレートへの酵素の結合を評価し、このことにより、直接吸光度タイプのインジケータに対するそれらの使用可能性が示される。標準ポリスチレンマイクロタイタープレートの表面を、５％スキムミルクの添加によりブロックした。このミルクを除去し、そしてArchaeoglobus fulgidus（Ａｆｕ）、Thermotoga maritima（Ｔｍａ）、およびSulfolobus acidocaldarius（Ｓａｃ）由来のｔＡＫの希釈液をプレートに塗布した。洗浄後、結合したｔＡＫの量を、標準アッセイ法について記載のようにして測定した（実施例１）。この結果は、Ｓａｃ ｔＡＫが、２つの別のｔＡＫのいずれよりも、ブロックしたプレートに対して有意に高い結合を示したことを示している。これらの酵素の比活性は同一ではなかったが、ＡｆｕおよびＴｍａのｔＡＫはともに、Ｓａｃ由来の酵素よりも高い活性を示し、そのため結合における現実の差は、図面に示したよりもずっと大きい。スキムミルクは、プレートへ結合するタンパク質を減少させるために一般に用いられるブロッキング剤であるので、これらの結果は、Ｓａｃ ｔＡＫが、これらの実験において使用した表面（ポリスチレン）への疎水性吸着に非常に強い傾向を有することを示している。酵素のこの特性は、スチール表面へのプリオン分子について観察されたものと同様であり、それが、広範なＴＳＥ不活性化および／または除去プロセスを評価するための非常に有効なインジケータであることを意味する。
【０１０７】
図６は、プリオンを不活性化するためのプロテアーゼ消化処理についての較正曲線の作成を示す。
【０１０８】
図７は、プリオンを不活性化するための気相オゾン処理についての較正曲線の作成を示す。
【０１０９】
図８は、標準的な汚れを除去するための院内用洗浄消毒器についての較正曲線の作成を示す。
【０１１０】
図９は、ｔＡＫインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持形衛生モニターの改変を示す。
【０１１１】
配列番号１：Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３：Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４：Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５：Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号７：Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８：Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号９：Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１０：Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１１：Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１２：Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１３：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１４：Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１５：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ（単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ））のタンパク質配列
配列番号１７：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１８：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１９：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２０：Thermatoga maritima由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２１：Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２２：Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２３：Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２４：Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２５：Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２６：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２７：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号２８：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２９：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号３０：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用はE. coliでの遺伝子の発現のために最適化されている
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（Sulfolobus acidocaldarius ＡＫのためのアッセイプロトコル）
適切な固体支持体上の１mg/mlのアデニル酸キナーゼの100μl処方物がインジケータであり、そしてこれを、必要とされる処理プロセスに供する。
【０１１３】
熱不活性化工程は任意である。これは、試料を、インジケータのＡＫには許容であるが、いずれの中温性ＡＫも変性される温度を上回る温度に加熱することを含む。代表的には、これは、８０℃にて１０分間のインキュベーションによる。
【０１１４】
洗浄工程は任意である。これは、処理を実施するために用いられる材料が微量であってもアッセイを妨害することが分かっている場合、それらを除くために組み込まれ得る。
【０１１５】
次いで、インジケータを、15mM MgAc、1mM EDTA緩衝液、pH6.8で13.5μMの濃度に希釈したＡＤＰ基質（例えば、Celsis, Biothema, Promegaからの試薬）を含むチューブに添加し、そして７０℃にて２０分間インキュベートする。
【０１１６】
試料を室温まで冷却し、そしてルシフェリン／ルシフェラーゼ基質（ＡＴＰ試薬、Thermo Life Science）を添加する。アッセイを必要な長さの時間インキュベートし、ルミノメーターを用いて試料を読み取る。
【０１１７】
（実施例２）
（天然型アデニル酸キナーゼ酵素の精製）
２４の種々の好熱性微生物および超好熱性微生物からバイオマスを生成した（表１）。
【０１１８】
古細菌の８つのメンバーを、１６の種々の好気性細菌および嫌気性細菌とともに表した。これらの生物の各々に由来するＡＫを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。全ての酵素をさらに特徴付け、そしてゲル濾過（Superdex G200）によって精製した。これは、主要なＡＫ画分の同定および分子量の推定を可能にした。
【０１１９】
（実施例３）
（天然型アデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
好熱性生物に由来するバイオマスから単離したアデニル酸キナーゼの７０℃、８０℃、および９０℃での熱安定性を評価し、そしてそれらの結果を図１に示した。
【０１２０】
アデニル酸キナーゼを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによってバイオマスから単離した。カラムから溶出した試料を1:10000希釈し、次いで各々１０μlをマイクロタイターウェルに添加した。2.5μlのアピラーゼを各ウェルに添加し、溶出緩衝液から存在するＡＴＰを破壊し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。アピラーゼを６５℃にて２０分間の熱処理によって不活性化した。
【０１２１】
ＡＤＰ基質を添加し、そして７０℃（パネルＡ）、８０℃（パネルＢ）、または９０℃（パネルＣ）のいずれかにて３０分間インキュベートし、そして２５℃まで冷却し、その後１０μlのＤ−ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添加した。生じたＡＴＰを、プレートルミノメーターでＲＬＵとして測定した。
【０１２２】
（実施例４）
（組換えアデニル酸キナーゼの発現および精製）
代表的な熱安定性ＡＫを発現するクローンを獲得し、そして好熱酸性古細菌Sulfolobusacidocaldariusおよび好熱性細菌Bacillus stearothermophilus由来の組換え熱安定性ＡＫを生成した。プラスミドをE. coliに形質転換し、そして細胞抽出物は、ＡＫの予測分子量に相当する電気泳動でのタンパク質バンドを含有することが示された。適切な温度（Sulfolobus acidocaldarius ＡＫは８０℃およびBacillus stearothermophilus ＡＫは６０℃）でのインキュベーション後に、熱安定性ＡＫ活性を測定した。
【０１２３】
両方の熱安定性ＡＫについての精製方法は確立されている。この方法には、８０℃で２０分間のインキュベーションの初期熱処理によりE. coli由来のタンパク質を不活性化して凝集し、その後アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過を行うことが含まれた。アフィニティークロマトグラフィーは、Blue Sepharoseへの酵素の吸着、次いで低濃度のＡＫ補因子（ＡＭＰ＋ＡＴＰおよびマグネシウムイオン）を用いる特異的溶出を含んだ。溶出緩衝液中のＡＴＰおよびＡＭＰ（Sigma）を、中温性アピラーゼとのインキュベーションにより分解した。中温性アピラーゼは引き続く熱処理によって容易に不活性化される。ゲル濾過クロマトグラフィーをスケールアップし、分取用Superdexカラムを使用して、両酵素を大量に調製できるようにした。
【０１２４】
候補の天然型酵素のスクリーニングの間に同定された好熱性生物由来のＡＫ遺伝子のＰＣＲ増幅のために、プライマーを設計した。
【０１２５】
熱安定性微生物を個々に既定されている増殖条件を用いて増殖させ、そしてゲノムＤＮＡを単離し、そして各生物由来のアデニル酸キナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。好熱性生物であるThermotoga maritima、Aeropyrum pernix、Sulfolobus acidocaldariusおよびSulfolobus solfataricus由来のＰＣＲ増幅したアデニル酸キナーゼ遺伝子をベクターpET28aにサブクローニングし、そして稀なtRNA（rare tRNA）を発現するコドン増強E. coli株（Zdanovskyら、2000）に形質転換した。このE. coli株は、ＡＴリッチ遺伝子の発現レベルの増強に適している。
【０１２６】
形質転換の成功をミニ発現試験によって評価し、そしてこの結果を、ＩＰＴＧでの誘導の前および後に、培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、熱処理工程を含んだ後の上清の分析にも使用した。この熱処理工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流す前に試料を８０℃まで２０分間加熱して、試料中に存在する熱不安定タンパク質を除去することからなる。
【０１２７】
配列：
配列番号
１−Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＴＴＶＬＳＦ ＡＤＫＩＬＴＥＫＧＩ
ＳＨＫＩＶＮＹＧＤＹ ＭＬＮＴＡＬＫＥＧＹ ＶＫＳＲＤＥＩＲＫＬ
ＱＩＥＫＱＲＥＬＱＡ ＬＡＡＲＲＩＶＥＤＬ ＳＬＬＧＤＥＧＩＧＬ
ＩＤＴＨＡＶＩＲＴＰ ＡＧＹＬＰＧＬＰＲＨ ＶＩＥＶＬＳＰＫＶＩ
ＦＬＬＥＡＤＰＫＩＩ ＬＥＲＱＫＲＤＳＳＲ ＡＲＴＤＹＳＤＴＡＶ
ＩＮＥＶＩＱＦＡＲＹ ＳＡＭＡＳＡＶＬＶＧ ＡＳＶＫＶＶＶＮＱＥ
ＧＤＰＳＩＡＡＳＥＩ ＩＮＳＬＭ
【０１２８】
２−Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＳＴＶＬＡＫ ＶＫＥＩＬＤＮＱＧＩ
ＮＮＫＩＩＮＹＧＤＦ ＭＬＡＴＡＬＫＬＧＹ ＡＫＤＲＤＥＭＲＫＬ
ＳＶＥＫＱＫＫＬＱＩ ＤＡＡＫＧＩＡＥＥＡ ＲＡＧＧＥＧＹＬＦＩ
ＤＴＨＡＶＩＲＴＰＳ ＧＹＬＰＧＬＰＳＹＶ ＩＴＥＩＮＰＳＶＩＦ
ＬＬＥＡＤＰＫＩＩＬ ＳＲＱＫＲＤＴＴＲＮ ＲＮＤＹＳＤＥＳＶＩ
ＬＥＴＩＮＦＡＲＹＡ ＡＴＡＳＡＶＬＡＧＳ ＴＶＫＶＩＶＮＶＥＧ
ＤＰＳＩＡＡＮＥＩＩ ＲＳＭＫ
【０１２９】
３−Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＫＭＫＩＧＩＶＴ ＧＩＰＧＶＧＫＴＴＶ ＬＳＫＶＫＥＩＬＥＥ
ＫＫＩＮＮＫＩＶＮＹ ＧＤＹＭＬＭＴＡＭＫ ＬＧＹＶＮＮＲＤＥＭ
ＲＫＬＰＶＥＫＱＫＱ ＬＱＩＥＡＡＲＧＩＡ ＮＥＡＫＥＧＧＤＧＬ
ＬＦＩＤＴＨＡＶＩＲ ＴＰＳＧＹＬＰＧＬＰ ＫＹＶＩＥＥＩＮＰＲ
ＶＩＦＬＬＥＡＤＰＫ ＶＩＬＤＲＱＫＲＤＴ ＳＲＳＲＳＤＹＳＤＥ
ＲＩＩＳＥＴＩＮＦＡ ＲＹＡＡＭＡＳＡＶＬ ＶＧＡＴＶＫＩＶＩＮ
ＶＥＧＤＰＡＶＡＡＮ ＥＩＩＮＳＭＬ
【０１３０】
４−Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＲＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＫＩＱＲＥＬＱＭＫＡ ＡＫＫＩＴＥＭＡＫＥ ＨＰＩＬＶＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＭＬＧ ＬＰＹＥＶＶＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＮＥＹＡ
【０１３１】
５−Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＫ ＬＡＬＱＲＴＲＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＬＫＬＫＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＶＱＲＥＬＱＭＮＡ ＡＫＫＩＡＥＭＡＫＮ ＹＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＩＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＴＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１３２】
６−Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＮ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＩＱＲＤＬＱＭＫＶ ＡＫＫＩＳＥＭＡＲＱ ＱＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＥＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１３３】
７−Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＬＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＧＴＴＩＴ ＱＫＡＭＥＫＬＳＥＥ
ＧＩＮＹＫＭＶＮＦＧ ＴＶＭＦＥＶＡＱＥＥ ＮＬＶＥＤＲＤＱＭＲ
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ ＭＶＫＥＳＰＶＶＶＤ
ＴＨＳＴＩＫＴＰＫＧ ＹＬＰＧＬＰＶＷＶＬ ＮＥＬＮＰＤＩＩＩＶ
ＶＥＴＳＧＤＥＩＬＩ ＲＲＬＮＤＥＴＲＮＲ ＤＬＥＴＴＡＧＩＥＥ
ＨＱＩＭＮＲＡＡＡＭ ＴＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＩＱＮＫＮＮＬＬ
ＤＹＡＶＥＥＬＩＳＶ ＬＲ
【０１３４】
８−Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＳＴＴＳＳ ＱＬＡＭＤＮＬＲＫＥ
ＧＶＮＹＫＭＶＳＦＧ ＳＶＭＦＥＶＡＫＥＥ ＮＬＶＳＤＲＤＱＭＲ
ＫＭＤＰＥＴＱＫＲＩ ＱＫＭＡＧＲＫＩＡＥ ＭＡＫＥＳＰＶＡＶＤ
ＴＨＳＴＶＳＴＰＫＧ ＹＬＰＧＬＰＳＷＶＬ ＮＥＬＮＰＤＬＩＩＶ
ＶＥＴＴＧＤＥＩＬＭ ＲＲＭＳＤＥＴＲＶＲ ＤＬＤＴＡＳＴＩＥＱ
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ ＳＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＶＱＮＲＮＧＬＬ
ＤＱＡＶＥＥＬＴＮＶ ＬＲ
【０１３５】
９−Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＭＭＫＮＫＶＶＶ ＩＶＧＶＰＧＶＧＳＴ ＴＶＴＮＫＡＩＥＥＬ
ＫＫＥＧＩＥＹＫＩＶ ＮＦＧＴＶＭＦＥＩＡ ＫＥＥＧＬＶＥＨＲＤ
ＱＬＲＫＬＰＰＥＥＱ ＫＲＩＱＫＬＡＧＫＫ ＩＡＥＭＡＫＥＦＮＩ
ＶＶＤＴＨＳＴＩＫＴ ＰＫＧＹＬＰＧＬＰＡ ＷＶＬＥＥＬＮＰＤＩ
ＩＶＬＶＥＡＥＮＤＥ ＩＬＭＲＲＬＫＤＥＴ ＲＱＲＤＦＥＳＴＥＤ
ＩＧＥＨＩＦＭＮＲＣ ＡＡＭＴＹＡＶＬＴＧ ＡＴＶＫＩＩＫＮＲＤ
ＦＬＬＤＫＡＶＱＥＬ ＩＥＶＬＫ
【０１３６】
１０−Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＧＹＶＩＶＡＴＧＶ ＰＧＶＧＡＴＴＶＴＴ ＥＡＶＫＥＬＥＧＹＥ
ＨＶＮＹＧＤＶＭＬＥ ＩＡＫＥＥＧＬＶＥＨ ＲＤＥＩＲＫＬＰＡＥ
ＫＱＲＥＩＱＲＬＡＡ ＲＲＩＡＫＭＡＥＥＫ ＥＧＩＩＶＤＴＨＣＴ
ＩＫＴＰＡＧＹＬＰＧ ＬＰＩＷＶＬＥＥＬＱ ＰＤＶＩＶＬＩＥＡＤ
ＰＤＥＩＭＭＲＲＶＫ ＤＳＥＥＲＱＲＤＹＤ ＲＡＨＥＩＥＥＨＱＫ
ＭＮＲＭＡＡＭＡＹＡ ＡＬＴＧＡＴＶＫＩＩ ＥＮＨＤＤＲＬＥＥＡ
ＶＲＥＦＶＥＴＶＲＳ Ｌ
【０１３７】
１１−Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ ＶＰＧＶＧＧＴＴＬＴ ＱＫＴＩＥＫＬＫＥＥ
ＧＩＥＹＫＭＶＮＦＧ ＴＶＭＦＥＶＡＫＥＥ ＧＬＶＥＤＲＤＱＭＲ
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ ＭＡＫＥＳＮＶＩＶＤ
ＴＨＳＴＶＫＴＰＫＧ ＹＬＡＧＬＰＩＷＶＬ ＥＥＬＮＰＤＩＩＶＩ
ＶＥＴＳＳＤＥＩＬＭ ＲＲＬＧＤＡＴＲＮＲ ＤＩＥＬＴＳＤＩＤＥ
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ ＡＹＧＶＬＴＧＡＴＶ ＫＩＩＫＮＲＤＧＬＬ
ＤＫＡＶＥＥＬＩＳＶ ＬＫ
【０１３８】
１２−Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＶＩＶＡＬＰＧ ＳＧＫＴＴＩＬＮＦＶ ＫＱＫＬＰＤＶＫＩＶ
ＮＹＧＤＶＭＬＥＩＡ ＫＫＲＦＧＩＱＨＲＤ ＥＭＲＫＫＩＰＶＤＥ
ＹＲＫＶＱＥＥＡＡＥ ＹＩＡＳＬＴＧＤＶＩ ＩＤＴＨＡＳＩＫＩＧ
ＧＧＹＹＰＧＬＰＤＲ ＩＩＳＫＬＫＰＤＶＩ ＬＬＬＥＹＤＰＫＶＩ
ＬＥＲＲＫＫＤＰＤＲ ＦＲＤＬＥＳＥＥＥＩ ＥＭＨＱＱＡＮＲＹＹ
ＡＦＡＡＡＮＡＧＥＳ ＴＶＨＶＬＮＦＲＧＫ ＰＥＳＲＰＦＥＨＡＥ
ＶＡＡＥＹＩＶＮＬＩ ＬＲＴＲＱＫＳ
【０１３９】
１３−Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＡＹＬＶＦＬＧＰ ＰＧＡＧＫＧＴＹＡＫ ＲＩＱＥＫＴＧＩＰＨ
ＩＳＴＧＤＩＦＲＤＩ ＶＫＫＥＮＤＥＬＧＫ ＫＩＫＥＩＭＥＫＧＥ
ＬＶＰＤＥＬＶＮＥＶ ＶＫＲＲＬＳＥＫＤＣ ＥＫＧＦＩＬＤＧＹＰ
ＲＴＶＡＱＡＥＦＬＤ ＳＦＬＥＳＱＮＫＱＬ ＴＡＡＶＬＦＤＶＰＥ
ＤＶＶＶＱＲＬＴＳＲ ＲＩＣＰＫＣＧＲＩＹ ＮＭＩＳＬＰＰＫＥＤ
ＥＬＣＤＤＣＫＶＫＬ ＶＱＲＤＤＤＫＥＥＴ ＶＲＨＲＹＫＶＹＬＥ
ＫＴＱＰＶＩＤＹＹＧ ＫＫＧＩＬＫＲＶＤＧ ＴＩＧＩＤＮＶＶＡＥ
ＶＬＫＩＩＧＷＳＤＫ
【０１４０】
１４−Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＶＲＨＰＦＫＶＶ ＶＶＴＧＶＰＧＶＧＫ ＴＴＶＩＫＥＬＱＧＬ
ＡＥＫＥＧＶＫＬＨＩ ＶＮＦＧＳＦＭＬＤＴ ＡＶＫＬＧＬＶＥＤＲ
ＤＫＩＲＴＬＰＬＲＲ ＱＬＥＬＱＲＥＡＡＫ ＲＩＶＡＥＡＳＫＡＬ
ＧＧＤＧＶＬＩＩＤＴ ＨＡＬＶＫＴＶＡＧＹ ＷＰＧＬＰＫＨＶＬＤ
ＥＬＫＰＤＭＩＡＶＶ ＥＡＳＰＥＥＶＡＡＲ ＱＡＲＤＴＴＲＹＲＶ
ＤＩＧＧＶＥＧＶＫＲ ＬＭＥＮＡＲＡＡＳＩ ＡＳＡＩＱＹＡＳＴＶ
ＡＩＶＥＮＲＥＧＥＡ ＡＫＡＡＥＥＬＬＲＬ ＩＫＮＬ
【０１４１】
１５−Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＮＬＩＦＬＧＰＰＧ ＡＧＫＧＴＱＡＫＲＶ ＳＥＫＹＧＩＰＱＩＳ
ＴＧＤＭＬＲＥＡＶＡ ＫＧＴＥＬＧＫＫＡＫ ＥＹＭＤＫＧＥＬＶＰ
ＤＥＶＶＩＧＩＶＫＥ ＲＬＱＱＰＤＣＥＫＧ ＦＩＬＤＧＦＰＲＴＬ
ＡＱＡＥＡＬＤＥＭＬ ＫＥＬＮＫＫＩＤＡＶ ＩＮＶＶＶＰＥＥＥＶ
ＶＫＲＩＴＹＲＲＴＣ ＲＮＣＧＡＶＹＨＬＩ ＹＡＰＰＫＥＤＮＫＣ
ＤＫＣＧＧＥＬＹＱＲ ＤＤＫＥＥＴＶＲＥ ＲＹＲＶＹＫＱＮＴＥ
ＰＬＩＤＹＹＲＫＫＧ ＩＬＹＤＶＤＧＴＫＤ ＩＥＧＶＷＫＥＩＥＡ
ＩＬＥＫＩＫＳ
【０１４２】
１６−Pyrococcus abyssi由来の単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ）
ＭＮＩＬＩＦＧＰＰＧ ＳＧＫＳＴＱＡＲＲＩ ＴＥＲＹＧＬＴＹＩＡ
ＳＧＤＩＩＲＡＥＩＫ ＡＲＴＰＬＧＩＥＭＥ ＲＹＬＳＲＧＤＬＩＰ
ＤＴＩＶＮＴＬＩＩＳ ＫＬＲＲＶＲＥＮＦＩ ＭＤＧＹＰＲＴＰＥＱ
ＶＩＴＬＥＮＹＬＹＤ ＨＧＩＫＬＤＶＡＩＤ ＩＹＩＴＫＥＥＳＶＲ
ＲＩＳＧＲＲＩＣＳＫ ＣＧＡＶＹＨＶＥＦＮ ＰＰＫＶＰＧＫＣＤＩ
ＣＧＧＥＬＩＱＲＰＤ ＤＲＰＥＩＶＥＫＲＹ ＤＩＹＳＫＮＭＥＰＩ
ＩＫＦＹＱＫＱＧＩＹ ＶＲＩＤＧＨＧＳＩＤ ＥＶＷＥＲＩＲＰＬＬ
ＤＹＩＹＮＱＥＮＲＲ
【０１４３】
（実施例５）
（組換えアデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
組換えｔＡＫ酵素の熱安定性をE. coli粗細胞溶解物で評価した。
【０１４４】
細胞を、本質的に実施例４に記載と同様に増殖させ、そして超音波処理によって溶解した。粗抽出物のＡＫ活性を８０℃にて３０分間の熱処理の前および後の両方で決定し、引き続き１０倍系列希釈を行った。
【０１４５】
結果（図４を参照のこと）は、広範な種々の組換え酵素が本発明の方法での使用に適していることを示している。特に好ましいＡＫは、T. maritima、A. fulgidus、およびS. solfataricus由来の酵素である。このような酵素は、生物発光アッセイについてより大きなダイナミックレンジを提供し、必要な場合、なおさらなる感度を提供すると思われる。
【０１４６】
（実施例６）
（特定の熱安定性アデニル酸キナーゼの特性はＴＳＥ不活性化についてのインジケータとしての価値を示す）
プリオン分子は、スチール表面に固着する顕著に高い性質を示す。
【０１４７】
プリオン汚染除去手順の検証のためのインジケータを開発するために、プリオン分子と同様の特性を有するキナーゼが有益である。この概念を探求するために、所定の表面への種々の組換え熱安定性アデニル酸キナーゼの結合を評価した（図５を参照のこと）。
【０１４８】
予めブロックしたプレートへのキナーゼの結合を評価した。標準のポリスチレンマイクロタイタープレートの表面を５％スキムミルクの添加によりブロックした。このミルクを除去し、そしてArchaeoglobus fulgidus（Afu）、Thermotoga maritime（Tma）およびSulfolobus acidocaldarius（Sac）由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの希釈物をプレートに塗布した。洗浄後、結合したキナーゼの量を、標準的なアッセイ方法（実施例１）について記載のようにして測定した。結果は、Sacキナーゼが、ブロックされたプレートに対して、２つの別のキナーゼのいずれよりも有意に高い結合を示したことを示している。酵素の比活性は同一ではないが、AfuキナーゼおよびTmaキナーゼはともにSac由来のキナーゼよりも高い活性を示し、このため、結合における現実の差異は、図に示すよりもずっとさらに大きい。
【０１４９】
スキムミルクは、プレートに結合するタンパク質を減少させるためのブロッキング剤として一般に用いられるので、これらの結果は、Sacキナーゼが、これらの実験で使用した表面（ポリスチレン）への疎水性吸着に非常に強い傾向を有することを示している。酵素のこの特性は、スチール表面に対してプリオン分子について観察された特性と同様であり、それが、広範なＴＳＥ不活性化および／または除去プロセスを評価するための非常に有効なインジケータであることを意味している。Sacキナーゼは、ステンレススチールに対してまさに同様の様式で結合し、そして結合の協同性を示す（すなわち、結合活性と低濃度の酵素の量との間には（線形ではなく）対数形の関係があり、このことは、それが、プリオン分子について見られるのと同様に、この表面で凝集特性を有することを示唆している）。
【０１５０】
酵素のこの特徴は、キナーゼが、共有結合されているのではなく、適切な支持体上に直接吸着されている直接吸着型のインジケータである可能性を示している。この場合のインジケータは、プロセスが表面から材料を除去する能力を評価することによって機能し、そして洗浄および汚染除去プロセスのモニタリングに広範に適用可能である。
【０１５１】
（実施例７）
（安定性を改善するためのアデニル酸キナーゼの遺伝子改変）
当業者に公知の標準的な方法を用いて、P. furiosus、P. horikoshii、およびS. acidocaldarius由来のＡＫ遺伝子において、それぞれ実施例８〜１０および配列番号１７〜１９に示すように、部位特異的変異体を構築した。
【０１５２】
各遺伝子で同定した特定の変更に加えて、S. acidocaldarius配列で下線を付した領域は、古細菌アデニル酸キナーゼ三量体構造のコアパッキング領域を形成している。したがって、この領域のパッキングを妨げるアミノ酸置換は、酵素の熱安定性および物理的安定性を減少させるのに大きな効果を有していると思われる。逆に、コアパッキングを改善するアミノ酸置換（特に、大きな側鎖を有する疎水性残基）は、熱または他のプロセスに対して酵素を安定化させ得る。したがって、既に記載された特定の変異に加えて、これらの領域において関連した遺伝子配列の局在遺伝子シャッフリング（本質的にStemmer (1994) Nature 370: 389-391およびCrameriら (1996) Nature Biotech. 14: 315-319に記載のように）および縮重オリゴヌクレオチドまたは改変したヌクレオチド混合物を用いるランダムＰＣＲに基づく変異誘発（例えば、Vartanianら (1996) Nucleic Acid Res. 24: 2627-2633）を用いる、多くの「選択的」アプローチを使用した。これらの改変の多くは、E. coliでの組換え発現、および高温での溶解した細胞中のアデニル酸キナーゼ活性の迅速アッセイにより評価した場合に、変化した安定性を示している。
【０１５３】
（実施例８）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１７））
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ
ＲＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
（ＫからＥ）ＩＱＲＥＬＱＭＫＡ ＡＫＫＩ（ＴからＡ）ＥＭＡＫＥ
ＨＰＩＬＶＤＴＨＡＴ ＩＫＴＰＨＧＹ（ＭからＬ）ＬＧ
ＬＰＹＥＶＶＫＴＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ
ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ
ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ
ＡＶＮＥＹＡ
【０１５４】
示した部位の１つ以上または全てでの変異が、酵素の熱安定性を改変する。強調した３つの規定の変更に加えて、１５７位のアラニンの別の小さな疎水性残基、例えば、Ｉ、Ｌまたはより大きな疎水性残基、例えば、Ｆへの改変は、組換えタンパク質の熱安定性を増大させる。したがって、これらの部位での改変の組み合わせによって可能な３５の改変体が存在する。アミノ酸１５７の極性残基、例えば、Ｔ（P. horikoshiiのＡｄｋＡでの等価な位置に見られる）、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒへの改変は、安定性の減少を生じる。
【０１５５】
（実施例９）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１８））
太字および下線で示した残基のいずれかまたは両方の改変は、酵素の熱安定性を増大さ
せる（３つの改変体が可能である）。
【０１５６】
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＫ ＬＡＬＱＲＴＲＡＫＦ
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ ＥＥＡＬＫＬＧＬＶＫ ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ
ＥＶＱＲＥＬＱＭＮＡ ＡＫＫＩＡＥＭＡＫＮ ＹＰＩＬＬＤＴＨＡＴ
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ ＬＰＹＥＶＩＫＩＬＮ ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ ＡＶＫＥＹＡ
【０１５７】
（実施例１０）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１９））
示した下線の残基の改変は、酵素の熱安定性を増大させ得る。
【０１５８】
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ ＧＶＧＫＳＴＶＬＡＫ ＶＫＥＩＬＤＮＱＧＩ
ＮＮＫＩＩＮＹＧＤＦ ＭＬＡＴＡＬＫＬＧＹ ＡＫＤＲＤＥＭＲＫＬ
ＳＶＥＫＱＫＫＬＱＩ ＤＡＡＫＧＩＡＥＥＡ ＲＡＧＧＥＧＹＬＦＩ
ＤＴＨＡＶＩＲＴＰＳ ＧＹ（ＡからＭ）ＰＧＬＰＳＹＶ ＩＴＥＩＮＰＳＶＩＦ
ＬＬＥＡＤＰＫＩＩＬ ＳＲＱＫＲＤＴＴＲＮ ＲＮＤＹＳＤＥＳＶＩ
ＬＥＴＩＮＦＡＲＹＡ ＡＴＡＳＡＶＬＡＧＳ ＴＶＫＶＩＶＮＶＥＧ
ＤＰＳＩＡＡＮＥＩＩ ＲＳＭＫ
【０１５９】
（実施例１１）
（ＴＳＥの不活性化の検証のためのアデニル酸キナーゼインジケータ）
高い温度およびｐＨでのＴＳＥ材料のプロテアーゼ不活性化について使用するために、ＡＫベースのプリオンインジケータを開発した。
【０１６０】
（インジケータ１）
ポリカーボネート支持体を、精製組換えS. acidocaldarius ＡＫ（実施例４に記載）の処方物でコーティングした。この酵素を、リン酸緩衝化生理食塩水pH7.4（ＰＢＳ）中に５％(w/v)ソルビトール、10mg/mlウシ血清アルブミン（Fraction V; Sigma chemical company）の存在下に１mg/mlの濃度で処方した。100μlの容量を、２２℃にて１時間支持体上で乾燥させた。
【０１６１】
（インジケータ２）
ポリスチレン支持体を、Tris緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）pH7.4中に１mg/mlのS. acidocaldarius ＡＫ、１ｍＭトリプトファン、５％(w/v)ソルビトールを含有する100μlの処方物でコーティングし、そして４℃にて２４時間乾燥させた。
【０１６２】
（インジケータ３）
第三のインジケータを、ジスルフィド結合形成に基づく方法を用いて、可撓性ポリスチレン細棒上でS. solfataricus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの１mg/mlの処方物の100μlを架橋させることにより調製した。組換え熱安定性アデニル酸キナーゼを、ヘテロ二官能剤のスルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＰＤＰ；Pierce chemical company, UK）を１：１〜３：１の間のＳＰＤＰ：タンパク質比で用いて誘導体化した。次いで、誘導体化したキナーゼを、還元剤のジチオスレイトール（ＤＴＴ）との反応により還元し、還元剤を透析により除去し、そしてキナーゼを、マレイミド誘導体化したポリスチレン細棒と反応させた。
【０１６３】
（プロテアーゼ処理）
器具洗浄浴を６０℃で作動するように設定し、そしてアルカリプロテアーゼ処方物を添加して、pH12（浴温で測定）に緩衝化された酵素1.5〜２mg/mlを得た。所望であれば、適切なアニオン性界面活性剤もまた処方物中に含まれ得る。インジケータを、記載の条件下で３０分間インキュベートした。次いで、インジケータを取り出し、そして蒸留水で１回リンスした。次いで、酵素活性を実施例１に記載のように測定し、そして蛍光をルミノメーターを用いて測定した。
【０１６４】
（アデニル酸キナーゼ酵素の標準曲線）
ＡＫ酵素の標準曲線を以下のようにして作成した。10μg/mlから１fg/mlまでの精製Sulfolobus acidocaldarius ＡＫの系列希釈を、50mM Tris、25mM MESNA、pH7.3中で調製した。100μlの酵素をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、そして100μlの135μM ＡＤＰ、15mM MgAc、１mM EDTAを各ウェルに添加した。３０℃、５０℃、および７０℃にて２０分間のアッセイプレートのインキュベーションについて、３つの別々の標準曲線を作成した。インキュベーション後、30μlのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬（Biothema）を添加し、そしてシグナルをルミノメーター（Orion, Berthold）で読み取り、そしてその結果を図３に示した。
【０１６５】
（ＴＳＥ不活性化の検証）
キナーゼ活性のレベルを、キナーゼの標準曲線に対して評価した。標準曲線から評価されるように、1,000,000相対発光量（ＲＬＵ）より大きな蛍光値を有する100μgのキナーゼを有するインジケータについては、4000ＲＬＵ未満の蛍光値はキナーゼ濃度の６対数減少に相当し、そして500ＲＬＵ未満の蛍光値はキナーゼ濃度の８対数減少に相当する。
【０１６６】
上記プロテアーゼ消化条件（pH12の緩衝液処方物中にＭＣ３と称するアルカリプロテアーゼを２mg/mlとし、６０℃で３０分間消化）下では、本発明者らは、ＶＭマウスでバイオアッセイしたBSE-301V株の感染度レベルで約８対数の減少を示した。同じ条件下で、上記のように処方したＡＫインジケータは、1,000,000超（未処理）から500未満のＲＬＵへのＲＬＵの減少を示した。したがって、キナーゼの濃度の８対数減少は、ＢＳＥの感染度の８対数減少に相当する。この事実を用いて、キナーゼ濃度をモニタリングし、この濃度をＢＳＥ感染度のレベルの減少と関連付けることが可能である。
【０１６７】
（検証された手順の使用）
いかなる型のＣＪＤが潜伏しているかが不明である患者に対して慣用の手術または神経手術で使用される手術器具のセットを、使用した後に院内滅菌サービスユニットに戻す。これらの器具を、アルカリプロテアーゼＭＣ３の処方物を用いて、６０℃にて３０分間作動するように設定した洗浄／消毒器中で、通常通り清浄を行うために準備する。１つ以上の上記ＡＫインジケータを処理浴中に入れておく。処理後、および器具が通常のオートクレーブ滅菌のために回送される前に、インジケータを取り出し、そして迅速アッセイを行い、プロセスが有効であることを確認する。プロセスのパラメーターとして規定された６対数または８対数の活性の減少を示すアッセイ結果が、器具がさらに処理される前に必要である。成功したプロセス後、器具は、必要に応じて、オートクレーブ滅菌のような他の滅菌手順に準備され得る。
【０１６８】
（実施例１２）
（酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼの発現）
実施例４の方法に従って、本発明者らは、酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼを発現させた：
【０１６９】
２０−Thermatoga maritima由来の酢酸キナーゼ
ＭＲＶＬＶＩＮＳＧＳ ＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭ ＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩ
ＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲ ＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨ ＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥ
ＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬ ＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤ ＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲ
ＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥ ＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫ ＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰ
ＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩ ＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶ ＰＮＶＡＶＦＤＴＡＦ
ＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬ ＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫ ＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧ
ＴＳＨＲＹＶＳＫＲＡ ＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥ ＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮ
ＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧ ＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴ ＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲ
ＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦ ＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰ ＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫ
ＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦ ＳＳＤＭＲＤＩＥＥＡ ＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬ
ＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡ ＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭ ＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡ
ＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲ ＥＤＶＣＳＹＬＥＦＬ ＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥ
ＥＴＩＲＧＫＥＧＩＩ ＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬ ＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩ
ＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫ ＩＧＲ
【０１７０】
２１−Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＭＫＬＰＳＨＫ ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ ＴＮＳＫＫＭＩＫＫＬ
ＩＥＡＧＭＮＶＡＲＩ ＮＦＳＨＧＴＦＥＥＨ ＡＫＩＩＥＭＶＲＥＱ
ＳＧＫＬＤＲＲＶＡＩ ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ
ＬＥＲＧＥＫＶＴＬＴ ＴＫＤＩＥＧＤＥＴＴ ＩＰＶＥＹＫＤＦＰＫ
ＬＶＳＫＧＤＶＩＹＬ ＳＤＧＹＩＶＬＲＶＥ ＤＶＫＥＮＥＶＥＡＶ
ＶＩＳＧＧＫＬＦＳＲ ＫＧＩＮＩＰＫＡＹＬ ＰＶＥＡＩＴＰＲＤＩ
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ ＮＶＹＤＶＬＫＡＫＳ
ＦＬＥＲＮＧＡＧＤＴ ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ ＡＶＲＮＦＮＥＩＬＮ
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ ＬＰＩＬＱＫＲＬＩＲ
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ ＭＥＫＶＰＴＲＡＥＶ
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ ＡＶＧＫＦＰＩＥＡＶ
ＥＭＭＡＲＩＡＫＶＴ ＥＥＹＲＥＳＦＧＩＴ ＲＭＲＥＦＬＥＧＴＫ
ＲＧＴＩＫＥＡＩＴＲ ＳＩＩＤＡＩＣＴＩＧ ＩＫＦＩＬＴＰＴＫＴ
ＧＲＴＡＲＬＩＳＲＦ ＫＰＫＱＷＩＬＡＦＳ ＴＲＥＫＶＣＮＮＬＭ
ＦＳＹＧＶＹＰＦＣＭ ＥＥＧＦＮＥＮＤＩＶ ＲＬＩＫＧＬＧＬＶＧ
ＳＤＤＩＶＬＭＴＥＧ ＫＰＩＥＫＴＶＧＴＮ ＳＩＫＩＦＱＩＡ
【０１７１】
２２−Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＫＴＫＩＶＡＴＬ ＧＰＳＳＥＥＫＶＫＥ ＬＡＥＹＶＤＶＦＲＩ
ＮＦＡＨＧＤＥＴＳＨ ＲＫＹＦＤＬＩＲＴＹ ＡＰＥＳＳＩＩＶＤＬ
ＰＧＰＫＬＲＬＧＥＬ ＫＥＰＩＥＶＫＫＧＤ ＫＩＶＦＳＱＫＤＧＩ
ＰＶＤＤＥＬＦＹＳＡ ＶＫＥＮＳＤＩＬＩＡ ＤＧＴＩＲＶＲＶＫＳ
ＫＡＫＤＲＶＥＧＴＶ ＩＥＧＧＩＬＬＳＲＫ ＧＩＮＩＰＮＶＮＬＫ
ＳＧＩＴＤＮＤＬＫＬ ＬＫＲＡＬＤＬＧＡＤ ＹＩＧＬＳＦＶＩＳＥ
ＮＤＶＫＫＶＫＥＦＶ ＧＤＥＡＷＶＩＡＫＩ ＥＫＳＥＡＬＫＮＬＴ
ＮＩＶＮＥＳＤＧＩＭ ＶＡＲＧＤＬＧＶＥＴ ＧＬＥＮＬＰＬＩＱＲ
ＲＩＶＲＴＳＲＶＦＧ ＫＰＶＩＬＡＴＱＶＬ ＴＳＭＩＮＳＰＩＰＴ
ＲＡＥＩＩＤＩＳＮＳ ＩＭＱＧＶＤＳＩＭＬ ＳＤＥＴＡＩＧＮＹＰ
ＶＥＳＶＲＴＬＨＮＩ ＩＳＮＶＥＫＳＶＫＨ ＲＰＩＧＰＬＮＳＥＳ
ＤＡＩＡＬＡＡＶＮＡ ＳＫＶＳＫＡＤＶＩＶ ＶＹＳＲＳＧＮＳＩＬ
ＲＶＳＲＬＲＰＥＲＮ ＩＩＧＶＳＰＤＰＲＬ ＡＫＫＦＫＬＣＹＧＶ
ＩＰＩＳＩＮＫＫＭＱ ＳＩＤＥＩＩＤＶＳＡ ＫＬＭＱＥＫＩＫＤＬ
ＫＦＫＫＩＶＩＶＧＧ ＤＰＫＱＥＡＧＫＴＮ ＦＶＩＶＫＴＬＥＱＱ
ＫＫ
【０１７２】
２３−Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＳＴＫＩＶＣＴＶ ＧＰＲＴＤＳＹＥＭＩ ＥＫＭＩＤＬＧＶＮＶ
ＦＲＩＮＴＳＨＧＤＷ ＮＥＱＥＱＫＩＬＫＩ ＫＤＬＲＥＫＫＫＫＰ
ＶＡＩＬＩＤＬＡＧＰ ＫＩＲＴＧＹＬＥＫＥ ＦＶＥＬＫＥＧＱＩＦ
ＴＬＴＴＫＥＩＬＧＮ ＥＨＩＶＳＶＮＬＳＳ ＬＰＫＤＶＫＫＧＤＴ
ＩＬＬＳＤＧＥＩＶＬ ＥＶＩＥＴＴＤＴＥＶ ＫＴＶＶＫＶＧＧＫＩ
ＴＨＲＲＧＶＮＶＰＴ ＡＤＬＳＶＥＳＩＴＤ ＲＤＲＥＦＩＫＬＧＴ
ＬＨＤＶＥＦＦＡＬＳ ＦＶＲＫＰＥＤＶＬＫ ＡＫＥＥＩＲＫＨＧＫ
ＥＩＰＶＩＳＫＩＥＴ ＫＫＡＬＥＲＬＥＥＩ ＩＫＶＳＤＧＩＭＶＡ
ＲＧＤＬＧＶＥＩＰＩ ＥＥＶＰＩＶＱＫＥＩ ＩＫＬＳＫＹＹＳＫＰ
ＶＩＶＡＴＱＩＬＥＳ ＭＩＥＮＰＦＰＴＲＡ ＥＶＴＤＩＡＮＡＩＦ
ＤＧＡＤＡＬＬＬＴＡ ＥＴＡＶＧＫＨＰＬＥ ＡＩＫＶＬＳＫＶＡＫ
ＥＡＥＫＫＬＥＦＦＲ ＴＩＥＹＤＴＳＤＩＳ ＥＡＩＳＨＡＣＷＱＬ
ＳＥＳＬＮＡＫＬＩＩ ＴＰＴＩＳＧＳＴＡＶ ＲＶＳＫＹＮＶＳＱＰ
ＩＶＡＬＴＰＥＥＫＴ ＹＹＲＬＳＬＶＲＫＶ ＩＰＶＬＡＥＫＣＳＱ
ＥＬＥＦＩＥＫＧＬＫ ＫＶＥＥＭＧＬＡＥＫ ＧＤＬＶＶＬＴＳＧＶ
ＰＧＫＶＧＴＴＮＴＩ ＲＶＬＫＶＤ
【０１７３】
２４−Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＶＫＬＰＳＨＫ ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ ＴＮＳＲＫＭＩＫＱＬ
ＩＫＡＧＭＮＶＡＲＩ ＮＦＳＨＧＳＦＥＥＨ ＡＲＶＩＥＩＩＲＥＥ
ＡＱＫＬＤＲＲＶＡＩ ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ
ＬＫＲＧＥＫＶＩＬＴ ＴＫＤＶＥＧＤＥＴＴ ＩＰＶＤＹＫＧＦＰＮ
ＬＶＳＫＧＤＩＩＹＬ ＮＤＧＹＩＶＬＫＶＥ ＮＶＲＥＮＥＶＥＡＶ
ＶＬＳＧＧＫＬＦＳＲ ＫＧＶＮＩＰＫＡＹＬ ＰＶＥＡＩＴＰＫＤＦ
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ ＳＶＹＤＶＬＫＡＫＳ
ＦＬＥＫＮＮＡＥＤＶ ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ ＡＶＲＮＦＤＥＩＬＮ
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ ＬＰＩＬＱＫＫＬＩＲ
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ ＴＥＫＶＰＴＲＡＥＶ
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ ＡＩＧＫＦＰＩＥＴＶ
ＥＭＭＧＫＩＡＫＶＴ ＥＥＹＲＥＳＦＧＬＳ ＲＩＲＥＦＭＥＩＫＫ
ＧＴＩＫＥＡＩＴＲＳ ＩＩＤＡＩＣＴＩＤＩ ＫＦＩＬＴＰＴＲＴＧ
ＲＴＡＲＬＩＳＲＦＫ ＰＫＱＷＩＬＡＦＳＴ ＮＥＲＶＣＮＮＬＭＦ
ＳＹＧＶＹＰＦＣＬＥ ＥＧＦＤＥＮＤＩＶＲ ＬＩＫＧＬＧＬＶＥＳ
ＤＤＭＶＬＭＴＥＧＫ ＰＩＥＫＴＶＧＴＮＳ ＩＫＩＦＱＩＡ
【０１７４】
２５−Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼ
ＭＫＶＬＶＩＮＡＧＳ ＳＳＬＫＹＱＬＩＤＭ ＴＮＥＳＡＬＡＶＧＬ
ＣＥＲＩＧＩＤＮＳＩ ＩＴＱＫＫＦＤＧＫＫ ＬＥＫＬＴＤＬＰＴＨ
ＫＤＡＬＥＥＶＶＫＡ ＬＴＤＤＥＦＧＶＩＫ ＤＭＧＥＩＮＡＶＧＨ
ＲＶＶＨＧＧＥＫＦＴ ＴＳＡＬＹＤＥＧＶＥ ＫＡＩＫＤＣＦＥＬＡ
ＰＬＨＮＰＰＮＭＭＧ ＩＳＡＣＡＥＩＭＰＧ ＴＰＭＶＩＶＦＤＴＡ
ＦＨＱＴＭＰＰＹＡＹ ＭＹＡＬＰＹＤＬＹＥ ＫＨＧＶＲＫＹＧＦＨ
ＧＴＳＨＫＹＶＡＥＲ ＡＡＬＭＬＧＫＰＡＥ ＥＴＫＩＩＴＣＨＬＧ
ＮＧＳＳＩＴＡＶＥＧ ＧＫＳＶＥＴＳＭＧＦ ＴＰＬＥＧＬＡＭＧＴ
ＲＣＧＳＩＤＰＡＩＶ ＰＦＬＭＥＫＥＧＬＴ ＴＲＥＩＤＴＬＭＮＫ
ＫＳＧＶＬＧＶＳＧＬ ＳＮＤＦＲＤＬＤＥＡ ＡＳＫＧＮＲＫＡＥＬ
ＡＬＥＩＦＡＹＫＶＫ ＫＦＩＧＥＹＳＡＶＬ ＮＧＡＤＡＶＶＦＴＡ
ＧＩＧＥＮＳＡＳＩＲ ＫＲＩＬＴＧＬＤＧＩ ＧＩＫＩＤＤＥＫＮＫ
ＩＲＧＱＥＩＤＩＳＴ ＰＤＡＫＶＲＶＦＶＩ ＰＴＮＥＥＬＡＩＡＲ
ＥＴＫＥＩＶＥＴＥＶ ＫＬＲＳＳＩＰＶ
【０１７５】
（実施例１３）
（ＴＳＥ因子のタンパク質分解不活性化のためのインジケータとしての熱安定性アデニル酸キナーゼ）
アルカリプロテアーゼの20mg/mlストックを緩衝化0.2M KCl（pH12）中の10μg/mlの組換えS. acidocaldarius ＡＫの溶液を用いて希釈し、２mg/mlから減少させて0.001μg/mlまでの範囲のプロテアーゼ濃度を生成した。100μlの容量の材料をポリスチレンサーモサイクラープレートに添加し、そして６０℃にて１０分間インキュベートし、アルカリプロテアーゼによってＡＫを消化した。10μlの10×リン酸緩衝液（pH7）の添加により、この溶液を中和した。15mM MgAc、１mM EDTA緩衝液中135μM ＡＤＰを100μl／ウェルで添加した。次いで、これらのウェルをサーモサイクラー中で７０℃にて２０分間インキュベートした。ルシフェリン／ルシフェラーゼ（ＡＴＰ）試薬（Biothema）を30μl／ウェルで添加し、そしてこれらのウェルをルミノメーターで即時に読み取った。アッセイの結果を図２に示す。
【０１７６】
これらの結果は、手術器具の汚染除去のために有用であると同定された条件下で、アルカリプロテアーゼによる消化に対するＡＫ酵素の顕著な安定性を示している。アルカリプロテアーゼでの消化後に見られた減少を処理後に残存する活性のレベルに関連付けるために、図３に示すような標準曲線を用いる。次に、これは、ＴＳＥの滴定曲線を用いて感染度のレベルの減少度に関連付けられる。インジケータとしての使用のために、アッセイは、酵素活性の標準曲線が、プロセスによる汚染除去の受容可能なレベルに相当する限界／閾値が明確に示されるように設計される。
【０１７７】
（実施例１４）
（生物学的界面活性剤を用いる衣服洗浄サイクルの性能の検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、ジスルフィド結合形成に基づく方法を用いて、可撓性ポリスチレン細棒上にS. solfataricus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼを架橋させることにより調製する。この方法では、熱安定性アデニル酸キナーゼを、スルホスクシンイミジル6-(3'-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート（ＳＰＤＰ；Pierce chemical company, UK）のようなヘテロ二官能剤を１：１〜３：１の間のＳＰＤＰ：タンパク質比で用いて誘導体化させる。次いで、誘導体化したキナーゼを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または2-メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ）のような還元剤との反応により還元し、還元剤を透析により除去し、そしてキナーゼを、マレイミド誘導体化したポリスチレン表面と反応させる。代表的には、0.1mgのキナーゼがインジケータ上に存在する。
【０１７８】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、高タンパク質結合性ポリスチレンストリップ上へのS. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼの非特異的接着により調製する。キナーゼを、必要に応じて安定化剤のソルビトールを0.1〜２％w/vで含む炭酸水素緩衝液(pH9.6)中で0.5〜２mg/mlの濃度で調製する。次いで、結合緩衝液中のキナーゼを高タンパク質結合性ポリスチレンストリップと２２℃にて１〜２時間（または４℃にて終夜）インキュベートする。残余キナーゼをリン酸緩衝化生理食塩水中での洗浄により除去する。代表的には、0.1mgのキナーゼがインジケータ上に存在する。
【０１７９】
（洗浄サイクルの検証）
洗浄機に洗浄する品目を入れ、そして洗浄機の内部にある適切なホルダー内にインジケータを固定する（その回収を容易にするため）。次いで、洗浄サイクルを行う。サイクルの完了後、インジケータを取り出し、そしてキナーゼの残余活性を、実施例１に記載のアッセイ方法に基づく「読み取り機」を用いて評価する。この読み取り機は、インジケータ内で受容可能な「閾値」レベルの残余キナーゼ活性を示すように較正される。この「閾値」レベルは、プロセス内での以前の較正および適切な性能の評価から導き出される。
【０１８０】
残余キナーゼ活性がこの閾値レベル以下であることを読み取り機が示す場合、投入物は清浄化されており、さらに処理される。
【０１８１】
（実施例１５）
（プロテアーゼ処方物を用いる硬質表面上でのノーウォーク様ウイルス（ノロウイルス、ノーウォークウイルス、または冬季嘔吐病とも呼ばれる）の不活性化のためのプロセスの検証）
（インジケータの調製）
実施例１４に記載のようなジスルフィド介在架橋を用いて、S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを薄片ポリスチレンストリップ上に固定化することにより、インジケータを調製する。
【０１８２】
（検証）
インジケータストリップを、汚染の可能性のある表面上に置く。次いで、表面およびインジケータストリップの両方を、ペースト中に処方された高活性アルカリプロテアーゼであるプロテイナーゼＫでコーティングする。（プロテイナーゼＫをペーストに処方することは、酵素と表面／インジケータとの間の接触を改善する。）このペーストを１〜２時間、表面／インジケータ上に放置する。
【０１８３】
処理の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、表面は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１８４】
（実施例１６）
（リシンのプロテアーゼ分解の検証）
（インジケータの調製）
テキストおよび実施例１４に記載される標準的なスルフヒドリル−マレイミドカップリング方法を用いて、Thermotoga maritima由来の熱安定性酢酸キナーゼ0.1mgをポリカーボネートストリップ上に固定化することにより、インジケータを調製する。
【０１８５】
（検証）
このインジケータストリップを、実施例１１と同様に、汚染除去される対象物と一緒にプロテアーゼ溶液中に浸漬するか、または実施例１５と同様に、汚染除去される表面に取り付けるかのいずれかを行う。
【０１８６】
次いで、対象物／表面を、必要な長さの時間、プロテアーゼ溶液で処理する。処理の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、対象物／表面は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１８７】
（実施例１７）
（ＴＳＥ因子の気相オゾン不活性化の検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、実施例１４に記載のようなＳＰＤＰ−マレイミド方法を用いて、S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを剛性ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）支持体上に共有結合架橋させることにより調製する。
【０１８８】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、アミン反応性ＰＶＣ表面の存在下でS. acidocaldariusアデニル酸キナーゼをビス-[β-(4-アジドサリチルアミド)エチル]ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ；Pierce chemicals）と反応させることにより調製する。これにより、キナーゼは、アミド結合を介して表面に迅速に共有結合される。
【０１８９】
（検証）
インジケータおよびＴＳＥ汚染物品を、気相オゾン不活性化プロセスに曝露する。プロセスの終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルを、実施例１４に記載と同様に、「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、この物品は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９０】
（実施例１８）
（内視鏡清浄のための液体化学滅菌システム（例えば、Endoclens）の検証）
（インジケータ１の調製）
A. fulgidus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを内視鏡チューブと同様の総内直径のチューブの内表面に（実施例１４に記載のＳＰＤＰベースの方法を用いて）化学架橋させることにより、インジケータを調製する。
【０１９１】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、アデニル酸キナーゼを誘導体化することなく調製する。Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼの遺伝子配列を、組換えタンパク質が、配列番号４に示すような配列のアミノ末端に付加システインを含むように改変する。組換えタンパク質を前に記載したように発現および精製し、そしてＤＴＴで還元し、スルフヒドリル基が利用可能であることを確定にする。次いで、これをマレイミド反応性プラスチックと直接反応させて、必要な架橋を生成し得る。約１〜２mg/mlのシステイン含有酵素の処方物は、実施例１４に記載の誘導体化方法に必要とした処方物と同様である。
【０１９２】
（検証）
インジケータ装置を、自動化再処理装置上で内視鏡に直列に連結し、そして次いで、内視鏡を通常通りに動かす。プロセスの終了時、インジケータを外し、そして残余キナーゼ活性のレベルについて、実施例１４に記載と同様に「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、内視鏡は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９３】
（実施例１９）
（院内洗浄消毒器での手術器具の清浄の検証）
（インジケータ１の調製）
S. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgをステンレススチール表面に非共有結合にて付着させることにより、インジケータを調製する。本実施例では、インジケータが、プロセスによる表面汚れの除去を測定するように設計されるので、タンパク質をインジケータデバイスに共有結合によって連結させない。キナーゼを、好ましくは、約pH9.6の炭酸水素緩衝液中に、１〜２mg/mlで処方する。材料を、室温にて１〜２時間インキュベートすることにより、金属表面上に吸着させる。金属表面は、必要に応じて、より疎水性となるように改変され得る（例えば、厳しさの高い洗浄については、インジケータに十分なシグナルが保持されるのを確実にするために、さらなる付着が必要とされ得る）。付着されていないキナーゼは、接着したインジケータキナーゼの大部分を外すことのないような条件下でインジケータを洗浄することにより除去される。
【０１９４】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、このタイプの清浄プロセスを検証するために現在使用されている標準汚れを含む処方物の一部として、ステンレススチール表面に、S. acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ0.1mgを、（インジケータ１について記載の方法を用いて）接着させることにより調製する。このことにより、インジケータ技術を、洗浄消毒器の慣用的な検証および維持の一部として規制機関に受容可能な方法と相関させることが可能になる。
【０１９５】
（検証）
インジケータを、処理される手術器具のバッチに入れ、そして洗浄消毒器サイクルを実行する。実行の終了時、インジケータを取り出し、そして残余キナーゼ活性のレベルについて実施例１４に記載と同様に「読み取り機」を用いて評価する。残余キナーゼ活性が読み取り機の「閾値」レベル以下である場合、器具は、使用に安全であるように清浄化されている。
【０１９６】
（実施例２０）
（バルク液を滅菌するためのプロセスの検証）
（インジケータ１の調製）
第一のインジケータを、Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼ0.1mgをポリスチレンストリップに共有結合で付着させることにより調製する。
【０１９７】
（インジケータ２の調製）
第二のインジケータを、A. fulgidus由来の熱安定性アデニル酸キナーゼ0.1mgを透析チューブのような半透過性膜の内表面に付着させることにより調製する。A. fulgidusキナーゼは、天然に存在する反応性システイン残基を含み（すなわち、天然型酵素内ではジスルフィド結合されていない）、これは、ＢＭＰＨ（Pierce）と反応し得る。これは、例えば、適切な酸化剤でのビスキングチューブの処理によって生じるような、酸化された糖質と反応し得る基を生じる。この酵素を実施例１４に記載のように処方し、そして酸化された膜表面と反応させて、共有結合したインジケータを生成する。
【０１９８】
（検証）
次いで、インジケータを、バルク液内に付着させ、そして滅菌プロセス（例えば、オートクレーブ処理、酸化ガスの通過、または他の化学滅菌）を行う。
【０１９９】
プロセスの完了時に、バルク液からインジケータを取り出し、そしてキナーゼの残余活性を実施例１４に記載のように規定の閾値と比較する。
【０２００】
（実施例２１）
（プロテアーゼ消化後の残余アデニル酸キナーゼ酵素活性の較正）
プリオン因子の不活性化の適切なレベルの評価のための較正曲線の図を、図６に示す。
【０２０１】
示した例は、pH12で３０℃にて３０分間として規定した条件下の手術器具のプロテアーゼ処理についてである。
【０２０２】
プロテアーゼ濃度は、記載の条件下で種々の濃度のプロテアーゼでプリオン不活性化のレベルを評価することにより規定される（パネルＡ）。図では、プロテアーゼＭＣ３は、規定された条件下で１mg/mlの濃度で、感染量の６対数減少に等価な不活性化のレベルを提供し得る。プロテアーゼの等価な濃度で、かつ同じ条件下で、本質的に実施例１１に記載したように調製したS. acidocaldariusインジケータに残っているアデニル酸キナーゼの残余活性は、10ＲＬＵの桁である（パネルＢ）。したがって、一バッチの器具を再利用のために通過させるには、10ＲＬＵ未満の値が必要である。
【０２０３】
必要に応じて、１未満のＲＬＵ値が必要であるように、さらなる安全性余裕が組み込まれる。これは、プリオン感染度の７対数減少（設定標準より１対数さらに不活性化）を示すプロテアーゼ濃度でのインジケータの処理後の残余アデニル酸キナーゼ活性のレベルに相関している。
【０２０４】
（実施例２２）
（オゾン処理後の残余アデニル酸キナーゼ酵素活性の較正）
オゾン処理方法によるプリオン因子の不活性化の適切なレベルの評価のための較正曲線の図を、図７に示す。
【０２０５】
示した例は、規定の時間にわたって滅菌チャンバー中に定速でオゾンを放出するオゾン処理についてである。次いで、時間を増減させることによりオゾンレベルを算定し、付随してオゾン濃度が増減する。
【０２０６】
パネルＡには、標準サイクル時間の分数または倍数によって、プリオン不活性化のレベルを示す。したがって、2.5標準サイクルは、プリオンの６対数不活性化を表す。等価倍数のオゾンサイクルでは、本質的に実施例１７に記載のように調製したインジケータに残っているアデニル酸キナーゼの残余レベルは、1000ＲＬＵの桁である。
【０２０７】
したがって、一バッチの器具を再利用のために通過させるには、1000ＲＬＵ未満の値が必要である。必要に応じて、100未満のＲＬＵ値が必要であるように、さらなる安全性余裕がインジケータについて組み込まれる。これは、プリオン感染度の７対数減少（設定標準より１対数さらに不活性化）を示すオゾン濃度でのインジケータの処理後の残余アデニル酸キナーゼ活性のレベルに相当している。
【０２０８】
（実施例２３）
（院内洗浄消毒器での手術器具の慣用の清浄をモニタリングするために設計されたインジケータについての較正）
図８は、生物学的（酵素含有）処方物または界面活性剤ベースの処方物のいずれかを用いる手術器具の慣用の清浄を評価するための較正曲線の図を示す。
【０２０９】
インジケータデバイスを、実施例１９に記載するように調製する。
【０２１０】
パネルＡは、規定の洗浄機用処方物を用いた洗浄消毒器実行による規定の医用器具からの標準汚れの除去率を示す。洗浄サイクルの時間は、適切な性能レベルを決定するために変更される。パネルＢは、実施例１７に記載のように調製し、そして標準的に汚れている器具に関して同じ条件下で洗浄したインジケータデバイスからの残余S. acidocaldariusキナーゼ活性を示す。
【０２１１】
汚れの残余レベルは、この試験における出発物の0.1％であると規定され、そしてこれは、２５分間の洗浄時間と相関している。２５分間洗浄したインジケータについてのＲＬＵ値は、約100ＲＬＵである。したがって、インジケータは、３０分洗浄サイクル内で使用され、100のＲＬＵ閾値を有する上記0.1％レベルまたは約２５のＲＬＵカットオフを有する0.05%レベルが、受容可能な「汚れ」除去であるとの指標を提供し得る。
【０２１２】
（実施例２４）
（キナーゼインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持型衛生モニターの改変）
本発明のインジケータに関連したキナーゼ活性のレベルを評価するために、多くのアッセイ形式が潜在的に利用可能である。これらには、チューブ状ルミノメーター、マイクロタイタープレートルミノメーター、および種々の他の形式が含まれる。
【０２１３】
本発明のインジケータ上のキナーゼ活性の評価に格別な実用性を有する１つの形式は、手持型衛生モニターである。現行の技術は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ酵素システムを介して、表面上で直接的にか、または表面から取り出した細菌または他の細胞を溶解することによるかのいずれかで、ＡＴＰを検出する。
【０２１４】
当業者は、システムがＡＴＰの存在に応じて光を生成および測定する能力を既に備えるので、このシステムがインジケータデバイス上でのキナーゼの検出用に適合可能であることを認識する。キナーゼについてのＡＤＰ基質を添加するように試薬処方を変更することにより、インジケータ上の酵素の存在を迅速に測定することが可能である。
【０２１５】
実施の際、インジケータを一バッチの材料に添加し、そして処理する。次いで、インジケータを取り出し、そして試薬チューブに入れ、ＡＴＰを生成させる。この試薬チューブの処方は、高純度ＡＤＰ試薬を用いて、本質的に実施例１の方法に記載の通りである。チューブを、モニタリングされるインジケータおよびプロセスのタイプについて規定されるように、規定の長さの時間インキュベートする。インキュベーションの終了時、残余ｔＡＫの存在により生成したＡＴＰを含む試薬試料を、ルシフェリン−ルシフェラーゼを含む第二のコンパートメントに放出し、そして測定可能な光を生じさせる。
【０２１６】
このデバイスは、第一のＡＴＰ生成工程がＡＴＰの検出に必要でないので、標準的な衛生モニターとは異なる。このようなデバイスを構築する最も簡易な方法は、図９に示すように、破断可能な隔膜によって分離された２つのコンパートメントを有するチューブを有することである。第一の位置（工程１）でチューブに挿入されたインジケータは、ＡＴＰ生成を可能にし、そしてインキュベーションの終了時に、自動的にまたは手動のいずれかで、工程２に示される位置に押し出され、そこで光生成が生じる。このようなデバイスの広範な種々の別の構築物も可能である。必要に応じて、内因性キナーゼ活性を除く熱変性工程および／または内因性ＡＴＰを除くアピラーゼ処理が実施され得る。ＡＴＰ生成工程は、必要とされる場合に高温で実施され得る。
【０２１７】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、および９０℃（Ｃ）での処理後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す。
【図２】図２は、種々の濃度のアルカリプロテアーゼによるアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）消化後の残余酵素活性を示す。
【図３】図３は、酵素活性とアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）の残余濃度との相関を示す標準曲線を示す。
【図４】図４は、E. coliで組換え発現した種々のＡＫ酵素の熱安定性を示す。
【図５】図５は、固体支持体への熱安定性アデニル酸キナーゼ（ｔＡＫ）の結合の差異を示す。
【図６】図６は、プリオンを不活性化するためのプロテアーゼ消化処理についての較正曲線の作成を示す。
【図７】図７は、プリオンを不活性化するための気相オゾン処理についての較正曲線の作成を示す。
【図８】図８は、標準的な汚れを除去するための院内用洗浄消毒器についての較正曲線の作成を示す。
【図９】図９は、ｔＡＫインジケータの迅速読み取り評価を可能にする手持形衛生モニターの改変を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するためのインジケータとしてのキナーゼの使用。
【請求項２】
キナーゼが固体支持体中に固定化されているか、または固体支持体上に固定化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記キナーゼが熱安定性である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記キナーゼが、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒する、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記固体支持体がマトリックスであり、そして前記キナーゼが該マトリックス内に分散されている、請求項２から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記固体支持体がポリマーマトリックスを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記固体支持体が、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズである、請求項２から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記インジケータが、前記キナーゼを安定化する薬剤をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記安定化剤が、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記支持体を表面に取り付ける手段をさらに含む、請求項２から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって前記支持体を表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部を備える、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして前記処理が、該因子の感染活性を減少させるためである、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１４】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１５】
前記処理プロセスが、高温、高ｐＨ、高圧、プロテアーゼへの曝露、界面活性剤への曝露、化学滅菌処理、または気相滅菌処理の１つ以上を含む、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１６】
前記処理プロセスが、少なくとも６０℃の温度でかつ少なくとも９のｐＨで、熱安定性プロテアーゼに前記試料を曝露する工程を含む、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１７】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１８】
キナーゼを含む、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１９】
さらに固体支持体を含み、前記キナーゼが該固体支持体中に固定化されているか、または該固体支持体上に固定化されている、請求項１８に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２０】
前記キナーゼが熱安定性である、請求項１８または１９に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２１】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項１８から２０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２２】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１８から２１のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２３】
前記キナーゼが、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒する、請求項１８から２２のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２４】
前記固体支持体がマトリックスであり、そして前記キナーゼが該マトリックス内に分散されている、請求項１９から２３のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２５】
前記支持体がポリマーマトリックスを含む、請求項２４に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２６】
前記支持体が、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズである、請求項１９から２５のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２７】
前記キナーゼを安定化する薬剤をさらに含む、請求項１８から２４のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２８】
前記安定化剤が、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される、請求項２７に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２９】
前記インジケータを表面に取り付ける手段をさらに含む、請求項１８から２８のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３０】
ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって前記インジケータを表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部を備える、請求項２９に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３１】
試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証することに用いられるキットであって、
（ｉ）請求項１８から３０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ、および
（iii）キナーゼに対する基質
を備える、キット。
【請求項３２】
ＡＴＰを検出する手段をさらに備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼをさらに備える、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ルミノメーターをさらに備える、請求項３１から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
前記インジケータのキナーゼ活性と前記生物学的因子の量または活性の減少との相関を示す照合表をさらに備える、請求項３１から３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
ＴＳＥ不活性化をモニタリングするための、請求項３１から３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
請求項３１から３６のいずれかに記載の携帯用キット。
【請求項３８】
処理プロセスを検証する方法であって、
（ii）生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
（ii）該試料を、規定量のキナーゼの存在下で処理に供する工程であって、該処理が、該生物学的因子の量または活性を減少させる、工程；
（iii）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
（iv）該残余活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、または該キナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、該所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ処理条件下での該生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記試料が、前記生物学的因子を含むことが分かっている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして該処理が、該生物学的因子の感染活性を減少させる、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記キナーゼが熱安定性キナーゼである、請求項３８から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項３８から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項３８から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記処理が、高温、高ｐＨ、高圧、プロテアーゼへの曝露、界面活性剤または化学滅菌剤への曝露の１つ以上を含む、請求項３８から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記処理が、前記試料を熱安定性プロテアーゼに５０〜１２０℃の範囲の温度で曝露する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記処理が、前記試料を前記プロテアーゼに６０℃以上の温度で曝露する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料を前記プロテアーゼに９以上のｐＨで曝露する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも10,000,000相対発光量の活性を有する、請求項３８から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも5,000,000相対発光量の活性を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも1,000,000相対発光量の活性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも500,000相対発光量の活性を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり10,000相対発光量未満である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり1000相対発光量未満である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり100相対発光量未満である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり10相対発光量未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、６対数減少以上である、請求項３８から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、７対数減少以上である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、８対数減少以上である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも６対数減少に相当する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも７対数減少に相当する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも８対数減少に相当する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも900,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項３８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも990,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,900ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,990ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも６対数減少である、請求項３８から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも７対数減少である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも８対数減少である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料を処理する前および前記試料を処理した後にキナーゼ活性を測定する工程を含む、請求項３８から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記キナーゼの残余活性を測定する前に、前記試料を少なくとも１０分間８０℃で処理する工程を含む、請求項３８から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記キナーゼの残余活性を測定する工程が、前記残余キナーゼにＡＤＰを含む基質を添加する工程、およびＡＴＰの形成を測定する工程を含む、請求項３８から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも６対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項３８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも７対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも８対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
試料中の生物学的因子の量または活性の減少と、請求項１８から３０のいずれかに記載のインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法であって、
（ｉ）規定量の該生物学的因子を含有する試料および規定量の該キナーゼを含有する試料を調製する工程；
（ii）該試料を処理に供する工程；
（vi）該キナーゼの残余活性を測定し、必要に応じてキナーゼ活性の減少を算定する工程；
（vii）該生物学的因子の残余量または残余活性を測定し、必要に応じて該生物学的因子の量または活性の減少を算定する工程；
（viii）該処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（ｖ）を繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項７８】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして前記処理が、該因子の感染活性を減少させる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記処理パラメーターが、時間、温度、ｐＨ、圧力、プロテアーゼ濃度、および滅菌剤または界面活性剤の濃度の１つ以上を含む、請求項７７から７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記処理が、５０〜１４０℃、好ましくは１３４〜１３８℃の間の温度で前記試料を加熱する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記処理が、９〜１４のｐＨ、好ましくは約ｐＨ１２に前記試料を曝露する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記処理が、0.5〜２mg/ml、好ましくは１mg/mlの濃度のプロテアーゼに前記試料を曝露する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８２のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するためのインジケータとしてのキナーゼの使用。
【請求項２】
キナーゼが固体支持体中に固定化されているか、または固体支持体上に固定化されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記キナーゼが熱安定性である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記キナーゼが、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒する、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記固体支持体がマトリックスであり、そして前記キナーゼが該マトリックス内に分散されている、請求項２から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記固体支持体がポリマーマトリックスを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記固体支持体が、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズである、請求項２から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記インジケータが、前記キナーゼを安定化する薬剤をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記安定化剤が、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記支持体を表面に取り付ける手段をさらに含む、請求項２から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって前記支持体を表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部を備える、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして前記処理が、該因子の感染活性を減少させるためである、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１４】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１５】
前記処理プロセスが、高温、高ｐＨ、高圧、プロテアーゼへの曝露、界面活性剤への曝露、化学滅菌処理、または気相滅菌処理の１つ以上を含む、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１６】
前記処理プロセスが、少なくとも６０℃の温度でかつ少なくとも９のｐＨで、熱安定性プロテアーゼに前記試料を曝露する工程を含む、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１７】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、前記いずれかの請求項に記載の使用。
【請求項１８】
キナーゼを含む、試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１９】
さらに固体支持体を含み、前記キナーゼが該固体支持体中に固定化されているか、または該固体支持体上に固定化されている、請求項１８に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２０】
前記キナーゼが熱安定性である、請求項１８または１９に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２１】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項１８から２０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２２】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項１８から２１のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２３】
前記キナーゼが、ＡＤＰを含む基質からのＡＴＰの形成を触媒する、請求項１８から２２のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２４】
前記固体支持体がマトリックスであり、そして前記キナーゼが該マトリックス内に分散されている、請求項１９から２３のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２５】
前記支持体がポリマーマトリックスを含む、請求項２４に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２６】
前記支持体が、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズである、請求項１９から２５のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２７】
前記キナーゼを安定化する薬剤をさらに含む、請求項１８から２４のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２８】
前記安定化剤が、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される、請求項２７に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２９】
前記インジケータを表面に取り付ける手段をさらに含む、請求項１８から２８のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３０】
ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって前記インジケータを表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部を備える、請求項２９に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３１】
試料中の生物学的因子の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証することに用いられるキットであって、
（ｉ）請求項１８から３０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ、および
（iii）キナーゼに対する基質
を備える、キット。
【請求項３２】
ＡＴＰを検出する手段をさらに備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼをさらに備える、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ルミノメーターをさらに備える、請求項３１から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
前記インジケータのキナーゼ活性と前記生物学的因子の量または活性の減少との相関を示す照合表をさらに備える、請求項３１から３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
ＴＳＥ不活性化をモニタリングするための、請求項３１から３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
請求項３１から３６のいずれかに記載の携帯用キット。
【請求項３８】
処理プロセスを検証する方法であって、
（ii）生物学的因子を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
（ii）該試料を、規定量のキナーゼの存在下で処理に供する工程であって、該処理が、該生物学的因子の量または活性を減少させる、工程；
（iii）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
（iv）該残余活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、または該キナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、該所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ処理条件下での該生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記試料が、前記生物学的因子を含むことが分かっている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして該処理が、該生物学的因子の感染活性を減少させる、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記キナーゼが熱安定性キナーゼである、請求項３８から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼ、またはピルビン酸キナーゼである、請求項３８から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記キナーゼが、配列番号１〜２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号２６〜３０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、請求項３８から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記処理が、高温、高ｐＨ、高圧、プロテアーゼへの曝露、界面活性剤または化学滅菌剤への曝露の１つ以上を含む、請求項３８から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記処理が、前記試料を熱安定性プロテアーゼに５０〜１２０℃の範囲の温度で曝露する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記処理が、前記試料を前記プロテアーゼに６０℃以上の温度で曝露する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料を前記プロテアーゼに９以上のｐＨで曝露する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも10,000,000相対発光量の活性を有する、請求項３８から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも5,000,000相対発光量の活性を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも1,000,000相対発光量の活性を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記キナーゼが、前記処理の前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも500,000相対発光量の活性を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり10,000相対発光量未満である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり1000相対発光量未満である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり100相対発光量未満である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記所定のキナーゼ活性が、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に１ｍｇキナーゼ当たり10相対発光量未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、６対数減少以上である、請求項３８から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、７対数減少以上である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、８対数減少以上である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも６対数減少に相当する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも７対数減少に相当する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、キナーゼの量または濃度の少なくとも８対数減少に相当する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも900,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項３８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも990,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,000ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,900ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも999,990ＲＬＵの相対発光量の減少に相当する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも６対数減少である、請求項３８から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも７対数減少である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記生物学的因子の量または活性の確認された減少が、少なくとも８対数減少である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記試料を処理する前および前記試料を処理した後にキナーゼ活性を測定する工程を含む、請求項３８から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記キナーゼの残余活性を測定する前に、前記試料を少なくとも１０分間８０℃で処理する工程を含む、請求項３８から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記キナーゼの残余活性を測定する工程が、前記残余キナーゼにＡＤＰを含む基質を添加する工程、およびＡＴＰの形成を測定する工程を含む、請求項３８から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも６対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項３８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも７対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも８対数の前記生物学的因子の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
試料中の生物学的因子の量または活性の減少と、請求項１８から３０のいずれかに記載のインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法であって、
（ｉ）規定量の該生物学的因子を含有する試料および規定量の該キナーゼを含有する試料を調製する工程；
（ii）該試料を処理に供する工程；
（vi）該キナーゼの残余活性を測定し、必要に応じてキナーゼ活性の減少を算定する工程；
（vii）該生物学的因子の残余量または残余活性を測定し、必要に応じて該生物学的因子の量または活性の減少を算定する工程；
（viii）該処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（ｖ）を繰り返す工程
を含む、方法。
【請求項７８】
前記生物学的因子が感染性生物学的因子であり、そして前記処理が、該因子の感染活性を減少させる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記生物学的因子が伝染性海綿状脳症である、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記処理パラメーターが、時間、温度、ｐＨ、圧力、プロテアーゼ濃度、および滅菌剤または界面活性剤の濃度の１つ以上を含む、請求項７７から７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記処理が、５０〜１４０℃、好ましくは１３４〜１３８℃の間の温度で前記試料を加熱する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記処理が、９〜１４のｐＨ、好ましくは約ｐＨ１２に前記試料を曝露する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記処理が、0.5〜２mg/ml、好ましくは１mg/mlの濃度のプロテアーゼに前記試料を曝露する工程を包含し；
前記処理パラメーターが時間であり；
そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される、
請求項７７から８２のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５３００２５（Ｐ２００７−５３００２５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４４６１（Ｐ２００７−５０４４６１）
【出願日】平成１７年３月２２日（２００５．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３０８５
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２２日（２００５．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１０５６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３０８５
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０３１９１２１０）ヘルス プロテクション エージェンシー (19)
【Ｆターム（参考）】
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