異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤
【課題】 異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供すること。
【解決手段】 本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。
【解決手段】 本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性を有する異常型プリオンタンパク質が脳内に感染すると、増殖して蓄積することにより脳機能を破壊し、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD; Creutzfeldt Jakob Disease）やゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（GSS; Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome）、牛の狂牛病（BSE; Bovine Spongiform Encephalopathy）などのプリオン病を発症させることはよく知られた事実である。従って、脳内における異常型プリオンタンパク質の形成を抑制することができれば、その増殖・蓄積を阻害することによってプリオン病の発症や症状の進展を防ぐことができることから、異常型プリオンタンパク質の形成抑制方法の探索が精力的に行われており、例えば、特許文献１には、ロイシンなどの分岐鎖を有する必須アミノ酸やトレハロースが、異常型プリオンタンパク質の形成抑制に効果があることが記載されている。
【特許文献１】特開２００４−２９２４３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、異常型プリオンタンパク質の形成に対して優れた抑制効果を有するとともに安全な薬剤の探求は意義深いことである。
そこで本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが細胞レベルでの異常型プリオンタンパク質の形成抑制に有効であることを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、請求項１記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載の形成抑制剤は、請求項１記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする。
また、請求項３記載の形成抑制剤は、請求項１または２記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項４記載の形成抑制剤は、請求項１または２記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項５記載の形成抑制剤は、請求項１記載の形成抑制剤において、発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において、発酵茶とは、茶葉の発酵を進行させてなる茶を意味し、その具体例としては、半発酵茶であるウーロン茶や発酵茶である紅茶などが挙げられる。また、本発明において、高分子ポリフェノールとは、分子内にフェノール性水酸基を複数個有する化合物、例えば、フラボノイド系ポリフェノールであるカテキン類が高度に重合したもの（例えば数平均分子量が５０００〜３００００）を意味する。カテキン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール系水酸基を複数個有するフラバン−３−オール骨格を持つ化合物群であり、特に、茶の葉に多く含まれることは当業者によく知られた事実である。カテキンの化学構造は下記に示す通りである。カテキンには様々な誘導体が存在する（例えばカテキンの５’位の水素が水酸基に置換されたものがガロカテキンであり、さらに３位の水酸基が没食子酸とエステル結合したものがガロカテキンガレートである）。本発明において、カテキン類とは、カテキンおよびその誘導体を意味し、その具体例としては、カテキン、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレートなどが挙げられる。
【０００８】
【化１】
【０００９】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、発酵茶の製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合することで生成すると考えられるものであり、その取得方法としては、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分（水、沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出することで溶出する成分）を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法や、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法などが挙げられる。なお、溶媒に含水アセトンを用いた分画精製は、例えば東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆを用いたクロマトグラフィーにより行うことができる。
また、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、水や、メタノールやエタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いた抽出操作によって得られる発酵茶葉抽出物を合成吸着剤（例えば芳香族系合成吸着剤である三菱化学株式会社のダイヤイオンＨＰ２０など）に吸着させ、吸着剤を３０％メタノール溶液などで洗浄した後、７０％メタノール溶液などで吸着成分を溶出し、溶出成分から酢酸エチル溶出成分を除去した後、酢酸エチル非溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いてクロマトグラフィーにより分画精製する方法などによっても取得することができる。
【００１０】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールの具体例としては、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であるものが挙げられる。プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１１】
【化２】
【００１２】
本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを自体公知の方法によって顆粒剤や錠剤やカプセル剤などの経口製剤に製剤化したり、注射剤などの非経口製剤に製剤化したりしてヒトを含む哺乳動物に投与することで、異常型プリオンタンパク質の形成を抑制し、プリオン病の発症や症状の進展を効果的に防ぐ。その投与量は、適用対象の年齢、性別、体重、体調、症状の程度などによって適宜決定することができる。また、本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを種々の形態の食品（サプリメントを含む）にプリオン病の発症や症状の進展に効果をもたらすに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
（Ａ）ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノールの調製
沸騰水１０００ｍＬにウーロン茶葉３０ｇを加え、約１分間沸騰後、１０分間静置した。その後、ウーロン茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、ウーロン茶葉１２０ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。
次に、水溶出成分から低分子ポリフェノールを除去するために酢酸エチル抽出した。具体的には、水溶液５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和酢酸エチルを加え、攪拌し、静置した後、酢酸エチル相を分取する操作を１０回繰り返し、酢酸エチル非溶出成分を含む水相を得た。
次に、酢酸エチル非溶出成分を含む水相をブタノール抽出した。具体的には、水相を減圧濃縮することで残存する酢酸エチルを除去した後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を１０回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり４．５ｇの収量で得た。
【００１５】
次に、以上の方法で得られたウーロン茶ブタノール抽出中性画分を、クロマトグラフィーを行ってさらに細かく分画した。固定相にはトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）を用い、移動相には含水アセトンを用いた。
まず、直径２．４ｃｍ×長さ３５ｃｍのカラムにトヨパールＨＷ−４０Ｆを充填した。また、移動相として２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液をそれぞれ６００ｍＬ準備した。
次に、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分０．３ｇを２０％アセトン溶液３ｍＬに溶解し、得られた溶液をカラムにアプライした。２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液を用いて固定相に吸着した成分を２０〜５０％の直線的濃度勾配をかけて０．３ｇ／分の速度で順次溶出させ、フラクションコレクターを用いて溶出液を５ｇずつ試験管に分取した。
次に、各試験管に分取した溶出液の３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成した。作成した溶出曲線に基づいてウーロン茶ブタノール抽出中性画分をさらに細かく分画し、同じ画分に属する溶出液を集めた後、減圧濃縮することでアセトンを除去し、凍結乾燥し、１５個の画分サンプルを得た。
図１にウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図１にあわせて示す。
【００１６】
（Ｂ）画分（１５）の平均分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって画分（１５）の平均分子量の測定を行った。高速クロマトグラフ装置としてＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を用い、カラムにはＴＳＫ−ＧＥＬα−３０００（カラム寸法：直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ，東ソー株式会社製）を用いた。カラム温度は４０℃とした。展開溶媒には塩化リチウム１０ｍＭを含有したジメチルホルムアミドを用いた。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。検出器にはＬＣ−１０Ａシステムに含まれるＵＶ検出器を用いた。検出波長は２７５ｎｍに設定した。
まず、カラムに分子量標準化合物としてＴＳＫ標準ポリスチレン（東ソー株式会社製）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、溶出曲線を作成し、これに基づいて較正曲線を作成した。
次に、カラムにジメチルホルムアミドに溶解した画分（１５）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線に基づいて平均分子量を算出したところ、数平均分子量は１．５２×１０４、重量平均分子量は２．１０×１０４であった。
【００１７】
（Ｃ）画分（１５）の構造解析
熱分解−ガスクロマトグラフ−マススペクトル（Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ）分析装置を用いて画分（１５）の構造解析を行った。Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ分析装置によれば、サンプルを熱分解装置（Ｐｙ）で熱分解した後、得られた熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置（ＧＣ）に導入して分別し、さらに分別した物質をマススペクトル装置（ＭＳ）で解析することにより、サンプルの熱的性質や化学構造に関する知見を得ることができる。
最初に、熱分解装置（Ｐｙ）としてキューリーポイント熱分解装置ＪＨＰ−５（日本分析工業株式会社製）を用いて画分（１５）の熱分解を行った。まず、炉内とガスクロマトグラフ導入部の温度を２５０℃にした。次に、フェロマグネティック−パイロホイル（厚さ５０μｍ）で０．１〜０．２ｍｇの画分（１５）を包み、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液５μＬを加え、炉内に入れて３１５℃で４秒間処理することで熱分解を行った後、熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置に導いた。なお、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液は、画分（１５）に含まれる化学構造をメチル化することにより質量分析の段階で揮発性や熱安定性が得られるようにする目的で用いた。
ガスクロマトグラフ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）にはガスクロマトグラフ質量分析装置ＪＭＳ−６００Ｍ（日本電子株式会社製）を用いた。また、データ処理装置としてＴＳＳ−２０００（日本分析工業株式会社製）を用いた。ガスクロマトグラフ用カラムにはキャピラリーカラムＨＰ−１ＭＳ（カラム寸法：直径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，コーティングした液層の厚さ：０．２５μｍ，アジレント・テクノロジー製）を用いた。画分（１５）の熱分解生成物とキャリアガスをカラム内に導入し、熱分解生成物中に存在する物質を分離するとともに、保持時間に関するデータを取得した。また、分離した各物質について質量分析を行い、化学構造などに関する知見を得た。なお、カラム内の温度は最初５０℃で１分間保持し、次に５℃／分で３００℃まで直線的に昇温させ、その後３００℃で１４分間保持した。キャリアガスにはヘリウムを用いた。流速は１ｍＬ／分に設定した。質量分析はイオン源温度２５０℃，イオン化電圧７０ｅＶの条件で行った。
ガスクロマトグラフ−マススペクトルにより得られたデータと、合成標準物質について同様の実験を行うことで得られたデータを比較した結果、画分（１５）の熱分解生成物から以下に化学式を示す１０種類の化合物が検出された。
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
なお、上記の化合物の保持時間（ｔＲ：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と分子量は次の通りである。
化合物１・・・ｔＲ：２３．０分，分子量：１６８
化合物２・・・ｔＲ：２２．１分，分子量：１６６
化合物３・・・ｔＲ：３０．３分，分子量：１９６
化合物４・・・ｔＲ：３０．５分，分子量：２２６
化合物５・・・ｔＲ：３１．１分，分子量：２５４
化合物６・・・ｔＲ：３２．４分，分子量：２５４
化合物７・・・ｔＲ：３２．９分，分子量：２５４
化合物８・・・ｔＲ：３５．２分，分子量：２８４
化合物９・・・ｔＲ：３６．９分，分子量：３１２
化合物１０・・ｔＲ：４６．５分，分子量：４５０
【００２２】
以上の結果から、画分（１５）は、上記の１０種類の熱分解生成物を与える化学構造を有する物質であることがわかった。質量分析の結果からは、この物質がカテキン類の２’位，５’位，６’位と他のカテキン類のいずれかの位置の間、例えば、カテキン類同士の８位と６’位の間，６位と６’位の間，６’位と６’位の間などに重合部位を有することが示唆された。また、別途に行った画分（１５）のタンナーゼ分解の結果からは、この物質にはエピカテキンやエピガロカテキンの３位の水酸基にエステル結合していると考えられる没食子酸残基が含まれることが示された。塩酸−ブタノール分解の結果からは、この物質は部分構造中にカテキン類同士の４位と８位の間または４位と６位の間で重合したプロシアニジン構造を含むことが推測された。以上の結果を総合的に判断すると、画分（１５）は、例えば、以下に示す、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでいる高分子ポリフェノールであることがわかった（なお、この高分子ポリフェノールに含まれる部分構造の種類は多種多様であると考えられ、以上の結果はベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造の存在を否定するものではない）。
【００２３】
【化６】
【００２４】
（Ｄ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
（実験方法）
異常型プリオンタンパク質形成の試験管内測定法（M.R.SCOTT, R.KOHLER, D.FOSTER and S.B.PRUSINER; Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice; Protein Sci. 1992, 1: 986-997）に従って、異常型プリオンタンパク質を保持する細胞培養株の１つであるＳｃＮ２ａ細胞（マウス神経芽細胞株）に、ＭＨＭ２配列（ヒトプリオンタンパク質のアミノ酸配列の一部を挿入したマウスプリオンタンパク質のアミノ酸配列）を標識として持つＭＨＭ２−プリオン遺伝子を導入して正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質を発現させ、４日間の培養によって発現した正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質が異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質に変換される過程に対する阻止作用でもって、画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を評価した。異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質であるか否かは、プロテイナーゼＫ処理に対して耐性獲得を有するか否かで評価した。具体的には、画分（１５）の高分子ポリフェノールを所定の濃度で添加または非添加の条件で４日間培養したＭＨＭ２−プリオンタンパク質発現ＳｃＮ２ａ細胞（１×１０７細胞）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む細胞溶解液で溶解した後、遠心してその上清に１μｇ／ｍＬになるようにプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、３７℃で１時間処理した。次いで、プロテイナーゼＫ処理に耐性の分子・微細構造を超遠心により回収し、ＳＤＳゲル電気泳動にかけた。ＭＨＭ２−プリオンタンパク質に対するモノクローナル抗体（３Ｆ４、Ｓｉｇｎｅｔ社製）を用いたウエスタンブロット法により、１５−３０ｋＤａに分布する３種類のプロテイナーゼＫ耐性ペプチドの存在の有無をもって異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質形成の指標とし、実験を行った。
【００２５】
（実験結果）
結果を図２に示す。ＡはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）処理前のウエスタンブロットの結果であり、ＢはプロテイナーゼＫ処理後のウエスタンブロットの結果である。図２から明らかなように、画分（１５）の高分子ポリフェノールを添加せずに４日間の培養を行った場合（コントロール）、プロテイナーゼＫ処理後において異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質の指標である２６，２１，１７ｋＤａのペプチドが存在したが、画分（１５）の高分子ポリフェノールを５０μｇ／ｍＬまたは１２μｇ／ｍＬの濃度で添加して４日間の培養を行った場合、プロテイナーゼＫ処理後においてこれらのペプチドは存在しなかった。この結果は、画分（１５）の高分子ポリフェノールが、正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質の異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質への変換を阻止したことにより、正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質がプロテイナーゼＫによって分解されたことを意味する。従って、画分（１５）の高分子ポリフェノールは、異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を有することがわかった。
【００２６】
実施例２：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
実施例１の（Ａ）でブタノール溶出成分を含む抽出液を得た後に残った水相を塩酸でｐＨを約３にした後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を５回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり３．２ｇの収量で得た。このウーロン茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１５個の画分サンプルを得た。図３にウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図３にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１４）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．７３×１０４、重量平均分子量は２．４４×１０４であった。この画分（１４）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２７】
実施例３：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
沸騰水５００ｍＬに紅茶葉２５ｇを加え、１０分間穏やかに沸騰後、直ちにブフナーロートとで紅茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、紅茶葉１００ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。以降の操作を実施例１の（Ａ）と同様にして紅茶ブタノール抽出中性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．５ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出中性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１６個の画分サンプルを得た。図４に紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を図４にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１５）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．３６×１０４、重量平均分子量は１．８９×１０４であった。この画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２８】
実施例４：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
実施例２と同様にして紅茶ブタノール抽出酸性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．９ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１１個の画分サンプルを得た。図５に紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を図５にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１１）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は９．４３×１０３、重量平均分子量は１．４８×１０４であった。この画分（１１）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２９】
製剤例１：錠剤
実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末５ｇ、乳糖７８ｇ、ステアリン酸マグネシウム１７ｇ、合計１００ｇを均一に混合し、常法に従って錠剤とした。
【００３０】
製剤例２：ビスケット
薄力粉３１ｇ、全卵１６ｇ、バター１６ｇ、砂糖２４ｇ、水１０ｇ、ベーキングパウダー１ｇ、実施例３の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末２ｇ、合計１００ｇを用い、常法に従ってビスケットとした。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１におけるウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図２】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を示すウエスタンブロットの結果である。
【図３】実施例２におけるウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図４】実施例３における紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を示すグラフである。
【図５】実施例４における紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性を有する異常型プリオンタンパク質が脳内に感染すると、増殖して蓄積することにより脳機能を破壊し、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（CJD; Creutzfeldt Jakob Disease）やゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（GSS; Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome）、牛の狂牛病（BSE; Bovine Spongiform Encephalopathy）などのプリオン病を発症させることはよく知られた事実である。従って、脳内における異常型プリオンタンパク質の形成を抑制することができれば、その増殖・蓄積を阻害することによってプリオン病の発症や症状の進展を防ぐことができることから、異常型プリオンタンパク質の形成抑制方法の探索が精力的に行われており、例えば、特許文献１には、ロイシンなどの分岐鎖を有する必須アミノ酸やトレハロースが、異常型プリオンタンパク質の形成抑制に効果があることが記載されている。
【特許文献１】特開２００４−２９２４３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、異常型プリオンタンパク質の形成に対して優れた抑制効果を有するとともに安全な薬剤の探求は意義深いことである。
そこで本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが細胞レベルでの異常型プリオンタンパク質の形成抑制に有効であることを見出した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、請求項１記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載の形成抑制剤は、請求項１記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする。
また、請求項３記載の形成抑制剤は、請求項１または２記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項４記載の形成抑制剤は、請求項１または２記載の形成抑制剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項５記載の形成抑制剤は、請求項１記載の形成抑制剤において、発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において、発酵茶とは、茶葉の発酵を進行させてなる茶を意味し、その具体例としては、半発酵茶であるウーロン茶や発酵茶である紅茶などが挙げられる。また、本発明において、高分子ポリフェノールとは、分子内にフェノール性水酸基を複数個有する化合物、例えば、フラボノイド系ポリフェノールであるカテキン類が高度に重合したもの（例えば数平均分子量が５０００〜３００００）を意味する。カテキン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール系水酸基を複数個有するフラバン−３−オール骨格を持つ化合物群であり、特に、茶の葉に多く含まれることは当業者によく知られた事実である。カテキンの化学構造は下記に示す通りである。カテキンには様々な誘導体が存在する（例えばカテキンの５’位の水素が水酸基に置換されたものがガロカテキンであり、さらに３位の水酸基が没食子酸とエステル結合したものがガロカテキンガレートである）。本発明において、カテキン類とは、カテキンおよびその誘導体を意味し、その具体例としては、カテキン、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレートなどが挙げられる。
【０００８】
【化１】
【０００９】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、発酵茶の製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合することで生成すると考えられるものであり、その取得方法としては、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分（水、沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出することで溶出する成分）を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法や、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法などが挙げられる。なお、溶媒に含水アセトンを用いた分画精製は、例えば東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆを用いたクロマトグラフィーにより行うことができる。
また、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、水や、メタノールやエタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いた抽出操作によって得られる発酵茶葉抽出物を合成吸着剤（例えば芳香族系合成吸着剤である三菱化学株式会社のダイヤイオンＨＰ２０など）に吸着させ、吸着剤を３０％メタノール溶液などで洗浄した後、７０％メタノール溶液などで吸着成分を溶出し、溶出成分から酢酸エチル溶出成分を除去した後、酢酸エチル非溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いてクロマトグラフィーにより分画精製する方法などによっても取得することができる。
【００１０】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールの具体例としては、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であるものが挙げられる。プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１１】
【化２】
【００１２】
本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを自体公知の方法によって顆粒剤や錠剤やカプセル剤などの経口製剤に製剤化したり、注射剤などの非経口製剤に製剤化したりしてヒトを含む哺乳動物に投与することで、異常型プリオンタンパク質の形成を抑制し、プリオン病の発症や症状の進展を効果的に防ぐ。その投与量は、適用対象の年齢、性別、体重、体調、症状の程度などによって適宜決定することができる。また、本発明の異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを種々の形態の食品（サプリメントを含む）にプリオン病の発症や症状の進展に効果をもたらすに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
（Ａ）ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノールの調製
沸騰水１０００ｍＬにウーロン茶葉３０ｇを加え、約１分間沸騰後、１０分間静置した。その後、ウーロン茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、ウーロン茶葉１２０ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。
次に、水溶出成分から低分子ポリフェノールを除去するために酢酸エチル抽出した。具体的には、水溶液５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和酢酸エチルを加え、攪拌し、静置した後、酢酸エチル相を分取する操作を１０回繰り返し、酢酸エチル非溶出成分を含む水相を得た。
次に、酢酸エチル非溶出成分を含む水相をブタノール抽出した。具体的には、水相を減圧濃縮することで残存する酢酸エチルを除去した後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を１０回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり４．５ｇの収量で得た。
【００１５】
次に、以上の方法で得られたウーロン茶ブタノール抽出中性画分を、クロマトグラフィーを行ってさらに細かく分画した。固定相にはトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）を用い、移動相には含水アセトンを用いた。
まず、直径２．４ｃｍ×長さ３５ｃｍのカラムにトヨパールＨＷ−４０Ｆを充填した。また、移動相として２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液をそれぞれ６００ｍＬ準備した。
次に、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分０．３ｇを２０％アセトン溶液３ｍＬに溶解し、得られた溶液をカラムにアプライした。２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液を用いて固定相に吸着した成分を２０〜５０％の直線的濃度勾配をかけて０．３ｇ／分の速度で順次溶出させ、フラクションコレクターを用いて溶出液を５ｇずつ試験管に分取した。
次に、各試験管に分取した溶出液の３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成した。作成した溶出曲線に基づいてウーロン茶ブタノール抽出中性画分をさらに細かく分画し、同じ画分に属する溶出液を集めた後、減圧濃縮することでアセトンを除去し、凍結乾燥し、１５個の画分サンプルを得た。
図１にウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図１にあわせて示す。
【００１６】
（Ｂ）画分（１５）の平均分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって画分（１５）の平均分子量の測定を行った。高速クロマトグラフ装置としてＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を用い、カラムにはＴＳＫ−ＧＥＬα−３０００（カラム寸法：直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ，東ソー株式会社製）を用いた。カラム温度は４０℃とした。展開溶媒には塩化リチウム１０ｍＭを含有したジメチルホルムアミドを用いた。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。検出器にはＬＣ−１０Ａシステムに含まれるＵＶ検出器を用いた。検出波長は２７５ｎｍに設定した。
まず、カラムに分子量標準化合物としてＴＳＫ標準ポリスチレン（東ソー株式会社製）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、溶出曲線を作成し、これに基づいて較正曲線を作成した。
次に、カラムにジメチルホルムアミドに溶解した画分（１５）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線に基づいて平均分子量を算出したところ、数平均分子量は１．５２×１０４、重量平均分子量は２．１０×１０４であった。
【００１７】
（Ｃ）画分（１５）の構造解析
熱分解−ガスクロマトグラフ−マススペクトル（Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ）分析装置を用いて画分（１５）の構造解析を行った。Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ分析装置によれば、サンプルを熱分解装置（Ｐｙ）で熱分解した後、得られた熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置（ＧＣ）に導入して分別し、さらに分別した物質をマススペクトル装置（ＭＳ）で解析することにより、サンプルの熱的性質や化学構造に関する知見を得ることができる。
最初に、熱分解装置（Ｐｙ）としてキューリーポイント熱分解装置ＪＨＰ−５（日本分析工業株式会社製）を用いて画分（１５）の熱分解を行った。まず、炉内とガスクロマトグラフ導入部の温度を２５０℃にした。次に、フェロマグネティック−パイロホイル（厚さ５０μｍ）で０．１〜０．２ｍｇの画分（１５）を包み、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液５μＬを加え、炉内に入れて３１５℃で４秒間処理することで熱分解を行った後、熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置に導いた。なお、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液は、画分（１５）に含まれる化学構造をメチル化することにより質量分析の段階で揮発性や熱安定性が得られるようにする目的で用いた。
ガスクロマトグラフ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）にはガスクロマトグラフ質量分析装置ＪＭＳ−６００Ｍ（日本電子株式会社製）を用いた。また、データ処理装置としてＴＳＳ−２０００（日本分析工業株式会社製）を用いた。ガスクロマトグラフ用カラムにはキャピラリーカラムＨＰ−１ＭＳ（カラム寸法：直径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，コーティングした液層の厚さ：０．２５μｍ，アジレント・テクノロジー製）を用いた。画分（１５）の熱分解生成物とキャリアガスをカラム内に導入し、熱分解生成物中に存在する物質を分離するとともに、保持時間に関するデータを取得した。また、分離した各物質について質量分析を行い、化学構造などに関する知見を得た。なお、カラム内の温度は最初５０℃で１分間保持し、次に５℃／分で３００℃まで直線的に昇温させ、その後３００℃で１４分間保持した。キャリアガスにはヘリウムを用いた。流速は１ｍＬ／分に設定した。質量分析はイオン源温度２５０℃，イオン化電圧７０ｅＶの条件で行った。
ガスクロマトグラフ−マススペクトルにより得られたデータと、合成標準物質について同様の実験を行うことで得られたデータを比較した結果、画分（１５）の熱分解生成物から以下に化学式を示す１０種類の化合物が検出された。
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
なお、上記の化合物の保持時間（ｔＲ：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と分子量は次の通りである。
化合物１・・・ｔＲ：２３．０分，分子量：１６８
化合物２・・・ｔＲ：２２．１分，分子量：１６６
化合物３・・・ｔＲ：３０．３分，分子量：１９６
化合物４・・・ｔＲ：３０．５分，分子量：２２６
化合物５・・・ｔＲ：３１．１分，分子量：２５４
化合物６・・・ｔＲ：３２．４分，分子量：２５４
化合物７・・・ｔＲ：３２．９分，分子量：２５４
化合物８・・・ｔＲ：３５．２分，分子量：２８４
化合物９・・・ｔＲ：３６．９分，分子量：３１２
化合物１０・・ｔＲ：４６．５分，分子量：４５０
【００２２】
以上の結果から、画分（１５）は、上記の１０種類の熱分解生成物を与える化学構造を有する物質であることがわかった。質量分析の結果からは、この物質がカテキン類の２’位，５’位，６’位と他のカテキン類のいずれかの位置の間、例えば、カテキン類同士の８位と６’位の間，６位と６’位の間，６’位と６’位の間などに重合部位を有することが示唆された。また、別途に行った画分（１５）のタンナーゼ分解の結果からは、この物質にはエピカテキンやエピガロカテキンの３位の水酸基にエステル結合していると考えられる没食子酸残基が含まれることが示された。塩酸−ブタノール分解の結果からは、この物質は部分構造中にカテキン類同士の４位と８位の間または４位と６位の間で重合したプロシアニジン構造を含むことが推測された。以上の結果を総合的に判断すると、画分（１５）は、例えば、以下に示す、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでいる高分子ポリフェノールであることがわかった（なお、この高分子ポリフェノールに含まれる部分構造の種類は多種多様であると考えられ、以上の結果はベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造の存在を否定するものではない）。
【００２３】
【化６】
【００２４】
（Ｄ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
（実験方法）
異常型プリオンタンパク質形成の試験管内測定法（M.R.SCOTT, R.KOHLER, D.FOSTER and S.B.PRUSINER; Chimeric prion protein expression in cultured cells and transgenic mice; Protein Sci. 1992, 1: 986-997）に従って、異常型プリオンタンパク質を保持する細胞培養株の１つであるＳｃＮ２ａ細胞（マウス神経芽細胞株）に、ＭＨＭ２配列（ヒトプリオンタンパク質のアミノ酸配列の一部を挿入したマウスプリオンタンパク質のアミノ酸配列）を標識として持つＭＨＭ２−プリオン遺伝子を導入して正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質を発現させ、４日間の培養によって発現した正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質が異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質に変換される過程に対する阻止作用でもって、画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を評価した。異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質であるか否かは、プロテイナーゼＫ処理に対して耐性獲得を有するか否かで評価した。具体的には、画分（１５）の高分子ポリフェノールを所定の濃度で添加または非添加の条件で４日間培養したＭＨＭ２−プリオンタンパク質発現ＳｃＮ２ａ細胞（１×１０７細胞）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む細胞溶解液で溶解した後、遠心してその上清に１μｇ／ｍＬになるようにプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、３７℃で１時間処理した。次いで、プロテイナーゼＫ処理に耐性の分子・微細構造を超遠心により回収し、ＳＤＳゲル電気泳動にかけた。ＭＨＭ２−プリオンタンパク質に対するモノクローナル抗体（３Ｆ４、Ｓｉｇｎｅｔ社製）を用いたウエスタンブロット法により、１５−３０ｋＤａに分布する３種類のプロテイナーゼＫ耐性ペプチドの存在の有無をもって異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質形成の指標とし、実験を行った。
【００２５】
（実験結果）
結果を図２に示す。ＡはプロテイナーゼＫ（ＰＫ）処理前のウエスタンブロットの結果であり、ＢはプロテイナーゼＫ処理後のウエスタンブロットの結果である。図２から明らかなように、画分（１５）の高分子ポリフェノールを添加せずに４日間の培養を行った場合（コントロール）、プロテイナーゼＫ処理後において異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質の指標である２６，２１，１７ｋＤａのペプチドが存在したが、画分（１５）の高分子ポリフェノールを５０μｇ／ｍＬまたは１２μｇ／ｍＬの濃度で添加して４日間の培養を行った場合、プロテイナーゼＫ処理後においてこれらのペプチドは存在しなかった。この結果は、画分（１５）の高分子ポリフェノールが、正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質の異常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質への変換を阻止したことにより、正常型ＭＨＭ２−プリオンタンパク質がプロテイナーゼＫによって分解されたことを意味する。従って、画分（１５）の高分子ポリフェノールは、異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を有することがわかった。
【００２６】
実施例２：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
実施例１の（Ａ）でブタノール溶出成分を含む抽出液を得た後に残った水相を塩酸でｐＨを約３にした後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を５回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり３．２ｇの収量で得た。このウーロン茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１５個の画分サンプルを得た。図３にウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図３にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１４）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．７３×１０４、重量平均分子量は２．４４×１０４であった。この画分（１４）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２７】
実施例３：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
沸騰水５００ｍＬに紅茶葉２５ｇを加え、１０分間穏やかに沸騰後、直ちにブフナーロートとで紅茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、紅茶葉１００ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。以降の操作を実施例１の（Ａ）と同様にして紅茶ブタノール抽出中性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．５ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出中性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１６個の画分サンプルを得た。図４に紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を図４にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１５）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．３６×１０４、重量平均分子量は１．８９×１０４であった。この画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２８】
実施例４：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用
実施例２と同様にして紅茶ブタノール抽出酸性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．９ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１１個の画分サンプルを得た。図５に紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を図５にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１１）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は９．４３×１０３、重量平均分子量は１．４８×１０４であった。この画分（１１）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００２９】
製剤例１：錠剤
実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末５ｇ、乳糖７８ｇ、ステアリン酸マグネシウム１７ｇ、合計１００ｇを均一に混合し、常法に従って錠剤とした。
【００３０】
製剤例２：ビスケット
薄力粉３１ｇ、全卵１６ｇ、バター１６ｇ、砂糖２４ｇ、水１０ｇ、ベーキングパウダー１ｇ、実施例３の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末２ｇ、合計１００ｇを用い、常法に従ってビスケットとした。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、異常型プリオンタンパク質の天然由来の形成抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１におけるウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図２】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの異常型プリオンタンパク質の形成に対する抑制作用を示すウエスタンブロットの結果である。
【図３】実施例２におけるウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図４】実施例３における紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を示すグラフである。
【図５】実施例４における紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤。
【請求項２】
高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする請求項１記載の形成抑制剤。
【請求項３】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の形成抑制剤。
【請求項４】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の形成抑制剤。
【請求項５】
発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする請求項１記載の形成抑制剤。
【請求項１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする異常型プリオンタンパク質の形成抑制剤。
【請求項２】
高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする請求項１記載の形成抑制剤。
【請求項３】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の形成抑制剤。
【請求項４】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の形成抑制剤。
【請求項５】
発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする請求項１記載の形成抑制剤。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２９７５２（Ｐ２００９−２９７５２Ａ）
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９６５９９（Ｐ２００７−１９６５９９）
【出願日】平成１９年７月２７日（２００７．７．２７）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月２７日（２００７．７．２７）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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