異種移植反応を決定する方法
本発明は、異種移植片として宿主に導入することが企図されている細胞を組み換えるもしくは操作する方法を提供するが、細胞の組み換えもしくは操作は少なくとも１つの適切なレポーター系の含有物を含む。レポーター系の含有物は、適切かつ便宜的な測定システムを通しての異種移植片のモニタリングおよび当該の異種移植パラメーターの決定を許容する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞もしくは組織を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作する、そして前記細胞もしくは組織を、特に異種移植片として非ヒト動物に導入する方法に関するが、特に異種移植片に限らない。異種移植細胞もしくは組織になされた１つ以上の遺伝子組み換えは、宿主動物に移植された細胞内での細胞の生理的過程の報告を可能にするようなことであり、異種移植片内での細胞の生理的過程をモニタリングする、および／または薬物もしくはその他の治療的介入が異種移植片へ及ぼす作用をモニタリングすることを目的とするが、特に限定されない。本発明は、遺伝子操作細胞および／またはそのような遺伝子操作細胞を含む組織を含む生成物およびそれらの使用をさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
動物における実験的異種移植片は、癌の研究および抗癌薬もしくはその他の治療手技の有効性を試験する際に極めて重要な手段である。実験的異種移植片は、さらにまたより一般的には、薬物もしくは他の化合物または生体系における生物学的物質もしくは生物学的作用物質の作用機構の試験において潜在的用途を有する。例えば、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて癌異種移植片を生成するため、ならびに疾患の進行および治療薬が異種移植腫瘍に及ぼす作用をモニタリングするためにヒト前立腺細胞系を使用することが、米国特許第６，１０７，５４０号および第６，３６５，７９７号に記載の先行技術から、分かっている。しかし、先行技術の実験的な取り組みから入手できる情報は限られている。これは、十分に、または効果的に測定できる異種移植片生理学について情報を提供するパラメーターがほんの少数しかないことに起因する。さらに、異種移植片自体が主として動物の淘汰を必要とするような侵襲的な方法、または面倒な方法によってしか入手できないという問題がある。したがって、異種移植片の測定は、ごく限られた特定時点でしか行うことができない。さらにまた別の問題は、異種移植片の細胞増殖状態の定量的評価にある。主として、異種移植片のサイズの測定はその指標として使用されるが、そのような測定は不正確になる傾向があり、異種移植腫瘍の進行または退行の場合に発生する可能性のあるかすかな変化を拾い上げることができない。
【０００３】
宿主内への異種移植片の導入から生成できる情報の量および質を決定する改良された方法は、現行方法を用いて反応が明らかになる前に、関係するメカニズムについての知識に基づいて反応の極めて初期の段階を検出する能力を含み、先行技術に対する直接的利点を提供するであろう。そのような方法は宿主内の異種移植片の生理的過程を理解するために有益であるだけではなく、異種移植動物モデルにおける候補治療薬の有効性およびそれらが生理的過程に及ぼす作用の測定の改良も提供するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、異種移植片として宿主内へ導入することを目的とする細胞の組み換えもしくは操作にあり、細胞の組み換えもしくは操作は少なくとも１つの適切なレポーター系の含有物を含む。レポーター系を含有すると、有益には適切かつ便宜的な測定システムを通して当該異種移植パラメーターを決定することができる。したがって、先行技術に関連する問題の多くを緩和することができ、実験的異種移植片からの情報を拡大することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１態様によると、動物モデルにおける異種移植片の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）細胞を動物に移植する前もしくは後のいずれかに、少なくとも１つのレポーター分子および／またはレポーター遺伝子を前記細胞に組み込むことができるように、前記細胞を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作するステップと、
（ｉｉ）前記組み換え細胞を前記動物モデルに移植して、異種移植片を十分な期間にわたり増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子に関連する選択された生化学的／生理的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップと、を含む方法が提供される。
【０００６】
好ましくは、複数の遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞が存在するが、より好ましくは、該細胞はヒトもしくは非ヒト起源であり、例えば腫瘍由来の一次分離株の形状であるか、または不死化もしくは株化細胞系の形状であってもよい。
【０００７】
好ましくは、動物宿主に移植される組み換え細胞は、例えば、肝臓、脳、腸、副腎、腎臓、皮膚、または異種移植片にとって望ましいいずれか他の器官もしくは組織の腫瘍由来の細胞を含む群から選択されるが、これに限定されない。細胞はそのような腫瘍から直接調製できる、または、例えばｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｔｕｍｏｒ−ｃａｔａｌｏｇ．ｐｄｆ．に列挙された腫瘍細胞系のリストから選択された細胞系などの株化細胞系であってよいが、これに限定されない。
【０００８】
本発明の異種移植細胞は腫瘍細胞には限定されず、例えば胚幹細胞であってよく、または哺乳動物もしくは非哺乳動物起源のあらゆるタイプの生きた細胞由来であってもよいことは理解されるであろう。例えば、適切なレポーター反応を生じる細菌細胞は宿主動物における所定のパラメーターを検出するために使用できる。
【０００９】
少なくとも１つのレポーター分子またはレポーター遺伝子をそれらに組み込めるように一過性もしくは安定性に組み換えもしくは操作されている細胞を以下では便宜的に「レポーター細胞／系」と呼ぶ。
【００１０】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む」および「含有する」ならびに例えば「含んでいる」および「含まれた」などのこれらの用語の変形は、「〜を含むがそれらに限定されない」ことを意味しており、他の構成要素、整数、成分、添加物もしくはステップを除外する（および除外しない）ことは企図されていない。
【００１１】
本明細書での「レポーター分子」についての言及は、核酸またはアミノ酸配列を標識するために使用される化学成分を含むことが企図されている。好ましくは、それらにはタンパク質、抗原、酵素、酵素基質、蛍光物質、化学発光物質、色素物質もしくは放射性核種が含まれるが、それらに限定されない。レポーター分子は、特定の核酸またはアミノ酸配列に関連している、それらの存在を確定する、そして定量を可能にすることがある。
【００１２】
本明細書での「レポーター遺伝子」についての言及は、機能的タンパク質をコードする核酸およびそのフラグメントを含むことが企図されている。本発明において言及したレポーター遺伝子は正常な生理的過程以外の多くの様々な特性および事象を「報告」することができ、例えば天然であるか逆方向遺伝学試験のために組み換えられているかに関わらずプロモーターの強度；遺伝子送達系の効率；遺伝子産物の細胞内運命；タンパク質輸送の結果；ツーハイブリッドシステム内の２種のタンパク質の相互作用またはワンハイブリッドシステム内のタンパク質と核酸の相互作用；翻訳開始シグナルの効率；分子クローニングの成功；および外因性物質が生理的過程に及ぼす作用、を報告できる。
【００１３】
レポーター遺伝子は、直接的もしくは間接的にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸配列である。レポーター遺伝子は、それらのタンパク質産物が不適切である、または予想されるアッセイにとって適用できない他のコーディング領域に代えて使用される。当分野において知られていて本発明の方法において使用できる適切なレポーター遺伝子は、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含むがそれらに限定されないタンパク質をコードするそれらの遺伝子から選択される。適切なレポーター遺伝子の上記のリストは網羅的または排他的ではなく、本出願の範囲を限定することは企図されていないことは理解されるであろう。当業者であれば、本発明の方法に同等に適用できるまた別のレポーター系を選択することができる。
【００１４】
レポーター遺伝子は、レポータータンパク質だけが作製されるように、またはレポータータンパク質が他のタンパク質に融合させられる（融合タンパク質）ように他の配列に付着させることができることは理解されるであろう。
【００１５】
本明細書での「レポーター物質」についての言及は、プロテアーゼもしくはキナーゼまたはタンパク質もしくはＲＮＡまたは細胞タンパク質もしくはｍＲＮＡ安定化において変化をもたらすいずれか他の生化学成分を含むことが企図されている。
【００１６】
好ましくは、動物モデルは齧歯類であり、そしてより好ましくは、野生型または例えば薬物代謝の特性が修飾されているような、特別に選択された遺伝的背景を備えるマウスもしくはラットである。
【００１７】
好ましくは、動物モデルはその中に移植されたレポーター細胞／系の２つ以上の相違する集団を有していてよい。
【００１８】
本発明の方法は、好ましくは宿主細胞ゲノムの複製とともに組み込まれたレポーター遺伝子の複製を可能にする方法で、１つ以上のレポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくは導入遺伝子を選択された細胞に組み込むことによってレポーター系になるようにヒトもしくは非ヒト起源の遺伝子組み換え細胞を使用するステップを含む。好ましくは、レポーター分子もしくは導入遺伝子は、細胞が非ヒト動物に移植されるとインビボの細胞の生理的過程の便宜的モニタリングを可能にするために適合する。レポーター細胞もしくは系からの「読み出し」もしくは情報は、定性的もしくは定量的データの形状であってよく、そしてこのデータを解明するための侵襲性もしくは非侵襲性方法を含んでいてよい。したがって、本発明の１つの方法は便宜的に長期間にわたって複数回の測定を行うことのできる動物モデルを提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法は、異種移植片を異種移植腫瘍として増殖させるステップをさらに含む。
【００２０】
好ましくは、レポーター細胞／系は、適切な培地に懸濁させた個別細胞または組織断片のいずれかとして動物宿主に導入することができる。レポーター細胞／系は宿主動物内で全身的に増殖するか、または移植部位で移植腫瘍として増殖することがあるが、続発部位での転移性腫瘍の有無にかかわらず、必ずしも腫瘍として増殖するとは限らない。
【００２１】
好ましくは、宿主細胞は適切な免疫抑制剤の投与手段によって免疫抑制される、または例えば制限はないが、ＳＣＩＤなどの免疫不全系統である。あるいは、レポーター系は、レポーター細胞が宿主動物と同遺伝子型である免疫学的に正常な動物においても増殖させることができる。
【００２２】
好ましくは、レポーター細胞／系は、１つもしくは複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている。レポーター細胞／系は、移植時点で既に１つ以上の導入遺伝子を発現していてよい、または例えば、ウイルスベクターによって、特別に標的を定めた方法で導入遺伝子をインビボでトランスフェクトされてもよい。したがって、本発明の方法は便宜的にも宿主動物への細胞の移植前または移植後に細胞のトランスフェクションを許容することは理解されるであろう。
【００２３】
好ましくは、レポーター細胞／系導入遺伝子は、レポーター細胞増殖中に発生する、または投与された化合物もしくは生物学的物質の毒物学的もしくは薬理学的作用によって誘発された細胞生理学の変化に反応した重要な生化学的パラメーターの測定を許容するエレメントを含んでいてよい。
【００２４】
好ましくは、適切なレポーター分子もしくは導入遺伝子によってモニタリングできる細胞の生理的過程には、
ａ）例えばレポーター細胞数、細胞周期の変調もしくは有糸分裂分画、細胞分化、血管形成、低酸素状態、細胞死または細胞溶解（例えばアポトーシス、壊死による）などの異種移植片の増殖もしくは分化もしくは死のパラメーター、
ｂ）例えば酸化ストレス、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア機能、膜摂動、ＧＳＨ枯渇、受容体媒介毒性、酵素阻害、補因子アベイラビリティ、ｐＨもしくは浸透圧の変化、カルシウムホメオスタシスの摂動、細胞分化、タンパク質の代謝回転、ユビキチン化、タンパク質のミスフォールディングなどの毒性のメカニズム、
ｃ）例えば細胞内シグナリング経路、受容体相互作用に及ぼす作用、遺伝子転写、翻訳もしくはタンパク質安定性、ホルモンもしくは成長因子受容体の変調；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の変調、例えばＭＡＰキナーゼもしくはホスファターゼシグナリング、ｐ５３シグナリング、ｒａｓシグナリングなどの細胞内シグナル伝達経路などに及ぼす作用、などの薬物作用のメカニズム、
ｄ）薬物耐性のメカニズム、薬物送達もしくは薬物バイスタンダー効果の誘導、が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
レポーター細胞は、その発現産物が関連パラメーターの便宜的決定を許容する少なくとも１つの導入遺伝子の組み込みを通して上記のプロセスの決定を促進するように遺伝子組操作することができる。
【００２６】
適切な導入遺伝子は、好ましくは結果としてレポータータンパク質の産生を生じさせる遺伝子の発現を促進する天然もしくは人工プロモーター配列を含む。
【００２７】
好ましくは、レポーター発現産物は転写的または転写後に検出可能である。
【００２８】
本発明の１つの実施形態（転写的報告）では、プロモーターが遺伝子転写を促進する能力は、関連パラメーターにポジティブまたはネガティブのどちらかで依存するので、遺伝子産物の直接感知は関連パラメーターの読み出しを提供する。
【００２９】
本発明のまた別の実施形態（転写後報告）では、プロモーターは構成的に活性であるか、または決定されるパラメーターからは独立した因子によって誘導性できるが、遺伝子産物は関連パラメーターの読み出しを促進する方法でレポーター細胞内のプロセスに影響を及ぼす、またはレポーター細胞内のプロセスによって影響を受ける。読み出しを入手するそのような方法の例には、例えば、その安定性が関連パラメーターにポジティブもしくはネガティブに依存する遺伝子転写産物もしくはタンパク質；その転写後修飾状態、例えばリン酸化の程度、またはその細胞レベル以下局在もしくは発現細胞からのその分泌が関連パラメーターに依存するタンパク質、またはそれらの修飾が測定可能な読み出しを提供するように同一細胞内での内因性遺伝子転写産物もしくはタンパク質またはその他の導入遺伝子の産物のいずれかの修飾を触媒する酵素活性を備えるタンパク質、が含まれる。
【００３０】
転写的報告を使用する実施形態では、例えば、転写は適切な遺伝子プロモーター、例えば、限定はされないが、低酸素状態を検出するための血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）プロモーター；酸化ストレスを検出するための誘導性一酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）プロモーターもしくはヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）プロモーターもしくはシクロ−オキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター；アポトーシスを検出するための組織トランスグルタミナーゼプロモーターもしくはＰｅｇ３／ｐｗｌプロモーター、ＤＮＡ損傷を検出するための１４−３−３タンパク質プロモーターもしくはＧＡＤＤ１５３プロモーターを通して媒介され得ることは予想されている。適切な遺伝子プロモーターの上記のリストは本発明の方法に限定されると企図されないことは理解されるであろう。プロモーターのリストは網羅的でも排他的でもなく、当業者であればモニタリングもしくは測定することが望ましい細胞の生理学的パラメーターを検出できるプロモーターを選択できる。
【００３１】
転写後報告を使用する実施形態では、それは例えば細胞質タンパク質から核への、または膜結合形から分泌形への転位を生じさせるプロテアーゼ活性の結果として例えばタンパク質組み換えを実行できるタンパク質の生成を通して、または例えばプロエンザイムもしくは転写調節因子の活性化または活性酵素もしくは転写調節因子の不活性化または血液中への分泌もしくは尿中への排泄（例、アラニンアミノトランスフェラーゼ）を生じさせることができるタンパク質開裂を通して実行できる。転写後報告は、さらにまた例えばタンパク質もしくはｍＲＮＡの安定化における変化をもたらすタンパク質もしくはＲＮＡの産生を含むことができる。
【００３２】
好ましくは、レポーター細胞／系は、重要な細胞生理的パラメーターまたは細胞内シグナル経路活性化への反応の検出を促進するための遺伝子エレメントを含むことができる。例えば、導入遺伝子発現の産物は、分泌された身体の生成物中、例えば尿（例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ｈＣＧ）、便、息もしくは唾液中での便宜的な非侵襲性アッセイを許容するために選択できる。あるいは、導入遺伝子発現の生成物は、例えば非侵襲性方法による、例えばグルコース利用率の生物発光測定、血圧測定、経皮的動脈血酸素分圧測定、核磁気共鳴測定またはポジトロン放射断層撮影法によるアッセイを許容するために選択できる。あるいは、導入遺伝子発現の産物は、例えば血液中（例えば分泌アルカリホスファターゼ、ＳＥＡＰ）または異種移植組織（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくは細胞由来ＲＮＡの「リアルタイム」ＰＣＲによって）中での便宜的侵襲性アッセイを可能にするために選択してもよい。
【００３３】
血液、組織もしくは身体生成物中で測定される導入遺伝子レポーター生成物は、好ましくは例えばイムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイもしくは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ））もしくは酵素アッセイ、または比色アッセイもしくはクロマトグラフィーアッセイ（例えば、ＨＰＬＣ）または質量分析アッセイもしくは核磁気共鳴分光法によってアッセイすることができる。
【００３４】
本発明のまた別の実施形態では、レポーター細胞／系は、例えば侵襲性および非侵襲性介入術または複数の当該パラメーターの同時測定からの個別パラメーターの複数の形態の「読み出し」を可能にする、または例えば血管形成に続発性の細胞増殖についてのように他のパラメーターに続発性である測定されたパラメーターについて制御できる複数の導入遺伝子を組み込むことができる。
【００３５】
あるいは、相違するプロモーターの制御下での導入遺伝子発現のレポータータンパク質生成物は、例えば明確に識別可能なエピトープタグに対する配列をコードする導入遺伝子のコーディング配列に組み込むことによってイムノアッセイによって識別できる。
【００３６】
本方法のステップ（ｉｉｉ）に記載されている本発明の方法の特別な長所は、
ａ）特に異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生した際の、または処理に反応したレポーター細胞の増殖を正確に測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した場合に分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違するかどうかを確証するために続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞に比較した分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で腫瘍細胞増殖または処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーターを用いて力学的測定を行うステップと、
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、および
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、そしてそれにより薬物を組み込む細胞を決定するステップと、を含む方法を提供することにある。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によると、遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞を含む生成物が提供され、該細胞が少なくとも１つのレポーター分子もしくはレポーター遺伝子を含むように組み換えもしくは操作されている。
【００３８】
好ましくは、該生成物は上述した特徴のいずれか１つ以上をさらに含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によると、ＳＦＮ遺伝子のプロモーター領域およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含み、ｈＣＧの発現がＳＦＮプロモーターによって制御される人工遺伝子構築物が提供される。
【００４０】
好ましくは、ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域は排出性レポーターであるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）へ結合している。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、３’末端はＡｍｐへ結合しており、ｈＣＧはｍｙｃなどのエピトープタグを含むが、当業者であれば３’末端への他の適切な変更を行うことは理解されるであろう。
【００４２】
本発明のさらに別の態様によると、上述したようにこの構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系が提供される。
【００４３】
本発明のさらに別の態様によると、上述したようにこの構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系を含有する動物モデルが提供される。
【００４４】
本発明のさらに別の態様によると、下記の例、
ａ）特に、しかし排他的ではなく異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生した際の、または処理に反応したレポーター細胞増殖を測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した場合に分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違する場合に続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞／系における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞と比較して分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で、腫瘍細胞増殖もしくは処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーター分子もしくは遺伝子を用いて力学的測定を行うステップと、
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、そしてそれにより薬物を組み込む細胞を決定するステップと、および
ｋ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、のいずれか１つ以上における本発明の方法または生成物の使用が提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様によると、上述したように少なくとも１つのレポーター細胞／系および任意でそのための１組の取扱説明書を含むキットが提供される。本発明のキットはレポーター細胞の懸濁液として供給できることが予想されている。
【００４６】
本発明を、単に例としてのみ以下の図面を参照しながら説明する。
【００４７】
材料および方法
レポーターの選択
Ｓｔｒａｔｉｆｉｎ（ＳＦＮ）遺伝子（１４−３−３σとしても知られている）のプロモーターは、ＤＮＡ損傷の結果として発生するＧ２／Ｍ停止のマーカーである。ＳＦＮ遺伝子は、γ線照射またはアドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られている）を用いて処理した後ヒト腫瘍由来細胞系内でのＧ２／Ｍ停止中のｐ５３依存性メカニズムを介して転写的にアップレギュレートされることが証明されている［１］。ＳＦＮの発現は、その発現がＧ２／Ｍチェックポイントを通して進行を停止させると思われる点で、Ｇ２／Ｍ停止に機能的に関係していると思われる［１］。さらに、ＳＦＮプロモーターの転写活性化は、その転写活性化機能がＤＮＡ損傷によって活性化される腫瘍抑制因子タンパク質ＢＲＣＡ１に反応して発生する可能性がある［２］。ＳＦＮ誘導がｐ５３発現の変化に先行し［３］、そしてＢＲＣＡ１発現がｐ５３欠損ＨＣＣ１９３７細胞内でのＧ２／Ｍ停止およびＳＦＮ誘導のために必要かつ十分である［４］という事実は、この誘導経路がｐ５３非依存性であることを示している。そこで、ＤＮＡ損傷によるＳＦＮの誘導は、ｐ５３依存性経路およびｐ５３非依存性経路の両方を介して発生すると思われる［１、３、４］。
【００４８】
ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域が分泌性レポーターであるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）へ結合している人工遺伝子構築物を生成した。この構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系をインビトロで組み換えて試験した。これを次にインビボ異種移植片実験で使用して抗癌剤を用いた処理に反応したｈＣＧの排泄の変化を証明した。
【００４９】
ＳＦＮ−ｈＣＧ構築物の生成
このレポーター構築物は、Ｒｅｄ／ＥＴ相同遺伝子組み換え系（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ社）を利用して組み換えクローニング法を用いて構築した。
【００５０】
ＳＦＮのゲノムクローン（ｓｆｎ ＰＲＯＴＥＩＮ）は、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｓｅｍｂｌサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって後援されている）を用いて同定した。全コーディング領域およびプロモーターを含有するヒトＰＡＣクローンＲＰＣＩ−５０ｏ２４が同定され、正常調節のためには調節領域が必須であると見なされた。５’および３’ＵＴＲの両方を含有するＰＡＣクローンをさらにＰＣＲによって検証した。スクリーニングに使用したＳＦＮオリゴは以下のとおりであった。
４８，６７１−４８，６９０ｂｐをポジショニングするためのＳＦＮ検証用オリゴ
ＳＦＮ＿フォワード ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ Ｃ（配列番号１）
ＳＦＮ＿リバース ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ Ａ（配列番号２）
【００５１】
次に正確なＰＣＲ産物を生じたクローンを以下のとおりに処理した。検証したＰＡＣクローンはプラスミドｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ社）を用いて形質転換させた。このプラスミドは、組み換えプロセスのために必須のリコンビナーゼを提供する。ＰＡＣ／ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡクローンをさらに制限酵素分析によってｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡの存在について検証した。正確な制限酵素パターンを生じたクローンだけを使用した。
【００５２】
ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐターゲティング構築物の生成は下記のとおりに実施したが、しかし我々の試験結果はこの構築物がこのようなタグの不在下で有効であることを示しているので、この構築物が必ずしもｍｙｃなどのエピトープタグを含む必要はないことは理解されるであろう：ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐテンプレートは、事前にｐＸＥＮバックボーンの同等物上にクローニングされていた。これを消化し、直線状にして、バックグラウンドを減少させた。ターゲティング分子を生成するために以下のオリゴヌクレオチド（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ社）を使用した。
ＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ
ＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ（配列番号３）
ＬＳ−ＳＦＮａｍｐ
ＴＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡ（配列番号４）
【００５３】
次の反応条件を使用した。３９．５μＬのｄＨ2Ｏ、５μＬの１０×Ｔｕｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰＳ（Ｒｏｃｈｅ社）、１μＬのＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ（１００ｐｍｏｌ）、１μＬのＬＳ−ＳＦＮａｍｐ（１００ｐｍｏｌ）、０．５μＬのＴｒｉｐｌｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）。
【００５４】
ＰＣＲブロック条件（ＭＷＧ）：９４℃で１分間×１サイクル、９３℃で３０秒間、５６℃で３０秒間×３０サイクル、７２℃で２分３０秒間、７２℃で５分間×１サイクル。このようにして生成した分子を図１に示した。
【００５５】
このＰＣＲにかけたターゲティング分子を、全ＰＣＲ反応上でＤｐｎ１消化を実施することによって（バックグラウンドをさらに減少させるために）処理した（これはテンプレートであるメチル化ＤＮＡを優先的に切断する）。消化したＰＣＲ反応物をエタノールで沈降させ、水に再懸濁させると、０．５μｇ／μＬの最終ＤＮＡ濃度が生じた。ＰＡＣ（ＲＰＣＩ−５Ｏｏ２４）を含有するｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡは下記のとおりに培養した。一晩の１ｍＬのＬＢ培養液（カナマイシン７０μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン３μｇ／ｍＬを添加した）を１０００ｒｐｍ（毎分回転数）で攪拌しながら３０℃で増殖させた。翌日、上記と同様に添加した３本の１．４ｍＬのＬｂ培養をセットし、３０μＬの一晩培養を接種し、攪拌しながら２時間にわたり３０℃で増殖させた。２時間後、３０μＬのＬ−アラビノース（１０％）を用いて２本の培養を誘導し、全細胞をさらに１時間にわたり攪拌しながら３７℃へ変化させた（これはリコンビナーゼを誘導し、ｐＳＣ１０１ＢＡＤプラスミドがそれ以上複製するのを停止させる）。得られた培養液は、さらに氷冷無菌水であれば１ｍＬ中で３回洗浄することによってエレクトロコンピテントにするために処理した。これらの細胞を次にＰＣＲにかけたターゲティング分子を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を３７℃の１ｍＬのＬＢブロスで７０分間にわたり回収した。回収した細胞はＬＢ選択寒天培地（カナマイシン７０μｇ／ｍＬおよびアンピシリン２０μｇ／ｍＬ）上にプレートアウトし、３７℃で一晩増殖させた。得られたコロニーを図２に示した組み換えＰＡＣの生成のための正確な組み換え事象についてスクリーニングし、制限酵素地図領域の詳細は図３に示した。
【００５６】
スクリーニング形態は、５’末端についてはｈＣＧおよびＳＦＮの接合部から３’末端についてはＡｍｐおよびＳＦＮの接合部にわたるＰＣＲであった。ポジティブクローンが同定されると、ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡプラスミドを組み換えＰＡＣ内に再導入し、以前に記載したとおりに検証した。次の段階では、１０Ｋｂの上流配列および一部の９Ｋｂの下流配列を用いてｐＡＣＹＣ１８４バックボーン上へ組み換えＳＦＮ遺伝子のサブクローニングを行った。これは再び、組み換えクローニングの使用により達成された。サブクローニング標的構築物は下記のオリゴを用いるＰＣＲを使用して生成した。
ＳＦＮサブクローニング用オリゴ
ＳＦＮサブクローン・フォワード
ＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号５）
ＳＦＮサブクローン・リバース
ＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号６）
【００５７】
ＰＣＲ条件は、使用したテンプレートが直線状ｐＡＣＹＣ１８４であることを除いて、以前に記載したとおりであった。ＰＣＲ産物は以前に記載したとおりに処理した。サブクローニングＳＦＮ標的構築物（ＳＦＮサブクローン中間体）は、図４に示したとおりに生成した。
【００５８】
ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡを含有する組み換えＳＦＮ ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐは、以前に記載したようにエレクトロコンピテントにし、ＳＦＮサブクローン中間体を用いてエレクトロポレーションした。結果として生じた形質転換物は、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン２０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ寒天プレート上にプレートアウトする前に１ｍＬのＬＢ中に回収した。潜在的形質転換物は多数の診断用制限酵素消化物を用いてスクリーニングし、正確な制限酵素パターンを提供することによって評価した。正確な制限酵素パターンを生じるクローンは、４００ｍＬの液体培養（１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢブロス）を増殖させることによってバルク調製し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキット（キットにに付いているプロトコールにしたがって）を用いてｍａｘｉｐｒｅｐした。最終構築物の制限酵素地図は図５に示した。
【００５９】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する細胞系の生成
前立腺腫瘍細胞系ＰＣ３は、インビトロで単層として増殖することができ、先天的無胸腺ヌードマウスにおいて異種移植片として増殖させると皮下腫瘍を形成するｐ５３-/-細胞系である。重要なことに、この細胞系は抗癌薬を用いた処理後にＧ２／Ｍ停止を受ける能力を有する［５］。
【００６０】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物は、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ社、イーストサセックス州ルイス）を用いて６ウェル組織培養プレート上のＰＣ３細胞内へトランスフェクトした。構築物ＤＮＡ（１μｇ／ウェルに相当する）をＦｕＧｅｎｅ試薬（３μＬ／ウェル）へ添加し、無血清含有培地を加えて１００μＬ／ウェルにした。その中で細胞が増殖している培地を吸引して除去し、１ウェル当たり１００μＬの上記混合液に交換した。一過性トランスフェクションのために、該構築物の添加２４時間後の細胞を実験のために使用した。
【００６１】
安定性細胞系を生成するために、上記のとおりにトランスフェクションを実施した。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、１０ｃｍ径組織培養皿（１０ｃｍ径の皿につき６ウェルプレート中の１ウェル）へ移した。細胞を選択前７日間にわたりこれらの皿上で増殖させた。この時点の後、Ｇ４１８（細胞培養培地中で２０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、培養皿はコロニーが目に見えるようになるまで（約１週間）維持した。トリプシン中に浸漬したクローニングディスクを用いて個々のコロニーを拾い、２４ウェルプレートのそれぞれのウェルへ移した。コロニーを次に６ウェルプレート、次にＴ２５フラスコで増殖させ、インビトロ誘導および異種移植片実験に使用するために十分な細胞が存在するようになるまで増殖させた。
【実施例１】
【００６２】
インビトロ実験の例示
エトポシドは、培養細胞中でＢＲＣＡ１結合メカニズムを介してＧ２／Ｍ停止を誘導することが知られている［６］。
【００６３】
構築物の添加２４時間後の一過性トランスフェクト細胞をエトポシド（５０μＭ）により処理した、または未処理で放置した。５０μＭエトポシドの存在下または不在下で２４時間後に、培地のサンプルを採取し、酵素結合免疫吸着検定法（Ｆｒｅｅ Ｂｅｔａヒト絨毛性性腺刺激ホルモンキット、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国テキサス州）によってｈＣＧについてアッセイした。この実験の結果を図６に示した。
【００６４】
これは、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有するＰＣ３細胞が周辺培地中へｈＣＧを分泌すること、そしてさらに、細胞をエトポシド処理した場合は分泌量が増加することを証明している。
【００６５】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する安定性細胞系の生成後に、細胞をさらにエトポシドを用いて試験した。細胞を６ウェルプレートにプレートアウトし、一晩おいて付着させた。翌日、それらはエトポシド（５０もしくは４００μＭ）または溶剤（ジメチルスルホキシド）を用いて処理した。エトポシドの存在下または不在下での２４時間後に、培地のサンプルを採取し、上記のとおりに酵素結合免疫吸着検定法によってｈＣＧについてアッセイした。この実験の結果を図７に示した。
【００６６】
これは、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐ構築物を含有するように安定的に操作したＰＣ３細胞が周囲培地中にｈＣＧを分泌したことを証明している。一過性トランスフェクタント中と同様に、細胞をエトポシドを用いて処理した場合は分泌量が増加した。さらに、細胞を高濃度のエトポシドへ曝露させた場合には分泌されたｈＣＧの量が増加した（４００μＭ対５０μＭ）。
【実施例２】
【００６７】
インビボの異種移植片
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を用いて安定的にトランスフェクトしたＰＣ３細胞を先天性無胸腺ヌードマウスにおける充実性皮下腫瘍として増殖させた。マウスを次に、Ｇ２／Ｍ停止を誘導することによって作用する抗癌薬を用いて処理した。この例証のために選択した薬物はエトポシドおよびカンプトテシンであった［１２］。
【００６８】
この実験のために、野生型ＰＣ３細胞（ｈＣＧを発現または分泌しない）およびＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する安定性細胞系を使用した。
【００６９】
野生型および組み換えＰＣ３腫瘍細胞系は、１０％〜１５％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ培地中で培養した。ＰＣ３／ＳＦＮ細胞のための培養培地はさらにＧ４１８（２００μｇ／ｍＬ）を含有していた。培養液は３７℃、５％ ＣＯ2に設定した加湿培養器内でインキュベートした。細胞を採取し、プールし、遠心分離し、そして低温培地中に再懸濁させた。これを同等量の冷却マトリゲルと混合したので、腫瘍細胞注射溶液は、腫瘍細胞／培地と各細胞系に対するマトリゲルの５０：５０混合液であった。野生型もしくはトランスフェクトしたＰＣ３細胞を動物１匹当たり２．５×１０6で注射した。全細胞系を、右側腹部にのみ１００μＬの量で注射した。
【００７０】
試験群は、各々が動物４匹を含む計４群から構成されていた。１群のマウスには野生型ＰＣ３細胞を移植し、残り３群には遺伝子操作細胞を移植した。腫瘍増殖は、細胞移植後に腫瘍の径が２〜５ｍｍに達するまで週２回測定した。腫瘍容積（Ｖ）は式：Ｖ＝４／３π（（ｄｌ＋ｄ２）／４）3（式中、ｄ＝平均径（ｎ＝２））を用いて計算した。
【００７１】
処理は、腫瘍移植の５週間後に開始した。野生型ＰＣ３−異種移植マウスは未処理のままにした；その他全てのマウスには溶剤単独（ＤＭＳＯ／生理食塩水）または試験物質を投与した。カンプトテシン（３０ｍｇ／ｋｇ）およびエトポシド（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に１０ｍＬ／ｋｇで単回投与した。さらに、エトポシド（２５ｍｇ／ｋｇ）を連続３日間にわたり単一群のマウスに投与した（腹腔内；１０ｍＬ／ｋｇ）。薬物の投与前、投与中および投与後に尿サンプルを採取した。動物を処理４８時間後に致死させた。尿をｈＣＧについて分析し、数値は尿中クレアチニンレベルに対して標準化した。
【００７２】
野生型ＰＣ３細胞を注射したマウスの尿中では、腫瘍容積が大きかったにもかかわらずｈＣＧは検出されなかった（データは示していない）。これとは逆に、ｈＣＧはトランスフェクトＰＣ３細胞を注射したマウスの尿中で検出され、これはここで検出されたｈＣＧが異種移植腫瘍から発現したことを示唆していた。図８に示したように、腫瘍容積と尿中ｈＣＧレベルとの間には正相関が見られた。これは、腫瘍容積と標準化尿中ｈＣＧ発現との間に関係があることを示している。腫瘍容積が大きいほど、ｈＣＧ発現のレベルが高くなった。
【００７３】
標準化ｈＣＧレベルは、図９に示したように、マウスに賦形剤単独、４０ｍｇ／ｋｇのエトポシドもしくは３０ｍｇ／ｋｇのカンプトテシン各々の単回用量を投与したときに０．５４倍、４．２９倍および５．２９倍へ増加した。
【００７４】
エトポシドおよびカンプトテシンはどちらも、図１０に示したように、賦形剤コントロールと比較して個別マウスにおいてｈＣＧ発現を有意に増加させた。これは、異種移植腫瘍におけるｈＣＧ発現が、ＤＮＡ損傷が増加した結果として抗癌薬のエトポシドおよびカンプトテシンによって誘導されることを証明している。これは、投与前数値に比較して薬物投与の４８時間後には尿中でｈＣＧのレベル上昇が検出されたことによって証明された。
【００７５】
マウスに２５ｍｇ／ｋｇでエトポシドを連続３回投与し、そして尿サンプルを薬物の投与前、投与中および投与後に採取した。第１回投与後には、標準化ｈＣＧ発現の急増が生じたが、試験物質の第２回投与後にはこのレベルにとどまっていた。その後のｈＣＧのレベルは、エトポシドの第３回投与の２４時間後および４８時間後にはコントロールレベルへ低下した。この例は図１１に示した。エトポシドの連続３回の投与後のｈＣＧレベルの低下は、ＤＮＡ損傷の結果としての細胞死が腫瘍の内部で発生していたことを示した。これは、エトポシドがＰＣ３／ＳＦＮ細胞に対する抗腫瘍作用を呈示し、それによってｈＣＧ発現癌細胞の数を減少させ、ｈＣＧ尿中レベルの減少を生じさせることを示唆した。
【００７６】
［文献］
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐターゲティング構築物の生成を示す。
【図２】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）：ＰＡＣクローンを示す。
【図３】図２の制限酵素地図の詳細を示す。
【図４】ＳＦＮサブクローン中間体の生成を示す。
【図５】最終構築物の制限酵素地図を示す。
【図６】一過性に感染したＰＣ３細胞中でのエトポシドによるｈＣＧの誘導を示す。
【図７】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐ構築物を含有するように安定的に操作されたＰＣ３細胞中でのエトポシドによるｈＣＧの誘導を示す。
【図８】腫瘍容積と標準化尿中ｈＣＧ発現（投与前）との関係のグラフを示す。
【図９】投与４８時間後の腫瘍容積に比較した標準化尿中ｈＣＧ発現を示す。
【図１０】個別マウスの投与４８時間後の腫瘍容積に比較した標準化尿中ｈＣＧ発現を示す。
【図１１】２５ｍｇ／ｋｇ（エトポシド）を連続３回投与された単一マウスにおける標準化尿中ｈＣＧレベルを示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞もしくは組織を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作する、そして前記細胞もしくは組織を、特に異種移植片として非ヒト動物に導入する方法に関するが、特に異種移植片に限らない。異種移植細胞もしくは組織になされた１つ以上の遺伝子組み換えは、宿主動物に移植された細胞内での細胞の生理的過程の報告を可能にするようなことであり、異種移植片内での細胞の生理的過程をモニタリングする、および／または薬物もしくはその他の治療的介入が異種移植片へ及ぼす作用をモニタリングすることを目的とするが、特に限定されない。本発明は、遺伝子操作細胞および／またはそのような遺伝子操作細胞を含む組織を含む生成物およびそれらの使用をさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
動物における実験的異種移植片は、癌の研究および抗癌薬もしくはその他の治療手技の有効性を試験する際に極めて重要な手段である。実験的異種移植片は、さらにまたより一般的には、薬物もしくは他の化合物または生体系における生物学的物質もしくは生物学的作用物質の作用機構の試験において潜在的用途を有する。例えば、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいて癌異種移植片を生成するため、ならびに疾患の進行および治療薬が異種移植腫瘍に及ぼす作用をモニタリングするためにヒト前立腺細胞系を使用することが、米国特許第６，１０７，５４０号および第６，３６５，７９７号に記載の先行技術から、分かっている。しかし、先行技術の実験的な取り組みから入手できる情報は限られている。これは、十分に、または効果的に測定できる異種移植片生理学について情報を提供するパラメーターがほんの少数しかないことに起因する。さらに、異種移植片自体が主として動物の淘汰を必要とするような侵襲的な方法、または面倒な方法によってしか入手できないという問題がある。したがって、異種移植片の測定は、ごく限られた特定時点でしか行うことができない。さらにまた別の問題は、異種移植片の細胞増殖状態の定量的評価にある。主として、異種移植片のサイズの測定はその指標として使用されるが、そのような測定は不正確になる傾向があり、異種移植腫瘍の進行または退行の場合に発生する可能性のあるかすかな変化を拾い上げることができない。
【０００３】
宿主内への異種移植片の導入から生成できる情報の量および質を決定する改良された方法は、現行方法を用いて反応が明らかになる前に、関係するメカニズムについての知識に基づいて反応の極めて初期の段階を検出する能力を含み、先行技術に対する直接的利点を提供するであろう。そのような方法は宿主内の異種移植片の生理的過程を理解するために有益であるだけではなく、異種移植動物モデルにおける候補治療薬の有効性およびそれらが生理的過程に及ぼす作用の測定の改良も提供するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、異種移植片として宿主内へ導入することを目的とする細胞の組み換えもしくは操作にあり、細胞の組み換えもしくは操作は少なくとも１つの適切なレポーター系の含有物を含む。レポーター系を含有すると、有益には適切かつ便宜的な測定システムを通して当該異種移植パラメーターを決定することができる。したがって、先行技術に関連する問題の多くを緩和することができ、実験的異種移植片からの情報を拡大することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１態様によると、動物モデルにおける異種移植片の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）細胞を動物に移植する前もしくは後のいずれかに、少なくとも１つのレポーター分子および／またはレポーター遺伝子を前記細胞に組み込むことができるように、前記細胞を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作するステップと、
（ｉｉ）前記組み換え細胞を前記動物モデルに移植して、異種移植片を十分な期間にわたり増殖させるステップと、
（ｉｉｉ）前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子に関連する選択された生化学的／生理的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップと、を含む方法が提供される。
【０００６】
好ましくは、複数の遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞が存在するが、より好ましくは、該細胞はヒトもしくは非ヒト起源であり、例えば腫瘍由来の一次分離株の形状であるか、または不死化もしくは株化細胞系の形状であってもよい。
【０００７】
好ましくは、動物宿主に移植される組み換え細胞は、例えば、肝臓、脳、腸、副腎、腎臓、皮膚、または異種移植片にとって望ましいいずれか他の器官もしくは組織の腫瘍由来の細胞を含む群から選択されるが、これに限定されない。細胞はそのような腫瘍から直接調製できる、または、例えばｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｔｕｍｏｒ−ｃａｔａｌｏｇ．ｐｄｆ．に列挙された腫瘍細胞系のリストから選択された細胞系などの株化細胞系であってよいが、これに限定されない。
【０００８】
本発明の異種移植細胞は腫瘍細胞には限定されず、例えば胚幹細胞であってよく、または哺乳動物もしくは非哺乳動物起源のあらゆるタイプの生きた細胞由来であってもよいことは理解されるであろう。例えば、適切なレポーター反応を生じる細菌細胞は宿主動物における所定のパラメーターを検出するために使用できる。
【０００９】
少なくとも１つのレポーター分子またはレポーター遺伝子をそれらに組み込めるように一過性もしくは安定性に組み換えもしくは操作されている細胞を以下では便宜的に「レポーター細胞／系」と呼ぶ。
【００１０】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、用語「含む」および「含有する」ならびに例えば「含んでいる」および「含まれた」などのこれらの用語の変形は、「〜を含むがそれらに限定されない」ことを意味しており、他の構成要素、整数、成分、添加物もしくはステップを除外する（および除外しない）ことは企図されていない。
【００１１】
本明細書での「レポーター分子」についての言及は、核酸またはアミノ酸配列を標識するために使用される化学成分を含むことが企図されている。好ましくは、それらにはタンパク質、抗原、酵素、酵素基質、蛍光物質、化学発光物質、色素物質もしくは放射性核種が含まれるが、それらに限定されない。レポーター分子は、特定の核酸またはアミノ酸配列に関連している、それらの存在を確定する、そして定量を可能にすることがある。
【００１２】
本明細書での「レポーター遺伝子」についての言及は、機能的タンパク質をコードする核酸およびそのフラグメントを含むことが企図されている。本発明において言及したレポーター遺伝子は正常な生理的過程以外の多くの様々な特性および事象を「報告」することができ、例えば天然であるか逆方向遺伝学試験のために組み換えられているかに関わらずプロモーターの強度；遺伝子送達系の効率；遺伝子産物の細胞内運命；タンパク質輸送の結果；ツーハイブリッドシステム内の２種のタンパク質の相互作用またはワンハイブリッドシステム内のタンパク質と核酸の相互作用；翻訳開始シグナルの効率；分子クローニングの成功；および外因性物質が生理的過程に及ぼす作用、を報告できる。
【００１３】
レポーター遺伝子は、直接的もしくは間接的にアッセイ可能なタンパク質をコードする核酸配列である。レポーター遺伝子は、それらのタンパク質産物が不適切である、または予想されるアッセイにとって適用できない他のコーディング領域に代えて使用される。当分野において知られていて本発明の方法において使用できる適切なレポーター遺伝子は、クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含むがそれらに限定されないタンパク質をコードするそれらの遺伝子から選択される。適切なレポーター遺伝子の上記のリストは網羅的または排他的ではなく、本出願の範囲を限定することは企図されていないことは理解されるであろう。当業者であれば、本発明の方法に同等に適用できるまた別のレポーター系を選択することができる。
【００１４】
レポーター遺伝子は、レポータータンパク質だけが作製されるように、またはレポータータンパク質が他のタンパク質に融合させられる（融合タンパク質）ように他の配列に付着させることができることは理解されるであろう。
【００１５】
本明細書での「レポーター物質」についての言及は、プロテアーゼもしくはキナーゼまたはタンパク質もしくはＲＮＡまたは細胞タンパク質もしくはｍＲＮＡ安定化において変化をもたらすいずれか他の生化学成分を含むことが企図されている。
【００１６】
好ましくは、動物モデルは齧歯類であり、そしてより好ましくは、野生型または例えば薬物代謝の特性が修飾されているような、特別に選択された遺伝的背景を備えるマウスもしくはラットである。
【００１７】
好ましくは、動物モデルはその中に移植されたレポーター細胞／系の２つ以上の相違する集団を有していてよい。
【００１８】
本発明の方法は、好ましくは宿主細胞ゲノムの複製とともに組み込まれたレポーター遺伝子の複製を可能にする方法で、１つ以上のレポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくは導入遺伝子を選択された細胞に組み込むことによってレポーター系になるようにヒトもしくは非ヒト起源の遺伝子組み換え細胞を使用するステップを含む。好ましくは、レポーター分子もしくは導入遺伝子は、細胞が非ヒト動物に移植されるとインビボの細胞の生理的過程の便宜的モニタリングを可能にするために適合する。レポーター細胞もしくは系からの「読み出し」もしくは情報は、定性的もしくは定量的データの形状であってよく、そしてこのデータを解明するための侵襲性もしくは非侵襲性方法を含んでいてよい。したがって、本発明の１つの方法は便宜的に長期間にわたって複数回の測定を行うことのできる動物モデルを提供する。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法は、異種移植片を異種移植腫瘍として増殖させるステップをさらに含む。
【００２０】
好ましくは、レポーター細胞／系は、適切な培地に懸濁させた個別細胞または組織断片のいずれかとして動物宿主に導入することができる。レポーター細胞／系は宿主動物内で全身的に増殖するか、または移植部位で移植腫瘍として増殖することがあるが、続発部位での転移性腫瘍の有無にかかわらず、必ずしも腫瘍として増殖するとは限らない。
【００２１】
好ましくは、宿主細胞は適切な免疫抑制剤の投与手段によって免疫抑制される、または例えば制限はないが、ＳＣＩＤなどの免疫不全系統である。あるいは、レポーター系は、レポーター細胞が宿主動物と同遺伝子型である免疫学的に正常な動物においても増殖させることができる。
【００２２】
好ましくは、レポーター細胞／系は、１つもしくは複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている。レポーター細胞／系は、移植時点で既に１つ以上の導入遺伝子を発現していてよい、または例えば、ウイルスベクターによって、特別に標的を定めた方法で導入遺伝子をインビボでトランスフェクトされてもよい。したがって、本発明の方法は便宜的にも宿主動物への細胞の移植前または移植後に細胞のトランスフェクションを許容することは理解されるであろう。
【００２３】
好ましくは、レポーター細胞／系導入遺伝子は、レポーター細胞増殖中に発生する、または投与された化合物もしくは生物学的物質の毒物学的もしくは薬理学的作用によって誘発された細胞生理学の変化に反応した重要な生化学的パラメーターの測定を許容するエレメントを含んでいてよい。
【００２４】
好ましくは、適切なレポーター分子もしくは導入遺伝子によってモニタリングできる細胞の生理的過程には、
ａ）例えばレポーター細胞数、細胞周期の変調もしくは有糸分裂分画、細胞分化、血管形成、低酸素状態、細胞死または細胞溶解（例えばアポトーシス、壊死による）などの異種移植片の増殖もしくは分化もしくは死のパラメーター、
ｂ）例えば酸化ストレス、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア機能、膜摂動、ＧＳＨ枯渇、受容体媒介毒性、酵素阻害、補因子アベイラビリティ、ｐＨもしくは浸透圧の変化、カルシウムホメオスタシスの摂動、細胞分化、タンパク質の代謝回転、ユビキチン化、タンパク質のミスフォールディングなどの毒性のメカニズム、
ｃ）例えば細胞内シグナリング経路、受容体相互作用に及ぼす作用、遺伝子転写、翻訳もしくはタンパク質安定性、ホルモンもしくは成長因子受容体の変調；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の変調、例えばＭＡＰキナーゼもしくはホスファターゼシグナリング、ｐ５３シグナリング、ｒａｓシグナリングなどの細胞内シグナル伝達経路などに及ぼす作用、などの薬物作用のメカニズム、
ｄ）薬物耐性のメカニズム、薬物送達もしくは薬物バイスタンダー効果の誘導、が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
レポーター細胞は、その発現産物が関連パラメーターの便宜的決定を許容する少なくとも１つの導入遺伝子の組み込みを通して上記のプロセスの決定を促進するように遺伝子組操作することができる。
【００２６】
適切な導入遺伝子は、好ましくは結果としてレポータータンパク質の産生を生じさせる遺伝子の発現を促進する天然もしくは人工プロモーター配列を含む。
【００２７】
好ましくは、レポーター発現産物は転写的または転写後に検出可能である。
【００２８】
本発明の１つの実施形態（転写的報告）では、プロモーターが遺伝子転写を促進する能力は、関連パラメーターにポジティブまたはネガティブのどちらかで依存するので、遺伝子産物の直接感知は関連パラメーターの読み出しを提供する。
【００２９】
本発明のまた別の実施形態（転写後報告）では、プロモーターは構成的に活性であるか、または決定されるパラメーターからは独立した因子によって誘導性できるが、遺伝子産物は関連パラメーターの読み出しを促進する方法でレポーター細胞内のプロセスに影響を及ぼす、またはレポーター細胞内のプロセスによって影響を受ける。読み出しを入手するそのような方法の例には、例えば、その安定性が関連パラメーターにポジティブもしくはネガティブに依存する遺伝子転写産物もしくはタンパク質；その転写後修飾状態、例えばリン酸化の程度、またはその細胞レベル以下局在もしくは発現細胞からのその分泌が関連パラメーターに依存するタンパク質、またはそれらの修飾が測定可能な読み出しを提供するように同一細胞内での内因性遺伝子転写産物もしくはタンパク質またはその他の導入遺伝子の産物のいずれかの修飾を触媒する酵素活性を備えるタンパク質、が含まれる。
【００３０】
転写的報告を使用する実施形態では、例えば、転写は適切な遺伝子プロモーター、例えば、限定はされないが、低酸素状態を検出するための血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）プロモーター；酸化ストレスを検出するための誘導性一酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）プロモーターもしくはヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）プロモーターもしくはシクロ−オキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター；アポトーシスを検出するための組織トランスグルタミナーゼプロモーターもしくはＰｅｇ３／ｐｗｌプロモーター、ＤＮＡ損傷を検出するための１４−３−３タンパク質プロモーターもしくはＧＡＤＤ１５３プロモーターを通して媒介され得ることは予想されている。適切な遺伝子プロモーターの上記のリストは本発明の方法に限定されると企図されないことは理解されるであろう。プロモーターのリストは網羅的でも排他的でもなく、当業者であればモニタリングもしくは測定することが望ましい細胞の生理学的パラメーターを検出できるプロモーターを選択できる。
【００３１】
転写後報告を使用する実施形態では、それは例えば細胞質タンパク質から核への、または膜結合形から分泌形への転位を生じさせるプロテアーゼ活性の結果として例えばタンパク質組み換えを実行できるタンパク質の生成を通して、または例えばプロエンザイムもしくは転写調節因子の活性化または活性酵素もしくは転写調節因子の不活性化または血液中への分泌もしくは尿中への排泄（例、アラニンアミノトランスフェラーゼ）を生じさせることができるタンパク質開裂を通して実行できる。転写後報告は、さらにまた例えばタンパク質もしくはｍＲＮＡの安定化における変化をもたらすタンパク質もしくはＲＮＡの産生を含むことができる。
【００３２】
好ましくは、レポーター細胞／系は、重要な細胞生理的パラメーターまたは細胞内シグナル経路活性化への反応の検出を促進するための遺伝子エレメントを含むことができる。例えば、導入遺伝子発現の産物は、分泌された身体の生成物中、例えば尿（例えば、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ｈＣＧ）、便、息もしくは唾液中での便宜的な非侵襲性アッセイを許容するために選択できる。あるいは、導入遺伝子発現の生成物は、例えば非侵襲性方法による、例えばグルコース利用率の生物発光測定、血圧測定、経皮的動脈血酸素分圧測定、核磁気共鳴測定またはポジトロン放射断層撮影法によるアッセイを許容するために選択できる。あるいは、導入遺伝子発現の産物は、例えば血液中（例えば分泌アルカリホスファターゼ、ＳＥＡＰ）または異種移植組織（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくは細胞由来ＲＮＡの「リアルタイム」ＰＣＲによって）中での便宜的侵襲性アッセイを可能にするために選択してもよい。
【００３３】
血液、組織もしくは身体生成物中で測定される導入遺伝子レポーター生成物は、好ましくは例えばイムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイもしくは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ））もしくは酵素アッセイ、または比色アッセイもしくはクロマトグラフィーアッセイ（例えば、ＨＰＬＣ）または質量分析アッセイもしくは核磁気共鳴分光法によってアッセイすることができる。
【００３４】
本発明のまた別の実施形態では、レポーター細胞／系は、例えば侵襲性および非侵襲性介入術または複数の当該パラメーターの同時測定からの個別パラメーターの複数の形態の「読み出し」を可能にする、または例えば血管形成に続発性の細胞増殖についてのように他のパラメーターに続発性である測定されたパラメーターについて制御できる複数の導入遺伝子を組み込むことができる。
【００３５】
あるいは、相違するプロモーターの制御下での導入遺伝子発現のレポータータンパク質生成物は、例えば明確に識別可能なエピトープタグに対する配列をコードする導入遺伝子のコーディング配列に組み込むことによってイムノアッセイによって識別できる。
【００３６】
本方法のステップ（ｉｉｉ）に記載されている本発明の方法の特別な長所は、
ａ）特に異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生した際の、または処理に反応したレポーター細胞の増殖を正確に測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した場合に分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違するかどうかを確証するために続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞に比較した分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で腫瘍細胞増殖または処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーターを用いて力学的測定を行うステップと、
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、および
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、そしてそれにより薬物を組み込む細胞を決定するステップと、を含む方法を提供することにある。
【００３７】
本発明のさらに別の態様によると、遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞を含む生成物が提供され、該細胞が少なくとも１つのレポーター分子もしくはレポーター遺伝子を含むように組み換えもしくは操作されている。
【００３８】
好ましくは、該生成物は上述した特徴のいずれか１つ以上をさらに含む。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によると、ＳＦＮ遺伝子のプロモーター領域およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含み、ｈＣＧの発現がＳＦＮプロモーターによって制御される人工遺伝子構築物が提供される。
【００４０】
好ましくは、ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域は排出性レポーターであるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）へ結合している。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、３’末端はＡｍｐへ結合しており、ｈＣＧはｍｙｃなどのエピトープタグを含むが、当業者であれば３’末端への他の適切な変更を行うことは理解されるであろう。
【００４２】
本発明のさらに別の態様によると、上述したようにこの構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系が提供される。
【００４３】
本発明のさらに別の態様によると、上述したようにこの構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系を含有する動物モデルが提供される。
【００４４】
本発明のさらに別の態様によると、下記の例、
ａ）特に、しかし排他的ではなく異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生した際の、または処理に反応したレポーター細胞増殖を測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した場合に分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違する場合に続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞／系における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞と比較して分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で、腫瘍細胞増殖もしくは処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーター分子もしくは遺伝子を用いて力学的測定を行うステップと、
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、そしてそれにより薬物を組み込む細胞を決定するステップと、および
ｋ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、のいずれか１つ以上における本発明の方法または生成物の使用が提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様によると、上述したように少なくとも１つのレポーター細胞／系および任意でそのための１組の取扱説明書を含むキットが提供される。本発明のキットはレポーター細胞の懸濁液として供給できることが予想されている。
【００４６】
本発明を、単に例としてのみ以下の図面を参照しながら説明する。
【００４７】
材料および方法
レポーターの選択
Ｓｔｒａｔｉｆｉｎ（ＳＦＮ）遺伝子（１４−３−３σとしても知られている）のプロモーターは、ＤＮＡ損傷の結果として発生するＧ２／Ｍ停止のマーカーである。ＳＦＮ遺伝子は、γ線照射またはアドリアマイシン（ドキソルビシンとしても知られている）を用いて処理した後ヒト腫瘍由来細胞系内でのＧ２／Ｍ停止中のｐ５３依存性メカニズムを介して転写的にアップレギュレートされることが証明されている［１］。ＳＦＮの発現は、その発現がＧ２／Ｍチェックポイントを通して進行を停止させると思われる点で、Ｇ２／Ｍ停止に機能的に関係していると思われる［１］。さらに、ＳＦＮプロモーターの転写活性化は、その転写活性化機能がＤＮＡ損傷によって活性化される腫瘍抑制因子タンパク質ＢＲＣＡ１に反応して発生する可能性がある［２］。ＳＦＮ誘導がｐ５３発現の変化に先行し［３］、そしてＢＲＣＡ１発現がｐ５３欠損ＨＣＣ１９３７細胞内でのＧ２／Ｍ停止およびＳＦＮ誘導のために必要かつ十分である［４］という事実は、この誘導経路がｐ５３非依存性であることを示している。そこで、ＤＮＡ損傷によるＳＦＮの誘導は、ｐ５３依存性経路およびｐ５３非依存性経路の両方を介して発生すると思われる［１、３、４］。
【００４８】
ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域が分泌性レポーターであるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）へ結合している人工遺伝子構築物を生成した。この構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系をインビトロで組み換えて試験した。これを次にインビボ異種移植片実験で使用して抗癌剤を用いた処理に反応したｈＣＧの排泄の変化を証明した。
【００４９】
ＳＦＮ−ｈＣＧ構築物の生成
このレポーター構築物は、Ｒｅｄ／ＥＴ相同遺伝子組み換え系（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ社）を利用して組み換えクローニング法を用いて構築した。
【００５０】
ＳＦＮのゲノムクローン（ｓｆｎ ＰＲＯＴＥＩＮ）は、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｓｅｍｂｌサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって後援されている）を用いて同定した。全コーディング領域およびプロモーターを含有するヒトＰＡＣクローンＲＰＣＩ−５０ｏ２４が同定され、正常調節のためには調節領域が必須であると見なされた。５’および３’ＵＴＲの両方を含有するＰＡＣクローンをさらにＰＣＲによって検証した。スクリーニングに使用したＳＦＮオリゴは以下のとおりであった。
４８，６７１−４８，６９０ｂｐをポジショニングするためのＳＦＮ検証用オリゴ
ＳＦＮ＿フォワード ＡＴＧ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＣＡ Ｃ（配列番号１）
ＳＦＮ＿リバース ＣＡＧ ＧＧＧ ＡＡＣ ＴＴＴ ＡＴＴ ＧＡＧ Ａ（配列番号２）
【００５１】
次に正確なＰＣＲ産物を生じたクローンを以下のとおりに処理した。検証したＰＡＣクローンはプラスミドｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡ（Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅｓ社）を用いて形質転換させた。このプラスミドは、組み換えプロセスのために必須のリコンビナーゼを提供する。ＰＡＣ／ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡクローンをさらに制限酵素分析によってｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡの存在について検証した。正確な制限酵素パターンを生じたクローンだけを使用した。
【００５２】
ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐターゲティング構築物の生成は下記のとおりに実施したが、しかし我々の試験結果はこの構築物がこのようなタグの不在下で有効であることを示しているので、この構築物が必ずしもｍｙｃなどのエピトープタグを含む必要はないことは理解されるであろう：ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐテンプレートは、事前にｐＸＥＮバックボーンの同等物上にクローニングされていた。これを消化し、直線状にして、バックグラウンドを減少させた。ターゲティング分子を生成するために以下のオリゴヌクレオチド（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ社）を使用した。
ＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ
ＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧ（配列番号３）
ＬＳ−ＳＦＮａｍｐ
ＴＡＧＣＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＴＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡ（配列番号４）
【００５３】
次の反応条件を使用した。３９．５μＬのｄＨ2Ｏ、５μＬの１０×Ｔｕｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）、２μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰＳ（Ｒｏｃｈｅ社）、１μＬのＵＳ−ＳＦＮｈＣＧ（１００ｐｍｏｌ）、１μＬのＬＳ−ＳＦＮａｍｐ（１００ｐｍｏｌ）、０．５μＬのＴｒｉｐｌｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）。
【００５４】
ＰＣＲブロック条件（ＭＷＧ）：９４℃で１分間×１サイクル、９３℃で３０秒間、５６℃で３０秒間×３０サイクル、７２℃で２分３０秒間、７２℃で５分間×１サイクル。このようにして生成した分子を図１に示した。
【００５５】
このＰＣＲにかけたターゲティング分子を、全ＰＣＲ反応上でＤｐｎ１消化を実施することによって（バックグラウンドをさらに減少させるために）処理した（これはテンプレートであるメチル化ＤＮＡを優先的に切断する）。消化したＰＣＲ反応物をエタノールで沈降させ、水に再懸濁させると、０．５μｇ／μＬの最終ＤＮＡ濃度が生じた。ＰＡＣ（ＲＰＣＩ−５Ｏｏ２４）を含有するｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡは下記のとおりに培養した。一晩の１ｍＬのＬＢ培養液（カナマイシン７０μｇ／ｍＬおよびテトラサイクリン３μｇ／ｍＬを添加した）を１０００ｒｐｍ（毎分回転数）で攪拌しながら３０℃で増殖させた。翌日、上記と同様に添加した３本の１．４ｍＬのＬｂ培養をセットし、３０μＬの一晩培養を接種し、攪拌しながら２時間にわたり３０℃で増殖させた。２時間後、３０μＬのＬ−アラビノース（１０％）を用いて２本の培養を誘導し、全細胞をさらに１時間にわたり攪拌しながら３７℃へ変化させた（これはリコンビナーゼを誘導し、ｐＳＣ１０１ＢＡＤプラスミドがそれ以上複製するのを停止させる）。得られた培養液は、さらに氷冷無菌水であれば１ｍＬ中で３回洗浄することによってエレクトロコンピテントにするために処理した。これらの細胞を次にＰＣＲにかけたターゲティング分子を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を３７℃の１ｍＬのＬＢブロスで７０分間にわたり回収した。回収した細胞はＬＢ選択寒天培地（カナマイシン７０μｇ／ｍＬおよびアンピシリン２０μｇ／ｍＬ）上にプレートアウトし、３７℃で一晩増殖させた。得られたコロニーを図２に示した組み換えＰＡＣの生成のための正確な組み換え事象についてスクリーニングし、制限酵素地図領域の詳細は図３に示した。
【００５６】
スクリーニング形態は、５’末端についてはｈＣＧおよびＳＦＮの接合部から３’末端についてはＡｍｐおよびＳＦＮの接合部にわたるＰＣＲであった。ポジティブクローンが同定されると、ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡプラスミドを組み換えＰＡＣ内に再導入し、以前に記載したとおりに検証した。次の段階では、１０Ｋｂの上流配列および一部の９Ｋｂの下流配列を用いてｐＡＣＹＣ１８４バックボーン上へ組み換えＳＦＮ遺伝子のサブクローニングを行った。これは再び、組み換えクローニングの使用により達成された。サブクローニング標的構築物は下記のオリゴを用いるＰＣＲを使用して生成した。
ＳＦＮサブクローニング用オリゴ
ＳＦＮサブクローン・フォワード
ＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣ（配列番号５）
ＳＦＮサブクローン・リバース
ＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＣＡＧＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡ（配列番号６）
【００５７】
ＰＣＲ条件は、使用したテンプレートが直線状ｐＡＣＹＣ１８４であることを除いて、以前に記載したとおりであった。ＰＣＲ産物は以前に記載したとおりに処理した。サブクローニングＳＦＮ標的構築物（ＳＦＮサブクローン中間体）は、図４に示したとおりに生成した。
【００５８】
ｐＳＣ１０１ＢＡＤｇｂａＡを含有する組み換えＳＦＮ ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐは、以前に記載したようにエレクトロコンピテントにし、ＳＦＮサブクローン中間体を用いてエレクトロポレーションした。結果として生じた形質転換物は、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン２０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ寒天プレート上にプレートアウトする前に１ｍＬのＬＢ中に回収した。潜在的形質転換物は多数の診断用制限酵素消化物を用いてスクリーニングし、正確な制限酵素パターンを提供することによって評価した。正確な制限酵素パターンを生じるクローンは、４００ｍＬの液体培養（１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加したＬＢブロス）を増殖させることによってバルク調製し、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキット（キットにに付いているプロトコールにしたがって）を用いてｍａｘｉｐｒｅｐした。最終構築物の制限酵素地図は図５に示した。
【００５９】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する細胞系の生成
前立腺腫瘍細胞系ＰＣ３は、インビトロで単層として増殖することができ、先天的無胸腺ヌードマウスにおいて異種移植片として増殖させると皮下腫瘍を形成するｐ５３-/-細胞系である。重要なことに、この細胞系は抗癌薬を用いた処理後にＧ２／Ｍ停止を受ける能力を有する［５］。
【００６０】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物は、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ社、イーストサセックス州ルイス）を用いて６ウェル組織培養プレート上のＰＣ３細胞内へトランスフェクトした。構築物ＤＮＡ（１μｇ／ウェルに相当する）をＦｕＧｅｎｅ試薬（３μＬ／ウェル）へ添加し、無血清含有培地を加えて１００μＬ／ウェルにした。その中で細胞が増殖している培地を吸引して除去し、１ウェル当たり１００μＬの上記混合液に交換した。一過性トランスフェクションのために、該構築物の添加２４時間後の細胞を実験のために使用した。
【００６１】
安定性細胞系を生成するために、上記のとおりにトランスフェクションを実施した。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、１０ｃｍ径組織培養皿（１０ｃｍ径の皿につき６ウェルプレート中の１ウェル）へ移した。細胞を選択前７日間にわたりこれらの皿上で増殖させた。この時点の後、Ｇ４１８（細胞培養培地中で２０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、培養皿はコロニーが目に見えるようになるまで（約１週間）維持した。トリプシン中に浸漬したクローニングディスクを用いて個々のコロニーを拾い、２４ウェルプレートのそれぞれのウェルへ移した。コロニーを次に６ウェルプレート、次にＴ２５フラスコで増殖させ、インビトロ誘導および異種移植片実験に使用するために十分な細胞が存在するようになるまで増殖させた。
【実施例１】
【００６２】
インビトロ実験の例示
エトポシドは、培養細胞中でＢＲＣＡ１結合メカニズムを介してＧ２／Ｍ停止を誘導することが知られている［６］。
【００６３】
構築物の添加２４時間後の一過性トランスフェクト細胞をエトポシド（５０μＭ）により処理した、または未処理で放置した。５０μＭエトポシドの存在下または不在下で２４時間後に、培地のサンプルを採取し、酵素結合免疫吸着検定法（Ｆｒｅｅ Ｂｅｔａヒト絨毛性性腺刺激ホルモンキット、Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国テキサス州）によってｈＣＧについてアッセイした。この実験の結果を図６に示した。
【００６４】
これは、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有するＰＣ３細胞が周辺培地中へｈＣＧを分泌すること、そしてさらに、細胞をエトポシド処理した場合は分泌量が増加することを証明している。
【００６５】
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する安定性細胞系の生成後に、細胞をさらにエトポシドを用いて試験した。細胞を６ウェルプレートにプレートアウトし、一晩おいて付着させた。翌日、それらはエトポシド（５０もしくは４００μＭ）または溶剤（ジメチルスルホキシド）を用いて処理した。エトポシドの存在下または不在下での２４時間後に、培地のサンプルを採取し、上記のとおりに酵素結合免疫吸着検定法によってｈＣＧについてアッセイした。この実験の結果を図７に示した。
【００６６】
これは、ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐ構築物を含有するように安定的に操作したＰＣ３細胞が周囲培地中にｈＣＧを分泌したことを証明している。一過性トランスフェクタント中と同様に、細胞をエトポシドを用いて処理した場合は分泌量が増加した。さらに、細胞を高濃度のエトポシドへ曝露させた場合には分泌されたｈＣＧの量が増加した（４００μＭ対５０μＭ）。
【実施例２】
【００６７】
インビボの異種移植片
ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を用いて安定的にトランスフェクトしたＰＣ３細胞を先天性無胸腺ヌードマウスにおける充実性皮下腫瘍として増殖させた。マウスを次に、Ｇ２／Ｍ停止を誘導することによって作用する抗癌薬を用いて処理した。この例証のために選択した薬物はエトポシドおよびカンプトテシンであった［１２］。
【００６８】
この実験のために、野生型ＰＣ３細胞（ｈＣＧを発現または分泌しない）およびＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐレポーター構築物を含有する安定性細胞系を使用した。
【００６９】
野生型および組み換えＰＣ３腫瘍細胞系は、１０％〜１５％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ培地中で培養した。ＰＣ３／ＳＦＮ細胞のための培養培地はさらにＧ４１８（２００μｇ／ｍＬ）を含有していた。培養液は３７℃、５％ ＣＯ2に設定した加湿培養器内でインキュベートした。細胞を採取し、プールし、遠心分離し、そして低温培地中に再懸濁させた。これを同等量の冷却マトリゲルと混合したので、腫瘍細胞注射溶液は、腫瘍細胞／培地と各細胞系に対するマトリゲルの５０：５０混合液であった。野生型もしくはトランスフェクトしたＰＣ３細胞を動物１匹当たり２．５×１０6で注射した。全細胞系を、右側腹部にのみ１００μＬの量で注射した。
【００７０】
試験群は、各々が動物４匹を含む計４群から構成されていた。１群のマウスには野生型ＰＣ３細胞を移植し、残り３群には遺伝子操作細胞を移植した。腫瘍増殖は、細胞移植後に腫瘍の径が２〜５ｍｍに達するまで週２回測定した。腫瘍容積（Ｖ）は式：Ｖ＝４／３π（（ｄｌ＋ｄ２）／４）3（式中、ｄ＝平均径（ｎ＝２））を用いて計算した。
【００７１】
処理は、腫瘍移植の５週間後に開始した。野生型ＰＣ３−異種移植マウスは未処理のままにした；その他全てのマウスには溶剤単独（ＤＭＳＯ／生理食塩水）または試験物質を投与した。カンプトテシン（３０ｍｇ／ｋｇ）およびエトポシド（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に１０ｍＬ／ｋｇで単回投与した。さらに、エトポシド（２５ｍｇ／ｋｇ）を連続３日間にわたり単一群のマウスに投与した（腹腔内；１０ｍＬ／ｋｇ）。薬物の投与前、投与中および投与後に尿サンプルを採取した。動物を処理４８時間後に致死させた。尿をｈＣＧについて分析し、数値は尿中クレアチニンレベルに対して標準化した。
【００７２】
野生型ＰＣ３細胞を注射したマウスの尿中では、腫瘍容積が大きかったにもかかわらずｈＣＧは検出されなかった（データは示していない）。これとは逆に、ｈＣＧはトランスフェクトＰＣ３細胞を注射したマウスの尿中で検出され、これはここで検出されたｈＣＧが異種移植腫瘍から発現したことを示唆していた。図８に示したように、腫瘍容積と尿中ｈＣＧレベルとの間には正相関が見られた。これは、腫瘍容積と標準化尿中ｈＣＧ発現との間に関係があることを示している。腫瘍容積が大きいほど、ｈＣＧ発現のレベルが高くなった。
【００７３】
標準化ｈＣＧレベルは、図９に示したように、マウスに賦形剤単独、４０ｍｇ／ｋｇのエトポシドもしくは３０ｍｇ／ｋｇのカンプトテシン各々の単回用量を投与したときに０．５４倍、４．２９倍および５．２９倍へ増加した。
【００７４】
エトポシドおよびカンプトテシンはどちらも、図１０に示したように、賦形剤コントロールと比較して個別マウスにおいてｈＣＧ発現を有意に増加させた。これは、異種移植腫瘍におけるｈＣＧ発現が、ＤＮＡ損傷が増加した結果として抗癌薬のエトポシドおよびカンプトテシンによって誘導されることを証明している。これは、投与前数値に比較して薬物投与の４８時間後には尿中でｈＣＧのレベル上昇が検出されたことによって証明された。
【００７５】
マウスに２５ｍｇ／ｋｇでエトポシドを連続３回投与し、そして尿サンプルを薬物の投与前、投与中および投与後に採取した。第１回投与後には、標準化ｈＣＧ発現の急増が生じたが、試験物質の第２回投与後にはこのレベルにとどまっていた。その後のｈＣＧのレベルは、エトポシドの第３回投与の２４時間後および４８時間後にはコントロールレベルへ低下した。この例は図１１に示した。エトポシドの連続３回の投与後のｈＣＧレベルの低下は、ＤＮＡ損傷の結果としての細胞死が腫瘍の内部で発生していたことを示した。これは、エトポシドがＰＣ３／ＳＦＮ細胞に対する抗腫瘍作用を呈示し、それによってｈＣＧ発現癌細胞の数を減少させ、ｈＣＧ尿中レベルの減少を生じさせることを示唆した。
【００７６】
［文献］
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）：Ａｍｐターゲティング構築物の生成を示す。
【図２】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）：ＰＡＣクローンを示す。
【図３】図２の制限酵素地図の詳細を示す。
【図４】ＳＦＮサブクローン中間体の生成を示す。
【図５】最終構築物の制限酵素地図を示す。
【図６】一過性に感染したＰＣ３細胞中でのエトポシドによるｈＣＧの誘導を示す。
【図７】ＳＦＮ−ｈＣＧ（ｍｙｃ）−Ａｍｐ構築物を含有するように安定的に操作されたＰＣ３細胞中でのエトポシドによるｈＣＧの誘導を示す。
【図８】腫瘍容積と標準化尿中ｈＣＧ発現（投与前）との関係のグラフを示す。
【図９】投与４８時間後の腫瘍容積に比較した標準化尿中ｈＣＧ発現を示す。
【図１０】個別マウスの投与４８時間後の腫瘍容積に比較した標準化尿中ｈＣＧ発現を示す。
【図１１】２５ｍｇ／ｋｇ（エトポシド）を連続３回投与された単一マウスにおける標準化尿中ｈＣＧレベルを示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト宿主動物における異種移植片の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）細胞を動物に移植する前もしくは後に、少なくとも１つのレポーター分子および／またはレポーター遺伝子および／またはレポーター物質を前記細胞に組み込むことができるように、前記細胞を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作するステップと、
（ｉｉ）前記組み換え細胞を前記宿主動物に移植し、異種移植片を十分な期間にわたり増殖させるステップと、および
（ｉｉｉ）前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子に関連する選択された生化学的／生理的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップと、を含む方法。
【請求項２】
ヒトもしくは非ヒト起源である複数の遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が正常組織もしくは腫瘍由来の一次分離株である、または不死化もしくは株化細胞系である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター分子が、タンパク質、抗原、酵素、酵素基質、蛍光物質、化学発光物質、色素物質または放射性核種からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子が、タンパク質であるクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）をコードする遺伝子から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター物質がプロテアーゼもしくはキナーゼである、または前記レポーターがタンパク質もしくはｍＲＮＡ安定化における変化を生じさせるタンパク質もしくはＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主動物が齧歯類である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記齧歯類が、特別に選択された遺伝的背景を有する野生型もしくは遺伝子操作マウスもしくはラットである、請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主動物がその中に移植されたレポーター細胞／系の２つ以上の相違する集団を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップを含むステップが定性的もしくは定量的測定を含み、さらにそのようなデータを確証するために侵襲性方法または非侵襲性方法を含んでいてよい、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種移植片が続発部位での転移性腫瘍を伴う、または伴わない異種移植腫瘍として増殖させられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記移植組み換え細胞が、適切な培地中に懸濁させた個別細胞または腫瘍フラグメントのいずれかとして宿主動物に導入される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記移植された組み換え細胞が、全身性で、または移植部位での異種移植腫瘍のいずれかとして宿主動物内で増殖させられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主動物が、適切な免疫抑制剤の投与によって免疫抑制されている、または免疫不全系統である、または免疫学的に正常であるいずれかであり、前記移植組み換え細胞が前記宿主動物と同遺伝子型である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター細胞／系が、１つもしくは複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター細胞／系が移植時点に１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質を発現する、または特別に対象を定めた方法で前記１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質を用いてインビボでトランスフェクトされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質が、レポーター細胞／系の増殖中に発生する細胞生理機能の変化、または投与された生体異物化合物もしくは生物学的物質の毒性効果もしくは薬理効果の結果としての細胞生理機能の変化のいずれかに反応して生化学的パラメーターの測定を可能する少なくとも１つのエレメントを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップが、下記のパラメーター、
ａ）レポーター細胞数、細胞周期の変調もしくは有糸分裂分画、細胞分化、血管形成、低酸素状態、壊死による細胞死、細胞溶解もしくはアポトーシス、
ｂ）酸化的ストレス、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア機能、膜摂動、ＧＳＨ枯渇、受容体媒介毒性、酵素阻害、補因子有効性、ｐＨもしくは浸透圧の変化、カルシウムホメオスタシスの摂動、細胞分化、タンパク質の代謝回転、ユビキチン化またはタンパク質のミスフォールディング、
ｃ）細胞内シグナリング経路、受容体相互作用に及ぼす作用、遺伝子転写、翻訳もしくはタンパク質安定性、ホルモンもしくは成長因子受容体の変調、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の変調、細胞内シグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼもしくはホスファターゼシグナリング、ｐ５３シグナリングまたはｒａｓシグナリングに及ぼす作用、および
ｄ）薬物耐性のメカニズム、薬物送達もしくは薬物バイスタンダー効果の誘導、
のいずれか１つ以上を測定もしくはモニタリングするステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子が、レポータータンパク質の産生を引き起こす遺伝子の発現を促進する天然もしくは人工プロモーター配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが構成的に活性である、または誘導性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のレポーター遺伝子発現産物が転写または転写後に報告可能である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
転写的報告が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、一酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）プロモーター、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター、トランスグルタミナーゼプロモーター、Ｐｅｇ３／ｐｗｌプロモーター、１４−３−３タンパク質プロモーターまたはＧＡＤＤ１５３プロモーターを含む群から選択される遺伝子プロモーターのいずれか１つによって媒介される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
転写後報告が、例えば細胞質タンパク質の核への移行、もしくは膜結合形から分泌形への転位を引き起こすプロテアーゼ活性の結果としてタンパク質修飾をもたらすタンパク質の生成を通して、あるいはプロエンザイムもしくは転写調節因子の活性化、または活性酵素もしくは転写調節因子の不活性化または血液中への分泌もしくは尿中への排泄のタンパク質開裂を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
転写後報告が、タンパク質もしくはｍＲＮＡの安定化における変化をもたらすタンパク質もしくはＲＮＡの産生を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
転写後報告が、タンパク質を発現する細胞が死ぬかもしくは溶解する際に分泌もしくは排出されるタンパク質、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼの産生を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップが非侵襲性もしくは侵襲性アッセイのいずれかによって行われ、
（ｉ）前記非侵襲性アッセイが、排出された身体生成物中において、または生物発光測定、血圧測定、経皮的動脈血酸素分圧測定、核磁気共鳴測定、またはポジトロン放射断層撮影測定によって行われる、または
（ｉｉ）侵襲性アッセイが血液もしくは異種移植レポーター生成物に対して行われる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法によって生成される、遺伝子組み換え細胞もしくは遺伝子操作細胞を含む生成物であって、前記細胞が少なくとも１つのレポーター分子もしくはレポーター遺伝子を含むように前記細胞が組み換えもしくは操作されている生成物。
【請求項２９】
請求項２から２７に記載されたいずれか１つ以上の特徴をさらに含む、請求項２８に記載の生成物。
【請求項３０】
ＳＦＮ遺伝子のプロモーター領域およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含む人工遺伝子構築物であって、ｈＣＧの発現が前記ＳＦＮプロモーターによって制御される構築物。
【請求項３１】
前記ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域がｈＣＧへ結合している、請求項３０に記載の構築物。
【請求項３２】
請求項３０または３１の構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系。
【請求項３３】
請求項３２に記載のヒト腫瘍由来細胞系を含有する非ヒト動物。
【請求項３４】
以下の状態、
ａ）特に、限定はされないが、異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生したときの、または処理に反応したレポーター細胞の増殖を測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した際の分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違する場合に続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞／系における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞と比較した分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で腫瘍細胞増殖または処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーター分子もしくは遺伝子を用いて力学的測定を行うステップと、および
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、それにより薬物を取り込む細胞を決定するステップと、および
ｋ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、のいずれか１つ以上における、請求項１に記載の方法または請求項２８または３０に記載の生成物の使用。
【請求項３５】
請求項２８または２９のいずれかに規定した少なくとも１つのレポーター細胞／系を備える生成物および任意選択的にそのための１組の取扱説明書を含むキット。
【請求項３６】
前記生成物がレポーター細胞の懸濁液として供給される、請求項３５に記載のキット。
【請求項１】
非ヒト宿主動物における異種移植片の進行をモニタリングする方法であって、
（ｉ）細胞を動物に移植する前もしくは後に、少なくとも１つのレポーター分子および／またはレポーター遺伝子および／またはレポーター物質を前記細胞に組み込むことができるように、前記細胞を遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作するステップと、
（ｉｉ）前記組み換え細胞を前記宿主動物に移植し、異種移植片を十分な期間にわたり増殖させるステップと、および
（ｉｉｉ）前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子に関連する選択された生化学的／生理的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップと、を含む方法。
【請求項２】
ヒトもしくは非ヒト起源である複数の遺伝子組み換えもしくは遺伝子操作細胞が提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が正常組織もしくは腫瘍由来の一次分離株である、または不死化もしくは株化細胞系である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター分子が、タンパク質、抗原、酵素、酵素基質、蛍光物質、化学発光物質、色素物質または放射性核種からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子が、タンパク質であるクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは緑色蛍光タンパク質、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、主要尿タンパク質（ＭＵＰ）またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）をコードする遺伝子から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レポーター物質がプロテアーゼもしくはキナーゼである、または前記レポーターがタンパク質もしくはｍＲＮＡ安定化における変化を生じさせるタンパク質もしくはＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主動物が齧歯類である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記齧歯類が、特別に選択された遺伝的背景を有する野生型もしくは遺伝子操作マウスもしくはラットである、請求項７または８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主動物がその中に移植されたレポーター細胞／系の２つ以上の相違する集団を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップを含むステップが定性的もしくは定量的測定を含み、さらにそのようなデータを確証するために侵襲性方法または非侵襲性方法を含んでいてよい、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種移植片が続発部位での転移性腫瘍を伴う、または伴わない異種移植腫瘍として増殖させられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記移植組み換え細胞が、適切な培地中に懸濁させた個別細胞または腫瘍フラグメントのいずれかとして宿主動物に導入される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記移植された組み換え細胞が、全身性で、または移植部位での異種移植腫瘍のいずれかとして宿主動物内で増殖させられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主動物が、適切な免疫抑制剤の投与によって免疫抑制されている、または免疫不全系統である、または免疫学的に正常であるいずれかであり、前記移植組み換え細胞が前記宿主動物と同遺伝子型である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター細胞／系が、１つもしくは複数の導入遺伝子を発現するように遺伝子操作されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記レポーター細胞／系が移植時点に１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質を発現する、または特別に対象を定めた方法で前記１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質を用いてインビボでトランスフェクトされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上のレポーター遺伝子もしくはレポーター物質が、レポーター細胞／系の増殖中に発生する細胞生理機能の変化、または投与された生体異物化合物もしくは生物学的物質の毒性効果もしくは薬理効果の結果としての細胞生理機能の変化のいずれかに反応して生化学的パラメーターの測定を可能する少なくとも１つのエレメントを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップが、下記のパラメーター、
ａ）レポーター細胞数、細胞周期の変調もしくは有糸分裂分画、細胞分化、血管形成、低酸素状態、壊死による細胞死、細胞溶解もしくはアポトーシス、
ｂ）酸化的ストレス、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア機能、膜摂動、ＧＳＨ枯渇、受容体媒介毒性、酵素阻害、補因子有効性、ｐＨもしくは浸透圧の変化、カルシウムホメオスタシスの摂動、細胞分化、タンパク質の代謝回転、ユビキチン化またはタンパク質のミスフォールディング、
ｃ）細胞内シグナリング経路、受容体相互作用に及ぼす作用、遺伝子転写、翻訳もしくはタンパク質安定性、ホルモンもしくは成長因子受容体の変調、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体の変調、細胞内シグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼもしくはホスファターゼシグナリング、ｐ５３シグナリングまたはｒａｓシグナリングに及ぼす作用、および
ｄ）薬物耐性のメカニズム、薬物送達もしくは薬物バイスタンダー効果の誘導、
のいずれか１つ以上を測定もしくはモニタリングするステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子が、レポータータンパク質の産生を引き起こす遺伝子の発現を促進する天然もしくは人工プロモーター配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが構成的に活性である、または誘導性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のレポーター遺伝子発現産物が転写または転写後に報告可能である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
転写的報告が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、一酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）プロモーター、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）プロモーター、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）プロモーター、トランスグルタミナーゼプロモーター、Ｐｅｇ３／ｐｗｌプロモーター、１４−３−３タンパク質プロモーターまたはＧＡＤＤ１５３プロモーターを含む群から選択される遺伝子プロモーターのいずれか１つによって媒介される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
転写後報告が、例えば細胞質タンパク質の核への移行、もしくは膜結合形から分泌形への転位を引き起こすプロテアーゼ活性の結果としてタンパク質修飾をもたらすタンパク質の生成を通して、あるいはプロエンザイムもしくは転写調節因子の活性化、または活性酵素もしくは転写調節因子の不活性化または血液中への分泌もしくは尿中への排泄のタンパク質開裂を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
転写後報告が、タンパク質もしくはｍＲＮＡの安定化における変化をもたらすタンパク質もしくはＲＮＡの産生を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
転写後報告が、タンパク質を発現する細胞が死ぬかもしくは溶解する際に分泌もしくは排出されるタンパク質、例えばアラニンアミノトランスフェラーゼの産生を通して媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター分子もしくはレポーター遺伝子もしくはレポーター物質に関連する選択された生化学的／生理学的反応の少なくとも１つのパラメーターを測定するステップが非侵襲性もしくは侵襲性アッセイのいずれかによって行われ、
（ｉ）前記非侵襲性アッセイが、排出された身体生成物中において、または生物発光測定、血圧測定、経皮的動脈血酸素分圧測定、核磁気共鳴測定、またはポジトロン放射断層撮影測定によって行われる、または
（ｉｉ）侵襲性アッセイが血液もしくは異種移植レポーター生成物に対して行われる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法によって生成される、遺伝子組み換え細胞もしくは遺伝子操作細胞を含む生成物であって、前記細胞が少なくとも１つのレポーター分子もしくはレポーター遺伝子を含むように前記細胞が組み換えもしくは操作されている生成物。
【請求項２９】
請求項２から２７に記載されたいずれか１つ以上の特徴をさらに含む、請求項２８に記載の生成物。
【請求項３０】
ＳＦＮ遺伝子のプロモーター領域およびヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を含む人工遺伝子構築物であって、ｈＣＧの発現が前記ＳＦＮプロモーターによって制御される構築物。
【請求項３１】
前記ＳＦＮ遺伝子の５’調節プロモーター領域がｈＣＧへ結合している、請求項３０に記載の構築物。
【請求項３２】
請求項３０または３１の構築物を含有するヒト腫瘍由来細胞系。
【請求項３３】
請求項３２に記載のヒト腫瘍由来細胞系を含有する非ヒト動物。
【請求項３４】
以下の状態、
ａ）特に、限定はされないが、異種移植片の増殖中もしくは分化中もしくは死が発生したときの、または処理に反応したレポーター細胞の増殖を測定するステップと、
ｂ）レポーター細胞の分化もしくは死が発生した際の分化もしくは死のメカニズムを決定するステップと、
ｃ）これらが反応において一次レポーター細胞異種移植片とは相違する場合に続発性転移腫瘍におけるプロセスをモニタリングするステップと、
ｄ）レポーター細胞／系における生化学的プロセスに関連するパラメーターの非侵襲性測定を行うステップと、
ｅ）例えば、非分裂細胞と比較した分裂細胞に対して、または正常酸素状態細胞と対照的に低酸素状態細胞に対して、薬物の特異的毒性から発生する薬物耐性細胞集団を同定するステップと、
ｆ）例えばｐ５３を発現する、および発現しない細胞中で腫瘍細胞増殖または処理に対する反応に遺伝的背景が及ぼす影響を決定するステップと、
ｇ）半減期の短い、もしくは排泄されるレポーター分子もしくは遺伝子を用いて力学的測定を行うステップと、および
ｈ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、
ｉ）薬物バイスタンダー効果を測定するステップ、および遺伝的調節に含まれるプロモーターエレメントを同定するステップと、
ｊ）細胞内薬物濃度を決定し、それにより薬物を取り込む細胞を決定するステップと、および
ｋ）インビボの薬物作用の標的を決定または確認するステップと、のいずれか１つ以上における、請求項１に記載の方法または請求項２８または３０に記載の生成物の使用。
【請求項３５】
請求項２８または２９のいずれかに規定した少なくとも１つのレポーター細胞／系を備える生成物および任意選択的にそのための１組の取扱説明書を含むキット。
【請求項３６】
前記生成物がレポーター細胞の懸濁液として供給される、請求項３５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５２２５９８（Ｐ２００６−５２２５９８Ａ）
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６１０２（Ｐ２００６−５０６１０２）
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１５４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０５３２
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３７９７９９）シーエックスアール・バイオサイエンシズ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１５４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０５３２
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３７９７９９）シーエックスアール・バイオサイエンシズ・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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