病原体を制御するためのアミノ酸及び核酸配列
本発明は、抗病原体タンパク質をコードしている、ニコチアナ・メガロシホン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）由来の核酸配列に関する。本発明は、病原体に対する抵抗性を示す農学的に興味深いトランスジェニック植物の入手における、この核酸分子の使用にも関する。本発明はさらに、植物病原体を制御するための、この抗病原体タンパク質を含有するバイオプロダクトに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に、具体的には、病原物質の制御における抗病原体タンパク質の使用に関する。抗病原体タンパク質を、遺伝子組換え植物内で発現させることによって、又はバイオプロダクトとして適用すると、植物病原物質によって生じる疾患について高レベルの制御が得られる。
【背景技術】
【０００２】
植物の抗病原体タンパク質は、ダイコン、タマネギ、ウマゴヤシ、コショウ、ジャガイモ及びダイズなどの作物由来の葉、葉鞘、根、塊茎、幹、果実及び花から単離されてきた。抗病原体タンパク質は、生化学及び構造レベルで研究されており、これらはおよそ５ＫＤａであり、４５〜５４個のアミノ酸を有し、システインに富み、高塩基性で正電荷を持つ小さなペプチドである。植物の抗病原体タンパク質のファミリーは、構造を安定化する８個のシステインのみが保存されていると思われるため、アミノ酸組成に関して多様である。この特徴は、種々の植物の抗病原体タンパク質によって示される多様な生物活性を表している（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３−８）。
【０００３】
植物の抗病原体タンパク質は、タンパク質前駆体の構造によって２つのグループに分けることができ、第１のグループにおいて、タンパク質前駆体は、小胞体由来のシグナルペプチド及び成熟タンパク質領域によって構成されている。このタンパク質は、分泌通路に入り、転写後プロセスのシグナルを有さない。第２のグループにおいて、抗病原体タンパク質は、シグナルペプチドと成熟領域に加えて、およそ３３アミノ酸からなるＣ末端前領域を含有する長い前駆体によって形成される。これまでのところ、これらの抗病原体タンパク質は、ナス科各種においてのみ発見されている（Ｌａｙ ｙ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００５）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ． ６：８５−１０１）。植物の抗病原体タンパク質の全てが同じ作用を有するのではなく、その一部はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、幅広い糸状菌に対してマイクロモル濃度で潜在的活性を示し、他のものは真菌の増殖を阻害しないが、α−アミラーゼ及び合成のタンパク質を阻害する（Ｃｏｌｉｌｌａ ｅｔ ａｌ（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７０：１９１−１９４）。
【０００４】
Ｓｈａｉ−Ｍａｔｓｕｚａｋｉ−Ｈｕａｎｇモデルは、大部分の抗病原体タンパク質の活性について説明しており、これは、細胞膜中に正電荷を持つタンパク質が挿入されたために、その正電荷を持つタンパク質と負電荷を持つ標的細胞表面のリン脂質の相互作用が起こった後、原形質膜の内部で多量体の孔形成を引き起こす脂質置換が伴う、ペプチドと原形質膜の相互作用について説明しており、これらの多量体の孔は電位依存性イオン透過チャンネルを構成する（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔａ ２１６：１９３−２０２）。
【０００５】
別のモデルは、多くの抗病原体タンパク質は、細胞質膜の透過処理によってだけではなく、細胞質標的を用いることによってもその作用を生じ、これらのタンパク質は、一旦標的細胞の内部に入ると、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成、リボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質に影響を及ぼすという理論に基づいている。このことは、細胞質膜の透過処理を引き起こす陽イオン性タンパク質の能力は、作用機構の主要な原因ではなく、細胞内標的の探索法であり得ることを示唆している（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【０００６】
これまでのところ、多くの種類の抗病原体タンパク質が同定及び特徴付けされており、それらの適用可能性は、遺伝子工学によって細胞ツール及び分子ツールによる植物の疾患に対する抵抗性戦略がもたらされるために、多様である（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。ダイコンの抗病原体タンパク質の構成的な発現により、葉の病原体タバコ赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓ）に対するタバコの抵抗性が増大し（Ｔｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：５７３−５８８）、これは同様にアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）を有するトマト植物においても起こることが実証された。また、抗病原体タンパク質の構成的な発現によって、圃場条件下でジャガイモ作物において、農学的に重要な真菌バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）に対する高い抵抗性がもたらされる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１３０７−１３１０）。
【０００７】
一方、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）種及びＢ．カムペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種の抗病原体タンパク質の遺伝子を発現しているイネ植物を改変して種々の位置にあるアミノ酸を置換し、亜熱帯及び熱帯諸国において非常に重要な疾患であるイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）に対する抵抗性を求めているイネ植物に個々に導入した。これらの抗病原体タンパク質により両方の疾患に対する有効な抵抗性が付与され、これらの遺伝子を改変することによってトランスジェニックイネにおける幅広い抵抗性が増大した（Ｋａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＡＲＱ ３７：７１−７６）。
【０００８】
病原体の攻撃による作物の損失を減少させるための代替として植物の抗病原体タンパク質を適用することは、化学殺菌剤の適用に関しては有利になる。第１に、植物の抗病原体タンパク質は、宿主植物に対して、そしてこれらの植物由来産物を消費する人々に対しても毒性がない天然物質を構成するように、種子、根及び塊茎から得られる。第２に、他のタンパク質と同様に、抗病原体タンパク質は、天然物質のように急速に分解され、それらの有効性が切れた後には何の残渣も残らない（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【０００９】
多剤耐性株の発生及び日和見病原体として認識されている酵母と同様糸状菌種の新規各種の出現に加えてＡＩＤＳ、癌及び臓器移植などの疾患のために免疫低下した患者の増加が過去数十年で増大しており、常に真核病原体の制御についてが医学における主要な問題の一つとなっているため、植物の抗病原体タンパク質は、抗真菌薬の開発に用いることもできる（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【００１０】
哺乳動物の細胞と病原体の細胞との間に類似性があるため、抗真菌化合物は、細胞壁の成分及び病原性因子のような、哺乳動物の細胞に存在しない又はめったに存在しない分子に作用すべきであり、また、抗真菌化合物は、できる限り天然で、幅広い作用スペクトルを有し、製造が容易で耐性を誘発しない製品であるべきである（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，３８：３３５−３４７）。一方、真菌の細胞膜は、スフィンゴ脂質のような真菌膜成分が哺乳動物の細胞と構造的に異なるため、これらの薬剤を開発するための魅力的な標的である。植物の抗病原体タンパク質の標的は、真菌の膜の透過処理を引き起こす自己のスフィンゴ脂質であるため、植物の抗病原体タンパク質は、スフィンゴ脂質の生合成を標的とするのではなく、完全に逆に作用する。これにより高い選択性がもたらされ、したがって、真菌の感染に対する治療について興味深い展望がもたらされる。植物の抗病原体タンパク質の一部は、ヒトにおいて臨床的に非常に興味深い病原体であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対してマイクロモル濃度で活性があるＤｍ−ＡＭＰ１、Ｈｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２として見出されており、治療法を開発するためのこの種の植物タンパク質の可能性の一例となっている（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解決するべき重要な問題は、農学及び医学における非常に重要な側面である、広範囲の真菌病原体及び細菌病原体を効率的に制御することができるタンパク質を起源とする抗病原体製品を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記の問題の解決に寄与し、ニコチアナ・メガロシホン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）から単離した新規の抗病原体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号６）を提供する。本発明のヌクレオチド配列は、いくつかの病原物質に著しい効果を有するシステインに富む小さなタンパク質をコードしている。
【００１３】
ａ）配列番号６として特定されるアミノ酸配列、又はｂ）配列番号６として特定されるアミノ酸に対して１個又は数個のアミノ酸残基が除去、置換及び付加されており、病原物質による感染を制御する特性を維持しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸も、本発明の対象である。
【００１４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子は、いくつかの病原物質に対して植物の抵抗性レベル及び防御力を向上させるために使用する。したがって、本発明は、配列番号６の抗病原体タンパク質の構成的発現又は誘発された発現を導く、配列番号１の核酸を用いた植物の遺伝的形質転換により、病原物質によって引き起こされる植物疾患に対する抵抗性を増大させる方法を含む。
【００１５】
本発明の対象の核酸分子は、植物の形質転換に使用することができる。好ましい実現化において、抗病原体タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、下記の植物各種の形質転換に用いることができる：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、モロコシ（ｂｉｃｏｌｏｒ Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ属サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー属各種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｎｕｔｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ｐｉｎｅａｐｐｌｅｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、ミカン属各種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃｏｃｏａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バショウ属各種（Ｍｕｓｅ ｓｐｐ．）、アボカド（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｒｓｅａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ属各種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ属各種（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ属各種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュマツ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（ｐｏｎｄｅｒｏｕｓ Ｐｉｎｕｓ）、ロッジポールマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）。
【００１６】
本発明は、抗病原体タンパク質を産生する農学的に興味深い植物を得るために、さまざまな方法において使用することができる。このようにして、抗病原体タンパク質をコードしている核酸配列（配列番号１）は、農学的に興味深い植物に導入されるプロモーターと組み合わせて用いることができる。抗病原体タンパク質を高レベルで発現させるために、構成的プロモーターを用いることができる。他の形態において、抗病原体タンパク質をコードしている配列を操作し特異的なプロモーターに融合させて、病原体に対して感受性がある植物の特定の組織中での発現を誘導することができる。本発明の別の対象は、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明において抗病原体タンパク質と称するこれらのポリペプチドはいずれも病原物質に対する生物活性を有する。本発明の別の対象は、配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド又は抗病原体タンパク質は、組換え法又は化学合成で得られる。本発明の抗病原体タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術によって種々の宿主系において発現させ、そこから単離することができる。本発明の具体化において、抗病原体タンパク質は、酵母において発現させることができる。好ましい実現化において、ＤＮＡ組換え法のための発現は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、好ましくは培養からの上清において行う。宿主から開始して、タンパク質単離の技法を利用して本発明のポリペプチドを得ることができる。精製プロセスは、免疫酵素、クロマトグラフィー、細胞沈殿、及び実際に公知のプロセスを用いて実現することができる。
【００１８】
安定化ペプチドと融合させたアミノ酸配列（配列番号６）の変異型又は宿主のある一定の区画で発現を誘導し、分子について実証された生物活性を維持しているアミノ酸配列（配列番号６）の変異型も、本発明の対象である。一例が、配列が配列番号７で表示される融合タンパク質である。病原物質に対する制御活性を保持している、配列番号８及び配列番号９のような配列表で特定されている抗病原体タンパク質断片も本発明の対象である。本発明の別の態様は、配列番号６、配列番号７として特定される、病原物質を制御するためのバイオプロダクト又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドである。
【００１９】
本発明において、これらの抗病原体タンパク質は、初めて、その使用により良い公共認識と少ない規制上の要件がもたらされるよう、高安定性及び低濃度で、病原物質によって起こる主要な植物疾患に対する高防御レベルを付与するバイオプロダクトに用いられる。本発明の抗病原体タンパク質を含有するバイオプロダクトにより、真菌及び細菌に対するこれまで報告されていない高防御レベルが生じる。バイオプロダクトを実現するために、抗病原体タンパク質は、懸濁液、溶液、エマルション、粉末、顆粒、乳剤、エアロゾル、含浸体、アジュバント顆粒、ペースト（ｐａｓｔｕｒｅ）によって、又はカプセル化によって調剤することができる。本発明の実現化において、バイオプロダクトは、遺伝子形質転換された宿主から精製されたポリペプチドを含有する、又は、この宿主の培養物の上清中に含有されたポリペプチドが直接使用される。好ましい実現化において、宿主はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００２０】
本発明の具体化において、特許請求した配列を有する抗病原体タンパク質、並びにそれらを含有するバイオプロダクトを、下記の多種多様な病原体を制御するために初めて使用することができる：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）［（アルテルナリア・ブラシコ−ラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）；アルテルナリア・ソラニ；黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）］；サトウキビ眼点病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ）；ボツリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）［セルコスポラ・キクチイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）；セルコスポラ・ゼアエ−マイディス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚａｅａ−ｍａｙｄｉｓ）；セルコスポラ・メジカギニス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）；セルコスポラ・ソジナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ）；セルコスポラ・ソルギ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ）］；クラドスポリウム・フルバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｎ）；コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）［コレトトリカム・リンデムチアナム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）；コレトトリカム・デマティウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｍａｔｉｕｍ）；コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）］、ディプロディア・マイディス（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｍａｙｄｉｓ）；エリシフェ属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）［エリシフェ・グラミニス 品種グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）；エリシフェ・グラミニス品種ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）］；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）［フザリウム・ニバレ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）；フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）；フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）；フザリウム・モニリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）；フザニウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］；ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）［ヘルミントスポリウム・ツルシクム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）；ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ）；ヘルミントスポリウム・マイディス（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｙｄｉｓ）］；イネいもち病菌；マイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｇｅｎｓｉｓ）；ツユカビ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）［ダイズべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ）；タバコべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ）］；フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ）；フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）［フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）；フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）；フィトフトラ・ファセオリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ）；フィトフトラ・パラシティカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）；フィトフトラ・シトロフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ）、フィトフトラ・メガスペルマ 品種ソジャエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ．ｓｐ． ｓｏｊａｅ）；ジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］、プシニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）［プシニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）；プシニア・ストリホルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）；プシニア・グラミニス 品種トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）；プシニア・アスパラギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｓｐａｒａｇｉ）；プシニア・レコンディタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）；プシニア・アラチディス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｒａｃｈｉｄｉｓ）；プシニア・メラノセファラ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ）］、フハイカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）［フィチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）；フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）］；イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）；リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）；リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）］；スセロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ）；スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）［セプトリア・リコペルシシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）；セプトリア・グリシネス（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）；セプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）］；チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）；ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）［トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）；ウスチラゴ・スシタミネア（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）］；バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）［バーティシリウム・ダーリエ；バーティシリウム・アルボアトルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ）］；シュードモナス・シリンガエ グリシネア型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐ．ｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）；キサントモナス・カムペストリス ファセオリ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）；キサントモナス・カムペストリス アルファルファエ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ａｌｆａｌｆａｅ）；キサントモナス・カムペストリス トランスルセンス型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）；シュードモナス・シリンガエ シリンガエ型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐ．ｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）；エルウィニア・カロトボルム カロトボラ型（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｐ．ｖ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）；エルウィニア・ステワルティ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）；クラビバクター・ミチガネンセ ネブラスケンセ亜種（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．Ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ）；シュードモナス・アベナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ）；エルウィニア・クリサンテミ ゼア型（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐ．ｖ．ｚｅａ）；エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）；キサントモナス・カムペストリス ホルシコラ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｈｏｌｃｉｃｏｌａ）、シュードモナス・アンドロポゴニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）及びシュードモナス・アベナエ。好ましい実現化において、バイオプロダクトは、植物の真菌を制御するのに有効である。本発明の具体化において、ポリペプチドは、１〜９μｇ／ｍｌの濃度範囲でバイオプロダクト中に含まれる。
【００２１】
配列番号６、配列番号７で特定されるポリペプチド又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドを含むバイオプロダクトを植物に適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法も、本発明の一部である。本発明の別の具体化において、植物病原物質を制御する方法は、本発明のバイオプロダクトをバイオ農薬と組み合わせて適用することを特徴とする。病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させるために、配列番号１の核酸配列又は配列番号１由来の核酸配列を用いて遺伝子改変された植物（トランスジェニック植物）も本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】植物（図１Ａ）及び酵母（図１Ｂ）において、対象の抗病原体タンパク質を発現ベクターにクローニングする戦略を示す図である。
【図２】サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファ因子由来のシグナルペプチドに融合させたｐＰＩＣ９Ｋベクターを用いた、ピキア・パストリスにおける抗病原体タンパク質の発現を示す図である。Ｐ．パストリスの上清（Ａ）及び精製画分（Ｂ）における抗病原体タンパク質の産生。
【図３】トランスジェニック植物における抗病原体タンパク質の構成的発現の試験及び疾患抵抗性の評価を示す図である。この図は、対照試料及び抗病原体タンパク質を発現しているトランスジェニッククローンにおける、疾患の症状がある葉及び茎の割合を示している。（図３Ａ）タバコの葉に対するペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｙｏｓｃｙａｍｉ ｆ．ｓｐ．ｔａｂａｃｉｎａ）の影響。（図３Ｂ）ジャガイモの葉に対するアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｏｌａｎｉ）の影響。（図３Ｃ）タバコの茎に対するフィトフトラ・パラシティカの影響。（図３Ｄ）ジャガイモの葉に対するジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の影響。図の棒線は、ａ．接種した対照、ｂ．接種していない対照、ｃ．クローン１．１、ｄ．クローン１．２、ｅ．クローン１．３を示す。
【図４】種々の濃度のいくつかの植物病原体に対する抗病原体タンパク質の活性の試験を示すグラフである。このグラフは、種々の濃度の、アルファ因子のシグナルペプチドに融合した抗病原体タンパク質（Ａ）及びシグナルペプチドなしで合成した抗病原体タンパク質（Ｂ）で処理した病原体由来の液体培地における増殖阻害の割合を示している。図４Ｂの凡例：□アルファ因子のシグナルペプチドに融合させたタンパク質の、ジャガイモ疫病菌に対する効果、◆シグナルペプチドなしのタンパク質の、ジャガイモ疫病菌に対する効果、■対照。
【図５】抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２製剤の、土壌中の病原体（Ａ）及び空気中の病原体（Ｂ）に対する制御効果の試験を示すグラフである。図の棒線は、■対照植物、□殺菌剤で処理した植物、◆抗病原体タンパク質製剤で処理した植物を示す。
【図６】ジャガイモ疫病菌に対する抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２断片の生物活性を示すグラフである。□ジャガイモ疫病菌に対する配列番号８のペプチドの効果、◆ジャガイモ疫病菌に対する配列番号９のペプチドの効果。
【実施例】
【００２３】
（例１）
植物材料の調製、ニコチアナ・メガロシホンからの、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２をコードしているＤＮＡの単離及びクローニング
Ｎ．メガロシホン（Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）種を、ブラッククラウド（ｂｌａｃｋ ｃｒｏｗｄ）とコメの殻を４：１の比率で含有する６インチのポットで生長させ、２３℃の温室条件下で維持した。ハバナのタバコ畑で採取したペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナの単離体を接種に用いた。接種は、６週齢のこの種の植物に、１ｍｌ当たり胞子５×１０３個の濃度の液滴１０μｌをいくつか置いて行った。植物を湿度が高い黒いプラスチックの袋の中に１２時間置き、感染を促進した（湿度は、袋の内部に水を噴霧して実現した）。
【００２４】
接種した６日後、遠心法（ｓｐｉｎ）の全ＲＮＡ抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてＮ．メガロシホンの葉から全ＲＮＡを抽出した。最後に、ＰｒｏｍｅｇａのｃＤＮＡ合成システムを用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成した（ｃＤＮＡ）。
【００２５】
抑制サブトラクションハイブリダイゼーション選択システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＡＣ，ＵＳＡ）を使用し、サブトラクションハイブリダイゼーションを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｐ．ヒオシアミ（Ｐ．ｈｙｏｓｃｙａｍｉ）を接種し、接種した６日後に収穫したＮ．メガロシホン植物から得たｃＤＮＡを、サブトラクションの試料として用いた。サブストラクションライブラリーを、説明書に従ってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００２６】
自動シーケンサーを用いてｃＤＮＡの配列決定を展開した。配列決定分析後、データベースに報告されているタンパク質との相同性レベルが低いＤＮＡ配列を選択し、その後の試験に使用した。
【００２７】
（例２）
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の遺伝子を用いた植物の形質転換
タバコトランスジェニック植物の作出：バイナリーベクターの構築
本試験において、抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子の完全なｃＤＮＡを、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドを用いて単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限部位において形質転換ベクター「ｐＣａｍｂｉａ ２３００」にクローニングした（図１Ａ）。タバコ植物の遺伝子形質転換を、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２：２１４３−２１５０から得た方法によって行った。この計画のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＡＴ２２６０株を、開発したバイナリーベクターと液体窒素法（Ｈｏｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９８７７）に使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した変種プチ・ハバナ（Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）ＳＲ１のタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物の葉の円盤状切片を形質転換した。マーカー剤として１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを用いた。葉の円盤状切片を、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）液体培地中で４８時間、組換えアグロバクテリウムと共培養した。タバコ植物の再分化（４〜６週間）を、ショ糖２５ｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／Ｌ、ナフタリン酢酸（ＡＮＡ）０．１ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ及びクラフォラン（Ｃｌａｆ）５００ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ培地において行った。植物の発根（１〜３週間）を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ及びＣｌａｆ５００ｍｇ／Ｌを含有するＭＳにおいて行った。
【００２８】
ジャガイモトランスジェニック植物の作出：バイナリーベクターの構築
本試験において、抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子の完全なｃＤＮＡを、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドを用いて単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限部位において形質転換ベクター「ｐＣａｍｂｉａ ３３００」にクローニングした（図１Ａ）。組織培養及び形質転換の試験に使用した植物材料は、ジャガイモ栽培品種「Ｄｅｓｉｒｅｅ」由来の植物からｉｎ ｖｉｔｒｏで取得した。植物を試験管内でＭＳ培地において生長させた。培地のｐＨは５．７に調整した。４週間培養した植物を用い、２５℃、照明が２０００ルクスの部屋で維持した。再分化試験及び形質転換のベースとして使用した培地はＳＣ（ＭＳ塩、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ショ糖２０ｇ／Ｌ、ＢＡＰ３．５ｍｇ／Ｌ、ＡＮＡ０．０１ｍｇ／Ｌ、植物寒天（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）６ｇ／Ｌ）、ＳＢ（ＭＳ塩、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ショ糖２０ｇ／Ｌ、ＡＧ３３．５ｍｇ／Ｌ、植物寒天６ｇ／Ｌ）及びＰＰ（ＭＳ塩、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、植物寒天６ｇ／Ｌ、活性炭５ｇ／Ｌ及び硝酸銀−チオ硫酸ナトリウム１ｍｇ／Ｌ（ＳＴＳ））であった。
【００２９】
アグロバクテリウムの「Ａｔ２２６０」株及び「ＬＢＡ４４０４」株を形質転換に用いた。この細菌を、酵母抽出物１ｇ／Ｌ、バクトペプトン（ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）１ｇ／Ｌ、ショ糖５ｇ／Ｌ及びラブレムコ（Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏ）粉末５ｇ／Ｌを有する培地において、２８℃、暗条件下で吸光度（ＯＤ）６２０が０．７〜０．９に達するまで培養した。
【００３０】
形質転換−再分化の手順は、以下のように２段階で展開した：ｉｎ ｖｉｔｒｏで４週間培養した植物の茎のセグメントを暗闇中２５℃で１２〜１６時間、ＭＳ培地でインキュベートし、次いで、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、外植片をＭＳ培地各２０ｍｌに対し１ｍＬの当該細菌の懸濁液を用いて７分間インキュベートすることにより感染させ；その外植片を、暗闇中、２２℃で４８時間、ＳＣ培地で共培養し、その外植片を無菌ろ紙上に置いた。その外植片を慎重に、ＭＳ培地で洗浄し、無菌ろ紙で慎重に乾燥させた。第１段階において、その外植片を、明条件下、ＳＣ選択培地、クラフォラン５００ｍｇ／Ｌ及びホスフィノトリシン（ＰＰＴ）５ｍｇ／Ｌで１５日間培養し、第２段階において、その外植片を、明条件下、ＳＢ選択培地、クラフォラン５００ｍｇ／Ｌ及びＰＰＴ５ｍｇ／Ｌで培養した。最後に、小植物を、ＰＰ選択培地においてクラフォラン５００ｍｇ／Ｌを用いて個別化し、ＰＰＴ５ｍｇ／Ｌにおいて選択した。
【００３１】
（例３）
疾患抵抗性に対する抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の効果の評価
ペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナに対するタバコの疾患抵抗性試験
抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を有し、抗病原体タンパク質の遺伝子を有する根付きの植物を、４５日間、温室条件下で適応させるためにポットに植えた。４５日後、６週齢のトランスジェニッククローン１００体からなる群に、ペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナの懸濁液を、胞子５×１０３個／ｍｌの濃度の液滴１０μｌをいくつか置いて接種した。その植物を１２時間、黒いプラスチックの袋の中に置いて水を噴霧し、感染を促進した。１週間後に疾患の症状がある葉の割合を測定して感受性の評価を行った（図３Ａ）。図３Ａから分かるように、接種した対照と種々のクローンの間で症状がある葉の割合を比較した場合、この病原体に対する高い抵抗性レベルが実現し、これは、この重要な病原体を制御するために用いた抗病原体タンパク質の有用性を示している。
【００３２】
フィトフトラ・パラシティカに対するタバコの疾患抵抗性試験
抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を有し、抗病原体タンパク質の遺伝子を有する根付きの植物を、４５日間、温室条件下で適応させるためにポットに植えた。４５日後、６週齢のトランスジェニッククローン１００体からなる群に、Ｐ．パラシティカ（Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）を接種し、１カ月後に疾患の症状がある茎の割合を評価した。
【００３３】
評価手順のために、Ｐ．パラシティカ（Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）を、３９ｇ／Ｌの濃度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地を含有するペトリ皿で増殖させた。この病原体を１０日間、２７℃でインキュベートした。タバコ植物に接種するために、病原体を有するＰＤＡ円盤状切片（直径１ｃｍ）を茎の基部に置き、高湿度、２８℃でインキュベートした（図３Ｂ）。図３Ｂから分かるように、抗病原体タンパク質を発現しているクローンは、この作物の実生期において重要な損失を引き起こすこの土壌中の病原体に対して、かつて見られなかった高い抵抗性レベルを実現した。この結果は、この病原体を制御するためにこのタンパク質を使用することが可能であることを実証している。
【００３４】
ジャガイモ疫病菌に対するジャガイモの疾患抵抗性試験
この試験は、５週齢のジャガイモトランスジェニック植物に、明るさ、温度及び相対湿度の制御条件下でジャガイモ疫病菌を接種することにある。抗病原体タンパク質を発現している５週齢のクローン約１００体を、遊走子１０６個／ｍｌの懸濁液で拡散させた。このクローンを、相対湿度８５〜９５％及び温度２３℃の制御条件下で維持した。接種した１週間後の、症状がある葉の割合を、この病原体に対する感受性の尺度として用いた（図３Ｃ）。この病原体は制御するのが極めて困難であるので、これは予想外の結果であった。図３Ｃにおいて、抗病原体タンパク質を発現しているクローンは、対照と比較して高い抵抗性レベルを示した。この結果は、この病原体の制御においてこのタンパク質を用いることの可能性、とりわけ世界的なレベルでの重要性について指摘している。
【００３５】
アルテルナリア・ソラニに対するジャガイモの疾患抵抗性試験
真菌アルテルナリア・ソラニを、明るさ、温度及び相対湿度の制御条件下で、５週齢のジャガイモトランスジェニック植物１００体に接種した。クローンに、胞子１０６個／ｍｌの懸濁液を拡散させた。このクローンを、相対湿度８５〜９５％及び温度２０℃の制御条件下で維持した。接種した１週間後の、症状がある葉の割合を、この病原体に対する感受性の尺度として用いた（図３Ｄ）。３種の分析クローンがこの病原体に対する高い抵抗性レベルを示し、制御するためにこのタンパク質を用いることの可能性が初めて提供される。
【００３６】
（例４）
ピキア・パストリス培養物の上清における、細胞外での抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の発現ベクターの構築
Ｎ．メガロシホン（Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）由来の抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子を、配列番号４及び配列番号５に対応する特異的オリゴヌクレオチドを用いて単離し、発現ベクターｐＰＩＣ９ｋのクローニングに必要な制限酵素部位ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩを有する、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２をコードしている遺伝子の完全な配列を得た。このクローニング戦略により、得られるタンパク質が配列番号７に属するよう、対象のタンパク質のアミノ末端にサッカロマイセス・セレビシエのアルファ因子のシグナルペプチドが付加される（図１Ｂ）。Ｐ．パストリスのＧＳ１１５株を形質転換する前にプラスミドをＢｇＩＩＩで直鎖化した。電気穿孔法によって形質転換を行った。ＧＳ１１５株は、形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得するｈｉｓ３栄養要求性変異株である。Ｈｉｓ＋クローンをグルコース最小培地で選択し、そのクローンをグリセロール最小培地で培養し、２８℃で１２６時間、メタノールを用いて誘導した。
【００３７】
形質転換されたクローンをドットブロットによって同定した。サザンブロット法を用いて、Ｍｕｔｓ（低メタノール）表現型及びＨｉｓ＋表現型に対応する組換えプラスミドを発現させるためのＰ．パストリス由来の遺伝子ＡＯＸ１の置換のために起こった組込みを測定した。Ｐ．パストリスは低レベルの自己のタンパク質を分泌し、その培地にタンパク質を補充する必要はなく、細胞内の培地に分泌されるタンパク質は、培養物中の全タンパク質の大部分（８０％を超える）を構成することが期待され得る（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１３０５−１３０８）。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、５リットルのバッシュ内で培地にメタノールを加えることによって抗病原体タンパク質を発現させた。抗病原体タンパク質の発現及びその完全性を、質量分析によって確認した。
【００３８】
（例５）
抗病原体タンパク質の精製及びその生物活性のアッセイ
アルファ因子のシグナルペプチドに融合させた抗病原体タンパク質（ＮｍＤｅｆ−Ｐｌｕｓ）を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で透析し；透析の産物を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で平衡化した陽イオン交換樹脂ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓａの高速流を通して使い；タンパク質を１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６を用いて溶出することによって、培地の上清から精製した。タンパク質含有画分を回収し、孔サイズ（カットオフ）が３ｋＤａの膜を用いた超遠心システムを使用して濃縮した。２５４ｎｍの波長を検出に用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％ｒｉｓ−Ｇｌｉｃｎｅ）を用いたポリアクリルアミドにおける電気泳動によって精製の確認を行い、銀染色法によってタンパク質を可視化した（図２）。
【００３９】
分光光度法及びブルーラクトフェノールを用いた染色による光学顕微鏡法を通じた菌糸体の分析によって、抗病原体タンパク質の抗真菌活性を定量化した（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）。ポテト−グルコース液体培地５０μＬ、病原体の胞子懸濁液５０μＬ及び部分的に精製した抗病原体タンパク質２０μＬを加えた９６ウェルプレートにおいて評価を行った。
【００４０】
病原体の増殖阻害の割合（ＰＩＣ）を、以前の報告（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って、以下の方程式によって測定した。
【数１】
【００４１】
阻害の割合間の関係は、アッセイを開始した４８時間後の、対照及び処理した試料について認識された読み取り値（５９５ｎｍに対する）を先の方程式に適用することによってもたらされる（図４Ａ）。
【００４２】
アルファ因子のシグナルペプチドを有さない抗病原体タンパク質を化学合成し、病原体ジャガイモ疫病菌（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する、種々の濃度でのその効果を、以前の報告（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って評価した（図４Ｂ）。
【００４３】
図４Ａ及び４Ｂにおいて、抗病原体タンパク質は、アルファ因子のシグナルペプチドに融合したかシグナルペプチドを用いずに化学合成したかのいずれかで、高レベルでの植物病原体の増殖阻害を実現した。非常に興味深いことに、報告されている他の抗真菌タンパク質によっては現在までに実現していない、重要な植物病原体の阻害が初めて観察された。別の予期されなかった結果及びこの抗病原体タンパク質を幅広い作用スペクトルで利用可能にする結果は、細菌病原体において示された高い阻害レベルであった（表１）。
【表１】
【００４４】
（例６）
土壌中及び空気中の真菌病原体に対する、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２製剤による制御の実証
タバコ種の種子を、抗病原体タンパク質製剤（９μｇ／ｍｌ）及び５％アルギン酸ナトリウムで処理し、その後、その種子を、ブラッククラウド及びコメを４：１の比率で含有する６インチのポット内で発芽させ、２３℃の温室で維持した。対照として、この処理に、１０％次亜塩素酸ナトリウムで処理した種子及び何の処理もしていないタイプの種子を用いた。３０日目に評価を行い、自然感染によって枯れた植物の割合を測定した（図５Ａ）。
【００４５】
一方、温室内の植物１００体に、５μｇ／ｍｌの濃度の有効成分及び５％アルギン酸ナトリウムを有する抗病原体タンパク質製剤を噴霧した。対照として、４０ｇ／Ｌの濃度の殺菌剤ベノミルを有する散布剤及び水を使用した。処理を適用した４５日後、自然感染による症状がある葉の割合を評価した（図５Ｂ）。
【００４６】
図５Ａ及び５Ｂにおいて、抗病原体タンパク質製剤により、使用した対照と比較して、土壌中及び空気中の真菌病原体の制御が実現し、この結果は今までのところ報告されておらず、植物病原体の制御において、このタンパク質をバイオプロダクトとして使用することを可能にしている。
【００４７】
（例７）
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２断片の生物活性
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の断片を化学合成によって得た（配列番号８及び配列番号９）。病原体ジャガイモ疫病菌に対する効果を、報告されている情報（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って、種々の濃度に関して評価した。それを図６に示す。得られた結果から、配列番号９のタンパク質画分を用いると、病原体の制御又は阻害を実現するためにタンパク質画分を使用することが可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に、具体的には、病原物質の制御における抗病原体タンパク質の使用に関する。抗病原体タンパク質を、遺伝子組換え植物内で発現させることによって、又はバイオプロダクトとして適用すると、植物病原物質によって生じる疾患について高レベルの制御が得られる。
【背景技術】
【０００２】
植物の抗病原体タンパク質は、ダイコン、タマネギ、ウマゴヤシ、コショウ、ジャガイモ及びダイズなどの作物由来の葉、葉鞘、根、塊茎、幹、果実及び花から単離されてきた。抗病原体タンパク質は、生化学及び構造レベルで研究されており、これらはおよそ５ＫＤａであり、４５〜５４個のアミノ酸を有し、システインに富み、高塩基性で正電荷を持つ小さなペプチドである。植物の抗病原体タンパク質のファミリーは、構造を安定化する８個のシステインのみが保存されていると思われるため、アミノ酸組成に関して多様である。この特徴は、種々の植物の抗病原体タンパク質によって示される多様な生物活性を表している（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：１３５３−８）。
【０００３】
植物の抗病原体タンパク質は、タンパク質前駆体の構造によって２つのグループに分けることができ、第１のグループにおいて、タンパク質前駆体は、小胞体由来のシグナルペプチド及び成熟タンパク質領域によって構成されている。このタンパク質は、分泌通路に入り、転写後プロセスのシグナルを有さない。第２のグループにおいて、抗病原体タンパク質は、シグナルペプチドと成熟領域に加えて、およそ３３アミノ酸からなるＣ末端前領域を含有する長い前駆体によって形成される。これまでのところ、これらの抗病原体タンパク質は、ナス科各種においてのみ発見されている（Ｌａｙ ｙ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（２００５）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ． ６：８５−１０１）。植物の抗病原体タンパク質の全てが同じ作用を有するのではなく、その一部はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、幅広い糸状菌に対してマイクロモル濃度で潜在的活性を示し、他のものは真菌の増殖を阻害しないが、α−アミラーゼ及び合成のタンパク質を阻害する（Ｃｏｌｉｌｌａ ｅｔ ａｌ（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７０：１９１−１９４）。
【０００４】
Ｓｈａｉ−Ｍａｔｓｕｚａｋｉ−Ｈｕａｎｇモデルは、大部分の抗病原体タンパク質の活性について説明しており、これは、細胞膜中に正電荷を持つタンパク質が挿入されたために、その正電荷を持つタンパク質と負電荷を持つ標的細胞表面のリン脂質の相互作用が起こった後、原形質膜の内部で多量体の孔形成を引き起こす脂質置換が伴う、ペプチドと原形質膜の相互作用について説明しており、これらの多量体の孔は電位依存性イオン透過チャンネルを構成する（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔａ ２１６：１９３−２０２）。
【０００５】
別のモデルは、多くの抗病原体タンパク質は、細胞質膜の透過処理によってだけではなく、細胞質標的を用いることによってもその作用を生じ、これらのタンパク質は、一旦標的細胞の内部に入ると、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成、リボ核酸（ＲＮＡ）及びタンパク質に影響を及ぼすという理論に基づいている。このことは、細胞質膜の透過処理を引き起こす陽イオン性タンパク質の能力は、作用機構の主要な原因ではなく、細胞内標的の探索法であり得ることを示唆している（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【０００６】
これまでのところ、多くの種類の抗病原体タンパク質が同定及び特徴付けされており、それらの適用可能性は、遺伝子工学によって細胞ツール及び分子ツールによる植物の疾患に対する抵抗性戦略がもたらされるために、多様である（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。ダイコンの抗病原体タンパク質の構成的な発現により、葉の病原体タバコ赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇｉｐｅｓ）に対するタバコの抵抗性が増大し（Ｔｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：５７３−５８８）、これは同様にアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）を有するトマト植物においても起こることが実証された。また、抗病原体タンパク質の構成的な発現によって、圃場条件下でジャガイモ作物において、農学的に重要な真菌バーティシリウム・ダーリエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）に対する高い抵抗性がもたらされる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１３０７−１３１０）。
【０００７】
一方、ブラシカ・オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）種及びＢ．カムペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）種の抗病原体タンパク質の遺伝子を発現しているイネ植物を改変して種々の位置にあるアミノ酸を置換し、亜熱帯及び熱帯諸国において非常に重要な疾患であるイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）に対する抵抗性を求めているイネ植物に個々に導入した。これらの抗病原体タンパク質により両方の疾患に対する有効な抵抗性が付与され、これらの遺伝子を改変することによってトランスジェニックイネにおける幅広い抵抗性が増大した（Ｋａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．（２００３）ＪＡＲＱ ３７：７１−７６）。
【０００８】
病原体の攻撃による作物の損失を減少させるための代替として植物の抗病原体タンパク質を適用することは、化学殺菌剤の適用に関しては有利になる。第１に、植物の抗病原体タンパク質は、宿主植物に対して、そしてこれらの植物由来産物を消費する人々に対しても毒性がない天然物質を構成するように、種子、根及び塊茎から得られる。第２に、他のタンパク質と同様に、抗病原体タンパク質は、天然物質のように急速に分解され、それらの有効性が切れた後には何の残渣も残らない（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【０００９】
多剤耐性株の発生及び日和見病原体として認識されている酵母と同様糸状菌種の新規各種の出現に加えてＡＩＤＳ、癌及び臓器移植などの疾患のために免疫低下した患者の増加が過去数十年で増大しており、常に真核病原体の制御についてが医学における主要な問題の一つとなっているため、植物の抗病原体タンパク質は、抗真菌薬の開発に用いることもできる（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【００１０】
哺乳動物の細胞と病原体の細胞との間に類似性があるため、抗真菌化合物は、細胞壁の成分及び病原性因子のような、哺乳動物の細胞に存在しない又はめったに存在しない分子に作用すべきであり、また、抗真菌化合物は、できる限り天然で、幅広い作用スペクトルを有し、製造が容易で耐性を誘発しない製品であるべきである（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，３８：３３５−３４７）。一方、真菌の細胞膜は、スフィンゴ脂質のような真菌膜成分が哺乳動物の細胞と構造的に異なるため、これらの薬剤を開発するための魅力的な標的である。植物の抗病原体タンパク質の標的は、真菌の膜の透過処理を引き起こす自己のスフィンゴ脂質であるため、植物の抗病原体タンパク質は、スフィンゴ脂質の生合成を標的とするのではなく、完全に逆に作用する。これにより高い選択性がもたらされ、したがって、真菌の感染に対する治療について興味深い展望がもたらされる。植物の抗病原体タンパク質の一部は、ヒトにおいて臨床的に非常に興味深い病原体であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対してマイクロモル濃度で活性があるＤｍ−ＡＭＰ１、Ｈｓ−ＡＦＰ１及びＲｓ−ＡＦＰ２として見出されており、治療法を開発するためのこの種の植物タンパク質の可能性の一例となっている（Ｔｈｏｍｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｏｒｄ．３：１−８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
解決するべき重要な問題は、農学及び医学における非常に重要な側面である、広範囲の真菌病原体及び細菌病原体を効率的に制御することができるタンパク質を起源とする抗病原体製品を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記の問題の解決に寄与し、ニコチアナ・メガロシホン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）から単離した新規の抗病原体タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号６）を提供する。本発明のヌクレオチド配列は、いくつかの病原物質に著しい効果を有するシステインに富む小さなタンパク質をコードしている。
【００１３】
ａ）配列番号６として特定されるアミノ酸配列、又はｂ）配列番号６として特定されるアミノ酸に対して１個又は数個のアミノ酸残基が除去、置換及び付加されており、病原物質による感染を制御する特性を維持しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸も、本発明の対象である。
【００１４】
本発明の一実施形態において、本発明の抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子は、いくつかの病原物質に対して植物の抵抗性レベル及び防御力を向上させるために使用する。したがって、本発明は、配列番号６の抗病原体タンパク質の構成的発現又は誘発された発現を導く、配列番号１の核酸を用いた植物の遺伝的形質転換により、病原物質によって引き起こされる植物疾患に対する抵抗性を増大させる方法を含む。
【００１５】
本発明の対象の核酸分子は、植物の形質転換に使用することができる。好ましい実現化において、抗病原体タンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、下記の植物各種の形質転換に用いることができる：トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、モロコシ（ｂｉｃｏｌｏｒ Ｓｏｒｇｈｕｍ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、サツマイモ属サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー属各種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｎｕｔｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ｐｉｎｅａｐｐｌｅｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、ミカン属各種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃｏｃｏａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バショウ属各種（Ｍｕｓｅ ｓｐｐ．）、アボカド（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｒｓｅａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ）、パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ属各種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）、ハイビスカス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ）、バラ属各種（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．）、チューリップ属各種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、スラッシュマツ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ）、ポンデローサマツ（ｐｏｎｄｅｒｏｕｓ Ｐｉｎｕｓ）、ロッジポールマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、ラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ）。
【００１６】
本発明は、抗病原体タンパク質を産生する農学的に興味深い植物を得るために、さまざまな方法において使用することができる。このようにして、抗病原体タンパク質をコードしている核酸配列（配列番号１）は、農学的に興味深い植物に導入されるプロモーターと組み合わせて用いることができる。抗病原体タンパク質を高レベルで発現させるために、構成的プロモーターを用いることができる。他の形態において、抗病原体タンパク質をコードしている配列を操作し特異的なプロモーターに融合させて、病原体に対して感受性がある植物の特定の組織中での発現を誘導することができる。本発明の別の対象は、配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明において抗病原体タンパク質と称するこれらのポリペプチドはいずれも病原物質に対する生物活性を有する。本発明の別の対象は、配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド又は抗病原体タンパク質は、組換え法又は化学合成で得られる。本発明の抗病原体タンパク質は、ＤＮＡ組換え技術によって種々の宿主系において発現させ、そこから単離することができる。本発明の具体化において、抗病原体タンパク質は、酵母において発現させることができる。好ましい実現化において、ＤＮＡ組換え法のための発現は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、好ましくは培養からの上清において行う。宿主から開始して、タンパク質単離の技法を利用して本発明のポリペプチドを得ることができる。精製プロセスは、免疫酵素、クロマトグラフィー、細胞沈殿、及び実際に公知のプロセスを用いて実現することができる。
【００１８】
安定化ペプチドと融合させたアミノ酸配列（配列番号６）の変異型又は宿主のある一定の区画で発現を誘導し、分子について実証された生物活性を維持しているアミノ酸配列（配列番号６）の変異型も、本発明の対象である。一例が、配列が配列番号７で表示される融合タンパク質である。病原物質に対する制御活性を保持している、配列番号８及び配列番号９のような配列表で特定されている抗病原体タンパク質断片も本発明の対象である。本発明の別の態様は、配列番号６、配列番号７として特定される、病原物質を制御するためのバイオプロダクト又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドである。
【００１９】
本発明において、これらの抗病原体タンパク質は、初めて、その使用により良い公共認識と少ない規制上の要件がもたらされるよう、高安定性及び低濃度で、病原物質によって起こる主要な植物疾患に対する高防御レベルを付与するバイオプロダクトに用いられる。本発明の抗病原体タンパク質を含有するバイオプロダクトにより、真菌及び細菌に対するこれまで報告されていない高防御レベルが生じる。バイオプロダクトを実現するために、抗病原体タンパク質は、懸濁液、溶液、エマルション、粉末、顆粒、乳剤、エアロゾル、含浸体、アジュバント顆粒、ペースト（ｐａｓｔｕｒｅ）によって、又はカプセル化によって調剤することができる。本発明の実現化において、バイオプロダクトは、遺伝子形質転換された宿主から精製されたポリペプチドを含有する、又は、この宿主の培養物の上清中に含有されたポリペプチドが直接使用される。好ましい実現化において、宿主はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【００２０】
本発明の具体化において、特許請求した配列を有する抗病原体タンパク質、並びにそれらを含有するバイオプロダクトを、下記の多種多様な病原体を制御するために初めて使用することができる：アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）［（アルテルナリア・ブラシコ−ラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）；アルテルナリア・ソラニ；黒斑病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）］；サトウキビ眼点病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓａｃｃｈａｒｉ）；ボツリティス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；セルコスポラ属（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）［セルコスポラ・キクチイ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）；セルコスポラ・ゼアエ−マイディス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｚａｅａ−ｍａｙｄｉｓ）；セルコスポラ・メジカギニス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）；セルコスポラ・ソジナ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｊｉｎａ）；セルコスポラ・ソルギ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｏｒｇｈｉ）］；クラドスポリウム・フルバム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｎ）；コレトトリカム属（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）［コレトトリカム・リンデムチアナム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）；コレトトリカム・デマティウム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｄｅｍａｔｉｕｍ）；コレトトリカム・グラミニコーラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）］、ディプロディア・マイディス（Ｄｉｐｌｏｄｉａ ｍａｙｄｉｓ）；エリシフェ属（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）［エリシフェ・グラミニス 品種グラミニス（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）；エリシフェ・グラミニス品種ホルデイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｈｏｒｄｅｉ）］；フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）［フザリウム・ニバレ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）；フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）；フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）；フザリウム・モニリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）；フザニウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）］；ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）［ヘルミントスポリウム・ツルシクム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｕｒｃｉｃｕｍ）；ヘルミントスポリウム・カルボヌム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ）；ヘルミントスポリウム・マイディス（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｙｄｉｓ）］；イネいもち病菌；マイコスファエレラ・フィジエンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｆｉｇｅｎｓｉｓ）；ツユカビ属（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）［ダイズべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ）；タバコべと病菌（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ）］；フォーマ・ベタエ（Ｐｈｏｍａ ｂｅｔａｅ）；フィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）［フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）；フィトフトラ・カクトルム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ）；フィトフトラ・ファセオリ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐｈａｓｅｏｌｉ）；フィトフトラ・パラシティカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）；フィトフトラ・シトロフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ）、フィトフトラ・メガスペルマ 品種ソジャエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ ｆ．ｓｐ． ｓｏｊａｅ）；ジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）］、プシニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）［プシニア・ソルギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉ）；プシニア・ストリホルミス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）；プシニア・グラミニス 品種トリチシ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ．ｓｐ．ｔｒｉｔｉｃｉ）；プシニア・アスパラギ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｓｐａｒａｇｉ）；プシニア・レコンディタ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）；プシニア・アラチディス（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｒａｃｈｉｄｉｓ）；プシニア・メラノセファラ（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ）］、フハイカビ属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）［フィチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）；フィチウム・ウルチムム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ）］；イネいもち病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）；リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）；リゾクトニア・セレアリス（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ）］；スセロチウム・ロルフシイ（Ｓｃｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ）；スクレロチニア・スクレロチオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；セプトリア属（Ｓｅｐｔｏｒｉａ）［セプトリア・リコペルシシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）；セプトリア・グリシネス（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）；セプトリア・ノドルム（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）；セプトリア・トリチシ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）］；チエラビオプシス・バシコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ）；ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）［トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）；ウスチラゴ・スシタミネア（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）］；バーティシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）［バーティシリウム・ダーリエ；バーティシリウム・アルボアトルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏａｔｒｕｍ）］；シュードモナス・シリンガエ グリシネア型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐ．ｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａ）；キサントモナス・カムペストリス ファセオリ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉ）；キサントモナス・カムペストリス アルファルファエ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ａｌｆａｌｆａｅ）；キサントモナス・カムペストリス トランスルセンス型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）；シュードモナス・シリンガエ シリンガエ型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐ．ｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）；エルウィニア・カロトボルム カロトボラ型（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ ｐ．ｖ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）；エルウィニア・ステワルティ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）；クラビバクター・ミチガネンセ ネブラスケンセ亜種（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓｐ．Ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ）；シュードモナス・アベナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｎａｅ）；エルウィニア・クリサンテミ ゼア型（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｐ．ｖ．ｚｅａ）；エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）；キサントモナス・カムペストリス ホルシコラ型（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐ．ｖ．ｈｏｌｃｉｃｏｌａ）、シュードモナス・アンドロポゴニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｉｓ）及びシュードモナス・アベナエ。好ましい実現化において、バイオプロダクトは、植物の真菌を制御するのに有効である。本発明の具体化において、ポリペプチドは、１〜９μｇ／ｍｌの濃度範囲でバイオプロダクト中に含まれる。
【００２１】
配列番号６、配列番号７で特定されるポリペプチド又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドを含むバイオプロダクトを植物に適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法も、本発明の一部である。本発明の別の具体化において、植物病原物質を制御する方法は、本発明のバイオプロダクトをバイオ農薬と組み合わせて適用することを特徴とする。病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させるために、配列番号１の核酸配列又は配列番号１由来の核酸配列を用いて遺伝子改変された植物（トランスジェニック植物）も本発明の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】植物（図１Ａ）及び酵母（図１Ｂ）において、対象の抗病原体タンパク質を発現ベクターにクローニングする戦略を示す図である。
【図２】サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファ因子由来のシグナルペプチドに融合させたｐＰＩＣ９Ｋベクターを用いた、ピキア・パストリスにおける抗病原体タンパク質の発現を示す図である。Ｐ．パストリスの上清（Ａ）及び精製画分（Ｂ）における抗病原体タンパク質の産生。
【図３】トランスジェニック植物における抗病原体タンパク質の構成的発現の試験及び疾患抵抗性の評価を示す図である。この図は、対照試料及び抗病原体タンパク質を発現しているトランスジェニッククローンにおける、疾患の症状がある葉及び茎の割合を示している。（図３Ａ）タバコの葉に対するペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｈｙｏｓｃｙａｍｉ ｆ．ｓｐ．ｔａｂａｃｉｎａ）の影響。（図３Ｂ）ジャガイモの葉に対するアルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｓｏｌａｎｉ）の影響。（図３Ｃ）タバコの茎に対するフィトフトラ・パラシティカの影響。（図３Ｄ）ジャガイモの葉に対するジャガイモ疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の影響。図の棒線は、ａ．接種した対照、ｂ．接種していない対照、ｃ．クローン１．１、ｄ．クローン１．２、ｅ．クローン１．３を示す。
【図４】種々の濃度のいくつかの植物病原体に対する抗病原体タンパク質の活性の試験を示すグラフである。このグラフは、種々の濃度の、アルファ因子のシグナルペプチドに融合した抗病原体タンパク質（Ａ）及びシグナルペプチドなしで合成した抗病原体タンパク質（Ｂ）で処理した病原体由来の液体培地における増殖阻害の割合を示している。図４Ｂの凡例：□アルファ因子のシグナルペプチドに融合させたタンパク質の、ジャガイモ疫病菌に対する効果、◆シグナルペプチドなしのタンパク質の、ジャガイモ疫病菌に対する効果、■対照。
【図５】抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２製剤の、土壌中の病原体（Ａ）及び空気中の病原体（Ｂ）に対する制御効果の試験を示すグラフである。図の棒線は、■対照植物、□殺菌剤で処理した植物、◆抗病原体タンパク質製剤で処理した植物を示す。
【図６】ジャガイモ疫病菌に対する抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２断片の生物活性を示すグラフである。□ジャガイモ疫病菌に対する配列番号８のペプチドの効果、◆ジャガイモ疫病菌に対する配列番号９のペプチドの効果。
【実施例】
【００２３】
（例１）
植物材料の調製、ニコチアナ・メガロシホンからの、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２をコードしているＤＮＡの単離及びクローニング
Ｎ．メガロシホン（Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）種を、ブラッククラウド（ｂｌａｃｋ ｃｒｏｗｄ）とコメの殻を４：１の比率で含有する６インチのポットで生長させ、２３℃の温室条件下で維持した。ハバナのタバコ畑で採取したペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナの単離体を接種に用いた。接種は、６週齢のこの種の植物に、１ｍｌ当たり胞子５×１０３個の濃度の液滴１０μｌをいくつか置いて行った。植物を湿度が高い黒いプラスチックの袋の中に１２時間置き、感染を促進した（湿度は、袋の内部に水を噴霧して実現した）。
【００２４】
接種した６日後、遠心法（ｓｐｉｎ）の全ＲＮＡ抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてＮ．メガロシホンの葉から全ＲＮＡを抽出した。最後に、ＰｒｏｍｅｇａのｃＤＮＡ合成システムを用いて二重鎖ｃＤＮＡを合成した（ｃＤＮＡ）。
【００２５】
抑制サブトラクションハイブリダイゼーション選択システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＡＣ，ＵＳＡ）を使用し、サブトラクションハイブリダイゼーションを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ｐ．ヒオシアミ（Ｐ．ｈｙｏｓｃｙａｍｉ）を接種し、接種した６日後に収穫したＮ．メガロシホン植物から得たｃＤＮＡを、サブトラクションの試料として用いた。サブストラクションライブラリーを、説明書に従ってｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【００２６】
自動シーケンサーを用いてｃＤＮＡの配列決定を展開した。配列決定分析後、データベースに報告されているタンパク質との相同性レベルが低いＤＮＡ配列を選択し、その後の試験に使用した。
【００２７】
（例２）
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の遺伝子を用いた植物の形質転換
タバコトランスジェニック植物の作出：バイナリーベクターの構築
本試験において、抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子の完全なｃＤＮＡを、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドを用いて単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限部位において形質転換ベクター「ｐＣａｍｂｉａ ２３００」にクローニングした（図１Ａ）。タバコ植物の遺伝子形質転換を、Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２：２１４３−２１５０から得た方法によって行った。この計画のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＡＴ２２６０株を、開発したバイナリーベクターと液体窒素法（Ｈｏｆｇｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９８７７）に使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した変種プチ・ハバナ（Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ）ＳＲ１のタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）植物の葉の円盤状切片を形質転換した。マーカー剤として１００ｍｇ／Ｌのカナマイシンを用いた。葉の円盤状切片を、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）液体培地中で４８時間、組換えアグロバクテリウムと共培養した。タバコ植物の再分化（４〜６週間）を、ショ糖２５ｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）１ｍｇ／Ｌ、ナフタリン酢酸（ＡＮＡ）０．１ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ及びクラフォラン（Ｃｌａｆ）５００ｍｇ／Ｌを含有するＭＳ培地において行った。植物の発根（１〜３週間）を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ及びＣｌａｆ５００ｍｇ／Ｌを含有するＭＳにおいて行った。
【００２８】
ジャガイモトランスジェニック植物の作出：バイナリーベクターの構築
本試験において、抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子の完全なｃＤＮＡを、配列番号２及び配列番号３のオリゴヌクレオチドを用いて単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ制限部位において形質転換ベクター「ｐＣａｍｂｉａ ３３００」にクローニングした（図１Ａ）。組織培養及び形質転換の試験に使用した植物材料は、ジャガイモ栽培品種「Ｄｅｓｉｒｅｅ」由来の植物からｉｎ ｖｉｔｒｏで取得した。植物を試験管内でＭＳ培地において生長させた。培地のｐＨは５．７に調整した。４週間培養した植物を用い、２５℃、照明が２０００ルクスの部屋で維持した。再分化試験及び形質転換のベースとして使用した培地はＳＣ（ＭＳ塩、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ショ糖２０ｇ／Ｌ、ＢＡＰ３．５ｍｇ／Ｌ、ＡＮＡ０．０１ｍｇ／Ｌ、植物寒天（ｐｈｙｔｏａｇａｒ）６ｇ／Ｌ）、ＳＢ（ＭＳ塩、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、ショ糖２０ｇ／Ｌ、ＡＧ３３．５ｍｇ／Ｌ、植物寒天６ｇ／Ｌ）及びＰＰ（ＭＳ塩、ビタミンＢ１ ０．４ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール１００ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、植物寒天６ｇ／Ｌ、活性炭５ｇ／Ｌ及び硝酸銀−チオ硫酸ナトリウム１ｍｇ／Ｌ（ＳＴＳ））であった。
【００２９】
アグロバクテリウムの「Ａｔ２２６０」株及び「ＬＢＡ４４０４」株を形質転換に用いた。この細菌を、酵母抽出物１ｇ／Ｌ、バクトペプトン（ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ）１ｇ／Ｌ、ショ糖５ｇ／Ｌ及びラブレムコ（Ｌａｂ−ｌｅｍｃｏ）粉末５ｇ／Ｌを有する培地において、２８℃、暗条件下で吸光度（ＯＤ）６２０が０．７〜０．９に達するまで培養した。
【００３０】
形質転換−再分化の手順は、以下のように２段階で展開した：ｉｎ ｖｉｔｒｏで４週間培養した植物の茎のセグメントを暗闇中２５℃で１２〜１６時間、ＭＳ培地でインキュベートし、次いで、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を、外植片をＭＳ培地各２０ｍｌに対し１ｍＬの当該細菌の懸濁液を用いて７分間インキュベートすることにより感染させ；その外植片を、暗闇中、２２℃で４８時間、ＳＣ培地で共培養し、その外植片を無菌ろ紙上に置いた。その外植片を慎重に、ＭＳ培地で洗浄し、無菌ろ紙で慎重に乾燥させた。第１段階において、その外植片を、明条件下、ＳＣ選択培地、クラフォラン５００ｍｇ／Ｌ及びホスフィノトリシン（ＰＰＴ）５ｍｇ／Ｌで１５日間培養し、第２段階において、その外植片を、明条件下、ＳＢ選択培地、クラフォラン５００ｍｇ／Ｌ及びＰＰＴ５ｍｇ／Ｌで培養した。最後に、小植物を、ＰＰ選択培地においてクラフォラン５００ｍｇ／Ｌを用いて個別化し、ＰＰＴ５ｍｇ／Ｌにおいて選択した。
【００３１】
（例３）
疾患抵抗性に対する抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の効果の評価
ペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナに対するタバコの疾患抵抗性試験
抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を有し、抗病原体タンパク質の遺伝子を有する根付きの植物を、４５日間、温室条件下で適応させるためにポットに植えた。４５日後、６週齢のトランスジェニッククローン１００体からなる群に、ペロノスポラ・ヒオシアミ 品種タバシナの懸濁液を、胞子５×１０３個／ｍｌの濃度の液滴１０μｌをいくつか置いて接種した。その植物を１２時間、黒いプラスチックの袋の中に置いて水を噴霧し、感染を促進した。１週間後に疾患の症状がある葉の割合を測定して感受性の評価を行った（図３Ａ）。図３Ａから分かるように、接種した対照と種々のクローンの間で症状がある葉の割合を比較した場合、この病原体に対する高い抵抗性レベルが実現し、これは、この重要な病原体を制御するために用いた抗病原体タンパク質の有用性を示している。
【００３２】
フィトフトラ・パラシティカに対するタバコの疾患抵抗性試験
抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を有し、抗病原体タンパク質の遺伝子を有する根付きの植物を、４５日間、温室条件下で適応させるためにポットに植えた。４５日後、６週齢のトランスジェニッククローン１００体からなる群に、Ｐ．パラシティカ（Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）を接種し、１カ月後に疾患の症状がある茎の割合を評価した。
【００３３】
評価手順のために、Ｐ．パラシティカ（Ｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）を、３９ｇ／Ｌの濃度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地を含有するペトリ皿で増殖させた。この病原体を１０日間、２７℃でインキュベートした。タバコ植物に接種するために、病原体を有するＰＤＡ円盤状切片（直径１ｃｍ）を茎の基部に置き、高湿度、２８℃でインキュベートした（図３Ｂ）。図３Ｂから分かるように、抗病原体タンパク質を発現しているクローンは、この作物の実生期において重要な損失を引き起こすこの土壌中の病原体に対して、かつて見られなかった高い抵抗性レベルを実現した。この結果は、この病原体を制御するためにこのタンパク質を使用することが可能であることを実証している。
【００３４】
ジャガイモ疫病菌に対するジャガイモの疾患抵抗性試験
この試験は、５週齢のジャガイモトランスジェニック植物に、明るさ、温度及び相対湿度の制御条件下でジャガイモ疫病菌を接種することにある。抗病原体タンパク質を発現している５週齢のクローン約１００体を、遊走子１０６個／ｍｌの懸濁液で拡散させた。このクローンを、相対湿度８５〜９５％及び温度２３℃の制御条件下で維持した。接種した１週間後の、症状がある葉の割合を、この病原体に対する感受性の尺度として用いた（図３Ｃ）。この病原体は制御するのが極めて困難であるので、これは予想外の結果であった。図３Ｃにおいて、抗病原体タンパク質を発現しているクローンは、対照と比較して高い抵抗性レベルを示した。この結果は、この病原体の制御においてこのタンパク質を用いることの可能性、とりわけ世界的なレベルでの重要性について指摘している。
【００３５】
アルテルナリア・ソラニに対するジャガイモの疾患抵抗性試験
真菌アルテルナリア・ソラニを、明るさ、温度及び相対湿度の制御条件下で、５週齢のジャガイモトランスジェニック植物１００体に接種した。クローンに、胞子１０６個／ｍｌの懸濁液を拡散させた。このクローンを、相対湿度８５〜９５％及び温度２０℃の制御条件下で維持した。接種した１週間後の、症状がある葉の割合を、この病原体に対する感受性の尺度として用いた（図３Ｄ）。３種の分析クローンがこの病原体に対する高い抵抗性レベルを示し、制御するためにこのタンパク質を用いることの可能性が初めて提供される。
【００３６】
（例４）
ピキア・パストリス培養物の上清における、細胞外での抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の発現ベクターの構築
Ｎ．メガロシホン（Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）由来の抗病原体タンパク質をコードしている遺伝子を、配列番号４及び配列番号５に対応する特異的オリゴヌクレオチドを用いて単離し、発現ベクターｐＰＩＣ９ｋのクローニングに必要な制限酵素部位ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩを有する、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２をコードしている遺伝子の完全な配列を得た。このクローニング戦略により、得られるタンパク質が配列番号７に属するよう、対象のタンパク質のアミノ末端にサッカロマイセス・セレビシエのアルファ因子のシグナルペプチドが付加される（図１Ｂ）。Ｐ．パストリスのＧＳ１１５株を形質転換する前にプラスミドをＢｇＩＩＩで直鎖化した。電気穿孔法によって形質転換を行った。ＧＳ１１５株は、形質転換後にＨｉｓ＋表現型を獲得するｈｉｓ３栄養要求性変異株である。Ｈｉｓ＋クローンをグルコース最小培地で選択し、そのクローンをグリセロール最小培地で培養し、２８℃で１２６時間、メタノールを用いて誘導した。
【００３７】
形質転換されたクローンをドットブロットによって同定した。サザンブロット法を用いて、Ｍｕｔｓ（低メタノール）表現型及びＨｉｓ＋表現型に対応する組換えプラスミドを発現させるためのＰ．パストリス由来の遺伝子ＡＯＸ１の置換のために起こった組込みを測定した。Ｐ．パストリスは低レベルの自己のタンパク質を分泌し、その培地にタンパク質を補充する必要はなく、細胞内の培地に分泌されるタンパク質は、培養物中の全タンパク質の大部分（８０％を超える）を構成することが期待され得る（Ｔｓｃｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１３０５−１３０８）。Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、５リットルのバッシュ内で培地にメタノールを加えることによって抗病原体タンパク質を発現させた。抗病原体タンパク質の発現及びその完全性を、質量分析によって確認した。
【００３８】
（例５）
抗病原体タンパク質の精製及びその生物活性のアッセイ
アルファ因子のシグナルペプチドに融合させた抗病原体タンパク質（ＮｍＤｅｆ−Ｐｌｕｓ）を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で透析し；透析の産物を、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で平衡化した陽イオン交換樹脂ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓａの高速流を通して使い；タンパク質を１Ｍの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６を用いて溶出することによって、培地の上清から精製した。タンパク質含有画分を回収し、孔サイズ（カットオフ）が３ｋＤａの膜を用いた超遠心システムを使用して濃縮した。２５４ｎｍの波長を検出に用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％ｒｉｓ−Ｇｌｉｃｎｅ）を用いたポリアクリルアミドにおける電気泳動によって精製の確認を行い、銀染色法によってタンパク質を可視化した（図２）。
【００３９】
分光光度法及びブルーラクトフェノールを用いた染色による光学顕微鏡法を通じた菌糸体の分析によって、抗病原体タンパク質の抗真菌活性を定量化した（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）。ポテト−グルコース液体培地５０μＬ、病原体の胞子懸濁液５０μＬ及び部分的に精製した抗病原体タンパク質２０μＬを加えた９６ウェルプレートにおいて評価を行った。
【００４０】
病原体の増殖阻害の割合（ＰＩＣ）を、以前の報告（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って、以下の方程式によって測定した。
【数１】
【００４１】
阻害の割合間の関係は、アッセイを開始した４８時間後の、対照及び処理した試料について認識された読み取り値（５９５ｎｍに対する）を先の方程式に適用することによってもたらされる（図４Ａ）。
【００４２】
アルファ因子のシグナルペプチドを有さない抗病原体タンパク質を化学合成し、病原体ジャガイモ疫病菌（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対する、種々の濃度でのその効果を、以前の報告（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って評価した（図４Ｂ）。
【００４３】
図４Ａ及び４Ｂにおいて、抗病原体タンパク質は、アルファ因子のシグナルペプチドに融合したかシグナルペプチドを用いずに化学合成したかのいずれかで、高レベルでの植物病原体の増殖阻害を実現した。非常に興味深いことに、報告されている他の抗真菌タンパク質によっては現在までに実現していない、重要な植物病原体の阻害が初めて観察された。別の予期されなかった結果及びこの抗病原体タンパク質を幅広い作用スペクトルで利用可能にする結果は、細菌病原体において示された高い阻害レベルであった（表１）。
【表１】
【００４４】
（例６）
土壌中及び空気中の真菌病原体に対する、抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２製剤による制御の実証
タバコ種の種子を、抗病原体タンパク質製剤（９μｇ／ｍｌ）及び５％アルギン酸ナトリウムで処理し、その後、その種子を、ブラッククラウド及びコメを４：１の比率で含有する６インチのポット内で発芽させ、２３℃の温室で維持した。対照として、この処理に、１０％次亜塩素酸ナトリウムで処理した種子及び何の処理もしていないタイプの種子を用いた。３０日目に評価を行い、自然感染によって枯れた植物の割合を測定した（図５Ａ）。
【００４５】
一方、温室内の植物１００体に、５μｇ／ｍｌの濃度の有効成分及び５％アルギン酸ナトリウムを有する抗病原体タンパク質製剤を噴霧した。対照として、４０ｇ／Ｌの濃度の殺菌剤ベノミルを有する散布剤及び水を使用した。処理を適用した４５日後、自然感染による症状がある葉の割合を評価した（図５Ｂ）。
【００４６】
図５Ａ及び５Ｂにおいて、抗病原体タンパク質製剤により、使用した対照と比較して、土壌中及び空気中の真菌病原体の制御が実現し、この結果は今までのところ報告されておらず、植物病原体の制御において、このタンパク質をバイオプロダクトとして使用することを可能にしている。
【００４７】
（例７）
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２断片の生物活性
抗病原体タンパク質ＮｍＤｅｆ−０２の断片を化学合成によって得た（配列番号８及び配列番号９）。病原体ジャガイモ疫病菌に対する効果を、報告されている情報（Ｔｅｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３０１−１５３０９）に従って、種々の濃度に関して評価した。それを図６に示す。得られた結果から、配列番号９のタンパク質画分を用いると、病原体の制御又は阻害を実現するためにタンパク質画分を使用することが可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１として特定される核酸配列を含む核酸。
【請求項２】
ａ）配列番号６として特定されるアミノ酸配列、又はｂ）配列番号６として特定されるアミノ酸に対して１個又は数個のアミノ酸残基が除去、置換及び付加されており、病原物質による感染を制御する特性を維持しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項３】
配列番号６を含む抗病原体タンパク質の構成的発現又は誘導された発現を導く、配列番号１として特定される核酸配列を含む核酸配列を用いた植物の遺伝子形質転換により、病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させる方法。
【請求項４】
配列番号６又は配列番号７として特定されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列をそのポリペプチド鎖に含むポリペプチド。
【請求項６】
組換え法又は化学合成によって得られる、請求項４及び５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
組換えＤＮＡ法による発現を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、好ましくはその培養上清において行う、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６、配列番号７として特定されるポリペプチド又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドを含む、病原物質を制御するためのバイオプロダクト。
【請求項９】
ポリペプチドが遺伝子形質転換された宿主から精製され、又はそのような宿主の培養物の上清中に含有されたポリペプチドが直接使用される、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１０】
宿主がＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項９に記載のバイオプロダクト。
【請求項１１】
病原物質が真菌病原体である、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１２】
ポリペプチドが１〜９μｇ／ｍｌの濃度範囲にある、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１３】
配列番号６又は配列番号７として特定されるポリペプチドの断片を含む、病原物質を制御するためのバイオプロダクト。
【請求項１４】
請求項８に記載のバイオプロダクトを植物に適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法。
【請求項１５】
請求項８に記載のバイオプロダクトをバイオ農薬と混合して適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法。
【請求項１６】
病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させるために、配列番号１として特定される核酸配列を用いて遺伝子改変された植物。
【請求項１】
配列番号１として特定される核酸配列を含む核酸。
【請求項２】
ａ）配列番号６として特定されるアミノ酸配列、又はｂ）配列番号６として特定されるアミノ酸に対して１個又は数個のアミノ酸残基が除去、置換及び付加されており、病原物質による感染を制御する特性を維持しているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項３】
配列番号６を含む抗病原体タンパク質の構成的発現又は誘導された発現を導く、配列番号１として特定される核酸配列を含む核酸配列を用いた植物の遺伝子形質転換により、病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させる方法。
【請求項４】
配列番号６又は配列番号７として特定されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列をそのポリペプチド鎖に含むポリペプチド。
【請求項６】
組換え法又は化学合成によって得られる、請求項４及び５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
組換えＤＮＡ法による発現を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、好ましくはその培養上清において行う、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６、配列番号７として特定されるポリペプチド又は配列番号６と少なくとも６０％の相同性を有するポリペプチドを含む、病原物質を制御するためのバイオプロダクト。
【請求項９】
ポリペプチドが遺伝子形質転換された宿主から精製され、又はそのような宿主の培養物の上清中に含有されたポリペプチドが直接使用される、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１０】
宿主がＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項９に記載のバイオプロダクト。
【請求項１１】
病原物質が真菌病原体である、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１２】
ポリペプチドが１〜９μｇ／ｍｌの濃度範囲にある、請求項８に記載のバイオプロダクト。
【請求項１３】
配列番号６又は配列番号７として特定されるポリペプチドの断片を含む、病原物質を制御するためのバイオプロダクト。
【請求項１４】
請求項８に記載のバイオプロダクトを植物に適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法。
【請求項１５】
請求項８に記載のバイオプロダクトをバイオ農薬と混合して適用することを特徴とする、植物病原物質を制御する方法。
【請求項１６】
病原物質によって生じる植物疾患に対する抵抗性を増大させるために、配列番号１として特定される核酸配列を用いて遺伝子改変された植物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５１５０９２（Ｐ２０１１−５１５０９２Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１０９５（Ｐ２０１１−５０１０９５）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００９／０００００３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１７９７５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００９／０００００３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１７９７５
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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