癌および／または腫瘍を治療するためのプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁
【課題】 癌および／または腫瘍を治療するために有効な組成物を提供すること。
【解決手段】 本発明は、有効量のプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）の葉汁を含むことを特徴とする腫瘍を治療するための組成物に関する。本発明はさらに、その組成物を生成する方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、有効量のプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）の葉汁を含むことを特徴とする腫瘍を治療するための組成物に関する。本発明はさらに、その組成物を生成する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および／または腫瘍を治療するための植物組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．、コリウス・アンボイニクス（Ｃｏｌｅｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）Ｌｏｕｒ．、コリウス・アロマチクス（Ｃｏｌｅｕｓ ａｒｏｍａｔｉｃｕｓ）Ｂｅｎｔｈ．、コリウス・クラシフォリウス（Ｃｏｌｅｕｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉｕｓ）Ｂｅｎｔｈ．、プレクトランサス・アロマチクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｒｏｍａｔｉｃｕｓ）（Ｂｅｎｔｈ．）Ｒｏｘｂ．、コリウス・スガンダ（Ｃｏｌｅｕｓ ｓｕｇａｎｄａ）Ｂｌａｎｃｏ、コリウス・カルノサス（Ｃｏｌｅｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）Ｈａｓｓｋ．、およびマジャンダ・アンボイニカ（Ｍａｊａｎａ ａｍｂｏｉｎｉｃａ）（Ｌｏｕｒ．）Ｋｕｎｔｚｅの別名でも知られるプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）は、シソ（Ｌａｂｉａｔａｅ）属に属し、以下の一般名を有する。野生のルリチシャ（country borage）、キューバンオレガノ、インディアンルリチシャ (borage）、アンボイニ（Ａｍｂｏｉｎｉ）コリウス、フレンチタイム、メキシカンミント、スパニッシュタイム、タオシュウシアン（Ｔａｏ−ｓｈｏｕ−ｈｓｉａｎｇ）、およびスープミント。プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）は、熱帯地方（アフリカ、インド、東南アジア、西インド諸島、メキシコ、近年は米国南部の一部）で、薬用植物、香味野菜、および香辛料として栽培されている。その芳香性の葉は、肉に風味をつける、肉、スープ、魚、地ビールに味をつける、野菜として摂取する、衣類および髪を洗うために使用するために用いられている。プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）はまた、極東においてその精油のために、ならびに観賞植物として栽培されている。
【０００３】
プレクトランサス・アンボイニクスはまた、伝統的な治療において用いられている。例えば、葉を煎じた液（ハチミツで甘味をつけたもの）は、咳および感冒を緩和することができる。さらに、葉を強く摩擦することによって得られた気体は、鼻詰まりを解消するのに役立つ。台湾では、プレクトランサス・アンボイニクスは、局所適用、例えば熱傷、咬傷、白癬、および水腫など、ならびに内服適用、例えば駆風および喘息鎮静などのために広く用いられている。さらに、プレクトランサス・アンボイニクスは、何十年にもわたって、その抗菌および抗真菌性がよく知られている。最近、プレクトランサス・アンボイニクス由来のジテルペンラクトン類、トリテルペン類、およびオレアノール酸が、誘導性ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性を阻害することによって、動物において炎症反応を阻害することが明らかにされた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６）。
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００６８０９８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００７６４５２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００７７３５０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／０１１０６０４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１０８６２８号明細書
【特許文献６】米国特許第６６２９８３５号明細書
【特許文献７】米国特許第５３８２５１０号明細書
【特許文献８】米国特許第５８４０５７９号明細書
【特許文献９】米国特許第６１８３９６４号明細書
【特許文献１０】米国特許第６４７２３８５号明細書
【特許文献１１】米国特許第６５３１５１２号明細書
【非特許文献１】Lanni S. Jennifer, Lowe W. Scott, Licitra J. Edward, Liu O. Jun, Jacks Tyler, P53-independent apoptosis induced by paclitaxel through an indirect mechanism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol94, September 1997, 9979-9683
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの従来技術の文献はいずれもプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁が、癌および／または腫瘍の治療に効果を有することを教示または示唆していない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、そのような治療を必要としている対象に本発明の組成物を投与することを含む、癌および／または腫瘍を治療するための方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、本発明の組成物を生成する方法であって、葉汁が、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップを含む方法によって生成される方法を提供する。
【０００９】
本発明の特定の一つの実施形態は、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物である。
【００１０】
したがって、本発明はさらに、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分が、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）葉汁から５０ｋＤ未満の分子量画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップを含む
方法によって生成される方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明によって、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁は、意外にも癌および／または腫瘍の治療において劇的な効果を有することが見出される。
【００１２】
本発明によって、有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物が提供される。
【００１３】
本明細書では、「葉抽出物」とも称される「葉汁」という用語は、天然に葉に含まれる流体を指す。葉汁は、組織片および／または残留物を除去することによって得ることができる。
【００１４】
本明細書では、「腫瘍」という用語は、身体の任意の部分における病的腫脹、隆起、または増殖、特に新しい組織の沈着によって生成された増殖、新生物（腫瘍）を指す。本明細書では、「悪性腫瘍性疾患」または「癌」とも称される「悪性腫瘍」という用語は、異常かつ無制御な細胞分裂に起因する腫瘍増殖を指し、これはリンパ系または血流によって身体の他の部分に広がるかもしれない。
【００１５】
本明細書では、「有効量」という用語は、動物に投与されたとき、その動物において所望の効果を有する組成物の量を指す。例えば、腫瘍を治療するための組成物の有効量は、動物において腫瘍増殖を制御し、および／または腫瘍を消失させる量である。
【００１６】
本発明の一つの実施形態において、本発明による組成物は、悪性腫瘍の増殖を阻害するために用いられる。本発明の他の実施形態において、本発明による組成物で処理されたとき、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、およびＢｏｗｅｓなどの悪性腫瘍細胞の数は減少し、さらには除去される。
【００１７】
本発明による組成物に応答する腫瘍細胞系をスクリーニングすると、この組成物がｐ５３ネットワークによって腫瘍の増殖を調節することが見出される。本発明による組成物は、そのｐ５３遺伝子が、野生型、部分的に機能性を有するもの、および突然変異活性を有するものを含む機能性を有するものである腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。したがって、本発明によって治療される腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍である。
【００１８】
ｐ５３ネットワークは、細胞周期Ｇ１チェックポイントの分子センサーであり、ＤＮＡ損傷、ヌクレオチドプールのレベル、紡錘体の状態、および遺伝毒性ストレスをモニターする。ｐ５３ネットワークはさらに、細胞周期の進行、プログラムされた細胞死、複製による老化、および場合により分化を調節する。したがって、ｐ５３は腫瘍抑制遺伝子とされている。実際、すべてのヒトの癌の半分以上が、１つまたは複数のｐ５３の変化に関連する。代わりに、突然変異ｐ５３タンパク質は、野生型ｐ５３と無関係である新しい腫瘍促進活性を獲得した可能性がある。ｐ５３ネットワークを対象とする悪性腫瘍を治療するいくつかの方策が開発されている（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１）。
【００１９】
本発明の一つの実施形態において、治療される腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫（メラノーマ）を含む。より好ましくは、治療される腫瘍は、ｐ５３ネットワークに関連する肝細胞癌および黒色腫を含む。
【００２０】
本発明によるプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析および同定することができる。例えば、内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍのＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって２１４ｎｍで得られたプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁５０μＬのスペクトログラムは、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離される場合、保持時間（retention time）１．７５６、２．５７３、７．１１８、７．８５１、９．７１５、１０．２７８、１０．８６４、１１．２１２、１２．２８７、１２．７９９、１３．１７８、１３．４１３、１４．０２７、１４．７９４、１６．２５３、および１８．７４２分のピークを含む。
【００２１】
プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分の薬学上の効果を調べると、癌および／または腫瘍の治療において、５０ｋＤを超える分子量の画分が他の画分に比べてより強い効果を有することが見出される。本発明の一つの実施形態において、５０ｋＤを超える分子量の画分の０．００１％は、肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）増殖を阻害する強い能力を示し、他の画分は、同様の効果を得るために０．５％までの用量を要する。
【００２２】
本発明による５０ｋＤを超える分子量の画分は、高速液体クロマトグラフィーによって分析および同定することができる。例えば、内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍのＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって２１４ｎｍで得られた５０ｋＤを超える分子量の画分５０μＬのスペクトログラムは、５０ｋＤを超える分子量の画分が流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離される場合、保持時間（retention time）２．５７４、４．７９８、５．７２８、７．１０１、９．７０１、１０．２７９、１０．８０８、１１．１８９、１２．２３５、１３．３５、１３．５８４、１３．９０３、１４．１１３、１５．１１４、１６．２０６、１６．７３６、１８．６１９、２２．１３７、２４．６７６、および２６．９０２分のピークを含む。
【００２３】
本発明の一つの実施形態において、組成物はさらに抗腫瘍薬を含む。腫瘍の増殖は複雑なネットワーク共同作用を含むので、異なるネットワークを対象とする抗腫瘍薬を組合せることにより、合理的に治療効果を高めることができる。本発明の好ましい一つの実施形態において、抗腫瘍薬はパクリタキセルである。パクリタキセル（タキソールとも称される）は、後期Ｇ２Ｍ期において強い有糸分裂抑制特性を有する臨床抗癌剤であり、Ｂｃｌ−２リン酸化およびパクリタキセル誘発のアポトーシス機構を仲介することによって強い抗腫瘍特性を示す。さらに、パクリタキセルは、微小管に結合することによって、有糸分裂の阻害を促進することが見出されている（非特許文献１）。本発明の一つの実施形態において、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の５％および５０ｎＭのパクリタキセルを含む組成物は、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁またはパクリタキセルを単独で含む組成物に比べて、腫瘍増殖の阻害においてより強い効果を有する。これはｐ５３およびＢｃｌ−ｘＬアポトーシス経路のクロストーク（cross-talking）が、癌および／または腫瘍の治療において有効な方法であることを示唆している。
【００２４】
都合よく適用するために、本発明による組成物は、薬学上許容可能な担体中に配合される。
【００２５】
本明細書では、「薬学上許容可能な担体」には、任意かつすべての溶媒、分散媒、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。これらの薬学上許容可能な担体は、希釈剤、結合剤および接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、充填剤、ならびに種々の材料、例えば特定の治療組成物を調製するために必要となる可能性のある緩衝剤および吸収剤などを含む広範な材料から調製することができるが、これらに限定されるものではない。薬学上活性な物質にそのような媒質および薬剤を用いることは、当分野においてよく知られている。任意の従来からの媒質および薬剤が有効成分と不適合である場合を除いて、本発明の組成物においてその使用が企図される。
【００２６】
本発明による組成物は、いくつかの方法で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は、注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用される。
【００２７】
本発明による組成物を生成する方法も提供される。特に、葉汁は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去する、好ましくは風乾によって除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップを含む方法によって生成される。
【００２８】
本発明の一つの実施形態において、葉は、粉砕する、攪拌する、乱す、切断する、または切り刻むなどの従来からの方法で小片に処理される。
【００２９】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含む。本発明の一つの実施形態において、２４℃、５分間、１５０００ｒｐｍの遠心分離を２回行う。
【００３０】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、葉汁を滅菌するステップをさらに含む。本発明の一つの実施形態において、葉汁は、濾過によって滅菌される。
【００３１】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、葉汁を濃縮するステップをさらに含む。
【００３２】
本発明はさらに、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を提供する。
【００３３】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）葉汁から５０ｋＤ未満の分子量画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量の画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップを含む方法によって生成される。
【００３４】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を生成する方法は、ステップ（ｅ）を除いて、上述の生成する方法と類似している。分子量の範囲によって画分を分離する方法は、当分野で十分に開発されている。本発明の一つの実施形態は、分子量によって画分を分離するために、異なる孔径を有するフィルタが提供されるＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルタ装置を用いる。
【００３５】
以下の実施例は、例示のために示されるものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の調製
プレクトランサス・アンボイニクスを、Ｔａｉｗａｎ Ｅｎｄｅｍｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮａｎＴａｏ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。プレクトランサス・アンボイニクスを、多量の水で栽培した。プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取し、蒸留水で洗浄、風乾して残存する水を除去した。組織を、葉汁を含む微粒子に粉砕した。この葉汁を、２４℃、５分間、１５０００ｒｐｍの遠心分離によって減じた。透明な溶液を回収し、さらに５分間、２４℃、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り組織繊維を除去した。この汁を、０．２２μｍのシリンジフィルタで濾過して滅菌した。この新鮮な葉汁を、使用前暗所に４℃で保存した。すべての植物粗抽出物は、３日以内に用いるか、長期貯蔵のために−８０℃で保存した。
【００３７】
クロマトグラフ測定は、脱気装置（Ｄｅｇａｓｓｅｒ）を備えた１１００クォータナリポンプ、１１００可変波長検出器、および１１００標準オートサンプラーからなるＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００シリーズ液体クロマトグラフシステムで行った。さらなるピーク分析は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。
【００３８】
バルク溶媒および移動相を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）溶媒濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、０．２２μｍのナイロン膜フィルタ（Ａｌｌｔｅｃｈ（登録商標）Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）で濾過した。
【００３９】
カラムを流速１ｍｌ／分、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化した。ＰＢＳ中の１Ｘ未精製試料５０μＬを、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ１８カラム（内径４．６ｍｍ×１５ｃｍ）に注入し、２５℃に温度を設定したカラムオーブンにカラムを保持した。注入後、分析物を３０分で０〜６０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離した。分析物は２１４ｎｍで検出する。
【００４０】
クロマトグラフィーの結果を図１に示し、顕著なピークを表１に要約する。
【００４１】
【表１】
【実施例２】
【００４２】
葉汁に応答する細胞系のスクリーニング
細胞系：異なる組織学的起源の以下の９種のヒト腫瘍細胞系を、他に記載のない限り、市販の細胞培養コレクションから得た。ＨｅｐＧ２（肝細胞癌、肝臓、Ｄｒ．ＣＨ Ｈｕａｎｇ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、肝臓、Ｄｒ．ＣＨ Ｈｕａｎｇ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、Ｕ９３７（骨髄性白血病）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病、骨髄）、Ｃａｌｕ−１（類表皮癌、肺、Ｄｒ．ＹＣ Ｋｕｏ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、ＴＬ（栄養膜様細胞系、胎盤、Ｄｒ．ＣＫ Ｈｏ、Ｖｅｔｅｒａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）、Ｊｕｒｋｅｔ（ヒトリンパ芽球様（lymphoblastoid）Ｔ細胞系）、Ｂｏｗｅｓ（ヒト黒色腫細胞）、およびＨｕｈ７（肝細胞癌／外胚葉）。
【００４３】
ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた最小必須培地で培養した。Ｕ９３７およびＫ５６２細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ−１６４０で維持した。Ｃａｌｕ−１およびＴＬ細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた高グルコース、ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。
【００４４】
培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。すべての細胞試薬は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から得た。
【００４５】
処理：すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、実施例１に従って調製した３％の葉汁を、継代培養後の細胞に直接加えた。
【００４６】
細胞数カウント：２０μＬの細胞懸濁液を２０μＬの０．４％トリパンブルーに添加することによって総細胞数カウントを行い、位相差顕微鏡下でカウントした。
【００４７】
結果を表２に示す。「Ｏ」は、その細胞が葉汁に応答する（すなわち、処理後に細胞数が減少する）ことを示し、「Ｘ」は、その細胞が葉汁に応答しない（すなわち、処理後に細胞数が増加する）ことを示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
表２に示した結果によれば、ｐ５３遺伝子が機能性である細胞系が、葉汁に応答する。これにより葉汁がｐ５３ネットワークによって腫瘍増殖を調節することが証明された。
【実施例３】
【００５０】
肝細胞癌を治療するための葉汁
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および１％、３％、５％、７％、または９％の葉汁で処理した実験群に分類した。各群を８回（ＨｅｐＧ２）または４回（Ｈｕｈ７）繰り返した。
【００５１】
第１日、３日、および５日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図２および３、ならびに表３に示した。図２および３に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．００１）、第３日（Ｐ＜０．００１）、および第５日（Ｐ＜０．００１）において、用量依存的に増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：１．２×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：６．１８×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：１０．４４×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【００５２】
【表３】
【００５３】
第１日、３日、および５日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図４および５、ならびに表４に示した。図４および５に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．０５）、第３日（Ｐ＜０．００１）、および第５日（Ｐ＜０．００１）において、用量依存的に増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：０．４９×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：２．４７×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：３．６３×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【００５４】
【表４】
【実施例４】
【００５５】
黒色腫を治療するための葉汁
この実施例に用いた黒色腫細胞系はＢｏｗｅｓであり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりであった。細胞を、コントロール群（無処理）、および１％または３％の葉汁で処理した実験群に分類した。各群を５回繰り返した。
【００５６】
第１日、３日、および５日に各群のＢｏｗｅｓ細胞の細胞数を求め、図６に示した。図６に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．０５）および第５日（Ｐ＜０．００５）において、強い用量依存性を伴って増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：２．２２×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：３．２６×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：２５．８×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【実施例５】
【００５７】
肝細胞癌を治療するための葉汁および／またはパクリタキセル
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、ならびに５％の葉汁、５０ｎＭのパクリタキセル、５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せで処理した実験群に分類した。各群を６回繰り返した。
【００５８】
第３日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図７に示した。図７に関して、すべての実験群で細胞増殖が有意に阻害されたことがわかる。各実験群の阻害率は、５２．１３％（５％の葉汁：Ｐ＝０．０１７）、４３．７７％（５０ｎＭのパクリタキセル：Ｐ＝０．０５２）、または７６．５７％（５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せ：Ｐ＝０．０００）である。本発明による葉汁とパクリタキセルとの組合せが、単独の葉汁またはパクリタキセルに比べて、細胞増殖阻害により強い効果を示すことがわかる。
【００５９】
第３日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図８に示した。図８に関して、すべての実験群で細胞増殖が有意に阻害されたことがわかる。各実験群の阻害率は、５０．２１％（５％の葉汁：Ｐ＝０．１１０）、６６．０９％（５０ｎＭのパクリタキセル：Ｐ＝０．０２３）、または７４．６８％（５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せ：Ｐ＝０．００９）である。本発明による葉汁とパクリタキセルとの組合せが、単独の葉汁またはパクリタキセルに比べて、細胞増殖阻害により強い効果を示すことがわかる。
【実施例６】
【００６０】
肝細胞癌を治療するための葉汁の動物モデル
接種：実施例２に記載の条件で、Ｈｕｈ７細胞を培養して総数３×１０８の細胞を得た。次いで、それらの細胞を、細胞密度２×１０８細胞／ｍＬでＤＭＥＭに懸濁した。０．１ｍＬの細胞溶液を、５から６週齢、体重約２０ｇのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右背の皮下部に接種した。コントロールグループは、マウスに０．１ｍＬのＤＭＥＭを接種した。
【００６１】
処理：大腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍを超える、マウス１匹）、中腫瘍（大きさ７ｍｍ×７ｍｍから１０ｍｍ×１０ｍｍ、マウス１匹）、または小腫瘍（大きさ７ｍｍ×７ｍｍ未満、マウス２匹）を有するマウスを、実施例１の方法に従って調製した葉汁で処理した。葉汁の用量は１０％×マウス体重であった。葉汁を含むシリンジの針を、腫瘍周囲部の皮下空隙に貫通させ、その後、腫瘍内部に葉汁を注入した。この処理を腫瘍の寸法測定および体重計量と共に、毎月曜日、水曜日、および金曜日に行った。ブランク群は、１０％のＰＢＳを投与した。
【００６２】
結果：結果を図９に示す。葉汁による処理後、小腫瘍面積は減少した（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝−２．０９ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）。中腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．８３４、Ｂ＝６．１９ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害され、コントロール群のわずか２７．１％であった。しかしながら、大腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．９９５、Ｂ＝３４．３８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害されなかった。さらに、葉汁で処理したすべてのマウスの体重が減少した（無接種：Ｒ２＝０．１７８、Ｂ＝−０．１３ｇ／日、Ｐ＜０．０５、小腫瘍：Ｒ２＝０．２８１、Ｂ＝−０．０９ｇ／日、Ｐ＜０．０５１、中腫瘍：Ｒ２＝０．５７６、Ｂ＝−０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．０５、大腫瘍：Ｒ２＝０．２１０、Ｂ＝−０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．３０２）。無処理のマウスのみ、体重が増加した（Ｒ２＝０．７３０、Ｂ＝０．２４ｇ／日、Ｐ＜０．００１）（図１０に示す）。
【００６３】
再発：小腫瘍を有する群の投与を第１３日に停止し、腫瘍面積を継続的にモニターした。結果を図１１に示す。小腫瘍（Ｒ２＝０．５５８、Ｂ＝０．７２ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０５）が、コントロール群（Ｒ２＝０．６２２、Ｂ＝３０．６２ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）のわずか２．４％の増殖速度で増殖することがわかる。さらに、投与停止後、すべてのマウスの体重が増加した（ブランク：Ｒ２＝０．７４３、Ｂ＝０．５３ｇ／日、Ｐ＜０．００１、小腫瘍：Ｒ２＝０．０４５、Ｂ＝０．０２ｇ／日、Ｐ＜０．６１５、コントロール群：Ｒ２＝０．２１４、／Ｂ＝０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．０５）（図１２に示す）。
【実施例７】
【００６４】
黒色腫を治療するための葉汁の動物モデル
接種：実施例２に記載の条件で、Ｂｏｗｅｓ細胞を培養して総数３×１０８の細胞を得た。次いで、それらの細胞を、細胞密度２×１０８細胞／ｍＬでＤＭＥＭに懸濁した。０．１ｍＬの細胞溶液を、５から６週齢、体重約２０ｇのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右背の皮下部に接種した。コントロールグループは、マウスに０．１ｍＬのＤＭＥＭを接種した。
【００６５】
処理：大腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍを超える、マウス１匹）または小腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ未満、マウス２匹）を有するマウスを、実施例１の方法に従って調製した葉汁で処理した。葉汁の用量は１０％Ｘマウス体重であった。葉汁を含むシリンジの針を、腫瘍周囲部の皮下空隙に貫通させ、その後、腫瘍内部に葉汁を注入した。この処理を腫瘍の寸法測定および体重計量と共に、毎月曜日、水曜日、および金曜日に行った。ブランク群は、１０％のＰＢＳを投与した。
【００６６】
結果：結果を図１３に示す。葉汁による処理後、大腫瘍面積は減少した（Ｒ２＝０．９２４、Ｂ＝−３．０８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）。小腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝１．５０ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害され、コントロール群のわずか３７．７％であった。さらに、有意に体重の増加した無処理のマウスを除いて（Ｒ２＝０．８９７、Ｂ＝０．０９ｇ／日、Ｐ＜０．００１）、葉汁で処理したすべてのマウスの体重が少し増加した（図１４に示す）。
【００６７】
再発：小腫瘍を有する群の投与を第２４日に停止し、腫瘍面積を継続的にモニターした。結果を図１５に示す。投与停止後の小腫瘍の増殖速度（Ｒ２＝０．７５０、Ｂ＝４．１ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）が、投与時の増殖速度（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝１．５０ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）に比べて１７３％高いことがわかる。さらに、ＰＢＳ投与停止後のブランクマウスの腫瘍増殖速度（Ｒ２＝０．３２０、Ｂ＝５．１３ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）は、投与時の増殖速度（Ｒ２＝０．６０８、Ｂ＝３．９８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）に比べて２９％高い。小腫瘍群およびブランク群は、継続投与の停止後、類似の増殖速度を有した。さらに、葉汁による処理を停止した後、すべてのマウスの体重が少し増加し、ブランク群は小腫瘍群より有意に体重が増加した（Ｒ２＝０．３１５、Ｂ＝−０．０３ｇ／日、Ｐ＜０．０５）（図１６に示す）。
【実施例８】
【００６８】
ＨｅｐＧ２細胞増殖の阻害における葉汁の画分の効果
画分：実施例１で調製した葉汁を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルタ装置（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−１０、１００００公称分画分子量（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ）（ＮＭＷＬ）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−３０、３００００ＮＭＷＬ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−５０、５００００ＮＭＷＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を用いて、画分＃１（分子量＜１０Ｋ、２５×葉汁）、＃２（分子量＜１０ｋＤ、１×葉汁）、＃３（分子量１０ｋＤから３０ｋＤ、２５×葉汁）、＃４（分子量１０ｋＤから３０ｋＤ、１×葉汁）、＃５（分子量３０ｋＤから５０ｋＤ、２５×葉汁）、＃６（分子量３０ｋＤから５０ｋＤ、１×葉汁）、＃７（分子量＜５０ｋＤ、２５×葉汁）、＃８（分子量＞５０ｋＤ、２５×葉汁）、および＃９（分子量＞５０ｋＤ、１×葉汁）に分けた。
【００６９】
処理：葉汁の画分のスクリーニングに用いた細胞系はＨｅｐＧ２である。細胞系の操作は実施例２に記載のとおりであり、細胞数を第４日にカウントした。
【００７０】
第４日のＨｅｐＧ２の細胞生存を表５に例示する。
【００７１】
【表５】
【００７２】
画分＃１、＃２、＃３、＃７、＃８、および＃９が用量依存的に腫瘍増殖を阻害することがわかる。さらに、画分＃２および＃９は、他の画分に比べて、ＨｅｐＧ２細胞系においてより強い増殖阻害効果を有する。
【００７３】
１×および２５×葉汁、０％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、および３％の画分＃１、＃２、および＃９をさらにＨｅｐＧ２細胞の処理に用いた。各群を４から７回繰り返した。
【００７４】
この結果は、０．５％（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．００１）、および３％（Ｐ＜０．００１）画分＃２、０．０１％画分＃９（Ｐ＜０．００１）、１％葉汁（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．０１）および３％（Ｐ＜０．００１）２５×葉汁が、ＨｅｐＧ２増殖を有意に阻害することを示している。他方、１％１×葉汁（Ｐ＝０．８４８）および１％画分＃１（Ｐ＝０．０５２）は、有意な阻害効果を持たない。有効用量がわずか０．０１％である画分＃９がもっとも強い効果を有することがわかる。有効用量が０．５％である画分＃２も強い効果を有する。２５×葉汁の有効用量は１％である。０．５％、１％、および３％画分＃２、０．０１％画分＃９、３％１×葉汁、ならびに１％および３％２５×葉汁の阻害率は、それぞれ３４．３％、６２．８％、９８．７％、３９．７％、５４．８％、５３．６％、および８３．８％である。
【００７５】
１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数を図１７に示す。
【００７６】
１×（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．５２５）および２５×（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．６８９）葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．３３３）、＃２（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．７９２）、および＃９（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４９８）がＨｅｐＧ２増殖を用量依存的に有意に阻害することがわかる。第４日の１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は、それぞれ１０．２、１５．７、９．２２、１８．４、および４３．７×１０４である。阻害効果は、画分＃９＞画分＃２＞２５×葉汁＞１×葉汁＞画分＃１である。
【００７７】
同一用量の１×および２５×葉汁、画分＃１、＃２、および＃９の効果も分析する。結果を図１８に示す。
【００７８】
用量が０．１％および０．５％であるとき、画分＃９の効果は、１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１および＃２の効果より有意に高い（すべてＰ＜０．００１）。
【００７９】
用量が１％であるとき、画分＃９の効果は、１×葉汁（Ｐ＝０．００１）の効果より有意に高く、２５×葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＝０．０５９）および＃２（Ｐ＝０．０７２）の効果より有意である。さらに、画分＃２の効果は、１×葉汁の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０５）。
【００８０】
用量が０．００１％であるとき、画分＃９の効果は、２５×葉汁の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０６３）。
【００８１】
用量が０．１％であるとき、画分＃９の効果は、１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１および＃２の効果より有意に高い（すべてＰ＜０．００１）。
【実施例９】
【００８２】
肝細胞癌ＨｅｐＧ２を治療するための葉汁の画分＃９
画分＃９のクロマトグラフ測定を、実施例１に記載のとおり行った。
【００８３】
クロマトグラフィーの結果を図１９に示し、顕著なピークを表６に要約する。
【００８４】
【表６】
【００８５】
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および実施例８に記載の１×葉汁、０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、または１％の画分＃９で処理した実験群に分類した。各群を４から８回繰り返した。
【００８６】
第４日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図２０に示した。図２０に関して、１％（Ｐ＜０．００１）、０．５％（Ｐ＜０．００１）、０．１％（Ｐ＜０．００１）、および０．０１％（Ｐ＜０．００１）の画分＃９は有意な阻害効果を示す。さらに、０．００１％の画分＃９（Ｐ＝０．０９２）は、ほぼ有意に細胞増殖を阻害する。１％、０．５％、０．１％、０．０１％、および０．００１％の画分＃９の阻害率は、それぞれ９３．６％、９４．７％、９３．８％、３９．７％、および１８．５％である。画分＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は４３．６５×１０４である。
【実施例１０】
【００８７】
Ｈｕｈ７細胞増殖の阻害における葉汁の画分の効果
葉汁の画分を実施例８に記載のとおり調製する。
【００８８】
処理：葉汁の画分のスクリーニングに用いた細胞系はＨｕｈ７である。細胞系の操作は実施例２に記載のとおりであり、細胞数を第４日にカウントした。
【００８９】
第４日のＨｕｈ７の細胞生存を表７に例示する。
【００９０】
【表７】
【００９１】
画分＃１、＃２、および＃９が用量依存的に腫瘍増殖を阻害することを示す。
【００９２】
１×および２５×葉汁、０％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、および３％の画分＃１、＃２、および＃９をさらにＨｕｈ７細胞の処理に用いた。各群を４から７回繰り返した。
【００９３】
この結果は、１％（Ｐ＜０．０１）および３％（Ｐ＝０．００１）画分＃１、１％（Ｐ＜０．０５）および３％（Ｐ＜０．０５）画分＃２、０．０１％画分＃９（Ｐ＝０．０１）、ならびに０．５％（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．０５）、および３％（Ｐ＜０．０１）２５×葉汁が、Ｈｕｈ７増殖を有意に阻害することを示している。他方、１％（Ｐ＝０．９３７）および３％（Ｐ＝０．６６６）１×葉汁は、有意な阻害効果を示さない。有効用量がわずか０．０１％である画分＃９がもっとも強い効果を有することが示された。有効用量が０．５％である２５×葉汁も強い効果を有する。画分＃１および＃２の有効用量は１％である。１％および３％画分＃１、１％および３％画分＃２、０．０１％画分＃９、ならびに０．５％、１％、および３％２５×葉汁の阻害率は、それぞれ５９．３％、７６．２％、５３．９％、６４．２％、５３．７％、４９．９％、５３．９％、および６７．１％である。
【００９４】
１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数を図２１に示す。
【００９５】
１×（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．３４６）葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４２９）、＃２（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．３５４）、および＃９（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４４０）が、Ｈｕｈ７増殖を用量依存的に有意に阻害することがわかる。第４日の２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は、それぞれ４．４１、５．２２、４．５２、１５．８×１０４である。阻害効果は、画分＃９＞画分＃１＞画分＃２＞２５×葉汁＞１×葉汁である。
【００９６】
同一用量の１×および２５×葉汁、画分＃１、＃２、および＃９の効果も分析する。結果を図２２に示す。
【００９７】
用量が１％（Ｐ＜０．０１）および０．５％（Ｐ＜０．０１）であるとき、画分＃９の効果は、１×葉汁の効果より有意に高い。さらに、用量が０．５％であるとき、画分＃９の効果は、画分＃２の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０５）。
【実施例１１】
【００９８】
肝細胞癌Ｈｕｈ７を治療するための葉汁の画分＃９
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および実施例１０に記載のように１×葉汁、０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、または１％の画分＃９で処理した実験群に分類した。各群を４から６回繰り返した。
【００９９】
第４日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図２３に示した。図２３に関して、１％（Ｐ＜０．００１）、０．５％（Ｐ＜０．００１）、０．１％（Ｐ＜０．０５）、および０．０１％（Ｐ＜０．０５）の画分＃９は有意な阻害効果を示す。さらに、０．００１％の画分＃９（Ｐ＝０．０６７）は、ほぼ有意に細胞増殖を阻害する。１％、０．５％、０．１％、０．０１％、および０．００１％の画分＃９の阻害率は、それぞれ９０．８％、８８．６％、５８．５％、５３．７％、および４８．５％である。画分＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は１５．８×１０４である。
【０１００】
本発明の実施形態を例示および記載したが、当分野の技術者は様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本発明の実施形態は限定的な意味ではなく、例として記載されたものである。本発明は例示した特定の形態に限定されるものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱しないすべての修正は添付の請求の範囲に定義した範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁のＨＰＬＣスペクトログラムを例示する図である。
【図２】実施例３に記載の、葉汁のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図３】実施例３に記載の、葉汁処理後の日数とＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図４】実施例３に記載の、葉汁のパーセンテージとＨｕｈ７細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図５】実施例３に記載の、葉汁処理後の日数とＨｕｈ７細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図６】実施例４に記載の、葉汁処理後の日数とＢｏｗｅｓ細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図７】実施例５に記載の、第３日の葉汁および／またはパクリタキセルで処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図８】実施例５に記載の、第３日の葉汁および／またはパクリタキセルで処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図９】実施例６に記載の、葉汁で処理したＨｕｈ７接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１０】実施例６に記載の、葉汁で処理したＨｕｈ７接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１１】実施例６に記載の、葉汁処理停止後のＨｕｈ７接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１２】実施例６に記載の、葉汁処理停止後のＨｕｈ７接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１３】実施例７に記載の、葉汁で処理したＢｏｗｅｓ接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１４】実施例７に記載の、葉汁で処理したＢｏｗｅｓ接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１５】実施例７に記載の、葉汁処理停止後のＢｏｗｅｓ接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１６】実施例７に記載の、葉汁処理停止後のＢｏｗｅｓ接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１７】実施例８に記載の、葉汁およびその画分のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図１８】実施例８に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図１９】５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分のＨＰＬＣスペクトログラムを例示する図である。
【図２０】実施例９に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図２１】実施例１０に記載の、葉汁およびその画分のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図２２】実施例１０に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図２３】実施例１１に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および／または腫瘍を治療するための植物組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）（Ｌｏｕｒ．）Ｓｐｒｅｎｇ．、コリウス・アンボイニクス（Ｃｏｌｅｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）Ｌｏｕｒ．、コリウス・アロマチクス（Ｃｏｌｅｕｓ ａｒｏｍａｔｉｃｕｓ）Ｂｅｎｔｈ．、コリウス・クラシフォリウス（Ｃｏｌｅｕｓ ｃｒａｓｓｉｆｏｌｉｕｓ）Ｂｅｎｔｈ．、プレクトランサス・アロマチクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｒｏｍａｔｉｃｕｓ）（Ｂｅｎｔｈ．）Ｒｏｘｂ．、コリウス・スガンダ（Ｃｏｌｅｕｓ ｓｕｇａｎｄａ）Ｂｌａｎｃｏ、コリウス・カルノサス（Ｃｏｌｅｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）Ｈａｓｓｋ．、およびマジャンダ・アンボイニカ（Ｍａｊａｎａ ａｍｂｏｉｎｉｃａ）（Ｌｏｕｒ．）Ｋｕｎｔｚｅの別名でも知られるプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）は、シソ（Ｌａｂｉａｔａｅ）属に属し、以下の一般名を有する。野生のルリチシャ（country borage）、キューバンオレガノ、インディアンルリチシャ (borage）、アンボイニ（Ａｍｂｏｉｎｉ）コリウス、フレンチタイム、メキシカンミント、スパニッシュタイム、タオシュウシアン（Ｔａｏ−ｓｈｏｕ−ｈｓｉａｎｇ）、およびスープミント。プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）は、熱帯地方（アフリカ、インド、東南アジア、西インド諸島、メキシコ、近年は米国南部の一部）で、薬用植物、香味野菜、および香辛料として栽培されている。その芳香性の葉は、肉に風味をつける、肉、スープ、魚、地ビールに味をつける、野菜として摂取する、衣類および髪を洗うために使用するために用いられている。プレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）はまた、極東においてその精油のために、ならびに観賞植物として栽培されている。
【０００３】
プレクトランサス・アンボイニクスはまた、伝統的な治療において用いられている。例えば、葉を煎じた液（ハチミツで甘味をつけたもの）は、咳および感冒を緩和することができる。さらに、葉を強く摩擦することによって得られた気体は、鼻詰まりを解消するのに役立つ。台湾では、プレクトランサス・アンボイニクスは、局所適用、例えば熱傷、咬傷、白癬、および水腫など、ならびに内服適用、例えば駆風および喘息鎮静などのために広く用いられている。さらに、プレクトランサス・アンボイニクスは、何十年にもわたって、その抗菌および抗真菌性がよく知られている。最近、プレクトランサス・アンボイニクス由来のジテルペンラクトン類、トリテルペン類、およびオレアノール酸が、誘導性ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２活性を阻害することによって、動物において炎症反応を阻害することが明らかにされた（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６）。
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００６８０９８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００７６４５２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００７７３５０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／０１１０６０４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１０８６２８号明細書
【特許文献６】米国特許第６６２９８３５号明細書
【特許文献７】米国特許第５３８２５１０号明細書
【特許文献８】米国特許第５８４０５７９号明細書
【特許文献９】米国特許第６１８３９６４号明細書
【特許文献１０】米国特許第６４７２３８５号明細書
【特許文献１１】米国特許第６５３１５１２号明細書
【非特許文献１】Lanni S. Jennifer, Lowe W. Scott, Licitra J. Edward, Liu O. Jun, Jacks Tyler, P53-independent apoptosis induced by paclitaxel through an indirect mechanism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol94, September 1997, 9979-9683
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらの従来技術の文献はいずれもプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁が、癌および／または腫瘍の治療に効果を有することを教示または示唆していない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、そのような治療を必要としている対象に本発明の組成物を投与することを含む、癌および／または腫瘍を治療するための方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、本発明の組成物を生成する方法であって、葉汁が、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップを含む方法によって生成される方法を提供する。
【０００９】
本発明の特定の一つの実施形態は、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物である。
【００１０】
したがって、本発明はさらに、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分が、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）葉汁から５０ｋＤ未満の分子量画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップを含む
方法によって生成される方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明によって、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁は、意外にも癌および／または腫瘍の治療において劇的な効果を有することが見出される。
【００１２】
本発明によって、有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物が提供される。
【００１３】
本明細書では、「葉抽出物」とも称される「葉汁」という用語は、天然に葉に含まれる流体を指す。葉汁は、組織片および／または残留物を除去することによって得ることができる。
【００１４】
本明細書では、「腫瘍」という用語は、身体の任意の部分における病的腫脹、隆起、または増殖、特に新しい組織の沈着によって生成された増殖、新生物（腫瘍）を指す。本明細書では、「悪性腫瘍性疾患」または「癌」とも称される「悪性腫瘍」という用語は、異常かつ無制御な細胞分裂に起因する腫瘍増殖を指し、これはリンパ系または血流によって身体の他の部分に広がるかもしれない。
【００１５】
本明細書では、「有効量」という用語は、動物に投与されたとき、その動物において所望の効果を有する組成物の量を指す。例えば、腫瘍を治療するための組成物の有効量は、動物において腫瘍増殖を制御し、および／または腫瘍を消失させる量である。
【００１６】
本発明の一つの実施形態において、本発明による組成物は、悪性腫瘍の増殖を阻害するために用いられる。本発明の他の実施形態において、本発明による組成物で処理されたとき、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、およびＢｏｗｅｓなどの悪性腫瘍細胞の数は減少し、さらには除去される。
【００１７】
本発明による組成物に応答する腫瘍細胞系をスクリーニングすると、この組成物がｐ５３ネットワークによって腫瘍の増殖を調節することが見出される。本発明による組成物は、そのｐ５３遺伝子が、野生型、部分的に機能性を有するもの、および突然変異活性を有するものを含む機能性を有するものである腫瘍細胞の細胞増殖を阻害する。したがって、本発明によって治療される腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍である。
【００１８】
ｐ５３ネットワークは、細胞周期Ｇ１チェックポイントの分子センサーであり、ＤＮＡ損傷、ヌクレオチドプールのレベル、紡錘体の状態、および遺伝毒性ストレスをモニターする。ｐ５３ネットワークはさらに、細胞周期の進行、プログラムされた細胞死、複製による老化、および場合により分化を調節する。したがって、ｐ５３は腫瘍抑制遺伝子とされている。実際、すべてのヒトの癌の半分以上が、１つまたは複数のｐ５３の変化に関連する。代わりに、突然変異ｐ５３タンパク質は、野生型ｐ５３と無関係である新しい腫瘍促進活性を獲得した可能性がある。ｐ５３ネットワークを対象とする悪性腫瘍を治療するいくつかの方策が開発されている（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１）。
【００１９】
本発明の一つの実施形態において、治療される腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫（メラノーマ）を含む。より好ましくは、治療される腫瘍は、ｐ５３ネットワークに関連する肝細胞癌および黒色腫を含む。
【００２０】
本発明によるプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析および同定することができる。例えば、内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍのＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって２１４ｎｍで得られたプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁５０μＬのスペクトログラムは、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離される場合、保持時間（retention time）１．７５６、２．５７３、７．１１８、７．８５１、９．７１５、１０．２７８、１０．８６４、１１．２１２、１２．２８７、１２．７９９、１３．１７８、１３．４１３、１４．０２７、１４．７９４、１６．２５３、および１８．７４２分のピークを含む。
【００２１】
プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分の薬学上の効果を調べると、癌および／または腫瘍の治療において、５０ｋＤを超える分子量の画分が他の画分に比べてより強い効果を有することが見出される。本発明の一つの実施形態において、５０ｋＤを超える分子量の画分の０．００１％は、肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）増殖を阻害する強い能力を示し、他の画分は、同様の効果を得るために０．５％までの用量を要する。
【００２２】
本発明による５０ｋＤを超える分子量の画分は、高速液体クロマトグラフィーによって分析および同定することができる。例えば、内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍのＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーによって２１４ｎｍで得られた５０ｋＤを超える分子量の画分５０μＬのスペクトログラムは、５０ｋＤを超える分子量の画分が流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離される場合、保持時間（retention time）２．５７４、４．７９８、５．７２８、７．１０１、９．７０１、１０．２７９、１０．８０８、１１．１８９、１２．２３５、１３．３５、１３．５８４、１３．９０３、１４．１１３、１５．１１４、１６．２０６、１６．７３６、１８．６１９、２２．１３７、２４．６７６、および２６．９０２分のピークを含む。
【００２３】
本発明の一つの実施形態において、組成物はさらに抗腫瘍薬を含む。腫瘍の増殖は複雑なネットワーク共同作用を含むので、異なるネットワークを対象とする抗腫瘍薬を組合せることにより、合理的に治療効果を高めることができる。本発明の好ましい一つの実施形態において、抗腫瘍薬はパクリタキセルである。パクリタキセル（タキソールとも称される）は、後期Ｇ２Ｍ期において強い有糸分裂抑制特性を有する臨床抗癌剤であり、Ｂｃｌ−２リン酸化およびパクリタキセル誘発のアポトーシス機構を仲介することによって強い抗腫瘍特性を示す。さらに、パクリタキセルは、微小管に結合することによって、有糸分裂の阻害を促進することが見出されている（非特許文献１）。本発明の一つの実施形態において、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の５％および５０ｎＭのパクリタキセルを含む組成物は、プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁またはパクリタキセルを単独で含む組成物に比べて、腫瘍増殖の阻害においてより強い効果を有する。これはｐ５３およびＢｃｌ−ｘＬアポトーシス経路のクロストーク（cross-talking）が、癌および／または腫瘍の治療において有効な方法であることを示唆している。
【００２４】
都合よく適用するために、本発明による組成物は、薬学上許容可能な担体中に配合される。
【００２５】
本明細書では、「薬学上許容可能な担体」には、任意かつすべての溶媒、分散媒、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。これらの薬学上許容可能な担体は、希釈剤、結合剤および接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、充填剤、ならびに種々の材料、例えば特定の治療組成物を調製するために必要となる可能性のある緩衝剤および吸収剤などを含む広範な材料から調製することができるが、これらに限定されるものではない。薬学上活性な物質にそのような媒質および薬剤を用いることは、当分野においてよく知られている。任意の従来からの媒質および薬剤が有効成分と不適合である場合を除いて、本発明の組成物においてその使用が企図される。
【００２６】
本発明による組成物は、いくつかの方法で対象に投与することができる。好ましくは、組成物は、注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用される。
【００２７】
本発明による組成物を生成する方法も提供される。特に、葉汁は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去する、好ましくは風乾によって除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップを含む方法によって生成される。
【００２８】
本発明の一つの実施形態において、葉は、粉砕する、攪拌する、乱す、切断する、または切り刻むなどの従来からの方法で小片に処理される。
【００２９】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含む。本発明の一つの実施形態において、２４℃、５分間、１５０００ｒｐｍの遠心分離を２回行う。
【００３０】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、葉汁を滅菌するステップをさらに含む。本発明の一つの実施形態において、葉汁は、濾過によって滅菌される。
【００３１】
任意選択的に、葉汁を生成する方法は、葉汁を濃縮するステップをさらに含む。
【００３２】
本発明はさらに、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を提供する。
【００３３】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含む、癌および／または腫瘍を治療するための組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）葉汁から５０ｋＤ未満の分子量画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量の画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップを含む方法によって生成される。
【００３４】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を生成する方法は、ステップ（ｅ）を除いて、上述の生成する方法と類似している。分子量の範囲によって画分を分離する方法は、当分野で十分に開発されている。本発明の一つの実施形態は、分子量によって画分を分離するために、異なる孔径を有するフィルタが提供されるＡｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルタ装置を用いる。
【００３５】
以下の実施例は、例示のために示されるものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の調製
プレクトランサス・アンボイニクスを、Ｔａｉｗａｎ Ｅｎｄｅｍｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮａｎＴａｏ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。プレクトランサス・アンボイニクスを、多量の水で栽培した。プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取し、蒸留水で洗浄、風乾して残存する水を除去した。組織を、葉汁を含む微粒子に粉砕した。この葉汁を、２４℃、５分間、１５０００ｒｐｍの遠心分離によって減じた。透明な溶液を回収し、さらに５分間、２４℃、１５０００ｒｐｍで遠心分離し、可能な限り組織繊維を除去した。この汁を、０．２２μｍのシリンジフィルタで濾過して滅菌した。この新鮮な葉汁を、使用前暗所に４℃で保存した。すべての植物粗抽出物は、３日以内に用いるか、長期貯蔵のために−８０℃で保存した。
【００３７】
クロマトグラフ測定は、脱気装置（Ｄｅｇａｓｓｅｒ）を備えた１１００クォータナリポンプ、１１００可変波長検出器、および１１００標準オートサンプラーからなるＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００シリーズ液体クロマトグラフシステムで行った。さらなるピーク分析は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。
【００３８】
バルク溶媒および移動相を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）溶媒濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、０．２２μｍのナイロン膜フィルタ（Ａｌｌｔｅｃｈ（登録商標）Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｐｔｙ．Ｌｔｄ）で濾過した。
【００３９】
カラムを流速１ｍｌ／分、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化した。ＰＢＳ中の１Ｘ未精製試料５０μＬを、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）Ｃ１８カラム（内径４．６ｍｍ×１５ｃｍ）に注入し、２５℃に温度を設定したカラムオーブンにカラムを保持した。注入後、分析物を３０分で０〜６０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離した。分析物は２１４ｎｍで検出する。
【００４０】
クロマトグラフィーの結果を図１に示し、顕著なピークを表１に要約する。
【００４１】
【表１】
【実施例２】
【００４２】
葉汁に応答する細胞系のスクリーニング
細胞系：異なる組織学的起源の以下の９種のヒト腫瘍細胞系を、他に記載のない限り、市販の細胞培養コレクションから得た。ＨｅｐＧ２（肝細胞癌、肝臓、Ｄｒ．ＣＨ Ｈｕａｎｇ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、Ｈｅｐ３Ｂ（肝細胞癌、肝臓、Ｄｒ．ＣＨ Ｈｕａｎｇ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、Ｕ９３７（骨髄性白血病）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病、骨髄）、Ｃａｌｕ−１（類表皮癌、肺、Ｄｒ．ＹＣ Ｋｕｏ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎにより提供）、ＴＬ（栄養膜様細胞系、胎盤、Ｄｒ．ＣＫ Ｈｏ、Ｖｅｔｅｒａｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）、Ｊｕｒｋｅｔ（ヒトリンパ芽球様（lymphoblastoid）Ｔ細胞系）、Ｂｏｗｅｓ（ヒト黒色腫細胞）、およびＨｕｈ７（肝細胞癌／外胚葉）。
【００４３】
ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた最小必須培地で培養した。Ｕ９３７およびＫ５６２細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ−１６４０で維持した。Ｃａｌｕ−１およびＴＬ細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、および５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた高グルコース、ダルベッコ改変イーグル培地で培養した。
【００４４】
培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、３７℃で維持した。すべての細胞試薬は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から得た。
【００４５】
処理：すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、実施例１に従って調製した３％の葉汁を、継代培養後の細胞に直接加えた。
【００４６】
細胞数カウント：２０μＬの細胞懸濁液を２０μＬの０．４％トリパンブルーに添加することによって総細胞数カウントを行い、位相差顕微鏡下でカウントした。
【００４７】
結果を表２に示す。「Ｏ」は、その細胞が葉汁に応答する（すなわち、処理後に細胞数が減少する）ことを示し、「Ｘ」は、その細胞が葉汁に応答しない（すなわち、処理後に細胞数が増加する）ことを示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
表２に示した結果によれば、ｐ５３遺伝子が機能性である細胞系が、葉汁に応答する。これにより葉汁がｐ５３ネットワークによって腫瘍増殖を調節することが証明された。
【実施例３】
【００５０】
肝細胞癌を治療するための葉汁
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および１％、３％、５％、７％、または９％の葉汁で処理した実験群に分類した。各群を８回（ＨｅｐＧ２）または４回（Ｈｕｈ７）繰り返した。
【００５１】
第１日、３日、および５日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図２および３、ならびに表３に示した。図２および３に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．００１）、第３日（Ｐ＜０．００１）、および第５日（Ｐ＜０．００１）において、用量依存的に増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：１．２×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：６．１８×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：１０．４４×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【００５２】
【表３】
【００５３】
第１日、３日、および５日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図４および５、ならびに表４に示した。図４および５に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．０５）、第３日（Ｐ＜０．００１）、および第５日（Ｐ＜０．００１）において、用量依存的に増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：０．４９×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：２．４７×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：３．６３×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【００５４】
【表４】
【実施例４】
【００５５】
黒色腫を治療するための葉汁
この実施例に用いた黒色腫細胞系はＢｏｗｅｓであり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりであった。細胞を、コントロール群（無処理）、および１％または３％の葉汁で処理した実験群に分類した。各群を５回繰り返した。
【００５６】
第１日、３日、および５日に各群のＢｏｗｅｓ細胞の細胞数を求め、図６に示した。図６に関して、葉汁の阻害効果は、第１日（Ｐ＜０．０５）および第５日（Ｐ＜０．００５）において、強い用量依存性を伴って増大する。さらに、葉汁の阻害効果は、第１日（阻害細胞数／葉汁％：２．２２×１０４）、第３日（阻害細胞数／葉汁％：３．２６×１０４）、および第５日（阻害細胞数／葉汁％：２５．８×１０４）において、処理期間が長くなるにつれて増大する。
【実施例５】
【００５７】
肝細胞癌を治療するための葉汁および／またはパクリタキセル
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、ならびに５％の葉汁、５０ｎＭのパクリタキセル、５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せで処理した実験群に分類した。各群を６回繰り返した。
【００５８】
第３日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図７に示した。図７に関して、すべての実験群で細胞増殖が有意に阻害されたことがわかる。各実験群の阻害率は、５２．１３％（５％の葉汁：Ｐ＝０．０１７）、４３．７７％（５０ｎＭのパクリタキセル：Ｐ＝０．０５２）、または７６．５７％（５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せ：Ｐ＝０．０００）である。本発明による葉汁とパクリタキセルとの組合せが、単独の葉汁またはパクリタキセルに比べて、細胞増殖阻害により強い効果を示すことがわかる。
【００５９】
第３日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図８に示した。図８に関して、すべての実験群で細胞増殖が有意に阻害されたことがわかる。各実験群の阻害率は、５０．２１％（５％の葉汁：Ｐ＝０．１１０）、６６．０９％（５０ｎＭのパクリタキセル：Ｐ＝０．０２３）、または７４．６８％（５％の葉汁と５０ｎＭのパクリタキセルとの組合せ：Ｐ＝０．００９）である。本発明による葉汁とパクリタキセルとの組合せが、単独の葉汁またはパクリタキセルに比べて、細胞増殖阻害により強い効果を示すことがわかる。
【実施例６】
【００６０】
肝細胞癌を治療するための葉汁の動物モデル
接種：実施例２に記載の条件で、Ｈｕｈ７細胞を培養して総数３×１０８の細胞を得た。次いで、それらの細胞を、細胞密度２×１０８細胞／ｍＬでＤＭＥＭに懸濁した。０．１ｍＬの細胞溶液を、５から６週齢、体重約２０ｇのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右背の皮下部に接種した。コントロールグループは、マウスに０．１ｍＬのＤＭＥＭを接種した。
【００６１】
処理：大腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍを超える、マウス１匹）、中腫瘍（大きさ７ｍｍ×７ｍｍから１０ｍｍ×１０ｍｍ、マウス１匹）、または小腫瘍（大きさ７ｍｍ×７ｍｍ未満、マウス２匹）を有するマウスを、実施例１の方法に従って調製した葉汁で処理した。葉汁の用量は１０％×マウス体重であった。葉汁を含むシリンジの針を、腫瘍周囲部の皮下空隙に貫通させ、その後、腫瘍内部に葉汁を注入した。この処理を腫瘍の寸法測定および体重計量と共に、毎月曜日、水曜日、および金曜日に行った。ブランク群は、１０％のＰＢＳを投与した。
【００６２】
結果：結果を図９に示す。葉汁による処理後、小腫瘍面積は減少した（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝−２．０９ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）。中腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．８３４、Ｂ＝６．１９ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害され、コントロール群のわずか２７．１％であった。しかしながら、大腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．９９５、Ｂ＝３４．３８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害されなかった。さらに、葉汁で処理したすべてのマウスの体重が減少した（無接種：Ｒ２＝０．１７８、Ｂ＝−０．１３ｇ／日、Ｐ＜０．０５、小腫瘍：Ｒ２＝０．２８１、Ｂ＝−０．０９ｇ／日、Ｐ＜０．０５１、中腫瘍：Ｒ２＝０．５７６、Ｂ＝−０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．０５、大腫瘍：Ｒ２＝０．２１０、Ｂ＝−０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．３０２）。無処理のマウスのみ、体重が増加した（Ｒ２＝０．７３０、Ｂ＝０．２４ｇ／日、Ｐ＜０．００１）（図１０に示す）。
【００６３】
再発：小腫瘍を有する群の投与を第１３日に停止し、腫瘍面積を継続的にモニターした。結果を図１１に示す。小腫瘍（Ｒ２＝０．５５８、Ｂ＝０．７２ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０５）が、コントロール群（Ｒ２＝０．６２２、Ｂ＝３０．６２ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）のわずか２．４％の増殖速度で増殖することがわかる。さらに、投与停止後、すべてのマウスの体重が増加した（ブランク：Ｒ２＝０．７４３、Ｂ＝０．５３ｇ／日、Ｐ＜０．００１、小腫瘍：Ｒ２＝０．０４５、Ｂ＝０．０２ｇ／日、Ｐ＜０．６１５、コントロール群：Ｒ２＝０．２１４、／Ｂ＝０．１１ｇ／日、Ｐ＜０．０５）（図１２に示す）。
【実施例７】
【００６４】
黒色腫を治療するための葉汁の動物モデル
接種：実施例２に記載の条件で、Ｂｏｗｅｓ細胞を培養して総数３×１０８の細胞を得た。次いで、それらの細胞を、細胞密度２×１０８細胞／ｍＬでＤＭＥＭに懸濁した。０．１ｍＬの細胞溶液を、５から６週齢、体重約２０ｇのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右背の皮下部に接種した。コントロールグループは、マウスに０．１ｍＬのＤＭＥＭを接種した。
【００６５】
処理：大腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍを超える、マウス１匹）または小腫瘍（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ未満、マウス２匹）を有するマウスを、実施例１の方法に従って調製した葉汁で処理した。葉汁の用量は１０％Ｘマウス体重であった。葉汁を含むシリンジの針を、腫瘍周囲部の皮下空隙に貫通させ、その後、腫瘍内部に葉汁を注入した。この処理を腫瘍の寸法測定および体重計量と共に、毎月曜日、水曜日、および金曜日に行った。ブランク群は、１０％のＰＢＳを投与した。
【００６６】
結果：結果を図１３に示す。葉汁による処理後、大腫瘍面積は減少した（Ｒ２＝０．９２４、Ｂ＝−３．０８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）。小腫瘍の増殖（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝１．５０ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）は阻害され、コントロール群のわずか３７．７％であった。さらに、有意に体重の増加した無処理のマウスを除いて（Ｒ２＝０．８９７、Ｂ＝０．０９ｇ／日、Ｐ＜０．００１）、葉汁で処理したすべてのマウスの体重が少し増加した（図１４に示す）。
【００６７】
再発：小腫瘍を有する群の投与を第２４日に停止し、腫瘍面積を継続的にモニターした。結果を図１５に示す。投与停止後の小腫瘍の増殖速度（Ｒ２＝０．７５０、Ｂ＝４．１ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）が、投与時の増殖速度（Ｒ２＝０．５６４、Ｂ＝１．５０ｍｍ２／日、Ｐ＜０．０１）に比べて１７３％高いことがわかる。さらに、ＰＢＳ投与停止後のブランクマウスの腫瘍増殖速度（Ｒ２＝０．３２０、Ｂ＝５．１３ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）は、投与時の増殖速度（Ｒ２＝０．６０８、Ｂ＝３．９８ｍｍ２／日、Ｐ＜０．００１）に比べて２９％高い。小腫瘍群およびブランク群は、継続投与の停止後、類似の増殖速度を有した。さらに、葉汁による処理を停止した後、すべてのマウスの体重が少し増加し、ブランク群は小腫瘍群より有意に体重が増加した（Ｒ２＝０．３１５、Ｂ＝−０．０３ｇ／日、Ｐ＜０．０５）（図１６に示す）。
【実施例８】
【００６８】
ＨｅｐＧ２細胞増殖の阻害における葉汁の画分の効果
画分：実施例１で調製した葉汁を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルタ装置（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−１０、１００００公称分画分子量（Ｎｏｍｉｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｌｉｍｉｔ）（ＮＭＷＬ）、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−３０、３００００ＮＭＷＬ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＰＬ−５０、５００００ＮＭＷＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を用いて、画分＃１（分子量＜１０Ｋ、２５×葉汁）、＃２（分子量＜１０ｋＤ、１×葉汁）、＃３（分子量１０ｋＤから３０ｋＤ、２５×葉汁）、＃４（分子量１０ｋＤから３０ｋＤ、１×葉汁）、＃５（分子量３０ｋＤから５０ｋＤ、２５×葉汁）、＃６（分子量３０ｋＤから５０ｋＤ、１×葉汁）、＃７（分子量＜５０ｋＤ、２５×葉汁）、＃８（分子量＞５０ｋＤ、２５×葉汁）、および＃９（分子量＞５０ｋＤ、１×葉汁）に分けた。
【００６９】
処理：葉汁の画分のスクリーニングに用いた細胞系はＨｅｐＧ２である。細胞系の操作は実施例２に記載のとおりであり、細胞数を第４日にカウントした。
【００７０】
第４日のＨｅｐＧ２の細胞生存を表５に例示する。
【００７１】
【表５】
【００７２】
画分＃１、＃２、＃３、＃７、＃８、および＃９が用量依存的に腫瘍増殖を阻害することがわかる。さらに、画分＃２および＃９は、他の画分に比べて、ＨｅｐＧ２細胞系においてより強い増殖阻害効果を有する。
【００７３】
１×および２５×葉汁、０％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、および３％の画分＃１、＃２、および＃９をさらにＨｅｐＧ２細胞の処理に用いた。各群を４から７回繰り返した。
【００７４】
この結果は、０．５％（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．００１）、および３％（Ｐ＜０．００１）画分＃２、０．０１％画分＃９（Ｐ＜０．００１）、１％葉汁（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．０１）および３％（Ｐ＜０．００１）２５×葉汁が、ＨｅｐＧ２増殖を有意に阻害することを示している。他方、１％１×葉汁（Ｐ＝０．８４８）および１％画分＃１（Ｐ＝０．０５２）は、有意な阻害効果を持たない。有効用量がわずか０．０１％である画分＃９がもっとも強い効果を有することがわかる。有効用量が０．５％である画分＃２も強い効果を有する。２５×葉汁の有効用量は１％である。０．５％、１％、および３％画分＃２、０．０１％画分＃９、３％１×葉汁、ならびに１％および３％２５×葉汁の阻害率は、それぞれ３４．３％、６２．８％、９８．７％、３９．７％、５４．８％、５３．６％、および８３．８％である。
【００７５】
１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数を図１７に示す。
【００７６】
１×（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．５２５）および２５×（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．６８９）葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．３３３）、＃２（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．７９２）、および＃９（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４９８）がＨｅｐＧ２増殖を用量依存的に有意に阻害することがわかる。第４日の１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は、それぞれ１０．２、１５．７、９．２２、１８．４、および４３．７×１０４である。阻害効果は、画分＃９＞画分＃２＞２５×葉汁＞１×葉汁＞画分＃１である。
【００７７】
同一用量の１×および２５×葉汁、画分＃１、＃２、および＃９の効果も分析する。結果を図１８に示す。
【００７８】
用量が０．１％および０．５％であるとき、画分＃９の効果は、１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１および＃２の効果より有意に高い（すべてＰ＜０．００１）。
【００７９】
用量が１％であるとき、画分＃９の効果は、１×葉汁（Ｐ＝０．００１）の効果より有意に高く、２５×葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＝０．０５９）および＃２（Ｐ＝０．０７２）の効果より有意である。さらに、画分＃２の効果は、１×葉汁の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０５）。
【００８０】
用量が０．００１％であるとき、画分＃９の効果は、２５×葉汁の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０６３）。
【００８１】
用量が０．１％であるとき、画分＃９の効果は、１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１および＃２の効果より有意に高い（すべてＰ＜０．００１）。
【実施例９】
【００８２】
肝細胞癌ＨｅｐＧ２を治療するための葉汁の画分＃９
画分＃９のクロマトグラフ測定を、実施例１に記載のとおり行った。
【００８３】
クロマトグラフィーの結果を図１９に示し、顕著なピークを表６に要約する。
【００８４】
【表６】
【００８５】
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｅｐＧ２であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および実施例８に記載の１×葉汁、０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、または１％の画分＃９で処理した実験群に分類した。各群を４から８回繰り返した。
【００８６】
第４日に各群のＨｅｐＧ２細胞の細胞数を求め、図２０に示した。図２０に関して、１％（Ｐ＜０．００１）、０．５％（Ｐ＜０．００１）、０．１％（Ｐ＜０．００１）、および０．０１％（Ｐ＜０．００１）の画分＃９は有意な阻害効果を示す。さらに、０．００１％の画分＃９（Ｐ＝０．０９２）は、ほぼ有意に細胞増殖を阻害する。１％、０．５％、０．１％、０．０１％、および０．００１％の画分＃９の阻害率は、それぞれ９３．６％、９４．７％、９３．８％、３９．７％、および１８．５％である。画分＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は４３．６５×１０４である。
【実施例１０】
【００８７】
Ｈｕｈ７細胞増殖の阻害における葉汁の画分の効果
葉汁の画分を実施例８に記載のとおり調製する。
【００８８】
処理：葉汁の画分のスクリーニングに用いた細胞系はＨｕｈ７である。細胞系の操作は実施例２に記載のとおりであり、細胞数を第４日にカウントした。
【００８９】
第４日のＨｕｈ７の細胞生存を表７に例示する。
【００９０】
【表７】
【００９１】
画分＃１、＃２、および＃９が用量依存的に腫瘍増殖を阻害することを示す。
【００９２】
１×および２５×葉汁、０％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、および３％の画分＃１、＃２、および＃９をさらにＨｕｈ７細胞の処理に用いた。各群を４から７回繰り返した。
【００９３】
この結果は、１％（Ｐ＜０．０１）および３％（Ｐ＝０．００１）画分＃１、１％（Ｐ＜０．０５）および３％（Ｐ＜０．０５）画分＃２、０．０１％画分＃９（Ｐ＝０．０１）、ならびに０．５％（Ｐ＜０．０５）、１％（Ｐ＜０．０５）、および３％（Ｐ＜０．０１）２５×葉汁が、Ｈｕｈ７増殖を有意に阻害することを示している。他方、１％（Ｐ＝０．９３７）および３％（Ｐ＝０．６６６）１×葉汁は、有意な阻害効果を示さない。有効用量がわずか０．０１％である画分＃９がもっとも強い効果を有することが示された。有効用量が０．５％である２５×葉汁も強い効果を有する。画分＃１および＃２の有効用量は１％である。１％および３％画分＃１、１％および３％画分＃２、０．０１％画分＃９、ならびに０．５％、１％、および３％２５×葉汁の阻害率は、それぞれ５９．３％、７６．２％、５３．９％、６４．２％、５３．７％、４９．９％、５３．９％、および６７．１％である。
【００９４】
１×および２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数を図２１に示す。
【００９５】
１×（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．３４６）葉汁、ならびに画分＃１（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４２９）、＃２（Ｐ＝０．００１、Ｒ２＝０．３５４）、および＃９（Ｐ＜０．００１、Ｒ２＝０．４４０）が、Ｈｕｈ７増殖を用量依存的に有意に阻害することがわかる。第４日の２５×葉汁、ならびに画分＃１、＃２、および＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は、それぞれ４．４１、５．２２、４．５２、１５．８×１０４である。阻害効果は、画分＃９＞画分＃１＞画分＃２＞２５×葉汁＞１×葉汁である。
【００９６】
同一用量の１×および２５×葉汁、画分＃１、＃２、および＃９の効果も分析する。結果を図２２に示す。
【００９７】
用量が１％（Ｐ＜０．０１）および０．５％（Ｐ＜０．０１）であるとき、画分＃９の効果は、１×葉汁の効果より有意に高い。さらに、用量が０．５％であるとき、画分＃９の効果は、画分＃２の効果より有意に高い（Ｐ＝０．０５）。
【実施例１１】
【００９８】
肝細胞癌Ｈｕｈ７を治療するための葉汁の画分＃９
この実施例に用いた肝細胞癌細胞系はＨｕｈ７であり、細胞培養および処理の操作は実施例２に記載のとおりである。細胞を、コントロール群（無処理）、および実施例１０に記載のように１×葉汁、０％、０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、または１％の画分＃９で処理した実験群に分類した。各群を４から６回繰り返した。
【００９９】
第４日に各群のＨｕｈ７細胞の細胞数を求め、図２３に示した。図２３に関して、１％（Ｐ＜０．００１）、０．５％（Ｐ＜０．００１）、０．１％（Ｐ＜０．０５）、および０．０１％（Ｐ＜０．０５）の画分＃９は有意な阻害効果を示す。さらに、０．００１％の画分＃９（Ｐ＝０．０６７）は、ほぼ有意に細胞増殖を阻害する。１％、０．５％、０．１％、０．０１％、および０．００１％の画分＃９の阻害率は、それぞれ９０．８％、８８．６％、５８．５％、５３．７％、および４８．５％である。画分＃９のパーセント当たりの阻害細胞数は１５．８×１０４である。
【０１００】
本発明の実施形態を例示および記載したが、当分野の技術者は様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本発明の実施形態は限定的な意味ではなく、例として記載されたものである。本発明は例示した特定の形態に限定されるものではなく、本発明の精神および範囲から逸脱しないすべての修正は添付の請求の範囲に定義した範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】プレクトランサス・アンボイニクスの葉汁のＨＰＬＣスペクトログラムを例示する図である。
【図２】実施例３に記載の、葉汁のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図３】実施例３に記載の、葉汁処理後の日数とＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図４】実施例３に記載の、葉汁のパーセンテージとＨｕｈ７細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図５】実施例３に記載の、葉汁処理後の日数とＨｕｈ７細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図６】実施例４に記載の、葉汁処理後の日数とＢｏｗｅｓ細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図７】実施例５に記載の、第３日の葉汁および／またはパクリタキセルで処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図８】実施例５に記載の、第３日の葉汁および／またはパクリタキセルで処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図９】実施例６に記載の、葉汁で処理したＨｕｈ７接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１０】実施例６に記載の、葉汁で処理したＨｕｈ７接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１１】実施例６に記載の、葉汁処理停止後のＨｕｈ７接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１２】実施例６に記載の、葉汁処理停止後のＨｕｈ７接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１３】実施例７に記載の、葉汁で処理したＢｏｗｅｓ接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１４】実施例７に記載の、葉汁で処理したＢｏｗｅｓ接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１５】実施例７に記載の、葉汁処理停止後のＢｏｗｅｓ接種マウスの腫瘍面積変化の結果を例示する図である。
【図１６】実施例７に記載の、葉汁処理停止後のＢｏｗｅｓ接種マウスの体重変化の結果を例示する図である。
【図１７】実施例８に記載の、葉汁およびその画分のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図１８】実施例８に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図１９】５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分のＨＰＬＣスペクトログラムを例示する図である。
【図２０】実施例９に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｅｐＧ２の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図２１】実施例１０に記載の、葉汁およびその画分のパーセンテージとＨｅｐＧ２細胞数とを対比したプロットを例示する図である。
【図２２】実施例１０に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【図２３】実施例１１に記載の、葉汁およびその画分で処理したＨｕｈ７の細胞数変化の結果を例示する図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含むことを特徴とする癌および／または腫瘍を治療するための組成物。
【請求項２】
悪性腫瘍を治療するためのものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍを有するＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２１４ｎｍで得られたプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）の葉汁５０μＬのスペクトログラムは、保持時間１．７５６、２．５７３、７．１１８、７．８５１、９．７１５、１０．２７８、１０．８６４、１１．２１２、１２．２８７、１２．７９９、１３．１７８、１３．４１３、１４．０２７、１４．７９４、１６．２５３、および１８．７４２分のピークを含み、前記葉汁は、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
抗腫瘍薬をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
薬学上許容可能な担体中に製剤されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を生成する方法であって、前記葉汁は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ
を含む方法によって生成されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
葉汁を生成する前記方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
葉汁を生成する前記方法は、葉汁を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記葉汁は、濾過によって滅菌されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
葉汁を生成する前記方法は、葉汁を濃縮するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含むことを特徴とする癌および／または腫瘍を治療するための組成物。
【請求項１７】
内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍを有するＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２１４ｎｍで得られた５０ｋＤを超える分子量の画分５０μＬのスペクトログラムは、保持時間２．５７４、４．７９８、５．７２８、７．１０１、９．７０１、１０．２７９、１０．８０８、１１．１８９、１２．２３５、１３．３５、１３．５８４、１３．９０３、１４．１１３、１５．１１４、１６．２０６、１６．７３６、１８．６１９、２２．１３７、２４．６７６、および２６．９０２分のピークを含み、５０ｋＤを超える分子量の前記画分は、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
悪性腫瘍を治療するためのものであることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍であることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫を含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
抗腫瘍薬をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルであることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学上許容可能な担体中に製剤されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１６に記載の組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の前記画分は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）分子量５０ｋＤ未満の葉汁の画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量の画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップ
を含む方法によって生成されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の前記画分は、濾過によって滅菌されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を濃縮するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
癌および／または腫瘍を治療する薬剤の製造において、請求項１に記載の組成物を使用する方法。
【請求項３１】
癌および／または腫瘍を治療する薬剤の製造において、請求項１６に記載の組成物を使用する方法。
【請求項１】
有効量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁を含むことを特徴とする癌および／または腫瘍を治療するための組成物。
【請求項２】
悪性腫瘍を治療するためのものであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍを有するＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２１４ｎｍで得られたプレクトランサス・アンボイニクス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ａｍｂｏｉｎｉｃｕｓ）の葉汁５０μＬのスペクトログラムは、保持時間１．７５６、２．５７３、７．１１８、７．８５１、９．７１５、１０．２７８、１０．８６４、１１．２１２、１２．２８７、１２．７９９、１３．１７８、１３．４１３、１４．０２７、１４．７９４、１６．２５３、および１８．７４２分のピークを含み、前記葉汁は、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
抗腫瘍薬をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
薬学上許容可能な担体中に製剤されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物を生成する方法であって、前記葉汁は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ
を含む方法によって生成されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
葉汁を生成する前記方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
葉汁を生成する前記方法は、葉汁を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記葉汁は、濾過によって滅菌されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
葉汁を生成する前記方法は、葉汁を濃縮するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
５０ｋＤを超える分子量のプレクトランサス・アンボイニクスの葉汁の画分を有効量含むことを特徴とする癌および／または腫瘍を治療するための組成物。
【請求項１７】
内径（Ｉ．Ｄ．）４．６ｍｍ、長さ（Ｌ）１５ｃｍを有するＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｃ１８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２１４ｎｍで得られた５０ｋＤを超える分子量の画分５０μＬのスペクトログラムは、保持時間２．５７４、４．７９８、５．７２８、７．１０１、９．７０１、１０．２７９、１０．８０８、１１．１８９、１２．２３５、１３．３５、１３．５８４、１３．９０３、１４．１１３、１５．１１４、１６．２０６、１６．７３６、１８．６１９、２２．１３７、２４．６７６、および２６．９０２分のピークを含み、５０ｋＤを超える分子量の前記画分は、流速１ｍＬ／分、３０分で０〜３０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡの直線勾配溶出で分離されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
悪性腫瘍を治療するためのものであることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍は、ｐ５３関連腫瘍であることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記腫瘍は、肝細胞癌および黒色腫を含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
抗腫瘍薬をさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルであることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学上許容可能な担体中に製剤されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
注射、経口投与、または局所投与によって対象に適用されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１６に記載の組成物を生成する方法であって、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の前記画分は、
（ａ）プレクトランサス・アンボイニクスの葉を採取するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の葉を蒸留水で洗浄するステップ、
（ｃ）葉から水を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）の葉から葉汁を得るステップ、および
（ｅ）分子量５０ｋＤ未満の葉汁の画分を除去し、５０ｋＤを超える分子量の画分を得るために、ステップ（ｄ）の葉汁をフィルタに通すステップ
を含む方法によって生成されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、ステップ（ｄ）の葉汁を遠心分離して、組織繊維を除去するステップ（ｄ２）をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を滅菌するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の前記画分は、濾過によって滅菌されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を生成する前記方法は、５０ｋＤを超える分子量の葉汁の画分を濃縮するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
癌および／または腫瘍を治療する薬剤の製造において、請求項１に記載の組成物を使用する方法。
【請求項３１】
癌および／または腫瘍を治療する薬剤の製造において、請求項１６に記載の組成物を使用する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００６−１９３４７１（Ｐ２００６−１９３４７１Ａ）
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００５−６７９３（Ｐ２００５−６７９３）
【出願日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５０１６７２４）ウィー ジーン テクノロジーズ インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０５０１６７３５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６７９３（Ｐ２００５−６７９３）
【出願日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５０１６７２４）ウィー ジーン テクノロジーズ インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０５０１６７３５）
【Ｆターム（参考）】
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