本発明は、非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ４３およびＣＥＡ上のエピトープに特異的に結合する抗体（キメラおよびヒト化抗体など）を提供する。さらに、本発明は、診断および治療目的における、本明細書に記載の抗体の使用も提供する。詳細には、本発明の抗体は、非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ４３および／またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞によって発現されるＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができる。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００７年１２月１８日に出願された米国仮出願第６１／０１４，７１６号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、非造血系腫瘍または癌細胞に発現するＣＤ４３および癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）の炭水化物含有エピトープを認識するモノクローナル抗体（例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体）に関する。これらの抗体は、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下でそうした非造血系腫瘍または癌細胞において細胞死（たとえば、アポトーシス）を誘導する特性を有する。これらの抗体は、診断薬および治療薬として有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＣＤ４３（シアロホリンまたはロイコシアリンとも呼ばれる）は、シアル酸に富む分子で、すべてのＴ細胞を含むほとんどのヒト白血球および血小板において高度に発現し、分子量は、１１５，０００〜１３５，０００である。Ｘ染色体関連劣性免疫不全障害であるウィスコット−アルドリッチ症候群の男性Ｔ細胞では、ＣＤ４３の発現が不完全である（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、（１９８７）Ｂｌｏｏｄ ７０（１）：１０４−９；Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌら、（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９：１７０５−２３）。
【０００４】
機能の研究から、抗ＣＤ４３モノクローナル抗体が末梢血Ｔリンパ球の増殖（Ｍｅｎｔｚｅｒら、（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１；１６５（５）：１３８３−９２；Ｐａｒｋら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５０：７０６−９）および単球の活性化（Ｎｏｎｇら、（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１：１７０（１）：２５９−６７）を刺激することが明らかにされた。モノクローナル抗ＣＤ４３抗体Ｌ１１は、リンパ節およびパイエル板ＨＥＶ（ｈｉｇｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｖｅｎｕｌｅ）へのＴ細胞の結合を遮断する。抗体Ｌ１１は、血液から器質性の二次リンパ組織へのＴ細胞の血管外遊走を阻害する（ＭｃＥｖｏｙら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１４９３−８）。ＣＤ４３分子を認識するモノクローナル抗体は、ＣＤ３４を高密度で発現する、細胞系統マーカー陰性の骨髄造血前駆細胞（ＨＰＣ：ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（Ｂａｚｉｌら、（１９９６）Ｂｌｏｏｄ，８７（４）：１２７２−８１．）およびヒトＴリンパ芽球様細胞（Ｂｒｏｗｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７６８６−９５）のアポトーシスを誘導する。最近の研究ではさらに、ＣＤ４３が、ヒトＴ細胞のＥ−セレクチンのリガンドとして機能することも示唆された（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００５】
興味深いことに、科学者らにより、ある種の非造血系腫瘍細胞、特に結腸直腸腺癌の細胞表面にもＣＤ４３分子が発現することが発見されている。非特許文献３：非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６を参照されたい。結腸癌細胞株（ＣＯＬＯ２０５）に発現するＣＤ４３のグリカンは、白血球のＣＤ４３のグリカンと異なることが明らかになっている（Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１５０３−９）。ＣＤ４３が過剰に発現すると、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３が活性化され（非特許文献７）、ｐ６５の転写活性の阻害などによりＮＦ−κＢ標的遺伝子のサブセットが抑制されると考えられてきたが（非特許文献８）、結腸腫瘍形成におけるＣＤ４３の原因的役割を示す直接的な証拠は未だに認められていない。非造血系腫瘍細胞の治療剤として従来の抗ＣＤ４３抗体を用いるのは、腫瘍にも免疫Ｔ細胞にも強く結合するため実用的ではない。非造血系腫瘍または癌細胞に発現するＣＤ４３に特異的に結合しても、白血球または造血系由来の他の細胞に発現するＣＤ４３には結合しない抗体を作製することが依然として求められている。こうした抗体は、ＣＤ４３を発現する非造血系癌を処置する治療薬として有用である可能性がある。
【０００６】
ＣＥＡは通常、種々の腺上皮組織（胃腸管、気道および尿生殖管など）に発現し、細胞の頂端表面に局在していると思われる（非特許文献９）。こうした組織から生じる腫瘍では、頂端膜ドメインから細胞表面全体に延在するＣＥＡの発現レベルが上昇するとともに、このタンパク質が血液へ分泌される（非特許文献９）。結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、肝細胞癌、乳房癌および甲状腺癌など、多くのタイプの癌では、ＣＥＡの過剰な発現が観察された。したがって、ＣＥＡは、腫瘍マーカーとして用いられており、癌の予後および管理においては、癌患者の血液中のＣＥＡ量の増加を測定するため、免疫学的アッセイが長年にわたり臨床の場で用いられている（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００７】
より重要なのは、ＣＥＡが、標的治療の腫瘍関連抗原として有用性が期待されるようになったことである（非特許文献１３）。癌免疫療法にＣＥＡを標的として用いる主要な戦略が２つ開発されている。１つの方法は、抗ＣＥＡ抗体によるＣＥＡ発現腫瘍細胞への自殺遺伝子（一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ：ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子）（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ．ら、（２０００）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０（６Ａ）：４０６７−７１）または同位元素（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ Ｒ Ｗ．ら、（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８，１０２５６−６０，Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｍ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，８６：１３９２−１４０３，Ｏｌａｆｓｅｎ Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７，２１−２７，２００４）の特異的ターゲティングである。また、この方法は、抗体、あるいは、薬物、トキシン、放射性ヌクレオチド、免疫調節物質（ｉｍｍｕｍｏｄｕｌａｔｏｒ）またはサイトカインなどの治療薬とコンジュゲートされた抗体フラグメントを使用するまでに広がっている。もう１つの方法は、免疫細胞溶解活性を利用するもので、具体的には抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によりＣＥＡ発現腫瘍細胞を除去する（Ｉｍａｋｉｉｒｅ Ｔら、，（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１０８，５６４−５７０）。これらの方法は、サイトカインを放出させるため、副作用が認められる場合が多い。
【０００８】
非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ−４３およびＣＥＡに存在する炭水化物含有エピトープを認識する抗体は、特許文献１および特許文献２に記載されている。これらの抗体は、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下でそうした非造血系癌細胞においてアポトーシスを誘導することができる。
【０００９】
本明細書に開示する参考文献、刊行物および特許出願については、参照によってその全体を本明細書に援用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０１７１０４３号明細書
【特許文献２】国際公開第０７／１４６１７２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）１７５：８０４２−５０
【非特許文献２】Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅら、Ｂｌｏｏｄ（２００６）１０７：１４２１−６
【非特許文献３】Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６）５６：３５２６−９
【非特許文献４】Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：１３６８８−９２
【非特許文献５】Ｂａｅｃｋｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２：１１５０３−９
【非特許文献６】Ｓｉｋｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９７）２３８：６１２−６
【非特許文献７】Ｋａｄａｊａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００４）２３：２５２３−３０
【非特許文献８】Ｌａｏｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（２００６）２８：６９５−７０４
【非特許文献９】Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｓ． Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．（１９９９）９，６７−８１．
【非特許文献１０】Ｇｏｌｄ Ｐ，ら、Ｊ．Ｅｘｐｌ．Ｍｅｄ．（１９６５）１２２：４６７−８１
【非特許文献１１】Ｃｈｅｖｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｈ． Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．（１９９１）７，１６２−１６６
【非特許文献１２】Ｓｈｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９８５）２，３５５−３９９
【非特許文献１３】Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ，ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００２）２２：４２５５−６４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ４３および／またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球またはＪｕｒｋａｔ細胞によって発現されるＣＤ４３には特異的に結合せず、かつ細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、非造血系癌細胞のアポトーシスを誘導することができる抗体（たとえば、キメラおよびヒト化抗体）を提供し、ここで、エピトープが炭水化物を含み、エピトープに対する抗体の結合がＬｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造、またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される。一部の実施形態では、抗体が結合するエピトープがフコース感受性である。
【００１３】
一部の実施形態では、抗体は、重鎖定常領域のヒンジ領域において少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を有するマウス抗体ｍ５Ｆ１由来のキメラまたはヒト化抗体である。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む単離された抗体を提供し、（ａ）重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域およびヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む重鎖可変領域を含み、重鎖定常領域のヒンジ領域が少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含み、かつ（ｂ）軽鎖が、配列番号２のアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、および少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含むヒトκ軽鎖由来の軽鎖定常領域またはヒトκ軽鎖由来の軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域が配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸が、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域においてアミノ酸Ｋ２１８のＮ末端に挿入されており、ここで残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムのものである。Ｂｕｒｔｏｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２巻：１６１〜２０６頁、１９８５年を参照されたい。一部の実施形態では、アミノ酸残基ＫＳＤが、アミノ酸Ｋ２１８のＮ末端に挿入されている。
【００１６】
一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域、ならびに配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含む。一部の実施形態では、抗体がヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体がキメラ抗体である。一部の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号１、３および８７〜９１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域が、配列番号２、４および９２〜９６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体の重鎖可変領域は、配列番号１もしくは配列番号３の残基２０〜１３７のアミノ酸配列または配列番号１もしくは配列番号３からの可変領域アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列、配列番号２からの可変領域アミノ酸配列、配列番号４の残基２１〜１３２のアミノ酸配列、または配列番号４からの可変領域アミノ酸配列を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または配列番号１からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、かつ軽鎖が、配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または配列番号２からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または配列番号１からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、かつ軽鎖が、配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または配列番号２からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖が、配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域または配列番号１からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、かつ軽鎖が、配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域または配列番号２からの可変領域アミノ酸配列、および配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載の抗体の抗原結合性フラグメントも提供する。
【００２１】
本発明は、１または複数の本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメントおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物も提供する。
【００２２】
本発明は、本明細書に記載の抗体の重鎖および／もしくは本明細書に記載の抗体の軽鎖またはそのフラグメントをコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびベクターは、配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域、および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖をコードしている核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびベクターは、配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む軽鎖をコードしている核酸配列を含む。
【００２３】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントのいずれかを産生するための方法をさらに提供する。この方法は、好適な宿主細胞において、抗体（これは、単一の重鎖または軽鎖として別々に発現させても、１つのベクターから重鎖および軽鎖の両方を発現させてもよい）またはその抗原結合性フラグメントをコードしている１または複数のポリヌクレオチドを発現させるステップを含んでもよい。一部の実施形態では、発現させた抗体またはその抗原結合性フラグメントが回収および／または単離される。本発明は、この方法によって産生される抗体または抗原結合性フラグメントも提供する。
【００２５】
本発明は、癌を有する個体の非造血系癌を処置するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の１または複数の抗体を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、１または複数の抗体は、個体において癌細胞に結合する。一部の実施形態では、非造血系癌は、結腸直腸癌、膵癌、または胃癌である。一部の実施形態では、抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
【００２６】
本発明は、個体の非造血系癌の発達を遅延させる（癌の進行の遅延および／または阻害など）ための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の１または複数の抗体を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、上記１または複数の抗体が、個体において癌細胞に結合する。一部の実施形態では、非造血系癌は、結腸直腸癌、膵癌、または胃癌である。一部の実施形態では、抗体が細胞毒にコンジュゲートされている。
【００２７】
本発明は、個体の非造血系癌を処置するための方法を提供し、この方法は、一定量の、本明細書に記載の１または複数の抗体および一定量の別の抗癌剤を個体に投与することを含み、１または複数の抗体は個体において癌細胞に結合し、それにより組み合わせた、１または複数の抗体および抗癌剤が個体において癌の有効な治療を提供する。一部の実施形態では、非造血系癌は、結腸直腸癌、膵癌、または胃癌である。一部の実施形態では、抗癌剤が化学療法剤である。
【００２８】
本発明は、本明細書に記載の１または複数の抗体を含む医薬組成物を含むキットをさらに提供する。一部の実施形態では、キットは、非造血系癌を処置するために、医薬組成物の有効量を個体に投与するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、医薬組成物を別の抗癌剤と併用して投与するための説明書を含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む定常領域とを含む。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを含む第１の医薬組成物と、別の抗癌剤を含む第２の医薬組成物と、非造血系癌を処置するために、第１の医薬組成物および第２の医薬組成物を併用して個体に投与するための説明書とを含むキットも提供する。
【００３０】
本明細書に記載の様々な実施形態の１つ、いくつか、または全ての性質を組み合わせて本発明の別の実施形態を形成してもよいことが理解されるべきである。本発明のこれらの態様および別の態様は、当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】マウスＩｇＧ３重鎖定常領域（配列番号１３８）およびヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１３９）間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。ヒンジ領域に下線を引いている。図示したように、アミノ酸同一性は２１４／３３３（６４．３％）であり、類似性は２６１／３３３（７８．４％）であり、ギャップは６／３３３（１．８％）である。
【図２Ａ】無改変および改変重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図２Ｂ】無改変および改変重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図２Ｃ】無改変および改変重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図２Ｄ】無改変および改変重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図２Ｅ】無改変および改変重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図２Ｆ】無改変および改変軽鎖ヒトＩｇＧ１κ定常領域間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図３】０．１２５μｇ／ｍｌ〜４μｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度でのフローサイトメトリー解析による、ｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１ｖ０、ｃ５Ｆ１ｖ１５、およびｃ５Ｆ１ｖ１６抗体のＣＯＬＯ２０５に対する結合を示す図である。対照抗体のバックグラウンドシグナル（ＭＦＩ）は、抗マウス二次抗体：３；抗ヒト二次抗体：３；マウスＩｇＧ：４；ヒトＩｇＧ：５である。全ての抗体、ｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１ｖ０、ｃ５Ｆ１ｖ１５、およびｃ５Ｆ１ｖ１６は、ＣＯＬＯ２０５に対してバックグラウンドシグナルよりも顕著な結合を示す。
【図４Ａ】ｈ５Ｆ１Ｍ、ｈ５Ｆ１Ａ Ｖａ、ｈ５Ｆ１Ａ Ｖｓ、ｈ５Ｆ１Ｍ Ｖａ、およびｈ５Ｆ１Ｍ ＶｓのＶＨ（ａ）およびＶＬ（ｂ）間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【図４Ｂ】ｈ５Ｆ１Ｍ、ｈ５Ｆ１Ａ Ｖａ、ｈ５Ｆ１Ａ Ｖｓ、ｈ５Ｆ１Ｍ Ｖａ、およびｈ５Ｆ１Ｍ ＶｓのＶＨ（ａ）およびＶＬ（ｂ）間のアミノ酸配列比較およびアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に存在する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体ばかりでなく、そのフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなど）、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾構造も包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）など任意のクラスの抗体を含むが、抗体は、特定のクラスである必要はない。免疫グロブリンは、抗体の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという５つの主要なクラスがあり、そのうちの一部は、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。免疫グロブリンの個々のクラスに対応する重鎖の定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元構造は、周知である。
【００３３】
本発明の抗体は、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により付与されるポリペプチドに対する親和性を持つ二重特異性分子、多重特異性分子、単鎖分子ならびにキメラ分子およびヒト化分子をさらに含むことが意図される。さらに、本発明の抗体は、抗体の重鎖可変ドメインまたは抗体の軽鎖可変ドメインのどちらかである単一ドメイン抗体もさらに含む。Ｈｏｌｔら、，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４−４９０，２００３を参照。また、抗体の６つの天然型相補性決定領域のうち３つを含む、抗体の重鎖可変ドメインまたは抗体の軽鎖可変ドメインのどちらかを含むドメイン抗体の作製方法についても、当該技術分野において公知である。たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２，２００１を参照されたい。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体群の中の抗体をいう。言い換えれば、抗体集団を構成する個々の抗体は、わずかながら存在する場合がある自然に発生し得る突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は通常、特異性が高く、単一の抗原部位を標的とする。さらに、各モノクローナル抗体は、異なる決定基（エピトープ）を標的にする様々な抗体を含むことが一般的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、抗原の単一決定基を標的にする。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特性を示すもので、任意の特定の方法により抗体を作製する必要があるものと解釈してはならない。たとえば、本発明に従って使用できるモノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記されたハイブリドーマ法で製造してもよいし、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法で製造してもよい。さらに、たとえば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４に記載の技法を用いて作製されたファージライブラリーからモノクローナル抗体を単離してもよい。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」とは、第１の種の可変領域または可変領域の一部と第２の種の定常領域を持つ抗体をいう。インタクトなキメラ抗体は、キメラ軽鎖の２つのコピーおよびキメラ重鎖の２つのコピーを含む。キメラ抗体の作製については、当該技術分野において公知である（Ｃａｂｉｌｌｙら、（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。一般に、こうしたキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の可変領域がともに、一方の哺乳動物種に由来する抗体の可変領域を模倣するのに対し、定常部分は、他方の動物種に由来する抗体の配列に相同的である。一部の実施形態において、アミノ酸修飾が、可変領域および／または定常領域内になされ得る。
【００３６】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋」とは、純度（すなわち、夾雑物を含まない）が少なくとも５０％、一層好ましくは純度が少なくとも９０％、一層好ましくは純度が少なくとも９５％、一層好ましくは純度が少なくとも９８％、一層好ましくは純度が少なくとも９９％である材料をいう。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最低限しか含まない特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（たとえばマウス）抗体の形態をいう。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）由来の残基を、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなど、非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換える、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）残基を、対応する非ヒト残基で置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られないが、抗体性能の一層の改良および最適化を行うために加える残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は実質的に、少なくとも１つ、一般には２つの可変ドメインの全部を含む。その可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。さらに、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのそれを含むのが最も望ましい。抗体は、国際公開第９９／５８５７２号に記載されているように改変したＦｃ領域を含み得る。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体から変化している１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）（元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼べる）を持っている。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒトから作製された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持っている抗体をいい、および／または、当該技術分野において公知か、本明細書に開示されたヒト抗体の作製技法のいずれかを用いて作製されている。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１種のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１種のヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そうした例の１つとして、マウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体がある。当該技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト抗体を作製することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４；Ｓｈｅｅｔｓら、，１９９８，ＰＮＡＳ，（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１）。また、たとえば、内在性免疫グロブリン遺伝子を一部または完全に不活化したマウスのようなトランスジェニックアニマルにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入して、ヒト抗体を作製してもよい。このアプローチについては、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球（このＢリンパ球については個体から回収してもよいし、インビトロで免疫してもよい）を不死化することで、ヒト抗体を調製することもできる。たとえば、Ｃｏｌｅら、，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
【００４０】
抗体の「可変領域」とは、単独または組み合わせての、抗体の軽鎖可変領域または抗体の重鎖可変領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が結合している４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術が存在する：（１）異種間の配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、このアプローチのどちらか、または、２つのアプローチを併用して定義されるＣＤＲを指してもよい。
【００４１】
抗体の「定常領域」とは、単独または組み合わせての、抗体の軽鎖定常領域または抗体の重鎖定常領域をいう。抗体の定常領域は通常、構造の安定性、ならびに抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移行および補体結合など他の生物学的機能を提供するが、抗原に対する結合には関与していない。定常領域の遺伝子のアミノ酸配列および対応するエクソン配列は、それが由来する種に依存するが、アロタイプが生じるアミノ酸配列の変異は、概ね種内の特定の定常領域に限られる。各鎖の可変領域は、結合ポリペプチド配列で定常領域に結合している。この結合配列は、軽鎖遺伝子の「Ｊ」配列と、重鎖遺伝子の「Ｄ」配列および「Ｊ」配列の組み合わせとによってコードされている。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ：Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後、標的細胞を溶解させる細胞媒介性の反応をいう。目的の分子のＡＤＣＣ活性については、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて決定することができる。そうしたアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）およびＮＫ細胞がある。その代わりに、またはそれに加えて、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓら、，１９９８，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６に開示されたような動物モデルを用いて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで決定してもよい。
【００４３】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させることをいう。補体活性化の経路は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が同族抗原と複合体を形成した分子（たとえば抗体）に結合することで始まる。補体活性化を決定するには、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００４４】
本明細書では、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語については同義で用い、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。ポリマーは、直鎖でも分枝でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸で中断されていてもよい。さらに、この語は、天然に修飾されている、あるいは、たとえば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識成分とのコンジュゲーションのような他の任意の操作または修飾などの介入により修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。さらに、この定義には、たとえば、アミノ酸の１つまたは複数のアナログ（たとえば、天然ではないアミノ酸など）および当該技術分野において公知の他の修飾体を含むポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは抗体をベースにしているため、ポリペプチドが、単鎖または結合鎖として生じる可能性があることが理解されよう。
【００４５】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「核酸」については、同義に用い、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基および／またはこれらのアナログ、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに取り込まれる場合がある任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびそのアナログを含み得る。ヌクレオチド構造の修飾を行う場合は、ポリマーの構築の前でも後でもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドについては、標識成分とのコンジュゲーションなどより、重合後にさらに修飾することもできる。他のタイプの修飾として、たとえば、「キャップ」、アナログによる１種または複数種の天然ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の修飾（たとえば、非荷電結合（たとえば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カバマートなど）および荷電結合（たとえば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）による修飾、たとえば、タンパク質（たとえば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）などのペンダント部分を含ませる修飾、インターカレーター（たとえば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（たとえば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含ませる修飾、アルキル化剤を含ませる修飾、修飾結合（たとえば、αアノマー核酸など）による修飾）、およびポリヌクレオチド（単数または複数）の無修飾形態が挙げられる。さらに、たとえば、糖に普通に存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホナート基、ホスフェート基で置換しても、標準的な保護基で保護しても、活性化してさらなるヌクレオチドへの追加結合を作製してもよいし、固体支持体にコンジュゲートしてもよい。５’および３’末端のＯＨについては、リン酸化しても、アミンまたは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換してもよい。さらに、他のヒドロキシルを標準的な保護基に誘導体化することもできる。さらに、ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野において公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含んでもよく、たとえば、２’−−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、αアノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログおよびメチルリボシドなどの無塩基のヌクレオシドアナログがある。１つまたは複数のホスホジエステル結合を別の結合基で置換してもよい。そうした別の結合基として、ホスファートを、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、‘‘（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）（ＲまたはＲ’は各々独立にＨまたは任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含む置換もしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）である）で置換する実施形態があるが、これに限定されるものではない。ポリヌクレオチドのすべての結合が同一である必要はない。前述の記載を、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書に言及するすべてのポリヌクレオチドに適用する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、１種または複数種の目的の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を送達し、好ましくは宿主細胞において発現させることができるコンストラクトをいう。ベクターの例として、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、陽イオン性縮合剤に結合されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターおよび生成細胞などのある種の真核細胞があるが、これに限定されるものではない。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「発現制御配列」とは、核酸の転写を指令する核酸配列をいう。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーターまたはエンハンサーであってもよい。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動的に連結されている。
【００４８】
本明細書で使用する場合、薬物、化合物または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的な用途の場合、有益または所望の結果には、疾患、その合併症および疾患の発生過程で見られる病理学的中間表現型の生化学的、組織学的および／または行動的症状を含む、疾患のリスクの除去もしくは抑制、重症度の緩和または発症の遅延などの結果が含まれる。治療用途の場合、有益または所望の結果には、疾患に起因する１つまたは複数の症状の減少、疾患に罹患している人の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬の用量の減少、ターゲティングなどによる別の薬の作用の強化、疾患の進行の遅延および／または生存の延長などの臨床結果がある。癌または腫瘍の場合、薬物の有効量は、癌細胞の数の減少；腫瘍の大きさの縮小；周辺臓器への癌細胞浸潤の抑制（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；腫瘍転移の抑制（すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止）；腫瘍成長のある程度の抑制；および／または障害に伴う１つまたは複数の症状のある程度の軽減に作用する場合がある。有効投与量を、単回で投与しても、複数回で投与してもよい。本発明において、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量は、直接あるいは間接に予防処置または治療処置を達成するのに十分な量である。臨床的な観点から理解されるように、薬物、化合物または医薬組成物の有効投与量を、別の薬物、化合物または医薬組成物との併用で達成する場合もあれば、そうでない場合もある。したがって、１種または複数種の治療薬を投与する観点から、「有効投与量」を考慮してもよく、１種または複数種の他の薬剤と併用して、所望の結果を得る可能性がある、または、得ている場合、単一の薬剤を有効量で投与すると考えてもよい。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「併用して」とは、１つの処置方式に加えて別の処置方式を投与することをいう。そのため、「併用して」とは、他方の処置方式を個体に投与する前、投与している最中または投与した後に、一方の処置方式を投与することをいう。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「処置」または「処置する」とは、好ましくは臨床的な結果を含め有益または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益または所望の臨床的な結果として、癌性細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の抑制（または癌細胞の破壊）、疾患に起因する諸症状の減少、疾患に罹患している人の生活の質の向上、疾患の処置に必要な他の薬の用量の減少、疾患の進行の遅延および／または個体の生存の延長の１つまたは複数があるが、これに限定されるものではない。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「疾患の発生の遅延」とは、疾患（癌など）の発生を遅らせる、妨げる、遅くする、妨害する、安定させる、および／または先延ばしすることをいう。こうした遅延の時間の長さは、疾患の病歴および／または処置する個体によって異なってもよい。当業者には明らかなように、十分なまたはかなりの遅延は、個体が疾患を発生しないという点で実質的に予防を包含する。たとえば、転移の発生のような後期癌を遅延させることができる。
【００５２】
「個体」または「被験体」とは、哺乳動物であり、一層好ましくはヒトである。さらに、哺乳動物には、家畜、競技用動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットも含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「特異的に認識する」または「特異的に結合する」という語は、生体分子などの不均一な分子集団の存在下で標的の存在の決定に役立つ、標的と抗体間の引力または結合などの測定可能で再現性のある相互作用をいう。たとえば、エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、標的の他のエピトープまたは標的以外のエピトープに結合するよりも高い親和性、結合活性で、容易に、および／または長時間そのエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、たとえば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分またはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することもあれば、そうでない場合があることも理解されるであろう。そのため、「特異的結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を（含んでもよいが）必要としない。標的に特異的に結合する抗体の結合定数は、少なくとも約１０^３Ｍ^−１または１０^４Ｍ^−１、場合によっては約１０^５Ｍ^−１または１０^６Ｍ^−１、他の場合には約１０^６Ｍ^−１または１０^７Ｍ^−１、約１０^８Ｍ^−１〜１０^９Ｍ^−１または約１０^１０Ｍ^−１〜１０^１１Ｍ^−１またはそれ以上であってもよい。種々のイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質に対して特異的な免疫反応を示す抗体を選択することができる。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）イムノアッセイを用いて、タンパク質に対して特異的な免疫反応を示すモノクローナル抗体を日常的に選択することができる。たとえば、特定の免疫反応性を決定するために使用することのできるイムノアッセイのフォーマットおよび条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「癌」、「腫瘍」、「癌性」および「悪性」という語は、一般に制御されない細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、説明する。癌の例として、腺癌などの癌腫、リンパ腫、芽腫、メラノーマおよび肉腫があるが、これに限定されるものではない。そうした癌のより具体的な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、胃腸癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、神経膠腫、卵巣癌、肝癌およびヘパトーマなどの肝臓癌、膀胱癌、乳房癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌および様々なタイプの頭頸部癌がある。
【００５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数の言及を含む。たとえば、「抗体」について言及する場合、１つの抗体からモル量のような多数の抗体をいい、当業者に公知のその等価物などを含む。
【００５６】
本明細書に記載の本発明の態様および変形例は、態様および変形例「からなる」および／または態様および変形例「から本質的になる」ものを含むことが理解されよう。
【００５７】
非造血系癌細胞上に発現されるＣＤ４３およびＣＥＡの炭水化物エピトープに特異的に結合する抗体およびポリペプチド
本発明は、非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ４３および／またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、白血球（末梢性Ｔ細胞など）またはＪｕｒｋａｔ細胞によって発現されるＣＤ４３には特異的に結合しない、単離された抗体、およびこの抗体に由来するポリペプチドを提供する。
【００５８】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号１の１または複数のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２の１または複数のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域およびκ軽鎖定常領域を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、抗体の重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域の１または複数のアミノ酸残基が改変されている（アミノ酸挿入、欠失、および置換を含む）。たとえば、アミノ酸残基は、実施例に示されるように改変されていてもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、ならびに（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域および配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む抗体を提供する。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。一部の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。一部の実施形態では、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、ＳＹＶＭＨ（配列番号１６８）、ＹＩＮＰＹＮＧＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１６９）、およびＲＴＦＰＹＹＦＤＹ（配列番号１７０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ、ＲＳＳＱＳＩＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号１７１）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１７２）、およびＦＱＧＳＨＡＰＬＴ（配列番号１７３）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１または３からの可変領域アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２または４からの可変領域アミノ酸配列を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、配列番号１および／または配列番号２のアミノ酸配列に由来する１または複数のＣＤＲは、配列番号１および／または配列番号２の少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つのＣＤＲに少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。
【００６２】
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特徴のうち１つまたは複数をさらに有していてもよい：（ａ）エピトープを含む分子をα−１→（２，３，４）−フコシダーゼで処理した場合、エピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合が減少する；（ｂ）エピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合が、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造、および／またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により阻害される；（ｃ）癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、細胞毒コンジュゲーションおよび免疫エフェクター機能の非存在下で（アポトーシスなどにより）非造血系癌細胞の死を誘導する；（ｄ）癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、非造血系癌細胞の細胞成長または増殖を阻害する；および（ｅ）結腸直腸癌および胃癌など、個体の細胞表面にエピトープを発現させる非造血系癌を処置または防止する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「阻害」という用語は、部分的および完全な阻害を含む。たとえば、Ｌｅ^ａ構造、Ｌｅ^ａ−ラクトース構造、ＬＮＤＦＨ ＩＩ構造、またはＬＮＴ構造を含む炭水化物により、ＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープに対する抗体またはポリペプチドの結合を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害する。エピトープに対する抗体の結合は、直接的な競合または別のメカニズムにより阻害することもできる。
【００６４】
エピトープを発現する非造血系癌細胞の例として、結腸直腸癌細胞（ＣＯＬＯ２０５およびＤＬＤ−１など）、胃癌細胞（ＮＣＩ−Ｎ８７など）、および膵癌細胞（ＳＵ．８６．８６、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８３７など）があるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞に存在するＣＤ４３の細胞外ドメインを認識することができるが、白血球ＣＤ４３（たとえば、末梢性Ｔ細胞）の細胞外ドメイン、またはＪｕｒｋａｔ細胞（リンパ芽球性白血病細胞）に発現するＣＤ４３の細胞外ドメインには結合しない。一部の実施形態では、本発明の新規な抗体またはポリペプチドは、造血系由来の細胞によって発現されるＣＤ４３に特異的に結合しない。
【００６６】
本発明は、特性に大きな影響を与えない機能的に等価な抗体ならびに活性および／または親和性を強化または減少した変異体を含む、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドの改変体を包含する。たとえば、抗体のアミノ酸配列を変異させて、癌細胞によって発現されるＣＤ４３またはＣＥＡに対して所望の結合親和性を持つ抗体を得てもよい。ポリペプチドの改変は、当技術分野において日常的に行われており、本明細書において詳細に記載する必要はない。改変ポリペプチドの例として、アミノ酸残基の保存的置換を持つポリペプチド、機能活性に著しい有害な変化を与えないアミノ酸の１つまたは複数の欠失もしくは付加、または化学的アナログの使用が挙げられる。
【００６７】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまで幅がある、アミノ末端および／またはカルボキシル末端融合だけでなく、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体またはエピトープタグとの融合抗体がある。抗体分子の別の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させる、抗体のＮまたはＣ末端への酵素またはポリペプチドの融合がある。
【００６８】
置換変異体は、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、代わりに別の残基が挿入されている。置換による突然変異誘発で大きな関心を集めている部位として、超可変領域があるが、ＦＲの変更も考えられる。保存的置換を下記の表に「保存的置換」の項目で示す。このような置換により生物活性に変化が生じる場合、下記の表に「例示的置換」として示される、またはアミノ酸クラスに関して下記に詳述する、より実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングしてもよい。
【００６９】
【表１】

抗体の生物学的特性の実質的な修飾を達成するには、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、たとえば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性または（ｃ）側鎖のかさの維持に対する作用が大きく異なる置換を選択する必要がある。以下に天然の残基を、共通の側鎖特性に基づき群に分けてある：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）非荷電極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【００７０】
非保存的置換に関しては、こうしたクラスのうちのあるクラスのメンバーを別のクラスと置換することで作製する。
【００７１】
抗体の適切な立体構造の維持に関与していない任意のシステイン残基については、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻害することもできる。反対に、特に抗体が、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、安定性を改善することもできる。
【００７２】
アミノ酸修飾は、１個または複数個のアミノ酸の変更または修飾から可変領域などの領域の完全な再設計まで多岐にわたる場合がある。可変領域を変更すれば、結合親和性および／または特異性が変化することがある。いくつかの実施形態では、ＣＤＲドメイン内に１〜５個以下の保存的アミノ酸置換を作製する。他の実施形態では、ＣＤＲドメイン内に１〜３個以下の保存的アミノ酸置換を作製する。なお他の実施形態では、ＣＤＲドメインは、ＣＤＲＨ３および／またはＣＤＲ Ｌ３である。
【００７３】
また、修飾体は、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチドならびに、たとえば、様々な糖によるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化など他の翻訳後修飾を受けたポリペプチドも含む。抗体は、その定常領域の保存位置でグリコシル化される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，ＴｉｂＴＥＣＨ １５：２６−３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、，１９９６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−１３１８；Ｗｉｔｔｗｅ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｄ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：４１７５−４１８０）および立体構造に影響する可能性がある糖タンパク質の部分と糖タンパク質の提示された三次元表面との間の分子内相互作用（Ｈｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ，ｓｕｐｒａ；Ｗｙｓｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４０９−４１６）に影響を与える。また、オリゴ糖は、特異的認識構造に基づき一定の糖タンパク質をある種の分子に向かわせる役割を果たす場合がある。さらに、抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えることも報告されている。特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）（バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒する糖転移酵素）のテトラサイクリン制御された発現を有するＣＨＯ細胞では、ＡＤＣＣ活性の改善が報告された（Ｕｍａｎａら、，１９９９，Ｍａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０）。
【００７４】
抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ結合型またはＯ結合型のどちらかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニンおよびアスパラギン−Ｘ−システイン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこうしたトリペプチド配列のいずれかが存在すれば、有望なグリコシル化部位になる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いてもよい。
【００７５】
抗体へのグリコシル化部位の付加を達成するには、アミノ酸配列が上記のトリペプチド配列の１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変化させると都合がよい（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）。この変更を、元の抗体の配列にセリン残基またはトレオニン残基の１つまたは複数を付加することで、あるいは、セリン残基またはトレオニン残基の１つまたは複数で置換することで行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
【００７６】
さらに、根底にあるヌクレオチド配列を変化させずに抗体のグリコシル化パターンを変化させることもできる。グリコシル化の大部分は、抗体の発現に用いる宿主細胞に依存する。たとえば、有望な治療剤としての抗体などの組換え糖タンパク質の発現に用いる細胞型が天然細胞であることは稀であるため、抗体のグリコシル化パターンの変形が予測され得る（たとえば、Ｈｓｅら、，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：９０６２−９０７０を参照）。
【００７７】
本発明の抗体は、抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の変形構造を包含することができる。抗体は、マウス由来、ラット由来、ラクダ由来、ヒト由来、または他の任意のもの由来（ヒト化抗体を含む）でもよい。
【００７８】
ＣＤ４３またはＣＥＡに対するポリペプチド（抗体を含む）の結合親和性は、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかを下回ってもよい。当該技術分野において周知のように、結合親和性をＫ_Ｄ、すなわち解離定数で表してもよく、結合親和性が高まると、Ｋ_Ｄは小さくなる。ＣＤ４３またはＣＥＡに対する抗体の結合親和性を判定する１つのやり方は、抗体の一官能性Ｆａｂフラグメントの結合親和性を測定する。一官能性Ｆａｂフラグメントを得るには、抗体（たとえば、ＩｇＧ）をパパインで切断しても、組換えによって発現させてもよい。表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ、Ｐｉｓｃａｗａｙ ＮＪ）およびＥＬＩＳＡで抗体のＦａｂフラグメントの親和性を判定してもよい。反応速度論的会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）（通常２５℃で測定）を得て、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）値をｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出する。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、癌細胞の数を減少させ、および／またはエピトープを持つ腫瘍または癌細胞の細胞成長または増殖を阻害する。好ましくは、細胞数の減少または細胞成長もしくは増殖の阻害は、抗体またはポリペプチドで処置していない細胞と比較して少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６５％、約７５％またはそれ以上である。癌細胞には、結腸直腸癌、膵臓癌、肺癌、および胃癌があるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
一部の実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合後、たとえば、アポトーシスにより細胞死を単独で誘導することができる。本明細書で使用する場合、「細胞死を誘導する」という語は、本発明の抗体またはポリペプチドが、細胞表面に発現する分子と直接的に相互作用することができ、細胞の細胞死を誘導するには、細胞毒コンジュゲーションまたは他の免疫エフェクター機能、すなわち、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または食作用などの他の因子の助けを借りずに、結合／相互作用だけで十分であることをいう。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「アポトーシス」という語は、遺伝子依存性の細胞内の細胞破壊プロセスをいう。アポトーシスは、壊死とは異なる。アポトーシスでは、細胞骨格の破壊、細胞質の収縮および凝縮、細胞膜外部表面におけるホスファチジルセリンの発現ならびにブレッビングが起こり、細胞膜に結合した小胞またはアポトーシス小体が形成される。このプロセスは、「プログラムされた細胞死」とも呼ばれる。アポトーシスの過程では、細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体ＤＮＡの断片化およびミトコンドリア機能の低下などの特徴的な現象が観察される。アネキシンＶ、ヨウ化プロピジウム、ＤＮＡ断片化アッセイおよびＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた細胞染色など、公知の様々な技法を用いてアポトーシスを検出することができる。
【００８２】
細胞死（アポトーシスなど）を検出する方法には、形態、ＤＮＡ断片化、酵素活性およびポリペプチド分解などの検出があるが、これらに限定されるものではない。参照によって本明細書に援用するＳｉｍａｎら、米国特許第６，０４８，７０３号；ＭａｒｔｉｎおよびＧｒｅｅｎ（１９９５年）、Ｃｅｌｌ、８２巻：３４９〜５２頁；ＴｈｏｍｂｅｒｒｙおよびＬａｚｅｂｎｉｋ（１９９８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１巻：１３１２〜６頁；Ｚｏｕら、米国特許第６，２９１，６４３号；ＳｃｏｖａｓｓｉおよびＰｏｉｒｉｅｒ（１９９９年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９巻：１２５〜３７頁；Ｗｙｌｌｉｅら（１９８０年）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ、６８巻：２５１〜３０６頁；Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅら、（２００４年）、Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、３巻（１号）：２３〜３２頁を参照されたい。
【００８３】
一部の実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、非造血系癌細胞によって発現される立体構造エピトープを認識し、このエピトープは、トリペプチドＮ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’が形成する構造と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含む。本明細書で使用する場合、「ペプチドが形成する構造と等価な物理的特徴および化学的特徴を持つ構造を含むエピトープ」とは、抗体結合に関して２つの構造の物理的および化学的特性が同等であり、そのため一方の構造に特異的に結合する抗体は両方の構造に結合することをいう。一部の実施形態では、抗体およびポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端にアミノ酸配列、Ｎ’−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｃ’を含むポリペプチドに結合する。
【００８４】
一部の実施形態では、本発明の抗体およびポリペプチドは、癌細胞の細胞表面に発現するエピトープへの結合において抗体ｍ５Ｆ１またはｈ５Ｆ１と競合する。一部の実施形態では、本発明の抗体またはポリペプチドは、抗体ｍ５Ｆ１またはｈ５Ｆ１のうち少なくとも１つが結合するＣＤ４３またはＣＥＡのエピトープに結合する。
【００８５】
競合アッセイを用いて、同一または立体的にオーバーラップするエピトープを認識することで２つの抗体が同じエピトープに結合するかどうか、あるいは、ある抗体が別の抗体の抗原への結合を競合的に阻害するかどうかを判定することができる。こうしたアッセイは、当該技術分野において公知である。一般には、抗原または抗原を発現している細胞をマルチウェルプレートに固定化し、非標識の抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を測定する。そうした競合アッセイの一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。
【００８６】
一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせ（「混合型（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ＣＤＲ」または「拡張型（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ＣＤＲ」ともいう）である。換言すれば、複数のＣＤＲを含む任意の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａおよび／または混合型のいずれであってもよい。
【００８７】
抗体および抗体に由来するポリペプチドを製造する方法については、当該技術分野において公知であり、本明細書に開示してある。作製される抗体に対して、非造血系癌または腫瘍細胞によって発現されるＣＤ−４３またはＣＥＡのエピトープには特異的に結合するが、ＣＤ４３を発現する白血球、Ｊｕｒｋａｔ細胞および／またはＣＤ４３を発現する造血系由来の他の細胞には特異的に結合しないかどうかを試験することができる。エピトープを含む癌細胞または細胞外ドメイン（そのフラグメントを含む）を用いて試験してもよい。
【００８８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、リンパ芽球性白血病細胞であり、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒらにより１４歳の少年の末梢血から樹立された。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９巻：６２１〜６２６頁、１９７７年。様々なＪｕｒｋａｔ細胞株が、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（たとえば、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２、ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６７８）から市販されている。
【００８９】
産生される抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイで判定することができる。そうした技法およびアッセイは、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性については、たとえば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ（１９８０年）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁のスキャッチャード解析により判定することができる。
【００９０】
同定した抗体における細胞死（たとえば、アポトーシス）を誘導する能力および／または細胞の成長または増殖を阻害する能力について、当該技術分野において公知の方法および本明細書に記載の方法を用いてさらに検査してもよい。
【００９１】
本発明の抗体を、参照によって本明細書に援用する米国特許第４，８１６，５６７号および同第６，３３１，４１５号に記載されているような組換えＤＮＡ法で作製してもよい。たとえば、本発明のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡを、従来の手順（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブの使用など）を用いて容易に単離して配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そうしたＤＮＡの好ましい供給源になる。ＤＮＡを単離したら、発現ベクターに組み込み、次いでそのベクターを、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得ることができる。さらに、たとえば、マウスの相同配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換して（米国特許第４，８１６，５６７号）、あるいは、非免疫グロブリンのポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結してＤＮＡを改変してもよい。そうした非免疫グロブリンのポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメイン、あるいは、本発明の抗体における１つの抗原結合部位の可変ドメインで置換してキメラ二価抗体を作製してもよい。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明の抗体を２種の発現ベクターから発現させる。第１の発現ベクターは、抗体の重鎖の可変領域をコードしている第１の部分および抗体の重鎖の定常領域をコードしている第２の部分を含む抗体（たとえば、ヒト化抗体）の重鎖をコードしている。一部の実施形態では、第１の部分は、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域、および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖をコードしている。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。第２の発現ベクターは、抗体の軽鎖の可変領域をコードしている第１の部分および抗体の軽鎖の定常領域をコードしている第２の部分を含む抗体の軽鎖をコードしている。一部の実施形態では、第１の部分は、配列番号２のアミノ酸配列由来の１または複数のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む軽鎖をコードしている。一部の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。
【００９３】
あるいは、本発明の抗体（たとえば、ヒト化抗体）を単一の発現ベクターから発現させる。単一の発現ベクターは、本発明の抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードしている。一部の実施形態では、発現ベクターは、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖、ならびに配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域および配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。一部の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域は、配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域である。
【００９４】
通常、発現ベクターは、宿主細胞と適合性のある種に由来する転写調節配列および翻訳調節配列を含む。さらに、ベクターは通常、形質転換細胞における表現型による選抜を可能にする特定の遺伝子（単数または複数）も保有する。
【００９５】
真核細胞の様々な組換え宿主ベクター発現系が公知であり、それを本発明に用いてもよい。たとえば、真核微生物では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般のパン酵母が最も多く用いられるが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなど他にも多くの菌株を用いることができる。ＡＴＣＣから入手可能なＳｐ２／０またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）など、多細胞生物に由来する細胞株を宿主として用いてもよい。真核細胞の形質転換に好適な典型的なベクタープラスミドには、たとえば、ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＳＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣＣ）、ｐＳＶＬおよびｐＳＶＫ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ならびにｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）がある。
【００９６】
本発明に有用な真核宿主細胞は、好ましくは、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、形質細胞腫細胞またはリンパ腫細胞である。しかしながら、哺乳動物の宿主細胞が、タンパク質の発現のための転写および翻訳ＤＮＡ配列を認識し、リーダー配列を切断してタンパク質を分泌させてリーダーペプチドを処理し、たとえば、グリコシル化のようなタンパク質の翻訳後改変を行える場合、他の真核宿主細胞を好適に用いることができる。
【００９７】
したがって、本発明は、本明細書に開示するＤＮＡコンストラクトを含む組換え発現ベクターで形質転換されていて、かつ、本発明の抗体またはポリペプチドを発現することができる真核宿主細胞を提供する。故に、一部の実施形態では、本発明の形質転換宿主細胞は、本明細書に記載の軽鎖ＤＮＡ配列および重鎖ＤＮＡ配列と、抗体またはポリペプチドの発現を誘導するように軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡ配列に対して配置されている転写調節配列および翻訳調節配列とを含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトを含む。
【００９８】
本発明に用いる宿主細胞については、当該技術分野において周知の標準的なトランスフェクション手順により種々のやり方で形質転換することができる。用いることができる標準的なトランスフェクション手順には、エレクトロポレーション技法、プロトプラスト融合技法およびリン酸カルシウム沈殿技法がある。こうした技法は概ね、Ｆ．Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏら、（１９８６年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、６巻：７０３〜７０６頁；Ｇ．Ｃｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８７年）、１５巻：１３１１〜１３２５頁；Ｄ．Ｒｉｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７９年）、７９巻：７８６２〜７８６５頁；およびＶ．Ｏｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３年）、８０巻：８２５〜８２９頁に記載されている。
【００９９】
発現ベクターが２種類の場合、２種の発現ベクターを宿主細胞に１つ１つ別々に導入してもよいし、一緒に移入してもよい（共移入または共トランスフェクト）。
【０１００】
また、本発明は、抗体またはポリペプチドの作製方法であって、抗体またはポリペプチドをコードしている発現ベクター（単数または複数）を含む宿主細胞を培養することと、当業者に周知のやり方で培養物から抗体またはポリペプチドを回収することとを含む方法も提供する。一部の実施形態では、たとえば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど、従来の免疫グロブリン精製手順で抗体を単離または精製してもよい。
【０１０１】
また、所望の抗体をトランスジェニックアニマルで作製することもできる。適切な発現ベクターを卵に微量注入することと、その卵を偽妊娠の雌に移植することと、所望の抗体を発現する子孫を選択することとを含む標準的な方法により、好適なトランスジェニックアニマルを得ることができる。
【０１０２】
また、本発明は、癌細胞によって発現されるＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープを特異的に認識するキメラ抗体も提供する。たとえば、キメラ抗体の可変領域と定常領域は、別の種に由来する。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖の可変領域は、ともに本明細書に記載のマウスの抗体に由来する。一部の実施形態では、可変領域は、配列番号１および配列番号２からの可変領域由来のアミノ酸配列、または配列番号１の残基２０〜１３７および配列番号２の残基２０〜１３１を含む。一部の実施形態では、重鎖および軽鎖の定常領域は、ともにヒト抗体に由来する。
【０１０３】
本発明のキメラ抗体については、当該技術分野で確立された技法によって調製することができる。たとえば、それぞれが参照によって本明細書に援用する米国特許第６，８０８，９０１号、米国特許第６，６５２，８５２号、米国特許第６，３２９，５０８号、米国特許第６，１２０，７６７号および米国特許第５，６７７，４２７号を参照されたい。一般に、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードしているｃＤＮＡを得て、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入して、真核宿主細胞に導入すると、本発明のキメラ抗体が発現することで、キメラ抗体を調製することができる。好ましくは、発現ベクターには、任意の可変重鎖または軽鎖配列を発現ベクターに挿入しやすいように機能的に完全な定常重鎖または軽鎖配列がある。
【０１０４】
本発明は、非造血系癌細胞によって発現されるＣＤ４３およびＣＥＡのエピトープを特異的に認識するヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、ＣＤＲの残基が、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲの残基で置換されているヒト抗体が一般的である。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基で置換することもある。
【０１０５】
モノクローナル抗体をヒト化するには、一般に４つのステップがある。それは、（１）出発抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわち、ヒト化プロセスにおいて用いる抗体フレームワーク領域を決定するステップ、（３）実際のヒト化の方法／技法ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現である。たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号；同第５，８０７，７１５号；同第５，８６６，６９２号；同第６，３３１，４１５号；同第５，５３０，１０１号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５８５，０８９号；同第６，１８０，３７０号；および同第６，５４８，６４０号を参照されたい。たとえば、抗体を臨床試験およびヒトの処置に用いる場合、定常領域を操作してヒト定常領域との類似性を高め、免疫反応を回避することができる。たとえば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照されたい。
【０１０６】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持したまま抗体をヒト化することが重要である。それには、三次元モデルの親配列およびヒト化配列を用いて親配列および種々の概念的ヒト化産物を解析するプロセスでヒト化抗体を調製すればよい。三次元の免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を図解表示するコンピュータプログラムを入手することができる。こうした表示を検査すれば、候補免疫グロブリン配列の機能に対して推定される残基の役割の解析、すなわち、抗原に対する候補免疫グロブリンの結合能力に影響を与える残基の解析を行うことができる。こうして、コンセンサス配列および移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせて、標的抗原（単数または複数）に対する親和性の増強など、所望の抗体特徴を得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に直接関与し、最も大きな影響を与える。ヒト化抗体は、抗体の１つまたは複数の特徴を改良するためにヒンジ領域が改変されていてもよい。
【０１０７】
別の方法として、抗体をスクリーニングしファージディスプレイ技法による組換えで製造する。たとえば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２巻：４３３〜４５５頁（１９９４年）を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８巻：５５２〜５５３頁（１９９０年））を用いて非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメインの遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで作製してもよい。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなど糸状バクテリオファージのメジャーあるいはマイナーコートいずれかタンパク質の遺伝子にインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含んでいるため、抗体の機能的特性に基づき選択を行えば、その特性を示す抗体をコードしている遺伝子を選択することにもなる。したがって、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかと類似している。ファージディスプレイについては、種々のフォーマットで行うことができる。概説には、たとえば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３巻、５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照されたい。ファージディスプレイでは、Ｖ−遺伝子セグメントの複数の供給源を用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）は、多様な抗オキサゾロン抗体のアレイを、免疫処置されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模でランダムなコンビナトリアルライブラリーから単離した。免疫処置されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）が記載した技法に本質的に従って多様な抗原（自己抗原を含む）のアレイに対する抗体を単離してもよい。自然な免疫反応では、抗体遺伝子は高い頻度で突然変異を積み重ねる（体細胞突然変異）。変化がある程度導入されると、親和性が高まり、高親和性の表面免疫グロブリンを提示しているＢ細胞は優先的に複製され、その後の抗原チャレンジの過程で分化される。この自然なプロセスを、「鎖シャフリング」として公知である技法を用いて模倣することができる。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子および軽鎖Ｖ領域遺伝子を、非免疫ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の自然に発生する変異体（レパートリー）のレパートリーと順次置換することで、ファージディスプレイで得られる「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技法であれば、親和性がｐＭ〜ｎＭの範囲にある抗体および抗体フラグメントの産生が可能である。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても公知である）を作る戦略については、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載されている。また、遺伝子シャフリングを用いて齧歯動物抗体からヒト抗体を得てもよく、この場合、ヒト抗体は、最初の齧歯動物抗体と同様の親和性と特性を持つ。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法では、ファージディスプレイ技法で得られる齧歯動物抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯動物−ヒトキメラを作製する。抗原を選択することによって、機能的な抗原結合部位を回復できるヒト可変領域の単離をもたらし、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配（インプリント）する。このプロセスを繰り返して残りの齧歯動物Ｖドメインを置換すれば、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開の国際出願公開第９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲグラフティングによる従来の齧歯動物抗体のヒト化と異なり、この技法では、齧歯動物由来のフレームワーク残基またはＣＤＲ残基のない完全なヒト抗体が得られる。上記の考察はヒト化抗体に関するが、考察対象の一般的な原理は、たとえば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシ用に抗体をカスタマイズする際に適用できることは明らかである。
【０１０８】
特定の実施形態では、抗体は完全ヒト抗体である。抗原に特異的に結合する非ヒト抗体を用いて、その抗原に結合する完全ヒト抗体を作製することができる。たとえば、当業者は、非ヒト抗体の重鎖を様々なヒト軽鎖を発現する発現ライブラリーと共発現させる鎖スワッピング技法を用いてもよい。次いで、得られたハイブリッド抗体（１つのヒト軽鎖と１つの非ヒト重鎖を含む）について、抗原結合をスクリーニングする。その後、抗原結合に関与する軽鎖をヒト抗体の重鎖ライブラリーと共発現させる。得られたヒト抗体を対象に、抗原結合について、もう一度スクリーニングを行う。このような技法については、米国特許第５，５６５，３３２号により詳細に記載されている。さらに、抗原を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物に接種してもよい。たとえば、米国特許第５，６６１，０１６号を参照されたい。
【０１０９】
抗体は、少なくとも２種類の抗原に対して結合特異性を持つモノクローナル抗体の二重特異性抗体でもよく、本明細書に開示する抗体を用いて調製することができる。二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野において公知である（たとえば、Ｓｕｒｅｓｈら、（１９８６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１巻：２１０頁を参照）。従来の二重特異性抗体の組換え型産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現をベースとし、その２つの重鎖は異なる特異性を持っていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、（１９８３年）、Ｎａｔｕｒｅ ３０５巻、５３７〜５３９頁）。
【０１１０】
二重特異性抗体の製造の一アプローチによれば、所望の結合特異性を持つ抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）を免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合する。この融合は、好ましくはヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のうち少なくとも一部を含む免疫グロブリンの重鎖定常ドメインとの融合である。この定常ドメインは、融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖との結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を含むことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に共トランスフェクトする。これにより、この構築に用いる３つのポリペプチド鎖の比率が異なるとき収量が最適になる場合、実施形態における３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する際の柔軟性が高まる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖が同じ割合で発現すると高い収量になる場合、またはその割合に特に重要性がない場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１１１】
一アプローチでは、二重特異性抗体は、一方の腕における第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、他方の腕におけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を与える）から構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を持つこうした非対称構造により、不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離しやすくなる。このアプローチは、１９９４年３月３日公開の国際公開第９４／０４６９０号に記載されている。
【０１１２】
共有結合で結合した２つの抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。そうした抗体は、望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とするのに使用される（米国特許第４，６７６，９８０号）ほか、ＨＩＶ感染の処置（国際出願公開第９１／００３６０号および国際出願公開第９２／２００３７３号；ならびに欧州特許第０３０８９号）にも使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて製造することができる。好適な架橋剤および技法については、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１１３】
単鎖Ｆｖフラグメントも、Ｉｌｉａｄｅｓら、１９９７年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０９巻：４３７〜４４１頁に記載されているように作製することができる。種々のリンカーを用いたこうした単鎖フラグメントの結合については、Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻：４２３〜４３３頁に記載されている。抗体の組換え作製および操作の様々な技法は、当該技術分野において周知である。
【０１１４】
本発明は、上記のモノクローナル抗体ばかりでなく、抗体の活性結合領域を含むその任意のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆｖフラグメントおよび同種のものなど）を包含することが企図されている。そうしたフラグメントを、当該技術分野において確立された技法を用いて本明細書に記載のモノクローナル抗体から作製することができる（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、（１９８６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１２１巻：６６３〜６９頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
【０１１５】
抗体フラグメントを調製する方法は、当該技術分野において周知である。たとえば、ペプシンで抗体を酵素的に切断しＦ（ａｂ’）_２と呼ばれる１００Ｋｄのフラグメントを得ることで抗体フラグメントを作製することができる。このフラグメントを、チオール還元剤および任意にジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の保護基を用いてさらに切断して、５０Ｋｄの一価Ｆａｂ’フラグメントを作製してもよい。あるいは、パパインを用いて酵素的に切断して、２つの一価Ｆａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントを直接作製する。こうした方法は、たとえば、米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号およびそこに含まれる参考文献に記載されており、特許については、参照によって本明細書に援用する。さらに、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、（１９６０年）、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９巻：２３０頁；Ｐｏｒｔｅｒ（１９５９年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３巻：１１９頁、Ｅｄｅｌｍａｎら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １巻、４２２頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７年）を参照されたい。
【０１１６】
あるいは、抗体のＦａｂをコードしているＤＮＡを原核生物の発現ベクターまたは真核生物の発現ベクターに挿入し、そのベクターを、原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現することにより、Ｆａｂを作製することができる。
【０１１７】
抗体の組換え作製の過程で、宿主細胞の選択の他にグリコシル化に影響する要因として、成長モード、培地組成、培養密度、酸素反応、ｐＨ、精製スキームおよび同種のものなどがある。個々の宿主生物で得られるグリコシル化パターンを変えるため、オリゴ糖生成に関与する一定の酵素の導入または過剰発現など、様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号；同第５，５１０，２６１号および第５，２７８，２９９号）。グリコシル化またはある種のグリコシル化は、たとえば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を用いて糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞を遺伝子改変して、ある種の多糖類の処理を不完全なものにすることもできる。これらおよび類似の技法は、当該技術分野において周知である。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、以下に限定されるものではないが、酵素的手段、酸化置換およびキレート化など当該技術分野において公知のカップリング技法を使用して修飾されていてもよい。たとえば、修飾を利用してイムノアッセイ用標識を結合してもよい。修飾ポリペプチドについては、当該技術分野において確立された手順を用いて製造して、当該技術分野において公知の標準アッセイを用いてスクリーニングすることができ、その一部を下記および実施例に記載してある。
【０１１９】
本発明の抗体またはポリペプチドを治療薬および標識などの薬剤とコンジュゲート（たとえば、結合）させてもよい。治療薬の例として、放射性部分、細胞毒または化学療法分子が挙げられる。
【０１２０】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、蛍光分子、放射性分子、酵素または当該技術分野において公知の他の任意の標識などの標識に結合してもよい。本明細書で使用する場合、「標識」という用語は、検出できる任意の分子をいう。特定の実施形態では、放射性標識アミノ酸を組み込むことで抗体を標識することができる。特定の実施形態では、標識されたアビジン（たとえば、光学的方法または比色法で検出可能な蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）で検出できるビオチン部分を抗体に結合してもよい。特定の実施形態では、標識を別の試薬に組み込むか結合させて、試薬を目的の抗体に結合させてもよい。たとえば、標識を抗体に組み込むか結合させて、その抗体を目的の抗体に特異的に結合させることができる。特定の実施形態では、標識またはマーカーは、治療的に作用してもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該技術分野において公知であり、それを用いてもよい。標識のある種の一般的なクラスとして、これらに限定されないが、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識および放射性標識が挙げられる。ポリペプチドの標識の例として、放射性同位元素またはラジオヌクレオイド（たとえば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（たとえば、フルオレセインイソトシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素標識（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース酸化酵素、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒロゲナーゼ、リンゴ酸デヒロゲナーゼ、ペニシリナーゼ、ルシフェラーゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（たとえば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）があるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、標識を様々な長さのスペーサーアームで結合して立体障害の起こる可能性を低下させる。
【０１２１】
また、本発明は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野において公知であり、薬理学的に有効な物質を投与しやすくする、相対的に不活性な物質である。たとえば、賦形剤は、形状またはコンシステンシーを与えてもよいし、希釈薬として働いてもよい。好適な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、オスモル濃度を変化させる塩、被包剤、緩衝剤および皮膚浸透促進剤があるが、これらに限定されるものではない。非経口的および経口的薬物送達用の賦形剤および製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に記載されている。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明は、薬剤としての使用および／または薬剤製造のための使用に関わりなく、本明細書に記載の方法のいずれかに用いる（本明細書に記載の）組成物を提供する。
【０１２３】
ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
また、本発明は、本明細書に記載のモノクローナル抗体およびポリペプチドのいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、軽鎖可変領域配列および／または重鎖可変領域配列を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖をコードしている核酸配列、ならびに／あるいは配列番号２のアミノ酸配列からの１または複数のＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む軽鎖をコードしている核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む重鎖可変領域および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖をコードしている核酸配列、ならびに／あるいは配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲ領域を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む軽鎖をコードしている核酸配列を含む。
【０１２５】
当業者であれば、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載するようなポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が多く存在することが分かる。こうしたポリヌクレオチドの一部は、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列との相同性が極めて低い。したがって、本発明は、コドン使用頻度の相違によって変化するポリヌクレオチドを明確に意図している。さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、１つまたは複数の突然変異の結果として変化する内因性の遺伝子である。その結果生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、異なる構造または機能を持つ場合もあるが、持っていなくてもよい。対立遺伝子は、標準技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を用いて同定することができる。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチドについては、化学合成、組換え方法またはＰＣＲを用いて得ることができる。ポリヌクレオチドの化学的合成方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者であれば、本明細書に記載の配列および市販のＤＮＡ合成機を用いて所望のＤＮＡ配列を製造することができる。
【０１２７】
組換え法を用いたポリヌクレオチドの作製のために、本明細書でさらに考察しているように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを好適なベクターに挿入し、さらに、そのベクターを複製および増幅に好適な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入するのは、当該技術分野において公知の任意の手段でよい。細胞に関しては、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合またはエレクトロポレーションにより外来性ポリヌクレオチドを導入して形質転換する。外来性ポリヌクレオチドを導入したら、組み込まれていないベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持しても、宿主細胞ゲノムに組み込んでもよい。こうして増幅させたポリヌクレオチドを、当該技術分野においてよく知られている方法で宿主細胞から単離することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照されたい。
【０１２８】
あるいは、ＰＣＲを用いると、ＤＮＡ配列の複製が可能になる。ＰＣＲ技法は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４）に記載されている。
【０１２９】
また、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド（抗体を含む）のいずれかをコードしている核酸配列も含むベクターを提供する（たとえば、クローニングベクター、発現ベクター）。好適なクローニングベクターに関しては、標準技法に従って構築してもよいし、当該技術分野において入手可能な多数のクローニングベクターから選択してもよい。選択するクローニングベクターは、使用しようとする宿主細胞によって異なってもよいが、有用なクローニングベクターは通常、自己複製能を持ち、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して単一の標的を保持し得、および／またはベクターを含むクローンの選択に使用できるマーカー用の遺伝子を保持することができる。好適な例として、プラスミドおよび細菌ウイルス（たとえば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（たとえば、ｐＢＳ ＳＫ＋））およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡおよびシャトルベクター（ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など）が挙げられる。これらおよび他の多くのクローニングベクターは、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ストラテジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）およびインビトロジェンなどの商業ベンダーから入手できる。
【０１３０】
発現ベクターは、通常、本発明によるポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、宿主細胞でエピソームとして、あるいは染色体ＤＮＡの内在性部分として複製可能の場合がある。好適な発現ベクターには、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）、コスミドおよび国際公開第８７／０４４６２号に開示された発現ベクター（単数または複数）があるが、これに限定されるものではない。ベクター成分としては通常、シグナル配列；複製起点；１つまたは複数のマーカー遺伝子；好適な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）の１つまたは複数が挙げられ得るが、これに限定されるものではない。発現（すなわち、翻訳）では、通常、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および終止コドンなど、１つまたは複数の翻訳制御エレメントも必要とされる。
【０１３１】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターについては、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質などを用いたトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（たとえば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子の場合）のような多数の適切な手段のいずれかで宿主細胞に導入してもよい。多くの場合、宿主細胞の特色に応じて導入するベクターまたはポリヌクレオチドを選択することになる。
【０１３２】
また、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている遺伝子を単離するには、異種ＤＮＡを過剰発現できる任意の宿主細胞を用いることができる。哺乳動物の宿主細胞の非限定的な例として、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞があるが、これに限定されるものではない。さらに、国際公開第８７／０４４６２号を参照されたい。好適な非哺乳動物の宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌など）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓなど）がある。
【０１３３】
診断用途
本発明は、エピトープの発現（正常なサンプルと比較した場合の発現の増加または減少、および／または通常はエピトープの発現が見られない組織（単数または複数）および／または細胞（単数または複数）での発現の存在などの異常な発現）に関連している疾患、障害または状態の検出、診断および監視のための、本発明の抗体、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法を提供する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、この方法は、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌および肺癌などの癌の疑いがある被験体から得たサンプルにおけるエピトープの発現を検出することを含む。好ましくは、この検出方法は、サンプルと本発明の抗体、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとを接触させること、および結合レベルが対照サンプルまたは比較サンプルのレベルと異なるかどうかを決定することを含む。また、この方法は、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドが患者の治療法として適切かどうかを決定するのにも有用である。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成要素（たとえば、以下に限定されるものではないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液などの体液）のサブセットをいう。「サンプル」または「生物学的サンプル」はさらに、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成要素のサブセットから調製されるホモジネート、溶解産物または抽出物、あるいは、以下に限定されるものではないが、たとえば、血漿、血清、髄液、リンパ液（ｌｙｍｐｈ ｆｌｕｉｄ）、皮膚、気道、腸管および尿生殖器官の外部切片、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器など、その画分または部分をいう。ほとんどの場合、サンプルを動物から採取しているが、「サンプル」または「生物学的サンプル」という語は、インビボで、すなわち、動物から取り出すことなく解析される細胞または組織もいう。一般に、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、動物由来の細胞を含むが、さらに、癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルの測定に用いることができる血液、唾液または尿の非細胞性の画分など、非細胞性の生物材料もいう。さらに、「サンプル」または「生物学的サンプル」は、タンパク質または核酸分子などの細胞成分を含み、かつ、生体を繁殖させる栄養ブロスまたはゲルなどの培地もいう。
【０１３６】
一実施形態では、細胞または細胞／組織溶解産物を抗体と接触させ、抗体と細胞間の結合を決定する。同じ組織型の対照細胞と比較して被検細胞に結合活性が示された場合、被検細胞が癌性であることが示唆されることがある。いくつかの実施形態では、被検細胞は、ヒト組織由来である。
【０１３７】
特異的な抗体−抗原結合の検出には、当該技術分野において公知の様々な方法を用いることができる。本発明に従って行うことができる例示的なイムノアッセイとして、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ：ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分または標識基については、対象となる抗体に結合させればよいが、用いる方法の様々な使用の要件を満たすように選択する。使用要件は、アッセイ機器および適合するイムノアッセイの手順の利用可能性に指示されることが多い。適切な標識として、放射性核種（たとえば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈまたは^３２Ｐ）、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはβ−グラクトシダーゼ）、蛍光部分もしくはタンパク質（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＢＦＰ（ｂｕｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ））または発光部分（たとえば、カンタムドットコーポレーション（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），パロアルト，カリフォルニア州が提供するＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）があるが、これに限定されるものではない。上記の様々なイムノアッセイを行う際に用いることができる一般的な技法は、当業者に公知である。
【０１３８】
診断のために、抗体を含むポリペプチドを、以下に限定されるものではないが、放射性同位元素、蛍光標識および当該技術分野において知られている種々の酵素−基質標識などの検出可能な部分で標識してもよい。標識を抗体にコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を含むポリペプチドを標識しなくてもよく、その存在を、本発明の抗体に結合する標識抗体を用いて検出してもよい。
【０１４０】
本発明の抗体については、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなど、任意の既知のアッセイ方法において用いることができる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照されたい。
【０１４１】
抗体およびポリペプチドを、インビボイメージングなどのインビボ診断アッセイに用いてもよい。通常、抗体またはポリペプチドを放射性核種（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉまたは^３Ｈなど）で標識して、免疫シンチオグラフィーを用いて目的の細胞または組織の位置を特定できるようにする。
【０１４２】
さらに、当該技術分野において周知の技法を用いて、病理研究用の染色試薬としてこの抗体を使用してもよい。
【０１４３】
治療用途
本発明の抗体は、非造血系癌の細胞死を誘導することができる。したがって、本発明は、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、乳房癌、肝細胞癌および甲状腺癌などの癌を処置するおよび／または癌の発達を遅延する際の、本発明の抗体およびポリペプチドの治療用途を提供する。癌細胞が本明細書に記載の抗体によって認識されるエピトープを発現する限り、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳房癌、脳腫瘍、悪性メラノーマ、腎細胞癌、膀胱癌、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、卵胞膜細胞腫症、アンドロブラストーマ、子宮内膜肥厚、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経線維腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、過誤芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状腺肉腫およびウィルムス腫瘍など、任意の癌を処置することができる。この方法は、処置する個体において本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと腫瘍または癌細胞との間の結合を検出するステップをさらに含み得る。
【０１４４】
通常、抗体またはポリペプチドを含む組成物を、処置が必要な被験体に有効量で投与することで、癌細胞の成長を阻害し、および／または癌細胞の死を誘導する。好ましくは、この組成物を薬学的に許容されるキャリアとともに製剤化する。
【０１４５】
一実施形態では、組成物を、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射および筋肉内注射による投与および経口、粘膜、吸入、舌下などによる他の形の投与用に製剤化する。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明は、検出可能な標識または治療薬もしくは細胞傷害性薬剤などの他の分子にコンジュゲートした本発明の抗体またはポリペプチドを含む組成物の投与を意図している。この薬剤としては、放射性同位元素、トキシン、トキソイド、炎症剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカインまたは化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗体をそうした分子とコンジュゲートする方法は通常、当業者に公知である。たとえば、国際公開第９２／０８４９５号；国際公開第９１／１４４３８号；国際公開第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。これらの開示については、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【０１４７】
一実施形態では、この組成物は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートした抗体またはポリペプチドを含む。細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含んでもよい。抗体またはフラグメントにコンジュゲートすることができる細胞傷害性薬剤の好ましいクラスとして、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１４８】
処置に必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、被験体の疾病の性質、被験体の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与する他の薬物および主治医の判断によって異なる。好適な投与量は、０．０１〜１０００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１４９】
一般に、以下の用量のいずれかを用いることができる：少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重；少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重またはそれ未満の用量を投与する。数日間以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が認められるまで処置を持続する。例示的な投与レジメンは、抗体を約６ｍｇ／ｋｇで週１回投与することを含む。ただし、医師が達成したい薬物動態学的消失のパターンにより、他の投与レジメン（ｄｏｓａｇｅ ｒｅｇｉｍｅｎ）が有用な場合もある。一般に、半減期などの経験的判断が投与量の決定に寄与する。こうした治療の進行については、従来の技法およびアッセイにより容易に監視できる。
【０１５０】
一部の被験体では、複数回の投与が必要とされる場合がある。投与頻度を決定してから、治療の過程で投与頻度を調整してもよい。たとえば、処置する癌のタイプおよびステージ、薬剤を投与するのが予防目的か治療目的か、今までの治療、患者の病歴および薬剤に対する反応ならびに主治医の裁量に基づき、投与頻度の決定または調整を行うことができる。一般に、臨床医は、所望の結果が得られる適切な投与量に達するまで治療用抗体（キメラ５Ｆ１抗体など）を投与する。場合によっては、抗体の持続放出性製剤が適切なこともある。持続的な放出を実現するための様々な製剤および装置については、当該技術分野において公知である。
【０１５１】
一実施形態では、抗体またはポリペプチドの投与量を、１回または複数回の投与（単数または複数）を行っている被験体ごとに経験に基づき決定してもよい。抗体またはポリペプチドの投与量を段階的に増やして被験体に投与する。抗体またはポリペプチドの有効性を決定するには、ＣＤ４３またはＣＥＡなどの疾患症状のマーカーを監視すればよい。また、インビボでの有効性を、腫瘍の負荷または腫瘍容積、疾患進行までの経過時間（ＴＤＰ：ｔｉｍｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を評価することおよび／または奏効率（ＲＲ：ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ）を決定することにより測定することもできる。
【０１５２】
本発明の方法による抗体またはポリペプチドの投与は、たとえば、被投与者の生理的状態、投与が治療目的か予防目的か、さらに当業者の知る他の要因に応じて連続的でも、間歇的でもよい。抗体またはポリペプチドの投与は、本質的に事前に選択した期間にわたり連続的であってもよいし、間隔をおいた一連の投与であってもよい。
【０１５３】
他の製剤は、以下に限定されるものではないが、リポソームのようなキャリアなど、当該技術分野において公知の好適な送達形態である。たとえば、Ｍａｈａｔｏら、（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９を参照されたい。リポソーム調製物には、サイトフェクチン、多重膜ベシクルおよび単層ベシクルがあるが、これに限定されるものではない。
【０１５４】
別の実施形態では、組成物は、１種または複数種の抗癌剤、本明細書に記載の１種または複数種の抗体、あるいは別の抗原に結合する抗体またはポリペプチドを含んでもよい。こうした組成物は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の抗体を含み得る。抗体および他の抗癌剤に関しては、同じ製剤（たとえば、当該技術分野でよく示されるように、混合物）中にあっても、別の製剤中にあってもよいが、同時または連続的に投与すれば、広範な個体群の処置に特に有用である。
【０１５５】
また、本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを用いて、本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかを送達し、所望の細胞に発現させることもできる。発現ベクターを用いて抗体またはポリペプチドの発現を誘導できることは明らかである。発現ベクターについては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、髄腔内投与、脳室内投与、経口投与、経腸的投与、非経口的投与、鼻腔内投与、経皮的投与、舌下投与または吸入など、当該技術分野において公知の任意の手段で投与することができる。たとえば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル投与および局所投与などの局所または全身投与がある。当業者であれば、インビボで外来性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。たとえば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。
【０１５６】
本発明の抗体またはポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的送達を用いることもできる。受容体を介したＤＮＡ送達の技法は、たとえば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ （Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）（１９９４）；Ｗｕら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら、，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：３６５５；Ｗｕら、（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３８に記載されている。遺伝子治療プロトコルでは、局所投与のために、ＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲でポリヌクレオチドを含む治療用組成物を投与する。また、遺伝子治療プロトコルにおいては、ＤＮＡを約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲で用いてもよい。
【０１５７】
遺伝子送達ビヒクルを用いて本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達してもよい。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス由来でも、非ウイルス由来でもよい（Ｊｏｌｌｙ（１９９４），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９８５），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１８５；ａｎｄ Ｋａｐｌｉｔｔ（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８を全般的に参照）。そうしたコード配列の発現を、哺乳動物の内因性または異種プロモーターを用いて誘導してもよい。コード配列の発現は、構成的でも、あるいは、調節的でもよい。
【０１５８】
所望のポリヌクレオチドを所望の細胞に送達し、発現させるウイルスベースのベクターは、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとして、組換えレトロウイルス（たとえば、国際公開第９０／０７９３６号；国際公開第９４／０３６２２号；国際公開第９３／２５６９８号；国際公開第９３／２５２３４号；国際公開第９３／１１２３０号；国際公開第９３／１０２１８号；国際公開第９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号；同特許第４，７７７，１２７号；独国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４２号を参照）、たとえば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））などのアルファウイルスベースのベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクター（たとえば、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号および国際公開第９５／００６５５号を参照）が挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７に記載されているような死滅アデノウイルスに結合したＤＮＡの投与を用いてもよい。
【０１５９】
さらに、以下に限定されるものではないが、死滅アデノウイルスに単独で結合した、あるいは結合していないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７を参照）；リガンド結合ＤＮＡ（たとえば、Ｗｕ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５を参照）；真核細胞の送達ビヒクル細胞（たとえば、米国特許第５，８１４，４８２号；国際公開第９５／０７９９４号；国際公開第９６／１７０７２号；国際公開第９５／３０７６３号；および国際公開第９７／４２３３８号を参照）および核電荷の中和または細胞膜との融合など、非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法を用いてもよい。
【０１６０】
さらに、裸のＤＮＡを用いてもよい。例示的な裸のＤＮＡの導入方法については、国際公開第９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして働くリポソームについては、米国特許第５，４２２，１２０号；国際公開第９５／１３７９６号；国際公開第９４／２３６９７号；国際公開第９１／１４４４５号；および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ９１：１５８１に記載されている。
【０１６１】
さらに、本発明は、個体の癌を処置する方法を提供し、この方法は、ａ）本発明の抗体を含む組成物の有効量を個体に投与すること、およびｂ）個体に第２の癌治療を適用することを含む。一部の実施形態では、第２の療法は、手術、照射、ホルモン療法、遺伝子療法、別の抗体療法、および化学療法を含む。抗体を含む組成物および第２の療法は、同時に（たとえば、同時投与）および／または順次に（たとえば、順次投与）適用することができる。たとえば、抗体を含む組成物および第２の療法は、約１０分、５分、または１分以下のいずれかなど約１５分以下の時間を隔てて適用される。あるいは、抗体を含む組成物および第２の療法は、約２０分、３０分、４０分、５０分、または６０分、１日、２日、３日、１週間、２週間、または１カ月以上など約１５分を超える時間を隔てて適用される。
【０１６２】
本発明の抗体を含む組成物については、化学療法剤（５−ＦＵ、５−ＦＵ／ＭＴＸ、５−ＦＵ／ロイコボリン、レバミソール、イリノテカン、オキサリプラチン、カペシタビンまたはウラシル／テガフールなど）、免疫アジュバント、成長阻害剤、細胞傷害性薬剤およびサイトカインなど１種または複数種の他の治療薬と連続的に、または、同時に投与してもよい。抗体および治療薬の量は、使用する薬物のタイプ、処置対象の病状ならびに投与スケジュールおよび投与経路に依存するが、通常、各治療薬を個々に使用する場合よりも少量になる。
【０１６３】
本明細書に記載の抗体を含む組成物の投与後、当業者に周知の様々な方法によりインビトロでもインビボでも組成物の有効性を評価することができる。候補組成物の抗癌活性を検査する場合、様々な動物モデルがよく知られている。こうしたモデルには、無胸腺ヌードマウスまたはｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに異種移植したヒト腫瘍、あるいはｐ５３ノックアウトマウスなどのマウスの遺伝性腫瘍モデルがある。こうした動物モデルのインビボでの性質から、ヒト患者の反応が具体的に予測される。こうしたモデルを、たとえば、皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹腔内移植および腎被膜下移植など標準技法を用いて細胞を同系マウスに導入して作製してもよい。
【０１６４】
キット
また、本発明は、本方法で使用するキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載の精製抗体またはポリペプチドと、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従った使用説明書とを含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、こうした説明書は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って結腸直腸癌などの非造血系癌を処置するおよび／またはその発達を遅延する抗体の投与に関する説明を含む。キットは、個体に疾患があるかどうかおよびその疾患のステージ、あるいは個体の癌細胞にエピトープが発現しているかどうかの確認を踏まえた、処置に好適な個体の選択に関する説明をさらに含み得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、サンプル中の癌細胞を検出するキットは、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと、サンプル中の細胞に対する抗体またはポリペプチドの結合を検出する試薬とを含む。
【０１６６】
癌を処置するおよび／またはその発達を遅延する抗体またはポリペプチドの使用に関する説明書には通常、意図される処置についての投与量、投与スケジュールおよび投与経路に関する情報が含まれている。容器は、単位用量でも、バルクパッケージ（たとえば、複数用量パッケージ）でも、サブユニット用量でもよい。本発明のキットで供給される説明書は一般に、ラベルまたは添付文書（たとえば、キットに含まれる紙シート）に記載された説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（たとえば、磁気または光学保存ディスク上にある説明書）でも問題ない。
【０１６７】
ラベルまたは添付文書には、その組成物を用いて本明細書に記載の癌を処置する旨表示されている。本明細書に記載の方法のいずれかの実施に関する説明書を提供してもよい。
【０１６８】
本発明のキットは、適切なパッケージ内にある。適切なパッケージには、バイアル、ビン、ジャー、フレキシブルパッケージ（たとえば、シールマイラーまたはビニール袋）などが含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、吸入器、鼻腔内投与装置（たとえば、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入装置のような特定の装置と組み合わせて用いるパッケージも意図している。キットには、滅菌アクセスポートがあってもよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓が付いた静脈内注射液バッグまたはバイアルであってもよい）。さらに、容器にも、滅菌アクセスポートがあってもよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓が付いた静脈内注射液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの有効な薬物は、本明細書に記載の抗体である。容器は、薬学的に有効な第２の薬物をさらに含み得る。
【０１６９】
キットは任意に、緩衝剤および説明情報など他の要素も提供する。通常、キットは、容器と、容器の表面上あるいは容器に付属したラベルまたは添付文書（単数または複数）とを含む。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、本発明の説明を目的としており、本発明を限定するために提供するものではない。
【０１７１】
（実施例１）
５Ｆ１の軽鎖および重鎖可変領域のクローニング
２００７年６月７日出願の米国仮特許出願第１１／８１１，３０３号（米国特許出願第２００８／０１７１０４３号として公開）に示されているように、５Ｆ１の軽鎖および重鎖の可変領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、その合成ｃＤＮＡを、配列決定のためにｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。いくつかの独立クローンからヌクレオチド配列を得て解析した。各抗体の軽鎖Ｖ領域または重鎖Ｖ領域を表すように、独立クローンから同一のｃＤＮＡ配列を選択した。以下の表２は、マウス５Ｆ１（ｍ５Ｆ１）およびヒト化５Ｆ１Ｖｃ（ｈ５Ｆ１Ｖｃ）の軽鎖Ｖ領域および重鎖Ｖ領域の翻訳されたアミノ酸配列およびそのＶ領域をコードしているヌクレオチド配列を示す。
【０１７２】
【表２−１】

【０１７３】
【表２−２】

【０１７４】
【表２−３】

（実施例２）
キメラ５Ｆ１変異体の改変型
マウス５Ｆ１抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＧ３である。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の問題を回避するため、およびヒトにおいてより有効なＦｃ−依存的機能を有するために、５Ｆ１（ｃ５Ｆ１）抗体のキメラ形態（ｃ５Ｆ１−ｖ０；重鎖について：配列番号１（ＶＨ）、配列番号９（ＣＨ）；軽鎖について配列番号２（ＶＬ）、配列番号１０（ＣＬ）、表２および図２を参照）は、マウス５Ｆ１抗体の可変（Ｖ）領域をヒトＩｇＧ１の定常領域と組み合わせることによって作製した。ヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ３のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域のアミノ酸配列も比較した。配列比較によると、ＣＨ１−ヒンジ領域はマウスＩｇＧ３およびヒトＩｇＧ１の間で最も違いが大きい（図１）。配列比較に関して本明細書で使用する場合、「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全ての配列において同一であることを意味し、「：」は、保存された置換が観察されたことを意味し、「．」は、半保存的な置換が観察されることを意味する。マウス５Ｆ１と等価なアポトーシス誘導活性のｃ５Ｆ１を有するために、ｃ５Ｆ１重鎖のＣＨ１および／またはヒンジドメインにおいていくつかの改変がなされ（表３；表３の残基番号付けは、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２巻：１６１〜２０６頁、１９８５年に記載のＥＵ番号付けシステムによる）、Ｃ５Ｆ１軽鎖においていくつかの改変がなされた（表４）。場合によって、改変重鎖は、Ｃ末端改変軽鎖とともに発現させた（表５）。重鎖および軽鎖アミノ酸配列に関して図２も参照されたい。
【０１７５】
【表３】

【０１７６】
【表４】

【０１７７】
【表５】

（実施例３）
キメラ５Ｆ１抗体の重鎖および軽鎖の定常領域における変化の導入
抗体産生および精製を容易にするために、ヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖の定常領域を含むｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１（ＡｂＧｅｎｏｍｉｃｓで作製）を使用してキメラ５Ｆ１（ｃ５Ｆ１）を発現させた。ｍ５Ｆ１重鎖および軽鎖遺伝子の可変領域を、それぞれｍ５Ｆ１ＨＣ−ＸｂａＩ ｆ／ｍ５Ｆ１ＨＣ−ＸｂａＩ ｒおよびｍ５Ｆ１ＬＣ−ＸｂａＩ ｆ／ｍ５ＦｌＬＣ−ＸｂａＩ ｒ（表６、プライマーＡ３／Ａ７およびＡ８／Ａ９）のプライマー対を使用したＰＣＲで別々に増幅した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、続けてｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１に挿入した。ｃ５Ｆ１の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方を含む完全にアセンブリされたｃ５Ｆ１発現プラスミドｃ５Ｆ１／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１を使用して、非改変ｃ５Ｆ１抗体を発現させた。同じプラスミドを、ｃ５Ｆ１改変の導入のための鋳型としても使用した。
【０１７８】
製造業者の使用説明書に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２００５３１−５）を使用して、プライマー（表６）を用いてｃ５Ｆ１／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１の遺伝子に変異を導入する、ＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発を使用して、残基２２０（Ｅｕ番号付け）に欠失（ｖ１５）またはＳ置換（ｖ１６）を有するコンストラクトを作製した。オリゴヌクレオチドＭ１（５’−ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号４７））を使用して残基２２０のＣｙｓを欠失させ（ｖ１５）、オリゴヌクレオチドＭ２（５’−ＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号４８））を使用して残基２２０のＳｅｒ置換を行った（ｖ１６）。部位特異的突然変異誘発の際のＰＣＲによって導入されるランダム突然変異の可能性を除去するため、改変を含むＤＮＡフラグメントをＡｇｅＩ（ＣＨ１領域内）およびＸｍａＩ（ＣＨ３領域内）で切り取り、元のｃ５Ｆ１／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１に再クローニングして、元の非改変領域を置き換えた。
【０１７９】
代替として、オーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を使用して残り全ての改変（表３〜６）も作製した。簡潔に述べると、２つのＰＣＲ反応を使用して、所望の変異を含み、少なくとも２０個のヌクレオチドのオーバーラップする配列を共有する、２つのＤＮＡ産物フラグメントを作製した。２つのＰＣＲ産物を次いで混合し、変性して再アニールさせた。次いで、２つの（先の２つのＰＣＲから）外側のプライマーを用いる別のＰＣＲ反応を使用して、アセンブリされた完全長ＤＮＡフラグメントを増幅した。たとえば、ｖ１について、プライマー対Ａ４／Ｍ２３およびＭ２４／Ａ３（表６）を使用して最初の２つのフラグメントをＰＣＲにより作製した。この２つのＰＣＲフラグメントを次いで混合し、再アニールさせ、外側プライマー（Ａ３およびＡ４）を使用して完全長ＰＣＲ産物を作製した。最後に、改変を含むＤＮＡフラグメントを元のｃ５Ｆ１／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１に再クローニングした。ＣＨ１改変を含むフラグメントを、ＸｂａＩ（重鎖Ｖ領域の開始部位内）およびＡｇｅＩ（ＣＨ１領域内）部位を介して再クローニングした。ヒンジ改変を含むフラグメントを、ＡｇｅＩ（ＣＨ１領域内）およびＸｍａＩ（ＣＨ３領域内）部位を介して再クローニングした。軽鎖のＣ末端改変を行うために、ＡｖｒＩＩ（軽鎖Ｖ領域の終止部位内）およびＢａｍＨＩ（軽鎖コード配列の下流内）部位を介してＰＣＲ産物をクローニングして、元の非改変配列を置き換えた。
【０１８０】
次いで、改変を有するまたは有さないプラスミドをＦｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｒ７５８〜０７）にリポフェタミン２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１６６８〜０１９）でトランスフェクトした。非改変または改変ｃ５Ｆ１抗体を含む培養培地を回収し、抗体をプロテインＡで精製した。精製した抗体を、ＣＯＬＯ２０５細胞において結合およびアポトーシス誘導活性について試験した。
【０１８１】
結合アッセイ
濃度０．１２５ｕｇ／ｍｌ〜４ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１−ｖ０、ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６抗体を、１．５×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートし、２％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ_３含有ＰＢＳで２回洗浄し、その後で１μｇ／ｍｌの対応する二次抗体（Ｒ−ＰＥ−コンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３２−０９；またはＲ−ＰＥ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０９）で、４℃で３０分間インキュベートした。染色の最後に、サンプルを２％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ_３含有ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。
【０１８２】
アポトーシスアッセイ
１．５×１０^５個のＣＯＬＯ２０５細胞を９６−ウェルプレートのウェルに播種した。濃度２〜３２ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１−ｖ０、ｃ５Ｆ１−ｖ１５、ｃ５Ｆ１−ｖ１６および対照抗体のアリコートを、培養培地中に新しく調製し、各ウェルに加えた。ｍ９Ｅ１０およびｈ１６Ｃ１１Ａで処理したサンプルをアイソタイプ対照として使用した。処理した細胞を、アポトーシスのＦＡＣＳ分析の前に３７℃インキュベーターに６時間保持した。細胞アポトーシスアッセイのために、製造業者の使用説明書に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＶＫ２５０）を使用してアネキシンＶ染色を測定した。簡潔に述べると、処理した細胞を集め、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有アネキシンＶ結合緩衝液に室温で再懸濁した。暗所で１５分のインキュベーション後、細胞を２００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ分析の前に、０．２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。アネキシンＶＩ陽性および／またはＰＩ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなす。
【０１８３】
【表６−１】

【０１８４】
【表６−２】

結果
フローサイトメトリー解析による変異体５Ｆ１抗体の結合およびアポトーシス誘導作用を、下記の図３および表７に示す。ｃ５Ｆ１−ｖ０、ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６はＣＯＬＯ２０５細胞に結合し、ちょうどマウスの対応物ｍ５Ｆ１のように、ＣＯＬＯ２０５細胞においてアポトーシスを誘導する。ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６は、ｃ５Ｆ１と比較してＣＯＬＯ２０５細胞への結合が比較的少ない。アポトーシス誘導について、ｃ５Ｆ１−ｖ０処理細胞において観察された作用は、ｍ５Ｆ１ほど効率的ではなかった。しかしながら、ヒンジ改変形態（ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６）を使用した場合、アポトーシス誘導活性は回復した。ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６のＣＯＬＯ２０５細胞への結合活性はｃ５Ｆ１−ｖ０のものよりも低いようであったにもかかわらず、ｃ５Ｆ１−ｖ１５およびｃ５Ｆ１−ｖ１６の両方が、ＣＯＬＯ２０５細胞においてｍ５Ｆ１とほぼ同程度に効率的にアポトーシスを誘導した。アイソタイプ対照抗体９Ｅ１０（マウスＩｇ対照）およびｈ１６Ｃ１１Ａ（ヒトＩｇ対照）は、３２ｕｇ／ｍｌでＣＯＬＯ２０５細胞のアポトーシスを誘導しなかった。
【０１８５】
【表７】

（実施例４）
５Ｆ１抗体のヒト化
５Ｆ１のヒト化型も開発し（図４）、定常領域改変を有する発現プラスミド中に組み込んだ（実施例２および３参照）。
【０１８６】
相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングを使用して、組換えＤＮＡ技術によってマウス５Ｆ１可変領域のＣＤＲがヒトＩｇＧ１可変領域（アクセプター抗体）のフレームワーク中に組み込まれたヒト化５Ｆ１（ｈ５Ｆ１Ｍ）の可変領域を作製した。マウス５Ｆ１に最適なアクセプター抗体を決定するため、マウス５Ｆ１の可変領域の配列を、ＡｂＧｅｎｏｍｉｃｓで作製された免疫グロブリンデータベースと一緒に分析した。マウス抗体Ｍ１９５（Ｍａｎ Ｓｕｎｇ ＣｏらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻（４号）：１１４９〜１１５４頁（１９９２年２月１５日））が、マウス５Ｆ１に最良な適合を示した。結果的に、ヒト抗体Ｅｕ（Ｍａｎ Ｓｕｎｇ ＣｏらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８巻（４号）：１１４９〜１１５４頁（１９９２年２月１５日））をアクセプター抗体として選択した。ヌクレオチド配列を設計および合成して、抗体Ｅｕの可変領域のフレームワーク中に組み込まれたマウス５Ｆ１の３つのＣＤＲ領域を有するヒト化５Ｆ１型を作製した。
【０１８７】
ｈ５Ｆ１Ｍの各Ｖ遺伝子を操作するために、次に少なくとも１８ヌクレオチドのオーバーラップ領域を順次に共有する長さが５５〜７０塩基の４対のオリゴヌクレオチドを合成した（表８．重鎖：Ｈ１〜Ｈ８、軽鎖：Ｌ１〜Ｌ８）。全Ｖ遺伝子のアセンブリおよび増幅を、４段階で行った：１）相補オリゴヌクレオチドの４対（重鎖：Ｈ１／Ｈ２、Ｈ３／Ｈ４、Ｈ５／Ｈ６およびＨ７／Ｈ８；軽鎖：Ｌ１／Ｌ２、Ｌ３／Ｌ４、Ｌ５／Ｌ６およびＬ７／Ｌ８）をアニールさせ、別の反応で３’陥凹（ｒｅｃｅｓｓ）領域をクレノーフラグメントで埋めて、４つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントを作製した；２）得られた４つのｄｓＤＮＡフラグメントを対で混合し、変性させ、再アニールさせ、３’陥凹を２つの別の反応で埋めて２つのｄｓＤＮＡフラグメントを作製した；３）得られた２つのｄｓＤＮＡフラグメントを混合し、変性させ、再アニールさせ、３’陥凹を埋めて完全長ｄｓＤＮＡを作製した；４）次いで、ＸｂａＩ部位を含む２つの外側プライマー（重鎖について：Ａ１０およびＡ１１、軽鎖について：Ａ１２およびＡ１３（表８）を用いたＰＣＲ反応を使用して、アセンブルされたＶＬおよびＶＨフラグメントを増幅した。
【０１８８】
次いで、ＸｂａＩ含有ＶＨおよびＶＬフラグメントを、重鎖および軽鎖それぞれについてＮｈｅＩ部位およびＡｖｒＩＩ部位を介してｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１ベクター中に挿入した。ｈ５Ｆ１Ｍの重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む完全にアセンブリされたｈ５Ｆ１Ｍ発現プラスミドｈ５Ｆ１Ｍ／ｐｃＤＮＡ５−ＦＲＴ−ｈＩｇＧ１を使用して、非改変ｈ５Ｆ１Ｍ抗体を発現させた。同じプラスミドを、ｈ５Ｆ１Ｍ改変の導入のための鋳型としても使用した（図４）。
【０１８９】
ｈ５Ｆ１−Ｍの改変
オーバーラッピングＰＣＲおよびＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発を使用して、表８および９に示したプライマーを使用して、ｈ５Ｆ１−Ｍ（図４）の可変領域を改変する。非改変または改変ｈ５Ｆ１可変領域を、実施例２〜３に述べたようにヒトＩｇＧ定常領域（非改変または改変）に組み込んだ。次いで発現プラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。上清を回収し、抗体をプロテインＡで精製する。精製した抗体を、ＣＯＬＯ２０５細胞において結合およびアポトーシス誘導機能について試験する。
【０１９０】
【表８−１】

【０１９１】
【表８−２】

【０１９２】
【表９】

（実施例５）
キメラ５Ｆ１変異体の特徴付け
抗体のＣｏｌｏ２０５細胞への結合
１ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１−ｖ０、ｃ５Ｆ１−ｖ１７、ｃ５Ｆ１−ｖ２４およびｃ５Ｆ１−ｖ２５抗体を、２×１０^５個のＣｏｌｏ２０５細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートし、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、その後１ｕｇ／ｍｌの対応する二次抗体（Ｒ−ＰＥ−コンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３２−０９；またはＲ−ＰＥ−コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４０−０９）で、４℃で３０分間インキュベートした。染色の最後に、サンプルを１％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ_３含有ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。表１０のデータは、試験された全ての型の５Ｆ１抗体がＣｏｌｏ２０５細胞に結合することができることを示した。
【０１９３】
【表１０】

アポトーシスアッセイ
１．５×１０^５個のＣｏｌｏ２０５細胞を９６−ウェルプレートのウェルに播種した。濃度８〜３２ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１、ｃ５Ｆ１−ｖ１７、ｃ５Ｆ１−ｖ２４、ｃ５Ｆ１−ｖ２５および対照抗体のアリコートを、培養培地中に新しく調製し、各ウェルに加えた。処理した細胞を、アポトーシスに関するＦＡＣＳ分析の前に３７℃インキュベーターに６時間保持した。細胞アポトーシスアッセイのために、製造業者の使用説明書に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＶＫ２５０）を使用してアネキシンＶ染色を測定した。簡潔に述べると、処理した細胞を集め、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有アネキシンＶ結合緩衝液に室温で再懸濁した。暗所で１５分のインキュベーション後、細胞を２００ｕｌのアネキシンＶ結合緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ分析の前に、０．２５ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。アネキシンＶＩ陽性および／またはＰＩ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなす。表１１のデータは、試験された全ての型の５Ｆ１抗体がＣｏｌｏ２０５細胞においてアポトーシスを誘導することができることを示した。
【０１９４】
【表１１】

移植片試験
０日目に、５×１０^６個のＣｏｌｏ２０５細胞を６〜７週齢ＳＣＩＤマウスの後方側腹領域に皮下移植した。腫瘍細胞接種後０日目に、抗体３０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射による処置を開始し、４、７、１１、１４および１８日目に繰り返した。この実験では、各群でマウス６匹を使用した。カリパスによる週２回の腫瘍容積（ｍｍ^３）の測定に基づき腫瘍成長を判定し、腫瘍の大きさを、式：π／６×長径×（短径）^２（Ｋｉｅｖｉｔ Ｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０巻：６６４９〜５５頁）を用いて算出した。２１日目にマウスを屠殺し、腫瘍を単離し、重量を測定した。表１２に示す結果は、ＰＢＳ処置と比較した、試験した全ての抗体の抗腫瘍作用を示す。
【０１９５】
【表１２】

Ｃｏｌｏ２０５細胞のアポトーシス誘導においてオキサリプラチンと組み合わせた５Ｆ１抗体の相乗効果
１．４×１０^５個のＣｏｌｏ２０５細胞を９６−ウェルプレートのウェルに播種した。５％グルコース溶液において再構成したオキサリプラチンのアリコートを新しく調製し、１０ｕｇ／ｍｌおよび３０ｕｇ／ｍｌの最終濃度の精製したｃ５Ｆ１−ｖ１７、ｃ５Ｆ１−ｖ２４、ｃ５Ｆ１−ｖ２５および対照抗体のアリコートとともにまたは組み合わせて、１ｕｇ／ｍｌおよび１０ｕｇ／ｍｌの最終濃度で各ウェルに加えた。処理した細胞を、アポトーシスのＦＡＣＳ分析の前に３７℃インキュベーターに２４時間保持した。細胞アポトーシスアッセイのために、製造業者の使用説明書に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＡＶＫ２５０）を使用してアネキシンＶ染色を測定した。簡潔に述べると、処理した細胞を集め、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有アネキシンＶ結合緩衝液に室温で再懸濁した。暗所で１５分のインキュベーション後、細胞を２００ｕｌのアネキシンＶ結合緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ分析の前に、０．５ｕｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。アネキシンＶ陽性および／またはＰＩ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなす。表１３のデータは、Ｃｏｌｏ２０５癌細胞のアポトーシス誘導における、オキサリプラチンと組み合わせて試験した全ての５Ｆ１抗体の相乗効果を示した。
【０１９６】
【表１３】

ＳＵ８６．８６膵臓癌細胞に対するｍ５Ｆ１抗体の結合およびアポトーシス誘導
１ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１および対照抗体を、２×１０^５個のＳＵ８６．８６細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートし、１％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、その後１ｕｇ／ｍｌの対応する二次抗体（Ｒ−ＰＥ−コンジュゲートヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１０３２−０９）で、４℃で１時間インキュベートした。染色の最後に、サンプルを１％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。
【０１９７】
【表１４】

２×１０^５個のＳＵ８６．８６細胞を１２−ウェルプレートのウェルに播種した。濃度２〜３２ｕｇ／ｍｌの精製されたｍ５Ｆ１のアリコートを、培養培地中に新しく調製し、各ウェルに加えた。バックグラウンドシグナル測定のために、３２ｕｇ／ｍｌの対照抗体を含めた。処理した細胞を、アポトーシスのＦＡＣＳ分析の前に３７℃インキュベーターに６時間保持した。細胞アポトーシスアッセイのために、製造業者の使用説明書に従ってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＡＶＫ２５０）を使用してアネキシンＶ染色を測定した。簡潔に述べると、処理した細胞を集め、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ含有アネキシンＶ結合緩衝液に室温で再懸濁した。暗所で１５分のインキュベーション後、細胞を２００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ分析の前に、０．２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加した。全てのフローサイトメトリー分析は、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔのソフトウェアを使用してＢＤ−ＬＳＲフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。アネキシンＶＩ陽性および／またはＰＩ陽性細胞をアポトーシス細胞とみなす。
【０１９８】
【表１５】

表１４および１５に示すデータは、ｍ５Ｆ１が膵臓癌細胞株ＳＵ．８６／８６に結合することができ、ｍ５Ｆ１の結合がＳＵ．８６．８６細胞のアポトーシスを誘導することを示した。
【０１９９】
抗体ｃ５Ｆ１．ｖ１５、ｃ５Ｆ１．ｖ１６、およびｃ５Ｆ１．ｖ２４について、結合実験を行った。これらの抗体は、ＳＵ．８６．８６細胞への顕著な結合を示した。抗体ｃ５Ｆ１．ｖ１５についてアポトーシスアッセイを行った。データは、この抗体は、Ｆｃγフラグメント特異性である（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０９−００５−０９８）架橋剤マウス抗ヒトＩｇＧの存在下でのみ、８ｕｇ／ｍｌおよび３２ｕｇ／ｍｌでＳＵ．８６．８６細胞のアポトーシスを誘導したことを示した。
【０２００】
【数１】

【０２０１】
【数２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖および軽鎖を含む単離された抗体であって、
（ａ）該重鎖は、配列番号１のアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域、および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み、該重鎖定常領域のヒンジ領域は、少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含み、かつ
（ｂ）該軽鎖は、配列番号２のアミノ酸配列からの３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域または配列番号１０のアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸挿入をさらに含む軽鎖定常領域を含む、
抗体。
【請求項２】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記重鎖定常領域が配列番号２５〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域が配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記重鎖定常領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記重鎖可変領域が配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖定常領域が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記重鎖定常領域が配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
前記重鎖可変領域が配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖定常領域が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域が配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項９】
前記重鎖可変領域が配列番号１の残基２０〜１３７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖定常領域が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号２の残基２０〜１３１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体をコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体をコードしている核酸配列を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
抗体を産生する方法であって、核酸によりコードされている該抗体を産生する請求項１３に記載の宿主細胞を培養すること、および該細胞培養物から該抗体を回収することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法によって産生される抗体。
【請求項１６】
抗体を産生する方法であって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域、および配列番号１１〜３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む重鎖をコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からの３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域、および配列番号１０および３１〜３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む定常領域を含む軽鎖をコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチド
を宿主細胞で発現させることを含み、該重鎖および軽鎖をコードしている該ポリヌクレオチドが、該宿主細胞において共発現される、方法。
【請求項１７】
前記抗体が単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
癌を有する個体の非造血系癌を処置するための方法であって、請求項１〜９および１５のいずれか一項に記載の抗体を含む組成物の有効量を該個体に投与することを含み、該抗体が該個体において該癌細胞に結合する、方法。
【請求項１９】
前記非造血系癌が結腸直腸癌、膵癌、または胃癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が細胞毒にコンジュゲートされている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
個体の非造血系癌を処置するための方法であって、一定量の、請求項１〜９および１５のいずれか一項に記載の抗体および一定量の別の抗癌剤を該個体に投与することを含み、該抗体が該個体において該癌細胞に結合し、それにより、組み合わせた該抗体および該抗癌剤が、該個体において癌の有効な処置を提供する、方法。
【請求項２２】
前記非造血系癌が結腸直腸癌、膵癌、または胃癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗癌剤が、化学療法剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜９および１５のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物と、非造血系癌を処置するために、該医薬組成物の有効量を個体に投与するための説明書とを含む、キット。
【請求項２５】
非造血系癌を処置するために、前記医薬組成物を別の抗癌剤と併用して個体に投与するための説明書をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１〜９および１５のいずれか一項に記載の抗体を含む第１の医薬組成物と、別の抗癌剤を含む第２の医薬組成物と、非造血系癌を処置するために、該第１の医薬組成物および該第２の医薬組成物を併用して個体に投与するための説明書とを含む、キット。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図２Ｅ】

【図２Ｆ】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【公表番号】特表２０１１−５０５８７５（Ｐ２０１１−５０５８７５Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９８２４（Ｐ２０１０−５３９８２４）
【出願日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８７５１５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７９６４９
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０８３５９６１９）
【Ｆターム（参考）】