癌細胞浸潤の診断及び予防
【課題】悪性疾患の分野における診断及び治療法並びに癌細胞浸潤の予防又は治療を含む、悪性疾患の浸潤性の測定法及び悪性疾患の浸潤性の減少法。
【解決手段】ＡＸＬ、ＧＡＳ６、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ５、ＦＹＮ、ＬＹＮ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＫ、ＲＰＳ６ＲＢ１、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα及びＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定し、並びにＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子又はタンパク質又はそのリガンドを抑制することから成る悪性疾患の浸潤度を減少させる。
【解決手段】ＡＸＬ、ＧＡＳ６、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ５、ＦＹＮ、ＬＹＮ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＫ、ＲＰＳ６ＲＢ１、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα及びＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定し、並びにＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子又はタンパク質又はそのリガンドを抑制することから成る悪性疾患の浸潤度を減少させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性疾患の分野における診断及び治療法に関する。更に特に本発明は、悪性疾患の浸潤度判定法及び癌細胞浸潤の予防又は治療を含む悪性疾患の浸潤度の減少法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
最近、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現が、ヒトを含む哺乳類において多くの症例で悪性疾患、特に癌の発生と関係があることが判明した。例えば受容体チロシンキナーゼＡＸＬ／ＵＦＯ（参照１、２；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６１２５）の過剰発現はヒトの血液学的悪性腫瘍の発生に関与している。更に最新データは、ＡＸＬ及びそのリガンドＧＡＳ６のシグナリングが癌細胞の腫瘍起因性血管形成、接着及び生存に関与していることを示す（参照３、４、５、６、７、８）。Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（１９９７年１０月）第４６巻、Ｎｏ．１、９１頁、Ａｔｔａｒ、Ｅ．Ｃ．その他は、ヒト乳癌におけるＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ発現に関する研究を開示している（参照３３）。Ｄｏｄｇｅ Ｚａｎｔｅｋ Ｎ．その他は乳癌における細胞−ＥＣＭ及び細胞間相互作用を調べるための新しい細胞系としてＭＣＦ−１０Ａ−ＮｅｏＳＴを発表した（参照３４）。彼らは、ＡＸＬの浸潤における潜在的役割及び乳癌の進行因子としての潜在的役割を指摘している。しかし、ＡＸＬの過剰発現がその他の悪性疾患における浸潤度及び／又は転移形成と関与していることを実証しうるデータは提供されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】J. W. Janssen, A. S. Schulz, A. C. Steenvoorden et al., A novel putative tyrosine kinase receptor with oncogenic potential. Oncogene 6 (1991), pp. 2113-2120
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【非特許文献３】Healy, A. M. , Schwartz, J. J. , Zhu, X., Herrick, B. E. , Varnum, B., Farber, H. W. (2001). Gas 6 promotes AXL-mediated survival in pulmonary endothelial cells. Am. J. Physio. 280: 1273L-1281
【非特許文献４】A. Neubauer, A. Fiebeler, D. K. Graham et al., Expression of axl, a transforming receptor tyrosine kinase, in normal and malignant hematopoiesis. Blood 84 (1994), pp. 1931-1941
【非特許文献５】P. McCloskey, J. Pierce, R. A. Koski, B. Varnum and E. T. Liu, Activation of the AXL receptor tyrosine kinase induces mitogenesis and transformation in 32D cells. Cell Growth Differ. 5 (1994), pp. 1105-1117
【非特許文献６】P. Bellosta, Q. Zhang, S. P. Goff and C. Basilico, Signalling through the ARK tyrosine kinase receptor protects from apoptosis in the absence of growth stimulation. Oncogene 15 (1997), pp. 2387-2397
【非特許文献７】S. Goruppi, E. Ruaro and C. Schneider, Gas6, the ligand of AL tyrosine kinase receptor, has mitogenic and survival activities for serum starved NIH3T3 fibroblasts. Oncogene 12 (1996), pp. 471-480
【非特許文献８】P. McCloskey, Y. W. Fridell, E. Attar et al., GAS6 mediates adhesion of cells expressing the receptor tyrosine kinase AXL. J. Biol. Chem. 272 (1997), pp. 23285-3291.
【非特許文献９】Caron de Fromentel C. , Nardeux P. C. , Soussi T., Lavialle C. , Estrade S., Carloni G. , Chandrasekaran K. , Cassingena R. Epithelial HBL-100 cell line derived from milk of an apparently healthy woman harbors SV40 genetic information. Exp. Cell Res. , (1985), 160: 83-94
【非特許文献１０】Albini A. , Iwamoto Y. , Kleinman H. K. , Martin G. R. , Aaronson S. A. , Kozlowski J. M. , McEwan R. N. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. , 47: 3239-3245,1987
【非特許文献１１】Thompson E. W. , Paik S. , Brunner N. , Sommers C. L. , Zugmaier G., Clarke R. , Shima T. B. , Torri J. , Donahue S., Lippman M. E., et al Association of increased basement membrane invasiveness with absence of estrogen receptor and expression of vimentin in human breast cancer cell lines. J. Cell. Physiol., 150: 534-544,1992
【非特許文献１２】Terranova V. P. , Hujanen E. S. , Martin G. R. Basement membrane and the invasive activity of metastatic tumor cells. J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 77: 311-316,1986
【非特許文献１３】Perou C. M., Jeffrey S. S. , van de Rijn M., Rees C. A., Eisen M. B., Ross D. T., Pergamenschikov A Williams C. F., Zhu S. X., Lee J. C. , Lashkari D., Shalon D. , Brown P. 0., Botstein D. Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 9212-9217, 1999
【非特許文献１４】Perou C. M., Sorlie T. , Eisen M. B. , van de Rijn M., Jeffrey S. S., Rees C. A., Pollack J. R. , Ross D. T., Johnsen H., Akslen L. A. , Fluge 0., Pergamenschikov A., Williams C. , Zhu S. X., Lonning P. E., Borresen-Dale A. L. , Brown P. O., Botstein D. Molecular portraits of human breast tumours. Nature (Lond. ), 406: 747-752, 2000
【非特許文献１５】Johnston M. Gene chips: array of hope for understanding gene regulation. Curr. Biol., 8: R171-174, 1998
【非特許文献１６】Duggan D. J. , Bittner M. , Chen Y., Meltzer P. , Trent J. M. Expression profiling using cDNA microarrays. Nat. Genet. , 21: 10-14,1999
【非特許文献１７】Price J. E., Polyzos A., Zhang R. D. , Daniels L. M. Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice. Cancer Res., 50 : 717-721,1990.
【非特許文献１８】Sommers C. L. , Byers S. W. , Thompson E. W. , Torri J. A., Gelmann E. P. Differentiation state and invasiveness of human breast cancer cell lines. Breast Cancer Res. Treat, 31: 325-335,1994
【非特許文献１９】Deborah A. Zajchowski, Marty F. Bartholdi, Yan Gong, Lynn Webster, Hsiao-Lai Liu, Alexander Munishkin, Catherine Beauheim, Susan Harvey, Stephen P. Ethier and Paul H. Johnson. Identification of Gene Expression Profiles That Predict the Aggressive Behavior of Breast Cancer Cells. Cancer Research 61,5168-5178, July 1,2001
【非特許文献２０】A. Wimmel, M. Schilli, U. Kaiser et al., Preferential histiotypic expression of CD44-isoforms in human lung cancer. Lung Cancer 16 (1997), pp. 151-172
【非特許文献２１】Subburaj Ilangumaran, Anne Briol, and Daniel C. Hoessli. CD44 Selectively Associates With Active Src Family Protein Tyrosine Kinases Lck and Fyn in Glycosphingolipid-Rich Plasma Membrane Domains of Human Peripheral Blood Lymphocytes. Blood, Vol. 91 No. 10 (May 15), 1998: pp. 3901-3908
【非特許文献２２】Domagala W. , Lasota J. , Bartowiak J. , Weber K. , Osborn M. Vimentin is preferentially expressed in human breast carcinomas with low estrogen receptor and high Ki-67 growth fraction. Am. J. Pathol., 136: 219-227, 1990
【非特許文献２３】Domagala W. , Wozniak L., Lasota J. , Weber K., Osborn M. Vimentin is preferentially expressed in high-grade ductal and medullary but not in lobular breast carcinomas. Am. J. Pathol., 137: 1059-1064, 1990
【非特許文献２４】Hayashi K, Matsuda S, Machida K, Yamamoto T, Fukuda Y, Nimura Y, Hayakawa T, Hamaguchi M. Invasion activating caveolin-1 mutation in human scirrhous breast cancers. Cancer Res 2001 Mar 15 ; 61 (6): 2361-4
【非特許文献２５】Yang G, Truong LD, Timme TL, Ren C, Wheeler TM, Park SH, Nasu Y, Bangma CH, Kattan MW, Scardino PT, Thompson TC. Elevated expression of caveolin is associated with prostate and breast cancer. Clin Cancer Res 1998 Aug; 4(8):1873-80
【非特許文献２６】Bachmeier BE, Nerlich AG, Lichtinghagen R, Sommerhoff CP. Matrix metalloproteinases (MMPs) in breast cancer cell lines of different tumorigenicity. Anticancer Res 2001 Nov-Dec ; 21 (6A) : 3821-8
【非特許文献２７】Sounni NE, Devy L, Hajitou A, Frankenne F, Munaut C, Gilles C, Deroanne C, Thompson EW, Foidart JM, Noel A. MT1-MMP expression promotes tumor growth and angiogenesis through an up-regulation of vascular endothelial growth factor expression. FASEB J 2002 Apr ; 16 (6): 555-64
【非特許文献２８】Lin EY, Nguyen AV, Russell RG, Pollard JW. Colony-stimulating factor 1 promotes progression of mammary tumors to malignancy. J Exp Med 2001 Mar 19; 193 (6): 727-40
【非特許文献２９】Pederson L, Winding B, Foged NT, Spelsberg TC, Oursler MJ. Identification of breast cancer cell line-derived paracrine factors that stimulate osteoclast activity. Cancer Res 1999 Nov 15; 59 (22): 5849-55
【非特許文献３０】Kelly Carles-Kinch, Katherine E. Kilpatrick, Jane C. Stewart and Michael S. Kinch. Antibody Targeting of the EphA2 Tyrosine Kinase Inhibits Malignant Cell Behavior. Cancer Research 62,2840-2847, May 15,2002
【非特許文献３１】Bange J., Prechtl D. , Cheburkin Y. , Specht K. , Harbeck N. , Schmitt M. , Knyazeva T., Muller S. , Gartner S., Sures I., Wang H., Imyanitov E. , Haring HU, Knyazev P., Iacobelli S. , Hofler H. , Ullrich A. Cancer progression and tumor cell motility are associated with the FGFR4 Arg (388) allele. Cancer Res. 2002, Feb. 1,62 (3), 840-7
【非特許文献３２】Yanagita M., Arai H., Ishii K., Nakano T. , Ohashi K, Mizuno K, Varnum B., Fukatsu A. , Doi T. , Kita T. Gas6 regulates mesangial cell proliferation through AXL in experimental glomerulonephritis. Am. J. Pathol, 2001 Apr. , 158 (4), 1423-32
【非特許文献３３】Attar E. C, Fridell Y. C, Xu L., Jin Y. , Maia D. M., Schell M. J. , and Liu E. T. AXL receptor tyrosine kinase expression in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, (Oct., 1997) Vol. 46, No. 1, pp. 91
【非特許文献３４】Dodge Zantek N. , Walker-Daniels J. , Stewart J. , Hansen R., Robinson D. , Miao H. , Wang B., Kung H-J. , Bissell M. J. and Kinch M. MCF-10A-neoSt : A New Cell System for Studying Cell-ECM and Cell-Cell Interactions in Breast Cancer. Clinical Research, Vol. 7, 3640-3548, November 2001
【非特許文献３５】Vajkoczy, P., Goldbrunner, R. , Farhadi, M. , Vince, G., Schilling, L. , Tonn, J. C. , Schmiedek, P. , and Menger, M. D. Glioma cell migration is associated with glioma-induced angiogenesis in vivo, Int J Dev Neurosci. 17: 557-63,1999
【非特許文献３６】Sasaki, T., Knyazev, P. G. , Cheburkin, Y. , Gohring, W. , Tisi, D., Ullrich, A. , Timpl, R. , and Ho-henester, E. Crystal structure of a C- terminal fragment of growth arrest-specific protein Gas6. Receptor tyrosine kinase activation by laminin G-like domains, J Biol Chem. 277: 44164-70., 2002
【非特許文献３７】Vajkoczy, P. , Schilling, L. , Ullrich, A. , Schmiedek, P. , and Menger, M. D. Characterization of angiogenesis and microcirculation of high- grade glioma : an intravital multifluorescence micro-scopic approach in the athymic nude mouse, J Cereb Blood Flow Metab. 18: 510-520,1998
【非特許文献３８】Vajkoczy, P. , Farhadi, M., Gaumann, A. , Heidenreich, R., Erber, R., Wunder, A., Tonn, J. C., Menger, M. D. , and Breier, G. Microtumor growth initiates angiogenic sprouting with simultane-ous expression of VEGF, VEGF receptor-2, and angiopoietin-2, J Clin Invest. 109: 777-85., 2002
【非特許文献３９】Read, T. A. , Farhadi, M., Bjerkvig, R., Olsen, B. R. , Rokstad, A. M., Huszthy, P. C. , and Vajko-czy, P. Intravital microscopy reveals novel antivascular and antitumor effects of endostatin deliv-ered locally by alginate-encapsulated cells, Cancer Res. 61: 6830-7., 2001
【非特許文献４０】Bjerkvig, R. , Laerum, O. D. , and Mella, 0. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggre-gates in vitro and with brain tissue in vivo, Cancer Res. 46: 4071-9., 1986
【非特許文献４１】Stitt, T. N. , Conn, G. , Gore, M. , Lai, C. , Bruno, J. , Radziejewski, C., Mattsson, K. , Fisher, J. , Gies, D. R. , Jones, P. F. , and et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases, Cell. 80: 661-70., 1995
【非特許文献４２】Fridell, Y. W., Villa, J. , Jr. , Attar, E. C. , and Liu, E. T. GAS6 induces Axl-mediated chemotaxis of vascular smooth muscle cells, J Biol Chem. 273: 7123-6., 1998
【非特許文献４３】Bellosta, P. , Costa, M. , Lin, D. A. , and Basilico, C. The receptor tyrosine kinase ARK mediates cell aggregation by homophilic binding, Mol Cell Biol. 15: 614-25., 1995
【非特許文献４４】Millauer B, Shawver LK, Plate KH, Risau W, Ullrich A (1994) Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. Nature (Lond. ) 367: 576-579
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的の一つは、浸潤度及び／又は攻撃性用の新しいマーカーを確認するために、悪性疾患、特に乳癌及び脳癌における遺伝子、特にプロテインキナーゼ、ホスファターゼ及びその他のシグナリング遺伝子から選択した遺伝子の発現プロファイルを確立することであった。ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアレイを７つの高浸潤性、１４の弱浸潤性乳癌細胞系及び３つの正常乳房上皮細胞系の遺伝子発現プロファイルを分析するために使用した。弱浸潤性と高浸潤性乳癌細胞系の間の遺伝子発現の差異を確認したが、これにより乳癌細胞系の浸潤度と相関する遺伝子クラスターの定義が可能となる。このクラスター又はそれからの遺伝子の組合せを使用することによって、高浸潤性乳癌細胞系を弱浸潤性乳癌細胞系及び正常乳房上皮細胞系から識別することができる。
【０００５】
更に、悪性神経膠腫の生物学に関与する新規受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を同定するために、ヒト神経膠腫細胞系におけるＲＴＫ発現プロファイルをｃＤＮＡマイクロアレイ法により判定した。ＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲ−αの他に受容体ＵＦＯ／ＡＸＬが最も顕著に発現したＲＴＫの一つであった。試験した９中７のヒト神経膠腫細胞系で、ＵＦＯ／ＡＸＬｍＲＮＡがＥＧＦＲ用のｍＲＮＡより高い発現レベルを有した（第４表）。ＵＦＯ／ＡＸＬの優性阻害型突然変異形を過剰発現させることによるＵＦＯ／ＡＸＬシグナル形質導入の抑制は、ＵＦＯ／ＡＸＬ野生型形を過剰発現させる細胞と比較すると、マウスで腫瘍進行を抑制し、生存を延ばした。ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの機序及びその神経膠腫増殖における役割を調べるために、腫瘍細胞形態学及び腫瘍細胞挙動を増殖、凝集能、遊走性及び浸潤性に関して試験管内で評価した。更に、腫瘍細胞挙動、腫瘍起因性血管形成及び腫瘍還流を生体内で生体内多蛍光顕微鏡法により分析した。この試験により、ＵＦＯ／ＡＸＬの新しい役割、即ち、神経膠腫細胞間相互作用、神経膠腫細胞遊走及び神経膠腫浸潤を媒介する役割が示される。ＵＦＯ／ＡＸＬは、悪性脳腫瘍の瀰漫性−浸潤性、局所転移性増殖を媒介に寄与しうる最初のＲＴＫである。
【０００６】
従って、本発明の最初の態様は、ＡＸＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７６１２５）、ＧＡＳ６（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｌ１３７２０）、ＭＭＰ１４（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４９９５）、ＡＤＡＭ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ０２３４７６）、ＡＤＡＭ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ６９６１１）、ＭＴ３ＭＭＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００５９６１）、ＦＧＦ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００２００６）、ＦＧＦ５（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４４６４）、ＦＹＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１４３３３）、ＬＹＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１６０３８）、ＤＤＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ７４７６４）、ＴＩＭＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００３２５４）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００１９４５）、ＳＧＫ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｙ１００３２）、ＲＰＳ６ＲＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ６０７２４）、ＭＡＰ４Ｋ４（Ｇｅｎｂａｎｋ ＸＭ０３８７４８）、ＳＩＲＰα（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｙ１０３７５）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄ０００１７）から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することから成る悪性疾患の浸潤度の判定法に関する。更に、遺伝子Ｓｔａｔ ５ｂ（Ａｃｃ．ＮＭ０１２４８８）又はＥＤＧ２（Ａｃｃ．ＮＭ０５７１５９）の発現は、場合により前記の１種以上の遺伝子の発現を測定することに加えて、悪性疾患の浸潤度用の指標として測定することができる。前記遺伝子の少なくとも１種の高い発現は高い浸潤度と相関すると判明した。
【０００７】
更に本発明では、高い浸潤度は前記遺伝子の少なくとも２種、特にＡＸＬ及び１種以上のその他の遺伝子の高い発現と相関すると判明した。１種以上のその他の遺伝子は、前記遺伝子から選択してもよいし、浸潤性用のマーカーとして既に公知である遺伝子から選択してもよい。
【０００８】
従って、方法は有利には、幾つかの前記遺伝子の発現の測定、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７又は８種の遺伝子の発現の測定から成る。更に有利には、方法は少なくともＡＸＬ／ＵＦＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７６１２５）の発現の測定から成る。更に方法は、浸潤性のマーカーとして既に公知である少なくとも１種のその他の遺伝子、例えばＣＤ４４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ６６７３３）、ビメンチン（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ５６１３４）、Ｃａｖ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ１８９５１）、ＣＡＶ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ０３５７２）、ＭＭＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１３５０９）、ＭＭＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４５３０）、ＭＭＰ９（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４９９４）、Ｍ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ３７４３５）及びＥＰＨＡ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５９３７１）の発現を測定することから成ってよい。
【０００９】
前記遺伝子クラスター及び特にＡＸＬ遺伝子と浸潤度の間の相関は、幾つかの種類の悪性疾患、例えば乳癌、特に原発性乳癌、前立腺癌、腎臓癌及び神経膠芽腫又はその他の上皮起源の癌で認められた。１種以上の前記マーカー遺伝子の発現及び特にＡＸＬ遺伝子の発現と神経膠芽腫の浸潤度との間に相関が存在するという発見は特に興味深い。
【００１０】
更に、ＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体の安定過剰発現が、細胞浸潤性及び遊走を強力に抑制することができ、ＡＸＬ機能の抑制が高浸潤性悪性疾患、例えば乳癌又は脳癌、例えば神経膠芽腫で転移生成を抑制し、減少させることを示すことを見出した。ＡＸＬの細胞外部分に対するポリクローナル抗体は、癌細胞、例えば乳癌又は前立腺癌細胞系の遊走及び浸潤度に対して非常に強力な抑制活性を有する。更に、弱浸潤性乳癌、前立腺癌細胞系及び神経膠腫細胞における野生型ＡＸＬの過剰発現はそれらの浸潤度を増加させた。
【００１１】
これらのデータは、ＡＸＬ遺伝子及びタンパク質が、悪性疾患の予防又は治療用の、特に悪性疾患における腫瘍浸潤性及び／又は転移形成を抑制するための、有望な新しい標的であることを示す。
【００１２】
従って、本発明のもう一つの態様は、ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子又はタンパク質又はそのリガンドを抑制することから成る悪性疾患の浸潤度を減少させる方法に関する。この方法は、（ｉ）ＡＸＬタンパク質の受容体チロシンキナーゼ活性を抑制し、（ｉｉ）ＡＸＬ遺伝子の発現を抑制し、（ｉｉｉ）ＡＸＬタンパク質及びそのリガンド、特にＧＡＳ６間の相互作用を抑制し、かつ／又は（ｉｖ）ＡＸＬと下流シグナル伝達因子の相互作用を抑制することから成ってよい。
【００１３】
ＡＸＬタンパク質リガンドに関して、特にＧＡＳ６のラミニンＧ様ドメイン（ＧＡＳ６−ＬＧ）が、ＡＸＬ結合及び活性化のようなＡＸＬタンパク質との相互作用に関与すると判明した（参照３６）。特にＧＡＳ−ＬＧ２ドメインの残基、例えばＬｅｕ６２０、Ｔｙｒ６６０及びＰｈｅ４８７がＡＸＬ結合及び／又は活性化に影響を与える。本発明の詳細な実施態様によれば、悪性疾患の浸潤度を減らす方法は、１種以上のＧＡＳ６−ＬＧの残基、特にＬｅｕ６２０、Ｔｙｒ６６０及び／又はＰｈｅ４８７の抑制から成る。
【００１４】
本発明は、悪性疾患の診断又は予防及び／又は治療に関し、特に悪性疾患における腫瘍浸潤度及び／又は転移生成に関する。悪性疾患の有利な例は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌及び神経膠芽腫である。更に特には悪性疾患は、乳癌又は神経膠芽腫である。
【００１５】
本発明の診断の実施態様では、浸潤性関与遺伝子の発現を定量的及び／又は定性的に測定する。発現は、例えばヒト腫瘍患者からの悪性細胞から成る試料で測定する。試料は、組織切片標本、生検試料など又は体液からのものであってよい。試験すべき試料の遺伝子発現を、例えば"正常"細胞又は弱浸潤性の悪性細胞からの陰性の対照試料及び／又は例えば高浸潤性悪性細胞からの陽性対照の対照試料における遺伝子発現と比較することができる。
【００１６】
遺伝子発現は例えばｍＲＮＡ又は転写物レベル及び／又はタンパク質レベルで公知方法により測定することができる。
【００１７】
ｍＲＮＡレベルの遺伝子発現の測定は、逆転写及び／又は増幅反応、例えばＰＣＲから成ってよい。有利には、遺伝子発現を核酸アレイで測定するが、その際試験すべき試料からの核酸、例えばＲＮＡ又はｃＤＮＡを試験すべき核酸に特異的な固定化プローブのアレイにハイブリッドさせる。好適な核酸アレイの有利な例は、ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１０７３に記載されている。代わりに、遺伝子発現をその他の方法、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーションにより測定することができる。
【００１８】
タンパク質レベルの遺伝子発現は、浸潤度関与遺伝子によりコードされたタンパク質に対する抗体を使用する免疫学的方法により測定することができる。抗体は、公知標識基、例えば当業者に公知であるような、放射性、蛍光、化学発光又は酵素基により直接又は間接的に標識付けされていてよい。
【００１９】
本発明の治療の実施態様は、特にＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンドの阻害剤をそれを必要とする被験者に悪性疾患の浸潤度の減少に効果的な量で投与することから成る方法に関する。被験者は有利には哺乳類、更に有利にはヒトである。ＡＸＬタンパク質のリガンドは有利にはＧＡＳ６、特に前記したようなＧＡＳＧ−ＬＧの残基である。
【００２０】
ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド、例えばＧＡＳ６の阻害剤は、抗体、生物学的活性核酸又は低分子量化合物、例えばペプチド又は非ペプチド有機化合物であってよい。
【００２１】
有利な態様では、阻害剤は、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド、例えばＧＡＳ６に対する抗体である。用語"抗体"とは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、特にキメラ又はヒト化モノクローナル抗体又はヒト抗体である。更に、この用語は抗体フラグメント、例えばタンパク質分解フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）２フラグメント又は組換えフラグメント、例えば単鎖抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメントから成る。前記の抗体又は抗体フラグメントの製造法は当業者に公知である。
【００２２】
更に有利な態様では、阻害剤は、生物学的活性核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成核酸類似物である。生物学的活性核酸の有利な例は、ＡＸＬ遺伝子又はＡＸＬリガンド遺伝子又はその転写物に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子である。更に有利な生物学的活性核酸の例は、ＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である。生物学的活性核酸は公知方法により、例えばウィルス性又は非ウィルス性遺伝子導入ベクターを使用することによって得られる。
【００２３】
更に有利な態様では、阻害剤はペプチド化合物、例えばアミノ酸４〜２５個の長さを有するペプチド、環状ペプチド、ペプチド誘導体又はこのようなペプチドから誘導されるペプチド模擬物である。代わりに、低分子量阻害剤は非ペプチド有機化合物、例えばＡＸＬキナーゼ活性の阻害剤であってよい。低分子量の阻害剤は、下記に更に詳説する方法で好適な化合物ライブラリーのスクリーニングにより得られる。
【００２４】
更に本発明のもう一つの態様は、薬理学的活性希釈剤、キャリア及び／又はアジュバントと一緒に、活性剤としてＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド（例えばＧＡＳ６、特に前記したようなＧＡＳ６−ＬＧからの残基）の阻害剤から成る医薬組成物に関する。この組成物は特に悪性疾患の浸潤度を減らしかつ／又は悪性疾患で転移生成を減少させるために好適である。活性剤として使用される阻害剤の種類に応じて、医薬組成物は液体、固体、例えば粉末、錠剤など、乳濁液又は懸濁液であってよい。組成物は、注入、経口、局所、直腸、鼻腔内又はその他の好適な方法により投与することができる。組成物中の活性剤の有効量は、化合物の種類及び治療すべき疾患に応じて過度の負担なしに当業者により決定することができる。
【００２５】
組成物は少なくとも１種のその他の活性剤から成ってよい。この少なくとも１種のその他の活性剤は、ＡＸＬ阻害剤と一緒に単一組成物中に処方することもできるし、ＡＸＬ阻害剤組成物と同時投与される別々の組成物中に処方することもできる。その他の活性剤は、細胞毒性又は細胞増殖抑制剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、抗腫瘍抗体又はその任意の組合せであってよい。
【００２６】
本発明のもう一つの態様は、少なくとも試験化合物がＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド（例えば前記したようなＧＡＳ６）又はタンパク質を抑制することができるかを判定することから成る悪性疾患の浸潤性の阻害剤の確認及び／又は特性付けの方法に関する。更に詳細には、方法は試験化合物がＡＸＬタンパク質と結合することができるか及び／又はＡＸＬ遺伝子発現を減少させることができるか判定することから成る。試験化合物は、化合物ライブラリー、例えばペプチド又は非ペプイドライブラリーから誘導することができ、これをＡＸＬ阻害活性に関してスクリーニングにかける。スクリーニング法は、細胞系アッセイシステム、例えばＡＸＬ遺伝子を過剰発現することができる細胞を使用するシステムの使用から成ってよい。付加的にか又は代わりに、方法は無細胞系アッセイシステムの使用から成ってもよく、その際、試験化合物のタンパク質又はそのフラグメントとの結合を判定するために、試験化合物を実質的に精製したＡＸＬタンパク質又はそのフラグメントと接触させる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、マトリゲル−マトリックスで培養した正常及び乳癌（ＢＣ）細胞系の形態学（３Ｄ伸展）を表す図である
【図２】図２は、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる乳癌細胞系の分類を表す図である
【図３Ａ】図３Ａは、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類を表す図である
【図３Ｂ】図３Ｂは、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類を表す図である
【図４】図４は、選択した識別性に発現したＡＸＬ／ＧＡＳ遺伝子のノーザンブロット分析図である
【図５Ａ】図５Ａは、マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学を表す図である
【図５Ｂ】図５Ｂは、マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学を表す図である
【図６Ａ】図６Ａは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用を表す図である
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用を表す図である
【図８】図８は、ウェスタンブロット分析の図である
【図９】図９において、Ａは、ＳＦ１２６細胞クローンに関する腫瘍容量の分析補足データを表す図である。Ｂは、生体内多蛍光ビデオ顕微鏡法による図である。Ｃは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍の組織形態学像である。Ｄは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍の組織形態学像である。Ｅは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍の組織形態学像である。Ｆは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍の組織形態学像である。Ｇは、蛍光顕微鏡図である。Ｈは、蛍光及び位相差顕微鏡による図である
【図１０】図１０において、Ａは、ＳＦ１２６細胞クローンのＭＴＴ増殖アッセイを表す図である。Ｂ及びＣは、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローンによる多細胞凝集体形成図である。Ｄは、ＳＦ１２６細胞クローンの遊走性の図である。Ｅ及びＦは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍細胞スフェロイド（Ｅ）又はＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイド（Ｆ）の４８時間対比による腫瘍細胞浸潤の分析図である
【図１１】図１１において、Ａは、脳中にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の定位移植後の成長したヌードマウスの生存曲線である。ＢからＥは隣接脳組織中への瀰漫性腫瘍細胞浸潤を示す図である
【００２８】
更に本発明を下記図及び実施例につき詳説する。
【００２９】
第１図：マトリゲル−マトリックスで培養した正常及び乳癌（ＢＣ）細胞系の形態学（３Ｄ伸展）。
【００３０】
細胞をマトリゲル層上で７〜１４日間培養した。３つの基本的形態学を表す写真は指示したＢＣ細胞系を表す。倍率は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＣＦ１０Ａに関しては×１００であった。マトリゲル上の細胞増殖の形態学測定は前記したようにして実施した（１０、１１、１２）。簡単には、培地５０μｌ中に再懸濁させた細胞（細胞５０００個／９６ウェルプレートのウェル）を−ＲＰＭＡ基礎培地塩中６ｍｇ／ｍｌに希釈したマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）７０μｌから成る前もって調整したマトリゲルコーチング上で培養した。その上で重合後、マトリゲル（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えた。コロニー伸展を実験の間中モニターし、ＯｐｅｎＬａｂ（ＵＫ）デジタルカメラを装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ３５顕微鏡を用いて７〜１４日目に撮影した。各細胞系の名前を示す。
【００３１】
第２図：公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる乳癌細胞系の分類。弱浸潤性対高浸潤性ＢＣ細胞系における通常の遺伝子発現変化（クラスターＡＸＬ）。
遺伝子発現を"材料及び方法"で記載したように、各々指示した細胞系からのＲＮＡのｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション（２部の標本）により測定した。２２種の選択した遺伝子は少なくとも７５％の弱浸潤性ＢＣ細胞系、高浸潤性ＢＣ細胞系（赤及び緑バー）又は両方とも２倍より大きい中央倍率変化で、識別性に発現した。ＭＣＦ１０Ａに関する遺伝子発現のレベルを、クラスターの下部キー中に示した色及びシャドウで表す。各色調は、尺度の下の数により挟まれた範囲の全ての値を包含する。ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ（第３表参照）及び各遺伝子の説明並びに自作アレイ膜上のスポット場所も得られる（遺伝子の別の第２及び３表参照）。確認試験は、アレイと同じＲＮＡ標本を用いて、ノーザン（ＡＸＬ及びＧＡＳ６）又はＲＴ−ＰＣＲ分析（ＨＥＲ２発現及び増幅に関してはＲｏｃｈｅ ｓｙｓｔｅｍ、未記載）により行った。他に記載のない限り、アレイとその他の方法間の一致は、大多数の試料に相関して、２倍以内であった：少なくとも１０倍の、その他の方法論による倍率変化を過小評価するアレイの定性的一致。浸潤性及び弱浸潤性細胞系の位置はカラーバーにより示した。
【００３２】
第３Ａ、Ｂ図：公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類。
遺伝子発現を"材料及び方法"で記載したように、指示した各細胞系及び原発性腫瘍からのＲＮＡのｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション（二部の標本）により測定した。２６種の選択遺伝子は少なくとも７５％の弱浸潤性ＢＣ細胞系、高浸潤性ＢＣ細胞系（赤及び緑バー）又は両方とも２倍より大きい中央倍率変化で、特異的に発現した。正常な乳房組織（２つの混合）に関する遺伝子発現レベルは、クラスターの下部キー中に示した色及びシャドウで表す。各色調は、尺度の下の数により挟まれた範囲の全ての値を包含する。ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ（第３表参照）及び各遺伝子の説明並びに自作アレイ膜上のスポット位置も得られる。確認試験は、アレイで使用したと同じＲＮＡ標本を用いて、ノーザン（ＡＸＬ及びＧＡＳ６、原発性腫瘍に関しては未記載）又はＲＴ−ＰＣＲ分析（ＨＥＲ２発現及び増幅に関してのみＲｏｃｈｅ ｓｙｓｔｅｍ、未記載）により行った。他に記載のない限り、アレイとその他の方法間の一致は、大多数の試料に相関して、２倍以内であった；少なくとも１０倍の、その他の方法論による倍率変化を過小評価するアレイの定性的一致。
【００３３】
Ａ．正常乳房組織、原発性腫瘍、正常乳房及び癌細胞系の教師なしアレイ分析。ＡＸＬクラスターは１８種の遺伝子を包含し（発現相関は０．５１又は有意）、これらの遺伝子の大部分は乳癌細胞系で確認された（第２図参照）。
【００３４】
Ｂ．コンセンサス浸潤性遺伝子のみを使用する原発性腫瘍及び乳癌細胞系の分類。全ての原発性腫瘍及びＢＣ細胞系を２６種の遺伝子（ＡＸＬクラスターに属す）を使用してクラスター分析した。原発性腫瘍及びＢＣ細胞系は識別され、高浸潤性（ＨＩ）ＢＣ細胞系は同じツリーに属す（赤いバーで示したＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び原発性腫瘍ＢＣ１５１を除く）。
【００３５】
第４図：選択した識別性に発現したＡＸＬ／ＧＡＳ遺伝子のノーザンブロット分析
指示した各細胞系から単離したｍＲＮＡ（１５μｇ／レーン）をｃＤＮＡアレイ上にデポジットしたフラグメントに相応するプローブを用いるハイブリダイゼーションによって指名遺伝子の発現に関して分析した。Ａｃ７４５（正常乳房上皮細胞）に相応する各ｍＲＮＡに関する発現レベルを各帯の下に記録する。主特異的帯に相応する大きさ（右）は各ｍＲＮＡに関して文献で報告されたものと一致する。同じフィルターを用いてプローブし、これらの分析用にプローブした。パネル：Ａ−発現ＡＸＬ、Ｂ−ＧＡＳ及びＣ−β−アクチンｍＲＮＡ。β−アクチンのレベルを代表的フィルター用の試料荷重用の対照として表す。ｍＲＮＡは２種の別々に増殖した細胞培養基から調製し、指示遺伝子の発現レベルに関して試験した。
【００３６】
第５Ａ及びＢ：マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学。
細胞はマトリゲル層上で７〜１４日間培養した。
Ａ．３つの基本的形態学を表す写真は指示したＢＣ細胞系を表す。Ｂ．傷アッセイ（Ｗｏｕｎｄ ａｓｓａｙ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓｍｏｃｋ及びｄｎＡＸＬ突然変異体クローン２に関して表す。位置及び処理は図に記載する。倍率は×１００であった。
【００３７】
第６Ａ、Ｂ及びＣ図：抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動。
Ａ．細胞はマトリゲル層上で７〜１４日間培養した（第１図の説明参照）。処理しなかったか又は指示したように抗体によって処理した。
【００３８】
Ｂ．指示したＢＣ細胞系の浸潤性活性を、"材料及び方法"に記載した方法により、マトリゲル（３〜４ｍｇ／ｍｌ）塗布したフィルターを透過した細胞数を数えることによってＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中で測定した。データは３点を有する少なくとも２個の個々の実験からの平均である。エラーバー。
【００３９】
Ｃ．遊走能は、浸潤性分析と同じ条件下でマトリゲルなしのフィルターを用いて平行なｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ中で分析した。結果は、三点を有する少なくとも２個の実験の平均である（エラーバー）。細胞遊走もＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中でマトリゲルバリアーの不在下で評価した。予想通り、細胞系ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５Ｓ及びＢＴ５４９は弱浸潤性細胞系ＭＣＦ７より運動性がかなり高い（未記載）。
【００４０】
第７図：ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用
Ａ．ＡＸＬ ｗｔ感染及び強制過剰発現の形態学的作用。ＭＣＦ７細胞におけるＡＸＬ ｗｔの過剰発現は、緊密な丸石形細胞から多数の突出拡張部を有する不規則形細胞への変化を生じる。
【００４１】
Ｂ．細胞浸潤に対するＡＸＬ ｗｔ感染の作用を前記したようにＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒアッセイで分析した（材料及び方法参照）。クローンＭＣＦ７−ＡＸＬ ｗｔは空のベクター感染細胞より浸潤性が３０倍であった。
【００４２】
合計２００００個の細胞をＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ上に３６〜４８時間播いた（フィルター孔８μｍ、濃度３〜４ｍｇ／ｍｌでマトリゲルマトリクッスで覆った）。Ａ ＸＬ ｗｔで感染させた細胞は空ベクター対照又はｄｎＡＸＬ突然変異体形より遙かに早く浸潤する。
【００４３】
第８図．
Ａ．対照ベクターを発現するＳＦ１２６神経膠腫細胞クローン（ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ）、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ）及びＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ）のウェスタンブロット分析。血清−減少細胞を処理しないまま（−）か又は２００μｇ／ｍｌＧａｓ６で処理した（＋）。溶解物を抗ホスホチロシン血清（上部パネル）又はヒトＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインに対する抗体（下の列）でブロットした。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞と比較して、分析により、各々ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞で増加（約３０％）及び全廃のＧａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬ媒介シグナリングが実証された。Ｂ〜Ｄ。ＳＦ１２６細胞（Ｂ）におけるＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形の発現は、ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２５−ＵＦＯ−ＷＴ細胞（Ｂ及びＣ）に比べた場合に、それらの形態学を変化させた。
【００４４】
第９図．
Ａ．ＳＦ１２６細胞クローンに関する腫瘍容量の分析。腫瘍細胞をヌードマウス（ｎ＝４群当たりの動物）中に皮下に移植し、１４日間追跡した。平均±ＳＥＭ値を表す。＊ｐ＜０．０５対ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞。Ｂ．生体内多蛍光ビデオ顕微鏡法により評価した、ＳＦ１２６細胞クローンをヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ中に移植後の腫瘍面積の定量的分析（左パネル）及び機能性血管密度（右パネル）（ｎ＝４、群当たりの動物）。平均±ＳＤ値を表す。統計分析をＡＮＯＶＡ、次いで適切な事後検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）により群間の個別比較を実施した；＊ｐ＜０．０５対ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞。Ｃ及びＤ．腫瘍容量の差異を示すＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍（Ｃ）及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍（Ｄ）の代表的組織形態学像。バーは１ｍｍを表す。Ｈ＆Ｅ染色。Ｅ及びＦ．腫瘍浸潤の差異を示すＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍（Ｅ）及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍（Ｆ）の代表的組織形態学像。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍は、隣接皮膚筋肉及び皮下組織を広範囲に浸潤した（Ｅ）（矢印は破壊された筋肉層の残遺物を示す）が、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞浸潤はほぼ完全に抑制された（Ｆ）。（Ｆ）中で筋肉層の構造は保持された。バーは１００μｍを表す。Ｈ＆Ｅ染色。Ｈ及びＩ．蛍光顕微鏡を単独（Ｇ）及び位相差と組み合わせて（Ｈ）、隣接組織層中へのＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞の浸潤の不在を確認。腫瘍細胞は移植の前にＤｉｌで標識付けした。バーは１００μｍを表す。全試料は、ヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ中へ移植後２１日目に摘出した。ｔ、腫瘍塊；ｍ、皮膚筋肉層；ｓｃ、皮下組織。ＳＦ１２６−ｍｏｃ、対照；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型を発現する細胞；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ、ＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形を発現する細胞。
【００４５】
第１０図．
Ａ．ＳＦ１２６細胞クローンのＭＴＴ増殖アッセイ。Ｇａｓ６（２００μｇ／ｍｌ）の不在及び存在下。細胞は左未処理（−Ｇａｓ６）又は２００μｇ／ｍｌのＧａｓ６で処理した（＋Ｇａｓ６）。分析は培養４８時間後に実施した。増殖率は刺激しなかったＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞に関して表す。平均値を表す。Ｂ及びＣ．ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制に付随する変化のない凝集能を実証するＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローンによる多細胞凝集体形成。Ｄ．７日間の観察期間中のＳＦ１２６細胞クローンの遊走性。遊走面積を画像分析システムを用いて面積測定法により分析した。平均±ＳＤ値を表す。統計分析は、ＡＮＯＶＡ、次いで対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。＊ｐ＜０，０５対ＳＦ１２６−ｍｏｃ。Ｅ及びＦ。胎児ラット脳凝集体を用いるＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍細胞スフェロイド（Ｅ）又はＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイド（Ｆ）の４８時間対比による腫瘍細胞浸潤の分析。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイドと脳細胞凝集体の間の輪郭の鮮明な境界は、ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制による浸潤性の欠如を示す。Ｂ，脳細胞凝集体；Ｓ、腫瘍スフェロイド、ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ、対照；ＳＦ−１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型を発現する細胞；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ、ＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異形を発現する細胞。
【００４６】
第１１図．
Ａ．脳中にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の定位移植後の成長したヌードマウスの生存曲線（ｎ＝４、群当たりの動物）。神経欠損を発現するか又は最初の体重の＞３０％減少したら直ちに動物を殺した。Ｂ〜Ｅ．隣接脳組織中への瀰漫性腫瘍細胞浸潤を示す、脳中への移植後のＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍の組織形態学（Ｂ）。腫瘍細胞は、血管周囲間隙（Ｃ）、白質路に添って（Ｄ）及び心室系の壁に添って（Ｅ）浸潤した。Ｈ＆Ｅ染色、バーは１００μｍを表す。
【実施例】
【００４７】
Ａ．乳癌及び前立腺癌試験
１．材料及び方法
１．１．腫瘍試料及び細胞系
乳癌（ＢＣ）及びその他の腫瘍の種類及び大きさに関する選択の偏向を排除するために、試験すべきＲＮＡは任意抽出試料から調製した。原発性浸潤性乳癌の試料は手術を受ける患者７２人から集めた。外科切除後、腫瘍をマクロ解剖し：切片を病理学的診断用に取り出し、隣接片をｍＲＮＡ抽出用の液体窒素中で素早く凍結させた。診断時の患者の平均年齢は５５才（２９〜８１才の範囲）であり、大多数は閉経後であった。腫瘍は、乳癌のＷＨＯ組織学的分類法により分類した：管癌、小葉癌、管小葉混合癌及び髄様癌。正常乳房ｍＲＮＡから得てプールした"正常"ｃＤＮＡを対照及び標準化用に使用した。前記"正常"ｃＤＮＡ中のプロテインキナーゼ（ＰＫ）及びホスファターゼ（ＰＰ）の発現プロファイルを別々に評価した。本試験に２１種のＢＣ及び３種の正常乳房上皮細胞系を含めた。乳癌細胞系の供給源は下記の通りであった：ＢＴ−２０，ＢＴ−４７４、ＢＴ−４８３、ＢＴ−４５９、Ｄｕ−４４７５、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、−１５７、−１７５、−３６１、−４３６、−４５３、−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３及びＺＲ−７５−１、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−３０はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ＭＣＦ−７、クローン及びＢＣ細胞系ＤＡＬはＳＵＧＥＮ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。ＨＢＬ−１００細胞系はＡＴＣＣからのものであった。この細胞系は正常組織からのものであったが、縦列統合ＳＶ−４０配列を有する（９）。培養はグルタミン６ｍＭ、ヒトインシュリン１０μｇ／ｍｌ及び１０％の胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＣＳＬ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、オーストラリア）中で対数増殖で維持した。正常乳房上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ１０Ｔ−２４及びＭＣＦ１０ｎｅｏはＤｒ．Ｍ．Ｇｉｌｌｅｓ（Ａｒｉｚｏｎａ Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ）から得た。Ａｃ７４５はＤｒ．Ｂ．Ｓｔａｍｐｆｅｒから入手し、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、インシュリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、コレラ毒素、ビタミン及び抗生物質のコンディション培地を補充したＤＭＥＭ Ｆ１２培地で増殖させた。
【００４８】
細胞はマイコプラズマ汚染してなかった。
【００４９】
１．２．ＲＮＡ及びＤＮＡの単離及び分別
全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡをグアニジニウムイソチオシアネート溶液（ＧＴＳ緩衝剤：４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．５％サルコシル及び０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）中で溶解、次いでフェノール−クロロホルム抽出により同じ細胞ペレットから単離した。全ＲＮＡを修正を加えた標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋその他［１９８９］）を用いて単離した。ＤＮＡを集め、同じ容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出した。ＲＮＡ及びＤＮＡを各細胞系から最小３つの別々の場合で単離した。
【００５０】
全及びｍＲＮＡインテグリティ及びｃＤＮＡ複合体を、特異的プローブを用いてアガロースゲル電気泳動法及びノーザンブロットによりコントロールした。ｍＲＮＡ抽出をＯｌｉｇｏ Ｔｅｘ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて行った。細胞ペレットを溶解／結合緩衝剤中に再懸濁させ、簡単にボルテックス混合し、２１Ｇニードルを３回通し、スピンライセイトカラムに入れ、１３０００ｇで３分間遠心分離した。次いで溶解物をＯｌｉｇｏ−ｄＴセルロース（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）と静かに攪拌し、前もって湿らせたＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｕａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に入れた。ｍＲＮＡを前もって温めた（６５℃）溶離緩衝剤で溶離する前に、カラムを溶解／結合緩衝剤で３回洗浄し、洗浄緩衝剤で４回洗浄した。ｍＲＮＡの量をＯＤ２６０を用いて測定した。
【００５１】
１．３．ｃＤＮＡアレイ標本
ＰＫ及びＰＰ遺伝子発現をナイロンフィルターアレイ上で放射性標的を用いてハイブリダイゼーションにより分析した（ｃＤＮＡ）。アレイはキナーゼ、ホスファターゼ及びその他のシグナリングプロテインをコードする６４５種の遺伝子：リガンド、アダプター、転写因子、メタロプロテイナーゼ／ＡＤＡＭ、アポトーシス関与遺伝子及び１１種のハウスキーピング遺伝子を含有した（リストはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ 又は ｕｌｌｒｉｃｈ＠ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅで得られる）。これらのアイデンティティーをプラスミドＤＮＡのシークエンス法により実証し、ＧｅｎＢａｎｋ配列情報と比較した。ＰＫ及びＰＰのアイデンティティーはナイロンフィルター上に、１個又は２部、スポットされた全クローンに関して合致した。標準化目的用に、ＧＦＰ遺伝をゲノム及びベクターＤＮＡと同様に２回スポットした。プラスミドの精製はプラスミド精製キッット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて行った。
【００５２】
１．４．ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
フィルターを先ず０．５％ＳＤＳ中で攪拌しながら５分間予備洗浄した。プレハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌ中には、酵母ｔＲＮＡが含まれていた。ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ（ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ法）をハイブリダイゼーション工程で使用したが、これはＲｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ（Ｈｙｂａｉｄ Ｉｎｃ．）中で１６時間回転炉中で６５℃で行った。標識付けしたプローブを１００℃で１０分間変性し、次いで直ちにハイブリダイゼーション混合物中に入れ、これを更に１８時間６５℃で培養した。１８時間後、ハイブリダイゼーション混合物を捨て、アレイを２塩化ナトリウム：クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝剤、０．２％ＳＤＳ中で４２℃で２０分間連続的に回転させながらインキュベーター中で２回洗浄した。３回めの洗浄をプラスチック箱中で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５〜６０分間６５℃で水平に振りながら行った。３回目の洗浄後、フィルターを湿らせた１枚のＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ上に載せ、サランラップで覆った。次いでアレイをＰｈｏｔｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｃｒｅｅｎを有するｉｍａｇｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｆｕｊｉ、日本）に入れ、２日間露光した。
【００５３】
１．５．画像取得及び分析
露光した蛍光画像記憶スクリーンをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｆｕｊｉ）で解像度５０ミクロンでスキャンし、ＭａｃＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ）を用いて視覚化した。画像をソフトウェアプロトコルにより分析するためにＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ Ｖ（カナダ）に送った。個々のエレメントの内部参照データベースへのマッピングは、全ゲノム対照ＤＮＡ、ＧＦＰ及びベクターを表す合計４つの対照要素を用いてソフトウェアベースの基板上に画像を整列させることによって行った。標準化は、各データ要素の未処理強度を１００（この値は、アレイ開発で我々が実施した多数の異なるハイブリダイゼーションから導き出した、全要素の平均未処理強度である）に分けた全ベクター要素の平均未処理強度と等しい標準化率を掛けることによって行った。標準化した画像のソフトウェアによる対比較を、前記したように正常乳房ＲＮＡ、不死（新生物発生前の）乳房上皮細胞系から得てプールした"正常"ｃＤＮＡから取った標識付けｃＤＮＡのハイブリダイゼーションから得た画像に対して行った。発現レベルの変化を標準化した強度を用いて計算し、比（プラスの比は転写レベルの増加を示し、マイナスの比は転写レベルの減少を示した）として表し、Ｓｃａｔｔｅｒ−ｂｌｏｔグラフィック及びＴｒｅｅＶｉｅｗ ｐｒｏｇｒａｍにより視覚化した（１３〜１６）。
【００５４】
１．６．アレイデータ分析
結果を分析する前に、重複スポット又は２つの別々のアレイ上の同じｃＤＮＡを用いた１つのハイブリダイゼーション又は同じＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いて２つの別々のハイブリダイゼーションを比較することによって、実験の再現性を実証した。各場合に、結果は各々相関係数０．９６、０．９８及び０．９８での良好な再現性を示した（データは未記載）。再現性は２倍発現差を有意な差異とみなすのに十分であった。二次分析はエクセル及び統計ソフトウェアを用いて行った。腫瘍パラメーターと相関させた発現レベルを有する遺伝子の探査を数回の連続工程で行った。先ず、遺伝子を重要な要因により相違する腫瘍の２つのサブグループにおけるそれらの中央発現レベルを比較することによって検出した。我々は平均値よりも中央値を用いた。それは、多くの遺伝子で発現レベルの可変性が高く、その結果、標準偏差で発現レベルが平均値と同じか又は上位となり平均との比較が不可能となるからである。第２に、これらの検出した遺伝子を図面で視覚により調べ、最後に、相関を確認すると確証されるものに対して適正な統計分析を行った。ＥＲ−陽性腫瘍及びＥＲ−陰性腫瘍間のＨＥＲ２発現の比較を、Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ試験を用いて検証した。相関係数を使用して遺伝子発現レベルを含まれた腋窩リンパ節の数と比較した。
【００５５】
１．７．クラスター分析
この試験からのデータを記載したように分析し、表示した（１３〜１６）。簡単には、階層的クラスタリングアルゴリズムにより結果の表を作成するが、その際要因／アレイのｃＤＮＡ（特異的遺伝子を表す）を遺伝子発現のパターンの類似性に基づいて一緒に分類する。同じアルゴリズムを適用して、実験試料（即ち細胞系及び腫瘍）をそれらの遺伝子発現の全般的パターンの類似性に従ってクラスターする。こうして整理したデータ表を着色画像として図示する。垂直軸に添って、分析された遺伝子はクラスタリングアルゴリズムによる順序付けて配列されるので、最も類似した発現パターンを有する遺伝子は相互に隣接している。水平軸に添って、実験試料は、全遺伝子中で最も類似した発現パターンを有するようなものが相互に隣接しているように配列される。この表の画像の各細胞／区画の色は、該当する各遺伝子の測定した発現比を表す。色彩度は測定した遺伝子発現比の強度に正比例し、最も明るい赤区画は最高Ｔ／Ｎ比（即ち＞８倍の差異）を有し、最も明るい緑区画は最低のＴ／Ｎ比、黒区画は約１の比を有し、灰色の区画は不十分なデータ品質を示す。
【００５６】
１．８．ノーザンブロットによるＲＮＡ分析
我々は幾つかの乳癌標本及び全乳癌細胞系における発現ＡＸＬ及びＧＡＳ６遺伝子の検出用にノーザンブロット分析の標準プロトコルを使用した。負荷ＲＮＡ試料をヒトβ−アクチンプローブを用いるフィルターの再ハイブリダイゼーションにより実証した。
【００５７】
１．９．化学浸潤及び遊走分析
化学浸潤分析は、Ａｌｂｉｎｉその他の方法を修正して使用して行った（１０）。トリプシン化後、細胞（２００００）をＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中のマトリゲル塗布（４．０ｍｇ／ｍｌの１５０μｌ）８μｍポリプロピレンフィルターインサートに載せた（Ｂｉｏｃｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ ｏｒ Ｎｕｎｃ １０ｍｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）。下部チェンバーは、Ａｌｂｉｎｉその他により記載されているようにして製造した０．５５ｍｌのＮＩＨ３Ｔ３−調整培地又は幾つかの細胞系に関しては通常増殖培地を含有した。
【００５８】
ＡＴＣＣから得たＢＣ細胞系をトリプシン化し、遠心分離し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に細胞４×１０５個／ｍｌで再懸濁させた。残りの細胞系はそれらの標準増殖培地に再懸濁させた。
【００５９】
２０〜３６時間後に、インサートの残っている細胞を綿棒で除去し、フィルター底部の細胞を異なるプロトコルを用いて数えた：Ｄｉｆｆ−ｑｕｉｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ、ＩＬ）中に固定し、室温（ＲＴ）で１分間沃化プロピジウム（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で染色する前に、ＲＮａｓｅＡで処理した（５０μｇ／ｍｌで３７℃で２０分間）。乾燥させたフィルターを除去し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ６０ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いてスライド上に載せた。フィルター上の個々のヨウ化プロピジウム染色核を計数した。結果はトリプシン化及び細胞計数を用いて得られた。各実験で３部作った試料を計数した。特定範囲外の値は平均浸潤活性の計算から除いた。
【００６０】
抗体の存在における浸潤アッセイ用に、細胞をマトリゲル上に播き、接着したら、指示抗体を培地に加えた。抗体はアッセイの全期間上部チェンバー中に存在した；アッセイ終了時に、上部チェンバーの細胞増殖率をトリパンブルーで評価した。遊走活性は、浸潤アッセイで記載した方法に従って測定したが、但しその際、細胞はＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中で塗布してない８μｍ孔のポリプロピレンフィルター上に載せた。
【００６１】
１．１０．マトリゲル増殖
マトリゲル上で増殖した細胞の形態学の測定は前記したようにして行った（１０）。簡単には、培地５０μｌ中に再懸濁させた細胞（細胞５０００個／９６ウェルプレートのウェル）を−ＲＰＭＡ基礎培地塩中６．０ｍｇ／ｍｌに希釈したマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）７０μｌから成る前もって調製したマトリゲルコーチング上で培養した。これらの上で重合後、希釈したマトリゲル（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えた。コロニー伸展を実験の間中モニターし、ＯｐｅｎＬａｂ（ＵＫ）デジタルカメラを装備したＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ３５顕微鏡を用いて７〜１４日目に撮影した。
【００６２】
１．１１．傷アッセイ
一夜断餌後、融合細胞単分子膜上にプラスチックチップで傷を付けた。写真撮影（位相差）する前に、ＭＤＡ−ＭＢ−３４５Ｓ−ｍｏｃｋ及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５−ｄｎＡＸＬ、クローン２細胞を培地（１０％ＦＣＳ）及びＧＡＳ６（２００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地で１２、２４及び４８時間処理した。細胞遊走を定量するために、傷の３個の無作為選択部分（長さ１ｍｍ）を倍率４０Ｘで写真撮影した；平均傷幅を２０μｍ毎に測定し、傷閉合平均％を計算した。試料当たり３つの別個の傷を調べ、傷閉合平均％を計算した。
【００６３】
１．１２．抗体を用いる細胞処理
乳癌細胞（３Ｄ増殖アッセイ用に５０００個及びＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中での浸潤アッセイ用に２００００個）を抗体５０μｌ及び細胞懸濁液５００μｌを使用してＥｘ−ＡＸＬポリクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ）により処理した。細胞を抗体と一緒に室温で６０分間培養し、次いで室温でＰＢＳ中で洗浄した。細胞のプレート及び次の２４時間処理間隔は同じ濃度のＥｘ−ＡＸＬ抗体を用いて行った。
【００６４】
１．１３．ＢＣ細胞の組換えレトロウィルス感染
ウィルスのＡＸＬｗｔ及びｄｎ−ＡＸＬ突然変異形を修正を加えた標準プロトコル（３１）に従って得た。簡単には、ｐＬＸＳＮ−ＡＸＬｗｔ及びｐＬＸＳＮ−ｄｎＡＸＬをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ及びＮｏｔｌ／Ｘｂａｌ位置経由でクローン化した。
【００６５】
パッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａを燐酸カルシウムを用いてこれらベクターで感染させた。感染したＰｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞の上澄液を集め、０．４５μｍフィルターで濾過した。ヒト癌細胞系の感染用に、細胞をウィルス上澄み液と一緒に２４時間培養した。４８時間後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ１４８を含有する培地と取り換えた。更に選別するために、細胞をＧ４１８と一緒に１４日間培養した。ポリクローナル及びモノクローナル細胞系は限定希釈により生成させた。ＡＸＬ発現をウェスタンブロット及びアレイ分析によりモニターした。ＡＸＬ ｗｔ及びｄｎ−ＡＸＬの同じ発現レベルを有するポリクローナル及び３つのモノクローナル細胞系を次の実験用に選択した。
【００６６】
１．１４．抗体
ＡＸＬ／ＵＦＯ特異性抗体は、ウサギをアミノ酸残基１−４１０（ＡＸＬ−Ｅｘ）を含有する組換えＧＳＴ−ＡＸＬ細胞外ドメイン融合タンパク質で免疫処理することによって産生した。組換えＧＳＴ−ＡＸＬ−Ｅｘタンパク質は感染したＨＥＫ２９３細胞（ベクターｐｃＤＮＡ３−ＧＳＴ）により安定的に分泌された。培地を集め、ＧＳＴ−ＡＸＬ−Ｅｘタンパク質を標準ＧＳＴ−ｔａｇプロトコル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製した。ＡＸＬ−Ｅｘポリクローナル抗体をＧＡＴ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラムで部分的に精製した。
【００６７】
２．結果
本試験の目的は、乳癌攻撃性用の新しいマーカーを確認する目的で乳癌細胞中のプロテインキナ−ゼ、ホスファターゼ及びシグナリング遺伝子の発現プロフファイルを確立することであった。ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを使用して、１４の弱浸潤性、７の高浸潤性乳癌細胞系及び３つの正常乳房上皮細胞系の遺伝子発現プロファイルを分析した（第１表、図１、浸潤性ＢＣ細胞系及び対照の３Ｄ増殖）。
第１表：浸潤性のコンセンサスを発生させるために使用した乳癌細胞系の特徴
【表１】
【００６８】
【表２】
注釈：
ａ）試料起源及び病理学的評価情報はＡＴＣＣカタログから得た。ＰＴ、原発性腫瘍；ＰＥ、胸膜滲出液；Ｃａ、癌。
ｂ）腫瘍データはＡＴＣＣカタログ又は参照1７に報告されていた。
＋、無胸腺ヌードマウス又はＳＣＩＤマウスの異種移植片として産出された触診できる腫瘍；
−、非腫瘍形成性；ｍｅｔ、対照１８及び１９により報告されたような転移性細胞系。
ｃ）マトリゲル中で培養した細胞の形態学の記載及びＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ浸潤性アッセイにおけるそれらの活性は対照１０から得た。
【００６９】
遺伝子６５０個を含有するｃＤＮＡマイクロアレイ膜をこれらの試験で使用した。各浸潤性表現型に関する"浸潤性のコンセンサス"の定義を可能にする弱浸潤性と高浸潤性ＢＣ細胞間の遺伝子発現の差異を確認した（図２、クラスターＡＸＬ、相関＞０．７１）。高浸潤性ＢＣ細胞系（ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）はＡＸＬを過剰発現し、これらを弱浸潤性ＢＣ細胞系及び"正常"乳房上皮細胞と区別する特定の遺伝子発現プロファイルを示す。これらクラスターは浸潤性のマーカーとして既に公知である遺伝子を含有した（ＣＤ４４、ＶＩＭ、ＣＡＶ１，２及びＭＭＰｓ（参照２０〜２７））。これらの遺伝子の中には癌細胞浸潤性との関連があるとのみ考えられていたものもある（Ｍ−ＣＳＦ及びＥＰＨＡ２（参照２８〜３０）及び第２表）。クラスターのその他の遺伝子は癌細胞攻撃性と関連した遺伝子として初めて確認された：ＡＸＬ、ＧＡＳ、ＭＭＰ１４、Ａｄａｍ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２及び５、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＫ、Ｓ６ＫＩＩ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα及びＡｎｎｅｘｉｎ２。
【００７０】
顕著なことには、これらのＢＣ細胞系でエストロゲン受容体を発現したものは全くなかった（ＢＣ細胞系特徴に関して示されたように、第３図参照）。共発現遺伝子のクラスターＡＸＬは、原発性ＢＣ（第３図）及びその他の腫瘍及び癌細胞系（腎臓、前立腺及び神経芽膠腫）でも確認された（データ未記載）。浸潤性ＢＣ細胞系におけるＡＸＬ及びＧＡＳ遺伝子の発現は、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した（第４図）。
【００７１】
高浸潤性ＢＣ細胞系中で安定過剰発現されたＡＸＬ遺伝子（ｄｎＡＸＬ）の優性阻害型突然変異体は強力に、幾つかのＢＣ細胞系の浸潤性、遊走性及び生存度を抑制した：ＭＤＡ−Ｍｂ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及び部分的にＭＤＡ−ＭＢ−２３１（第５Ａ及びＢ図）。安定なｄｎ−ＡＸＬ発現を有するクローンは全て、非浸潤性又は弱浸潤性乳癌細胞系、例えばＭＣＦ７のように、マトリゲルマトリックス上で３Ｄ−増殖を有した。ｄｎ−ＡＸＬ発現は有意にＧＡＳ６シグナリングを抑制し、その結果ＧＡＳ処理でＡＸＬ燐酸化は減少又は欠如する。これらの細胞中のＥＲＫシグナリングも遮断された。
【００７２】
ＡＸＬの細胞外部分（アミノ酸残基１−４１０を含有する、Ｅｘ−ＡＸＬ）に対するポリクローナル抗体は細胞形態学を変え（第６Ａ図）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びＢＴ５４９ＢＣ細胞系の遊走及び浸潤に対して非常に強力な抑制活性を有する（第６Ｂ及びＣ図）。同じ結果が前立腺癌細胞系ＰＰＣ１を用いて得られた。更に、弱浸潤性ＢＣ細胞系ＭＣＦ７及び前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰで野生型（ｗｔ）ＡＸＬの過剰発現は高浸潤性表現型への形質転換を生じた。
【００７３】
Ｂ．神経膠芽腫試験
１．材料及び方法
１．１ ヒト神経膠腫
下記ヒト神経膠腫細胞をこの試験で使用した：Ｕ−１１８、Ｕ−１２４２、ＳＦ１２６、Ａ−１７２、Ｕ−３７３、Ｕ−１２４０、Ｔ−９８Ｇ、ＳＦ７６３及びＳＦ７６７。細胞は全て５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で１０％胎児ウシ血清（ＰＡＡ ＧｍｂＨ、Ｌｉｎｚ、オーストリア）中で３７℃で増殖させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料を用いてマイコプラズマ汚染に関して定期的に試験した。下記のように増殖培地（全てＧｉｂｃｏ、カースルスーエ、ドイツ）を使用した：Ｕ−１１８、Ｔ−９８Ｇ及びＳＦ７６３用にＤＭＥＭ；Ｕ−１２４２用にＭＥＭ、非必須アミノ酸（原料の１：１００希釈；Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＳＦ−１２６、Ａ−１７２及びＵ３７３用にグルコース４．５ｇ／Ｌを有するＤＭＥＭ及びＵ−１２４０及びＳＦ７６７用にＭＥＭ。ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ標本中への腫瘍移植の前に、前記したように細胞をＤｉｌで染色した（参照３５）。
【００７４】
１．２ ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイ並びにそのハイブリダイゼーション法は前記で詳説した（参照３１）。アレイは８４のＲＴＫ及び３０のプロテインチロシンホスファターゼに相応する１２５のｃＤＮＡフラグメント＋対照ｃＤＮＡから成っていた。全ＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ及びｃＤＮＡプローブは前記したようにして産生した（対照３１）。ｃＤＮＡ３〜５μｌの標識付けは［３２−Ｐ］ｄＡＴＰの５０μＣｉの存在でＭｅｇａｐｒｉｍｅ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。プレハイブリダイゼーション溶液を５×ＳＳＣ、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、パン酵母ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）１００μｇ／ｍｌ及び標識付けしたｃＤＮＡプローブ（２〜５×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を含有するハイブリダイゼーション溶液と取り換え、６８℃で１６時間培養した。膜を厳しい条件下で洗浄した。ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ１０００；Ｆｕｊｉ）を使用してハイブリダイゼーションシグナルを定量した。各スロットの平均値を式：Ａ＝（ＡＢ−Ｂ）×１００／Ｂを用いて計算した［Ａ、最終容量；ＡＢ、各スロットシグナルの強度（ピクセル／ｍｍ２）；Ｂ、背景（ピクセル／ｍｍ２）］。ｃＤＮＡアレイの結果は、前記したようにＲＴ−ＰＣＲ分析により確認すべきであった（参照３１）。
【００７５】
１．３ 発現コントラクト及び安定細胞系の生成
ＡＸＬ用コード２．７ｋｂｐのｃＤＮＡシークエンスをレトロウィルスベクターｐＬＸＳＮのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限部位中にクローンした。優性阻害型変異体を１．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｆｓｐｌフラグメントを同じベクター中にサブクローンすることによって産生した。発現プラスミド及び空ベクターを燐酸カルシウム共沈殿法を用いてＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞中にトランスインフェクションした。組換えレトロウィルスを含有する上澄みをトランスインフェクション後２８時間ハーベストし、最終濃度８μｇ／ｍｌでポリブレンと混合し、サブコンフルエントＳＦ１２６細胞に３時間適用した。感染を同じプロデューサー細胞の新しい上澄みを用いて２回繰り返した。感染した細胞を１日後に通過させ、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて２週間選別した。モノクローナル細胞系をウェスタンブロット分析によりモニターしたようにＡＸＬの高発現用に選択した。
【００７６】
１．４免疫沈降法及びウェスタンブロット
細胞は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ１０μｇ／ｍｌを補充した１０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ中で溶解した。タンパク質濃度はマイクロＢＣＡプロテインアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により測定した。ＡＸＬを全細胞タンパク質１．８ｍｇから、プロテインＡセファローズ懸濁液（ＣＬ−４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）３０μｌ及び抗−ＡＸＬポリクローナルウサギ血清（対照３６）３μｌを用いて一夜４℃で沈殿させた。沈殿をＨＮＴＧ緩衝剤（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄した。免疫沈殿又は全細胞タンパク質２００μｇ／レーンを還元試料緩衝剤と混合し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に移した。膜を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で０．２５％ゼラチンでブロックし、同じ緩衝剤中で１：５０００に希釈した抗ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０と一緒に一夜−４℃で培養した。二次抗体ヤギ抗マウスＨＲＰ（１：１００００、ＢｉｏＲａｄ）を室温で６０分間適応した。抗−ＡＸＬ（ポリクローナルウサギ血清。１：１０００）及びプロテインＡ−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ、１：４００００）で再プローブする前に、膜を５５℃で９０分間ストリッピングした。検出はＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ボストン）を用いて行った。
【００７７】
１．５ マウス
無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ；雄／雌）を特異的病原菌不含環境内部で飼育、維持し、６〜１０週の年齢で使用した。実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの認証研究プロトコル及びガイドラインに従って行った。外科処理用にマウスをケタミン／キシラジンの皮下注射により麻酔した。
【００７８】
１．６ 皮下及び同所性異種移植片
神経膠腫異種移植片は１×１０６個のＣ６細胞（対照４４）のヌードマウス左腋腹中への注射により皮下で増殖させた。腫瘍増殖は移植後１４日までノギスを用いて評価した。腫瘍容量を（長さ×幅×高さ）／２として計算した。大脳内腫瘍細胞移植用に、ヌードマウスの頭を定位ネズミ頭ホルダー（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｒｏｄｅｎｔ ｈｅａｄ ｈｏｌｄｅｒ）に固定した。移植は、細胞５×１０５個を右線条体に定位に注射することによって行った。一つの実験群の動物が神経学的欠損を発現するか又は動物の体重が＞３０％減少したら直ちに、腫瘍増殖を比較するために、動物を殺した。
【００７９】
１．７ Ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒモデル
２枚の対照的チタン枠を動物の背面皮膚の襞に置き、皮膚の伸ばした二重層を挟み、１層の黄紋筋層、皮下組織及び表皮から成るｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒを作った。ガラスカバーガラスで覆った観察窓により、チェンバー内で増殖する腫瘍の微小血管系の生体内顕微鏡観察を繰り返し行うことができた。チェンバー製造２日後に、腫瘍細胞移植用にｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒのカバーガラスを一時的に取り除いた。動物はｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒによく耐え、睡眠及び食餌挙動において不快又は変化の徴候を示さなかった。
【００８０】
１．８ 生体内多蛍光顕微鏡法
生体内エピ蛍光ビデオ顕微鏡法を移植後２１日間に渡って実施した（対照３７、３８、３９）。神経膠腫細胞のＤｉｌ標識付けにより、隣接宿主組織からの腫瘍の詳細な描写並びに緑色光エピイルミネーション（５２０〜５７０ｎｍ）適用により個々の腫瘍細胞の確認が可能となった。ＦＩＴＣ結合デキストラン（ＭＷ＝１５００００；０．１ｍｌ静脈内）でコントラスト増強及び青色光エピイルミネーション（４５０〜４９０ｎｍ）の使用を適用して個々の血管を可視性にした。腫瘍増殖を、蛍光により標識付けした腫瘍塊により覆われた組織面積の測定により評価した。宿主及び腫瘍微小血管系の分析は、血管密度及び血管直径が含んだ（対照３７）。
【００８１】
１．９ 組織学
実験終了時に、神経膠腫含有ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ標本及び脳を切開し、組織形態学分析用に液体窒素中で凍結した。切片をスタブに載せ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）中に包埋し、液体Ｎ２で冷却した２−メチルブタン（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）中で凍結した。連続軸切片（５μｍ）を切断し、ゼラチンを前塗布したスライド上に載せた（Ｓｉｇｍａ）。切片を標準工程に従ってハリス・ヘマトキシリン及びエオシンＧ（Ｍｅｒｃｋ）で染色した。
【００８２】
１．１０ 増殖アッセイ
神経膠腫細胞系の増殖を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で評価した。細胞を９６ウェル組織培養プレート中で細胞３０００個／ウェルの濃度で播き、Ｇａｓ６（２００μｇ／ｍｌ）の不在又は存在で４８時間培養した。次いで細胞を、ＭＴＴ染料の着色ホルマザン生成物へのそれらの還元力を細胞増殖指数として検定した。
【００８３】
１．１１ 遊走性アッセイ
神経膠腫スフェロイドを細胞５×１０６個を培地中で１．０％Ｎｏｂｌｅ寒天（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を前もって下塗した７５ｃｍ２フラスコ中へ播くことにより産生した。培養中で７〜１０日後、３００μｍより小さい直径を有するスフェロイドを遊走性及び浸潤性試験用に選択した。神経膠腫スフェロイドを２４ウェルプレートの中央に置いた。スフェロイド外植片から遊走する腫瘍細胞により覆われた面積を細胞遊走性指数として使用した。各外植片の２つの直交直径を７日間に渡って位相差顕微鏡を用いて毎日測定し、腫瘍細胞により覆われた平均面積を計算した。遊走性アッセイは４回実施した。
【００８４】
１．１２ 浸潤性アッセイ
胎児ラット脳細胞凝集体を前記した標準化方法により産生した（対照４０）。簡単には、１８日の年齢のＢＤ ＩＸラット胎児を帝王切開により取り出した。脳を注意深く切開し、ミンチし、連続的にトリプシン化した。遠心分離後、細胞１×１０７個（培地に再懸濁）を２４ウェルプレートの寒天塗布ウェル中に播いた。再凝集２日後、スフェロイドを新しいウェルに移し（凝集体５〜７個／ウェル）、そこで１８〜２１日間成熟させた。その時間までに成熟脳凝集体は生成した。胎児ラット脳凝集体及び神経膠腫スフェロイドは、ｉｎ ｓｉｔｕで脳及び神経膠腫細胞に似ている標準化された原発性無血管脳及び腫瘍塊を表し、従って試験管内での神経膠腫細胞遊走及び血管に無関係な浸潤を調べるための好適なモデルとなる。浸潤性アッセイ用に、単一成熟脳凝集体（直径＝２５０〜３００μｍ）を寒天塗布９６ウェルプレート中に入れた。同じ大きさの単一神経膠腫スフェロイドを同じくウェル中へ移し、脳凝集体と接触させた。対比を各々２４時間及び４８時間培養し、その後ハーベストし、パラホルムアルデヒド中に固定し、準薄（ｓｅｍｉｔｈｉｎ）切片（２μｍ）の製造用にプラスチック樹脂中に包埋した。切片をトルイジンブルーで染色した。神経膠腫細胞浸潤工程を無傷のままのラット脳凝集体の量に関して評価した。浸潤性アッセイは４回行った。
【００８５】
１．１３ 統計
群間の差異を分析するために、群間の個々の比較用に、一元配置分析（ＡＮＯＶＡ）、次いで適切な事後試験（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を実施した。ｐ＜０．０５の結果は有意であるとみなした。
【００８６】
２．結果
２．１
神経膠腫細胞生物学におけるＵＦＯ／ＡＸＬの関連性を調べるために、細胞内ＲＴＫドメインを欠くヒトＵＦＯ／ＡＸＬの切端ドメインネガティブ突然変異体をレトロウィルス発現系を用いてＳＦ１２６神経膠腫細胞（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ）中に導入した。空ベクターで感染させた細胞（ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ）又はＵＦＯ／ＡＸＬのヒト野生型形（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ）を対照として使用した。ヒトＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインに対する抗体を用いるウェスタンブロット法により、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローン中の野生型及び切端受容体の高発現レベルを確認した（図８Ａ低いパネル）。切端受容体の発現がＵＦＯ／ＡＸＬシグナル伝達を遮断するか否かを確認するために、そのリガンドＧａｓ６で刺激に次ぐＵＦＯ／ＡＸＬ受容体燐酸化を測定した（図８Ａトップレーン）。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞中で、中程度のベースラインシグナルが観察され、これはＧａｓ６刺激で増加した。ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ中でＧａｓ６−誘発シグナルが増加した。反対に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞中でベースライン及びＧａｓ６−誘発燐酸化はほぼ完全に抑制された。
【００８７】
ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの遮断は、標準培養条件下及びそのリガンド不在で、神経膠腫細胞形態学に著しい影響を有した。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞（図８Ｂ及びＣ）は多数の細胞間接触を有する伸張した紡錘形形態を示したが、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞は丸い形態及び減少した細胞間接触が特徴的であった（図８Ｄ）。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞はまたプラスチックに対するその良好な接着性を失ったようであった。
【００８８】
２．２
腫瘍増殖に関するＵＦＯ／ＡＸＬの相関を調べるために、各クローンの細胞１×１０６個を大人のヌードマウスの腋腹中に皮下移植した。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞に比較すると、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の腫瘍形成性は劇的に損なわれ、腫瘍増殖は９７％減少した（図９Ａ）。反対にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞では腫瘍増殖は僅かに促進された（図９Ａ）。生体内における神経膠腫細胞生物学におけるＵＦＯ／ＡＸＬの役割を更に詳細に検証するために、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞を大人のヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄの透明なチェンバー中へ移植した。腫瘍細胞の蛍光標識付け及び蛍光血漿マーカーの全身投与により、このモデルは腫瘍増殖、腫瘍細胞挙動、腫瘍の腫瘍起因性血管形成及び腫瘍灌流を生体内多蛍光ビデオ顕微鏡により繰り返しかつ非観血的に評価することができる。この方法を用いて腫瘍増殖に関するＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの有意性を確認することができた。
【００８９】
ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍との比較で、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍の拡大は有意に抑制された（図９Ｂ）。ＵＦＯ／ＡＸＬが腫瘍増殖及び拡大に影響を与えうる機序の一つは、血管機能及び腫瘍への栄養血液供給のその調整である。この仮説は、Ｇａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬ媒介シグナリングが凝集カスケード並びに血管形成及び成熟を妨害することを示す最近の研究により支持される（参照４１、４２）。これを試験するために腫瘍機能性血管密度及び微小血管直径を腫瘍の腫瘍起因性血管形成及び腫瘍灌流のマーカーとして定量的に分析した。しかし、図９Ｂに図示したように、これらの分析はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍増殖の劇的な抑制に関する血管の説明（例えば抗腫瘍起因性血管形成、腫瘍血管血栓症による灌流不全）を支持することはできなかった。
【００９０】
腫瘍試料の組織形態学的分析は、ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングが神経膠腫細胞生物学で中心的役割を演じるという仮説を更に強調した。図９Ｃ及びＥで実証したように、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍は、大きな硬い腫瘍塊並びに個々の腫瘍細胞による大規模な浸潤及び隣接する宿主組織（即ち筋肉及び皮下組織）の二次的破壊を特徴としていた。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍は遙かに小さく、周囲の宿主組織への浸潤がなかった（図９Ｄ及びＦ）。このＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍浸潤組織の欠如は更に、隣接組織内部のＤＩ−標識付けされたＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の欠如を実証する凍結した切片の蛍光及び位相差顕微鏡法により確認された（図９Ｇ及びＨ）。
【００９１】
２．３
ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の遮断による腫瘍増殖の抑制の下にある機序を更に解明するために、試験管内の神経膠腫細胞挙動を分析した。ＭＴＴアッセイはＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の増殖が標準培養条件下で、各々ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ細胞に比較して５０％及び３５％減少したことを実証した（図１０Ａ）。注目に値することには、この結果はＵＦＯ／ＡＸＬリガンドＧａｓ６を用いる刺激と無関係であったことであり、これはＧａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングが細胞分裂促進性作用を発揮しないという前記仮説を確認する。ＵＦＯ／ＡＸＬは細胞間接着を媒介すると指摘された（参照４３）ので、細胞の多細胞凝集体形成力を調べた。ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞は迅速にスフェロイドを形成した（図１０Ｂ）。それらの凝集力はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞中で減弱せず（図１０Ｃ）、これは細胞凝集がＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインによってのみ媒介されることを確認する。次ぎに、神経膠腫細胞遊走を腫瘍スフェロイドを培養し、遊走する腫瘍細胞と最初のスフェロイドからの距離を測定することによってアドレスした。ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞が相当距離遊走したが、腫瘍細胞遊走性はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞で非常に減少していた（図１０Ｄ）。細胞遊走性は腫瘍浸潤に必要不可欠であるので、ＳＦ１２６細胞クローンの浸潤性を腫瘍スフェロイドを胎児のラット脳細胞凝集体と対比させることによってアドレスした。共培養４８時間後、ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ細胞の両方が能凝集体を瀰漫性に浸潤した（図１０Ｅ）。対照的に、同じ時間後にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍スフェロイドと脳細胞凝集体との間の明確な境界を観察することができ、これらの細胞が正常な脳組織中へ浸潤できなかったことを示す（図１０Ｆ）。
【００９２】
総合して、腫瘍異種移植片の組織形態学及び試験管内の結果は、ＵＦＯ／ＡＸＬが神経膠腫細胞の増殖、遊走及び浸潤性を有意に調整し、ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの抑制が腫瘍細胞増殖及び隣接組織中への浸潤の遮断により腫瘍拡大を抑制するという明白な証拠を示した。悪性神経膠腫の治療用の新しい標的となるＵＦＯ／ＡＸＬの能力を試験するために、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞を大人のヌードマウスの脳中へ移植し、それらの生存を評価した。神経学的欠損を発現するか又は最初の体重の＞３０％減少が見られたら直ちに動物を殺した。ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ腫瘍は、全動物を急速な臨床的悪化により８日間以内に殺さざるをえなかっった攻撃的臨床過程を特徴とした（図１１Ａ）。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍を有する動物はある観察期間の間、症状なしにかつ体重減少なしに生存した（０日の体重＝２９±２ｇ対８日の体重＝２８±１ｇ）（図１１Ａ）。組織形態学的分析から、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞は脳実質に瀰漫性に浸潤したが、硬い腫瘍塊の影響を有する間隙は中程度でしかなかったことが判明した（図１１Ｂ）。ここでヒト腫瘍細胞浸潤の典型が観察された：血管周囲の間隙に添って（図１１Ｃ）。白色路に添って（図１１Ｄ）及び脳質系の壁に添って（図１１Ｅ）。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍形成はどの動物でも確認することができなかった。
【００９３】
２．４ 総括
総合して、本分析の結果は、悪性脳腫瘍の生物学におけるＲＴＫ ＵＦＯ／ＡＸＬの新しい基本的役割を示す。所見は、ＵＦＯ／ＡＸＬが、ＥＧＦＲ又はＰＤＧＦＲ−αと比較可能な程度まで、有意数のヒト神経膠腫細胞系によって過剰発現されかつ神経膠腫増殖並びに神経膠腫浸潤を媒介することを示す。ＵＦＯ／ＡＸＬは神経膠腫浸潤に関与すると報告された最初のＲＴＫであり、従ってこれらの高攻撃性であり、しかも難治性の腫瘍を抑制するための新しい治療標的である。これはＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの抑制が神経膠腫増殖を抑制し、正位移植による生存を伸ばすことを実証する本発明の結果により支持される。
【００９４】
ＵＦＯ／ＡＸＬの生物学的機能を調べるために、このヒト神経膠腫細胞のお互いの相互作用の複合力及びマトリックスを詳細に分析した。結果として、切端優性阻害型受容体突然変異体を発現させることによるＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制が細胞の健康な脳組織中への遊走及び浸潤力をほぼ完全に抑制することを実証することができた。本実験で使用したＵＦＯ／ＡＸＬの突然変異体が細胞内ドメインを欠き、細胞外ドメインはなお機能的に無傷であることを特記すべきである。従って、ＵＦＯ／ＡＸＬは腫瘍細胞浸潤を単に受容体のマトリックスとの相互作用だけによって媒介するのではなく、むしろ複合シグナリングカスケード下流受容体を巻き込むことによって媒介する。更に、本結果は、ＵＦＯ／ＡＸＬが潜在的に再び細胞間及び細胞−マトリックス相互作用を調整することにより腫瘍細胞増殖に関与していることも示す。
【００９５】
中枢神経系は、ＵＦＯ／ＡＸＬ、そのリガンドＧａｓ６及び類似ＲＴＫ、例えばＴｙｒｏ３又はＭｅｒの顕著な発現を特徴とする。本試験の所見は、Ｇａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングがニューロン及び神経膠細胞の遊走及び誘導を調整する分子系の一部であるかもしれないことを示す。更に宿主及び腫瘍組織によるＵＦＯ／ＡＸＬ及びそのリガンドＧａｓ６の顕著な発現は、脳内部に起因する腫瘍の独特な浸潤力を更に解明する手がかりとなるかもしれない。
【００９６】
Ｃ．討論
単一遺伝子としてのＲＴＫ ＡＸＬが実験系で腫瘍転移を誘発するのに十分であるという事実は、転移表現型の取得が数種の遺伝及びエピ遺伝現象を含む多段工程であるという現行の見解と対比するので、意外である。
【００９７】
良性及び悪性腫瘍が抑制されてない状態で増殖する。しかし悪性腫瘍の細胞だけが周囲の組織に浸潤し、遠隔器官に移動する（転移する）。この攻撃性に関する分子ベースの解明から、良性から悪性への腫瘍の移行を阻止し、局所疾患を食い止める治療が導き出されるであろう。我々は、ＡＸＬ及びＧＡＳというタンパク質を浸潤性だけでなく、腫瘍細胞の生存及び運動−転移に必要な三組の特徴を調整する分子検問所における受容体−リガンド対として確認した。ｄｎ−ＡＸＬ／ＧＡＳ６複合体も腫瘍細胞抗アポプトーシス力を抑制する。
【００９８】
このデータは、血清の存在におけるＢＴ−５４９細胞のＧＡＳ治療（ｄｎ−ＡＸＬの安定発現）がＥＲＫ１／２ＭＡＰＫの活性化を誘発することができないことを示す。従って、このシグナリング経路はＡＸＬ抑制を効果的に遮断する。
【００９９】
総括すると、本データにより、ＡＸＬ／ＧＡＳが腫瘍細胞浸潤に影響を与えることによってヒトの癌で重要な役割を演じることが実証された。ＡＸＬタンパク質は癌の診断及び治療（抗浸潤性）の新しい標的である。例えば、癌細胞におけるｄｎＡＸＬの発現は浸潤及び転移発生を防止することができる。更にＡＸＬクラスターの遺伝子（第２表に列記）は原発性腫瘍、特に乳房、前立腺、腎臓の腫瘍及び神経膠芽腫における浸潤前段階発達の検出用の診断道具として使用することができる。
【０１００】
Ｄ．結論
１．ＢＣ細胞系、原発性腫瘍及び神経膠芽腫細胞のｃＤＮＡアレイ分析を使用して、"浸潤性のコンセンサス"（クラスターＡＸＬ）を確認した。この３２種の遺伝子から成る浸潤性のコンセンサスを使用して癌細胞及び原発性腫瘍の攻撃性を予言することができる。
【０１０１】
２．ＡＸＬの優性阻害型突然変異体（ｄｎ−ＡＸＬ）は、高浸潤性乳癌細胞系を強力に抑制し、それらの血清停止（アポトーシス）に対するそれらの感受性を増加させる。ＡＸＬの細胞外部分に対するポリクローナル抗体（アミノ酸残基１−４１０、Ｅｘ−ＡＸＬを含む）は治療した癌細胞の攻撃性を抑制することができる。
【０１０２】
３．単一遺伝子としてのＲＴＫ ＡＸＬは実験系で乳癌細胞浸潤を誘発するのに十分である（２及びモデル系ＢＣ−ＭＣＦ７−ｗｔＡＸＬ及び前立腺癌細胞系−ＬＮＣａＰ−ｗｔＡＸＬ）。この結果は、転移表現型の取得がいくつかの遺伝及びエピ遺伝現象を含む多段工程であるという現行の見解と対比する。
【０１０３】
４．ＰＴＫ ＡＸＬは、癌浸潤及び転移を引き起こす活動過多の細胞シグナリングの重要経路を標的とする"シグナル伝達治療"の治療戦略の有望な候補である。ｄｎ−ＡＸＬ突然変異体による及び／又は阻害抗体を用いる治療によるＡＸＬシグナリング機能の抑制は、副行又は代償性経路により迂回され得ない。
【０１０４】
５．腫瘍治療におけるＡＸＬ遺伝子発現の抑制は、遺伝子又は転写物レベルでのＡＸＬの抑制、例えば突然変異体の遺伝子トランスファー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はＡＸＬ遺伝子発現サプレッサー又はタンパク質レベルでの抑制、例えば低分子量ＡＸＬキナーゼ阻害剤、ＡＸＬ類似物、例えばＥｘ−ＡＸＬ融合タンパク質、例えばＥｘ−ＡＸＬとＪｇＧ１Ｆｃフラグメントの融合（参照３２）又は抑制抗体により行うことができる。更に、ＡＸＬ遺伝子発現の抑制はＡＸＬシグナル阻害剤、例えば下流阻害剤により行われるかもしれない。
【０１０５】
第２表：浸潤性のコンセンサス
【表３】
【０１０６】
第３表
【表４】
【０１０７】
第４表：チロシンキナーゼｃＤＮＡアレイにより評価した、ヒト神経膠腫細胞系におけるＥＧＦＲ及びＵＦＯ／Ａｘｌの発現
【表５】
参考文献
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性疾患の分野における診断及び治療法に関する。更に特に本発明は、悪性疾患の浸潤度判定法及び癌細胞浸潤の予防又は治療を含む悪性疾患の浸潤度の減少法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
最近、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現が、ヒトを含む哺乳類において多くの症例で悪性疾患、特に癌の発生と関係があることが判明した。例えば受容体チロシンキナーゼＡＸＬ／ＵＦＯ（参照１、２；Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６１２５）の過剰発現はヒトの血液学的悪性腫瘍の発生に関与している。更に最新データは、ＡＸＬ及びそのリガンドＧＡＳ６のシグナリングが癌細胞の腫瘍起因性血管形成、接着及び生存に関与していることを示す（参照３、４、５、６、７、８）。Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（１９９７年１０月）第４６巻、Ｎｏ．１、９１頁、Ａｔｔａｒ、Ｅ．Ｃ．その他は、ヒト乳癌におけるＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ発現に関する研究を開示している（参照３３）。Ｄｏｄｇｅ Ｚａｎｔｅｋ Ｎ．その他は乳癌における細胞−ＥＣＭ及び細胞間相互作用を調べるための新しい細胞系としてＭＣＦ−１０Ａ−ＮｅｏＳＴを発表した（参照３４）。彼らは、ＡＸＬの浸潤における潜在的役割及び乳癌の進行因子としての潜在的役割を指摘している。しかし、ＡＸＬの過剰発現がその他の悪性疾患における浸潤度及び／又は転移形成と関与していることを実証しうるデータは提供されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
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【非特許文献３２】Yanagita M., Arai H., Ishii K., Nakano T. , Ohashi K, Mizuno K, Varnum B., Fukatsu A. , Doi T. , Kita T. Gas6 regulates mesangial cell proliferation through AXL in experimental glomerulonephritis. Am. J. Pathol, 2001 Apr. , 158 (4), 1423-32
【非特許文献３３】Attar E. C, Fridell Y. C, Xu L., Jin Y. , Maia D. M., Schell M. J. , and Liu E. T. AXL receptor tyrosine kinase expression in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, (Oct., 1997) Vol. 46, No. 1, pp. 91
【非特許文献３４】Dodge Zantek N. , Walker-Daniels J. , Stewart J. , Hansen R., Robinson D. , Miao H. , Wang B., Kung H-J. , Bissell M. J. and Kinch M. MCF-10A-neoSt : A New Cell System for Studying Cell-ECM and Cell-Cell Interactions in Breast Cancer. Clinical Research, Vol. 7, 3640-3548, November 2001
【非特許文献３５】Vajkoczy, P., Goldbrunner, R. , Farhadi, M. , Vince, G., Schilling, L. , Tonn, J. C. , Schmiedek, P. , and Menger, M. D. Glioma cell migration is associated with glioma-induced angiogenesis in vivo, Int J Dev Neurosci. 17: 557-63,1999
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【非特許文献３７】Vajkoczy, P. , Schilling, L. , Ullrich, A. , Schmiedek, P. , and Menger, M. D. Characterization of angiogenesis and microcirculation of high- grade glioma : an intravital multifluorescence micro-scopic approach in the athymic nude mouse, J Cereb Blood Flow Metab. 18: 510-520,1998
【非特許文献３８】Vajkoczy, P. , Farhadi, M., Gaumann, A. , Heidenreich, R., Erber, R., Wunder, A., Tonn, J. C., Menger, M. D. , and Breier, G. Microtumor growth initiates angiogenic sprouting with simultane-ous expression of VEGF, VEGF receptor-2, and angiopoietin-2, J Clin Invest. 109: 777-85., 2002
【非特許文献３９】Read, T. A. , Farhadi, M., Bjerkvig, R., Olsen, B. R. , Rokstad, A. M., Huszthy, P. C. , and Vajko-czy, P. Intravital microscopy reveals novel antivascular and antitumor effects of endostatin deliv-ered locally by alginate-encapsulated cells, Cancer Res. 61: 6830-7., 2001
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【非特許文献４１】Stitt, T. N. , Conn, G. , Gore, M. , Lai, C. , Bruno, J. , Radziejewski, C., Mattsson, K. , Fisher, J. , Gies, D. R. , Jones, P. F. , and et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases, Cell. 80: 661-70., 1995
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的の一つは、浸潤度及び／又は攻撃性用の新しいマーカーを確認するために、悪性疾患、特に乳癌及び脳癌における遺伝子、特にプロテインキナーゼ、ホスファターゼ及びその他のシグナリング遺伝子から選択した遺伝子の発現プロファイルを確立することであった。ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアレイを７つの高浸潤性、１４の弱浸潤性乳癌細胞系及び３つの正常乳房上皮細胞系の遺伝子発現プロファイルを分析するために使用した。弱浸潤性と高浸潤性乳癌細胞系の間の遺伝子発現の差異を確認したが、これにより乳癌細胞系の浸潤度と相関する遺伝子クラスターの定義が可能となる。このクラスター又はそれからの遺伝子の組合せを使用することによって、高浸潤性乳癌細胞系を弱浸潤性乳癌細胞系及び正常乳房上皮細胞系から識別することができる。
【０００５】
更に、悪性神経膠腫の生物学に関与する新規受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を同定するために、ヒト神経膠腫細胞系におけるＲＴＫ発現プロファイルをｃＤＮＡマイクロアレイ法により判定した。ＥＧＦＲ及びＰＤＧＦＲ−αの他に受容体ＵＦＯ／ＡＸＬが最も顕著に発現したＲＴＫの一つであった。試験した９中７のヒト神経膠腫細胞系で、ＵＦＯ／ＡＸＬｍＲＮＡがＥＧＦＲ用のｍＲＮＡより高い発現レベルを有した（第４表）。ＵＦＯ／ＡＸＬの優性阻害型突然変異形を過剰発現させることによるＵＦＯ／ＡＸＬシグナル形質導入の抑制は、ＵＦＯ／ＡＸＬ野生型形を過剰発現させる細胞と比較すると、マウスで腫瘍進行を抑制し、生存を延ばした。ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの機序及びその神経膠腫増殖における役割を調べるために、腫瘍細胞形態学及び腫瘍細胞挙動を増殖、凝集能、遊走性及び浸潤性に関して試験管内で評価した。更に、腫瘍細胞挙動、腫瘍起因性血管形成及び腫瘍還流を生体内で生体内多蛍光顕微鏡法により分析した。この試験により、ＵＦＯ／ＡＸＬの新しい役割、即ち、神経膠腫細胞間相互作用、神経膠腫細胞遊走及び神経膠腫浸潤を媒介する役割が示される。ＵＦＯ／ＡＸＬは、悪性脳腫瘍の瀰漫性−浸潤性、局所転移性増殖を媒介に寄与しうる最初のＲＴＫである。
【０００６】
従って、本発明の最初の態様は、ＡＸＬ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７６１２５）、ＧＡＳ６（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｌ１３７２０）、ＭＭＰ１４（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４９９５）、ＡＤＡＭ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ０２３４７６）、ＡＤＡＭ１７（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ６９６１１）、ＭＴ３ＭＭＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００５９６１）、ＦＧＦ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００２００６）、ＦＧＦ５（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４４６４）、ＦＹＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１４３３３）、ＬＹＮ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１６０３８）、ＤＤＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ７４７６４）、ＴＩＭＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００３２５４）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００１９４５）、ＳＧＫ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｙ１００３２）、ＲＰＳ６ＲＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ６０７２４）、ＭＡＰ４Ｋ４（Ｇｅｎｂａｎｋ ＸＭ０３８７４８）、ＳＩＲＰα（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｙ１０３７５）及びＡｎｎｅｘｉｎ Ａ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｄ０００１７）から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することから成る悪性疾患の浸潤度の判定法に関する。更に、遺伝子Ｓｔａｔ ５ｂ（Ａｃｃ．ＮＭ０１２４８８）又はＥＤＧ２（Ａｃｃ．ＮＭ０５７１５９）の発現は、場合により前記の１種以上の遺伝子の発現を測定することに加えて、悪性疾患の浸潤度用の指標として測定することができる。前記遺伝子の少なくとも１種の高い発現は高い浸潤度と相関すると判明した。
【０００７】
更に本発明では、高い浸潤度は前記遺伝子の少なくとも２種、特にＡＸＬ及び１種以上のその他の遺伝子の高い発現と相関すると判明した。１種以上のその他の遺伝子は、前記遺伝子から選択してもよいし、浸潤性用のマーカーとして既に公知である遺伝子から選択してもよい。
【０００８】
従って、方法は有利には、幾つかの前記遺伝子の発現の測定、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７又は８種の遺伝子の発現の測定から成る。更に有利には、方法は少なくともＡＸＬ／ＵＦＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ７６１２５）の発現の測定から成る。更に方法は、浸潤性のマーカーとして既に公知である少なくとも１種のその他の遺伝子、例えばＣＤ４４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ６６７３３）、ビメンチン（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｘ５６１３４）、Ｃａｖ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｚ１８９５１）、ＣＡＶ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＦ０３５７２）、ＭＭＰ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１３５０９）、ＭＭＰ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４５３０）、ＭＭＰ９（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＭ００４９９４）、Ｍ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ３７４３５）及びＥＰＨＡ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ５９３７１）の発現を測定することから成ってよい。
【０００９】
前記遺伝子クラスター及び特にＡＸＬ遺伝子と浸潤度の間の相関は、幾つかの種類の悪性疾患、例えば乳癌、特に原発性乳癌、前立腺癌、腎臓癌及び神経膠芽腫又はその他の上皮起源の癌で認められた。１種以上の前記マーカー遺伝子の発現及び特にＡＸＬ遺伝子の発現と神経膠芽腫の浸潤度との間に相関が存在するという発見は特に興味深い。
【００１０】
更に、ＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体の安定過剰発現が、細胞浸潤性及び遊走を強力に抑制することができ、ＡＸＬ機能の抑制が高浸潤性悪性疾患、例えば乳癌又は脳癌、例えば神経膠芽腫で転移生成を抑制し、減少させることを示すことを見出した。ＡＸＬの細胞外部分に対するポリクローナル抗体は、癌細胞、例えば乳癌又は前立腺癌細胞系の遊走及び浸潤度に対して非常に強力な抑制活性を有する。更に、弱浸潤性乳癌、前立腺癌細胞系及び神経膠腫細胞における野生型ＡＸＬの過剰発現はそれらの浸潤度を増加させた。
【００１１】
これらのデータは、ＡＸＬ遺伝子及びタンパク質が、悪性疾患の予防又は治療用の、特に悪性疾患における腫瘍浸潤性及び／又は転移形成を抑制するための、有望な新しい標的であることを示す。
【００１２】
従って、本発明のもう一つの態様は、ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子又はタンパク質又はそのリガンドを抑制することから成る悪性疾患の浸潤度を減少させる方法に関する。この方法は、（ｉ）ＡＸＬタンパク質の受容体チロシンキナーゼ活性を抑制し、（ｉｉ）ＡＸＬ遺伝子の発現を抑制し、（ｉｉｉ）ＡＸＬタンパク質及びそのリガンド、特にＧＡＳ６間の相互作用を抑制し、かつ／又は（ｉｖ）ＡＸＬと下流シグナル伝達因子の相互作用を抑制することから成ってよい。
【００１３】
ＡＸＬタンパク質リガンドに関して、特にＧＡＳ６のラミニンＧ様ドメイン（ＧＡＳ６−ＬＧ）が、ＡＸＬ結合及び活性化のようなＡＸＬタンパク質との相互作用に関与すると判明した（参照３６）。特にＧＡＳ−ＬＧ２ドメインの残基、例えばＬｅｕ６２０、Ｔｙｒ６６０及びＰｈｅ４８７がＡＸＬ結合及び／又は活性化に影響を与える。本発明の詳細な実施態様によれば、悪性疾患の浸潤度を減らす方法は、１種以上のＧＡＳ６−ＬＧの残基、特にＬｅｕ６２０、Ｔｙｒ６６０及び／又はＰｈｅ４８７の抑制から成る。
【００１４】
本発明は、悪性疾患の診断又は予防及び／又は治療に関し、特に悪性疾患における腫瘍浸潤度及び／又は転移生成に関する。悪性疾患の有利な例は、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌及び神経膠芽腫である。更に特には悪性疾患は、乳癌又は神経膠芽腫である。
【００１５】
本発明の診断の実施態様では、浸潤性関与遺伝子の発現を定量的及び／又は定性的に測定する。発現は、例えばヒト腫瘍患者からの悪性細胞から成る試料で測定する。試料は、組織切片標本、生検試料など又は体液からのものであってよい。試験すべき試料の遺伝子発現を、例えば"正常"細胞又は弱浸潤性の悪性細胞からの陰性の対照試料及び／又は例えば高浸潤性悪性細胞からの陽性対照の対照試料における遺伝子発現と比較することができる。
【００１６】
遺伝子発現は例えばｍＲＮＡ又は転写物レベル及び／又はタンパク質レベルで公知方法により測定することができる。
【００１７】
ｍＲＮＡレベルの遺伝子発現の測定は、逆転写及び／又は増幅反応、例えばＰＣＲから成ってよい。有利には、遺伝子発現を核酸アレイで測定するが、その際試験すべき試料からの核酸、例えばＲＮＡ又はｃＤＮＡを試験すべき核酸に特異的な固定化プローブのアレイにハイブリッドさせる。好適な核酸アレイの有利な例は、ＰＣＴ／ＥＰ０２／０１０７３に記載されている。代わりに、遺伝子発現をその他の方法、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーションにより測定することができる。
【００１８】
タンパク質レベルの遺伝子発現は、浸潤度関与遺伝子によりコードされたタンパク質に対する抗体を使用する免疫学的方法により測定することができる。抗体は、公知標識基、例えば当業者に公知であるような、放射性、蛍光、化学発光又は酵素基により直接又は間接的に標識付けされていてよい。
【００１９】
本発明の治療の実施態様は、特にＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンドの阻害剤をそれを必要とする被験者に悪性疾患の浸潤度の減少に効果的な量で投与することから成る方法に関する。被験者は有利には哺乳類、更に有利にはヒトである。ＡＸＬタンパク質のリガンドは有利にはＧＡＳ６、特に前記したようなＧＡＳＧ−ＬＧの残基である。
【００２０】
ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド、例えばＧＡＳ６の阻害剤は、抗体、生物学的活性核酸又は低分子量化合物、例えばペプチド又は非ペプチド有機化合物であってよい。
【００２１】
有利な態様では、阻害剤は、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド、例えばＧＡＳ６に対する抗体である。用語"抗体"とは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、特にキメラ又はヒト化モノクローナル抗体又はヒト抗体である。更に、この用語は抗体フラグメント、例えばタンパク質分解フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）２フラグメント又は組換えフラグメント、例えば単鎖抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖフラグメントから成る。前記の抗体又は抗体フラグメントの製造法は当業者に公知である。
【００２２】
更に有利な態様では、阻害剤は、生物学的活性核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成核酸類似物である。生物学的活性核酸の有利な例は、ＡＸＬ遺伝子又はＡＸＬリガンド遺伝子又はその転写物に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子である。更に有利な生物学的活性核酸の例は、ＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である。生物学的活性核酸は公知方法により、例えばウィルス性又は非ウィルス性遺伝子導入ベクターを使用することによって得られる。
【００２３】
更に有利な態様では、阻害剤はペプチド化合物、例えばアミノ酸４〜２５個の長さを有するペプチド、環状ペプチド、ペプチド誘導体又はこのようなペプチドから誘導されるペプチド模擬物である。代わりに、低分子量阻害剤は非ペプチド有機化合物、例えばＡＸＬキナーゼ活性の阻害剤であってよい。低分子量の阻害剤は、下記に更に詳説する方法で好適な化合物ライブラリーのスクリーニングにより得られる。
【００２４】
更に本発明のもう一つの態様は、薬理学的活性希釈剤、キャリア及び／又はアジュバントと一緒に、活性剤としてＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド（例えばＧＡＳ６、特に前記したようなＧＡＳ６−ＬＧからの残基）の阻害剤から成る医薬組成物に関する。この組成物は特に悪性疾患の浸潤度を減らしかつ／又は悪性疾患で転移生成を減少させるために好適である。活性剤として使用される阻害剤の種類に応じて、医薬組成物は液体、固体、例えば粉末、錠剤など、乳濁液又は懸濁液であってよい。組成物は、注入、経口、局所、直腸、鼻腔内又はその他の好適な方法により投与することができる。組成物中の活性剤の有効量は、化合物の種類及び治療すべき疾患に応じて過度の負担なしに当業者により決定することができる。
【００２５】
組成物は少なくとも１種のその他の活性剤から成ってよい。この少なくとも１種のその他の活性剤は、ＡＸＬ阻害剤と一緒に単一組成物中に処方することもできるし、ＡＸＬ阻害剤組成物と同時投与される別々の組成物中に処方することもできる。その他の活性剤は、細胞毒性又は細胞増殖抑制剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、抗腫瘍抗体又はその任意の組合せであってよい。
【００２６】
本発明のもう一つの態様は、少なくとも試験化合物がＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質又はそのリガンド（例えば前記したようなＧＡＳ６）又はタンパク質を抑制することができるかを判定することから成る悪性疾患の浸潤性の阻害剤の確認及び／又は特性付けの方法に関する。更に詳細には、方法は試験化合物がＡＸＬタンパク質と結合することができるか及び／又はＡＸＬ遺伝子発現を減少させることができるか判定することから成る。試験化合物は、化合物ライブラリー、例えばペプチド又は非ペプイドライブラリーから誘導することができ、これをＡＸＬ阻害活性に関してスクリーニングにかける。スクリーニング法は、細胞系アッセイシステム、例えばＡＸＬ遺伝子を過剰発現することができる細胞を使用するシステムの使用から成ってよい。付加的にか又は代わりに、方法は無細胞系アッセイシステムの使用から成ってもよく、その際、試験化合物のタンパク質又はそのフラグメントとの結合を判定するために、試験化合物を実質的に精製したＡＸＬタンパク質又はそのフラグメントと接触させる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、マトリゲル−マトリックスで培養した正常及び乳癌（ＢＣ）細胞系の形態学（３Ｄ伸展）を表す図である
【図２】図２は、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる乳癌細胞系の分類を表す図である
【図３Ａ】図３Ａは、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類を表す図である
【図３Ｂ】図３Ｂは、公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類を表す図である
【図４】図４は、選択した識別性に発現したＡＸＬ／ＧＡＳ遺伝子のノーザンブロット分析図である
【図５Ａ】図５Ａは、マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学を表す図である
【図５Ｂ】図５Ｂは、マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学を表す図である
【図６Ａ】図６Ａは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動を表す図である
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用を表す図である
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用を表す図である
【図８】図８は、ウェスタンブロット分析の図である
【図９】図９において、Ａは、ＳＦ１２６細胞クローンに関する腫瘍容量の分析補足データを表す図である。Ｂは、生体内多蛍光ビデオ顕微鏡法による図である。Ｃは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍の組織形態学像である。Ｄは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍の組織形態学像である。Ｅは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍の組織形態学像である。Ｆは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍の組織形態学像である。Ｇは、蛍光顕微鏡図である。Ｈは、蛍光及び位相差顕微鏡による図である
【図１０】図１０において、Ａは、ＳＦ１２６細胞クローンのＭＴＴ増殖アッセイを表す図である。Ｂ及びＣは、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローンによる多細胞凝集体形成図である。Ｄは、ＳＦ１２６細胞クローンの遊走性の図である。Ｅ及びＦは、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍細胞スフェロイド（Ｅ）又はＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイド（Ｆ）の４８時間対比による腫瘍細胞浸潤の分析図である
【図１１】図１１において、Ａは、脳中にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の定位移植後の成長したヌードマウスの生存曲線である。ＢからＥは隣接脳組織中への瀰漫性腫瘍細胞浸潤を示す図である
【００２８】
更に本発明を下記図及び実施例につき詳説する。
【００２９】
第１図：マトリゲル−マトリックスで培養した正常及び乳癌（ＢＣ）細胞系の形態学（３Ｄ伸展）。
【００３０】
細胞をマトリゲル層上で７〜１４日間培養した。３つの基本的形態学を表す写真は指示したＢＣ細胞系を表す。倍率は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＣＦ１０Ａに関しては×１００であった。マトリゲル上の細胞増殖の形態学測定は前記したようにして実施した（１０、１１、１２）。簡単には、培地５０μｌ中に再懸濁させた細胞（細胞５０００個／９６ウェルプレートのウェル）を−ＲＰＭＡ基礎培地塩中６ｍｇ／ｍｌに希釈したマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）７０μｌから成る前もって調整したマトリゲルコーチング上で培養した。その上で重合後、マトリゲル（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えた。コロニー伸展を実験の間中モニターし、ＯｐｅｎＬａｂ（ＵＫ）デジタルカメラを装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ３５顕微鏡を用いて７〜１４日目に撮影した。各細胞系の名前を示す。
【００３１】
第２図：公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる乳癌細胞系の分類。弱浸潤性対高浸潤性ＢＣ細胞系における通常の遺伝子発現変化（クラスターＡＸＬ）。
遺伝子発現を"材料及び方法"で記載したように、各々指示した細胞系からのＲＮＡのｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション（２部の標本）により測定した。２２種の選択した遺伝子は少なくとも７５％の弱浸潤性ＢＣ細胞系、高浸潤性ＢＣ細胞系（赤及び緑バー）又は両方とも２倍より大きい中央倍率変化で、識別性に発現した。ＭＣＦ１０Ａに関する遺伝子発現のレベルを、クラスターの下部キー中に示した色及びシャドウで表す。各色調は、尺度の下の数により挟まれた範囲の全ての値を包含する。ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ（第３表参照）及び各遺伝子の説明並びに自作アレイ膜上のスポット場所も得られる（遺伝子の別の第２及び３表参照）。確認試験は、アレイと同じＲＮＡ標本を用いて、ノーザン（ＡＸＬ及びＧＡＳ６）又はＲＴ−ＰＣＲ分析（ＨＥＲ２発現及び増幅に関してはＲｏｃｈｅ ｓｙｓｔｅｍ、未記載）により行った。他に記載のない限り、アレイとその他の方法間の一致は、大多数の試料に相関して、２倍以内であった：少なくとも１０倍の、その他の方法論による倍率変化を過小評価するアレイの定性的一致。浸潤性及び弱浸潤性細胞系の位置はカラーバーにより示した。
【００３２】
第３Ａ、Ｂ図：公知キナーゼ及びホスファターゼの遺伝子発現プロファイルによる原発性乳癌及びそれらの細胞系の分類。
遺伝子発現を"材料及び方法"で記載したように、指示した各細胞系及び原発性腫瘍からのＲＮＡのｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション（二部の標本）により測定した。２６種の選択遺伝子は少なくとも７５％の弱浸潤性ＢＣ細胞系、高浸潤性ＢＣ細胞系（赤及び緑バー）又は両方とも２倍より大きい中央倍率変化で、特異的に発現した。正常な乳房組織（２つの混合）に関する遺伝子発現レベルは、クラスターの下部キー中に示した色及びシャドウで表す。各色調は、尺度の下の数により挟まれた範囲の全ての値を包含する。ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ（第３表参照）及び各遺伝子の説明並びに自作アレイ膜上のスポット位置も得られる。確認試験は、アレイで使用したと同じＲＮＡ標本を用いて、ノーザン（ＡＸＬ及びＧＡＳ６、原発性腫瘍に関しては未記載）又はＲＴ−ＰＣＲ分析（ＨＥＲ２発現及び増幅に関してのみＲｏｃｈｅ ｓｙｓｔｅｍ、未記載）により行った。他に記載のない限り、アレイとその他の方法間の一致は、大多数の試料に相関して、２倍以内であった；少なくとも１０倍の、その他の方法論による倍率変化を過小評価するアレイの定性的一致。
【００３３】
Ａ．正常乳房組織、原発性腫瘍、正常乳房及び癌細胞系の教師なしアレイ分析。ＡＸＬクラスターは１８種の遺伝子を包含し（発現相関は０．５１又は有意）、これらの遺伝子の大部分は乳癌細胞系で確認された（第２図参照）。
【００３４】
Ｂ．コンセンサス浸潤性遺伝子のみを使用する原発性腫瘍及び乳癌細胞系の分類。全ての原発性腫瘍及びＢＣ細胞系を２６種の遺伝子（ＡＸＬクラスターに属す）を使用してクラスター分析した。原発性腫瘍及びＢＣ細胞系は識別され、高浸潤性（ＨＩ）ＢＣ細胞系は同じツリーに属す（赤いバーで示したＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び原発性腫瘍ＢＣ１５１を除く）。
【００３５】
第４図：選択した識別性に発現したＡＸＬ／ＧＡＳ遺伝子のノーザンブロット分析
指示した各細胞系から単離したｍＲＮＡ（１５μｇ／レーン）をｃＤＮＡアレイ上にデポジットしたフラグメントに相応するプローブを用いるハイブリダイゼーションによって指名遺伝子の発現に関して分析した。Ａｃ７４５（正常乳房上皮細胞）に相応する各ｍＲＮＡに関する発現レベルを各帯の下に記録する。主特異的帯に相応する大きさ（右）は各ｍＲＮＡに関して文献で報告されたものと一致する。同じフィルターを用いてプローブし、これらの分析用にプローブした。パネル：Ａ−発現ＡＸＬ、Ｂ−ＧＡＳ及びＣ−β−アクチンｍＲＮＡ。β−アクチンのレベルを代表的フィルター用の試料荷重用の対照として表す。ｍＲＮＡは２種の別々に増殖した細胞培養基から調製し、指示遺伝子の発現レベルに関して試験した。
【００３６】
第５Ａ及びＢ：マトリゲル上で培養した場合のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｍｏｃｋ）又は安定発現ｄｎＡＸＬの形態学。
細胞はマトリゲル層上で７〜１４日間培養した。
Ａ．３つの基本的形態学を表す写真は指示したＢＣ細胞系を表す。Ｂ．傷アッセイ（Ｗｏｕｎｄ ａｓｓａｙ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓｍｏｃｋ及びｄｎＡＸＬ突然変異体クローン２に関して表す。位置及び処理は図に記載する。倍率は×１００であった。
【００３７】
第６Ａ、Ｂ及びＣ図：抗Ｅｘ−ＡＸＬ抗体を用いて処理後のＢＣ細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ｍｏｃｋ、安定発現ｄｎＡＸＬの３Ｄ増殖、遊走性及び浸潤性挙動。
Ａ．細胞はマトリゲル層上で７〜１４日間培養した（第１図の説明参照）。処理しなかったか又は指示したように抗体によって処理した。
【００３８】
Ｂ．指示したＢＣ細胞系の浸潤性活性を、"材料及び方法"に記載した方法により、マトリゲル（３〜４ｍｇ／ｍｌ）塗布したフィルターを透過した細胞数を数えることによってＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中で測定した。データは３点を有する少なくとも２個の個々の実験からの平均である。エラーバー。
【００３９】
Ｃ．遊走能は、浸潤性分析と同じ条件下でマトリゲルなしのフィルターを用いて平行なｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒ中で分析した。結果は、三点を有する少なくとも２個の実験の平均である（エラーバー）。細胞遊走もＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中でマトリゲルバリアーの不在下で評価した。予想通り、細胞系ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３５Ｓ及びＢＴ５４９は弱浸潤性細胞系ＭＣＦ７より運動性がかなり高い（未記載）。
【００４０】
第７図：ＭＣＦ７乳癌細胞に対するＡＸＬ ｗｔトランスフェクションの作用
Ａ．ＡＸＬ ｗｔ感染及び強制過剰発現の形態学的作用。ＭＣＦ７細胞におけるＡＸＬ ｗｔの過剰発現は、緊密な丸石形細胞から多数の突出拡張部を有する不規則形細胞への変化を生じる。
【００４１】
Ｂ．細胞浸潤に対するＡＸＬ ｗｔ感染の作用を前記したようにＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒアッセイで分析した（材料及び方法参照）。クローンＭＣＦ７−ＡＸＬ ｗｔは空のベクター感染細胞より浸潤性が３０倍であった。
【００４２】
合計２００００個の細胞をＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ上に３６〜４８時間播いた（フィルター孔８μｍ、濃度３〜４ｍｇ／ｍｌでマトリゲルマトリクッスで覆った）。Ａ ＸＬ ｗｔで感染させた細胞は空ベクター対照又はｄｎＡＸＬ突然変異体形より遙かに早く浸潤する。
【００４３】
第８図．
Ａ．対照ベクターを発現するＳＦ１２６神経膠腫細胞クローン（ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ）、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ）及びＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ）のウェスタンブロット分析。血清−減少細胞を処理しないまま（−）か又は２００μｇ／ｍｌＧａｓ６で処理した（＋）。溶解物を抗ホスホチロシン血清（上部パネル）又はヒトＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインに対する抗体（下の列）でブロットした。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞と比較して、分析により、各々ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞で増加（約３０％）及び全廃のＧａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬ媒介シグナリングが実証された。Ｂ〜Ｄ。ＳＦ１２６細胞（Ｂ）におけるＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形の発現は、ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２５−ＵＦＯ−ＷＴ細胞（Ｂ及びＣ）に比べた場合に、それらの形態学を変化させた。
【００４４】
第９図．
Ａ．ＳＦ１２６細胞クローンに関する腫瘍容量の分析。腫瘍細胞をヌードマウス（ｎ＝４群当たりの動物）中に皮下に移植し、１４日間追跡した。平均±ＳＥＭ値を表す。＊ｐ＜０．０５対ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞。Ｂ．生体内多蛍光ビデオ顕微鏡法により評価した、ＳＦ１２６細胞クローンをヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ中に移植後の腫瘍面積の定量的分析（左パネル）及び機能性血管密度（右パネル）（ｎ＝４、群当たりの動物）。平均±ＳＤ値を表す。統計分析をＡＮＯＶＡ、次いで適切な事後検定（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）により群間の個別比較を実施した；＊ｐ＜０．０５対ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞。Ｃ及びＤ．腫瘍容量の差異を示すＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍（Ｃ）及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍（Ｄ）の代表的組織形態学像。バーは１ｍｍを表す。Ｈ＆Ｅ染色。Ｅ及びＦ．腫瘍浸潤の差異を示すＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍（Ｅ）及びＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍（Ｆ）の代表的組織形態学像。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍は、隣接皮膚筋肉及び皮下組織を広範囲に浸潤した（Ｅ）（矢印は破壊された筋肉層の残遺物を示す）が、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞浸潤はほぼ完全に抑制された（Ｆ）。（Ｆ）中で筋肉層の構造は保持された。バーは１００μｍを表す。Ｈ＆Ｅ染色。Ｈ及びＩ．蛍光顕微鏡を単独（Ｇ）及び位相差と組み合わせて（Ｈ）、隣接組織層中へのＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞の浸潤の不在を確認。腫瘍細胞は移植の前にＤｉｌで標識付けした。バーは１００μｍを表す。全試料は、ヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ中へ移植後２１日目に摘出した。ｔ、腫瘍塊；ｍ、皮膚筋肉層；ｓｃ、皮下組織。ＳＦ１２６−ｍｏｃ、対照；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型を発現する細胞；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ、ＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異体形を発現する細胞。
【００４５】
第１０図．
Ａ．ＳＦ１２６細胞クローンのＭＴＴ増殖アッセイ。Ｇａｓ６（２００μｇ／ｍｌ）の不在及び存在下。細胞は左未処理（−Ｇａｓ６）又は２００μｇ／ｍｌのＧａｓ６で処理した（＋Ｇａｓ６）。分析は培養４８時間後に実施した。増殖率は刺激しなかったＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞に関して表す。平均値を表す。Ｂ及びＣ．ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制に付随する変化のない凝集能を実証するＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローンによる多細胞凝集体形成。Ｄ．７日間の観察期間中のＳＦ１２６細胞クローンの遊走性。遊走面積を画像分析システムを用いて面積測定法により分析した。平均±ＳＤ値を表す。統計分析は、ＡＮＯＶＡ、次いで対応のないスチューデントｔ検定を使用して行った。＊ｐ＜０，０５対ＳＦ１２６−ｍｏｃ。Ｅ及びＦ。胎児ラット脳凝集体を用いるＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＷＴ腫瘍細胞スフェロイド（Ｅ）又はＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイド（Ｆ）の４８時間対比による腫瘍細胞浸潤の分析。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ腫瘍細胞スフェロイドと脳細胞凝集体の間の輪郭の鮮明な境界は、ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制による浸潤性の欠如を示す。Ｂ，脳細胞凝集体；Ｓ、腫瘍スフェロイド、ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ、対照；ＳＦ−１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ、ＵＦＯ／ＡＸＬの野生型を発現する細胞；ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ、ＵＦＯ／ＡＸＬの切端優性阻害型突然変異形を発現する細胞。
【００４６】
第１１図．
Ａ．脳中にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の定位移植後の成長したヌードマウスの生存曲線（ｎ＝４、群当たりの動物）。神経欠損を発現するか又は最初の体重の＞３０％減少したら直ちに動物を殺した。Ｂ〜Ｅ．隣接脳組織中への瀰漫性腫瘍細胞浸潤を示す、脳中への移植後のＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍の組織形態学（Ｂ）。腫瘍細胞は、血管周囲間隙（Ｃ）、白質路に添って（Ｄ）及び心室系の壁に添って（Ｅ）浸潤した。Ｈ＆Ｅ染色、バーは１００μｍを表す。
【実施例】
【００４７】
Ａ．乳癌及び前立腺癌試験
１．材料及び方法
１．１．腫瘍試料及び細胞系
乳癌（ＢＣ）及びその他の腫瘍の種類及び大きさに関する選択の偏向を排除するために、試験すべきＲＮＡは任意抽出試料から調製した。原発性浸潤性乳癌の試料は手術を受ける患者７２人から集めた。外科切除後、腫瘍をマクロ解剖し：切片を病理学的診断用に取り出し、隣接片をｍＲＮＡ抽出用の液体窒素中で素早く凍結させた。診断時の患者の平均年齢は５５才（２９〜８１才の範囲）であり、大多数は閉経後であった。腫瘍は、乳癌のＷＨＯ組織学的分類法により分類した：管癌、小葉癌、管小葉混合癌及び髄様癌。正常乳房ｍＲＮＡから得てプールした"正常"ｃＤＮＡを対照及び標準化用に使用した。前記"正常"ｃＤＮＡ中のプロテインキナーゼ（ＰＫ）及びホスファターゼ（ＰＰ）の発現プロファイルを別々に評価した。本試験に２１種のＢＣ及び３種の正常乳房上皮細胞系を含めた。乳癌細胞系の供給源は下記の通りであった：ＢＴ−２０，ＢＴ−４７４、ＢＴ−４８３、ＢＴ−４５９、Ｄｕ−４４７５、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、−１５７、−１７５、−３６１、−４３６、−４５３、−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３及びＺＲ−７５−１、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−３０はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ＭＣＦ−７、クローン及びＢＣ細胞系ＤＡＬはＳＵＧＥＮ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。ＨＢＬ−１００細胞系はＡＴＣＣからのものであった。この細胞系は正常組織からのものであったが、縦列統合ＳＶ−４０配列を有する（９）。培養はグルタミン６ｍＭ、ヒトインシュリン１０μｇ／ｍｌ及び１０％の胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＣＳＬ、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、オーストラリア）中で対数増殖で維持した。正常乳房上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ１０Ｔ−２４及びＭＣＦ１０ｎｅｏはＤｒ．Ｍ．Ｇｉｌｌｅｓ（Ａｒｉｚｏｎａ Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ）から得た。Ａｃ７４５はＤｒ．Ｂ．Ｓｔａｍｐｆｅｒから入手し、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ、インシュリン、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、コレラ毒素、ビタミン及び抗生物質のコンディション培地を補充したＤＭＥＭ Ｆ１２培地で増殖させた。
【００４８】
細胞はマイコプラズマ汚染してなかった。
【００４９】
１．２．ＲＮＡ及びＤＮＡの単離及び分別
全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡをグアニジニウムイソチオシアネート溶液（ＧＴＳ緩衝剤：４Ｍグアニジニウムイソチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．０、０．５％サルコシル及び０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）中で溶解、次いでフェノール−クロロホルム抽出により同じ細胞ペレットから単離した。全ＲＮＡを修正を加えた標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋその他［１９８９］）を用いて単離した。ＤＮＡを集め、同じ容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出した。ＲＮＡ及びＤＮＡを各細胞系から最小３つの別々の場合で単離した。
【００５０】
全及びｍＲＮＡインテグリティ及びｃＤＮＡ複合体を、特異的プローブを用いてアガロースゲル電気泳動法及びノーザンブロットによりコントロールした。ｍＲＮＡ抽出をＯｌｉｇｏ Ｔｅｘ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて行った。細胞ペレットを溶解／結合緩衝剤中に再懸濁させ、簡単にボルテックス混合し、２１Ｇニードルを３回通し、スピンライセイトカラムに入れ、１３０００ｇで３分間遠心分離した。次いで溶解物をＯｌｉｇｏ−ｄＴセルロース（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）と静かに攪拌し、前もって湿らせたＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｕａｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に入れた。ｍＲＮＡを前もって温めた（６５℃）溶離緩衝剤で溶離する前に、カラムを溶解／結合緩衝剤で３回洗浄し、洗浄緩衝剤で４回洗浄した。ｍＲＮＡの量をＯＤ２６０を用いて測定した。
【００５１】
１．３．ｃＤＮＡアレイ標本
ＰＫ及びＰＰ遺伝子発現をナイロンフィルターアレイ上で放射性標的を用いてハイブリダイゼーションにより分析した（ｃＤＮＡ）。アレイはキナーゼ、ホスファターゼ及びその他のシグナリングプロテインをコードする６４５種の遺伝子：リガンド、アダプター、転写因子、メタロプロテイナーゼ／ＡＤＡＭ、アポトーシス関与遺伝子及び１１種のハウスキーピング遺伝子を含有した（リストはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ 又は ｕｌｌｒｉｃｈ＠ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅで得られる）。これらのアイデンティティーをプラスミドＤＮＡのシークエンス法により実証し、ＧｅｎＢａｎｋ配列情報と比較した。ＰＫ及びＰＰのアイデンティティーはナイロンフィルター上に、１個又は２部、スポットされた全クローンに関して合致した。標準化目的用に、ＧＦＰ遺伝をゲノム及びベクターＤＮＡと同様に２回スポットした。プラスミドの精製はプラスミド精製キッット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて行った。
【００５２】
１．４．ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
フィルターを先ず０．５％ＳＤＳ中で攪拌しながら５分間予備洗浄した。プレハイブリダイゼーション溶液１０ｍｌ中には、酵母ｔＲＮＡが含まれていた。ヒトＣｏｔ−１ＤＮＡ（ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ法）をハイブリダイゼーション工程で使用したが、これはＲｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ（Ｈｙｂａｉｄ Ｉｎｃ．）中で１６時間回転炉中で６５℃で行った。標識付けしたプローブを１００℃で１０分間変性し、次いで直ちにハイブリダイゼーション混合物中に入れ、これを更に１８時間６５℃で培養した。１８時間後、ハイブリダイゼーション混合物を捨て、アレイを２塩化ナトリウム：クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝剤、０．２％ＳＤＳ中で４２℃で２０分間連続的に回転させながらインキュベーター中で２回洗浄した。３回めの洗浄をプラスチック箱中で０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５〜６０分間６５℃で水平に振りながら行った。３回目の洗浄後、フィルターを湿らせた１枚のＷｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ上に載せ、サランラップで覆った。次いでアレイをＰｈｏｔｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｃｒｅｅｎを有するｉｍａｇｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｆｕｊｉ、日本）に入れ、２日間露光した。
【００５３】
１．５．画像取得及び分析
露光した蛍光画像記憶スクリーンをＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｆｕｊｉ）で解像度５０ミクロンでスキャンし、ＭａｃＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ）を用いて視覚化した。画像をソフトウェアプロトコルにより分析するためにＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ Ｖ（カナダ）に送った。個々のエレメントの内部参照データベースへのマッピングは、全ゲノム対照ＤＮＡ、ＧＦＰ及びベクターを表す合計４つの対照要素を用いてソフトウェアベースの基板上に画像を整列させることによって行った。標準化は、各データ要素の未処理強度を１００（この値は、アレイ開発で我々が実施した多数の異なるハイブリダイゼーションから導き出した、全要素の平均未処理強度である）に分けた全ベクター要素の平均未処理強度と等しい標準化率を掛けることによって行った。標準化した画像のソフトウェアによる対比較を、前記したように正常乳房ＲＮＡ、不死（新生物発生前の）乳房上皮細胞系から得てプールした"正常"ｃＤＮＡから取った標識付けｃＤＮＡのハイブリダイゼーションから得た画像に対して行った。発現レベルの変化を標準化した強度を用いて計算し、比（プラスの比は転写レベルの増加を示し、マイナスの比は転写レベルの減少を示した）として表し、Ｓｃａｔｔｅｒ−ｂｌｏｔグラフィック及びＴｒｅｅＶｉｅｗ ｐｒｏｇｒａｍにより視覚化した（１３〜１６）。
【００５４】
１．６．アレイデータ分析
結果を分析する前に、重複スポット又は２つの別々のアレイ上の同じｃＤＮＡを用いた１つのハイブリダイゼーション又は同じＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いて２つの別々のハイブリダイゼーションを比較することによって、実験の再現性を実証した。各場合に、結果は各々相関係数０．９６、０．９８及び０．９８での良好な再現性を示した（データは未記載）。再現性は２倍発現差を有意な差異とみなすのに十分であった。二次分析はエクセル及び統計ソフトウェアを用いて行った。腫瘍パラメーターと相関させた発現レベルを有する遺伝子の探査を数回の連続工程で行った。先ず、遺伝子を重要な要因により相違する腫瘍の２つのサブグループにおけるそれらの中央発現レベルを比較することによって検出した。我々は平均値よりも中央値を用いた。それは、多くの遺伝子で発現レベルの可変性が高く、その結果、標準偏差で発現レベルが平均値と同じか又は上位となり平均との比較が不可能となるからである。第２に、これらの検出した遺伝子を図面で視覚により調べ、最後に、相関を確認すると確証されるものに対して適正な統計分析を行った。ＥＲ−陽性腫瘍及びＥＲ−陰性腫瘍間のＨＥＲ２発現の比較を、Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｎｅｙ試験を用いて検証した。相関係数を使用して遺伝子発現レベルを含まれた腋窩リンパ節の数と比較した。
【００５５】
１．７．クラスター分析
この試験からのデータを記載したように分析し、表示した（１３〜１６）。簡単には、階層的クラスタリングアルゴリズムにより結果の表を作成するが、その際要因／アレイのｃＤＮＡ（特異的遺伝子を表す）を遺伝子発現のパターンの類似性に基づいて一緒に分類する。同じアルゴリズムを適用して、実験試料（即ち細胞系及び腫瘍）をそれらの遺伝子発現の全般的パターンの類似性に従ってクラスターする。こうして整理したデータ表を着色画像として図示する。垂直軸に添って、分析された遺伝子はクラスタリングアルゴリズムによる順序付けて配列されるので、最も類似した発現パターンを有する遺伝子は相互に隣接している。水平軸に添って、実験試料は、全遺伝子中で最も類似した発現パターンを有するようなものが相互に隣接しているように配列される。この表の画像の各細胞／区画の色は、該当する各遺伝子の測定した発現比を表す。色彩度は測定した遺伝子発現比の強度に正比例し、最も明るい赤区画は最高Ｔ／Ｎ比（即ち＞８倍の差異）を有し、最も明るい緑区画は最低のＴ／Ｎ比、黒区画は約１の比を有し、灰色の区画は不十分なデータ品質を示す。
【００５６】
１．８．ノーザンブロットによるＲＮＡ分析
我々は幾つかの乳癌標本及び全乳癌細胞系における発現ＡＸＬ及びＧＡＳ６遺伝子の検出用にノーザンブロット分析の標準プロトコルを使用した。負荷ＲＮＡ試料をヒトβ−アクチンプローブを用いるフィルターの再ハイブリダイゼーションにより実証した。
【００５７】
１．９．化学浸潤及び遊走分析
化学浸潤分析は、Ａｌｂｉｎｉその他の方法を修正して使用して行った（１０）。トリプシン化後、細胞（２００００）をＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中のマトリゲル塗布（４．０ｍｇ／ｍｌの１５０μｌ）８μｍポリプロピレンフィルターインサートに載せた（Ｂｉｏｃｏａｔ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ ｏｒ Ｎｕｎｃ １０ｍｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔｓ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）。下部チェンバーは、Ａｌｂｉｎｉその他により記載されているようにして製造した０．５５ｍｌのＮＩＨ３Ｔ３−調整培地又は幾つかの細胞系に関しては通常増殖培地を含有した。
【００５８】
ＡＴＣＣから得たＢＣ細胞系をトリプシン化し、遠心分離し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中に細胞４×１０５個／ｍｌで再懸濁させた。残りの細胞系はそれらの標準増殖培地に再懸濁させた。
【００５９】
２０〜３６時間後に、インサートの残っている細胞を綿棒で除去し、フィルター底部の細胞を異なるプロトコルを用いて数えた：Ｄｉｆｆ−ｑｕｉｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ、ＩＬ）中に固定し、室温（ＲＴ）で１分間沃化プロピジウム（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）で染色する前に、ＲＮａｓｅＡで処理した（５０μｇ／ｍｌで３７℃で２０分間）。乾燥させたフィルターを除去し、Ｃｙｔｏｓｅａｌ ６０ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）を用いてスライド上に載せた。フィルター上の個々のヨウ化プロピジウム染色核を計数した。結果はトリプシン化及び細胞計数を用いて得られた。各実験で３部作った試料を計数した。特定範囲外の値は平均浸潤活性の計算から除いた。
【００６０】
抗体の存在における浸潤アッセイ用に、細胞をマトリゲル上に播き、接着したら、指示抗体を培地に加えた。抗体はアッセイの全期間上部チェンバー中に存在した；アッセイ終了時に、上部チェンバーの細胞増殖率をトリパンブルーで評価した。遊走活性は、浸潤アッセイで記載した方法に従って測定したが、但しその際、細胞はＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中で塗布してない８μｍ孔のポリプロピレンフィルター上に載せた。
【００６１】
１．１０．マトリゲル増殖
マトリゲル上で増殖した細胞の形態学の測定は前記したようにして行った（１０）。簡単には、培地５０μｌ中に再懸濁させた細胞（細胞５０００個／９６ウェルプレートのウェル）を−ＲＰＭＡ基礎培地塩中６．０ｍｇ／ｍｌに希釈したマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）７０μｌから成る前もって調製したマトリゲルコーチング上で培養した。これらの上で重合後、希釈したマトリゲル（１．０ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを加えた。コロニー伸展を実験の間中モニターし、ＯｐｅｎＬａｂ（ＵＫ）デジタルカメラを装備したＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ３５顕微鏡を用いて７〜１４日目に撮影した。
【００６２】
１．１１．傷アッセイ
一夜断餌後、融合細胞単分子膜上にプラスチックチップで傷を付けた。写真撮影（位相差）する前に、ＭＤＡ−ＭＢ−３４５Ｓ−ｍｏｃｋ及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５−ｄｎＡＸＬ、クローン２細胞を培地（１０％ＦＣＳ）及びＧＡＳ６（２００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地で１２、２４及び４８時間処理した。細胞遊走を定量するために、傷の３個の無作為選択部分（長さ１ｍｍ）を倍率４０Ｘで写真撮影した；平均傷幅を２０μｍ毎に測定し、傷閉合平均％を計算した。試料当たり３つの別個の傷を調べ、傷閉合平均％を計算した。
【００６３】
１．１２．抗体を用いる細胞処理
乳癌細胞（３Ｄ増殖アッセイ用に５０００個及びＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ中での浸潤アッセイ用に２００００個）を抗体５０μｌ及び細胞懸濁液５００μｌを使用してＥｘ−ＡＸＬポリクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ）により処理した。細胞を抗体と一緒に室温で６０分間培養し、次いで室温でＰＢＳ中で洗浄した。細胞のプレート及び次の２４時間処理間隔は同じ濃度のＥｘ−ＡＸＬ抗体を用いて行った。
【００６４】
１．１３．ＢＣ細胞の組換えレトロウィルス感染
ウィルスのＡＸＬｗｔ及びｄｎ−ＡＸＬ突然変異形を修正を加えた標準プロトコル（３１）に従って得た。簡単には、ｐＬＸＳＮ−ＡＸＬｗｔ及びｐＬＸＳＮ−ｄｎＡＸＬをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ及びＮｏｔｌ／Ｘｂａｌ位置経由でクローン化した。
【００６５】
パッケージング細胞系Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａを燐酸カルシウムを用いてこれらベクターで感染させた。感染したＰｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞の上澄液を集め、０．４５μｍフィルターで濾過した。ヒト癌細胞系の感染用に、細胞をウィルス上澄み液と一緒に２４時間培養した。４８時間後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ１４８を含有する培地と取り換えた。更に選別するために、細胞をＧ４１８と一緒に１４日間培養した。ポリクローナル及びモノクローナル細胞系は限定希釈により生成させた。ＡＸＬ発現をウェスタンブロット及びアレイ分析によりモニターした。ＡＸＬ ｗｔ及びｄｎ−ＡＸＬの同じ発現レベルを有するポリクローナル及び３つのモノクローナル細胞系を次の実験用に選択した。
【００６６】
１．１４．抗体
ＡＸＬ／ＵＦＯ特異性抗体は、ウサギをアミノ酸残基１−４１０（ＡＸＬ−Ｅｘ）を含有する組換えＧＳＴ−ＡＸＬ細胞外ドメイン融合タンパク質で免疫処理することによって産生した。組換えＧＳＴ−ＡＸＬ−Ｅｘタンパク質は感染したＨＥＫ２９３細胞（ベクターｐｃＤＮＡ３−ＧＳＴ）により安定的に分泌された。培地を集め、ＧＳＴ−ＡＸＬ−Ｅｘタンパク質を標準ＧＳＴ−ｔａｇプロトコル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて精製した。ＡＸＬ−Ｅｘポリクローナル抗体をＧＡＴ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティーカラムで部分的に精製した。
【００６７】
２．結果
本試験の目的は、乳癌攻撃性用の新しいマーカーを確認する目的で乳癌細胞中のプロテインキナ−ゼ、ホスファターゼ及びシグナリング遺伝子の発現プロフファイルを確立することであった。ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを使用して、１４の弱浸潤性、７の高浸潤性乳癌細胞系及び３つの正常乳房上皮細胞系の遺伝子発現プロファイルを分析した（第１表、図１、浸潤性ＢＣ細胞系及び対照の３Ｄ増殖）。
第１表：浸潤性のコンセンサスを発生させるために使用した乳癌細胞系の特徴
【表１】
【００６８】
【表２】
注釈：
ａ）試料起源及び病理学的評価情報はＡＴＣＣカタログから得た。ＰＴ、原発性腫瘍；ＰＥ、胸膜滲出液；Ｃａ、癌。
ｂ）腫瘍データはＡＴＣＣカタログ又は参照1７に報告されていた。
＋、無胸腺ヌードマウス又はＳＣＩＤマウスの異種移植片として産出された触診できる腫瘍；
−、非腫瘍形成性；ｍｅｔ、対照１８及び１９により報告されたような転移性細胞系。
ｃ）マトリゲル中で培養した細胞の形態学の記載及びＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ浸潤性アッセイにおけるそれらの活性は対照１０から得た。
【００６９】
遺伝子６５０個を含有するｃＤＮＡマイクロアレイ膜をこれらの試験で使用した。各浸潤性表現型に関する"浸潤性のコンセンサス"の定義を可能にする弱浸潤性と高浸潤性ＢＣ細胞間の遺伝子発現の差異を確認した（図２、クラスターＡＸＬ、相関＞０．７１）。高浸潤性ＢＣ細胞系（ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４１５、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ）はＡＸＬを過剰発現し、これらを弱浸潤性ＢＣ細胞系及び"正常"乳房上皮細胞と区別する特定の遺伝子発現プロファイルを示す。これらクラスターは浸潤性のマーカーとして既に公知である遺伝子を含有した（ＣＤ４４、ＶＩＭ、ＣＡＶ１，２及びＭＭＰｓ（参照２０〜２７））。これらの遺伝子の中には癌細胞浸潤性との関連があるとのみ考えられていたものもある（Ｍ−ＣＳＦ及びＥＰＨＡ２（参照２８〜３０）及び第２表）。クラスターのその他の遺伝子は癌細胞攻撃性と関連した遺伝子として初めて確認された：ＡＸＬ、ＧＡＳ、ＭＭＰ１４、Ａｄａｍ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２及び５、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＫ、Ｓ６ＫＩＩ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα及びＡｎｎｅｘｉｎ２。
【００７０】
顕著なことには、これらのＢＣ細胞系でエストロゲン受容体を発現したものは全くなかった（ＢＣ細胞系特徴に関して示されたように、第３図参照）。共発現遺伝子のクラスターＡＸＬは、原発性ＢＣ（第３図）及びその他の腫瘍及び癌細胞系（腎臓、前立腺及び神経芽膠腫）でも確認された（データ未記載）。浸潤性ＢＣ細胞系におけるＡＸＬ及びＧＡＳ遺伝子の発現は、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した（第４図）。
【００７１】
高浸潤性ＢＣ細胞系中で安定過剰発現されたＡＸＬ遺伝子（ｄｎＡＸＬ）の優性阻害型突然変異体は強力に、幾つかのＢＣ細胞系の浸潤性、遊走性及び生存度を抑制した：ＭＤＡ−Ｍｂ−４３５Ｓ、ＢＴ５４９及び部分的にＭＤＡ−ＭＢ−２３１（第５Ａ及びＢ図）。安定なｄｎ−ＡＸＬ発現を有するクローンは全て、非浸潤性又は弱浸潤性乳癌細胞系、例えばＭＣＦ７のように、マトリゲルマトリックス上で３Ｄ−増殖を有した。ｄｎ−ＡＸＬ発現は有意にＧＡＳ６シグナリングを抑制し、その結果ＧＡＳ処理でＡＸＬ燐酸化は減少又は欠如する。これらの細胞中のＥＲＫシグナリングも遮断された。
【００７２】
ＡＸＬの細胞外部分（アミノ酸残基１−４１０を含有する、Ｅｘ−ＡＸＬ）に対するポリクローナル抗体は細胞形態学を変え（第６Ａ図）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びＢＴ５４９ＢＣ細胞系の遊走及び浸潤に対して非常に強力な抑制活性を有する（第６Ｂ及びＣ図）。同じ結果が前立腺癌細胞系ＰＰＣ１を用いて得られた。更に、弱浸潤性ＢＣ細胞系ＭＣＦ７及び前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰで野生型（ｗｔ）ＡＸＬの過剰発現は高浸潤性表現型への形質転換を生じた。
【００７３】
Ｂ．神経膠芽腫試験
１．材料及び方法
１．１ ヒト神経膠腫
下記ヒト神経膠腫細胞をこの試験で使用した：Ｕ−１１８、Ｕ−１２４２、ＳＦ１２６、Ａ−１７２、Ｕ−３７３、Ｕ−１２４０、Ｔ−９８Ｇ、ＳＦ７６３及びＳＦ７６７。細胞は全て５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で１０％胎児ウシ血清（ＰＡＡ ＧｍｂＨ、Ｌｉｎｚ、オーストリア）中で３７℃で増殖させ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染料を用いてマイコプラズマ汚染に関して定期的に試験した。下記のように増殖培地（全てＧｉｂｃｏ、カースルスーエ、ドイツ）を使用した：Ｕ−１１８、Ｔ−９８Ｇ及びＳＦ７６３用にＤＭＥＭ；Ｕ−１２４２用にＭＥＭ、非必須アミノ酸（原料の１：１００希釈；Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ；ＳＦ−１２６、Ａ−１７２及びＵ３７３用にグルコース４．５ｇ／Ｌを有するＤＭＥＭ及びＵ−１２４０及びＳＦ７６７用にＭＥＭ。ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ標本中への腫瘍移植の前に、前記したように細胞をＤｉｌで染色した（参照３５）。
【００７４】
１．２ ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイ並びにそのハイブリダイゼーション法は前記で詳説した（参照３１）。アレイは８４のＲＴＫ及び３０のプロテインチロシンホスファターゼに相応する１２５のｃＤＮＡフラグメント＋対照ｃＤＮＡから成っていた。全ＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ及びｃＤＮＡプローブは前記したようにして産生した（対照３１）。ｃＤＮＡ３〜５μｌの標識付けは［３２−Ｐ］ｄＡＴＰの５０μＣｉの存在でＭｅｇａｐｒｉｍｅ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。プレハイブリダイゼーション溶液を５×ＳＳＣ、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、パン酵母ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）１００μｇ／ｍｌ及び標識付けしたｃＤＮＡプローブ（２〜５×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を含有するハイブリダイゼーション溶液と取り換え、６８℃で１６時間培養した。膜を厳しい条件下で洗浄した。ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ１０００；Ｆｕｊｉ）を使用してハイブリダイゼーションシグナルを定量した。各スロットの平均値を式：Ａ＝（ＡＢ−Ｂ）×１００／Ｂを用いて計算した［Ａ、最終容量；ＡＢ、各スロットシグナルの強度（ピクセル／ｍｍ２）；Ｂ、背景（ピクセル／ｍｍ２）］。ｃＤＮＡアレイの結果は、前記したようにＲＴ−ＰＣＲ分析により確認すべきであった（参照３１）。
【００７５】
１．３ 発現コントラクト及び安定細胞系の生成
ＡＸＬ用コード２．７ｋｂｐのｃＤＮＡシークエンスをレトロウィルスベクターｐＬＸＳＮのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限部位中にクローンした。優性阻害型変異体を１．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ／Ｆｓｐｌフラグメントを同じベクター中にサブクローンすることによって産生した。発現プラスミド及び空ベクターを燐酸カルシウム共沈殿法を用いてＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞中にトランスインフェクションした。組換えレトロウィルスを含有する上澄みをトランスインフェクション後２８時間ハーベストし、最終濃度８μｇ／ｍｌでポリブレンと混合し、サブコンフルエントＳＦ１２６細胞に３時間適用した。感染を同じプロデューサー細胞の新しい上澄みを用いて２回繰り返した。感染した細胞を１日後に通過させ、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて２週間選別した。モノクローナル細胞系をウェスタンブロット分析によりモニターしたようにＡＸＬの高発現用に選択した。
【００７６】
１．４免疫沈降法及びウェスタンブロット
細胞は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ１０μｇ／ｍｌを補充した１０ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ ＮａＦ中で溶解した。タンパク質濃度はマイクロＢＣＡプロテインアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）により測定した。ＡＸＬを全細胞タンパク質１．８ｍｇから、プロテインＡセファローズ懸濁液（ＣＬ−４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、ドイツ）３０μｌ及び抗−ＡＸＬポリクローナルウサギ血清（対照３６）３μｌを用いて一夜４℃で沈殿させた。沈殿をＨＮＴＧ緩衝剤（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄した。免疫沈殿又は全細胞タンパク質２００μｇ／レーンを還元試料緩衝剤と混合し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔｒａｎ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ，ドイツ）に移した。膜を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で０．２５％ゼラチンでブロックし、同じ緩衝剤中で１：５０００に希釈した抗ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０と一緒に一夜−４℃で培養した。二次抗体ヤギ抗マウスＨＲＰ（１：１００００、ＢｉｏＲａｄ）を室温で６０分間適応した。抗−ＡＸＬ（ポリクローナルウサギ血清。１：１０００）及びプロテインＡ−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ、１：４００００）で再プローブする前に、膜を５５℃で９０分間ストリッピングした。検出はＷｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ボストン）を用いて行った。
【００７７】
１．５ マウス
無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ；雄／雌）を特異的病原菌不含環境内部で飼育、維持し、６〜１０週の年齢で使用した。実験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの認証研究プロトコル及びガイドラインに従って行った。外科処理用にマウスをケタミン／キシラジンの皮下注射により麻酔した。
【００７８】
１．６ 皮下及び同所性異種移植片
神経膠腫異種移植片は１×１０６個のＣ６細胞（対照４４）のヌードマウス左腋腹中への注射により皮下で増殖させた。腫瘍増殖は移植後１４日までノギスを用いて評価した。腫瘍容量を（長さ×幅×高さ）／２として計算した。大脳内腫瘍細胞移植用に、ヌードマウスの頭を定位ネズミ頭ホルダー（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｒｏｄｅｎｔ ｈｅａｄ ｈｏｌｄｅｒ）に固定した。移植は、細胞５×１０５個を右線条体に定位に注射することによって行った。一つの実験群の動物が神経学的欠損を発現するか又は動物の体重が＞３０％減少したら直ちに、腫瘍増殖を比較するために、動物を殺した。
【００７９】
１．７ Ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒモデル
２枚の対照的チタン枠を動物の背面皮膚の襞に置き、皮膚の伸ばした二重層を挟み、１層の黄紋筋層、皮下組織及び表皮から成るｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒを作った。ガラスカバーガラスで覆った観察窓により、チェンバー内で増殖する腫瘍の微小血管系の生体内顕微鏡観察を繰り返し行うことができた。チェンバー製造２日後に、腫瘍細胞移植用にｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒのカバーガラスを一時的に取り除いた。動物はｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒによく耐え、睡眠及び食餌挙動において不快又は変化の徴候を示さなかった。
【００８０】
１．８ 生体内多蛍光顕微鏡法
生体内エピ蛍光ビデオ顕微鏡法を移植後２１日間に渡って実施した（対照３７、３８、３９）。神経膠腫細胞のＤｉｌ標識付けにより、隣接宿主組織からの腫瘍の詳細な描写並びに緑色光エピイルミネーション（５２０〜５７０ｎｍ）適用により個々の腫瘍細胞の確認が可能となった。ＦＩＴＣ結合デキストラン（ＭＷ＝１５００００；０．１ｍｌ静脈内）でコントラスト増強及び青色光エピイルミネーション（４５０〜４９０ｎｍ）の使用を適用して個々の血管を可視性にした。腫瘍増殖を、蛍光により標識付けした腫瘍塊により覆われた組織面積の測定により評価した。宿主及び腫瘍微小血管系の分析は、血管密度及び血管直径が含んだ（対照３７）。
【００８１】
１．９ 組織学
実験終了時に、神経膠腫含有ｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄ ｃｈａｍｂｅｒ標本及び脳を切開し、組織形態学分析用に液体窒素中で凍結した。切片をスタブに載せ、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）中に包埋し、液体Ｎ２で冷却した２−メチルブタン（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）中で凍結した。連続軸切片（５μｍ）を切断し、ゼラチンを前塗布したスライド上に載せた（Ｓｉｇｍａ）。切片を標準工程に従ってハリス・ヘマトキシリン及びエオシンＧ（Ｍｅｒｃｋ）で染色した。
【００８２】
１．１０ 増殖アッセイ
神経膠腫細胞系の増殖を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で評価した。細胞を９６ウェル組織培養プレート中で細胞３０００個／ウェルの濃度で播き、Ｇａｓ６（２００μｇ／ｍｌ）の不在又は存在で４８時間培養した。次いで細胞を、ＭＴＴ染料の着色ホルマザン生成物へのそれらの還元力を細胞増殖指数として検定した。
【００８３】
１．１１ 遊走性アッセイ
神経膠腫スフェロイドを細胞５×１０６個を培地中で１．０％Ｎｏｂｌｅ寒天（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を前もって下塗した７５ｃｍ２フラスコ中へ播くことにより産生した。培養中で７〜１０日後、３００μｍより小さい直径を有するスフェロイドを遊走性及び浸潤性試験用に選択した。神経膠腫スフェロイドを２４ウェルプレートの中央に置いた。スフェロイド外植片から遊走する腫瘍細胞により覆われた面積を細胞遊走性指数として使用した。各外植片の２つの直交直径を７日間に渡って位相差顕微鏡を用いて毎日測定し、腫瘍細胞により覆われた平均面積を計算した。遊走性アッセイは４回実施した。
【００８４】
１．１２ 浸潤性アッセイ
胎児ラット脳細胞凝集体を前記した標準化方法により産生した（対照４０）。簡単には、１８日の年齢のＢＤ ＩＸラット胎児を帝王切開により取り出した。脳を注意深く切開し、ミンチし、連続的にトリプシン化した。遠心分離後、細胞１×１０７個（培地に再懸濁）を２４ウェルプレートの寒天塗布ウェル中に播いた。再凝集２日後、スフェロイドを新しいウェルに移し（凝集体５〜７個／ウェル）、そこで１８〜２１日間成熟させた。その時間までに成熟脳凝集体は生成した。胎児ラット脳凝集体及び神経膠腫スフェロイドは、ｉｎ ｓｉｔｕで脳及び神経膠腫細胞に似ている標準化された原発性無血管脳及び腫瘍塊を表し、従って試験管内での神経膠腫細胞遊走及び血管に無関係な浸潤を調べるための好適なモデルとなる。浸潤性アッセイ用に、単一成熟脳凝集体（直径＝２５０〜３００μｍ）を寒天塗布９６ウェルプレート中に入れた。同じ大きさの単一神経膠腫スフェロイドを同じくウェル中へ移し、脳凝集体と接触させた。対比を各々２４時間及び４８時間培養し、その後ハーベストし、パラホルムアルデヒド中に固定し、準薄（ｓｅｍｉｔｈｉｎ）切片（２μｍ）の製造用にプラスチック樹脂中に包埋した。切片をトルイジンブルーで染色した。神経膠腫細胞浸潤工程を無傷のままのラット脳凝集体の量に関して評価した。浸潤性アッセイは４回行った。
【００８５】
１．１３ 統計
群間の差異を分析するために、群間の個々の比較用に、一元配置分析（ＡＮＯＶＡ）、次いで適切な事後試験（ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を実施した。ｐ＜０．０５の結果は有意であるとみなした。
【００８６】
２．結果
２．１
神経膠腫細胞生物学におけるＵＦＯ／ＡＸＬの関連性を調べるために、細胞内ＲＴＫドメインを欠くヒトＵＦＯ／ＡＸＬの切端ドメインネガティブ突然変異体をレトロウィルス発現系を用いてＳＦ１２６神経膠腫細胞（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ）中に導入した。空ベクターで感染させた細胞（ＳＦ１２６−ｍｏｃｋ）又はＵＦＯ／ＡＸＬのヒト野生型形（ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ）を対照として使用した。ヒトＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインに対する抗体を用いるウェスタンブロット法により、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞クローン中の野生型及び切端受容体の高発現レベルを確認した（図８Ａ低いパネル）。切端受容体の発現がＵＦＯ／ＡＸＬシグナル伝達を遮断するか否かを確認するために、そのリガンドＧａｓ６で刺激に次ぐＵＦＯ／ＡＸＬ受容体燐酸化を測定した（図８Ａトップレーン）。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞中で、中程度のベースラインシグナルが観察され、これはＧａｓ６刺激で増加した。ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ中でＧａｓ６−誘発シグナルが増加した。反対に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞中でベースライン及びＧａｓ６−誘発燐酸化はほぼ完全に抑制された。
【００８７】
ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの遮断は、標準培養条件下及びそのリガンド不在で、神経膠腫細胞形態学に著しい影響を有した。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞（図８Ｂ及びＣ）は多数の細胞間接触を有する伸張した紡錘形形態を示したが、ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞は丸い形態及び減少した細胞間接触が特徴的であった（図８Ｄ）。ＳＦ１２６−ＵＦＯ−ＤＮ細胞はまたプラスチックに対するその良好な接着性を失ったようであった。
【００８８】
２．２
腫瘍増殖に関するＵＦＯ／ＡＸＬの相関を調べるために、各クローンの細胞１×１０６個を大人のヌードマウスの腋腹中に皮下移植した。ＳＦ１２６−ｍｏｃ細胞に比較すると、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の腫瘍形成性は劇的に損なわれ、腫瘍増殖は９７％減少した（図９Ａ）。反対にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞では腫瘍増殖は僅かに促進された（図９Ａ）。生体内における神経膠腫細胞生物学におけるＵＦＯ／ＡＸＬの役割を更に詳細に検証するために、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞を大人のヌードマウスのｄｏｒｓａｌ ｓｋｉｎｆｏｌｄの透明なチェンバー中へ移植した。腫瘍細胞の蛍光標識付け及び蛍光血漿マーカーの全身投与により、このモデルは腫瘍増殖、腫瘍細胞挙動、腫瘍の腫瘍起因性血管形成及び腫瘍灌流を生体内多蛍光ビデオ顕微鏡により繰り返しかつ非観血的に評価することができる。この方法を用いて腫瘍増殖に関するＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの有意性を確認することができた。
【００８９】
ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍との比較で、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍の拡大は有意に抑制された（図９Ｂ）。ＵＦＯ／ＡＸＬが腫瘍増殖及び拡大に影響を与えうる機序の一つは、血管機能及び腫瘍への栄養血液供給のその調整である。この仮説は、Ｇａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬ媒介シグナリングが凝集カスケード並びに血管形成及び成熟を妨害することを示す最近の研究により支持される（参照４１、４２）。これを試験するために腫瘍機能性血管密度及び微小血管直径を腫瘍の腫瘍起因性血管形成及び腫瘍灌流のマーカーとして定量的に分析した。しかし、図９Ｂに図示したように、これらの分析はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍増殖の劇的な抑制に関する血管の説明（例えば抗腫瘍起因性血管形成、腫瘍血管血栓症による灌流不全）を支持することはできなかった。
【００９０】
腫瘍試料の組織形態学的分析は、ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングが神経膠腫細胞生物学で中心的役割を演じるという仮説を更に強調した。図９Ｃ及びＥで実証したように、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ腫瘍は、大きな硬い腫瘍塊並びに個々の腫瘍細胞による大規模な浸潤及び隣接する宿主組織（即ち筋肉及び皮下組織）の二次的破壊を特徴としていた。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍は遙かに小さく、周囲の宿主組織への浸潤がなかった（図９Ｄ及びＦ）。このＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍浸潤組織の欠如は更に、隣接組織内部のＤＩ−標識付けされたＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の欠如を実証する凍結した切片の蛍光及び位相差顕微鏡法により確認された（図９Ｇ及びＨ）。
【００９１】
２．３
ＵＦＯ／ＡＸＬ機能の遮断による腫瘍増殖の抑制の下にある機序を更に解明するために、試験管内の神経膠腫細胞挙動を分析した。ＭＴＴアッセイはＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞の増殖が標準培養条件下で、各々ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ細胞に比較して５０％及び３５％減少したことを実証した（図１０Ａ）。注目に値することには、この結果はＵＦＯ／ＡＸＬリガンドＧａｓ６を用いる刺激と無関係であったことであり、これはＧａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングが細胞分裂促進性作用を発揮しないという前記仮説を確認する。ＵＦＯ／ＡＸＬは細胞間接着を媒介すると指摘された（参照４３）ので、細胞の多細胞凝集体形成力を調べた。ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞は迅速にスフェロイドを形成した（図１０Ｂ）。それらの凝集力はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞中で減弱せず（図１０Ｃ）、これは細胞凝集がＵＦＯ／ＡＸＬの細胞外ドメインによってのみ媒介されることを確認する。次ぎに、神経膠腫細胞遊走を腫瘍スフェロイドを培養し、遊走する腫瘍細胞と最初のスフェロイドからの距離を測定することによってアドレスした。ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞が相当距離遊走したが、腫瘍細胞遊走性はＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞で非常に減少していた（図１０Ｄ）。細胞遊走性は腫瘍浸潤に必要不可欠であるので、ＳＦ１２６細胞クローンの浸潤性を腫瘍スフェロイドを胎児のラット脳細胞凝集体と対比させることによってアドレスした。共培養４８時間後、ＳＦ１２６−ｍｏｃ及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ細胞の両方が能凝集体を瀰漫性に浸潤した（図１０Ｅ）。対照的に、同じ時間後にＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍スフェロイドと脳細胞凝集体との間の明確な境界を観察することができ、これらの細胞が正常な脳組織中へ浸潤できなかったことを示す（図１０Ｆ）。
【００９２】
総合して、腫瘍異種移植片の組織形態学及び試験管内の結果は、ＵＦＯ／ＡＸＬが神経膠腫細胞の増殖、遊走及び浸潤性を有意に調整し、ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの抑制が腫瘍細胞増殖及び隣接組織中への浸潤の遮断により腫瘍拡大を抑制するという明白な証拠を示した。悪性神経膠腫の治療用の新しい標的となるＵＦＯ／ＡＸＬの能力を試験するために、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞及びＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ細胞を大人のヌードマウスの脳中へ移植し、それらの生存を評価した。神経学的欠損を発現するか又は最初の体重の＞３０％減少が見られたら直ちに動物を殺した。ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−Ｗｔ腫瘍は、全動物を急速な臨床的悪化により８日間以内に殺さざるをえなかっった攻撃的臨床過程を特徴とした（図１１Ａ）。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍を有する動物はある観察期間の間、症状なしにかつ体重減少なしに生存した（０日の体重＝２９±２ｇ対８日の体重＝２８±１ｇ）（図１１Ａ）。組織形態学的分析から、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＷＴ細胞は脳実質に瀰漫性に浸潤したが、硬い腫瘍塊の影響を有する間隙は中程度でしかなかったことが判明した（図１１Ｂ）。ここでヒト腫瘍細胞浸潤の典型が観察された：血管周囲の間隙に添って（図１１Ｃ）。白色路に添って（図１１Ｄ）及び脳質系の壁に添って（図１１Ｅ）。対照的に、ＳＦ１２６−Ｕｆｏ−ＤＮ腫瘍形成はどの動物でも確認することができなかった。
【００９３】
２．４ 総括
総合して、本分析の結果は、悪性脳腫瘍の生物学におけるＲＴＫ ＵＦＯ／ＡＸＬの新しい基本的役割を示す。所見は、ＵＦＯ／ＡＸＬが、ＥＧＦＲ又はＰＤＧＦＲ−αと比較可能な程度まで、有意数のヒト神経膠腫細胞系によって過剰発現されかつ神経膠腫増殖並びに神経膠腫浸潤を媒介することを示す。ＵＦＯ／ＡＸＬは神経膠腫浸潤に関与すると報告された最初のＲＴＫであり、従ってこれらの高攻撃性であり、しかも難治性の腫瘍を抑制するための新しい治療標的である。これはＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングの抑制が神経膠腫増殖を抑制し、正位移植による生存を伸ばすことを実証する本発明の結果により支持される。
【００９４】
ＵＦＯ／ＡＸＬの生物学的機能を調べるために、このヒト神経膠腫細胞のお互いの相互作用の複合力及びマトリックスを詳細に分析した。結果として、切端優性阻害型受容体突然変異体を発現させることによるＵＦＯ／ＡＸＬ機能の抑制が細胞の健康な脳組織中への遊走及び浸潤力をほぼ完全に抑制することを実証することができた。本実験で使用したＵＦＯ／ＡＸＬの突然変異体が細胞内ドメインを欠き、細胞外ドメインはなお機能的に無傷であることを特記すべきである。従って、ＵＦＯ／ＡＸＬは腫瘍細胞浸潤を単に受容体のマトリックスとの相互作用だけによって媒介するのではなく、むしろ複合シグナリングカスケード下流受容体を巻き込むことによって媒介する。更に、本結果は、ＵＦＯ／ＡＸＬが潜在的に再び細胞間及び細胞−マトリックス相互作用を調整することにより腫瘍細胞増殖に関与していることも示す。
【００９５】
中枢神経系は、ＵＦＯ／ＡＸＬ、そのリガンドＧａｓ６及び類似ＲＴＫ、例えばＴｙｒｏ３又はＭｅｒの顕著な発現を特徴とする。本試験の所見は、Ｇａｓ６／ＵＦＯ／ＡＸＬシグナリングがニューロン及び神経膠細胞の遊走及び誘導を調整する分子系の一部であるかもしれないことを示す。更に宿主及び腫瘍組織によるＵＦＯ／ＡＸＬ及びそのリガンドＧａｓ６の顕著な発現は、脳内部に起因する腫瘍の独特な浸潤力を更に解明する手がかりとなるかもしれない。
【００９６】
Ｃ．討論
単一遺伝子としてのＲＴＫ ＡＸＬが実験系で腫瘍転移を誘発するのに十分であるという事実は、転移表現型の取得が数種の遺伝及びエピ遺伝現象を含む多段工程であるという現行の見解と対比するので、意外である。
【００９７】
良性及び悪性腫瘍が抑制されてない状態で増殖する。しかし悪性腫瘍の細胞だけが周囲の組織に浸潤し、遠隔器官に移動する（転移する）。この攻撃性に関する分子ベースの解明から、良性から悪性への腫瘍の移行を阻止し、局所疾患を食い止める治療が導き出されるであろう。我々は、ＡＸＬ及びＧＡＳというタンパク質を浸潤性だけでなく、腫瘍細胞の生存及び運動−転移に必要な三組の特徴を調整する分子検問所における受容体−リガンド対として確認した。ｄｎ−ＡＸＬ／ＧＡＳ６複合体も腫瘍細胞抗アポプトーシス力を抑制する。
【００９８】
このデータは、血清の存在におけるＢＴ−５４９細胞のＧＡＳ治療（ｄｎ−ＡＸＬの安定発現）がＥＲＫ１／２ＭＡＰＫの活性化を誘発することができないことを示す。従って、このシグナリング経路はＡＸＬ抑制を効果的に遮断する。
【００９９】
総括すると、本データにより、ＡＸＬ／ＧＡＳが腫瘍細胞浸潤に影響を与えることによってヒトの癌で重要な役割を演じることが実証された。ＡＸＬタンパク質は癌の診断及び治療（抗浸潤性）の新しい標的である。例えば、癌細胞におけるｄｎＡＸＬの発現は浸潤及び転移発生を防止することができる。更にＡＸＬクラスターの遺伝子（第２表に列記）は原発性腫瘍、特に乳房、前立腺、腎臓の腫瘍及び神経膠芽腫における浸潤前段階発達の検出用の診断道具として使用することができる。
【０１００】
Ｄ．結論
１．ＢＣ細胞系、原発性腫瘍及び神経膠芽腫細胞のｃＤＮＡアレイ分析を使用して、"浸潤性のコンセンサス"（クラスターＡＸＬ）を確認した。この３２種の遺伝子から成る浸潤性のコンセンサスを使用して癌細胞及び原発性腫瘍の攻撃性を予言することができる。
【０１０１】
２．ＡＸＬの優性阻害型突然変異体（ｄｎ−ＡＸＬ）は、高浸潤性乳癌細胞系を強力に抑制し、それらの血清停止（アポトーシス）に対するそれらの感受性を増加させる。ＡＸＬの細胞外部分に対するポリクローナル抗体（アミノ酸残基１−４１０、Ｅｘ−ＡＸＬを含む）は治療した癌細胞の攻撃性を抑制することができる。
【０１０２】
３．単一遺伝子としてのＲＴＫ ＡＸＬは実験系で乳癌細胞浸潤を誘発するのに十分である（２及びモデル系ＢＣ−ＭＣＦ７−ｗｔＡＸＬ及び前立腺癌細胞系−ＬＮＣａＰ−ｗｔＡＸＬ）。この結果は、転移表現型の取得がいくつかの遺伝及びエピ遺伝現象を含む多段工程であるという現行の見解と対比する。
【０１０３】
４．ＰＴＫ ＡＸＬは、癌浸潤及び転移を引き起こす活動過多の細胞シグナリングの重要経路を標的とする"シグナル伝達治療"の治療戦略の有望な候補である。ｄｎ−ＡＸＬ突然変異体による及び／又は阻害抗体を用いる治療によるＡＸＬシグナリング機能の抑制は、副行又は代償性経路により迂回され得ない。
【０１０４】
５．腫瘍治療におけるＡＸＬ遺伝子発現の抑制は、遺伝子又は転写物レベルでのＡＸＬの抑制、例えば突然変異体の遺伝子トランスファー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はＡＸＬ遺伝子発現サプレッサー又はタンパク質レベルでの抑制、例えば低分子量ＡＸＬキナーゼ阻害剤、ＡＸＬ類似物、例えばＥｘ−ＡＸＬ融合タンパク質、例えばＥｘ−ＡＸＬとＪｇＧ１Ｆｃフラグメントの融合（参照３２）又は抑制抗体により行うことができる。更に、ＡＸＬ遺伝子発現の抑制はＡＸＬシグナル阻害剤、例えば下流阻害剤により行われるかもしれない。
【０１０５】
第２表：浸潤性のコンセンサス
【表３】
【０１０６】
第３表
【表４】
【０１０７】
第４表：チロシンキナーゼｃＤＮＡアレイにより評価した、ヒト神経膠腫細胞系におけるＥＧＦＲ及びＵＦＯ／Ａｘｌの発現
【表５】
参考文献
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＸＬ、ＧＡＳ、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ５、ＦＹＮ、ＬＹＮ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＦ、Ｓ６ＫＩＩ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα、Ａｎｎｅｘｉｎ ２、Ｓｔａｔ ５ｂ及びＥＤＧ２から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することから成り、その際、高発現が高浸潤と相関している、悪性疾患の浸潤性の判定法。
【請求項２】
前記群から選択した少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともＡＸＬ遺伝子の発現を測定することから成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
悪性疾患が癌、特に乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、神経膠芽腫及びその他の癌から選択した癌である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
癌が神経膠芽腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
発現をｍＲＮＡレベルで測定する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
発現を核酸アレイで測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発現をタンパク質レベルで測定する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
発現を免疫学的検定法で測定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＸＬ遺伝子発現及び／又はＡＸＬリガンド遺伝子発現及び／又はタンパク質機能及び／又はタンパク質リガンド機能を抑制することから成る、悪性疾患の浸潤性を減少させる方法。
【請求項１１】
ＡＸＬタンパク質リガンドがＧＡＳ６である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＸＬタンパク質の受容体チロシンキナーゼ活性を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＸＬ遺伝子の発現を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＸＬタンパク質及びそのリガンド間の相互作用を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドの阻害剤を、悪性疾患の浸潤性を減少させるのに効果的な量でそれを必要としている被験者に投与することから成る、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
悪性疾患が癌、特に乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、神経膠芽腫及びその他の癌から選択した癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌が神経膠芽腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者が哺乳類、特にヒトである、請求項１５から１７に記載の方法。
【請求項１９】
阻害剤がＡＸＬタンパク質に対する抗体である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
阻害剤が、ＡＸＬ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子又はその転写物である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤がＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
薬理学的活性希釈剤、キャリア及び／又はアジュバントと一緒に、活性剤としてＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドの阻害剤から成る医薬組成物。
【請求項２３】
阻害剤がＡＸＬタンパク質に対する抗体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
阻害剤が、ＡＸＬ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子又はその転写物である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
阻害剤がＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
悪性疾患の浸潤性を減少させるための請求項２２から２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
悪性疾患で転移形成を減少させるための請求項２２から２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
悪性疾患が神経膠芽腫である、請求項２６から２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
少なくとも１種のその他の活性剤から成る、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
その他の活性剤が細胞毒性又は細胞増殖抑制剤である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
試験化合物がＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドを抑制することができるかどうかを測定することから成る悪性疾患の浸潤性の阻害剤の同定及び／又はキャラクタリゼーション法。
【請求項３２】
試験化合物がＡＸＬタンパク質と結合できる及び／又はＡＸＬ遺伝子発現を減少させることができるかどうかを測定することから成る請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞ベースのアッセイ系を使用する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞不含アッセイ系を使用する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項１】
ＡＸＬ、ＧＡＳ、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ３ＭＭＰ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ５、ＦＹＮ、ＬＹＮ、ＤＤＲ２、ＴＩＭＰ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＳＧＦ、Ｓ６ＫＩＩ、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＩＲＰα、Ａｎｎｅｘｉｎ ２、Ｓｔａｔ ５ｂ及びＥＤＧ２から成る群から選択した少なくとも１種の遺伝子の発現を測定することから成り、その際、高発現が高浸潤と相関している、悪性疾患の浸潤性の判定法。
【請求項２】
前記群から選択した少なくとも２種の遺伝子の発現を測定することから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともＡＸＬ遺伝子の発現を測定することから成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
悪性疾患が癌、特に乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、神経膠芽腫及びその他の癌から選択した癌である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
癌が神経膠芽腫である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
発現をｍＲＮＡレベルで測定する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
発現を核酸アレイで測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
発現をタンパク質レベルで測定する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
発現を免疫学的検定法で測定する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＸＬ遺伝子発現及び／又はＡＸＬリガンド遺伝子発現及び／又はタンパク質機能及び／又はタンパク質リガンド機能を抑制することから成る、悪性疾患の浸潤性を減少させる方法。
【請求項１１】
ＡＸＬタンパク質リガンドがＧＡＳ６である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＸＬタンパク質の受容体チロシンキナーゼ活性を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＸＬ遺伝子の発現を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＸＬタンパク質及びそのリガンド間の相互作用を抑制することから成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドの阻害剤を、悪性疾患の浸潤性を減少させるのに効果的な量でそれを必要としている被験者に投与することから成る、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
悪性疾患が癌、特に乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、神経膠芽腫及びその他の癌から選択した癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌が神経膠芽腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者が哺乳類、特にヒトである、請求項１５から１７に記載の方法。
【請求項１９】
阻害剤がＡＸＬタンパク質に対する抗体である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
阻害剤が、ＡＸＬ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子又はその転写物である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
阻害剤がＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
薬理学的活性希釈剤、キャリア及び／又はアジュバントと一緒に、活性剤としてＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドの阻害剤から成る医薬組成物。
【請求項２３】
阻害剤がＡＸＬタンパク質に対する抗体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
阻害剤が、ＡＸＬ遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイム又はＲＮＡ干渉分子又はその転写物である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
阻害剤がＡＸＬ遺伝子の優性阻害型突然変異体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
悪性疾患の浸潤性を減少させるための請求項２２から２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
悪性疾患で転移形成を減少させるための請求項２２から２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
悪性疾患が神経膠芽腫である、請求項２６から２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
少なくとも１種のその他の活性剤から成る、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
その他の活性剤が細胞毒性又は細胞増殖抑制剤である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
試験化合物がＡＸＬ遺伝子、ＡＸＬリガンド遺伝子、ＡＸＬタンパク質及び／又はＡＸＬタンパク質リガンドを抑制することができるかどうかを測定することから成る悪性疾患の浸潤性の阻害剤の同定及び／又はキャラクタリゼーション法。
【請求項３２】
試験化合物がＡＸＬタンパク質と結合できる及び／又はＡＸＬ遺伝子発現を減少させることができるかどうかを測定することから成る請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞ベースのアッセイ系を使用する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞不含アッセイ系を使用する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−２４５８０（Ｐ２０１１−２４５８０Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７３６４６（Ｐ２０１０−１７３６４６）
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００４−５２０６６２（Ｐ２００４−５２０６６２）の分割
【原出願日】平成１５年７月１７日（２００３．７．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（３９００４０４２０）マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ (54)
【氏名又は名称原語表記】Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｚｕｒ Ｆｏｅｒｄｅｒｕｎｇ ｄｅｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ｅ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２日（２０１０．８．２）
【分割の表示】特願２００４−５２０６６２（Ｐ２００４−５２０６６２）の分割
【原出願日】平成１５年７月１７日（２００３．７．１７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．サランラップ
【出願人】（３９００４０４２０）マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ (54)
【氏名又は名称原語表記】Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｚｕｒ Ｆｏｅｒｄｅｒｕｎｇ ｄｅｒ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ｅ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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