皮膚再生システム
【課題】 血清やフィーダー細胞などの外来成分の必要性を解消または少なくとも低減する、細胞培養培地および培養システムを提供する。
【解決手段】該細胞培養培地は、ＩＧＦと、ビトロネクチンもしくはフィブロネクチンと、任意選択でＩＧＦＢＰとを含むものであり、その後皮膚を成長および再生させる際に使用するケラチノサイトを増殖させるのに特に適している。本発明はまた、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を成長および再生させるための、培養ケラチノサイトのエアロゾル送達を利用する組成物および方法に関する。
【解決手段】該細胞培養培地は、ＩＧＦと、ビトロネクチンもしくはフィブロネクチンと、任意選択でＩＧＦＢＰとを含むものであり、その後皮膚を成長および再生させる際に使用するケラチノサイトを増殖させるのに特に適している。本発明はまた、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を成長および再生させるための、培養ケラチノサイトのエアロゾル送達を利用する組成物および方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に関する。より詳細には、本発明は、ケラチノサイトを増殖させて皮膚を成長および再生させる際に使用することを目的とした、培地、システム、および方法に関する。本発明はまた、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を成長および再生させる際に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）であるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、過形成、ＤＮＡ合成、分化、細胞周期の進行、およびアポトーシスの抑制を含む、広い範囲の細胞プロセスに関与する分裂促進性ペプチド成長因子である（非特許文献１〜３）。これらの効果は、細胞表面のチロシンキナーゼ結合型受容体、すなわち１型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）への該因子の結合を介して発揮される。ＩＧＦはまたＩＧＦＢＰと呼ばれる特異的に結合するタンパク質ファミリーにより厳格な調節を受けるが、ＩＧＦＢＰは、遊離ＩＧＦに結合することによって、ＩＧＦの半減期、特異性、および活性を適正にすることを主な役割としている（非特許文献４）。
【０００３】
最近になって、ビトロネクチン（ＶＮ）がＩＧＦ−ＩＩに直接的に結合することが示されているが（非特許文献５）、ＩＧＦ−Ｉは、ある種のＩＧＦＢＰの存在下でＶＮに結合し得る（特許文献１；非特許文献６）。ＥＣＭを組織化する分子であり接着分子でもあるＶＮが、ＩＧＦ−ＩＩがその生物学的受容体に該当するＩＧＦ−ＩＲに結合する親和性と同様の親和性でＩＧＦ−ＩＩに結合するという発見（非特許文献５）は、ＩＧＦの作用とＥＣＭ中のＶＮとの特異的な物理的関連を明らかにするものである。さらに、ＶＮに結合したＩＧＦ−ＩＩ、およびＩＧＦＢＰを介してＶＮに結合したＩＧＦ−Ｉは、ヒト・ケラチノサイトを含む多様な細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで相乗的な機能的応答を刺激し得る（特許文献１；ノーブルら（Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ．）、２００３年、前掲；非特許文献６）。
【０００４】
創傷、火傷、および潰瘍は、衰弱をもたらし痛みを伴う皮膚状態であり、集中的で費用のかかる治療が必要となるが、部分的にしか成果の上がらないことが多い。例えば、現在５２０，０００人を超えるオーストラリア人が糖尿病と診断され、そのうち５％超が足潰瘍になる。このような創傷は、患者の生活の質を著しく損ない、しばしば入院期間を延長し、ついには切断に至ることもある。実際、行われる下肢の切断の大半は、回復しない潰瘍のせいであるとされる。
【０００５】
創傷、火傷、および潰瘍の治癒へ向けたより一層好ましい手法は、死んだ皮膚または損傷を受けた皮膚を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた自己または同種のケラチノサイトに替えることである。通常、ケラチノサイトは、血清やウシ下垂体抽出物などの外部から添加した外来因子の存在下にて所定の培地で、通常はケラチノサイトの増殖を最適にするフィーダー細胞（栄養支持細胞）と共に増殖させる。
【特許文献１】国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレット
【非特許文献１】ケイスら（Ｋｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第４１巻、ｐ．６６
【非特許文献２】ウーおよびイー（Ｗｏｏｄ＆Ｙｅｅ）、２０００年、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ 第５巻、ｐ．１
【非特許文献３】ジョーンズおよびクレモンズ（Ｊｏｎｅｓ＆Ｃｌｅｍｍｏｎｓ）、１９９５年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．第１６巻、ｐ．３
【非特許文献４】クレモンズ（Ｃｌｅｍｍｏｎｓ）、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． 第１４０巻、ｐ．１９
【非特許文献５】アプトンら（Ｕｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 第１４０巻、ｐ．２９２８〜３１
【非特許文献６】Ｋｒｉｃｋｅｒら、２００３年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． 第１４４巻、ｐ．２８０７〜１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
典型的な従来技術のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養システムは、前述の外来因子を含めなければならないので比較的費用がかかる。その上、血清やウシ下垂体抽出物などの動物由来の外来因子は、比較的不確定なものであり、ＣＪＤ、ＨＩＶおよびその他の疾患を引き起こすものなど感染性の物質が含まれる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのため、本発明者らは、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮからなるタンパク質複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏの初代細胞培養物において血清の非存在下で顕著な増殖応答を刺激することを発見した。より詳細には、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮからなるタンパク質複合体は、皮膚の交換、火傷および創傷の治癒、ならびにｅｘ ｖｉｖｏでの皮膚増殖を必要とする他の治療処置を目的としたケラチノサイトの増殖を強化するために使用することができる。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦを含むことと、
（ｉｉ）血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含むことと
を特徴とする細胞培養培地を提供する。
【０００９】
１実施形態では、培養培地はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰを含む。
第２の態様では、本発明は、培養容器と第１の態様の細胞培養培地とからなる細胞培養システムを提供する。
【００１０】
本発明の培養培地および培養システムのうち少なくともいずれかが、ビトロネクチン（ＶＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）のうち少なくともいずれかまたはそれらの断片をさらに含んでもよいことは理解されよう。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の細胞培養培地および第２の態様の細胞培養システムのうち少なくともいずれかにおいて１または複数種の細胞を培養する工程を含む細胞培養方法を提供する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の方法に従って培養された１または複数種の細胞を、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に含んでなる薬剤組成物を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態では、薬剤組成物は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞のエアロゾル送達に適している。
第５の実施形態では、本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生するためのケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞の送達方法であって、個体に前記第４の態様の薬剤組成物を送達して皮膚の再生を促進する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
この態様の好ましい実施形態は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生させる方法であって、
（ｉ）個体の皮膚に１または複数種のケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を噴霧する工程と、
（ｉｉ）前記ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を増殖させて、ｉｎ ｓｉｔｕで再生皮膚を形成させる工程と
を含む方法を提供する。
【００１５】
本明細書中では、別段の指摘がない限り、「含む、含んでなる、からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、記載されているものが、その他の記載されていない１または複数のものを含み得るように、排他的でなく包含的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】血清の非存在下における、単離タンパク質複合体およびフィーダー細胞の存在下でのケラチノサイトの増殖を示す図。ウシ胎児血清および３ｔ３細胞のいずれも存在する従来の方法と比較した、新鮮な単離ケラチノサイトのＶｉｔｒｏＧｒｏ（登録商標）（＋３ｔ３細胞）存在下での平均的な増殖を示している。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、細胞を回収して再び播種した回数に相当する（Ｐ０＝皮膚試料から単離した直後の細胞の能力）。増殖中の細胞によって着色物質へと変換されるＭＴＴを用いた染色によりデータを取得した。異なるドナー組織間の変動が大きいため、エラー・バーは示していない。
【図２】血清の非存在下において、単離タンパク質複合体およびフィーダー細胞の存在下で増殖させた後のケラチノサイトの形態を示す図。細胞は、ウシ胎児血清およびマウス３ｔ３細胞の存在下で３週間（Ａ）、またはＶｉｔｒｏＧｒｏ（Ｂ；ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦ−Ｉ）およびマウス３ｔ３細胞の存在下で血清の非存在下にて３週間、増殖させた。スケール・バーは約２００マイクロメートル（μｍ）である。
【図３】ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体の相対的活性を示す図。対照＝１０％ウシ胎児血清を添加した標準的なケラチノサイト増殖培地。ＶｉｔｒｏＧｒｏ３＝ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ３、およびＩＧＦ−Ｉ（無血清）。ＶｉｔｒｏＧｒｏ５＝ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦ−Ｉ（無血清）。全ての培養物を、ガンマ線照射したマウス３ｔ３細胞存在下で増殖させた。
【図４】ＩＧＦタンパク質複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏでのケラチノサイトの増殖を支持することを示す図。ＩＧＦタンパク質複合体上に播種したヒト成人皮膚由来ケラチノサイトは生き残り、ウシ胎児血清の存在下で照射処理したマウス３ｔ３細胞上に播種された細胞に匹敵する速度で増殖する。細胞増殖は、（ａ）培養物の形態／集密度（コンフルエンス）の視認検査、および（ｂ）ＭＴＴアッセイによる定量化によって観察した。（ａ）左から右へ、フィーダー層＋ウシ血清、対照、ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ５＋ＶＮ（フィーダー層も血清も含まない）、（ｂ）左から右へ、グリーン培地＋フィーダー層＋ウシ血清、グリーン培地＋フィーダー層のみ、インスリンを含まないグリーン培地＋ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ３＋ＶＮ、インスリンを含まないグリーン培地＋ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ５＋ＶＮ。ＶＮは、３００ｎｇ／ウェルである。ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−ＩＩは１００ｎｇ／ウェル、かつＩＧＦＢＰ類は３００ｎｇ／ウェルである。
【図５】その他の増殖因子を加えたＩＧＦタンパク質複合体が、ケラチノサイト培養物の増殖をさらに促進することを示す図。ヒト成人皮膚由来のケラチノサイトを、ＩＧＦタンパク質複合体＋上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて培養し、［３Ｈ］ロイシンの取り込みによってタンパク質合成について検査した。ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ５およびＶＮの３量体複合体、またはＩＧＦ−ＩＩおよびＶＮタンパク質の２量体複合体について播種した細胞は、規定ケラチノサイト培地（ＤＫＭ、インビトロジェン）に匹敵する速度で増殖する。さらにＥＧＦ（１００ｎｇ／ウェル）およびｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ウェル）が加わったＩＧＦタンパク質複合体は、ＤＫＭと比較して、タンパク質合成を有意に促進した（ｐ＜０．０５）。ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−ＩＩは、１００ｎｇ／ウェルであり、ＶＮは３００ｎｇ／ウェル、およびＩＧＦＢＰ類は３００ｎｇ／ウェルである。
【図６】ケラチノサイト生存率に対するＴＩＳＳＯＭＡＴ（登録商標）の作用を示す図。ケラチノサイトをコラーゲンコーティングした直径１５０ｍｍの培養ディッシュに噴霧播種した後の、細胞の分布および増殖を示す。噴霧領域の被覆に必要な細胞数を測定するために、細胞を２つの異なる濃度で噴霧した。噴霧に使用した培養物は、対照（血清含有）またはＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦ−Ｉが共存するビトロネクチン（ＶｉｔｒｏＧｒｏ）のいずれかで元々培養したものとした。全ての培養物を、３ｔ３細胞存在下で調製した。次に、培養物を、コラーゲンコーティングプレート上で血清存在下にて７日間増殖（創傷部位に送達した後の条件を模倣して設定）させた後に、クリスタル・バイオレットで染色した。噴霧量は０．２ｍＬ、噴霧圧１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）、高さ＝１０ｃｍとした。
【図７】ケラチノサイト生存率に対するＴＩＳＳＯＭＡＴの作用を示す図。培養物を、血清を添加した従来の培養培地を使用して確立した。（Ａ）トリパン・ブルー排除試験を、捕集チューブ中に細胞を噴霧した後、数分以内に実施した。生細胞は該色素に対する透過性がない。（Ｂ）ＭＴＴ変換データは、細胞噴霧後２４時間の代謝活性を示す、生存率の指標である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮとを含んでなる培地が、通常はケラチノサイトのｅｘ ｖｉｖｏでの増殖に必要な血清の非存在下、ｅｘ
ｖｉｖｏのケラチノサイト初代培養物において顕著な増殖応答を刺激するという発見から生まれた。
【００１８】
さらに、特に細胞培養物が最初に確立してしまった後の細胞培養の後期段階では、フィーダー細胞の絶対的な必要を少なくともある程度解消することができる。
したがって、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで皮膚を再生させるための現行の最善の臨床業務を改善する技術を提供する。さらに、本発明は、組織生検からのケラチノサイトの誘導および樹立も提供する。好ましい形態では、本発明は、患者自身の血清から単離された自己ビトロネクチンまたは組換え生産された自己ビトロネクチンを利用し、それによって異種または同種異系の支援システムの使用がさらに最小限に抑えられるだけでなく、不確定な補充製品の使用が排除されるケラチノサイトの培養培地および培養システムを提供する。したがって、このことから、好適な治療用途に転換することのできる、自己細胞を主体とした組織工学システムが提供されることになろう。
【００１９】
本発明の目的では、「単離（された）、単離型（の）」とは、材料がその本来の状態から取り出されているか、または人の手による操作を受けていることを意味する。単離（型）材料は、その本来の状態では通常付随する成分を実質的または本質的に含んでいなくてもよいし、その本来の状態では通常付随する成分を伴ったまま人工の状態になるように操作されていてもよい。単離材料は、天然型、化学合成型、または組換え型のいずれでもよい。
【００２０】
本明細書では、「合成（の）」とは、天然に生じたものではなく、人による技術が介入
してできているという意味である。合成タンパク質および合成核酸に関しては、この語句は、当業界でよく理解されているように、組換え技術、または化学合成およびコンビナトリアル技術によって生産された分子を含む。
【００２１】
「タンパク質」とは、アミノ酸重合体を意味する。アミノ酸は、当業界でよく理解されているように、天然型または非天然型のアミノ酸、すなわちＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のいずれでもよい。
【００２２】
「ペプチド」とは、アミノ酸が５０個未満のタンパク質である。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸が５０個以上のタンパク質である。
特定の態様では、本発明は、血清などの外来の動物由来の因子を必要としないか、または細胞の増殖および生存能力のうち少なくともいずれかが維持されるのに必要な前記因子のレベルが実質的に低減された、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかを含む細胞培地および細胞培養システムを提供する。
【００２３】
本発明は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかに応答するあらゆる種類の哺乳動物細胞に適用可能であることが理解されよう。
そのような細胞は、一般に、上皮細胞、筋芽細胞およびそれらの前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞などの中胚葉由来の細胞である。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、ケラチノサイト、ケラチノサイト前駆細胞などの皮膚上皮細胞、および角膜上皮細胞を含めた上皮細胞に適用可能である。実際には、皮膚上皮細胞および角膜上皮細胞はいずれも、ケラチンタンパク質を産生するので「ケラチノサイト」とみなしてよい。
【００２５】
ケラチノサイトおよび／またはその前駆細胞は、正常な皮膚、創傷や潰瘍から採取したものなどの皮膚生検材料由来のものでもよいし、または毛嚢の外毛根鞘（ＯＲＳ）細胞から得たものでよく、またこれらに限られるものでもない。
【００２６】
したがって、例えば、口腔および呼吸器の粘膜（口、鼻、気管、および食道の内側の層）や尿生殖器組織（例えば、膣、膀胱）といった、上皮細胞が見られる場所であれば、本発明の培地、方法、およびシステムを使用して置換組織を構築できる可能性があることが理解されよう。これらの組織は、火傷および他の外傷などによる損傷を受けているものでもよく、それ自体、皮膚生検材料と同様の手段で増殖させた培養移植片を使用して治療することができる。
【００２７】
本発明は、同じく通常は培養中に血清を必要とするヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞に適用することもできる。
したがって、「血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含む」とは、血清が全く存在しないか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの最適な細胞の増殖および／または発育に本来必要な血清の量または濃度よりも実質的に低減された量または濃度の血清が含まれることを意味する。
【００２８】
「血清」とは、広範囲の巨大分子、リポイド物質および微量元素の運搬タンパク質、細胞の接着因子および伸展因子、低分子量栄養素、ならびにホルモンおよび成長因子を含む、血液由来の画分を意味する。操作上は、血清は、赤血球、血小板、および血漿の凝固成分を除去した後に残る、血液のタンパク性無細胞画分であると定義することができる。細胞培養に最も広く用いられる動物血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）であるが、成体のウシ血清、ウマ血清、およびそのタンパク質画分（例えば、血清アルブミンフラクションＶ）を用いてもよい。
【００２９】
通常、哺乳動物細胞は、細胞の種類、培養期間、フィーダー細胞および培養システムの他の細胞成分のうち少なくともいずれかの有無、ならびに当業者にとって明らかな他の要因に応じて、５〜１０％の血清を必要とする。
【００３０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、５％未満の血清、より好ましくは２％未満の血清、より一層好ましくは１％未満の血清を企図するが、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、または０．２％以下（ｖ／ｖ）の血清が有利である。
【００３１】
特に有利な実施形態では、本発明は、血清が存在しないか、または０．１％もしくは０．０５％以下（ｖ／ｖ）の血清を企図する。
ＩＧＦ−Ｉが存在する実施形態では、ＩＧＦ−Ｉはタンパク質複合体の一成分であり、該複合体がＩＧＦＢＰおよびビトロネクチン（ＶＮ）をさらに含んでなることが好ましい。
【００３２】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦＢＰ６から選択される。
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５であることが好ましい。
【００３３】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ５であることがより好ましい。
ＩＧＦ−ＩＩが存在する実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩは単離型タンパク質複合体の一成分であり、該複合体がビトロネクチン（ＶＮ）をさらに含んでなることが好ましい。
【００３４】
ビトロネクチン（ＶＮ）が単量体の形でも多量体の形でもよいことも理解されよう。
特定の１実施形態では、本発明は、精製された自己ＶＮを含む。
ケラチノサイトは、当業界で通常使用されるような培養容器で培養することが好ましい。したがって、培養中に存在するＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰの各量は、培養容器の大きさ、容器中に存在する液体培地の量、細胞密度、および当業界で知られている他の要因などの諸要因に応じて決まることが理解されよう。
【００３５】
指標として、１．９ｃｍ２のウェルでは、好ましい量は次のとおりである。すなわち
ＶＮ：５０〜５０００ｎｇ、より好ましくは１００〜５００ｎｇ、または有利なものとして２５０〜３５０ｎｇ；
ＩＧＦ：０．１〜１０００ｎｇ、より好ましくは１０〜２００ｎｇ、または有利なものとして５０〜１５０ｎｇ；
ＩＧＦＢＰ：１〜１０００ｎｇ、より好ましくは３０〜７００ｎｇ、または有利なものとして３００〜５００ｎｇ
である。
【００３６】
本発明の培養培地は、他の特定の成分を含むことが適切である。非限定的であり、任意選択される成分には、ＤＭＥＭやＨａｍ’ｓ培地などのよく知られている基本培地、ストレプトマイシンやペニシリンなどの抗生物質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）、Ｌ−グルタミンなどのアミノ酸補給物、β−メルカプトエタノールなどの抗酸化剤、トランスフェンリン、炭酸緩衝剤などの緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、および通常は細胞培養インキュベータによって提供される二酸化炭素供給源が挙げられる。
【００３７】
本発明は、細胞の増殖、分化、生存、および／または遊走を調節する追加の生物活性タンパク質、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ；ヘルディンら（Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第４巻、ｐ．１１２２〜１１２３）、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ；ヌルコンベら（Ｎｕｒｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７５巻、ｐ．３０００９〜３００１８）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；タラボレッティ（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．、第８巻、ｐ．４７１〜４７９）、オステオポンチン（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、第１４１巻、ｐ．１１００）、トロンボスポンジン−１（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、前掲）、テナシン−Ｃ（アライら（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、ｐ．６０９９）、ＰＡＩ−１（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌ．、第１３８巻、ｐ．２９７２）、プラスミノーゲン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２７５巻、Ｅ３２１）、フィブリノーゲン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７４巻、ｐ．３０２１５）、フィブリン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．）、１９９９年、前掲）、またはトランスフェリン（ウェインジマーら（Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第８６巻、ｐ．１８０６）などの使用も企図する。
【００３８】
追加の好ましい生物活性タンパク質は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦである。
ＥＧＦやｂＦＧＦなどの追加の生物活性タンパク質は、１．９ｃｍ２の培養ウェルあたり０．１〜１０００ｎｇ存在してよいが、有利には１〜１００ｎｇ存在してよい。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明は、ヘパリン結合ドメイン様のドメインを有する任意の成長因子の使用を企図する。
別の特定の実施形態では、本発明は、単離型タンパク質複合体に加え、細胞の分化を抑制するＬＩＦおよび／または他の作用物質の使用を企図する。
【００４０】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、本発明の培養培地、培養システム、および方法のうち少なくともいずれかにおける、ポリＬ−リシン、ポリＬ−アルギニン、およびビトロネクチンと相互作用する細胞分泌物、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン／プロテオグリカン、ラミニン、シアロタンパク質、および／もしくはムチンの重合体のうちの１種または複数の使用を企図する。
【００４１】
本発明が、少なくとも細胞培養の最初の樹立段階の後、フィーダー細胞の非存在下での細胞培養を円滑にし得ることも提唱しておく。
ケラチノサイトおよび／またはケラチノサイト前駆細胞に関しては、血清非存在下での培養の最初の６〜７日間は（放射線照射した３ｔ３フィーダー細胞などの）フィーダー細胞が存在していてもよく、その後、最高で２継代の間はフィーダー細胞がなくてもよい。
【００４２】
前述のことを踏まえつつ、いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、細胞の培養中に、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦＢＰおよびＶＮとともに単離型タンパク質複合体を形成し、ＩＧＦ−ＩＩがＶＮとの複合体を形成して生物学的効果を発揮するということを提唱する。
【００４３】
用語「単離型タンパク質複合体」とは、本明細書では、国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレットおよび国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号において使用されるものと一致する。
【００４４】
単離型タンパク質複合体は、予め形成してから本発明の培養培地に含めてもよいし、または培養容器中で形成してもよい。
通常、ビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンは、培養容器に結合、固定、も
しくはコーティングされるか、または別の方法で培養容器に結び付けられる。ＩＧＦ、および任意選択でＩＧＦＢＰを加えると、培養容器に結合、固定、もしくはコーティングされるかまたは別の方法で培養容器に結び付けられたビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンとの複合体が形成される。
【００４５】
国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号に記載されているように、本発明の単離型タンパク質複合体は、成長因子（例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）を含んでもよいし、または成長因子の少なくとも１ドメインであって、同族の成長因子受容体（例えば、ＩＧＦ１型受容体）に結合することのできるドメインを含むものでもよい。
【００４６】
これに関して、「ドメイン」とは、成長因子の少なくとも一部分または領域であって、同族の成長因子受容体に結合することのできるものを意味する。通常、限定するものではないが、同族の成長因子受容体が細胞によって発現され、前記同族の成長因子受容体に前記の成長因子の少なくとも１ドメインが結合または連結すると、細胞の増殖、分化、生存および／または遊走などの細胞応答が誘発される。
【００４７】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、前記ドメインは、ロイシン残基ではないアミノ酸残基２４を含むことが適切である。
通常、前記の残基はチロシンである。
【００４８】
特にＩＧＦ−ＩＩに関して、前記ドメインは、ロイシン残基でないアミノ酸残基２７を含むことが適切である。
通常、前記の残基はチロシンである。
【００４９】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、１実施形態では、前記ドメインは、ＩＧＦ−Ｉの残基１〜７０を含んでなるか、または同残基１〜７０から構成される。
別の実施形態では、前記ドメインは、ＩＧＦ−Ｉの残基４〜７０を含んでなるか、または同残基４〜７０から構成される。
【００５０】
本発明の単離型タンパク質複合体の別の成分が、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンの少なくともインテグリン結合ドメインであることも理解されよう。
この成分としては、αｖインテグリンに結合することのできる、ＶＮもしくはＦＮの任意のドメインを挙げることができ、これらが包含される。
【００５１】
インテグリンは、αｖβ３インテグリンまたはαｖβ５インテグリンであることがより好ましい。
国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号に記載されているように、ＶＮ（および同様にＦＮ）のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）は、単離型タンパク質複合体の完全な生物活性にとって必要ではない。
【００５２】
ＶＮに関しては、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉ／ＧＦＢＰ複合体との相互作用に必要なのは、おそらくＶＮ（および同様にＦＮ）のポリアニオン領域である。
ポリアニオン領域は、成熟型ＶＮ配列のアミノ酸残基５３〜６４である。
【００５３】
前述のことを考慮すれば、本発明は、ＶＮまたはＦＮのＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかを含まない合成キメラタンパク質の実施形態を企図するものである。
【００５４】
ＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかを含まないＶＮタンパク質およびそのアミノ酸配列に関しては、（ＨＢＤを欠いている）５４ｋＤａのニワトリ卵黄Ｖ
Ｎなど、天然のタンパク質でもよいし、あるいはＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかが含まれないか、または少なくとも実質的に機能しないように、ＶＮタンパク質もしくはアミノ酸配列を欠失、突然変異、または短縮させることによって作出したものでもよい。
【００５５】
前述の事項から、本発明の単離型タンパク質複合体が、非共有結合により会合しているオリゴ−タンパク質複合体の形態、（可逆的または不可逆的に）共有結合によって架橋されているオリゴ−タンパク質複合体の形態、または合成キメラタンパク質の形態のいずれでもよいことが容易に理解されるであろう。
【００５６】
したがって、特定の態様では、本発明は、合成キメラタンパク質の形態の単離型タンパク質複合体を提供する。
本明細書では、「キメラタンパク質」は、ＶＮもしくはＦＮのインテグリン受容体結合ドメイン由来の連続したアミノ酸配列と、成長因子または成長因子の少なくとも受容体結合ドメインとを含んでなる。
【００５７】
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、合成キメラタンパク質は、前記成長因子の同族の受容体とＶＮもしくはＦＮのインテグリン受容体とを同時に連結し、かつ同時に活性化することができ、それによって細胞の遊走を刺激、誘発、増強、または促進し得ることを提唱しておく。
【００５８】
本発明によるキメラタンパク質の利点は、化学合成または組換えの手段によって容易に製造され、かつ非共有結合型のオリゴ−タンパク質複合体において必要なタンパク質−タンパク質相互作用の維持に依存しないのでｉｎ ｖｉｖｏでより安定であると予想される点である。
【００５９】
これに関して、ＩＧＦ−Ｉの受容体結合ドメインを含む単離型タンパク質複合体はＩＧＦＢＰも含むはずであるが、前述の作用様式によれば、ＩＧＦ−Ｉ／ＶＮ合成キメラにはＩＧＦＢＰが存在しないことが好ましいと提唱しておく。
【００６０】
キメラタンパク質は、成長因子配列とＶＮもしくはＦＮのアミノ酸配列との間に、かつこれらの配列に隣接して位置する「リンカー配列」をさらに含むことが好ましい。
１実施形態では、前記のリンカー配列は、１または複数のグリシン残基と１または複数のセリン残基とからなる。
【００６１】
リンカー配列の特定の例は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ；Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から選択可能であるが、この限りでない。
別の実施形態では、リンカー配列には、Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏの配列など、プラスミン切断認識部位が含まれる。
【００６２】
さらに別の実施形態では、リンカー配列には、Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓの配列など、コラゲナーゼ３切断認識部位が含まれる。
上記は、成長因子、成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチン／フィブロネクチンのうち少なくともいずれかの生物活性を有する断片の例である。
【００６３】
１実施形態では、前記の「生物活性を有する断片」は、「完全長」タンパク質の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、より一層好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％以上、または少なくとも９５％の生物学的活性を有する。
【００６４】
同様に、本発明に従って使用することのできる、成長因子のバリアント、成長因子結合
タンパク質、および／もしくはビトロネクチン／フィブロネクチン、および／またはこれらをコードする核酸も企図する。
【００６５】
１実施形態では、「バリアント」は、１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸と入れ替わっている。ある種のアミノ酸が、そのタンパク質の本来の活性を変化させることなく、概ね類似の性質を備えた他のアミノ酸に変更可能であること（保存的置換）は、当業界で十分に理解されている。
【００６６】
１実施形態では、バリアントは、本明細書に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００６７】
少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より一層好ましくは少なくとも９０％を上回る配列同一性が測定されることが好ましく、配列同一性が実質的に本発明の合成タンパク質の全長にわたっていると有利である。
【００６８】
配列同一性（％）を決定するには、アルゴリズム（インテリジェネティックス社（In telligenetics ）のＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；米国ウィスコンシン州マディソンのサイエンスドライブ５７５所在のジェネティクスコンピュータグループ（Genetics Computer Group ）のウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース７．０（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 ）の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；参照により本願明細書に援用する）のコンピュータ処理の実行、または検討により、アミノ酸および／または核酸の配列の最適なアラインメントを実施すればよく、最適な（すなわち、比較枠内全体で最高の相同性（％）をもたらす）アラインメントは、選択した種々の方法のいずれかによって得ることができる。参照により本願明細書に援用されるアルツシュルらの文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９９７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、ｐ．３３８９）に開示されているような、ＢＬＡＳＴプログラムファミリーを参照してもよい。
【００６９】
別の例では、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータ・プログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）対応Ｖｅｒｓｉｏｎ２．５；米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在の日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社から入手可能）によって算出される「一致率（％）」を意味するものと理解してもよい。
【００７０】
配列解析の詳細な議論については、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（ジョンウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク、１９９５〜１９９９年）の１９．３項に見ることができる。
【００７１】
本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質、および／またはビトロネクチン／フィブロネクチンの誘導体も企図する。
本明細書では、「誘導体」とは、例えば、他の化学基の付加、結合、もしくは複合体化によって、または当業界で十分に理解されているような翻訳後修飾技術によって改変されているものである。
【００７２】
アミノ酸の「付加」には、他のペプチドまたはポリペプチドとの融合が挙げられる。他のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、タンパク質の精製の助けとなり得る。例えば、これらのペプチドまたはポリペプチドには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、プロテインＡ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００７３】
本発明が企図する他の誘導体には、側鎖の修飾、タンパク質合成の際の非天然アミノ酸および／もしくはその誘導体の組込み、ならびにタンパク質の高次構造を拘束する架橋剤の使用および他の方法が含まれるがこの限りでない。本発明が企図する側鎖の修飾の非限定的な例としては、無水酢酸を用いるアシル化による修飾などのアミノ基の修飾、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化、アセトイミド酸メチルを用いるアミジン化、シアナートを用いるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−リン酸を用いるリシンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＨ４による還元、アルデヒドとの反応に続いてＮａＢＨ４で還元することによる還元アルキル化、および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化が挙げられる。 スルフィドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化；４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、４−クロロマーキュリベンゾアート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の生成；他のチオール化合物との混合型ジスルフィドの生成；マレイミド、マレイン酸無水物、または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化；シアナートを用いるアルカリ性ｐＨでのカルバモイル化などの方法によって修飾することができる。
【００７４】
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ピロ炭酸ジエチルを用いるＮ−カルボエトキシル化、またはヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化によって修飾することができる。
ペプチド合成の際に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が含まれるがこの限りでない。
【００７５】
タンパク質の化学的誘導体化の別の例は、コリガンら（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．）編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」、米国ニューヨーク所在のジョンウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９５〜２００１年の第１５章に示されている。
【００７６】
本発明によれば、タンパク質は、当業者に知られている任意の適切な方法によって調製可能である。
１実施形態では、タンパク質は、実質的に純粋な天然型でよい。
【００７７】
特定の１例は、精製自己ビトロネクチンである。
別の実施形態では、タンパク質は化学合成によって生産することができる。化学合成技術は当業界でよく知られているが、当業者は、適切な方法の例について、コリガンら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」、米国ニューヨーク所在のジョンウィリーアンドサンズ社（１９９５〜２００１年）の第１８章を参照してもよい。
【００７８】
さらに別の実施形態では、タンパク質は、組換えタンパク質として調製されてもよい。
組換えタンパク質の製造は、当業界でよく知られており、当業者は、例えば、本願明細書に援用するサンブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）の「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（コールドスプリングハーバープレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）、特に第１６項および第１７項；本願明細書に援用するアウスベルら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（ジョンウィリーアンドサンズ社、１９９５〜１９９９年）、特に第１０章および第１６章；ならびに本
願明細書に援用するコリガンら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」（ジョンウィリーアンドサンズ社、１９９５〜１９９９年）、特に第１、第５、および第６章に記載されているような標準のプロトコールを参照してもよい。
【００７９】
組換えタンパク質は、融合パートナーをさらに含んでもよい。
よく知られている融合パートナーの例としては、限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）を挙げることができ、これらはアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティクロマトグラフィによって融合タンパク質を精製する目的については、関連するアフィニティクロマトグラフィ用マトリックスは、それぞれグルタチオン−、アミロース−、およびニッケルもしくはコバルトに結合した樹脂である。このような多くのマトリックスは、ＨＩＳ６融合パートナーとともに使用可能なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））や、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＧＳＴ精製システムなど、「キット」の形態で入手可能である。
【００８０】
場合によっては、融合パートナーもＸａ因子やトロンビンなどのプロテアーゼの切断部位を有していて、その結果関連プロテアーゼによる本発明の融合タンパク質の部分消化が可能となり、それによって組換えタンパク質が融合タンパク質から解放されるようになる。次いで、解放されたタンパク質を続いてクロマトグラフィにより分離して、融合パートナーから単離することができる。
【００８１】
本発明の融合パートナーの範囲内には、一般に短いペプチド配列であり、該配列に対する特異的抗体が入手可能な「エピトープタグ」も含まれる。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能なよく知られたエピトープタグの例には、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、およびＦＬＡＧタグが含まれる。
【００８２】
発現に適した宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば大腸菌（例えばＤＨＳα）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系とともに利用されるＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨＥＫ２９３の各細胞であるが、これらに限定はされない。
【００８３】
本発明はさらに、
（ｉ）組換えＩＧＦ、
（ｉｉ）組換えＩＧＦＢＰ、
（ｉｉｉ）組換えビトロネクチン、
（ｉｖ）前述のような組換えキメラタンパク質、および
（ｖ）ＥＧＦやｂＦＧＦなど追加の生物活性タンパク質
からなる群から選択される少なくとも１種の組換えタンパク質を発現させることのできる、ケラチノサイトやケラチノサイト前駆細胞などの細胞の使用を企図する。
【００８４】
特定の実施形態によれば、ＩＧＦ、ＶＮ、および／またはＩＧＦＢＰの傍分泌発現／自己分泌発現によって、血清を含まない培地で、かつ成長因子、ＩＧＦＢＰ、およびビトロネクチンのうちの１または複数を培養培地に加える必要なしにケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を培養することができる。
【００８５】
組換えタンパク質の発現は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞に発現構築物を導入することで実現できる。
通常、発現構築物は、発現の対象である（組換えタンパク質をコードしている）核酸を
、プロモータに作動可能なように連結され、または作動可能なように接続された状態で含んでいる。
【００８６】
プロモータは、構成的プロモータでも誘導プロモータでもよい。
構成的プロモータまたは誘導プロモータとしては、例えば、テトラサイクリン抑制性、エクジソン誘導性、アルコール誘導性、およびメタロチオネイン誘導性のプロモータが挙げられる。プロモータは、天然のプロモータ（例えば、αクリスタリンプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヒト伸長因子αプロモータ、およびＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ由来プロモータなどのウイルスプロモータ）でもよいし、または２種以上のプロモータの要素が組み合わされている合成ハイブリッドプロモータ（例えば、ＳＲαプロモータ）でもよい。
【００８７】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、形質転換した細菌の選択を行う目的にも（ｂｌａ、ｋａｎＲ、ｔｅｔＲなど）、形質転換した哺乳動物細胞の選択を行う目的にも（ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシンなど）有用である。
【００８８】
発現構築物は、電気穿孔法、微粒子銃、ウイルスを利用する遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオンリポソーム、リポフェクション、リポフェクタミンなど（これらに限定はされない）のよく知られている手段によって、ケラチノサイトやケラチノサイト前駆細胞などの哺乳動物細胞に導入することができる。
【００８９】
ケラチノサイト中での組換え成長因子タンパク質の発現に適用できる可能性のある方法の非限定的な特定の例については、サップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第１１４巻、ｐ．５、およびサップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．、第８巻、ｐ．２６〜３５を参照することができる。
【００９０】
［薬剤組成物］
本発明は、本発明の培地および／または培養システムを使用して生産された、その限りではないがケラチノサイトなどの１または複数の細胞と、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤とを含んでなる薬剤組成物も提供する。
【００９１】
本発明の薬剤組成物を使用すると、細胞の遊走、組織の再生、および創傷の治癒を促進し、または容易にすることができる。
一般に、本発明の組成物は、必要に応じて治療処置または予防処置に使用することができる。例えば、薬剤組成物は、皮膚の修復、創傷の治癒、火傷の治癒、および他の皮膚科学的処置のための治療用もしくは美容用調製物の形態で適用することができる。
【００９２】
薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に適することが好ましい。
特定の実施形態では、薬剤組成物は、本発明に従って培養した自己または同種異系のケラチノサイトを含む。
【００９３】
「薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」とは、全身投与に安全に使用することのできる固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当業界でよく知られている種々の担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽（ｍａｌｔ）、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝剤、乳化剤、等張生理食塩水、および塩酸塩、臭化物、硫酸塩を含む鉱酸の塩、酢酸塩
、プロピオン酸塩、マロン酸塩といった有機酸の塩などの塩、および発熱物質を含まない水を含む群から選択することができる。
【００９４】
薬剤として許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤が記載されている有用な参考文献は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（米国ニュージャージー州所在のマックパブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．）、１９９１年）であり、これを本願明細書に援用する。
【００９５】
患者に本発明の組成物を提供するには、任意の安全な投与経路を使用すればよい。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などの投与を使用することができる。
【００９６】
剤形には、錠剤、分散剤、懸濁物、注射剤、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアロゾル、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形には、本目的用に特別に設計された注射用もしくはインプラント用の徐放デバイス、または本目的用にも作用するように改変された他の形態のインプラントも挙げることができる。
【００９７】
徐放製剤は、例えば、アクリル樹脂、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸などの疎水性ポリマー、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのある種のセルロース誘導体でコーティングすることにより実現できる。他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを使用して徐放を実現してもよい。徐放型の製剤および送達デバイスの非限定的な例には、例えば、浸透圧ポンプ、ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）ポリマーを用いたミクロスフェア、ヒドロゲルポリマー、ＯｃｔｏＤＥＸ（商標）などの化学的に架橋されたデキストランゲル、およびｄ−乳酸−ＨＥＭＡが含まれる。
【００９８】
上記組成物は、投与製剤に適した方法で、かつ薬学的に有効な量を投与すればよい。本発明では、患者に投与される用量は、適切な期間にわたり患者に有益な応答をもたらすのに十分であるべきである。投与すべき薬剤の量は、対象者の年齢、性別、体重、および全般的な健康状態を含めて治療を施す対象に応じて、医師の判断いかんで決まる諸要因に応じて様々でよい。
【００９９】
創傷治癒のための薬剤組成物に関しては、本願明細書に援用する米国特許第５９３６０６４号および国際公開公報第９９／６２５３６号パンフレットが特に参考文献として挙げられる。
【０１００】
特定の１実施形態では、本発明の組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕでの噴霧送達に適する。
用語「噴霧」は、「エアロゾル」もしくは「ミスト」、または一般に液滴の形の液体懸濁物であるとされる「濃縮物」などの用語を包含し、またこれらの用語を例として挙げられる。
【０１０１】
本発明によれば、任意選択であるが、噴霧もしくはエアロゾル組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚細胞の増殖および遊走を促進するために、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択される少なくとも１種のＩＧＦを含んでもよいし、または特定の実施形態では、ＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰを含む単離型タンパク質複合体を含んでもよい。ＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦなどの追加の生物活性タンパク質が含まれてもよい。
【０１０２】
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明では、噴霧組成物中に存在するＩＧＦ複合体中のＶＮの固有の「粘着性」が、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびＥＧＦやｂＦＧＦなどの他の成長因子の送達を促進するであろうと予想される。 通常、本発
明の噴霧組成物は、送達用流出口を備えた加圧缶などの装置によって送達される。
【０１０３】
ブタモデルでの創傷治癒用など、エアロゾル化ケラチノサイト送達系の例が、ナヴァーロら（Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ、第２１巻、ｐ．５１３によって示されている。ブタモデルにおける創傷治癒用にエアロゾル化ケラチノサイトをフィブリン糊と合わせて使用することについて記載している、グラントら（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．）、２００２年、Ｂｒ Ｊ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ、第５５巻、ｐ．２１９も参考文献として挙げられる。
【０１０４】
本発明の噴霧組成物は、実質的に血清を含まないことが好ましい。
特定の１実施形態では、本発明の皮膚噴霧組成物は、調節器によって制御される医療用の圧縮空気流中へ送達することによって、フィブリン糊の噴霧式の適用を円滑にし、液体をエアロゾル化する、Ｔｉｓｓｏｍａｔ（登録商標）（バクスターヘルスケア社（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を構成する。６９〜２０７ｋＰａ（１０〜３０ｐｓｉ）の圧力が適切であるが、圧力を増大させると生存率の低下が認められる。細胞は、０．５〜１．５×１０６／ｍｌの濃度で噴霧するとよい。０．２ミリリットルの細胞懸濁液を１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で適用すると、約２５平方センチメートルの面積を覆うのに十分である（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間増殖させた後の、細胞で覆われた表面積の測定に基づく）。細胞は、無血清の増殖培地に含めて送達することが好ましいが、市販のＴｉｓｓｅｅｌ／Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（バクスターヘルスケア社（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））などのフィブリン糊に懸濁させてもよい。
【０１０５】
本発明の組成物のシリンジ送達（例えば、スプレーキャップを装着したシリンジ）を使用しても、同様の有効性が得られることが予想される。
［治療への使用］
特定の態様では、本発明は、火傷、創傷、および潰瘍の治療方法、ならびに肌質または肌の外観を改善し、または向上させるための皮膚の美容処置に関する方法を提供する。
【０１０６】
これらの方法は特に、哺乳動物、より詳細にはヒトの治療または処置を目的とする。しかし、本発明が、当業者には十分に理解されるように、飼養動物、家畜、および曲芸動物を治療するための獣医学的適用を有し得ることも承知されよう。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明に従って個体に投与することのできる初代ケラチノサイトをｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるための培地、培養システム、および方法を提供する。
【０１０８】
特定の実施形態では、ケラチノサイトは、本発明に従って培養した自己または同種異系のケラチノサイトである。
その方法としては、上述のように規定した薬剤組成物の投与を挙げることができ、米国特許第６０９０７９０号に記載のものなど、特定の組織部位への微細針による注射；米国特許第６０５４１２２号に記載のものなど、創傷、火傷、もしくは潰瘍に適用する局所用のクリーム、ローション、またはシーラント包帯剤；または国際公開公報第９９／４７０７０号に記載のものなど、組成物を放出するインプラントを用いるものでよい。
【０１０９】
遺伝子操作により所望の成長因子を発現させるなど、皮膚代替物を作製する目的のために皮膚細胞の遺伝子を改変できる方法も存在する（サップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第１１４巻、ｐ．５）。この分野の総説の例は、ベヴァンら（Ｂｅｖａｎ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、第１６巻、ｐ．２３１である。
【０１１０】
国際公開公報第９９／１１７８９号に記載のものなど、レシピエントに対する形質導入細胞または形質転換細胞の「接種」も企図される。
これらの方法を使用して細胞の遊走を刺激し、それによって、創傷および火傷の治癒、潰瘍などの皮膚病変の修復、自己の皮膚のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養などによる組織の置換および移植、腎臓や肺などの内部臓器の上皮再形成、ならびに損傷神経組織の修復を促進し、または進行させることができる。
【０１１１】
皮膚置換治療は、当業界でよく知られつつあり、例えば、ケヘら（Ｋｅｈｅ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、第２９１巻、ｐ．６００に記載されているような、上皮／ケラチノサイト同時培養細胞株の使用、または（通常は自己の）初代上皮細胞、真皮細胞、および／もしくはケラチノサイト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を採用することができる。これらの技術は、人工生体材料および合成ポリマーの「骨格」を利用するものでもよい。
【０１１２】
一般にこの分野の総説の例は、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ＆Ｖａｓｉｌｉｅｖ、１９９９年、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．、第１８８巻、ｐ．４１、ならびにＥａｇｌｅｓｔｅｉｎ＆Ｆａｌａｎｇａ、１９９８年、Ｃｕｔｉｓ、第６２巻、ｐ．１である。
【０１１３】
より具体的には、頭蓋顔面外科で有用な置換用口腔粘膜の生産について、イズミら（Ｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．、第７９巻、ｐ．７９８に記載されている。胎児のケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、皮膚病変を治療するための移植用皮膚を生産することができ（例えばファウザら（Ｆａｕｚａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．、第３３巻、ｐ．３５７に記載）、一方ヒアルロン酸由来の生体材料上でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した真皮および表皮の皮膚成分から得た皮膚代替物は、火傷の治療に潜在的に有用であることが示されている（ザッチら（Ｚａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第４０巻、ｐ．１８７）。
【０１１４】
例えば、シェリダンら（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１４巻、ｐ．９１ページ、およびファウザら（Ｆａｕｚａ
ｅｔ ａｌ．）、１９９８年（前掲）に記載されているように、代替皮膚の作出を円滑にする目的でポリマー骨格も企図されており、同様に創傷および火傷に皮膚細胞を送達するための作用物質としてミクロスフェアも企図されている（ラフランスおよびアームストロング（ＬａＦｒａｎｃｅ＆Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、１９９９年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、第５巻、ｐ．１５３）。
【０１１５】
通常は治療での使用向けに生産されるケラチノサイトシートは、熱傷創を最終的に閉じる役割を担う。このシート移植技術は、すべての部分層熱傷に適用可能であり、外部からの助けなしでは創傷部位およびドナー部位を早期に永久閉鎖することがほとんど不可能な広い面積の創傷の治療に最も有用である。このような創傷は、最近のバリ島の爆破で火傷を負った患者の死亡原因となった種類の傷害である。
【０１１６】
現在、患者の５０セント硬貨大の皮膚生検材料から成人全体を覆うのに十分なだけ皮膚を成長させることが可能である。この培養工程は１７日間を要する。
しかし、患者の外傷、感染の危険、瘢痕化、および永久的な皮膚移植に先立って現在必要とされる高価な仮の皮膚置換の必要性を減らすために、より早期の皮膚置換が早急に求められている。また、培養皮膚のシートは、多くの皮膚細胞を含み、該皮膚細胞は成熟しているものもあれば、未成熟のものもある。培養ケラチノサイトを集密（コンフルエント）にするという（皮膚シートの生産に必要な）単純な行為が原因で、細胞は最初に有していた特性を早期に喪失してしまう、すなわち分化してしまう。培養皮膚シートが適用され
るとき、未成熟の細胞のみが患者に接着し、定着することができる。狭い面積しか付着していないので、シートは、摩擦や患者の動きによって生じる損傷を非常に受けやすく、時には移植片全体を失うことになりかねない。その上、シート移植片では、シート中の皮膚細胞が成熟しているほど、移植片は定着しにくく、細胞自体も創傷床で増殖や遊走をしにくくなると思われる。したがって、未成熟な皮膚細胞をより早期に適用することが、より良好な移植片の定着をもたらし、瘢痕を減らすことは明らかである。
【０１１７】
したがって、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで培養した皮膚細胞を患者の火傷、潰瘍、または創傷のある皮膚に送達して、患者の身体のより広い表面域が、現存するシート移植技術よりもはるかに早期に未成熟の皮膚細胞によって覆われるようにするための噴霧もしくはエアロゾル送達法を提供する。この方法では、わずか７日という早さも可能になる。また、この方法は、瘢痕形成、ショック、および熱放散を大幅に低減すると考えられ、部分層熱傷だけでなく全層性熱傷においても皮膚機能のより迅速な回復を可能にすると考えられる。
【０１１８】
本発明によれば、任意選択ではあるが、投与される噴霧剤またはエアロゾルは、皮膚細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの増殖および遊走を促進するために、ＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰと共にＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦを含む単離型タンパク質複合体をさらに含んでもよい。
【０１１９】
患者自身の皮膚細胞（自己皮膚）およびドナーの皮膚細胞（同種異系または異種の皮膚）を、増殖させ、早期に熱傷創を閉鎖すべく使用することができる。ドナー細胞は、移植抗原を発現しないので、患者の免疫応答を引き起こさない。しかし、ドナーの皮膚細胞は、最終的には患者自身の皮膚細胞に入れ替わる。
【０１２０】
自己細胞が好ましいが、皮膚用噴霧剤に同種異系または異種の細胞を使用すれば、細胞を必要とする患者への即座の適用が可能になるはずである。あるいは、治療用噴霧剤に使用するのに十分な自己細胞が、約７日間で培養できるということもありうる。
【０１２１】
皮膚の表面（上皮）および深部層（真皮）の両方を失っている傷への培養皮膚の生着が弱いことから、本発明が企図する別の治療は、全層性の傷を早期に閉鎖するための熱傷患者の治療である。本発明は、真皮代替物を皮膚用噴霧剤と共に使用して、このような最も恐ろしい損傷を早期に永久的に閉鎖することを企図する。生物由来および合成のいずれの真皮代替物も企図される。例えば、死体由来の、表皮を除いて細胞を除いた（ｄｅ−ｃｅｌｌｕｌａｒｉｓｅｄ）、本発明の単離型タンパク質複合体を含む真皮骨格に、合成表皮（包帯剤）を被せることができる。本発明者らは、およそ７日後には、この真皮が自己内皮細胞による盛んな浸潤を受けるという仮説を立てている。この時点で、合成皮膚を取り除き、ｅｘ−ｖｉｖｏで増殖させた患者自身の線維芽細胞およびケラチノサイトを同種異系の真皮（ａｌｌｏ−ｄｅｒｍｉｓ）に適用する。
【０１２２】
真皮代替物は、栄養になり安定化させる骨格として働き、皮膚細胞および皮膚中に通常見られる他の重要な細胞の遊走および定着を促進するので、表皮シートよりもむしろ皮膚用噴霧剤の方が成功を収めると予想される。これによって、全層性皮膚損傷における培養皮膚細胞の生着の向上が実現されよう。
【０１２３】
本発明をより容易に理解し、実際の効果につなげることができるよう、当業者は、以下の非限定的な実施例を参照されたい。
【実施例１】
【０１２４】
［血清非存在下における初代ヒト・ケラチノサイトの増殖］
材料および方法
増殖因子濃度／培養用プラスチックへの予備的吸着
全ての実験において、ＶＮ、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰを添加する標準法を使用した。培養用プラスチックを、無血清培地中のビトロネクチン１５０ｎｇ／ｃｍ２とともに３７℃で２時間インキュベーションすることによって調製する。次に、ＶＮ溶液を取り除き、ＩＧＦＢＰ（２５０ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｃｍ２）、およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｃｍ２）を含む無血清培地に置き換える。これらの増殖因子を１晩４℃（冷蔵庫内）に放置してＶＮ処理プラスチックに吸着させる。翌日、増殖因子溶液を取り除き、ＶＮ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＧＦＢＰ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＧＦ−Ｉ １５ｎｇ／ｃｍおよびＥＧＦ １５ｎｇ／ｃｍを含む増殖培地（以下に定める）に置き換える。細胞を、以下の密度で加える。一般に、培地は３日に１度交換する。各培養物を、約６日間増殖させてから継代前する。すなわち継代の間隔は約６日間である。
【０１２５】
増殖培地
基本培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を３：１に混合したものであり、通常Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、アデニン（１８０μＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、および非必須アミノ酸混合物（１％ｖ／ｖ）を添加する。
【０１２６】
陽性対照培地は、さらに１０％ウシ胎児血清、インスリン（５μｇ／ｍＬ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。
播種密度
培養物を、増殖を停止させたマウス３ｔ３細胞（密度２．５×１０４／ｃｍ２）の存在下で増殖させた。３ｔ３細胞は、使用直前のガンマ線照射によって「増殖を停止」させる。
【０１２７】
ケラチノサイトを、継代数に応じて異なる２種類の密度で播種した。初代培養物（Ｐ０）を、３．８×１０４／ｃｍ２で細胞を播種して確立した。その後の培養物（Ｐ１、Ｐ２等）は、回収した細胞を６．４×１０３／ｃｍ２の密度で再播種することによって確立した。Ｐ０の培養物について高密度で播種したのは、培養時には採取したばかりの細胞の一部しか持続的に増殖しないものと思われるからである。こうして、細胞を培養することにより、増殖する母集団の拡大が可能となる。
【０１２８】
結果
従来の血清含有増殖培地との培養物の比較
図１を参照すると、このグラフは、単離したばかりのケラチノサイトの、ＶｉｔｒｏＧｒｏ（登録商標）を用いた平均的な増殖（＋３ｔ３細胞）を、ウシ胎児血清と３ｔ３細胞とのいずれも存在する従来法と比較して示すものである。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、細胞を回収して再播種した回数に相当する（Ｐ０＝皮膚試料から単離した直後の細胞による実施）。ＭＴＴによる染色を利用してデータを取得した。該データは、単離タンパク質複合体存在下の血清非存在下での培養が、１０％血清含有下で達成される細胞増殖の少なくとも９０％を常に達成したことを示している。
【０１２９】
図２Ａおよび２Ｂを参照すると、ＶｉｔｒｏＧｒｏと共に増殖させた皮膚細胞は、ウシ胎児血清存在下に増殖させた皮膚細胞（図２Ａ）と同様の外観を示す。分子マーカーの存在に基づくさらに詳細な比較は、この結論を確定するために現在進行中である。使用する技術には、免疫細胞化学法、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、ウエスタン・ブロッティング、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の各方法が含まれることになろう。最新のプロテオミクス技術および遺伝子アレイ技術の使用も考慮中である。検討する主たるマーカーは、サイトケラチン類（ＣＫ１およびＣＫ１０、ＣＫ６、ＣＫ１４、およびＣＫ
１９）および想定されるケラチノサイト前駆細胞マーカー（例えばｐ６３、α９−インテグリン、α６−インテグリンｂｒｉ／ＣＤ７１ｄｉｍ）を含むことになろう。想定される前駆細胞マーカーは、移植後の培養物において臨床上の有効性をもたらすと思われるため、該マーカーの発現の比較にことに注目が置かれることになろう。さらに、日常的なｉｎ
ｖｉｔｒｏの機能アッセイにおける細胞の反応（接着、遊走、増殖）も、実施可能である。
【０１３０】
ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体の相対的活性
図３を参照すると、ＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体が、ケラチノサイトの収量に関して、ＩＧＦＢＰ３を含む複合体よりも効果的であることが明らかである。
【実施例２】
【０１３１】
［フィーダー細胞の存在下および非存在下における、血清非存在下での初代ヒト・ケラチノサイトの増殖］
材料および方法
初代ケラチノサイトの培養
ラインヴァルトおよびグリーン（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ）、１９７７、Ｎａｔｕｒｅ、２６５巻、ｐ．４２１によって最初に報告された方法と基本的に同一である標準法を使用して、ヒト成人皮膚からケラチノサイトを単離した。簡潔に述べると、該方法はＤｉｓｐａｓｅＩＩ（商品名）溶液中での３７℃、１時間の皮膚試料の消化を伴うものであった。続いて、回収した上皮は、細胞を分離させるために０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡと共に３７℃でさらに１０分間消化される。残存トリプシン活性を不活化し、次いで回収した細胞を洗浄し、致死線量を照射した３ｔ３マウス線維芽細胞の存在下または非存在下、組織培養ディッシュに播種する。これらの標準条件を使用して培養した「対照」細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、０．１μｇ／ｍＬコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）、５μｇ／ｍＬインスリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、および２ｎＭトリヨードサイロニンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させるが、一方、単離増殖因子複合体で処理する細胞には、インスリンを含まないということを除いて同じ培地を使用した。インスリンは、インスリンが１型ＩＧＦ受容体へ競合的に結合するのを最小限にするために、単離タンパク質複合体処理と同時に使用される培地には含めなかった。また、単離増殖因子複合体でコーティングしたディッシュで培養した細胞は、放射線処理したマウス線維芽細胞を含まないプレートに細胞を播種するという点で、標準法にしたがって培養される細胞とは異なっていた。
【０１３２】
タンパク質合成アッセイ
ケラチノサイトは、成人皮膚生検由来であり、Ｇｒｅｅｎ培地、血清、およびフィーダー細胞を取り入れた標準法を使用して継代数２まで増殖させた。次にこれらの細胞を、タンパク質合成の促進に関して、ＩＧＦ＋ＶＮ複合体の存在下および不在下で評価した。ここでは、２４ウェル・プレートを、ビトロネクチン３００ｎｇで２時間コーティングし、次に結合していないビトロネクチンを除去するために洗浄された。次に、調べようとする増殖因子と共にウェルをインキュベートした。使用した増殖因子は、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、およびインスリン様増殖因子ＩＩであり、インスリン様増殖因子結合タンパク質５と組み合わせてウェルに加え、ビトロネクチンに１晩結合させた。翌日、結合していない増殖因子をすべて除去するためにウェルを２回洗浄し、プレートを風乾した。次に、ケラチノサイトを回収し、１ウェルあたり細胞１×１０５個の密度で、［３Ｈ］ロイシン １μＣｉ／ウェルを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。選択されたウェルにおいては、ケラチノサイトの無血清培養のための市販品である規定ケラチノサイト培地（Defined Keratinocyte Medium 、ＤＫＭ）（インビトロジェン（Invirogen ））に細胞を播種した。次にプレートを４８時
間インキュベーションし、取り込まれなかった［３Ｈ］ロイシンをすべて除去するために洗浄した。ｄｅ ｎｏｖｏ合成されたタンパク質への［３Ｈ］ロイシンの取り込みを、βシンチレーション計測用に可溶化タンパク質の沈渣を採取することによって評価した。
【０１３３】
ＭＴＴ‐Ｅｓｔａアッセイ
ヒト・ケラチノサイトを単離し、致死線量を照射したマウス３ｔ３細胞のフィーダー層が共存する添加剤を全て含んだＧｒｅｅｎ培地での標準培養技術を使用して、培養細胞を確立した。細胞を継代数３まで増殖させ、Ｇｒｅｅｎ培地を含む２４ウェル・プレートに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および３ｔ３細胞の存在下または非存在下で播種した。選択した処理については、ウェルを単離タンパク質複合体でコーティングした。ウェルをビトロネクチン３００ｎｇと共に２時間インキュベーションし、吸引除去してからＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５、あるいはＩＧＦ−ＩＩを加えた。プレートを１晩インキュベーションし、吸引除去してから細胞を播種した。培養物について、すでに報告されているＭＴＴ‐Ｅｓｔａアッセイ（Ｅａｌｅｙら、１９８８、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１巻、Ｒ１〜Ｒ４）を使用して測定したように、代謝活性に関して評価した。
【０１３４】
結果
樹立細胞株において単離増殖因子複合体によって得られた機能的反応の有意な促進（国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレット；Ｎｏｂｌｅら、２００３、前掲；Ｋｒｉｃｋｅｒら、２００３、前掲）を考慮し、本発明者らは、最近になって本発明者らの研究を成人皮膚に由来するケラチノサイトの細胞培養へと広げた。特に、本発明者らは、自己の分層皮膚移植のためのｅｘ ｖｉｖｏにおけるケラチノサイトの増殖のために、現在最善の臨床業務において使用される血清およびフィーダー細胞を、単離増殖因子複合体に置き換える可能性について検討した。この方法は、熱傷の患者に利用可能な非常に進歩した治療法であるが、患者由来のケラチノサイトの培養は、病原体の供給源となる可能性があり、半確定状態の生体異物製品であるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で実施される。さらに、ケラチノサイトの分離および確立を行う初期の段階において、第２の生物種、すなわちマウス３ｔ３細胞に由来するフィーダー細胞層が、細胞の接着と増殖とを助長するためのサイトカインおよびマトリクス成分の供給源として使用される。ＦＢＳもこれらの作用に寄与する。
【０１３５】
（ｉ）ＩＧＦ類はフィーダー細胞によって分泌されるサイトカイン類の大部分を占めること、（ｉｉ）ＶＮが、プラスチック器材に低密度で播種されたケラチノサイト初代培養細胞の接着を促進するためのあらゆる血清要求性を代替することが確認されたこと、ならびに（ｉｉｉ）単離増殖因子複合体と共に培養されたケラチノサイト細胞株で得られた作用が、１０％ＦＢＳを含む培地で得られた作用と同等であることから、本発明者らは、単離増殖因子複合体を添加した培地が、自己ケラチノサイト工学への適用に対して優れた産物を提供する可能性を有すると仮説を立てた。この仮説は、ＩＧＦ類がケラチノサイトの増殖を刺激する鍵となるマイトジェンであるがケラチノサイト自体はＩＧＦ−Ｉを分泌しないという事実によって支持される。ＫＧＭ（商標）（クロネティクス（Clonetics ））およびＥｐｉＬｉｆｅ（商標）（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich ））といった無血清培地が、ケラチノサイトの増殖のために商業的に開発されてきたが、これらの培地は、不確定で、生体異物の、病原体供給源となる可能性を有しているウシ下垂体抽出物の添加を必要とするか、または高価な添加物を加えることが必要である。さらに、最新の無血清ケラチノサイト培養の用途には、非常に高密度での播種が必要とされるため、ケラチノサイトを大量かつ迅速に培養するという目的が頓挫することとなり、かつ日常的な臨床適用にこれらの方法があまり採用されない原因ともなっている。
【０１３６】
本発明者らは仮説を直接試験し、その結果は図４に示されている。この実験では、ケラ
チノサイトは成人皮膚由来であり、通例の方法にて７日間で確立した。次に、細胞をトリプシン処理によって継代し、低密度（ケラチノサイト８５００個／ｃｍ２）で、単離増殖因子複合体でコーティングした組織培養用プラスチック上に播種し、フィーダー細胞の非存在下、ＦＢＳもインスリンも含めずにさらに７日間増殖させた（図４）。これらの条件で増殖させた細胞が、最新かつ最善の臨床上の方法のみを使用して増殖させた細胞（すなわちＦＢＳおよびマウス３Ｔ３フィーダー線維芽細胞と共に増殖させたもの、図４）よりも迅速に増殖することが判明した。単離タンパク質複合体の存在下で増殖させたコロニーの周辺部は、ケラチノサイトが外側に向かって移動し、正常で、増殖していることを示している。図４に示されている最も内側の細胞は、コンフルエンス間近のケラチノサイト培養物で観察される典型的な敷石状の形態を示しているが、この場合はちょうど７日でコンフルエンスに達した。これらのタンパク質複合体存在下でのケラチノサイトの増殖をＭＴＴアッセイで定量化することによって、これらの知見（図４Ｂ）が確定する。
【０１３７】
フィーダー細胞は最初の生検からの培養細胞の確立に重要と思われるため、その後のデータは、ケラチノサイトがフィーダー細胞非存在下（血清も含まない）で良好に増殖する能力が、細胞培養の比較的遅い段階に限られることを示唆する傾向にあった。
【０１３８】
添加した増殖因子ＥＧＦおよびｂＦＧＦの作用について、図５に示す。本発明者らは、継代数３のヒト皮膚ケラチノサイト（成人皮膚生検由来）について調べ、添加したＩＧＦ＋ＶＮ複合体によるタンパク質合成の促進を、４８時間にわたって評価した。これらの処理については、ケラチノサイトの無血清培養のための市販品である、未知量のインスリン、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含んだ規定ケラチノサイト−ＳＦＭ（ＤＫＭ）（インビトロジェン）で増殖させた細胞と並行して調べた。ＤＫＭは、タンパク質合成の増大を促進して、上記対照ウェル（−ＶＮ）より１４８％上昇させることが明らかとなり、これはＶＮ単独（＋ＶＮ）やＶＮおよび増殖因子を含まない場合（−ＶＮ）での作用より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＩＧＦ−ＩＩ＋ＶＮの２量体およびＩＧＦ−ＩＩ＋ＶＮ＋ＩＧＦＢＰ−５の３量体の複合体も、タンパク質合成の大幅な増大を促進し、それぞれ１３４％および１６１％（ｐ＜０．０５）上昇させた。実際、ＤＫＭ、２量体複合体、および３量体複合体で観察されたタンパク質合成の促進に関して有意差はなく（ｐ＞０．０５）、いずれの複合体も、ケラチノサイトのタンパク質合成の刺激において市販品であるＤＫＭと同程度に有効であることを示している。
【０１３９】
ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたは両方の増殖因子を組み合わせて３量体複合体に加えた場合、２１６％、２４８％、および２１３％の上昇が観察された。これらの反応全てがＤＫＭでの上昇より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。同様に、ＥＧＦ、またはＥＧＦとｂＦＧＦとの双方を２量体複合体に加えた場合、タンパク質合成においてそれぞれ１９２％および１９８％の顕著な上昇が得られ、この上昇はＤＫＭでの上昇より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果によって、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを単離タンパク質複合体に取り入れることで、無血清かつフィーダーを使用しないケラチノサイト培養用の市販品を上回るタンパク質合成の増大が促進されるということが明らかとなる。
【実施例３】
【０１４０】
［皮膚への噴霧技術］
材料および方法
ここでは２つの問題を扱う。第１に、噴霧用細胞懸濁物が適用できるようになる十分な数の細胞が、１週間以内にＶｉｔｒｏＧｒｏ上で生産される。したがって、この技術は既に使用されている市販品（クリニカルセルカルチャーリミテッド（Clinical Cell Culture Ltd ））の技術と一致するが、無血清という利点がある。第２に、ＶｉｔｒｏＧｒｏで増殖した細胞は噴霧後も生存が維持される。本発明者らが使用してきた送達システムはＴｉｓｓｏｍａｔ（登録商標）（バクスターヘルスケア（Baxter Healthcare ））である。
Ｔｉｓｓｏｍａｔ送達システムは、フィブリン糊の噴霧施用のために設計されており、調整器で制御された医療用圧搾空気流の中に送達することで液体をエアロゾル化する。しかしながら、代替の噴霧法（噴霧器のキャップに取り付けたシリンジ）を使用しても同様の結果が達成可能であると本発明者らは期待している。圧力は６９〜２０７ｋＰａ（１０〜３０ｐｓｉ）が適切であるが、圧力を上昇させると生存率の低下が観察される。細胞を１ミリリットルあたり０．５〜１．５×１０６個の濃度で噴霧するとよい。細胞懸濁液０．２ミリリットルを１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で適用すると、約２５ｃｍ２の領域の被覆に十分である（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間増殖させた後に細胞で覆われる表面域の測定に基づく）。細胞を無血清増殖培地中で送達することも可能であるが、市販品のＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）／Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（バクスターヘルスケア）といったフィブリン糊に懸濁して使用してもよい。本発明者らの研究によると、フィブリン糊は、注射用無菌水で等張条件に希釈し、さらに最終フィブリン糊成分を無菌生理食塩水でフィブリノゲンについては１〜１０ｍｇ／ｍＬ、トロンビンについては１０〜１００単位／ｍＬに調整することによって、使用前に調製するべきである。
【０１４１】
結果
図６は、ケラチノサイトを、コラーゲンでコーティングされた直径１５０ｍｍの培養ディッシュに噴霧送達した後の細胞の分布および増殖を示す。重要なことには、ＶｉｔｒｏＧｒｏで増殖した細胞は、噴霧後に良好な生存率を示す。噴霧領域の被覆に必要な細胞数を測定するために、細胞を２つの異なる濃度で噴霧した。噴霧に使用した培養物は、対照（血清含有）、またはＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−Ｉを伴うビトロネクチンのいずれかで元々培養したものとした。全ての培養物は、３ｔ３細胞存在下で調製した。噴霧後、創傷部位における条件を模倣するために、細胞を血清存在下で増殖させた。該培養物を、細胞分布を示すためにクリスタル・バイオレットで染色した。
【０１４２】
図７に示されるように、Ｔｉｓｓｏｍａｔ送達システムによる培養ケラチノサイト噴霧の作用を見ることができる。これらの予備実験のためには、血清およびフィーダー細胞を加えた従来の培養培地を使用して培養細胞を確立した。図７Ａでは、捕集用チューブ内に細胞を噴霧した後数分以内にトリパン・ブルー排除試験を実施したが、該試験は生存細胞には色素が透過しないという原理によるものである。図７Ｂに見られるように、ＭＴＴ換算データは、細胞噴霧後２４時間における代謝活性の指標を提供するので、より確かな生存率測定法である。
【０１４３】
図７Ａおよび７Ｂのいずれにおいても、送達圧力は２０７ｋＰａ（３０ｐｓｉ）でも許容できる生存率であるが、至適送達圧力は６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉ）であることがわかる。
【実施例４】
【０１４４】
［皮膚用噴霧剤の臨床試験］
皮膚生検の採取
適切なドナー部位を選び、剃毛と殺菌剤による消毒とによって準備する。約１０ｃｍ２の分層皮膚移植片を、手術室で局所麻酔の下に採取する。この生検物を、抗生物質を含む無菌生理食塩水中に入れ、処理のために直ちに皮膚培養室に運ぶ。ドナー部位には、担当外科医の判断にしたがってＯｐｓｉｔｅ（登録商標）または他の被覆材を貼付する。
【０１４５】
ケラチノサイトの単離および培養
皮膚培養施設に到着後、各患者の生検物を無菌緩衝液で洗浄し、その後の培養における細菌汚染の可能性を低減させるために、抗生物質中において室温で１時間インキュベーションする。表皮層および真皮層を、トリプシン消化によって分離する。分離した組織の向かい合う面をこすり取って、取り出した細胞（主として基底ケラチノサイト）を洗浄し、
大豆トリプシン阻害剤を含む無血清培地中に再懸濁する。この最終細胞懸濁液を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコに播種するが、フラスコには、増殖を停止させたマウス３ｔ３線維芽細胞（２．５×１０４個／ｃｍ２）ならびにビトロネクチン（ＶＮ、５０ｎｇ／ｃｍ２）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ、１５ｎｇ／ｃｍ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５、５０ｎｇ／ｃｍ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ、１５ｎｇ／ｃｍ２）、アデニン（１８０μＭ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、および非必須アミノ酸類（１％ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地５ｍＬが含まれる。培養フラスコを、タンパク質複合体が予め吸着しやすくするために、ＶＮ（３００ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦＢＰ５（５００ｎｇ／ｃｍ２）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｃｍ２）で前処理する。新鮮培地を、３日後に加える。６日間の培養後に、３ｔ３細胞をＥＤＴＡ含有緩衝生理食塩水中でのインキュベーションによって取り除く。残るケラチノサイトを、トリプシン／ＥＤＴＡでさらにインキュベーションすることによって採取し、大豆トリプシン阻害剤を含む緩衝生理食塩水で洗浄する。回収した細胞の濃度を、０．２％ヒト血清アルブミンを含む緩衝生理食塩水で２×１０６個／ｍＬに調製し、手術室に運ぶ。
【０１４６】
ケラチノサイト懸濁液の調製および送達
ＴＥＳＳＥＥＬ Ｄｕｏ ５００（登録商標）を、製造元の指示に従って３７℃に静置して融解させる。融解したら、フィブリノゲンおよびトロンビンのシリンジをそれぞれのホルダから取り外し、無菌プラスチック・チューブに分注する。フィブリノゲン成分は、注射用無菌水で１：１に希釈してから患者細胞懸濁液ストック（第２段階で調製したように細胞２×１０６個／ｍＬ）でさらに１：４に希釈する。トロンビン成分は、注射用無菌水で１：０．２５（すなわち４：１）に希釈する。希釈処理した各成分（フィブリノゲン＋細胞およびトロンビン）の等容量を別個の１ｍＬシリンジに装填し、Ｄｕｐｌｏｊｅｃｔ（登録商標）噴霧ノズルを介してＴＩＳＳＯＭＡＴに装着する。適用時には、２本のシリンジが均等に圧縮され、さらに各成分が１：１の混合物となる。このように、噴霧産物中の最終濃度は、細胞が０．８×１０６個／ｍＬ、トロンビンが１７０ＩＵ／ｍＬ、フィブリノゲンが４．７ｍｇ／ｍＬとなる。混合液約０．５ｍＬを、１０ｃｍの高さから１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で連続的に各２０ｃｍ２の分層創傷に送達する。従って、適用される細胞の平均播種密度は０．２×１０５個／ｃｍ２である。各噴霧の高さおよび間隔は、手の幅（高さ）および３指を合わせた幅（間隔）を使用して概算される。処置される創傷は、日常的な自家分層皮膚移植（火傷の治療や痙縮解除処置）を実施する過程で生じるものである。各創傷のおよそ半分を、噴霧時に無菌マスクで覆って非処置対照とする。２つのドナー部位を使用するとよい。すなわち、１つは処置用、１つは非処置用である。細胞懸濁液を適用する前後に、各創傷を写真撮影する。処置した創傷をＯｐｓｉｔｅ（登録商標）シリコン被覆材で覆う。
【０１４７】
術後の臨床上の注意および評価は、従来のプロトコールに従って行われる。
【実施例５】
【０１４８】
［ＯＲＳ由来細胞の増殖および遊走］
外毛根鞘（ＯＲＳ）初代培養細胞は、同意を得た糖尿病患者の頭皮から採取された成長相の毛嚢に由来するものとし、リマトおよびフンツィカー（Ｌｉｍａｔ＆Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）、２００２、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、第１７２巻、ｐ．７９〜８５および国際公開第０１／５９４４２号パンフレットによって記載された方法を使用して培養する。細胞は、事前に形成した分裂終了ヒト皮膚線維芽細胞フィーダー層およびウシ胎児血清添加培地を使用して、皮膚由来のケラチノサイトについて前述したように、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる。培養物を、最大継代数を３としてほぼコンフルエントな状態で維持し、単離タンパク質複合体存在下での細胞増殖の形態学的かつ機能的評価を、血清
およびフィーダー細胞の非存在下で検討する。
【０１４９】
皮膚由来ケラチノサイトの増殖のために至適であると評価された特定の複合体について試験する。
ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＯＲＳ由来ケラチノサイト前駆細胞が、単離タンパク質複合体存在下で増殖かつ遊走することが実証されたため、次に、成長相のＯＲＳからの最初の細胞採取と以後の初代培養とについても、血清およびフィーダー細胞を含まない条件で実施可能かどうかを評価する。よって、成長相の毛嚢のＯＲＳを細胞培養インサートの微小孔性膜上に移植し、該膜インサートの下側を分裂終了皮膚線維芽細胞のフィーダー層で被覆するかわりに単離タンパク質複合体で被覆する。細胞を、無血清培地のみ、または患者から採取した自家血清を添加した培地、または単離タンパク質複合体を含む培地で増殖させる。単離タンパク質複合体存在下で増殖させたＯＲＳ由来細胞の増殖速度を、従来の方法を使用してインサート上で増殖させた細胞と比較する。
【０１５０】
また、リマトおよびフンツィカー（Ｌｉｍａｔ＆Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）、２００２、前掲によって記載されているようにして細胞を空気に曝すことにより上皮相当物を調製し、組織学的、超微細構造学的（例えば底部の膜様構造、ケラトヒアリン顆粒、ケラチノゾーム）および免疫組織化学的（例えばケラチン、インテグリン、ｇｐ８０、インボルクリン、フィラグリン）な基準を使用して特性を明らかにする。成功すれば、この増殖因子＋ＶＮ技術によるＯＲＳ由来前駆細胞の使用は、製造コストを顕著に低減させるだけでなく、安全性を促進し、したがって細胞を基盤とする治療法の認可に伴う規制上の問題が迅速に処理されることになろう。
【実施例６】
【０１５１】
［精製ビトロネクチンの調製］
患者血液から精製された自家ビトロネクチン（通常は血液中に０．４ｍｇ／ｍＬで存在する）を、ｅｘ ｖｉｖｏにおける患者自身のケラチノサイトの増殖を支持するために使用する。本発明者らは、ビトロネクチンに対して作製されたモノクローナル抗体でありヒト血清からのビトロネクチンの精製における使用に成功している抗体（アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、２００１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ．、第２４７巻、ｐ．２１７〜２４）について検討する。検討用に選択したモノクローナル抗体を、血清からのＶＮの精製について記載された方法と同様の方法を使用して、精製用マトリクス支持体に連結させる。この段階で、本発明者らは、１ｍ２の患者の細胞を培養するためには０．２５ｍｇのＶＮが必要であると推測するが、この量は２０ｍＬの患者血液から容易に得られるはずである。アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、２００１、前掲による精製方法を、最小限の操作および簡便性に力点をおいて改変するが、理想的には２〜３回の洗浄ステップだけで済む使い捨てのアフィニティ精製マトリクスを開発することが目的である。ＶＮは患者自身に由来するため、得られたＶＮが依然として効果的に細胞増殖を促進可能であるなら、純粋なＶＮである必要性は低減される。したがって、開発されたプロトコールを使用して精製されたＶＮを、ケラチノサイトの増殖を促進する有効性について評価するとともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端タンパク質配列決定、静電噴霧質量分析法、ならびにＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの結合といった標準的生化学的分析を通して評価し、またプロメガ（株）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）から購入したＶＮと比較する。
【０１５２】
明細書全体にわたって、本発明をいずれの１実施形態、特定の特徴の集合体にも限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することを目的としてきた。したがって本明細書の開示を考慮して、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態を様々に改変および変更できることは当業者には理解されよう。
【０１５３】
本明細書で参照した全てのコンピュータ・プログラム、アルゴリズム、特許文献、および学術文献は、参照により本願明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養に関する。より詳細には、本発明は、ケラチノサイトを増殖させて皮膚を成長および再生させる際に使用することを目的とした、培地、システム、および方法に関する。本発明はまた、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を成長および再生させる際に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）であるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、過形成、ＤＮＡ合成、分化、細胞周期の進行、およびアポトーシスの抑制を含む、広い範囲の細胞プロセスに関与する分裂促進性ペプチド成長因子である（非特許文献１〜３）。これらの効果は、細胞表面のチロシンキナーゼ結合型受容体、すなわち１型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）への該因子の結合を介して発揮される。ＩＧＦはまたＩＧＦＢＰと呼ばれる特異的に結合するタンパク質ファミリーにより厳格な調節を受けるが、ＩＧＦＢＰは、遊離ＩＧＦに結合することによって、ＩＧＦの半減期、特異性、および活性を適正にすることを主な役割としている（非特許文献４）。
【０００３】
最近になって、ビトロネクチン（ＶＮ）がＩＧＦ−ＩＩに直接的に結合することが示されているが（非特許文献５）、ＩＧＦ−Ｉは、ある種のＩＧＦＢＰの存在下でＶＮに結合し得る（特許文献１；非特許文献６）。ＥＣＭを組織化する分子であり接着分子でもあるＶＮが、ＩＧＦ−ＩＩがその生物学的受容体に該当するＩＧＦ−ＩＲに結合する親和性と同様の親和性でＩＧＦ−ＩＩに結合するという発見（非特許文献５）は、ＩＧＦの作用とＥＣＭ中のＶＮとの特異的な物理的関連を明らかにするものである。さらに、ＶＮに結合したＩＧＦ−ＩＩ、およびＩＧＦＢＰを介してＶＮに結合したＩＧＦ−Ｉは、ヒト・ケラチノサイトを含む多様な細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで相乗的な機能的応答を刺激し得る（特許文献１；ノーブルら（Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ．）、２００３年、前掲；非特許文献６）。
【０００４】
創傷、火傷、および潰瘍は、衰弱をもたらし痛みを伴う皮膚状態であり、集中的で費用のかかる治療が必要となるが、部分的にしか成果の上がらないことが多い。例えば、現在５２０，０００人を超えるオーストラリア人が糖尿病と診断され、そのうち５％超が足潰瘍になる。このような創傷は、患者の生活の質を著しく損ない、しばしば入院期間を延長し、ついには切断に至ることもある。実際、行われる下肢の切断の大半は、回復しない潰瘍のせいであるとされる。
【０００５】
創傷、火傷、および潰瘍の治癒へ向けたより一層好ましい手法は、死んだ皮膚または損傷を受けた皮膚を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた自己または同種のケラチノサイトに替えることである。通常、ケラチノサイトは、血清やウシ下垂体抽出物などの外部から添加した外来因子の存在下にて所定の培地で、通常はケラチノサイトの増殖を最適にするフィーダー細胞（栄養支持細胞）と共に増殖させる。
【特許文献１】国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレット
【非特許文献１】ケイスら（Ｋｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第４１巻、ｐ．６６
【非特許文献２】ウーおよびイー（Ｗｏｏｄ＆Ｙｅｅ）、２０００年、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ 第５巻、ｐ．１
【非特許文献３】ジョーンズおよびクレモンズ（Ｊｏｎｅｓ＆Ｃｌｅｍｍｏｎｓ）、１９９５年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．第１６巻、ｐ．３
【非特許文献４】クレモンズ（Ｃｌｅｍｍｏｎｓ）、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． 第１４０巻、ｐ．１９
【非特許文献５】アプトンら（Ｕｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 第１４０巻、ｐ．２９２８〜３１
【非特許文献６】Ｋｒｉｃｋｅｒら、２００３年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． 第１４４巻、ｐ．２８０７〜１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
典型的な従来技術のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養システムは、前述の外来因子を含めなければならないので比較的費用がかかる。その上、血清やウシ下垂体抽出物などの動物由来の外来因子は、比較的不確定なものであり、ＣＪＤ、ＨＩＶおよびその他の疾患を引き起こすものなど感染性の物質が含まれる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのため、本発明者らは、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮからなるタンパク質複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏの初代細胞培養物において血清の非存在下で顕著な増殖応答を刺激することを発見した。より詳細には、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮからなるタンパク質複合体は、皮膚の交換、火傷および創傷の治癒、ならびにｅｘ ｖｉｖｏでの皮膚増殖を必要とする他の治療処置を目的としたケラチノサイトの増殖を強化するために使用することができる。
【０００８】
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦを含むことと、
（ｉｉ）血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含むことと
を特徴とする細胞培養培地を提供する。
【０００９】
１実施形態では、培養培地はＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰを含む。
第２の態様では、本発明は、培養容器と第１の態様の細胞培養培地とからなる細胞培養システムを提供する。
【００１０】
本発明の培養培地および培養システムのうち少なくともいずれかが、ビトロネクチン（ＶＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）のうち少なくともいずれかまたはそれらの断片をさらに含んでもよいことは理解されよう。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、第１の態様の細胞培養培地および第２の態様の細胞培養システムのうち少なくともいずれかにおいて１または複数種の細胞を培養する工程を含む細胞培養方法を提供する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、第３の態様の方法に従って培養された１または複数種の細胞を、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に含んでなる薬剤組成物を提供する。
【００１３】
好ましい実施形態では、薬剤組成物は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞のエアロゾル送達に適している。
第５の実施形態では、本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生するためのケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞の送達方法であって、個体に前記第４の態様の薬剤組成物を送達して皮膚の再生を促進する工程を含む方法を提供する。
【００１４】
この態様の好ましい実施形態は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生させる方法であって、
（ｉ）個体の皮膚に１または複数種のケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を噴霧する工程と、
（ｉｉ）前記ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を増殖させて、ｉｎ ｓｉｔｕで再生皮膚を形成させる工程と
を含む方法を提供する。
【００１５】
本明細書中では、別段の指摘がない限り、「含む、含んでなる、からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、記載されているものが、その他の記載されていない１または複数のものを含み得るように、排他的でなく包含的に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】血清の非存在下における、単離タンパク質複合体およびフィーダー細胞の存在下でのケラチノサイトの増殖を示す図。ウシ胎児血清および３ｔ３細胞のいずれも存在する従来の方法と比較した、新鮮な単離ケラチノサイトのＶｉｔｒｏＧｒｏ（登録商標）（＋３ｔ３細胞）存在下での平均的な増殖を示している。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、細胞を回収して再び播種した回数に相当する（Ｐ０＝皮膚試料から単離した直後の細胞の能力）。増殖中の細胞によって着色物質へと変換されるＭＴＴを用いた染色によりデータを取得した。異なるドナー組織間の変動が大きいため、エラー・バーは示していない。
【図２】血清の非存在下において、単離タンパク質複合体およびフィーダー細胞の存在下で増殖させた後のケラチノサイトの形態を示す図。細胞は、ウシ胎児血清およびマウス３ｔ３細胞の存在下で３週間（Ａ）、またはＶｉｔｒｏＧｒｏ（Ｂ；ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦ−Ｉ）およびマウス３ｔ３細胞の存在下で血清の非存在下にて３週間、増殖させた。スケール・バーは約２００マイクロメートル（μｍ）である。
【図３】ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体の相対的活性を示す図。対照＝１０％ウシ胎児血清を添加した標準的なケラチノサイト増殖培地。ＶｉｔｒｏＧｒｏ３＝ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ３、およびＩＧＦ−Ｉ（無血清）。ＶｉｔｒｏＧｒｏ５＝ビトロネクチン、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦ−Ｉ（無血清）。全ての培養物を、ガンマ線照射したマウス３ｔ３細胞存在下で増殖させた。
【図４】ＩＧＦタンパク質複合体が、ｅｘ ｖｉｖｏでのケラチノサイトの増殖を支持することを示す図。ＩＧＦタンパク質複合体上に播種したヒト成人皮膚由来ケラチノサイトは生き残り、ウシ胎児血清の存在下で照射処理したマウス３ｔ３細胞上に播種された細胞に匹敵する速度で増殖する。細胞増殖は、（ａ）培養物の形態／集密度（コンフルエンス）の視認検査、および（ｂ）ＭＴＴアッセイによる定量化によって観察した。（ａ）左から右へ、フィーダー層＋ウシ血清、対照、ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ５＋ＶＮ（フィーダー層も血清も含まない）、（ｂ）左から右へ、グリーン培地＋フィーダー層＋ウシ血清、グリーン培地＋フィーダー層のみ、インスリンを含まないグリーン培地＋ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ３＋ＶＮ、インスリンを含まないグリーン培地＋ＩＧＦ−Ｉ＋ＩＧＦＢＰ５＋ＶＮ。ＶＮは、３００ｎｇ／ウェルである。ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−ＩＩは１００ｎｇ／ウェル、かつＩＧＦＢＰ類は３００ｎｇ／ウェルである。
【図５】その他の増殖因子を加えたＩＧＦタンパク質複合体が、ケラチノサイト培養物の増殖をさらに促進することを示す図。ヒト成人皮膚由来のケラチノサイトを、ＩＧＦタンパク質複合体＋上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いて培養し、［３Ｈ］ロイシンの取り込みによってタンパク質合成について検査した。ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ５およびＶＮの３量体複合体、またはＩＧＦ−ＩＩおよびＶＮタンパク質の２量体複合体について播種した細胞は、規定ケラチノサイト培地（ＤＫＭ、インビトロジェン）に匹敵する速度で増殖する。さらにＥＧＦ（１００ｎｇ／ウェル）およびｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ウェル）が加わったＩＧＦタンパク質複合体は、ＤＫＭと比較して、タンパク質合成を有意に促進した（ｐ＜０．０５）。ＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−ＩＩは、１００ｎｇ／ウェルであり、ＶＮは３００ｎｇ／ウェル、およびＩＧＦＢＰ類は３００ｎｇ／ウェルである。
【図６】ケラチノサイト生存率に対するＴＩＳＳＯＭＡＴ（登録商標）の作用を示す図。ケラチノサイトをコラーゲンコーティングした直径１５０ｍｍの培養ディッシュに噴霧播種した後の、細胞の分布および増殖を示す。噴霧領域の被覆に必要な細胞数を測定するために、細胞を２つの異なる濃度で噴霧した。噴霧に使用した培養物は、対照（血清含有）またはＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦ−Ｉが共存するビトロネクチン（ＶｉｔｒｏＧｒｏ）のいずれかで元々培養したものとした。全ての培養物を、３ｔ３細胞存在下で調製した。次に、培養物を、コラーゲンコーティングプレート上で血清存在下にて７日間増殖（創傷部位に送達した後の条件を模倣して設定）させた後に、クリスタル・バイオレットで染色した。噴霧量は０．２ｍＬ、噴霧圧１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）、高さ＝１０ｃｍとした。
【図７】ケラチノサイト生存率に対するＴＩＳＳＯＭＡＴの作用を示す図。培養物を、血清を添加した従来の培養培地を使用して確立した。（Ａ）トリパン・ブルー排除試験を、捕集チューブ中に細胞を噴霧した後、数分以内に実施した。生細胞は該色素に対する透過性がない。（Ｂ）ＭＴＴ変換データは、細胞噴霧後２４時間の代謝活性を示す、生存率の指標である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＩＧＦ−ＩＩとＶＮ、またはＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰとＶＮとを含んでなる培地が、通常はケラチノサイトのｅｘ ｖｉｖｏでの増殖に必要な血清の非存在下、ｅｘ
ｖｉｖｏのケラチノサイト初代培養物において顕著な増殖応答を刺激するという発見から生まれた。
【００１８】
さらに、特に細胞培養物が最初に確立してしまった後の細胞培養の後期段階では、フィーダー細胞の絶対的な必要を少なくともある程度解消することができる。
したがって、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで皮膚を再生させるための現行の最善の臨床業務を改善する技術を提供する。さらに、本発明は、組織生検からのケラチノサイトの誘導および樹立も提供する。好ましい形態では、本発明は、患者自身の血清から単離された自己ビトロネクチンまたは組換え生産された自己ビトロネクチンを利用し、それによって異種または同種異系の支援システムの使用がさらに最小限に抑えられるだけでなく、不確定な補充製品の使用が排除されるケラチノサイトの培養培地および培養システムを提供する。したがって、このことから、好適な治療用途に転換することのできる、自己細胞を主体とした組織工学システムが提供されることになろう。
【００１９】
本発明の目的では、「単離（された）、単離型（の）」とは、材料がその本来の状態から取り出されているか、または人の手による操作を受けていることを意味する。単離（型）材料は、その本来の状態では通常付随する成分を実質的または本質的に含んでいなくてもよいし、その本来の状態では通常付随する成分を伴ったまま人工の状態になるように操作されていてもよい。単離材料は、天然型、化学合成型、または組換え型のいずれでもよい。
【００２０】
本明細書では、「合成（の）」とは、天然に生じたものではなく、人による技術が介入
してできているという意味である。合成タンパク質および合成核酸に関しては、この語句は、当業界でよく理解されているように、組換え技術、または化学合成およびコンビナトリアル技術によって生産された分子を含む。
【００２１】
「タンパク質」とは、アミノ酸重合体を意味する。アミノ酸は、当業界でよく理解されているように、天然型または非天然型のアミノ酸、すなわちＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のいずれでもよい。
【００２２】
「ペプチド」とは、アミノ酸が５０個未満のタンパク質である。
「ポリペプチド」とは、アミノ酸が５０個以上のタンパク質である。
特定の態様では、本発明は、血清などの外来の動物由来の因子を必要としないか、または細胞の増殖および生存能力のうち少なくともいずれかが維持されるのに必要な前記因子のレベルが実質的に低減された、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかを含む細胞培地および細胞培養システムを提供する。
【００２３】
本発明は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかに応答するあらゆる種類の哺乳動物細胞に適用可能であることが理解されよう。
そのような細胞は、一般に、上皮細胞、筋芽細胞およびそれらの前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞などの中胚葉由来の細胞である。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明は、ケラチノサイト、ケラチノサイト前駆細胞などの皮膚上皮細胞、および角膜上皮細胞を含めた上皮細胞に適用可能である。実際には、皮膚上皮細胞および角膜上皮細胞はいずれも、ケラチンタンパク質を産生するので「ケラチノサイト」とみなしてよい。
【００２５】
ケラチノサイトおよび／またはその前駆細胞は、正常な皮膚、創傷や潰瘍から採取したものなどの皮膚生検材料由来のものでもよいし、または毛嚢の外毛根鞘（ＯＲＳ）細胞から得たものでよく、またこれらに限られるものでもない。
【００２６】
したがって、例えば、口腔および呼吸器の粘膜（口、鼻、気管、および食道の内側の層）や尿生殖器組織（例えば、膣、膀胱）といった、上皮細胞が見られる場所であれば、本発明の培地、方法、およびシステムを使用して置換組織を構築できる可能性があることが理解されよう。これらの組織は、火傷および他の外傷などによる損傷を受けているものでもよく、それ自体、皮膚生検材料と同様の手段で増殖させた培養移植片を使用して治療することができる。
【００２７】
本発明は、同じく通常は培養中に血清を必要とするヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞に適用することもできる。
したがって、「血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含む」とは、血清が全く存在しないか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの最適な細胞の増殖および／または発育に本来必要な血清の量または濃度よりも実質的に低減された量または濃度の血清が含まれることを意味する。
【００２８】
「血清」とは、広範囲の巨大分子、リポイド物質および微量元素の運搬タンパク質、細胞の接着因子および伸展因子、低分子量栄養素、ならびにホルモンおよび成長因子を含む、血液由来の画分を意味する。操作上は、血清は、赤血球、血小板、および血漿の凝固成分を除去した後に残る、血液のタンパク性無細胞画分であると定義することができる。細胞培養に最も広く用いられる動物血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）であるが、成体のウシ血清、ウマ血清、およびそのタンパク質画分（例えば、血清アルブミンフラクションＶ）を用いてもよい。
【００２９】
通常、哺乳動物細胞は、細胞の種類、培養期間、フィーダー細胞および培養システムの他の細胞成分のうち少なくともいずれかの有無、ならびに当業者にとって明らかな他の要因に応じて、５〜１０％の血清を必要とする。
【００３０】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、５％未満の血清、より好ましくは２％未満の血清、より一層好ましくは１％未満の血清を企図するが、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、または０．２％以下（ｖ／ｖ）の血清が有利である。
【００３１】
特に有利な実施形態では、本発明は、血清が存在しないか、または０．１％もしくは０．０５％以下（ｖ／ｖ）の血清を企図する。
ＩＧＦ−Ｉが存在する実施形態では、ＩＧＦ−Ｉはタンパク質複合体の一成分であり、該複合体がＩＧＦＢＰおよびビトロネクチン（ＶＮ）をさらに含んでなることが好ましい。
【００３２】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦＢＰ６から選択される。
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５であることが好ましい。
【００３３】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦＢＰ５であることがより好ましい。
ＩＧＦ−ＩＩが存在する実施形態では、ＩＧＦ−ＩＩは単離型タンパク質複合体の一成分であり、該複合体がビトロネクチン（ＶＮ）をさらに含んでなることが好ましい。
【００３４】
ビトロネクチン（ＶＮ）が単量体の形でも多量体の形でもよいことも理解されよう。
特定の１実施形態では、本発明は、精製された自己ＶＮを含む。
ケラチノサイトは、当業界で通常使用されるような培養容器で培養することが好ましい。したがって、培養中に存在するＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰの各量は、培養容器の大きさ、容器中に存在する液体培地の量、細胞密度、および当業界で知られている他の要因などの諸要因に応じて決まることが理解されよう。
【００３５】
指標として、１．９ｃｍ２のウェルでは、好ましい量は次のとおりである。すなわち
ＶＮ：５０〜５０００ｎｇ、より好ましくは１００〜５００ｎｇ、または有利なものとして２５０〜３５０ｎｇ；
ＩＧＦ：０．１〜１０００ｎｇ、より好ましくは１０〜２００ｎｇ、または有利なものとして５０〜１５０ｎｇ；
ＩＧＦＢＰ：１〜１０００ｎｇ、より好ましくは３０〜７００ｎｇ、または有利なものとして３００〜５００ｎｇ
である。
【００３６】
本発明の培養培地は、他の特定の成分を含むことが適切である。非限定的であり、任意選択される成分には、ＤＭＥＭやＨａｍ’ｓ培地などのよく知られている基本培地、ストレプトマイシンやペニシリンなどの抗生物質、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）、Ｌ−グルタミンなどのアミノ酸補給物、β−メルカプトエタノールなどの抗酸化剤、トランスフェンリン、炭酸緩衝剤などの緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、および通常は細胞培養インキュベータによって提供される二酸化炭素供給源が挙げられる。
【００３７】
本発明は、細胞の増殖、分化、生存、および／または遊走を調節する追加の生物活性タンパク質、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ；ヘルディンら（Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第４巻、ｐ．１１２２〜１１２３）、線維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ；ヌルコンベら（Ｎｕｒｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７５巻、ｐ．３０００９〜３００１８）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；タラボレッティ（Ｔａｒａｂｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．、第８巻、ｐ．４７１〜４７９）、オステオポンチン（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、第１４１巻、ｐ．１１００）、トロンボスポンジン−１（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、前掲）、テナシン−Ｃ（アライら（Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、ｐ．６０９９）、ＰＡＩ−１（ナムら（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｅｎｄｏｅｒｉｎｏｌ．、第１３８巻、ｐ．２９７２）、プラスミノーゲン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２７５巻、Ｅ３２１）、フィブリノーゲン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、第２７４巻、ｐ．３０２１５）、フィブリン（キャンベルら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．）、１９９９年、前掲）、またはトランスフェリン（ウェインジマーら（Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．）、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第８６巻、ｐ．１８０６）などの使用も企図する。
【００３８】
追加の好ましい生物活性タンパク質は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦである。
ＥＧＦやｂＦＧＦなどの追加の生物活性タンパク質は、１．９ｃｍ２の培養ウェルあたり０．１〜１０００ｎｇ存在してよいが、有利には１〜１００ｎｇ存在してよい。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明は、ヘパリン結合ドメイン様のドメインを有する任意の成長因子の使用を企図する。
別の特定の実施形態では、本発明は、単離型タンパク質複合体に加え、細胞の分化を抑制するＬＩＦおよび／または他の作用物質の使用を企図する。
【００４０】
さらに別の特定の実施形態では、本発明は、本発明の培養培地、培養システム、および方法のうち少なくともいずれかにおける、ポリＬ−リシン、ポリＬ−アルギニン、およびビトロネクチンと相互作用する細胞分泌物、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、グリコサミノグリカン／プロテオグリカン、ラミニン、シアロタンパク質、および／もしくはムチンの重合体のうちの１種または複数の使用を企図する。
【００４１】
本発明が、少なくとも細胞培養の最初の樹立段階の後、フィーダー細胞の非存在下での細胞培養を円滑にし得ることも提唱しておく。
ケラチノサイトおよび／またはケラチノサイト前駆細胞に関しては、血清非存在下での培養の最初の６〜７日間は（放射線照射した３ｔ３フィーダー細胞などの）フィーダー細胞が存在していてもよく、その後、最高で２継代の間はフィーダー細胞がなくてもよい。
【００４２】
前述のことを踏まえつつ、いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、細胞の培養中に、ＩＧＦ−ＩがＩＧＦＢＰおよびＶＮとともに単離型タンパク質複合体を形成し、ＩＧＦ−ＩＩがＶＮとの複合体を形成して生物学的効果を発揮するということを提唱する。
【００４３】
用語「単離型タンパク質複合体」とは、本明細書では、国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレットおよび国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号において使用されるものと一致する。
【００４４】
単離型タンパク質複合体は、予め形成してから本発明の培養培地に含めてもよいし、または培養容器中で形成してもよい。
通常、ビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンは、培養容器に結合、固定、も
しくはコーティングされるか、または別の方法で培養容器に結び付けられる。ＩＧＦ、および任意選択でＩＧＦＢＰを加えると、培養容器に結合、固定、もしくはコーティングされるかまたは別の方法で培養容器に結び付けられたビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンとの複合体が形成される。
【００４５】
国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号に記載されているように、本発明の単離型タンパク質複合体は、成長因子（例えば、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）を含んでもよいし、または成長因子の少なくとも１ドメインであって、同族の成長因子受容体（例えば、ＩＧＦ１型受容体）に結合することのできるドメインを含むものでもよい。
【００４６】
これに関して、「ドメイン」とは、成長因子の少なくとも一部分または領域であって、同族の成長因子受容体に結合することのできるものを意味する。通常、限定するものではないが、同族の成長因子受容体が細胞によって発現され、前記同族の成長因子受容体に前記の成長因子の少なくとも１ドメインが結合または連結すると、細胞の増殖、分化、生存および／または遊走などの細胞応答が誘発される。
【００４７】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、前記ドメインは、ロイシン残基ではないアミノ酸残基２４を含むことが適切である。
通常、前記の残基はチロシンである。
【００４８】
特にＩＧＦ−ＩＩに関して、前記ドメインは、ロイシン残基でないアミノ酸残基２７を含むことが適切である。
通常、前記の残基はチロシンである。
【００４９】
特にＩＧＦ−Ｉに関して、１実施形態では、前記ドメインは、ＩＧＦ−Ｉの残基１〜７０を含んでなるか、または同残基１〜７０から構成される。
別の実施形態では、前記ドメインは、ＩＧＦ−Ｉの残基４〜７０を含んでなるか、または同残基４〜７０から構成される。
【００５０】
本発明の単離型タンパク質複合体の別の成分が、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンの少なくともインテグリン結合ドメインであることも理解されよう。
この成分としては、αｖインテグリンに結合することのできる、ＶＮもしくはＦＮの任意のドメインを挙げることができ、これらが包含される。
【００５１】
インテグリンは、αｖβ３インテグリンまたはαｖβ５インテグリンであることがより好ましい。
国際出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００１１７号に記載されているように、ＶＮ（および同様にＦＮ）のヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）は、単離型タンパク質複合体の完全な生物活性にとって必要ではない。
【００５２】
ＶＮに関しては、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦ−Ｉ／ＧＦＢＰ複合体との相互作用に必要なのは、おそらくＶＮ（および同様にＦＮ）のポリアニオン領域である。
ポリアニオン領域は、成熟型ＶＮ配列のアミノ酸残基５３〜６４である。
【００５３】
前述のことを考慮すれば、本発明は、ＶＮまたはＦＮのＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかを含まない合成キメラタンパク質の実施形態を企図するものである。
【００５４】
ＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかを含まないＶＮタンパク質およびそのアミノ酸配列に関しては、（ＨＢＤを欠いている）５４ｋＤａのニワトリ卵黄Ｖ
Ｎなど、天然のタンパク質でもよいし、あるいはＨＢＤおよびポリアニオン領域のうち少なくともいずれかが含まれないか、または少なくとも実質的に機能しないように、ＶＮタンパク質もしくはアミノ酸配列を欠失、突然変異、または短縮させることによって作出したものでもよい。
【００５５】
前述の事項から、本発明の単離型タンパク質複合体が、非共有結合により会合しているオリゴ−タンパク質複合体の形態、（可逆的または不可逆的に）共有結合によって架橋されているオリゴ−タンパク質複合体の形態、または合成キメラタンパク質の形態のいずれでもよいことが容易に理解されるであろう。
【００５６】
したがって、特定の態様では、本発明は、合成キメラタンパク質の形態の単離型タンパク質複合体を提供する。
本明細書では、「キメラタンパク質」は、ＶＮもしくはＦＮのインテグリン受容体結合ドメイン由来の連続したアミノ酸配列と、成長因子または成長因子の少なくとも受容体結合ドメインとを含んでなる。
【００５７】
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、合成キメラタンパク質は、前記成長因子の同族の受容体とＶＮもしくはＦＮのインテグリン受容体とを同時に連結し、かつ同時に活性化することができ、それによって細胞の遊走を刺激、誘発、増強、または促進し得ることを提唱しておく。
【００５８】
本発明によるキメラタンパク質の利点は、化学合成または組換えの手段によって容易に製造され、かつ非共有結合型のオリゴ−タンパク質複合体において必要なタンパク質−タンパク質相互作用の維持に依存しないのでｉｎ ｖｉｖｏでより安定であると予想される点である。
【００５９】
これに関して、ＩＧＦ−Ｉの受容体結合ドメインを含む単離型タンパク質複合体はＩＧＦＢＰも含むはずであるが、前述の作用様式によれば、ＩＧＦ−Ｉ／ＶＮ合成キメラにはＩＧＦＢＰが存在しないことが好ましいと提唱しておく。
【００６０】
キメラタンパク質は、成長因子配列とＶＮもしくはＦＮのアミノ酸配列との間に、かつこれらの配列に隣接して位置する「リンカー配列」をさらに含むことが好ましい。
１実施形態では、前記のリンカー配列は、１または複数のグリシン残基と１または複数のセリン残基とからなる。
【００６１】
リンカー配列の特定の例は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ；Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３、および（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３から選択可能であるが、この限りでない。
別の実施形態では、リンカー配列には、Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏの配列など、プラスミン切断認識部位が含まれる。
【００６２】
さらに別の実施形態では、リンカー配列には、Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓの配列など、コラゲナーゼ３切断認識部位が含まれる。
上記は、成長因子、成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチン／フィブロネクチンのうち少なくともいずれかの生物活性を有する断片の例である。
【００６３】
１実施形態では、前記の「生物活性を有する断片」は、「完全長」タンパク質の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ましくは５０％以上、より一層好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％以上、または少なくとも９５％の生物学的活性を有する。
【００６４】
同様に、本発明に従って使用することのできる、成長因子のバリアント、成長因子結合
タンパク質、および／もしくはビトロネクチン／フィブロネクチン、および／またはこれらをコードする核酸も企図する。
【００６５】
１実施形態では、「バリアント」は、１または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸と入れ替わっている。ある種のアミノ酸が、そのタンパク質の本来の活性を変化させることなく、概ね類似の性質を備えた他のアミノ酸に変更可能であること（保存的置換）は、当業界で十分に理解されている。
【００６６】
１実施形態では、バリアントは、本明細書に記載のアミノ酸配列との配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、有利には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００６７】
少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より一層好ましくは少なくとも９０％を上回る配列同一性が測定されることが好ましく、配列同一性が実質的に本発明の合成タンパク質の全長にわたっていると有利である。
【００６８】
配列同一性（％）を決定するには、アルゴリズム（インテリジェネティックス社（In telligenetics ）のＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；米国ウィスコンシン州マディソンのサイエンスドライブ５７５所在のジェネティクスコンピュータグループ（Genetics Computer Group ）のウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージリリース７．０（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 ）の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；参照により本願明細書に援用する）のコンピュータ処理の実行、または検討により、アミノ酸および／または核酸の配列の最適なアラインメントを実施すればよく、最適な（すなわち、比較枠内全体で最高の相同性（％）をもたらす）アラインメントは、選択した種々の方法のいずれかによって得ることができる。参照により本願明細書に援用されるアルツシュルらの文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９９７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻、ｐ．３３８９）に開示されているような、ＢＬＡＳＴプログラムファミリーを参照してもよい。
【００６９】
別の例では、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータ・プログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）対応Ｖｅｒｓｉｏｎ２．５；米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在の日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社から入手可能）によって算出される「一致率（％）」を意味するものと理解してもよい。
【００７０】
配列解析の詳細な議論については、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（ジョンウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク、１９９５〜１９９９年）の１９．３項に見ることができる。
【００７１】
本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質、および／またはビトロネクチン／フィブロネクチンの誘導体も企図する。
本明細書では、「誘導体」とは、例えば、他の化学基の付加、結合、もしくは複合体化によって、または当業界で十分に理解されているような翻訳後修飾技術によって改変されているものである。
【００７２】
アミノ酸の「付加」には、他のペプチドまたはポリペプチドとの融合が挙げられる。他のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、タンパク質の精製の助けとなり得る。例えば、これらのペプチドまたはポリペプチドには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、プロテインＡ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００７３】
本発明が企図する他の誘導体には、側鎖の修飾、タンパク質合成の際の非天然アミノ酸および／もしくはその誘導体の組込み、ならびにタンパク質の高次構造を拘束する架橋剤の使用および他の方法が含まれるがこの限りでない。本発明が企図する側鎖の修飾の非限定的な例としては、無水酢酸を用いるアシル化による修飾などのアミノ基の修飾、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化、アセトイミド酸メチルを用いるアミジン化、シアナートを用いるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール−５−リン酸を用いるリシンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＨ４による還元、アルデヒドとの反応に続いてＮａＢＨ４で還元することによる還元アルキル化、および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化が挙げられる。 スルフィドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化；４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、４−クロロマーキュリベンゾアート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の生成；他のチオール化合物との混合型ジスルフィドの生成；マレイミド、マレイン酸無水物、または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化；シアナートを用いるアルカリ性ｐＨでのカルバモイル化などの方法によって修飾することができる。
【００７４】
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ピロ炭酸ジエチルを用いるＮ−カルボエトキシル化、またはヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化によって修飾することができる。
ペプチド合成の際に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用が含まれるがこの限りでない。
【００７５】
タンパク質の化学的誘導体化の別の例は、コリガンら（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．）編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」、米国ニューヨーク所在のジョンウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９５〜２００１年の第１５章に示されている。
【００７６】
本発明によれば、タンパク質は、当業者に知られている任意の適切な方法によって調製可能である。
１実施形態では、タンパク質は、実質的に純粋な天然型でよい。
【００７７】
特定の１例は、精製自己ビトロネクチンである。
別の実施形態では、タンパク質は化学合成によって生産することができる。化学合成技術は当業界でよく知られているが、当業者は、適切な方法の例について、コリガンら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」、米国ニューヨーク所在のジョンウィリーアンドサンズ社（１９９５〜２００１年）の第１８章を参照してもよい。
【００７８】
さらに別の実施形態では、タンパク質は、組換えタンパク質として調製されてもよい。
組換えタンパク質の製造は、当業界でよく知られており、当業者は、例えば、本願明細書に援用するサンブロックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）の「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（コールドスプリングハーバープレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年）、特に第１６項および第１７項；本願明細書に援用するアウスベルら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ」（ジョンウィリーアンドサンズ社、１９９５〜１９９９年）、特に第１０章および第１６章；ならびに本
願明細書に援用するコリガンら編「ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ」（ジョンウィリーアンドサンズ社、１９９５〜１９９９年）、特に第１、第５、および第６章に記載されているような標準のプロトコールを参照してもよい。
【００７９】
組換えタンパク質は、融合パートナーをさらに含んでもよい。
よく知られている融合パートナーの例としては、限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）を挙げることができ、これらはアフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティクロマトグラフィによって融合タンパク質を精製する目的については、関連するアフィニティクロマトグラフィ用マトリックスは、それぞれグルタチオン−、アミロース−、およびニッケルもしくはコバルトに結合した樹脂である。このような多くのマトリックスは、ＨＩＳ６融合パートナーとともに使用可能なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））や、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＧＳＴ精製システムなど、「キット」の形態で入手可能である。
【００８０】
場合によっては、融合パートナーもＸａ因子やトロンビンなどのプロテアーゼの切断部位を有していて、その結果関連プロテアーゼによる本発明の融合タンパク質の部分消化が可能となり、それによって組換えタンパク質が融合タンパク質から解放されるようになる。次いで、解放されたタンパク質を続いてクロマトグラフィにより分離して、融合パートナーから単離することができる。
【００８１】
本発明の融合パートナーの範囲内には、一般に短いペプチド配列であり、該配列に対する特異的抗体が入手可能な「エピトープタグ」も含まれる。特異的モノクローナル抗体が容易に入手可能なよく知られたエピトープタグの例には、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、およびＦＬＡＧタグが含まれる。
【００８２】
発現に適した宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよく、例えば大腸菌（例えばＤＨＳα）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系とともに利用されるＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨＥＫ２９３の各細胞であるが、これらに限定はされない。
【００８３】
本発明はさらに、
（ｉ）組換えＩＧＦ、
（ｉｉ）組換えＩＧＦＢＰ、
（ｉｉｉ）組換えビトロネクチン、
（ｉｖ）前述のような組換えキメラタンパク質、および
（ｖ）ＥＧＦやｂＦＧＦなど追加の生物活性タンパク質
からなる群から選択される少なくとも１種の組換えタンパク質を発現させることのできる、ケラチノサイトやケラチノサイト前駆細胞などの細胞の使用を企図する。
【００８４】
特定の実施形態によれば、ＩＧＦ、ＶＮ、および／またはＩＧＦＢＰの傍分泌発現／自己分泌発現によって、血清を含まない培地で、かつ成長因子、ＩＧＦＢＰ、およびビトロネクチンのうちの１または複数を培養培地に加える必要なしにケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を培養することができる。
【００８５】
組換えタンパク質の発現は、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞に発現構築物を導入することで実現できる。
通常、発現構築物は、発現の対象である（組換えタンパク質をコードしている）核酸を
、プロモータに作動可能なように連結され、または作動可能なように接続された状態で含んでいる。
【００８６】
プロモータは、構成的プロモータでも誘導プロモータでもよい。
構成的プロモータまたは誘導プロモータとしては、例えば、テトラサイクリン抑制性、エクジソン誘導性、アルコール誘導性、およびメタロチオネイン誘導性のプロモータが挙げられる。プロモータは、天然のプロモータ（例えば、αクリスタリンプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヒト伸長因子αプロモータ、およびＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ由来プロモータなどのウイルスプロモータ）でもよいし、または２種以上のプロモータの要素が組み合わされている合成ハイブリッドプロモータ（例えば、ＳＲαプロモータ）でもよい。
【００８７】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカーは、形質転換した細菌の選択を行う目的にも（ｂｌａ、ｋａｎＲ、ｔｅｔＲなど）、形質転換した哺乳動物細胞の選択を行う目的にも（ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシンなど）有用である。
【００８８】
発現構築物は、電気穿孔法、微粒子銃、ウイルスを利用する遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオンリポソーム、リポフェクション、リポフェクタミンなど（これらに限定はされない）のよく知られている手段によって、ケラチノサイトやケラチノサイト前駆細胞などの哺乳動物細胞に導入することができる。
【００８９】
ケラチノサイト中での組換え成長因子タンパク質の発現に適用できる可能性のある方法の非限定的な特定の例については、サップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第１１４巻、ｐ．５、およびサップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ．、第８巻、ｐ．２６〜３５を参照することができる。
【００９０】
［薬剤組成物］
本発明は、本発明の培地および／または培養システムを使用して生産された、その限りではないがケラチノサイトなどの１または複数の細胞と、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤とを含んでなる薬剤組成物も提供する。
【００９１】
本発明の薬剤組成物を使用すると、細胞の遊走、組織の再生、および創傷の治癒を促進し、または容易にすることができる。
一般に、本発明の組成物は、必要に応じて治療処置または予防処置に使用することができる。例えば、薬剤組成物は、皮膚の修復、創傷の治癒、火傷の治癒、および他の皮膚科学的処置のための治療用もしくは美容用調製物の形態で適用することができる。
【００９２】
薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に適することが好ましい。
特定の実施形態では、薬剤組成物は、本発明に従って培養した自己または同種異系のケラチノサイトを含む。
【００９３】
「薬剤として許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤」とは、全身投与に安全に使用することのできる固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当業界でよく知られている種々の担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽（ｍａｌｔ）、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝剤、乳化剤、等張生理食塩水、および塩酸塩、臭化物、硫酸塩を含む鉱酸の塩、酢酸塩
、プロピオン酸塩、マロン酸塩といった有機酸の塩などの塩、および発熱物質を含まない水を含む群から選択することができる。
【００９４】
薬剤として許容可能な担体、希釈剤、および賦形剤が記載されている有用な参考文献は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（米国ニュージャージー州所在のマックパブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．）、１９９１年）であり、これを本願明細書に援用する。
【００９５】
患者に本発明の組成物を提供するには、任意の安全な投与経路を使用すればよい。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などの投与を使用することができる。
【００９６】
剤形には、錠剤、分散剤、懸濁物、注射剤、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、坐剤、エアロゾル、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形には、本目的用に特別に設計された注射用もしくはインプラント用の徐放デバイス、または本目的用にも作用するように改変された他の形態のインプラントも挙げることができる。
【００９７】
徐放製剤は、例えば、アクリル樹脂、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸などの疎水性ポリマー、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのある種のセルロース誘導体でコーティングすることにより実現できる。他のポリマーマトリックス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを使用して徐放を実現してもよい。徐放型の製剤および送達デバイスの非限定的な例には、例えば、浸透圧ポンプ、ポリラクチドコグリコリド（ＰＬＧ）ポリマーを用いたミクロスフェア、ヒドロゲルポリマー、ＯｃｔｏＤＥＸ（商標）などの化学的に架橋されたデキストランゲル、およびｄ−乳酸−ＨＥＭＡが含まれる。
【００９８】
上記組成物は、投与製剤に適した方法で、かつ薬学的に有効な量を投与すればよい。本発明では、患者に投与される用量は、適切な期間にわたり患者に有益な応答をもたらすのに十分であるべきである。投与すべき薬剤の量は、対象者の年齢、性別、体重、および全般的な健康状態を含めて治療を施す対象に応じて、医師の判断いかんで決まる諸要因に応じて様々でよい。
【００９９】
創傷治癒のための薬剤組成物に関しては、本願明細書に援用する米国特許第５９３６０６４号および国際公開公報第９９／６２５３６号パンフレットが特に参考文献として挙げられる。
【０１００】
特定の１実施形態では、本発明の組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕでの噴霧送達に適する。
用語「噴霧」は、「エアロゾル」もしくは「ミスト」、または一般に液滴の形の液体懸濁物であるとされる「濃縮物」などの用語を包含し、またこれらの用語を例として挙げられる。
【０１０１】
本発明によれば、任意選択であるが、噴霧もしくはエアロゾル組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚細胞の増殖および遊走を促進するために、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択される少なくとも１種のＩＧＦを含んでもよいし、または特定の実施形態では、ＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰを含む単離型タンパク質複合体を含んでもよい。ＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦなどの追加の生物活性タンパク質が含まれてもよい。
【０１０２】
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、本発明では、噴霧組成物中に存在するＩＧＦ複合体中のＶＮの固有の「粘着性」が、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびＥＧＦやｂＦＧＦなどの他の成長因子の送達を促進するであろうと予想される。 通常、本発
明の噴霧組成物は、送達用流出口を備えた加圧缶などの装置によって送達される。
【０１０３】
ブタモデルでの創傷治癒用など、エアロゾル化ケラチノサイト送達系の例が、ナヴァーロら（Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ、第２１巻、ｐ．５１３によって示されている。ブタモデルにおける創傷治癒用にエアロゾル化ケラチノサイトをフィブリン糊と合わせて使用することについて記載している、グラントら（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．）、２００２年、Ｂｒ Ｊ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ、第５５巻、ｐ．２１９も参考文献として挙げられる。
【０１０４】
本発明の噴霧組成物は、実質的に血清を含まないことが好ましい。
特定の１実施形態では、本発明の皮膚噴霧組成物は、調節器によって制御される医療用の圧縮空気流中へ送達することによって、フィブリン糊の噴霧式の適用を円滑にし、液体をエアロゾル化する、Ｔｉｓｓｏｍａｔ（登録商標）（バクスターヘルスケア社（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を構成する。６９〜２０７ｋＰａ（１０〜３０ｐｓｉ）の圧力が適切であるが、圧力を増大させると生存率の低下が認められる。細胞は、０．５〜１．５×１０６／ｍｌの濃度で噴霧するとよい。０．２ミリリットルの細胞懸濁液を１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で適用すると、約２５平方センチメートルの面積を覆うのに十分である（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間増殖させた後の、細胞で覆われた表面積の測定に基づく）。細胞は、無血清の増殖培地に含めて送達することが好ましいが、市販のＴｉｓｓｅｅｌ／Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（バクスターヘルスケア社（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））などのフィブリン糊に懸濁させてもよい。
【０１０５】
本発明の組成物のシリンジ送達（例えば、スプレーキャップを装着したシリンジ）を使用しても、同様の有効性が得られることが予想される。
［治療への使用］
特定の態様では、本発明は、火傷、創傷、および潰瘍の治療方法、ならびに肌質または肌の外観を改善し、または向上させるための皮膚の美容処置に関する方法を提供する。
【０１０６】
これらの方法は特に、哺乳動物、より詳細にはヒトの治療または処置を目的とする。しかし、本発明が、当業者には十分に理解されるように、飼養動物、家畜、および曲芸動物を治療するための獣医学的適用を有し得ることも承知されよう。
【０１０７】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明に従って個体に投与することのできる初代ケラチノサイトをｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるための培地、培養システム、および方法を提供する。
【０１０８】
特定の実施形態では、ケラチノサイトは、本発明に従って培養した自己または同種異系のケラチノサイトである。
その方法としては、上述のように規定した薬剤組成物の投与を挙げることができ、米国特許第６０９０７９０号に記載のものなど、特定の組織部位への微細針による注射；米国特許第６０５４１２２号に記載のものなど、創傷、火傷、もしくは潰瘍に適用する局所用のクリーム、ローション、またはシーラント包帯剤；または国際公開公報第９９／４７０７０号に記載のものなど、組成物を放出するインプラントを用いるものでよい。
【０１０９】
遺伝子操作により所望の成長因子を発現させるなど、皮膚代替物を作製する目的のために皮膚細胞の遺伝子を改変できる方法も存在する（サップら（Ｓｕｐｐ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、第１１４巻、ｐ．５）。この分野の総説の例は、ベヴァンら（Ｂｅｖａｎ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、第１６巻、ｐ．２３１である。
【０１１０】
国際公開公報第９９／１１７８９号に記載のものなど、レシピエントに対する形質導入細胞または形質転換細胞の「接種」も企図される。
これらの方法を使用して細胞の遊走を刺激し、それによって、創傷および火傷の治癒、潰瘍などの皮膚病変の修復、自己の皮膚のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養などによる組織の置換および移植、腎臓や肺などの内部臓器の上皮再形成、ならびに損傷神経組織の修復を促進し、または進行させることができる。
【０１１１】
皮膚置換治療は、当業界でよく知られつつあり、例えば、ケヘら（Ｋｅｈｅ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、第２９１巻、ｐ．６００に記載されているような、上皮／ケラチノサイト同時培養細胞株の使用、または（通常は自己の）初代上皮細胞、真皮細胞、および／もしくはケラチノサイト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を採用することができる。これらの技術は、人工生体材料および合成ポリマーの「骨格」を利用するものでもよい。
【０１１２】
一般にこの分野の総説の例は、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ＆Ｖａｓｉｌｉｅｖ、１９９９年、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．、第１８８巻、ｐ．４１、ならびにＥａｇｌｅｓｔｅｉｎ＆Ｆａｌａｎｇａ、１９９８年、Ｃｕｔｉｓ、第６２巻、ｐ．１である。
【０１１３】
より具体的には、頭蓋顔面外科で有用な置換用口腔粘膜の生産について、イズミら（Ｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．、第７９巻、ｐ．７９８に記載されている。胎児のケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、皮膚病変を治療するための移植用皮膚を生産することができ（例えばファウザら（Ｆａｕｚａ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．、第３３巻、ｐ．３５７に記載）、一方ヒアルロン酸由来の生体材料上でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した真皮および表皮の皮膚成分から得た皮膚代替物は、火傷の治療に潜在的に有用であることが示されている（ザッチら（Ｚａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、第４０巻、ｐ．１８７）。
【０１１４】
例えば、シェリダンら（Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、第１４巻、ｐ．９１ページ、およびファウザら（Ｆａｕｚａ
ｅｔ ａｌ．）、１９９８年（前掲）に記載されているように、代替皮膚の作出を円滑にする目的でポリマー骨格も企図されており、同様に創傷および火傷に皮膚細胞を送達するための作用物質としてミクロスフェアも企図されている（ラフランスおよびアームストロング（ＬａＦｒａｎｃｅ＆Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、１９９９年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．、第５巻、ｐ．１５３）。
【０１１５】
通常は治療での使用向けに生産されるケラチノサイトシートは、熱傷創を最終的に閉じる役割を担う。このシート移植技術は、すべての部分層熱傷に適用可能であり、外部からの助けなしでは創傷部位およびドナー部位を早期に永久閉鎖することがほとんど不可能な広い面積の創傷の治療に最も有用である。このような創傷は、最近のバリ島の爆破で火傷を負った患者の死亡原因となった種類の傷害である。
【０１１６】
現在、患者の５０セント硬貨大の皮膚生検材料から成人全体を覆うのに十分なだけ皮膚を成長させることが可能である。この培養工程は１７日間を要する。
しかし、患者の外傷、感染の危険、瘢痕化、および永久的な皮膚移植に先立って現在必要とされる高価な仮の皮膚置換の必要性を減らすために、より早期の皮膚置換が早急に求められている。また、培養皮膚のシートは、多くの皮膚細胞を含み、該皮膚細胞は成熟しているものもあれば、未成熟のものもある。培養ケラチノサイトを集密（コンフルエント）にするという（皮膚シートの生産に必要な）単純な行為が原因で、細胞は最初に有していた特性を早期に喪失してしまう、すなわち分化してしまう。培養皮膚シートが適用され
るとき、未成熟の細胞のみが患者に接着し、定着することができる。狭い面積しか付着していないので、シートは、摩擦や患者の動きによって生じる損傷を非常に受けやすく、時には移植片全体を失うことになりかねない。その上、シート移植片では、シート中の皮膚細胞が成熟しているほど、移植片は定着しにくく、細胞自体も創傷床で増殖や遊走をしにくくなると思われる。したがって、未成熟な皮膚細胞をより早期に適用することが、より良好な移植片の定着をもたらし、瘢痕を減らすことは明らかである。
【０１１７】
したがって、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏで培養した皮膚細胞を患者の火傷、潰瘍、または創傷のある皮膚に送達して、患者の身体のより広い表面域が、現存するシート移植技術よりもはるかに早期に未成熟の皮膚細胞によって覆われるようにするための噴霧もしくはエアロゾル送達法を提供する。この方法では、わずか７日という早さも可能になる。また、この方法は、瘢痕形成、ショック、および熱放散を大幅に低減すると考えられ、部分層熱傷だけでなく全層性熱傷においても皮膚機能のより迅速な回復を可能にすると考えられる。
【０１１８】
本発明によれば、任意選択ではあるが、投与される噴霧剤またはエアロゾルは、皮膚細胞のｉｎ ｓｉｔｕでの増殖および遊走を促進するために、ＩＧＦ、ＶＮ、およびＩＧＦＢＰと共にＥＧＦおよび／またはｂＦＧＦを含む単離型タンパク質複合体をさらに含んでもよい。
【０１１９】
患者自身の皮膚細胞（自己皮膚）およびドナーの皮膚細胞（同種異系または異種の皮膚）を、増殖させ、早期に熱傷創を閉鎖すべく使用することができる。ドナー細胞は、移植抗原を発現しないので、患者の免疫応答を引き起こさない。しかし、ドナーの皮膚細胞は、最終的には患者自身の皮膚細胞に入れ替わる。
【０１２０】
自己細胞が好ましいが、皮膚用噴霧剤に同種異系または異種の細胞を使用すれば、細胞を必要とする患者への即座の適用が可能になるはずである。あるいは、治療用噴霧剤に使用するのに十分な自己細胞が、約７日間で培養できるということもありうる。
【０１２１】
皮膚の表面（上皮）および深部層（真皮）の両方を失っている傷への培養皮膚の生着が弱いことから、本発明が企図する別の治療は、全層性の傷を早期に閉鎖するための熱傷患者の治療である。本発明は、真皮代替物を皮膚用噴霧剤と共に使用して、このような最も恐ろしい損傷を早期に永久的に閉鎖することを企図する。生物由来および合成のいずれの真皮代替物も企図される。例えば、死体由来の、表皮を除いて細胞を除いた（ｄｅ−ｃｅｌｌｕｌａｒｉｓｅｄ）、本発明の単離型タンパク質複合体を含む真皮骨格に、合成表皮（包帯剤）を被せることができる。本発明者らは、およそ７日後には、この真皮が自己内皮細胞による盛んな浸潤を受けるという仮説を立てている。この時点で、合成皮膚を取り除き、ｅｘ−ｖｉｖｏで増殖させた患者自身の線維芽細胞およびケラチノサイトを同種異系の真皮（ａｌｌｏ−ｄｅｒｍｉｓ）に適用する。
【０１２２】
真皮代替物は、栄養になり安定化させる骨格として働き、皮膚細胞および皮膚中に通常見られる他の重要な細胞の遊走および定着を促進するので、表皮シートよりもむしろ皮膚用噴霧剤の方が成功を収めると予想される。これによって、全層性皮膚損傷における培養皮膚細胞の生着の向上が実現されよう。
【０１２３】
本発明をより容易に理解し、実際の効果につなげることができるよう、当業者は、以下の非限定的な実施例を参照されたい。
【実施例１】
【０１２４】
［血清非存在下における初代ヒト・ケラチノサイトの増殖］
材料および方法
増殖因子濃度／培養用プラスチックへの予備的吸着
全ての実験において、ＶＮ、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰを添加する標準法を使用した。培養用プラスチックを、無血清培地中のビトロネクチン１５０ｎｇ／ｃｍ２とともに３７℃で２時間インキュベーションすることによって調製する。次に、ＶＮ溶液を取り除き、ＩＧＦＢＰ（２５０ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦ−Ｉ（５０ｎｇ／ｃｍ２）、およびＥＧＦ（５０ｎｇ／ｃｍ２）を含む無血清培地に置き換える。これらの増殖因子を１晩４℃（冷蔵庫内）に放置してＶＮ処理プラスチックに吸着させる。翌日、増殖因子溶液を取り除き、ＶＮ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＧＦＢＰ ５０ｎｇ／ｍＬ、ＩＧＦ−Ｉ １５ｎｇ／ｃｍおよびＥＧＦ １５ｎｇ／ｃｍを含む増殖培地（以下に定める）に置き換える。細胞を、以下の密度で加える。一般に、培地は３日に１度交換する。各培養物を、約６日間増殖させてから継代前する。すなわち継代の間隔は約６日間である。
【０１２５】
増殖培地
基本培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を３：１に混合したものであり、通常Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、アデニン（１８０μＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、および非必須アミノ酸混合物（１％ｖ／ｖ）を添加する。
【０１２６】
陽性対照培地は、さらに１０％ウシ胎児血清、インスリン（５μｇ／ｍＬ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。
播種密度
培養物を、増殖を停止させたマウス３ｔ３細胞（密度２．５×１０４／ｃｍ２）の存在下で増殖させた。３ｔ３細胞は、使用直前のガンマ線照射によって「増殖を停止」させる。
【０１２７】
ケラチノサイトを、継代数に応じて異なる２種類の密度で播種した。初代培養物（Ｐ０）を、３．８×１０４／ｃｍ２で細胞を播種して確立した。その後の培養物（Ｐ１、Ｐ２等）は、回収した細胞を６．４×１０３／ｃｍ２の密度で再播種することによって確立した。Ｐ０の培養物について高密度で播種したのは、培養時には採取したばかりの細胞の一部しか持続的に増殖しないものと思われるからである。こうして、細胞を培養することにより、増殖する母集団の拡大が可能となる。
【０１２８】
結果
従来の血清含有増殖培地との培養物の比較
図１を参照すると、このグラフは、単離したばかりのケラチノサイトの、ＶｉｔｒｏＧｒｏ（登録商標）を用いた平均的な増殖（＋３ｔ３細胞）を、ウシ胎児血清と３ｔ３細胞とのいずれも存在する従来法と比較して示すものである。Ｐ０、Ｐ１、およびＰ２は、細胞を回収して再播種した回数に相当する（Ｐ０＝皮膚試料から単離した直後の細胞による実施）。ＭＴＴによる染色を利用してデータを取得した。該データは、単離タンパク質複合体存在下の血清非存在下での培養が、１０％血清含有下で達成される細胞増殖の少なくとも９０％を常に達成したことを示している。
【０１２９】
図２Ａおよび２Ｂを参照すると、ＶｉｔｒｏＧｒｏと共に増殖させた皮膚細胞は、ウシ胎児血清存在下に増殖させた皮膚細胞（図２Ａ）と同様の外観を示す。分子マーカーの存在に基づくさらに詳細な比較は、この結論を確定するために現在進行中である。使用する技術には、免疫細胞化学法、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、ウエスタン・ブロッティング、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の各方法が含まれることになろう。最新のプロテオミクス技術および遺伝子アレイ技術の使用も考慮中である。検討する主たるマーカーは、サイトケラチン類（ＣＫ１およびＣＫ１０、ＣＫ６、ＣＫ１４、およびＣＫ
１９）および想定されるケラチノサイト前駆細胞マーカー（例えばｐ６３、α９−インテグリン、α６−インテグリンｂｒｉ／ＣＤ７１ｄｉｍ）を含むことになろう。想定される前駆細胞マーカーは、移植後の培養物において臨床上の有効性をもたらすと思われるため、該マーカーの発現の比較にことに注目が置かれることになろう。さらに、日常的なｉｎ
ｖｉｔｒｏの機能アッセイにおける細胞の反応（接着、遊走、増殖）も、実施可能である。
【０１３０】
ＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体の相対的活性
図３を参照すると、ＩＧＦＢＰ５を含む単離タンパク質複合体が、ケラチノサイトの収量に関して、ＩＧＦＢＰ３を含む複合体よりも効果的であることが明らかである。
【実施例２】
【０１３１】
［フィーダー細胞の存在下および非存在下における、血清非存在下での初代ヒト・ケラチノサイトの増殖］
材料および方法
初代ケラチノサイトの培養
ラインヴァルトおよびグリーン（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ＆Ｇｒｅｅｎ）、１９７７、Ｎａｔｕｒｅ、２６５巻、ｐ．４２１によって最初に報告された方法と基本的に同一である標準法を使用して、ヒト成人皮膚からケラチノサイトを単離した。簡潔に述べると、該方法はＤｉｓｐａｓｅＩＩ（商品名）溶液中での３７℃、１時間の皮膚試料の消化を伴うものであった。続いて、回収した上皮は、細胞を分離させるために０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡと共に３７℃でさらに１０分間消化される。残存トリプシン活性を不活化し、次いで回収した細胞を洗浄し、致死線量を照射した３ｔ３マウス線維芽細胞の存在下または非存在下、組織培養ディッシュに播種する。これらの標準条件を使用して培養した「対照」細胞を、１０％ウシ胎児血清、０．１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液、０．４μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、０．１μｇ／ｍＬコレラ毒素、１０ｎｇ／ｍＬヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）、５μｇ／ｍＬインスリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、および２ｎＭトリヨードサイロニンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で増殖させるが、一方、単離増殖因子複合体で処理する細胞には、インスリンを含まないということを除いて同じ培地を使用した。インスリンは、インスリンが１型ＩＧＦ受容体へ競合的に結合するのを最小限にするために、単離タンパク質複合体処理と同時に使用される培地には含めなかった。また、単離増殖因子複合体でコーティングしたディッシュで培養した細胞は、放射線処理したマウス線維芽細胞を含まないプレートに細胞を播種するという点で、標準法にしたがって培養される細胞とは異なっていた。
【０１３２】
タンパク質合成アッセイ
ケラチノサイトは、成人皮膚生検由来であり、Ｇｒｅｅｎ培地、血清、およびフィーダー細胞を取り入れた標準法を使用して継代数２まで増殖させた。次にこれらの細胞を、タンパク質合成の促進に関して、ＩＧＦ＋ＶＮ複合体の存在下および不在下で評価した。ここでは、２４ウェル・プレートを、ビトロネクチン３００ｎｇで２時間コーティングし、次に結合していないビトロネクチンを除去するために洗浄された。次に、調べようとする増殖因子と共にウェルをインキュベートした。使用した増殖因子は、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、およびインスリン様増殖因子ＩＩであり、インスリン様増殖因子結合タンパク質５と組み合わせてウェルに加え、ビトロネクチンに１晩結合させた。翌日、結合していない増殖因子をすべて除去するためにウェルを２回洗浄し、プレートを風乾した。次に、ケラチノサイトを回収し、１ウェルあたり細胞１×１０５個の密度で、［３Ｈ］ロイシン １μＣｉ／ウェルを加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に播種した。選択されたウェルにおいては、ケラチノサイトの無血清培養のための市販品である規定ケラチノサイト培地（Defined Keratinocyte Medium 、ＤＫＭ）（インビトロジェン（Invirogen ））に細胞を播種した。次にプレートを４８時
間インキュベーションし、取り込まれなかった［３Ｈ］ロイシンをすべて除去するために洗浄した。ｄｅ ｎｏｖｏ合成されたタンパク質への［３Ｈ］ロイシンの取り込みを、βシンチレーション計測用に可溶化タンパク質の沈渣を採取することによって評価した。
【０１３３】
ＭＴＴ‐Ｅｓｔａアッセイ
ヒト・ケラチノサイトを単離し、致死線量を照射したマウス３ｔ３細胞のフィーダー層が共存する添加剤を全て含んだＧｒｅｅｎ培地での標準培養技術を使用して、培養細胞を確立した。細胞を継代数３まで増殖させ、Ｇｒｅｅｎ培地を含む２４ウェル・プレートに、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および３ｔ３細胞の存在下または非存在下で播種した。選択した処理については、ウェルを単離タンパク質複合体でコーティングした。ウェルをビトロネクチン３００ｎｇと共に２時間インキュベーションし、吸引除去してからＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰ３またはＩＧＦＢＰ５、あるいはＩＧＦ−ＩＩを加えた。プレートを１晩インキュベーションし、吸引除去してから細胞を播種した。培養物について、すでに報告されているＭＴＴ‐Ｅｓｔａアッセイ（Ｅａｌｅｙら、１９８８、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１巻、Ｒ１〜Ｒ４）を使用して測定したように、代謝活性に関して評価した。
【０１３４】
結果
樹立細胞株において単離増殖因子複合体によって得られた機能的反応の有意な促進（国際公開公報第０２／２４２１９号パンフレット；Ｎｏｂｌｅら、２００３、前掲；Ｋｒｉｃｋｅｒら、２００３、前掲）を考慮し、本発明者らは、最近になって本発明者らの研究を成人皮膚に由来するケラチノサイトの細胞培養へと広げた。特に、本発明者らは、自己の分層皮膚移植のためのｅｘ ｖｉｖｏにおけるケラチノサイトの増殖のために、現在最善の臨床業務において使用される血清およびフィーダー細胞を、単離増殖因子複合体に置き換える可能性について検討した。この方法は、熱傷の患者に利用可能な非常に進歩した治療法であるが、患者由来のケラチノサイトの培養は、病原体の供給源となる可能性があり、半確定状態の生体異物製品であるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で実施される。さらに、ケラチノサイトの分離および確立を行う初期の段階において、第２の生物種、すなわちマウス３ｔ３細胞に由来するフィーダー細胞層が、細胞の接着と増殖とを助長するためのサイトカインおよびマトリクス成分の供給源として使用される。ＦＢＳもこれらの作用に寄与する。
【０１３５】
（ｉ）ＩＧＦ類はフィーダー細胞によって分泌されるサイトカイン類の大部分を占めること、（ｉｉ）ＶＮが、プラスチック器材に低密度で播種されたケラチノサイト初代培養細胞の接着を促進するためのあらゆる血清要求性を代替することが確認されたこと、ならびに（ｉｉｉ）単離増殖因子複合体と共に培養されたケラチノサイト細胞株で得られた作用が、１０％ＦＢＳを含む培地で得られた作用と同等であることから、本発明者らは、単離増殖因子複合体を添加した培地が、自己ケラチノサイト工学への適用に対して優れた産物を提供する可能性を有すると仮説を立てた。この仮説は、ＩＧＦ類がケラチノサイトの増殖を刺激する鍵となるマイトジェンであるがケラチノサイト自体はＩＧＦ−Ｉを分泌しないという事実によって支持される。ＫＧＭ（商標）（クロネティクス（Clonetics ））およびＥｐｉＬｉｆｅ（商標）（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich ））といった無血清培地が、ケラチノサイトの増殖のために商業的に開発されてきたが、これらの培地は、不確定で、生体異物の、病原体供給源となる可能性を有しているウシ下垂体抽出物の添加を必要とするか、または高価な添加物を加えることが必要である。さらに、最新の無血清ケラチノサイト培養の用途には、非常に高密度での播種が必要とされるため、ケラチノサイトを大量かつ迅速に培養するという目的が頓挫することとなり、かつ日常的な臨床適用にこれらの方法があまり採用されない原因ともなっている。
【０１３６】
本発明者らは仮説を直接試験し、その結果は図４に示されている。この実験では、ケラ
チノサイトは成人皮膚由来であり、通例の方法にて７日間で確立した。次に、細胞をトリプシン処理によって継代し、低密度（ケラチノサイト８５００個／ｃｍ２）で、単離増殖因子複合体でコーティングした組織培養用プラスチック上に播種し、フィーダー細胞の非存在下、ＦＢＳもインスリンも含めずにさらに７日間増殖させた（図４）。これらの条件で増殖させた細胞が、最新かつ最善の臨床上の方法のみを使用して増殖させた細胞（すなわちＦＢＳおよびマウス３Ｔ３フィーダー線維芽細胞と共に増殖させたもの、図４）よりも迅速に増殖することが判明した。単離タンパク質複合体の存在下で増殖させたコロニーの周辺部は、ケラチノサイトが外側に向かって移動し、正常で、増殖していることを示している。図４に示されている最も内側の細胞は、コンフルエンス間近のケラチノサイト培養物で観察される典型的な敷石状の形態を示しているが、この場合はちょうど７日でコンフルエンスに達した。これらのタンパク質複合体存在下でのケラチノサイトの増殖をＭＴＴアッセイで定量化することによって、これらの知見（図４Ｂ）が確定する。
【０１３７】
フィーダー細胞は最初の生検からの培養細胞の確立に重要と思われるため、その後のデータは、ケラチノサイトがフィーダー細胞非存在下（血清も含まない）で良好に増殖する能力が、細胞培養の比較的遅い段階に限られることを示唆する傾向にあった。
【０１３８】
添加した増殖因子ＥＧＦおよびｂＦＧＦの作用について、図５に示す。本発明者らは、継代数３のヒト皮膚ケラチノサイト（成人皮膚生検由来）について調べ、添加したＩＧＦ＋ＶＮ複合体によるタンパク質合成の促進を、４８時間にわたって評価した。これらの処理については、ケラチノサイトの無血清培養のための市販品である、未知量のインスリン、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含んだ規定ケラチノサイト−ＳＦＭ（ＤＫＭ）（インビトロジェン）で増殖させた細胞と並行して調べた。ＤＫＭは、タンパク質合成の増大を促進して、上記対照ウェル（−ＶＮ）より１４８％上昇させることが明らかとなり、これはＶＮ単独（＋ＶＮ）やＶＮおよび増殖因子を含まない場合（−ＶＮ）での作用より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＩＧＦ−ＩＩ＋ＶＮの２量体およびＩＧＦ−ＩＩ＋ＶＮ＋ＩＧＦＢＰ−５の３量体の複合体も、タンパク質合成の大幅な増大を促進し、それぞれ１３４％および１６１％（ｐ＜０．０５）上昇させた。実際、ＤＫＭ、２量体複合体、および３量体複合体で観察されたタンパク質合成の促進に関して有意差はなく（ｐ＞０．０５）、いずれの複合体も、ケラチノサイトのタンパク質合成の刺激において市販品であるＤＫＭと同程度に有効であることを示している。
【０１３９】
ＥＧＦ、ｂＦＧＦまたは両方の増殖因子を組み合わせて３量体複合体に加えた場合、２１６％、２４８％、および２１３％の上昇が観察された。これらの反応全てがＤＫＭでの上昇より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。同様に、ＥＧＦ、またはＥＧＦとｂＦＧＦとの双方を２量体複合体に加えた場合、タンパク質合成においてそれぞれ１９２％および１９８％の顕著な上昇が得られ、この上昇はＤＫＭでの上昇より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果によって、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを単離タンパク質複合体に取り入れることで、無血清かつフィーダーを使用しないケラチノサイト培養用の市販品を上回るタンパク質合成の増大が促進されるということが明らかとなる。
【実施例３】
【０１４０】
［皮膚への噴霧技術］
材料および方法
ここでは２つの問題を扱う。第１に、噴霧用細胞懸濁物が適用できるようになる十分な数の細胞が、１週間以内にＶｉｔｒｏＧｒｏ上で生産される。したがって、この技術は既に使用されている市販品（クリニカルセルカルチャーリミテッド（Clinical Cell Culture Ltd ））の技術と一致するが、無血清という利点がある。第２に、ＶｉｔｒｏＧｒｏで増殖した細胞は噴霧後も生存が維持される。本発明者らが使用してきた送達システムはＴｉｓｓｏｍａｔ（登録商標）（バクスターヘルスケア（Baxter Healthcare ））である。
Ｔｉｓｓｏｍａｔ送達システムは、フィブリン糊の噴霧施用のために設計されており、調整器で制御された医療用圧搾空気流の中に送達することで液体をエアロゾル化する。しかしながら、代替の噴霧法（噴霧器のキャップに取り付けたシリンジ）を使用しても同様の結果が達成可能であると本発明者らは期待している。圧力は６９〜２０７ｋＰａ（１０〜３０ｐｓｉ）が適切であるが、圧力を上昇させると生存率の低下が観察される。細胞を１ミリリットルあたり０．５〜１．５×１０６個の濃度で噴霧するとよい。細胞懸濁液０．２ミリリットルを１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で適用すると、約２５ｃｍ２の領域の被覆に十分である（ｉｎ ｖｉｔｒｏで７日間増殖させた後に細胞で覆われる表面域の測定に基づく）。細胞を無血清増殖培地中で送達することも可能であるが、市販品のＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）／Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（バクスターヘルスケア）といったフィブリン糊に懸濁して使用してもよい。本発明者らの研究によると、フィブリン糊は、注射用無菌水で等張条件に希釈し、さらに最終フィブリン糊成分を無菌生理食塩水でフィブリノゲンについては１〜１０ｍｇ／ｍＬ、トロンビンについては１０〜１００単位／ｍＬに調整することによって、使用前に調製するべきである。
【０１４１】
結果
図６は、ケラチノサイトを、コラーゲンでコーティングされた直径１５０ｍｍの培養ディッシュに噴霧送達した後の細胞の分布および増殖を示す。重要なことには、ＶｉｔｒｏＧｒｏで増殖した細胞は、噴霧後に良好な生存率を示す。噴霧領域の被覆に必要な細胞数を測定するために、細胞を２つの異なる濃度で噴霧した。噴霧に使用した培養物は、対照（血清含有）、またはＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦ−Ｉを伴うビトロネクチンのいずれかで元々培養したものとした。全ての培養物は、３ｔ３細胞存在下で調製した。噴霧後、創傷部位における条件を模倣するために、細胞を血清存在下で増殖させた。該培養物を、細胞分布を示すためにクリスタル・バイオレットで染色した。
【０１４２】
図７に示されるように、Ｔｉｓｓｏｍａｔ送達システムによる培養ケラチノサイト噴霧の作用を見ることができる。これらの予備実験のためには、血清およびフィーダー細胞を加えた従来の培養培地を使用して培養細胞を確立した。図７Ａでは、捕集用チューブ内に細胞を噴霧した後数分以内にトリパン・ブルー排除試験を実施したが、該試験は生存細胞には色素が透過しないという原理によるものである。図７Ｂに見られるように、ＭＴＴ換算データは、細胞噴霧後２４時間における代謝活性の指標を提供するので、より確かな生存率測定法である。
【０１４３】
図７Ａおよび７Ｂのいずれにおいても、送達圧力は２０７ｋＰａ（３０ｐｓｉ）でも許容できる生存率であるが、至適送達圧力は６９〜１３８ｋＰａ（１０〜２０ｐｓｉ）であることがわかる。
【実施例４】
【０１４４】
［皮膚用噴霧剤の臨床試験］
皮膚生検の採取
適切なドナー部位を選び、剃毛と殺菌剤による消毒とによって準備する。約１０ｃｍ２の分層皮膚移植片を、手術室で局所麻酔の下に採取する。この生検物を、抗生物質を含む無菌生理食塩水中に入れ、処理のために直ちに皮膚培養室に運ぶ。ドナー部位には、担当外科医の判断にしたがってＯｐｓｉｔｅ（登録商標）または他の被覆材を貼付する。
【０１４５】
ケラチノサイトの単離および培養
皮膚培養施設に到着後、各患者の生検物を無菌緩衝液で洗浄し、その後の培養における細菌汚染の可能性を低減させるために、抗生物質中において室温で１時間インキュベーションする。表皮層および真皮層を、トリプシン消化によって分離する。分離した組織の向かい合う面をこすり取って、取り出した細胞（主として基底ケラチノサイト）を洗浄し、
大豆トリプシン阻害剤を含む無血清培地中に再懸濁する。この最終細胞懸濁液を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコに播種するが、フラスコには、増殖を停止させたマウス３ｔ３線維芽細胞（２．５×１０４個／ｃｍ２）ならびにビトロネクチン（ＶＮ、５０ｎｇ／ｃｍ２）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ、１５ｎｇ／ｃｍ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５、５０ｎｇ／ｃｍ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ、１５ｎｇ／ｃｍ２）、アデニン（１８０μＭ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍＬ）、および非必須アミノ酸類（１％ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地５ｍＬが含まれる。培養フラスコを、タンパク質複合体が予め吸着しやすくするために、ＶＮ（３００ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｃｍ２）、ＩＧＦＢＰ５（５００ｎｇ／ｃｍ２）、およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｃｍ２）で前処理する。新鮮培地を、３日後に加える。６日間の培養後に、３ｔ３細胞をＥＤＴＡ含有緩衝生理食塩水中でのインキュベーションによって取り除く。残るケラチノサイトを、トリプシン／ＥＤＴＡでさらにインキュベーションすることによって採取し、大豆トリプシン阻害剤を含む緩衝生理食塩水で洗浄する。回収した細胞の濃度を、０．２％ヒト血清アルブミンを含む緩衝生理食塩水で２×１０６個／ｍＬに調製し、手術室に運ぶ。
【０１４６】
ケラチノサイト懸濁液の調製および送達
ＴＥＳＳＥＥＬ Ｄｕｏ ５００（登録商標）を、製造元の指示に従って３７℃に静置して融解させる。融解したら、フィブリノゲンおよびトロンビンのシリンジをそれぞれのホルダから取り外し、無菌プラスチック・チューブに分注する。フィブリノゲン成分は、注射用無菌水で１：１に希釈してから患者細胞懸濁液ストック（第２段階で調製したように細胞２×１０６個／ｍＬ）でさらに１：４に希釈する。トロンビン成分は、注射用無菌水で１：０．２５（すなわち４：１）に希釈する。希釈処理した各成分（フィブリノゲン＋細胞およびトロンビン）の等容量を別個の１ｍＬシリンジに装填し、Ｄｕｐｌｏｊｅｃｔ（登録商標）噴霧ノズルを介してＴＩＳＳＯＭＡＴに装着する。適用時には、２本のシリンジが均等に圧縮され、さらに各成分が１：１の混合物となる。このように、噴霧産物中の最終濃度は、細胞が０．８×１０６個／ｍＬ、トロンビンが１７０ＩＵ／ｍＬ、フィブリノゲンが４．７ｍｇ／ｍＬとなる。混合液約０．５ｍＬを、１０ｃｍの高さから１３８ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で連続的に各２０ｃｍ２の分層創傷に送達する。従って、適用される細胞の平均播種密度は０．２×１０５個／ｃｍ２である。各噴霧の高さおよび間隔は、手の幅（高さ）および３指を合わせた幅（間隔）を使用して概算される。処置される創傷は、日常的な自家分層皮膚移植（火傷の治療や痙縮解除処置）を実施する過程で生じるものである。各創傷のおよそ半分を、噴霧時に無菌マスクで覆って非処置対照とする。２つのドナー部位を使用するとよい。すなわち、１つは処置用、１つは非処置用である。細胞懸濁液を適用する前後に、各創傷を写真撮影する。処置した創傷をＯｐｓｉｔｅ（登録商標）シリコン被覆材で覆う。
【０１４７】
術後の臨床上の注意および評価は、従来のプロトコールに従って行われる。
【実施例５】
【０１４８】
［ＯＲＳ由来細胞の増殖および遊走］
外毛根鞘（ＯＲＳ）初代培養細胞は、同意を得た糖尿病患者の頭皮から採取された成長相の毛嚢に由来するものとし、リマトおよびフンツィカー（Ｌｉｍａｔ＆Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）、２００２、Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ、第１７２巻、ｐ．７９〜８５および国際公開第０１／５９４４２号パンフレットによって記載された方法を使用して培養する。細胞は、事前に形成した分裂終了ヒト皮膚線維芽細胞フィーダー層およびウシ胎児血清添加培地を使用して、皮膚由来のケラチノサイトについて前述したように、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる。培養物を、最大継代数を３としてほぼコンフルエントな状態で維持し、単離タンパク質複合体存在下での細胞増殖の形態学的かつ機能的評価を、血清
およびフィーダー細胞の非存在下で検討する。
【０１４９】
皮膚由来ケラチノサイトの増殖のために至適であると評価された特定の複合体について試験する。
ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させたＯＲＳ由来ケラチノサイト前駆細胞が、単離タンパク質複合体存在下で増殖かつ遊走することが実証されたため、次に、成長相のＯＲＳからの最初の細胞採取と以後の初代培養とについても、血清およびフィーダー細胞を含まない条件で実施可能かどうかを評価する。よって、成長相の毛嚢のＯＲＳを細胞培養インサートの微小孔性膜上に移植し、該膜インサートの下側を分裂終了皮膚線維芽細胞のフィーダー層で被覆するかわりに単離タンパク質複合体で被覆する。細胞を、無血清培地のみ、または患者から採取した自家血清を添加した培地、または単離タンパク質複合体を含む培地で増殖させる。単離タンパク質複合体存在下で増殖させたＯＲＳ由来細胞の増殖速度を、従来の方法を使用してインサート上で増殖させた細胞と比較する。
【０１５０】
また、リマトおよびフンツィカー（Ｌｉｍａｔ＆Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）、２００２、前掲によって記載されているようにして細胞を空気に曝すことにより上皮相当物を調製し、組織学的、超微細構造学的（例えば底部の膜様構造、ケラトヒアリン顆粒、ケラチノゾーム）および免疫組織化学的（例えばケラチン、インテグリン、ｇｐ８０、インボルクリン、フィラグリン）な基準を使用して特性を明らかにする。成功すれば、この増殖因子＋ＶＮ技術によるＯＲＳ由来前駆細胞の使用は、製造コストを顕著に低減させるだけでなく、安全性を促進し、したがって細胞を基盤とする治療法の認可に伴う規制上の問題が迅速に処理されることになろう。
【実施例６】
【０１５１】
［精製ビトロネクチンの調製］
患者血液から精製された自家ビトロネクチン（通常は血液中に０．４ｍｇ／ｍＬで存在する）を、ｅｘ ｖｉｖｏにおける患者自身のケラチノサイトの増殖を支持するために使用する。本発明者らは、ビトロネクチンに対して作製されたモノクローナル抗体でありヒト血清からのビトロネクチンの精製における使用に成功している抗体（アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、２００１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ．、第２４７巻、ｐ．２１７〜２４）について検討する。検討用に選択したモノクローナル抗体を、血清からのＶＮの精製について記載された方法と同様の方法を使用して、精製用マトリクス支持体に連結させる。この段階で、本発明者らは、１ｍ２の患者の細胞を培養するためには０．２５ｍｇのＶＮが必要であると推測するが、この量は２０ｍＬの患者血液から容易に得られるはずである。アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ）ら、２００１、前掲による精製方法を、最小限の操作および簡便性に力点をおいて改変するが、理想的には２〜３回の洗浄ステップだけで済む使い捨てのアフィニティ精製マトリクスを開発することが目的である。ＶＮは患者自身に由来するため、得られたＶＮが依然として効果的に細胞増殖を促進可能であるなら、純粋なＶＮである必要性は低減される。したがって、開発されたプロトコールを使用して精製されたＶＮを、ケラチノサイトの増殖を促進する有効性について評価するとともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎ末端タンパク質配列決定、静電噴霧質量分析法、ならびにＩＧＦおよびＩＧＦＢＰの結合といった標準的生化学的分析を通して評価し、またプロメガ（株）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）から購入したＶＮと比較する。
【０１５２】
明細書全体にわたって、本発明をいずれの１実施形態、特定の特徴の集合体にも限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することを目的としてきた。したがって本明細書の開示を考慮して、本発明の範囲から逸脱することなく、例示された特定の実施形態を様々に改変および変更できることは当業者には理解されよう。
【０１５３】
本明細書で参照した全てのコンピュータ・プログラム、アルゴリズム、特許文献、および学術文献は、参照により本願明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦを含むことと、
（ｉｉ）血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含むことと
を特徴とする哺乳動物細胞培養培地。
【請求項２】
血清を含まないか、または血清の濃度が１％（ｖ／ｖ）以下である、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項３】
血清の濃度が０．５％（ｖ／ｖ）以下である、請求項２に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項４】
血清の濃度が０．１％（ｖ／ｖ）以下である、請求項３に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項５】
血清を含まないことを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項６】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−ＩＩである、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項７】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−Ｉである、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項８】
ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦＢＰ６からなる群から選択されたＩＧＦＢＰをさらに含む、請求項７に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項９】
前記ＩＧＦＢＰが、ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される、請求項８に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１０】
前記ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ５である、請求項９に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１１】
ビトロネクチン（ＶＮ）またはその断片をさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１２】
前記ＶＮ断片がヘパリン結合性ドメイン（ＨＢＤ）を含まない、請求項１１に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１３】
前記ＶＮ断片がポリアニオン領域を含む、請求項１２に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１４】
前記ＶＮ断片が、αｖβ３インテグリンまたはαｖβ５インテグリンから選択されるインテグリン受容体に結合することができる、請求項１３に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１５】
ビトロネクチン（ＶＮ）が精製された自己ビトロネクチン（ＶＮ）である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ、およびビトロネクチンを単離型タンパク質複合体の形で含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１７】
ＩＧＦ−ＩＩおよびビトロネクチンを単離型タンパク質複合体の形で含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１８】
前記単離型タンパク質複合体が合成キメラタンパク質である、請求項６または請求項１７に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１９】
ＥＧＦおよびｂＦＧＦのうち少なくともいずれかをさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項２０】
培養容器と、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞培養培地とからなる哺乳動物細胞システム。
【請求項２１】
ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのうち少なくともいずれか、またはこれらの断片が、固定、結合、またはその他の方法で前記培養容器に結び付いている、請求項２０に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項２２】
請求項２０または請求項２１に記載の哺乳動物細胞培養システムで１または複数の細胞を培養する工程を含む細胞培養方法。
【請求項２３】
培養期間のうち少なくとも一部の期間はフィーダー細胞が存在しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１または複数の細胞が上皮細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記１または複数の細胞がケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１または複数の細胞が角膜細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法に従って培養した１または複数のケラチノサイトと、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤とを含んでなる、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞をエアロゾル送達するための薬剤組成物。
【請求項２８】
噴射剤をさらに含んでなる、請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
フィブリン糊をさらに含んでなる、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦをさらに含んでなる、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかが単離型タンパク質複合体中に存在する、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
個体の皮膚に請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の薬剤組成物を噴霧して、皮膚の再生を促進する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生させるためのケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞の送達方法。
【請求項３３】
前記ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を増殖させて、ｉｎ ｓｉｔｕで再生皮膚を形成させる工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦを含むことと、
（ｉｉ）血清を含まないか、または前記少なくとも１種類のＩＧＦの非存在下では細胞増殖を支持しないと思われる量の血清を含むことと
を特徴とする哺乳動物細胞培養培地。
【請求項２】
血清を含まないか、または血清の濃度が１％（ｖ／ｖ）以下である、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項３】
血清の濃度が０．５％（ｖ／ｖ）以下である、請求項２に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項４】
血清の濃度が０．１％（ｖ／ｖ）以下である、請求項３に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項５】
血清を含まないことを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項６】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−ＩＩである、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項７】
前記ＩＧＦがＩＧＦ−Ｉである、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項８】
ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、およびＩＧＦＢＰ６からなる群から選択されたＩＧＦＢＰをさらに含む、請求項７に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項９】
前記ＩＧＦＢＰが、ＩＧＦＢＰ３およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される、請求項８に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１０】
前記ＩＧＦＢＰがＩＧＦＢＰ５である、請求項９に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１１】
ビトロネクチン（ＶＮ）またはその断片をさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１２】
前記ＶＮ断片がヘパリン結合性ドメイン（ＨＢＤ）を含まない、請求項１１に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１３】
前記ＶＮ断片がポリアニオン領域を含む、請求項１２に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１４】
前記ＶＮ断片が、αｖβ３インテグリンまたはαｖβ５インテグリンから選択されるインテグリン受容体に結合することができる、請求項１３に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１５】
ビトロネクチン（ＶＮ）が精製された自己ビトロネクチン（ＶＮ）である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項１６】
ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ、およびビトロネクチンを単離型タンパク質複合体の形で含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１７】
ＩＧＦ−ＩＩおよびビトロネクチンを単離型タンパク質複合体の形で含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１８】
前記単離型タンパク質複合体が合成キメラタンパク質である、請求項６または請求項１７に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項１９】
ＥＧＦおよびｂＦＧＦのうち少なくともいずれかをさらに含む、請求項１に記載の哺乳動物細胞培養培地。
【請求項２０】
培養容器と、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の哺乳動物細胞培養培地とからなる哺乳動物細胞システム。
【請求項２１】
ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのうち少なくともいずれか、またはこれらの断片が、固定、結合、またはその他の方法で前記培養容器に結び付いている、請求項２０に記載の哺乳動物細胞培養システム。
【請求項２２】
請求項２０または請求項２１に記載の哺乳動物細胞培養システムで１または複数の細胞を培養する工程を含む細胞培養方法。
【請求項２３】
培養期間のうち少なくとも一部の期間はフィーダー細胞が存在しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１または複数の細胞が上皮細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記１または複数の細胞がケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１または複数の細胞が角膜細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法に従って培養した１または複数のケラチノサイトと、薬剤として許容可能な担体、希釈剤、もしくは賦形剤とを含んでなる、ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞をエアロゾル送達するための薬剤組成物。
【請求項２８】
噴射剤をさらに含んでなる、請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
フィブリン糊をさらに含んでなる、請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩから選択された少なくとも１種類のＩＧＦをさらに含んでなる、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのうち少なくともいずれかが単離型タンパク質複合体中に存在する、請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
個体の皮膚に請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の薬剤組成物を噴霧して、皮膚の再生を促進する工程を含む、ｉｎ ｓｉｔｕで皮膚を再生させるためのケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞の送達方法。
【請求項３３】
前記ケラチノサイトまたはケラチノサイト前駆細胞を増殖させて、ｉｎ ｓｉｔｕで再生皮膚を形成させる工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−５７５１３（Ｐ２０１０−５７５１３Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８５５１２（Ｐ２００９−２８５５１２）
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【分割の表示】特願２００６−５２１３４４（Ｐ２００６−５２１３４４）の分割
【原出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（５９２２５３２７５）クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１６日（２００９．１２．１６）
【分割の表示】特願２００６−５２１３４４（Ｐ２００６−５２１３４４）の分割
【原出願日】平成１６年７月２８日（２００４．７．２８）
【出願人】（５９２２５３２７５）クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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