稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６
本発明により、単離された水稲内在性のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子（遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６）、その機能保存変体、機能の同等の生物活性断片または誘導体が提供される。さらにハイブリッド種子生産過程での自家交配混雑を避ける方法、部位特異的遺伝操作の新たな方法及び植物の性質の改良する新たな方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属するものである。より詳しくは、本発明は、稲の中のベンタゾン（Bentazon）及びスルホニルウレア系（sulfonylurea）除草剤に耐性のある遺伝子の正確なマッピング、単離、及びクローニングに関する。さらに本発明は、前記の除草剤耐性遺伝子の助けを借りて他の重要な農学上の性質に関する遺伝子に対して部位特異的突然変異を行って、稲などの作物の重要な農学上の性質に対する改良、ハイブリッド種子を作る場合の自家交配混雑の回避及び部位（座位）特異的な遺伝子の操作などへの応用にも関する。
【０００２】
背景技術
稲の雑種強勢を利用して、中国はハイブリット・イネの研究に成功して、稲の生産高を大幅に高めさせている。中国のは核細胞質相互作用雄性不稔（Nuclear Male Sterile）の三系法（Three-line-method）に基づく雑種強勢の利用の成功に続いて、大規模な二系法（Two-line-method）ハイブリット・イネの研究、開発及び普及を進めている。二系法の稲のハイブリッド種子は、光・温度感応性雄性不稔系統の育種（Breeding of PTGMS-Line）により生産されるものであるが、光・温度感応性雄性不稔系統の稔性は、環境温度の影響を受け易く、夏の異常低温が光・温度感応性雄性不稔系統の稔性を回復させることがある。これにより、二系法でハイブリッド種子の生産が低温に遭うと、収穫する種子が真のハイブリッド種子に偽のハイブリッド種子（即ち不稔系統の自家交配で実る種）が混じるという潜在的なリスクが存在している。一旦、このような母本の自家交配の混雑がおこると、これを有効に除去できなければ、種子生産または大面積での生産に重大な損失が引き起こされる。広西では１９８９年、湖南では１９９９年に、すべてこのような原因により大きな損失に見舞われた。
【０００３】
資料によれば、稲のハイブリッド種の純度が１パーセント下がるごとに、大面積での生産ではヘクタールごとに生産高が７５ｋｇ減少する。このため、「稲のハイブリッド種子の純度を９８％以上に達すること」との、中国農業部による種子規格が規定されている。光・温度感応性雄性不稔系統の種子生産で生産される二系法稲のハイブリッド種子に混雑の問題が存在しているだけでなく、修飾遺伝子が関与する核の主要遺伝子による不稔、薬剤及び施薬条件に影響される人工化学品による除雄不稔、核内の温度感応性遺伝子に影響される核細胞質相互作用雄性不稔、及び人工培養の非整倍体雄性不稔などの不完全雄性不稔系統で種子を培養する場合も、すべて、生産されるハイブリッド種子に母本自家交配の種子が混雑することがある。その自家交配混雑を排除して、作物の雑種強勢の利用の普及によってより信頼できる基礎を確立するために、様々な試みがなされてきた。耐除草剤の特性が現代作物の育種に広く応用されている現状に鑑み、野生型の稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性のある特徴を利用して、上記のハイブリッド稲の育種の過程にある種の混雑の問題を解決するように努力している研究者も少なくない。
【０００４】
野生型の稲に適用されている選択性の除草剤は主に二種類ある。一つはベンタゾンのような、ベンゾチアジアゾール（benzothiadiazole）類の除草剤である。これは、有効成分が作物の根、葉を通じて吸収され、豆科以外の大多数の双子葉植物及びカヤツリグサ科の雑草に対する除去作用がある一方で、イネ科植物に無害である。ベンタゾンの除草原理は植物の光合成の中のヒル反応（Hill reaction）に対する抑制である。これまでのところ、植物からベンタゾンのような除草剤に耐性のある内在性遺伝子はまだクローニングされていない。もう一つは、ＤｕＰｏｎｔ社により開発された、スルホニルウレア系除草剤類であり、選択性が高く、適用範囲の広く、毒性が低く、内部吸収型であるという特徴のある、新しいカテゴリーの超高効果除草剤である。この内、ベンスルフロンメチル（bensulfuron-methyl）、トリベヌロンメチル（Tribenuron-methyl）及びその複合剤型は、中国の稲田の除草に最も広く応用されている除草剤である。スルホニルウレア系除草剤は最大の特徴が高い活性にあり、普通の場合、使用剤量が５〜１００ｇ／ヘクタールである。スルホニルウレア系除草剤はアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）抑制剤であり、多くの一年生または多年生の雑草、特に広葉の雑草に特効を持っていて、稲、小麦、大豆、トウモロコシ、アブラナ（耐エタメツルフロンメチル）、平らな草地及びその他の非耕地の雑草に広く用いられている。ＤｕＰｏｎｔ社は複数のスルホニルウレアに耐性のある遺伝子を開発した。一つはタバコ耐性変異体からクローニングされた耐スルホニルウレア遺伝子ＳＵＲＢ−Ｈｒａである。当遺伝子はタバコＡＬＳ遺伝子の変異に基いて形成する耐性であり、すでに綿花、大豆など多種の作物に応用されている（ＵＳ５０１３６５９，ＵＳ５０８４０８６，ＵＳ５１４１８７０，ＵＳ５３７８８２４，ＵＳ５６０５０１１）。他のの耐スルホニルウレア遺伝子は土壌細菌からの遺伝子Ｐ４５０ ｓｕ１であり、スルホニルウレアの代謝を速めて無毒にしてその耐性を実現させるものである。ＤｕＰｏｎｔ社は遺伝子Ｐ４５０及びその応用について深く研究した。関連の情報はＵＳ５３４９１２７などを参照のこと。日本の日産化学株式会社は特許出願ＷＯ９７０８３２７において、双子葉の広葉植物のホウキギ（Kochia scoparia）のｃＤＮＡから単離されて、形質転換された植物の株をスルホニルウレアに耐えさせる機能を持っているアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）の遺伝子を公開した。
【０００５】
現在、除草剤耐性の作物の開発方法は主に二種類ある。一つは伝統的な物理化学的な突然変異生成を通じて、耐除草剤の作物の変異体を得る方法であり、もう一つはＤＮＡ組換え技術により耐除草剤の遺伝子を現有の種に導入して、耐除草剤の新しい素材を創造する方法である。この内、後者は最も広く応用されているものである。現在、作物の除草剤耐性を高めるために、組換えＤＮＡ技術を用いる二種類の方策がある。一つは除草剤の作用を修飾するターゲットタンパク（herbicide target protein）を導入して、除草剤に対して耐性にさせ、または、植物が除草剤を吸収してから正常に代謝できるように、それを過量発現させるものである。もう一つは新たな酵素または酵素システムを導入して、除草剤が働く前にそれを分解したり、解毒したりするものである。例えば、遺伝子Ｐ４５０など（Wang Guanlin & Fang Hongjun、１９９８）である。
【０００６】
野生型稲は天然的にベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性を持っている。日本の学者のＭｏｒｉ氏及び湖北省農業科学院張集文氏などは相次ぎ、ガンマ線照射技術により、稲のベンタゾン感応性致死変異体である、農林８号Ｍ（Mori，１９８４）及び８０７７Ｓ（張集文氏、武暁智氏、１９９９）を得た。張集文氏らはさらに、ベンタゾン除草剤に対して感応性である隠性遺伝子の部位（site）で母本不稔系統を表示する除雑保純技術システム（張集文氏ら、２００１）も開発した。ハイブリッド稲特に二系ハイブリッド稲の種の純度安全の保障体系の中のこんな種質資源の重要な応用により、８０７７Ｓの携帯している変異部位で表示する二系不稔系統を利用すると、最大の限度で二系ハイブリッド稲の種子生産のリスクを下げ、ハイブリッド種子の純度を保証できるので、育種の専門家及び種子企業に高度に重視されている。但し、その除雑保純技術システムは種子生産の後に除雑を行うものであるから、効果がいいであっても、販売の前に、その純度の低い種が国家の規定する種子の純度の規格と衝突するので、種子の管理機関に承認され難い。したがって、新たな除雑保純技術システムが必要となる。但し、多年以来、当性質の制御遺伝子がずっと正確にマッピングまたは単離クローンを行われていないので、当性質に対する遺伝操作及びさらにの利用ができない。これはこの分野の大きな技術障害となった。
【０００７】
上述の状況に鑑み、本発明者らは研究を通じて、稲の現有の二つのベンタゾン感応性致死変異体を材料にして、その変異の遺伝子部位に対する精細なマッピングを行って、それにその野生型同部位の遺伝子をクローニングした。同時に、それに基いて有用の方法及び技術を開発した。例えば、植物化学での補充殺雄の温度感応性の不稔系統の創造方法、遺伝子グループの二部位または多（複数）部位の部位特異的な遺伝子の共修飾による遺伝子操作技術、植物遺伝子の生物学機能の新たな調査方法及び植物の性質改良の新たな方法。それにより、ハイブリッド稲の育種の過程にある除雑保純の問題を解決しただけでなく、遺伝子の生物学機能の研究及び生物性質の改良に極めて応用前途を持っている実用的な方法を提供している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は目的が下記の通りである：
− 単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子（以下「遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６」と称する）、その機能保存変体、機能の同等な生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− 上述の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子のｃＤＮＡ配列、その機能保存変体、機能の同等の生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子を提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物を含む組換えベクターを提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドを提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物または遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドの遺伝子工学的な細胞を提供すること。
− ハイブリッド稲のハイブリッド種子生産の時にある自家交配混雑の防止方法を提供すること。
− 新たな部位特異的な遺伝子操作方法を提供すること。
− 植物の性質の改良する新たな方法を提供すること。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本発明の上述の目的および特徴は下記の具体的な説明により明らかにされるであろう。
【００１０】
本発明者らはまず、変異体８０７７Ｓ及び農林８号ｍにあるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子に対する精細なマッピングを行い、それに野生型の栽培稲からベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６及び当遺伝子に対する調整及び制御を行うプロモーターのＤＮＡ断片を単離して、当遺伝子で大豆以外の大多数の双子葉植物及びカヤツリグサ科雑草植物のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える特性を改良できる。
【００１１】
本発明により提供されるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子は、下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【００１２】
前記の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性の内在性遺伝子は好ましくは配列番号１に示すヌクレオチド配列であり、前記の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性の内在性遺伝子のｃＤＮＡは好ましくは、配列番号２に示すヌクレオチド配列である。
【００１３】
本発明により提供されるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりコードされてなるポリペプチドは、下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列のポリペプチドを含んでなる：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【００１４】
この内、好ましい具体例は配列番号３に示すアミノ酸配列である。
【００１５】
本発明は、生細胞内において遺伝子グループの二つまたは複数の部位におけるターゲット配列に対して、同時に部位特異的な共修飾を行う遺伝操作方法であって、
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド分子（ＲＣＯｓ）を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型（選別可能の表型）を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うこと
を特徴とする方法を提供する。
【００１６】
上述の遺伝操作方法の中に、選別マーカーにするヌクレオチド配列は変異または未変異の耐性（感応性）除草剤の遺伝子、耐抗生物質の遺伝子、生物または化学の発光遺伝子及び酵素遺伝子などを含むがそれに限られず、当業者は公知の知識により自由に選択してもいい。その中、除草剤耐性／感応性遺伝子、特に配列番号１または配列番号２のあるヌクレオチド配列またはその機能と同等の断片または誘導体、配列番号１に示すヌクレオチド配列の中の第２４５５位塩基Ｃまたは第４００６位塩基Ｇの欠けているヌクレオチド配列、配列番号２に示すヌクレオチド配列の中の第５６０位の塩基Ｃまたは第１３８５位塩基Ｇの欠けているヌクレオチド配列を優先して選ぶ。
【００１７】
現在の研究によれば、単離及びクローニングの行われた耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子はシトクロムＰ４５０タンパクをコードしており、これは国際標準分類及び命名システムで正式に「ＣＹＰ８１Ａ６」（http:// drnelson. utmen.edu/cytochromep450. html）と名称を付けられいる。このタンパク質は、一般のタンパクＰ４５０の保存領域を含み、そのアミノ酸配列は配列番号３の通りである。現在、タバコのＣＹＰ７１Ａ１１及びＣＹＰ８１Ｂ２（Yamadaら、２０００）、大豆のＣＹＰ７１Ａ１０（Siminszky氏ら、１９９９）、高粱のＣＹＰ７３Ａ１（Pierrel氏ら、１９９４）及びＣＹＰ７６Ｂ１（Didierjean氏ら、２００２）及びhlaspi arvensae のＣＹＰ７１Ｂ１（Lamb氏ら、１９９８）のように、種々の除草剤耐性遺伝子Ｐ４５０が植物からクローニングされているが、それらの遺伝子Ｐ４５０と遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６との間の同一性はすべて４０％未満であり、それにベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤を分解できない。これらの結果から、遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６は新たな耐除草剤の遺伝子Ｐ４５０である。したがって、本発明はこの遺伝子と遺伝子自身のプロモーターまたは他の組成型または特異プロモーターとの連接を利用して、豆科以外の大多数の広葉植物またはカヤツリグサ科の雑草に導入して、新たな耐除草剤の植物系統を開発することに関連する。
【００１８】
本発明に示すＤＮＡ断片の発現は構成的発現であるので、当遺伝子のアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉと葯組織の特異発現のＯｓｇ６Ｂ及びＲＡ３９などのような特異発現プロモーターとの連結を利用して、稲などの温度感応性の不稔系統に導入して、当遺伝子をその葯で発現できないようにして、スルホニルウレア系除草剤を利用して花粉を殺し、新たな化学的に補充し除雄した温度感応性雄性不稔系統を作製する。
【００１９】
他に、本発明で鑑定されているベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して感応性する二つのＣＹＰ８１Ａ６一塩基の変異部位の欠失が遺伝子の部位特異的突然変異に利用できる修飾ターゲットを提供している。故に、ＲＣＯｓ分子の部位特異的修復の変異体の中の遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６を利用して、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性を修復体に与えて、選別の目的に適合する。この変異遺伝子の助けを借りて、異なるターゲットに向けるＲＣＯｓ分子に対する設計及び導入を二種またはそれ以上に行ってもいい。その中、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対するその耐性を回復して選別のマーカーとするように、一種の分子は遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６の単ヌクレオチドの欠失変異の部位特異的修復に用いられ、農学上の性質の改良された所望の新たな品種もしくは系統を得るように、もう一種または多種の分子は内在性遺伝子に対する部位特異的突然変異に用いられて、次に、変異体と野生型との間に表示している表型または生理生化型の差異により、その確実な生物学機能を推定し、または目的遺伝子の変異体に対する純系の選育を行う。外に、その他の遺伝子の部位の選択可能性の修飾表型または共に外来選択可能性の遺伝子に対する導入を通じてターゲット遺伝子の変異体に対する関連性選択を行ってもいい。
【００２０】
さらに、この技術またはその他のＤＮＡ相同組換え技術または物理化学的突然変異生成技術を利用して遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６に対する部位特異的またはランダムの変異を行って、この遺伝子の機能を変えて、除雑保純に用いられる新たなベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性変異体を作製してもいい。外に、クローンされる野生型の同等の遺伝子は遺伝形質転換を行われてから豆科以外の大多数の広葉植物またはカヤツリグサ科の雑草にベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える特性を与えられる。
【００２１】
ＣＹＰ８１Ａ６のコード配列は異なる種の植物に広く保存しているので、稲の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６及びその誘導配列の約８つまたはもっと多くのヌクレオチドのプライマー及びプローブをイネ科の中の他の属種の相同遺伝子の単離及びクローンに利用する。上述の方法で稲のＣＹＰ８１Ａ６と高度に相同する遺伝子をクローンできる。この配列を適するベクターにつないで、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に感応性である植物細胞を導入して、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える遺伝子組み換え植物を創造する。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される下記用語の意義は当業者のよく知られており、常用されているのものである。ここにその中の一部の用語について例をあげて簡明に説明する。
【００２３】
本明細書において「ヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチド並びにその断片または部分のことであり、ゲノムであってもまたは合成のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖でも二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表してもよい。
【００２４】
「機能同等の断片」、「機能同等の生物活性断片」とは単離されたＤＮＡの断片の一部または亜配列である。その中、これらの断片または亜配列が活性タンパク質にコードを付けているか付けていないかにかかわらず、すべて遺伝子の発現を変えたり、一定の耐除草剤を生じたりする能力を保留している。例として、上述の断片はキメラ遺伝子の設計またはアンチセンス抑制などに用いられる。「機能同等の誘導体」、「機能保存変体」とは単離されたＤＮＡの断片の配列の全部、または一部である。この内、これらの断片が活性タンパク質にコードを付けているか付けていないかにかかわらず、すべて遺伝子の発現を変えたり、一定の耐除草剤を生じたりする能力を保留していて、それにキメラ遺伝子の設計またはアンチセンス抑制などに用いられる。
【００２５】
「変体」とは、一つまたは複数のアミノ酸残基または核酸塩基の変更のあるアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列をいう。ここで言う「変更」とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の欠失、挿入または置換などを含む。本発明でいう「変体」は保存的変更を有しており、変更されたアミノ酸は元のアミノ酸と構造上もしくは化学的性質上類似している。このポリヌクレオチドの変体は天然発生または非天然発生の変体であってもいい。これらのヌクレオチド変体は、置換体、欠失体、及び挿入体を含む。当該技術分野において知られているように、等位変体はポリヌクレオチドの取替形式であり、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失及び挿入であることがあるが、実質にそのコードされたポリペプチドの機能を変えることがない。
【００２６】
「アミノ酸配列」とはオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列及びその断片または一部のことである。本発明に関連する「ポリペプチド」または「タンパク質」はいわゆるポリペプチドまたはタンパク質分子の完全な天然アミノ酸配列に限らない。
【００２７】
「相同性」とは、二種または多種のアミノ酸またはヌクレオチド配列の比べの中に配列の同じまたは類似のパーセントのことであり、相同性方法の測定に用いられ、例として、プログラムＭＥＧＡＬＩＧＮ（Lasergene software package,DNASTAR, Inc.,Madison Wis.）を採用することにより測定することができる。プログラムＭＥＧＡＬＩＧＮはＣｌｕｓｔｅｒ法（Higgins, D.G. 及びP.M.Sharp (1988)Gene 73:237-244）などの異なる方法により二またはそれ以上の配列間を比べてもいいし、Ｃｌｕｓｔｅｒ法及びＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎのような当該技術分野において公知の方法により核酸配列の間の相同性（Hein J., (1990) Methods in emzumology 183:625-645）を測定してもよい。
【００２８】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）低いイオン強度及び高い温度に行うハイブリッド及び洗浄のことであり、例として、０．２×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ，６０℃、または、（２）ハイブリッドの場合に変性剤を加えることであり、例として、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ， ４２℃など、または、（３）二つの配列の間の相同性が少なくとも９５％以上にあり、最適化選択９７％以上の場合しかハイブリッドを実施しなく、それに、ハイブリッド実施可能のポリヌクレオチドのコーディングのポリペプチドと配列番号１に示すヌクレオチドのコーディングのポリペプチドとが同じ生物学機能を持っている。
【００２９】
「ベクター」とは、当該技術分野においてよく知られている細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド及び植物細胞ウイルスなどのことである。本発明に適用するベクターはアグロバクテリウムベクター、大腸菌プラスミドベクター及びウイルスベクターなどを含む。まとめて言うと、宿主の体内に複製及び安定な遺伝を実施さえすれば、いかなるプラスミド及びベクターも本発明の組換え発現ベクターを構成できる。
【００３０】
「宿主細胞」とは、本発明のヌクレオチド配列を導入でき、または本発明のヌクレオチド配列の組換えベクターを含む、遺伝子工学的宿主細胞のことをいい、例えば、十字花科植物（musttard）、ナス科植物(solanaceae)、カヤツリグサ科植物(cyperaceae)、旋花科植物(convolvulaceae)、アオイ科植物(malvaceae)、及び亜麻科植物(linaceae)の細胞などが挙げられる。
【００３１】
「スルホニルウレア系除草剤」は、効果が非常に高く、適用範囲が広く、毒性が低く、選択性の高い除草剤のカテゴリーであり、生物活性が伝統的な除草剤の１００〜１０００倍を超え、植物の根、茎及び葉に吸収され、アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）に作用して、バリン及びイソロイシンの生物合成を抑制して、タンパク質の合成障害を起こして、感応性植物の成長部の成長を抑制する。本発明の中の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６は耐えるのが表１に示すスルホニルウレア系除草剤を含むが、それに限らない。
【００３２】
さらに、本発明の核酸配列または本発明の核酸配列の組換えベクターを含む形質転換宿主細胞は、当業者によく知られている日常的な技術で行ってもいい。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＣａＣｌ２法、電気穿孔法などを利用してもいい。宿主が真核細胞である場合、アグロバクテリウム法、粒子衝撃法、ＤＮＡ転染法、リン酸カルシウム共沈殿法、顕微注射法またはリポソーム包接法などを使用してもいい。
【００３３】
【表１】
【００３４】
配列番号１： ＣＹＰ８１Ａ６コード遺伝子及びＣＹＰ８１Ａ６のプロモーターを含む。
配列番号２： ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列。
配列番号３： ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子によりコードされたアミノ酸配列。
【００３５】
次に、具体的な実施例に結び合わせて、本発明について詳細に説明する。当業者が知っているように、これらの実施例は本発明を限定するものではない。通常、下記の実施例において条件及び試験方法について説明されていないものは、Sambrookらの「分子クローン実験ガイド」（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に記載されている条件のような公知の手法及びメーカーの説明書により操作される。
【実施例】
【００３６】
実施例１： ターゲット遺伝子の精細なマッピング及びクローニング
１． 稲品種８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死遺伝子ｂｅｌの精細なマッピング
１．１ マッピング集団
本実験に使用されるマッピング集団は、Ｆ２劣性単株からなる。構成する場合、先ず、遺伝子ｂｅｌ部位を含む低く育成されている６４Ｓ戻し交配転育系統（「低育成６４ｍ」と略す）（野生型の低育成６４Ｓは湖南国家ハイブリッド稲研究及び開発センターより提供）と野生型の９３−１１回復系統（江蘇里下河地区農科所より提供）とのハイブリッドによりＦ１を得て、次にＦ１の自家交配によりＦ２を計１０００株得た。種子を播いてから、苗が３〜４枚の葉まで成長した場合、張集文及び武暁智氏（１９９９）のベンタゾンの薬塗りの鑑定方法により、濃度１２５０ｍｇ／Ｌのベンタゾン（江蘇剣ブランド農薬化工有限公司製の２５％ベンタゾン水剤）でこのＦ２群のすべての単株に対して葉を一々に切って（葉先から１ｃｍぐらい切る）、株ごとに３枚の葉に薬を塗った。その後、葉を処理する時のベンタゾン感応性反応により、劣性感応性致死ホモ接合体を２３１株本実験のマッピング集団に確定した。
【００３７】
１．２ ＤＮＡの抽出
ＭｃＣｏｕｃｈ氏ら（１９８８）のＣＴＡＢ法を応用して、二つの親本９３−１１、低く育成６４ｍ及び２３１の感応性致死個体からそれぞれ葉総ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出用試薬は全部上海生工生物工学技術サービス有限公司（以下「上海生工」と略す）から購入した。
【００３８】
１．３ ＳＳＲ分析及び遺伝子ｂｅｌの精細なマッピング
ＳＳＲ増幅反応の体系は下記の通りである。５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１×ＰＣＲ反応緩衝液、１．８７ｍＭ Ｍｇ２＋、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、酵素１．０ｕ ｒＴａｑ ［宝生物工学（大連）有限公司、即ちTakara Biotech、以下「Ｔａｋａｒａ」と略す］及びフォワードおよびリバース プライマー 各０．２μＭ。反応の総体積：２０μｌ。反応の条件： ９５℃ ３分間、次に３５の循環（９４℃、１分間、６０℃、１分間、７２℃）を行い、７２℃に５分間、最後に、１０℃に保存した。３．５％のゲロース糖脂質（上海生工）でＰＣＲ産物を単離し、ＥＢ（上海生工）で染色を実施し、ＵＶＰ作像方式（ドイツ）で観察して写真を取った。
【００３９】
本発明者らは、先の研究にＳＳＲマーカーで８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死遺伝子を初めに稲の第三染色体の長いアームに位置を決めて、ＳＳＲ分子のマーカーＲＭ１６８との遺伝距離が７．１ｃＭ（Ｚｈａｎｇら、２００２）であった。さらに遺伝子ｂｅｌに対する精細なマッピングを行うために、本発明はＳＳＲプライマーサーチソフトウェアのＳＳＲＨｕｎｔｅｒ １．３の助けを借りてＲＭ１６８から染色体の長いアームの末端までの間のゲノム配列（http://btn.genomics.org.cn/rice）を分析して、ＳＳＲマーカーを設計して合成した。例として、７ａ（フォワードプライマー：５’−ＧＴＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＡＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧ−３’）、３ａ（フォワードプライマー：５’−ＴＧＴ ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＧＴＧＴＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣ ＧＴＡＴＴＣ−３’）及び８ａ（フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴ−３’；リバースプライマー：５’−ＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＴＧＡＣＧ−３’）など（プライマー配列はすべて上海生工で合成した）。その中、３ａ及び７ａが同一のＢＡＣクローンＡＣ０８４２８２にあった。８ａで劣性致死グループから検出した四つの単交換の発生した組換え単株を表示し、７ａマーカーは感応性致死グループから他の異なる単交換組換え単株を四つ検出した。ベンタゾン感応性致死遺伝子がこの二つのマーカーの間に位置しているとこの結果がさらに証明している。さらに、８ａに近い分子マーカー３ａで遺伝子ｂｅｌに対する精細なマッピングを行った結果、出てきた単交換組換え単種が一つしかなかったので、ベンタゾン感応性致死遺伝子の位置を３ａと７ａとの間に決めた。ＭＡＰＭＡＲＫＥＲ３．０でｂｅｌ遺伝子部位の精細なマッピング地図（図１）を作成した。その中、分子マーカー３ａ及び７ａが遺伝子ｂｅｌからの遺伝距離がそれぞれ０．１ｃＭ及び０．４ｃＭであった。
【００４０】
２． 候補遺伝子の確定及びその単離、クローン
２．１ 候補遺伝子の確定及び順序測定、分析
配列の分析によると、分子マーカー３ａと７ａとの間に推測の遺伝子（putative genes）が１８あり、その中、連続して排列しているシトクロム遺伝子Ｐ４５０を４つ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がそれぞれＡＡＫ６３９４０．１，ＡＡＫ６３９２０．１，ＡＡＫ６３９２２．１及びＡＡＫ６３９２５．１である）含み、国際標準分類及び命名システムに正式にＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ６、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８と命名された（http://drnelson.utmen. edu/cytochromep450.html）。これまでの研究により、稲の微粒体の中の遺伝子Ｐ４５０がベンタゾンの解毒作用（Ｈａａｃｋら、１９９４）に関与した。それに、Ｄｅｎｇ及びＨａｔｚｉｏｓ（２００３）らは稲の苗から分子量約６０ｋＤａまで純化されたＰ４５０タンパクを単離し、除草剤ベンスルフロンメチル（bensulfuron-methyl）の分解代謝の過程に非常に重要な役割があることを確認した。故に、ベンタゾンの感応性致死基因が遺伝子Ｐ４５０に関連する可能があると考えて、その四つの遺伝子Ｐ４５０のクラスターを候補遺伝子と確定した。
【００４１】
より正確に候補遺伝子を確定するために、私たちは四つの遺伝子Ｐ４５０のゲノム配列によりそれぞれ特異プライマー（表２）を合成し、ハイファイのｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を利用して野生型の稲Ｗ６１５４Ｓ及び変異体８０７７Ｓからそれぞれ候補遺伝子を拡張して、それに直接に配列を測定した（Perkin Elmer AMI 377、上海基康生物技術有限公司、以下「上海基康」と略す）。配列測定の結果に関する分析により、野生型の稲Ｗ６１５４Ｓ及び変異体８０７７ＳからのＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの間にいかなる差異もなく、源泉変異体８０７７Ｓのｃｙｐ８１Ａ６が野生型のＷ６１５４Ｓの中のＣＹＰ８１Ａ６より一つのＧ（配列番号１に示す配列の第４００６塩基）を欠けている。故に、ＣＹＰ８１Ａ６を唯一の候補遺伝子に確定した。
【００４２】
上記の４つの遺伝子に対するＰＣＲ増幅及び配列測定に使われたプライマー（配列は上海生工で合成した）は下記の通りであった： ＣＹＰ８１Ａ５：Ｐ１−１ａ及びＰ１−１ｂ，Ｐ１−２ａ及びＰ１−２ｂ，Ｐ１−３ａ及びＰ１−３ｂ；ＣＹＰ８１Ａ６：Ｐ２−１ａ及びＰ２−１ｂ，Ｐ２−２ａ及びＰ２−２ｂ，Ｐ２−３ａ及びＰ２−３ｂ，Ｐ２−４ａ及びＰ２−４ｂ，Ｐ２−５ａ及びＰ２−５ｂ，Ｐ２−６ａ及びＰ２−６ｂ；ＣＹＰ８１Ａ７：Ｐ３−１ａ及びＰ３−１ｂ，Ｐ３−２ａ及びＰ３−２ｂ，Ｐ３−３ａ及びＰ３−３ｂ；ＣＹＰ８１Ａ８：Ｐ４−１ａ及びＰ４−１ｂ，Ｐ４−２ａ及びＰ４−２ｂ，Ｐ４−３ａ及びＰ４−３ｂ。各プライマーの配列は表２の通りである。
【００４３】
２．２ ジャポニカ米の稲及びインディカ米の稲の中のベンタゾン感応性致死遺伝子の等位性テスト
早くも１９８４年の時に、日本の学者のＭｏｒｉはガンマ線照射誘導技術で農林８号を誘導してベンタゾンに感応性である致死変異体の農林８号ｍ（Ｍｏｒｉ，１９８４）を得た。古典的な遺伝学の分析によると、この性質は一対の劣性遺伝子に制御されている。８０７７Ｓと農林８号ｍの中のベンタゾン感応性致死遺伝子と等位であるかどうかを検証するように、私たちは８０７７Ｓと農林８号ｍとのハイブリッドにより、Ｆ１ハイブリッド及び一つの８００株のＦ２グループを得た。種をまいてから、苗が生９〜１０枚の葉まで出てから、１２５０ｍｇ／Ｌ濃度のベンタゾンを８０７７Ｓ、農林８号ｍ及びそれらのＦ１植株に散布した。一週間の後に、すべての植株が枯れて死亡した（図２）。これにより、二つの変異体の中のベンタゾン感応性致死遺伝子の間の相互の等位が証明された。同時に、８００つのＦ２植株のグループに薬を散布した。その結果、処理されたすべての植株も枯れて死んだ。これはより一歩に二つの変異体の中のべンタゾン感応性致死遺伝子が一対の等位遺伝子であったことを証明した。区別するために、８０７７Ｓ及び農林８号ｍからのｃｙｐ８１Ａ６をそれぞれｃｙｐ８１Ａ６−１及びｃｙｐ８１Ａ６−２と命名した。
【００４４】
遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の特異プライマー（表２）を利用して、ハイファイ重合酵素ｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）で野生型稲の農林８号及び変異体の農林８号ｍからそれぞれＣＹＰ８１Ａ６及びｃｙｐ８１Ａ６−２を拡充して、それに直接に配列（Perkin Elmer AMI 377、上海基康）を測定した。その結果によると、変異体農林８号ｍからのｃｙｐ８１Ａ６−２は野生型の農林８号の中のＣＹＰ８１Ａ６より、配列番号１に示す配列の第２４５５ｂｐの部に一つのＣを欠失している。それにより、等位分析の結果がさらに証明された。
【００４５】
【表２】
【００４６】
２．３ ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析
配列測定にある可能の誤差を防止するように、私たちはさらにＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析法を利用して二つの変異体の中のｃｙｐ８１Ａ６−１及びｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基の変異部位に対する検査及び検証を行った。実験に、先ず分析ソフトウェアＷＥＢＣＵＴＴＥＲ ２．０を利用してｃｙｐ８１Ａ６−１変異部位を含む一つの断片の野生型及び変異型配列に対する対比分析を行い、その変異の前後に変えられたまたは新たに生じた制限酵素の部位（Restriction Enzyme cutting site）を観察した結果、そんな部位を見つけなかった。故に、私たちはプライマー設計を通じてｃｙｐ８１Ａ６−１変異部位の上位置の付近の二つの異なる塩基Ｇ及びＡを二つのＣに変え、当プライマーを利用して拡充した当変位点を含んだ一断片のＤＮＡ配列を人工により新たなＢｇｌ Ｉ（ＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ）酵素部位を導入させた。検査の結果により、野生型の稲の品種の中で、その拡充の産物に欠失していない塩基Ｇが余っているので、Ｂｇｌ Ｉに酵素部位点と識別されられなく、当酵素で切ってから長さの２５１ｂｐしか形成しなかった。けれども、その変異体中に、そのＰＣＲ産物が酵素Ｂｇｌ Ｉに切られてから２４ｂｐ及び２２７ｂｐの二本の帯（図３）が形成できた。さらに当該ＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマー利用してそれぞれ二つの親本９３−１１、低育成６４ｍ及びそのＦ２マッピング集団のＤＮＡ混合サンプル（（４６株／部））を５部拡充して、得た拡充産物がＰＣＲ産物専用試薬ケース（Ｔａｋａｒａ）で純化されてから、酵素Ｂｇｌ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）で切り、すべてのＦ２混合サンプルのバンドｔｙｐｅが親本の低育成６４ｍのそれと一致（図４）していたので、ＣＹＰ８１Ａ６−１変異部位に対して人工で導入したＢｇｌＩ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーが遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６と共に単離されたものと証明した。私たちは当マーカーをＤＰ１（図１）と命名した。
【００４７】
変異体ｃｙｐ８１Ａ６−２に対して、同様に、分析ソフトウェアＷＥＢＣＵＴＴＥＲ ２．０利用して、その野生型及び変異体のＤＮＡ配列に対する制限性酵素部位分析を行った。結果によると、当変異体に生じた一塩基欠失変異部位がちょうどＮａｅ Ｉ（ＧＣＣＧＧＣ）酵素識別配列にあったので、当酵素に識別されなく、その上位５０ｂｐのところ（ＰＣＲ増幅範囲の内）にあるもう一つのＮａｅ Ｉ酵素部位が変えられなかった。故に、当酵素でｃｙｐ８１Ａ６−２の野生型及び変異体のＰＣＲ産物に対したＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析（技術プロセスは図５を参照）の結果によると、野生型の農林８号から得るＰＣＲ産物はＴａｋａｒａ純化試薬に純化されてから酵素ＮａｅＩ（Ｔａｋａｒａ）に三本のバンド（２１ｂｐ、５０ｂｐ及び１５１ｂｐ）に切られるが、変異体農林８号ｍから得るＰＣＲ産物はＴａｋａｒａ純化試薬ケースに純化されてから当部位で酵素ＮａｅＩに切られなく、２１ｂｐ及び２００ｂｐの二本のバンド（図５）しか切られる。ＣＹＰ８１Ａ６−１のＰＣＲ−ＲＬＰ分析結果と同様に、変異点に基くＮａｅ Ｉ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーが遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６と共に単離されたものであると当結果が証明したので、ＤＰ２（図１）と命名した。同時に、それらの結果はさらに前述の配列測定結果を証明した。
【００４８】
２．４ 候補遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６のクローン及びその生物学機能の相互補完の検証
候補遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の全遺伝子配列はＴａｋａｒａ社製の酵素ＬＡ Ｔａｑ（商標）及びその試薬ケースを利用して一次性拡充を通じて得たものであり、使用した長い断片のＰＣＲプライマー（フォワードプライマー： ５’−ＣＡＡＡＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡ ＣＴ−３’。リバースプライマー：５’−ＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣ ＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＴＡＧＡＡ−３’、上海生工で合成した）がインディカ米稲の遺伝子グループのデータベース（http://btn.genomics.org.cn/rice）に公布したＤＮＡ配列により、それぞれ当遺伝子の５’端の酵素ＢａｍＨＩの部位の前の１２４ｂｐのところ及びその後の４１４５ｂｐのところで設計して、それに、生粘性末端の発生、クローン及び連結に便利にするように、３’端のプライマーに酵素ＢｓｔＥIIの部位を加えた。この対のプライマーから拡充した４３１１ｂｐの断片は長さがそれぞれ１２４ｂｐのＢａｍＨＩ上流配列、１３２１ｂｐのプロモーター配列、２３２１ｂｐの遺伝子引導区にエクソン及びイントロンの加えられた配列、２７２ｂｐの３’−ＵＴＲ及びその後の遺伝子２８８ｂｐグループ配列（その中、制限酵素（restriction endonuclease）７ｂｐＢｓｔＥＩＩの識別部位及び保護塩基５ｂｐを含む）を含む。拡充の後に得た断片は先ず用バクテリオファージＴ４−ＤＮＡ連結酵素でＴＡプラスミドベクター（Ｔａｋａｒａ）につないで重複のある配列測定（Perkin Elmer AMI 377、上海基康）分析を行った。後に、エクソンの全部誤りのなく拡充されたクローンを選択して、酵素ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＥII（Ｔａｋａｒａ）でそれをＴＡプラスミドのベクターから切ってから、同じ双酵素で切られた遺伝形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１につないだ。次に、正しく断片を挿されたプラスミドを選択して、電子形質転換法でそれをアグロバクテリウムＥＨＡ１０５菌株に導入した。当菌株形質転換遺伝子グループ８０７７Ｓで生物学機能の相互補完検証を行い、得た耐性傷ふさがりが５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン（ＡＢＩ、ＵＳＡ）で３度に選別してから、４．２μΜ／Ｌのベンスルフロンメチル（Bensulfonyluron- methyl,Sigma）選別（図６）を行い、それにより得た双耐傷ふさがりを含５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンの再生培養基に置いて緑苗分化を行い、得た植株がＰＣＲ検証を経て、ベンタゾン（１２５０ｍｇ／ｌ）を塗って鑑定した。結果により、すべての形質転換体がべンタゾンに対する耐性（図７にその中の一株の結果を示す）を回復した。私たちのクローンした遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６がベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子であったとこれらの結果は証明した。
【００４９】
２．５ 遺伝子の構造上の特徴
遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の構造上の特徴は翻訳開始コドンの前にある５３ｂｐの長さ（配列番号１に示す配列の第１８９６〜１９４８ｂｐ）の５’−ＵＴＲ、２２６８ｂｐの長さ（配列番号１示す配列の第１９４９〜４２１６ｂｐ）のコード領域及び終止コドンの後にある２７２ｂｐの長さの（配列番号１示す配列の第４２１７〜４４８８ｂｐ）３’−ＵＴＲを含む。当遺伝子のコード領域は二つのエクソンからなり、真ん中に一つのイントロンを隔てている（図８）。二つのエクソンは長さがそれぞれ９２４ｂｐ（配列番号１に示す配列の１９４９〜２８７２ｂｐ）及び６１８ｂｐ（配列番号１に示す配列の３５９９〜４２１６ｂｐ）であり、イントロンは長さが７２６ｂｐ（配列番号１に示す配列の第２８７３〜３５９８ｂｐ）である。
【００５０】
当該遺伝子はシトクロムＰ４５０タンパク（その配列は配列番号３を参照）をコードし、大多数のＰ４５０タンパクの共有する四つの保存域がある。即ち、Ｃ末端にあるＰｈｅ−ｘ−ｘ−Ｇｌｙ−ｘ−Ａｒｇ−ｘ−Ｃｙｓ−ｘ−Ｇｌｙのヘム結合ドメイン（heme-binding domain）、分子の酸化、活発化に重要な作用のあるヘム結合ドメインの上位の１５０のアミノ酸残基のＡ１ａ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｘ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／ＳｅｒのＩヘリックス（I helix）、ヘム結合ドメインとＩヘリックスとの間にあるＰｒｏ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ−Ｐｈｅ／Ｔｒｐの湾曲（ｍｅａｎｄｅｒ）区及びＮ末端にあるプロリンリッチヒンジ機能域（proline-rich hinge）（Werch- Reichhartら、2000）。実際、ちょうどこれらの保存ドメインの存在により、大多数のシトクロムＰ４５０タンパクの保存の三次元構造を維持することができた。
【００５１】
実施例２： 稲のＷｘ遺伝子のターゲット変異及び遺伝的改良
栽培稲に広く当遺伝子Ｗｘ部位に分布している野生型の等位遺伝子Ｗｘａ及びＷｘｂが二つある。その中、Ｗｘａはインディカ米の稲の特徴であり、ＲＮＡ及びタンパク質レベルでの発現活発性がＷｘｂより１０倍強い。その高量発現は高いアミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）を起こし、蒸したり、煮たりするご飯が硬くて、緊密ではなく、口当たりがおいしくない。Ｗｘｂは主にジャポニカ米の稲にあり、その低量発現がジャポニカ米の稲タイプのミラーゼの含有量を起こし、その米が蒸したり、煮たりされてから柔らかでり、おいしい。研究によれば、Ｗｘａ及びＷｘｂの二つの等位遺伝子の発現の活発性にある差異は主に後者のリーダー区イントロンの５’スプライシング部位にＧ→Ｔの変異がある（程世軍ら、２００１）。当変異はＷｘｂ前体ｍＲＮＡの中のリーダー区イントロンの連結効率の低下を起こし、成熟のｍＲＮＡ及び遺伝子コーディングのアミラーゼの合成酵素（granule-bound starch synthase，ＧＢＳＳ）の量の減少を起こし、最終にアミラーゼの合成量減少に発現する。
【００５２】
Ｗｘ遺伝子リーダー領域イントロンの５’スプライシング部位配列及びＣＹＰ８１Ａ６一塩基欠失変異配列により、それぞれスプライシング部位のＧ塩基に向けて変異できる変異分子（図９ ＲＣＯ１）及びｃｙｐ８１Ａ６−１の一塩基に向けて欠失の部位修復を行う修復子分子（図１０ ＲＣＯ２）を設計した。パーティクルボンバードメント（particle bombardment）でそれをそれぞれ一部分の修復子：三部分の変異子により同時に対の形式で変異体８０７７Ｓに導入して、スルホニルウレア系除草剤で一塩基ｃｙｐ８１Ａ６−１の欠失変異の回復体及び遺伝子Ｗｘの共修飾変異体を選別した。それから、設計した特異プライマーを利用して（フォワードプライマー：５’−ＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣ ＣＴＴＣＡＧ−３’。リバースプライマー： ５’−ＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＴＡＡＣＧＡ−３’）共修飾変異体のターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及びＡｃｃＩ（Ｔａｋａｒａ）酵素切りを行い、成功してＷｘ遺伝子真実変異体を得て、大面積の稲田中間試験及び純系選択育成を経て、新たなＷｘ遺伝子の改良系を得た。
【００５３】
実施例３： 稲ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの未知遺伝子の生物学機能を研究するための二重ＲＣＯｓ分子部位特異的な遺伝子共修飾技術の利用
ジーン・ターゲッティング（ｇene targeting）修飾技術は理論において具体的なターゲット遺伝子部位に向けて精確に行う。既知のＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの遺伝子のコーディングは一類シトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ（monooxygenase）タンパクであるが、稲Ｐ４５０は厖大な遺伝子ファミリーであり、インディカ米稲だけでは４５４のメンバーがある。当遺伝子ファミリーはタンパクのレベルに存在する高度に保存しているヘム結合ドメインモティフ（Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｇ）であり、特にその中のシスティン（ｃｙｓｔｉｎｅ）のコア残基は遺伝子Ｐ４５０の生物学機能の決定に対してきわめて重要であるので、理想的な変異ターゲットとしてもいい。
【００５４】
現有の稲Ｐ４５０のデータベース（http://drnelson.utmen.edu/cytochromep 450.html）から、稲ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの３つのシトクロムＰ４５０酵素のヘムの保存モティフの中のアミノ酸配列がそれぞれＦＧＭＧ ＲＲＲＣＰＧＥＴＬＡ、ＦＧＭＧＲＲＫＣＰＧＥＴＭＡ及びＦＧＭＧＲＲＲＣＰＧＥＭＬＡであると調べている。それらのモティフのヌクレオチド配列の情報及びＣＹＰ８１Ａ６一塩基の欠失変異の情報を利用してそれぞれモティフの中のキー残基システィン（Ｃ）コドンまたはその他の塩基に対して変異できる変異子分子（図１１ ＲＣＯ ３及び図１２ ＲＣＯ ４）及びｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基に向けて欠失部位に対して修復を行う修復分子（図１３ ＲＣＯ ５）を設計した。パーティクルバードメントでそれぞれそれを一部分の修復子：三部分の変異子またはその他の比率により同時に対の形式で農林８号ｍの変異体に導入し、スルホニルウレア系除草剤でｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基の欠失変異の回復体及び推定のＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８の共修飾変異体を選別してから、特異プライマーを利用してそれらの変異体を推定したターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及び配列測定検証を行い、得たＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８の共修飾変異体を野生型と比べて、発現の表型または生物化学型の差異によりそれに関連していた生物学機能を推測した。
【００５５】
上述の実験ステップに、ｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基の欠失部位に対する修復の目的はその他の遺伝子の変異に選別作用を提供することにある。故に、理論から言うと、一つのサルフォニラリアスルフォニル・ターゲット酵素アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）（Okuzaki及びToriyama、２００４）のような遺伝子部位は修飾されてから選別可能の特性があるだけで、修飾ターゲットとしてその目的に用いられる。
【００５６】
実施例４： 外来発現遺伝子の選別作用及びＲＣＯｓ分子の修飾機能を助けを借りた、未知の稲Ｐ４５０遺伝子の生物学機能の検討
抗生物質耐性マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌、動物またはその他の植物からの耐除草剤遺伝子及びＧＵＳ遺伝子などのような外来選択マーカー遺伝子は共導入、整合及び発現の方法を通じてＲＣＯｓ対ターゲット遺伝子の変異に選別作用を提供する。ここにハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を例にして説明する。機能未知のＰ４５０遺伝子に向けてＲＣＯｓ分子（図１４ ＲＣＯ６）を一つ設計して、同時にハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を（ｈｐｈ）プラスミドベクターに構成して形質転換プラスミドｐＨＰＨ（図１５）を得た。次に公知のパーティクルバードメント（Tu et al、1998）を利用してプラスミドｐＨＰＨ及びＲＣＯｓ分子を共に受体の細胞に導入し、ハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子の整合及び発現の発生したハイグロマイシン耐性を利用してＰ４５０遺伝子のＲＣＯ修飾変異体を選別した。次に、特異プライマーを利用して当変異体のターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及び配列測定検証を行い、得た稲Ｐ４５０修飾変異体を野生型のものと比べて、発現していた表型または生物化学型差異によりその関連した生物学機能を推測した。
【００５７】
実施例５： 稲の内在性Ｂｅｌ遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ断片の抑制効果に対する観察
クローンした稲の耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子のコーディング配列により、そのアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列（配列番号１の第１９３９位から第２４３９位までのヌクレオチド配列を参照）を設計して、それをアクチン１のような稲の組成型発現のプロモーターとつなぎで、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターｐＡＡＮＴＩ１（図１６）を構成して、アグロバクテリウムに仲介された（Agrobacterium-mediated transformation）標準の形質転換ステップによりそれをMinghui６３／Ｂｔのような野生型の品系に導入した。続いて、特異プライマーを利用して遺伝子組み換えのＴ０代の植株に対するＰＣＲ分析を行った。その結果により、すべての遺伝子組み換えの植株は対照プラスミドの拡充産物に一致していた断片を発現していて、外来のアンチセンスＲＮＡ断片にMinghui６３受体の遺伝子グループ（図１７）を導入していたと証明した。さらに、ベンタゾンを１２５０ｍｇ／Ｌ利用してそれらの遺伝子組み換えの植株の葉（株ごとに３枚の葉）に塗った。３６時間の後に、それらの処理された葉は枯れて死んだ（図１８）。稲の内在性Ｂｅｌ遺伝子の発現に対するアンチセンスＲＮＡ断片の抑制が有効的であったとその結果は証明した。
【００５８】
実施例６： 化学的に補充した除雄−温度感応性不稔系統の育成
上述の有効的であったと証明されたアンチセンスＲＮＡ断片を稲の下生え及びＯｓｇ６ＢまたはＲＡ３９のような花粉特異発現プロモーターにつないでから、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターｐＯＡＮＴＩ１（図１９）を構成した。次に、アグロバクテリウムに仲介された標準の双遺伝子の共形質転換ステップによりそれをそれぞれ現在に稲の生産に大面積に利用していた光温度感応性不稔系統の低育成６４Ｓに導入して、それを特異性により温度感応性不稔系統の内在性耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子の下生え細胞及び花粉粒の中での発現を抑制させて、大面積の稲田での中間試験及び純系育成を通じて新たな化学的に補充した除雄−温度感応性不稔系統に転換できる。そんな二系不稔系統がハイブリッド種子生産の過程に真夏の異常な低温に遭って育成可能の花粉が出てくる場合、スルホニルウレア系除草剤でそれを死なせて、防雑保純の目的に達させる。
【００５９】
実施例７： 新たな耐除草剤選別マーカーの構成及び応用
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子の配列またはそのコーディング配列を３５Ｓ、Ｕｂｉ−１、アクチン１等及びｎｏｓターミネーター（terminator）などのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、現在常用のハイグロマイシン、カナマイシン耐性遺伝子またはＧＵＳ報告遺伝子などを替えた。当耐性遺伝子をベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に感応性である稲８０７７Ｓ細胞に導入して、得た形質転換陽性傷ふさがりがＢＳＭの含んだ培養基で続いて成長できたが（図６左）、対照グループが当培養基で成長を停止し（図６右）、除草剤での耐性または陽性傷ふさがりの目的に達した。
【００６０】
実施例８： 耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換え植物の育成
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子配列またはそのコーディング配列を３５Ｓ、Ｕｂｉ−１、アクチン１等及びｎｏｓターミネーターなどのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、直接に形質転換及び選別に用いられ、得た分子分析及び表型鑑定検証の行われた遺伝子組み換え植株は大面積の中間試験及び純系育成を経て耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換え系に転換できた。ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子配列を感応性稲の８０７７Ｓに導入して、耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換えの新たな株系（図７左）を得られた。
【００６１】
実施例９： 稲の耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の相同クローン
シトクロムＰ４５０のメンバーに保存の配列が４つあり、触媒作用に重要な作用を発揮したヘム結合ドメイン（heme-binding domain）、膜の結合に重要なＮ−末端疎水領域、タンパク質の正確な組立の担当するグリシン／プロラインリッチ（glycine/proline-rich）領域及びヘムの結合領域の上位にある１５０のアミノ酸のＩへリックス（I helix）（Werch-Reichhart氏ら、２０００）を含む。故に、それらの保存領域でプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣ−３’。リバースプライマー：５’−ＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣ−３’）を設計して、稲以外のイネ科または豆科植物の遺伝子に対する拡充を行い、高度に相同する配列して、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ法により単離して相同配列の両端の配列の全部を得て、高度に相同した遺伝子を分離した。
【００６２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】第３染色体分子マーカー遺伝連鎖図上の本発明の稲ベンタゾン感応性致死遺伝部位ｂｅｌ及びそれと共に分離するＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーＤＰ１及びＤＰ２の位置。
【図２】農林８号ｍ及び８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死位点の等位性テスト。 ａ： ベンタゾンで処理前の植株。左：農林８号ｍ、右：８０７７Ｓ、中：農林８号ｍと８０７７ＳとのＦ１ハイブリッド。ｂ： ベンタゾンで処理後一週間の植株。処理用のベンタゾンの濃度が１２５０ｍｇ／ｌである。
【図３】８０７７Ｓにあるｃｙｐ８１Ａ６−１一塩基の欠失変異部位を検証するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析のフローチャート。変異部位、ＰＣＲプライマーの配列、プライマー設計を利用して人工で導入する、変異部位の含むＢｇｌＩの酵素切断部位（Restriction Enzyme cutting site）、及びＢｇｌＩでＰＣＲ産物に対する切断の断片の長さの差異の詳細は図の中の注の通りである。
【図４】マッピング集団のＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーの分析結果。 Ｍ：１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｔａｋａｒａ）、 １−５： Ｆ２マッピング集団（劣性感応性致死ホモ接合体）の５つのＤＮＡ混合サンプル（４６株／サンプル）、 ６： ９３−１１、 ７： 低育成６４ｍ。
【図５】農林８号ｍにあるｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基の欠失変異部位を検証するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析のフローチャート。変異部位、ＰＣＲプライマーの配列、ｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基欠失変異部位に対応する野生型のＣＹＰ８１Ａ６コード配列にもとに存在していたＮａｅＩ酵素切断部位及びＮａｅＩでＰＣＲ産物に対する酵素切断の断片の長さの差異の詳細は図の中の注を参照すること。
【図６】８０７７Ｓを受体とするＣＹＰ８１Ａ６の形質転換して傷がふさがるベンスルフロンメチルの選別結果。 左：遺伝子組み換えの傷がふさがる、右： ８０７７Ｓ対照の傷がふさがる。
【図７】８０７７Ｓ受体とするＣＹＰ８１Ａ６遺伝子組み換えの苗のベンタゾン耐性の鑑定結果。左：８０７７Ｓ対照、中：遺伝子組み換えの苗、右： Ｗ６１５４Ｓ対照。
【図８】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の構造。 黒色の長方形：遺伝子の発現区域（expressed region）を表す、灰色の長方形：遺伝子の５’端及び３’端の非コード領域を表す、真中の実線：遺伝子の内部区域（Intervening region）を表す。それらの長さはそれぞれ図の上部に表示されている。図の下部に表示されているのは開始コドンのＡＴＧ、終止コドンのＴＧＡ及び編集点配列ＧＴ及びＡＧである。
【図９】遺伝子Ｗａｘａ のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ１。
【図１０】遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６−１のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ２。
【図１１】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ６、ＣＹＰ８１Ａ７、ＣＹＰ８１Ａ８のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ３．
【図１２】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ８のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ４。
【図１３】遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６−２のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ５。
【図１４】機能未知の稲Ｐ４５０（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｂ１１４７Ａ０４）遺伝子のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ６。
【図１５】ヒグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を運ぶｐＨＰＨプラスミド地図。
【図１６】プロモーター・アクチンＩに駆動されるＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子ｐＡＡＮＴＩ１プラスミド地図。
【図１７】Minghui６３回復系統を起源とするＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子形質転換植株のＰＣＲ鑑定結果。 Ｍ： ＤＬ２０００（Ｔａｋａｒａ）分子量マーカー。 １−２：遺伝子組み替え植株。 ３：野生型の対照植株； ４：プラスミド対照。
【図１８】Minghui６３回復系統を起源とするＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子形質転換植株のベンタゾン耐性の試験結果。 左：ベンタゾン感応性変異体のマイナス対照。中：アンチセンスＲＮＡ形質転換植株。右：Minghui６３野生型のプラス対照。ベンタゾン処理濃度：１２５０ｍｇ／Ｌ。
【図１９】組織特異型のプロモーターＯｓｇ６Ｂに駆動されるＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子ｐＯＡＮＴＩ１プラスミド地図。
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、遺伝子工学の技術分野に属するものである。より詳しくは、本発明は、稲の中のベンタゾン（Bentazon）及びスルホニルウレア系（sulfonylurea）除草剤に耐性のある遺伝子の正確なマッピング、単離、及びクローニングに関する。さらに本発明は、前記の除草剤耐性遺伝子の助けを借りて他の重要な農学上の性質に関する遺伝子に対して部位特異的突然変異を行って、稲などの作物の重要な農学上の性質に対する改良、ハイブリッド種子を作る場合の自家交配混雑の回避及び部位（座位）特異的な遺伝子の操作などへの応用にも関する。
【０００２】
背景技術
稲の雑種強勢を利用して、中国はハイブリット・イネの研究に成功して、稲の生産高を大幅に高めさせている。中国のは核細胞質相互作用雄性不稔（Nuclear Male Sterile）の三系法（Three-line-method）に基づく雑種強勢の利用の成功に続いて、大規模な二系法（Two-line-method）ハイブリット・イネの研究、開発及び普及を進めている。二系法の稲のハイブリッド種子は、光・温度感応性雄性不稔系統の育種（Breeding of PTGMS-Line）により生産されるものであるが、光・温度感応性雄性不稔系統の稔性は、環境温度の影響を受け易く、夏の異常低温が光・温度感応性雄性不稔系統の稔性を回復させることがある。これにより、二系法でハイブリッド種子の生産が低温に遭うと、収穫する種子が真のハイブリッド種子に偽のハイブリッド種子（即ち不稔系統の自家交配で実る種）が混じるという潜在的なリスクが存在している。一旦、このような母本の自家交配の混雑がおこると、これを有効に除去できなければ、種子生産または大面積での生産に重大な損失が引き起こされる。広西では１９８９年、湖南では１９９９年に、すべてこのような原因により大きな損失に見舞われた。
【０００３】
資料によれば、稲のハイブリッド種の純度が１パーセント下がるごとに、大面積での生産ではヘクタールごとに生産高が７５ｋｇ減少する。このため、「稲のハイブリッド種子の純度を９８％以上に達すること」との、中国農業部による種子規格が規定されている。光・温度感応性雄性不稔系統の種子生産で生産される二系法稲のハイブリッド種子に混雑の問題が存在しているだけでなく、修飾遺伝子が関与する核の主要遺伝子による不稔、薬剤及び施薬条件に影響される人工化学品による除雄不稔、核内の温度感応性遺伝子に影響される核細胞質相互作用雄性不稔、及び人工培養の非整倍体雄性不稔などの不完全雄性不稔系統で種子を培養する場合も、すべて、生産されるハイブリッド種子に母本自家交配の種子が混雑することがある。その自家交配混雑を排除して、作物の雑種強勢の利用の普及によってより信頼できる基礎を確立するために、様々な試みがなされてきた。耐除草剤の特性が現代作物の育種に広く応用されている現状に鑑み、野生型の稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性のある特徴を利用して、上記のハイブリッド稲の育種の過程にある種の混雑の問題を解決するように努力している研究者も少なくない。
【０００４】
野生型の稲に適用されている選択性の除草剤は主に二種類ある。一つはベンタゾンのような、ベンゾチアジアゾール（benzothiadiazole）類の除草剤である。これは、有効成分が作物の根、葉を通じて吸収され、豆科以外の大多数の双子葉植物及びカヤツリグサ科の雑草に対する除去作用がある一方で、イネ科植物に無害である。ベンタゾンの除草原理は植物の光合成の中のヒル反応（Hill reaction）に対する抑制である。これまでのところ、植物からベンタゾンのような除草剤に耐性のある内在性遺伝子はまだクローニングされていない。もう一つは、ＤｕＰｏｎｔ社により開発された、スルホニルウレア系除草剤類であり、選択性が高く、適用範囲の広く、毒性が低く、内部吸収型であるという特徴のある、新しいカテゴリーの超高効果除草剤である。この内、ベンスルフロンメチル（bensulfuron-methyl）、トリベヌロンメチル（Tribenuron-methyl）及びその複合剤型は、中国の稲田の除草に最も広く応用されている除草剤である。スルホニルウレア系除草剤は最大の特徴が高い活性にあり、普通の場合、使用剤量が５〜１００ｇ／ヘクタールである。スルホニルウレア系除草剤はアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）抑制剤であり、多くの一年生または多年生の雑草、特に広葉の雑草に特効を持っていて、稲、小麦、大豆、トウモロコシ、アブラナ（耐エタメツルフロンメチル）、平らな草地及びその他の非耕地の雑草に広く用いられている。ＤｕＰｏｎｔ社は複数のスルホニルウレアに耐性のある遺伝子を開発した。一つはタバコ耐性変異体からクローニングされた耐スルホニルウレア遺伝子ＳＵＲＢ−Ｈｒａである。当遺伝子はタバコＡＬＳ遺伝子の変異に基いて形成する耐性であり、すでに綿花、大豆など多種の作物に応用されている（ＵＳ５０１３６５９，ＵＳ５０８４０８６，ＵＳ５１４１８７０，ＵＳ５３７８８２４，ＵＳ５６０５０１１）。他のの耐スルホニルウレア遺伝子は土壌細菌からの遺伝子Ｐ４５０ ｓｕ１であり、スルホニルウレアの代謝を速めて無毒にしてその耐性を実現させるものである。ＤｕＰｏｎｔ社は遺伝子Ｐ４５０及びその応用について深く研究した。関連の情報はＵＳ５３４９１２７などを参照のこと。日本の日産化学株式会社は特許出願ＷＯ９７０８３２７において、双子葉の広葉植物のホウキギ（Kochia scoparia）のｃＤＮＡから単離されて、形質転換された植物の株をスルホニルウレアに耐えさせる機能を持っているアセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）の遺伝子を公開した。
【０００５】
現在、除草剤耐性の作物の開発方法は主に二種類ある。一つは伝統的な物理化学的な突然変異生成を通じて、耐除草剤の作物の変異体を得る方法であり、もう一つはＤＮＡ組換え技術により耐除草剤の遺伝子を現有の種に導入して、耐除草剤の新しい素材を創造する方法である。この内、後者は最も広く応用されているものである。現在、作物の除草剤耐性を高めるために、組換えＤＮＡ技術を用いる二種類の方策がある。一つは除草剤の作用を修飾するターゲットタンパク（herbicide target protein）を導入して、除草剤に対して耐性にさせ、または、植物が除草剤を吸収してから正常に代謝できるように、それを過量発現させるものである。もう一つは新たな酵素または酵素システムを導入して、除草剤が働く前にそれを分解したり、解毒したりするものである。例えば、遺伝子Ｐ４５０など（Wang Guanlin & Fang Hongjun、１９９８）である。
【０００６】
野生型稲は天然的にベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性を持っている。日本の学者のＭｏｒｉ氏及び湖北省農業科学院張集文氏などは相次ぎ、ガンマ線照射技術により、稲のベンタゾン感応性致死変異体である、農林８号Ｍ（Mori，１９８４）及び８０７７Ｓ（張集文氏、武暁智氏、１９９９）を得た。張集文氏らはさらに、ベンタゾン除草剤に対して感応性である隠性遺伝子の部位（site）で母本不稔系統を表示する除雑保純技術システム（張集文氏ら、２００１）も開発した。ハイブリッド稲特に二系ハイブリッド稲の種の純度安全の保障体系の中のこんな種質資源の重要な応用により、８０７７Ｓの携帯している変異部位で表示する二系不稔系統を利用すると、最大の限度で二系ハイブリッド稲の種子生産のリスクを下げ、ハイブリッド種子の純度を保証できるので、育種の専門家及び種子企業に高度に重視されている。但し、その除雑保純技術システムは種子生産の後に除雑を行うものであるから、効果がいいであっても、販売の前に、その純度の低い種が国家の規定する種子の純度の規格と衝突するので、種子の管理機関に承認され難い。したがって、新たな除雑保純技術システムが必要となる。但し、多年以来、当性質の制御遺伝子がずっと正確にマッピングまたは単離クローンを行われていないので、当性質に対する遺伝操作及びさらにの利用ができない。これはこの分野の大きな技術障害となった。
【０００７】
上述の状況に鑑み、本発明者らは研究を通じて、稲の現有の二つのベンタゾン感応性致死変異体を材料にして、その変異の遺伝子部位に対する精細なマッピングを行って、それにその野生型同部位の遺伝子をクローニングした。同時に、それに基いて有用の方法及び技術を開発した。例えば、植物化学での補充殺雄の温度感応性の不稔系統の創造方法、遺伝子グループの二部位または多（複数）部位の部位特異的な遺伝子の共修飾による遺伝子操作技術、植物遺伝子の生物学機能の新たな調査方法及び植物の性質改良の新たな方法。それにより、ハイブリッド稲の育種の過程にある除雑保純の問題を解決しただけでなく、遺伝子の生物学機能の研究及び生物性質の改良に極めて応用前途を持っている実用的な方法を提供している。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は目的が下記の通りである：
− 単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子（以下「遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６」と称する）、その機能保存変体、機能の同等な生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− 上述の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える内在性遺伝子のｃＤＮＡ配列、その機能保存変体、機能の同等の生物活性の断片または誘導体を提供すること。
− ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子を提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物を含む組換えベクターを提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドを提供すること。
− 遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子または両方を含む機能同等物または遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６または両方を含む機能同等物によりコードされたポリペプチドの遺伝子工学的な細胞を提供すること。
− ハイブリッド稲のハイブリッド種子生産の時にある自家交配混雑の防止方法を提供すること。
− 新たな部位特異的な遺伝子操作方法を提供すること。
− 植物の性質の改良する新たな方法を提供すること。
【発明の具体的説明】
【０００９】
本発明の上述の目的および特徴は下記の具体的な説明により明らかにされるであろう。
【００１０】
本発明者らはまず、変異体８０７７Ｓ及び農林８号ｍにあるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性遺伝子に対する精細なマッピングを行い、それに野生型の栽培稲からベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６及び当遺伝子に対する調整及び制御を行うプロモーターのＤＮＡ断片を単離して、当遺伝子で大豆以外の大多数の双子葉植物及びカヤツリグサ科雑草植物のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える特性を改良できる。
【００１１】
本発明により提供されるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子は、下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【００１２】
前記の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性の内在性遺伝子は好ましくは配列番号１に示すヌクレオチド配列であり、前記の単離された稲のベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性の内在性遺伝子のｃＤＮＡは好ましくは、配列番号２に示すヌクレオチド配列である。
【００１３】
本発明により提供されるベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりコードされてなるポリペプチドは、下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列のポリペプチドを含んでなる：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【００１４】
この内、好ましい具体例は配列番号３に示すアミノ酸配列である。
【００１５】
本発明は、生細胞内において遺伝子グループの二つまたは複数の部位におけるターゲット配列に対して、同時に部位特異的な共修飾を行う遺伝操作方法であって、
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド分子（ＲＣＯｓ）を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型（選別可能の表型）を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うこと
を特徴とする方法を提供する。
【００１６】
上述の遺伝操作方法の中に、選別マーカーにするヌクレオチド配列は変異または未変異の耐性（感応性）除草剤の遺伝子、耐抗生物質の遺伝子、生物または化学の発光遺伝子及び酵素遺伝子などを含むがそれに限られず、当業者は公知の知識により自由に選択してもいい。その中、除草剤耐性／感応性遺伝子、特に配列番号１または配列番号２のあるヌクレオチド配列またはその機能と同等の断片または誘導体、配列番号１に示すヌクレオチド配列の中の第２４５５位塩基Ｃまたは第４００６位塩基Ｇの欠けているヌクレオチド配列、配列番号２に示すヌクレオチド配列の中の第５６０位の塩基Ｃまたは第１３８５位塩基Ｇの欠けているヌクレオチド配列を優先して選ぶ。
【００１７】
現在の研究によれば、単離及びクローニングの行われた耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子はシトクロムＰ４５０タンパクをコードしており、これは国際標準分類及び命名システムで正式に「ＣＹＰ８１Ａ６」（http:// drnelson. utmen.edu/cytochromep450. html）と名称を付けられいる。このタンパク質は、一般のタンパクＰ４５０の保存領域を含み、そのアミノ酸配列は配列番号３の通りである。現在、タバコのＣＹＰ７１Ａ１１及びＣＹＰ８１Ｂ２（Yamadaら、２０００）、大豆のＣＹＰ７１Ａ１０（Siminszky氏ら、１９９９）、高粱のＣＹＰ７３Ａ１（Pierrel氏ら、１９９４）及びＣＹＰ７６Ｂ１（Didierjean氏ら、２００２）及びhlaspi arvensae のＣＹＰ７１Ｂ１（Lamb氏ら、１９９８）のように、種々の除草剤耐性遺伝子Ｐ４５０が植物からクローニングされているが、それらの遺伝子Ｐ４５０と遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６との間の同一性はすべて４０％未満であり、それにベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤を分解できない。これらの結果から、遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６は新たな耐除草剤の遺伝子Ｐ４５０である。したがって、本発明はこの遺伝子と遺伝子自身のプロモーターまたは他の組成型または特異プロモーターとの連接を利用して、豆科以外の大多数の広葉植物またはカヤツリグサ科の雑草に導入して、新たな耐除草剤の植物系統を開発することに関連する。
【００１８】
本発明に示すＤＮＡ断片の発現は構成的発現であるので、当遺伝子のアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉと葯組織の特異発現のＯｓｇ６Ｂ及びＲＡ３９などのような特異発現プロモーターとの連結を利用して、稲などの温度感応性の不稔系統に導入して、当遺伝子をその葯で発現できないようにして、スルホニルウレア系除草剤を利用して花粉を殺し、新たな化学的に補充し除雄した温度感応性雄性不稔系統を作製する。
【００１９】
他に、本発明で鑑定されているベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して感応性する二つのＣＹＰ８１Ａ６一塩基の変異部位の欠失が遺伝子の部位特異的突然変異に利用できる修飾ターゲットを提供している。故に、ＲＣＯｓ分子の部位特異的修復の変異体の中の遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６を利用して、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対して耐性を修復体に与えて、選別の目的に適合する。この変異遺伝子の助けを借りて、異なるターゲットに向けるＲＣＯｓ分子に対する設計及び導入を二種またはそれ以上に行ってもいい。その中、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に対するその耐性を回復して選別のマーカーとするように、一種の分子は遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６の単ヌクレオチドの欠失変異の部位特異的修復に用いられ、農学上の性質の改良された所望の新たな品種もしくは系統を得るように、もう一種または多種の分子は内在性遺伝子に対する部位特異的突然変異に用いられて、次に、変異体と野生型との間に表示している表型または生理生化型の差異により、その確実な生物学機能を推定し、または目的遺伝子の変異体に対する純系の選育を行う。外に、その他の遺伝子の部位の選択可能性の修飾表型または共に外来選択可能性の遺伝子に対する導入を通じてターゲット遺伝子の変異体に対する関連性選択を行ってもいい。
【００２０】
さらに、この技術またはその他のＤＮＡ相同組換え技術または物理化学的突然変異生成技術を利用して遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６に対する部位特異的またはランダムの変異を行って、この遺伝子の機能を変えて、除雑保純に用いられる新たなベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の感応性変異体を作製してもいい。外に、クローンされる野生型の同等の遺伝子は遺伝形質転換を行われてから豆科以外の大多数の広葉植物またはカヤツリグサ科の雑草にベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える特性を与えられる。
【００２１】
ＣＹＰ８１Ａ６のコード配列は異なる種の植物に広く保存しているので、稲の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６及びその誘導配列の約８つまたはもっと多くのヌクレオチドのプライマー及びプローブをイネ科の中の他の属種の相同遺伝子の単離及びクローンに利用する。上述の方法で稲のＣＹＰ８１Ａ６と高度に相同する遺伝子をクローンできる。この配列を適するベクターにつないで、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に感応性である植物細胞を導入して、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に耐える遺伝子組み換え植物を創造する。
【００２２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される下記用語の意義は当業者のよく知られており、常用されているのものである。ここにその中の一部の用語について例をあげて簡明に説明する。
【００２３】
本明細書において「ヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチド並びにその断片または部分のことであり、ゲノムであってもまたは合成のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖でも二本鎖であってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表してもよい。
【００２４】
「機能同等の断片」、「機能同等の生物活性断片」とは単離されたＤＮＡの断片の一部または亜配列である。その中、これらの断片または亜配列が活性タンパク質にコードを付けているか付けていないかにかかわらず、すべて遺伝子の発現を変えたり、一定の耐除草剤を生じたりする能力を保留している。例として、上述の断片はキメラ遺伝子の設計またはアンチセンス抑制などに用いられる。「機能同等の誘導体」、「機能保存変体」とは単離されたＤＮＡの断片の配列の全部、または一部である。この内、これらの断片が活性タンパク質にコードを付けているか付けていないかにかかわらず、すべて遺伝子の発現を変えたり、一定の耐除草剤を生じたりする能力を保留していて、それにキメラ遺伝子の設計またはアンチセンス抑制などに用いられる。
【００２５】
「変体」とは、一つまたは複数のアミノ酸残基または核酸塩基の変更のあるアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列をいう。ここで言う「変更」とは、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列中のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の欠失、挿入または置換などを含む。本発明でいう「変体」は保存的変更を有しており、変更されたアミノ酸は元のアミノ酸と構造上もしくは化学的性質上類似している。このポリヌクレオチドの変体は天然発生または非天然発生の変体であってもいい。これらのヌクレオチド変体は、置換体、欠失体、及び挿入体を含む。当該技術分野において知られているように、等位変体はポリヌクレオチドの取替形式であり、一つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失及び挿入であることがあるが、実質にそのコードされたポリペプチドの機能を変えることがない。
【００２６】
「アミノ酸配列」とはオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列及びその断片または一部のことである。本発明に関連する「ポリペプチド」または「タンパク質」はいわゆるポリペプチドまたはタンパク質分子の完全な天然アミノ酸配列に限らない。
【００２７】
「相同性」とは、二種または多種のアミノ酸またはヌクレオチド配列の比べの中に配列の同じまたは類似のパーセントのことであり、相同性方法の測定に用いられ、例として、プログラムＭＥＧＡＬＩＧＮ（Lasergene software package,DNASTAR, Inc.,Madison Wis.）を採用することにより測定することができる。プログラムＭＥＧＡＬＩＧＮはＣｌｕｓｔｅｒ法（Higgins, D.G. 及びP.M.Sharp (1988)Gene 73:237-244）などの異なる方法により二またはそれ以上の配列間を比べてもいいし、Ｃｌｕｓｔｅｒ法及びＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎのような当該技術分野において公知の方法により核酸配列の間の相同性（Hein J., (1990) Methods in emzumology 183:625-645）を測定してもよい。
【００２８】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）低いイオン強度及び高い温度に行うハイブリッド及び洗浄のことであり、例として、０．２×ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ，６０℃、または、（２）ハイブリッドの場合に変性剤を加えることであり、例として、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ， ４２℃など、または、（３）二つの配列の間の相同性が少なくとも９５％以上にあり、最適化選択９７％以上の場合しかハイブリッドを実施しなく、それに、ハイブリッド実施可能のポリヌクレオチドのコーディングのポリペプチドと配列番号１に示すヌクレオチドのコーディングのポリペプチドとが同じ生物学機能を持っている。
【００２９】
「ベクター」とは、当該技術分野においてよく知られている細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母プラスミド及び植物細胞ウイルスなどのことである。本発明に適用するベクターはアグロバクテリウムベクター、大腸菌プラスミドベクター及びウイルスベクターなどを含む。まとめて言うと、宿主の体内に複製及び安定な遺伝を実施さえすれば、いかなるプラスミド及びベクターも本発明の組換え発現ベクターを構成できる。
【００３０】
「宿主細胞」とは、本発明のヌクレオチド配列を導入でき、または本発明のヌクレオチド配列の組換えベクターを含む、遺伝子工学的宿主細胞のことをいい、例えば、十字花科植物（musttard）、ナス科植物(solanaceae)、カヤツリグサ科植物(cyperaceae)、旋花科植物(convolvulaceae)、アオイ科植物(malvaceae)、及び亜麻科植物(linaceae)の細胞などが挙げられる。
【００３１】
「スルホニルウレア系除草剤」は、効果が非常に高く、適用範囲が広く、毒性が低く、選択性の高い除草剤のカテゴリーであり、生物活性が伝統的な除草剤の１００〜１０００倍を超え、植物の根、茎及び葉に吸収され、アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）に作用して、バリン及びイソロイシンの生物合成を抑制して、タンパク質の合成障害を起こして、感応性植物の成長部の成長を抑制する。本発明の中の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６は耐えるのが表１に示すスルホニルウレア系除草剤を含むが、それに限らない。
【００３２】
さらに、本発明の核酸配列または本発明の核酸配列の組換えベクターを含む形質転換宿主細胞は、当業者によく知られている日常的な技術で行ってもいい。宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＣａＣｌ２法、電気穿孔法などを利用してもいい。宿主が真核細胞である場合、アグロバクテリウム法、粒子衝撃法、ＤＮＡ転染法、リン酸カルシウム共沈殿法、顕微注射法またはリポソーム包接法などを使用してもいい。
【００３３】
【表１】
【００３４】
配列番号１： ＣＹＰ８１Ａ６コード遺伝子及びＣＹＰ８１Ａ６のプロモーターを含む。
配列番号２： ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列。
配列番号３： ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子によりコードされたアミノ酸配列。
【００３５】
次に、具体的な実施例に結び合わせて、本発明について詳細に説明する。当業者が知っているように、これらの実施例は本発明を限定するものではない。通常、下記の実施例において条件及び試験方法について説明されていないものは、Sambrookらの「分子クローン実験ガイド」（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に記載されている条件のような公知の手法及びメーカーの説明書により操作される。
【実施例】
【００３６】
実施例１： ターゲット遺伝子の精細なマッピング及びクローニング
１． 稲品種８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死遺伝子ｂｅｌの精細なマッピング
１．１ マッピング集団
本実験に使用されるマッピング集団は、Ｆ２劣性単株からなる。構成する場合、先ず、遺伝子ｂｅｌ部位を含む低く育成されている６４Ｓ戻し交配転育系統（「低育成６４ｍ」と略す）（野生型の低育成６４Ｓは湖南国家ハイブリッド稲研究及び開発センターより提供）と野生型の９３−１１回復系統（江蘇里下河地区農科所より提供）とのハイブリッドによりＦ１を得て、次にＦ１の自家交配によりＦ２を計１０００株得た。種子を播いてから、苗が３〜４枚の葉まで成長した場合、張集文及び武暁智氏（１９９９）のベンタゾンの薬塗りの鑑定方法により、濃度１２５０ｍｇ／Ｌのベンタゾン（江蘇剣ブランド農薬化工有限公司製の２５％ベンタゾン水剤）でこのＦ２群のすべての単株に対して葉を一々に切って（葉先から１ｃｍぐらい切る）、株ごとに３枚の葉に薬を塗った。その後、葉を処理する時のベンタゾン感応性反応により、劣性感応性致死ホモ接合体を２３１株本実験のマッピング集団に確定した。
【００３７】
１．２ ＤＮＡの抽出
ＭｃＣｏｕｃｈ氏ら（１９８８）のＣＴＡＢ法を応用して、二つの親本９３−１１、低く育成６４ｍ及び２３１の感応性致死個体からそれぞれ葉総ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出用試薬は全部上海生工生物工学技術サービス有限公司（以下「上海生工」と略す）から購入した。
【００３８】
１．３ ＳＳＲ分析及び遺伝子ｂｅｌの精細なマッピング
ＳＳＲ増幅反応の体系は下記の通りである。５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１×ＰＣＲ反応緩衝液、１．８７ｍＭ Ｍｇ２＋、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、酵素１．０ｕ ｒＴａｑ ［宝生物工学（大連）有限公司、即ちTakara Biotech、以下「Ｔａｋａｒａ」と略す］及びフォワードおよびリバース プライマー 各０．２μＭ。反応の総体積：２０μｌ。反応の条件： ９５℃ ３分間、次に３５の循環（９４℃、１分間、６０℃、１分間、７２℃）を行い、７２℃に５分間、最後に、１０℃に保存した。３．５％のゲロース糖脂質（上海生工）でＰＣＲ産物を単離し、ＥＢ（上海生工）で染色を実施し、ＵＶＰ作像方式（ドイツ）で観察して写真を取った。
【００３９】
本発明者らは、先の研究にＳＳＲマーカーで８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死遺伝子を初めに稲の第三染色体の長いアームに位置を決めて、ＳＳＲ分子のマーカーＲＭ１６８との遺伝距離が７．１ｃＭ（Ｚｈａｎｇら、２００２）であった。さらに遺伝子ｂｅｌに対する精細なマッピングを行うために、本発明はＳＳＲプライマーサーチソフトウェアのＳＳＲＨｕｎｔｅｒ １．３の助けを借りてＲＭ１６８から染色体の長いアームの末端までの間のゲノム配列（http://btn.genomics.org.cn/rice）を分析して、ＳＳＲマーカーを設計して合成した。例として、７ａ（フォワードプライマー：５’−ＧＴＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＡＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧ−３’）、３ａ（フォワードプライマー：５’−ＴＧＴ ＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＧＴＧＴＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣ ＧＴＡＴＴＣ−３’）及び８ａ（フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＴ−３’；リバースプライマー：５’−ＣＴＴＧＴＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＴＧＡＣＧ−３’）など（プライマー配列はすべて上海生工で合成した）。その中、３ａ及び７ａが同一のＢＡＣクローンＡＣ０８４２８２にあった。８ａで劣性致死グループから検出した四つの単交換の発生した組換え単株を表示し、７ａマーカーは感応性致死グループから他の異なる単交換組換え単株を四つ検出した。ベンタゾン感応性致死遺伝子がこの二つのマーカーの間に位置しているとこの結果がさらに証明している。さらに、８ａに近い分子マーカー３ａで遺伝子ｂｅｌに対する精細なマッピングを行った結果、出てきた単交換組換え単種が一つしかなかったので、ベンタゾン感応性致死遺伝子の位置を３ａと７ａとの間に決めた。ＭＡＰＭＡＲＫＥＲ３．０でｂｅｌ遺伝子部位の精細なマッピング地図（図１）を作成した。その中、分子マーカー３ａ及び７ａが遺伝子ｂｅｌからの遺伝距離がそれぞれ０．１ｃＭ及び０．４ｃＭであった。
【００４０】
２． 候補遺伝子の確定及びその単離、クローン
２．１ 候補遺伝子の確定及び順序測定、分析
配列の分析によると、分子マーカー３ａと７ａとの間に推測の遺伝子（putative genes）が１８あり、その中、連続して排列しているシトクロム遺伝子Ｐ４５０を４つ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号がそれぞれＡＡＫ６３９４０．１，ＡＡＫ６３９２０．１，ＡＡＫ６３９２２．１及びＡＡＫ６３９２５．１である）含み、国際標準分類及び命名システムに正式にＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ６、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８と命名された（http://drnelson.utmen. edu/cytochromep450.html）。これまでの研究により、稲の微粒体の中の遺伝子Ｐ４５０がベンタゾンの解毒作用（Ｈａａｃｋら、１９９４）に関与した。それに、Ｄｅｎｇ及びＨａｔｚｉｏｓ（２００３）らは稲の苗から分子量約６０ｋＤａまで純化されたＰ４５０タンパクを単離し、除草剤ベンスルフロンメチル（bensulfuron-methyl）の分解代謝の過程に非常に重要な役割があることを確認した。故に、ベンタゾンの感応性致死基因が遺伝子Ｐ４５０に関連する可能があると考えて、その四つの遺伝子Ｐ４５０のクラスターを候補遺伝子と確定した。
【００４１】
より正確に候補遺伝子を確定するために、私たちは四つの遺伝子Ｐ４５０のゲノム配列によりそれぞれ特異プライマー（表２）を合成し、ハイファイのｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）重合酵素（Ｔａｋａｒａ）を利用して野生型の稲Ｗ６１５４Ｓ及び変異体８０７７Ｓからそれぞれ候補遺伝子を拡張して、それに直接に配列を測定した（Perkin Elmer AMI 377、上海基康生物技術有限公司、以下「上海基康」と略す）。配列測定の結果に関する分析により、野生型の稲Ｗ６１５４Ｓ及び変異体８０７７ＳからのＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの間にいかなる差異もなく、源泉変異体８０７７Ｓのｃｙｐ８１Ａ６が野生型のＷ６１５４Ｓの中のＣＹＰ８１Ａ６より一つのＧ（配列番号１に示す配列の第４００６塩基）を欠けている。故に、ＣＹＰ８１Ａ６を唯一の候補遺伝子に確定した。
【００４２】
上記の４つの遺伝子に対するＰＣＲ増幅及び配列測定に使われたプライマー（配列は上海生工で合成した）は下記の通りであった： ＣＹＰ８１Ａ５：Ｐ１−１ａ及びＰ１−１ｂ，Ｐ１−２ａ及びＰ１−２ｂ，Ｐ１−３ａ及びＰ１−３ｂ；ＣＹＰ８１Ａ６：Ｐ２−１ａ及びＰ２−１ｂ，Ｐ２−２ａ及びＰ２−２ｂ，Ｐ２−３ａ及びＰ２−３ｂ，Ｐ２−４ａ及びＰ２−４ｂ，Ｐ２−５ａ及びＰ２−５ｂ，Ｐ２−６ａ及びＰ２−６ｂ；ＣＹＰ８１Ａ７：Ｐ３−１ａ及びＰ３−１ｂ，Ｐ３−２ａ及びＰ３−２ｂ，Ｐ３−３ａ及びＰ３−３ｂ；ＣＹＰ８１Ａ８：Ｐ４−１ａ及びＰ４−１ｂ，Ｐ４−２ａ及びＰ４−２ｂ，Ｐ４−３ａ及びＰ４−３ｂ。各プライマーの配列は表２の通りである。
【００４３】
２．２ ジャポニカ米の稲及びインディカ米の稲の中のベンタゾン感応性致死遺伝子の等位性テスト
早くも１９８４年の時に、日本の学者のＭｏｒｉはガンマ線照射誘導技術で農林８号を誘導してベンタゾンに感応性である致死変異体の農林８号ｍ（Ｍｏｒｉ，１９８４）を得た。古典的な遺伝学の分析によると、この性質は一対の劣性遺伝子に制御されている。８０７７Ｓと農林８号ｍの中のベンタゾン感応性致死遺伝子と等位であるかどうかを検証するように、私たちは８０７７Ｓと農林８号ｍとのハイブリッドにより、Ｆ１ハイブリッド及び一つの８００株のＦ２グループを得た。種をまいてから、苗が生９〜１０枚の葉まで出てから、１２５０ｍｇ／Ｌ濃度のベンタゾンを８０７７Ｓ、農林８号ｍ及びそれらのＦ１植株に散布した。一週間の後に、すべての植株が枯れて死亡した（図２）。これにより、二つの変異体の中のベンタゾン感応性致死遺伝子の間の相互の等位が証明された。同時に、８００つのＦ２植株のグループに薬を散布した。その結果、処理されたすべての植株も枯れて死んだ。これはより一歩に二つの変異体の中のべンタゾン感応性致死遺伝子が一対の等位遺伝子であったことを証明した。区別するために、８０７７Ｓ及び農林８号ｍからのｃｙｐ８１Ａ６をそれぞれｃｙｐ８１Ａ６−１及びｃｙｐ８１Ａ６−２と命名した。
【００４４】
遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の特異プライマー（表２）を利用して、ハイファイ重合酵素ｐｙｒｏｂｅｓｔ（商標）で野生型稲の農林８号及び変異体の農林８号ｍからそれぞれＣＹＰ８１Ａ６及びｃｙｐ８１Ａ６−２を拡充して、それに直接に配列（Perkin Elmer AMI 377、上海基康）を測定した。その結果によると、変異体農林８号ｍからのｃｙｐ８１Ａ６−２は野生型の農林８号の中のＣＹＰ８１Ａ６より、配列番号１に示す配列の第２４５５ｂｐの部に一つのＣを欠失している。それにより、等位分析の結果がさらに証明された。
【００４５】
【表２】
【００４６】
２．３ ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析
配列測定にある可能の誤差を防止するように、私たちはさらにＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析法を利用して二つの変異体の中のｃｙｐ８１Ａ６−１及びｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基の変異部位に対する検査及び検証を行った。実験に、先ず分析ソフトウェアＷＥＢＣＵＴＴＥＲ ２．０を利用してｃｙｐ８１Ａ６−１変異部位を含む一つの断片の野生型及び変異型配列に対する対比分析を行い、その変異の前後に変えられたまたは新たに生じた制限酵素の部位（Restriction Enzyme cutting site）を観察した結果、そんな部位を見つけなかった。故に、私たちはプライマー設計を通じてｃｙｐ８１Ａ６−１変異部位の上位置の付近の二つの異なる塩基Ｇ及びＡを二つのＣに変え、当プライマーを利用して拡充した当変位点を含んだ一断片のＤＮＡ配列を人工により新たなＢｇｌ Ｉ（ＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ）酵素部位を導入させた。検査の結果により、野生型の稲の品種の中で、その拡充の産物に欠失していない塩基Ｇが余っているので、Ｂｇｌ Ｉに酵素部位点と識別されられなく、当酵素で切ってから長さの２５１ｂｐしか形成しなかった。けれども、その変異体中に、そのＰＣＲ産物が酵素Ｂｇｌ Ｉに切られてから２４ｂｐ及び２２７ｂｐの二本の帯（図３）が形成できた。さらに当該ＰＣＲ−ＲＦＬＰプライマー利用してそれぞれ二つの親本９３−１１、低育成６４ｍ及びそのＦ２マッピング集団のＤＮＡ混合サンプル（（４６株／部））を５部拡充して、得た拡充産物がＰＣＲ産物専用試薬ケース（Ｔａｋａｒａ）で純化されてから、酵素Ｂｇｌ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）で切り、すべてのＦ２混合サンプルのバンドｔｙｐｅが親本の低育成６４ｍのそれと一致（図４）していたので、ＣＹＰ８１Ａ６−１変異部位に対して人工で導入したＢｇｌＩ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーが遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６と共に単離されたものと証明した。私たちは当マーカーをＤＰ１（図１）と命名した。
【００４７】
変異体ｃｙｐ８１Ａ６−２に対して、同様に、分析ソフトウェアＷＥＢＣＵＴＴＥＲ ２．０利用して、その野生型及び変異体のＤＮＡ配列に対する制限性酵素部位分析を行った。結果によると、当変異体に生じた一塩基欠失変異部位がちょうどＮａｅ Ｉ（ＧＣＣＧＧＣ）酵素識別配列にあったので、当酵素に識別されなく、その上位５０ｂｐのところ（ＰＣＲ増幅範囲の内）にあるもう一つのＮａｅ Ｉ酵素部位が変えられなかった。故に、当酵素でｃｙｐ８１Ａ６−２の野生型及び変異体のＰＣＲ産物に対したＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析（技術プロセスは図５を参照）の結果によると、野生型の農林８号から得るＰＣＲ産物はＴａｋａｒａ純化試薬に純化されてから酵素ＮａｅＩ（Ｔａｋａｒａ）に三本のバンド（２１ｂｐ、５０ｂｐ及び１５１ｂｐ）に切られるが、変異体農林８号ｍから得るＰＣＲ産物はＴａｋａｒａ純化試薬ケースに純化されてから当部位で酵素ＮａｅＩに切られなく、２１ｂｐ及び２００ｂｐの二本のバンド（図５）しか切られる。ＣＹＰ８１Ａ６−１のＰＣＲ−ＲＬＰ分析結果と同様に、変異点に基くＮａｅ Ｉ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーが遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６と共に単離されたものであると当結果が証明したので、ＤＰ２（図１）と命名した。同時に、それらの結果はさらに前述の配列測定結果を証明した。
【００４８】
２．４ 候補遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６のクローン及びその生物学機能の相互補完の検証
候補遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の全遺伝子配列はＴａｋａｒａ社製の酵素ＬＡ Ｔａｑ（商標）及びその試薬ケースを利用して一次性拡充を通じて得たものであり、使用した長い断片のＰＣＲプライマー（フォワードプライマー： ５’−ＣＡＡＡＣＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡ ＣＴ−３’。リバースプライマー：５’−ＣＣＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣ ＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＴＡＧＡＡ−３’、上海生工で合成した）がインディカ米稲の遺伝子グループのデータベース（http://btn.genomics.org.cn/rice）に公布したＤＮＡ配列により、それぞれ当遺伝子の５’端の酵素ＢａｍＨＩの部位の前の１２４ｂｐのところ及びその後の４１４５ｂｐのところで設計して、それに、生粘性末端の発生、クローン及び連結に便利にするように、３’端のプライマーに酵素ＢｓｔＥIIの部位を加えた。この対のプライマーから拡充した４３１１ｂｐの断片は長さがそれぞれ１２４ｂｐのＢａｍＨＩ上流配列、１３２１ｂｐのプロモーター配列、２３２１ｂｐの遺伝子引導区にエクソン及びイントロンの加えられた配列、２７２ｂｐの３’−ＵＴＲ及びその後の遺伝子２８８ｂｐグループ配列（その中、制限酵素（restriction endonuclease）７ｂｐＢｓｔＥＩＩの識別部位及び保護塩基５ｂｐを含む）を含む。拡充の後に得た断片は先ず用バクテリオファージＴ４−ＤＮＡ連結酵素でＴＡプラスミドベクター（Ｔａｋａｒａ）につないで重複のある配列測定（Perkin Elmer AMI 377、上海基康）分析を行った。後に、エクソンの全部誤りのなく拡充されたクローンを選択して、酵素ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＥII（Ｔａｋａｒａ）でそれをＴＡプラスミドのベクターから切ってから、同じ双酵素で切られた遺伝形質転換ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１につないだ。次に、正しく断片を挿されたプラスミドを選択して、電子形質転換法でそれをアグロバクテリウムＥＨＡ１０５菌株に導入した。当菌株形質転換遺伝子グループ８０７７Ｓで生物学機能の相互補完検証を行い、得た耐性傷ふさがりが５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシン（ＡＢＩ、ＵＳＡ）で３度に選別してから、４．２μΜ／Ｌのベンスルフロンメチル（Bensulfonyluron- methyl,Sigma）選別（図６）を行い、それにより得た双耐傷ふさがりを含５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンの再生培養基に置いて緑苗分化を行い、得た植株がＰＣＲ検証を経て、ベンタゾン（１２５０ｍｇ／ｌ）を塗って鑑定した。結果により、すべての形質転換体がべンタゾンに対する耐性（図７にその中の一株の結果を示す）を回復した。私たちのクローンした遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６がベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子であったとこれらの結果は証明した。
【００４９】
２．５ 遺伝子の構造上の特徴
遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の構造上の特徴は翻訳開始コドンの前にある５３ｂｐの長さ（配列番号１に示す配列の第１８９６〜１９４８ｂｐ）の５’−ＵＴＲ、２２６８ｂｐの長さ（配列番号１示す配列の第１９４９〜４２１６ｂｐ）のコード領域及び終止コドンの後にある２７２ｂｐの長さの（配列番号１示す配列の第４２１７〜４４８８ｂｐ）３’−ＵＴＲを含む。当遺伝子のコード領域は二つのエクソンからなり、真ん中に一つのイントロンを隔てている（図８）。二つのエクソンは長さがそれぞれ９２４ｂｐ（配列番号１に示す配列の１９４９〜２８７２ｂｐ）及び６１８ｂｐ（配列番号１に示す配列の３５９９〜４２１６ｂｐ）であり、イントロンは長さが７２６ｂｐ（配列番号１に示す配列の第２８７３〜３５９８ｂｐ）である。
【００５０】
当該遺伝子はシトクロムＰ４５０タンパク（その配列は配列番号３を参照）をコードし、大多数のＰ４５０タンパクの共有する四つの保存域がある。即ち、Ｃ末端にあるＰｈｅ−ｘ−ｘ−Ｇｌｙ−ｘ−Ａｒｇ−ｘ−Ｃｙｓ−ｘ−Ｇｌｙのヘム結合ドメイン（heme-binding domain）、分子の酸化、活発化に重要な作用のあるヘム結合ドメインの上位の１５０のアミノ酸残基のＡ１ａ／Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｘ−Ａｓｐ／Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／ＳｅｒのＩヘリックス（I helix）、ヘム結合ドメインとＩヘリックスとの間にあるＰｒｏ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ−Ｐｈｅ／Ｔｒｐの湾曲（ｍｅａｎｄｅｒ）区及びＮ末端にあるプロリンリッチヒンジ機能域（proline-rich hinge）（Werch- Reichhartら、2000）。実際、ちょうどこれらの保存ドメインの存在により、大多数のシトクロムＰ４５０タンパクの保存の三次元構造を維持することができた。
【００５１】
実施例２： 稲のＷｘ遺伝子のターゲット変異及び遺伝的改良
栽培稲に広く当遺伝子Ｗｘ部位に分布している野生型の等位遺伝子Ｗｘａ及びＷｘｂが二つある。その中、Ｗｘａはインディカ米の稲の特徴であり、ＲＮＡ及びタンパク質レベルでの発現活発性がＷｘｂより１０倍強い。その高量発現は高いアミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）を起こし、蒸したり、煮たりするご飯が硬くて、緊密ではなく、口当たりがおいしくない。Ｗｘｂは主にジャポニカ米の稲にあり、その低量発現がジャポニカ米の稲タイプのミラーゼの含有量を起こし、その米が蒸したり、煮たりされてから柔らかでり、おいしい。研究によれば、Ｗｘａ及びＷｘｂの二つの等位遺伝子の発現の活発性にある差異は主に後者のリーダー区イントロンの５’スプライシング部位にＧ→Ｔの変異がある（程世軍ら、２００１）。当変異はＷｘｂ前体ｍＲＮＡの中のリーダー区イントロンの連結効率の低下を起こし、成熟のｍＲＮＡ及び遺伝子コーディングのアミラーゼの合成酵素（granule-bound starch synthase，ＧＢＳＳ）の量の減少を起こし、最終にアミラーゼの合成量減少に発現する。
【００５２】
Ｗｘ遺伝子リーダー領域イントロンの５’スプライシング部位配列及びＣＹＰ８１Ａ６一塩基欠失変異配列により、それぞれスプライシング部位のＧ塩基に向けて変異できる変異分子（図９ ＲＣＯ１）及びｃｙｐ８１Ａ６−１の一塩基に向けて欠失の部位修復を行う修復子分子（図１０ ＲＣＯ２）を設計した。パーティクルボンバードメント（particle bombardment）でそれをそれぞれ一部分の修復子：三部分の変異子により同時に対の形式で変異体８０７７Ｓに導入して、スルホニルウレア系除草剤で一塩基ｃｙｐ８１Ａ６−１の欠失変異の回復体及び遺伝子Ｗｘの共修飾変異体を選別した。それから、設計した特異プライマーを利用して（フォワードプライマー：５’−ＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＣ ＣＴＴＣＡＧ−３’。リバースプライマー： ５’−ＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＴＡＡＣＧＡ−３’）共修飾変異体のターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及びＡｃｃＩ（Ｔａｋａｒａ）酵素切りを行い、成功してＷｘ遺伝子真実変異体を得て、大面積の稲田中間試験及び純系選択育成を経て、新たなＷｘ遺伝子の改良系を得た。
【００５３】
実施例３： 稲ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの未知遺伝子の生物学機能を研究するための二重ＲＣＯｓ分子部位特異的な遺伝子共修飾技術の利用
ジーン・ターゲッティング（ｇene targeting）修飾技術は理論において具体的なターゲット遺伝子部位に向けて精確に行う。既知のＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの遺伝子のコーディングは一類シトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ（monooxygenase）タンパクであるが、稲Ｐ４５０は厖大な遺伝子ファミリーであり、インディカ米稲だけでは４５４のメンバーがある。当遺伝子ファミリーはタンパクのレベルに存在する高度に保存しているヘム結合ドメインモティフ（Ｆ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｇ）であり、特にその中のシスティン（ｃｙｓｔｉｎｅ）のコア残基は遺伝子Ｐ４５０の生物学機能の決定に対してきわめて重要であるので、理想的な変異ターゲットとしてもいい。
【００５４】
現有の稲Ｐ４５０のデータベース（http://drnelson.utmen.edu/cytochromep 450.html）から、稲ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８などの３つのシトクロムＰ４５０酵素のヘムの保存モティフの中のアミノ酸配列がそれぞれＦＧＭＧ ＲＲＲＣＰＧＥＴＬＡ、ＦＧＭＧＲＲＫＣＰＧＥＴＭＡ及びＦＧＭＧＲＲＲＣＰＧＥＭＬＡであると調べている。それらのモティフのヌクレオチド配列の情報及びＣＹＰ８１Ａ６一塩基の欠失変異の情報を利用してそれぞれモティフの中のキー残基システィン（Ｃ）コドンまたはその他の塩基に対して変異できる変異子分子（図１１ ＲＣＯ ３及び図１２ ＲＣＯ ４）及びｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基に向けて欠失部位に対して修復を行う修復分子（図１３ ＲＣＯ ５）を設計した。パーティクルバードメントでそれぞれそれを一部分の修復子：三部分の変異子またはその他の比率により同時に対の形式で農林８号ｍの変異体に導入し、スルホニルウレア系除草剤でｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基の欠失変異の回復体及び推定のＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８の共修飾変異体を選別してから、特異プライマーを利用してそれらの変異体を推定したターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及び配列測定検証を行い、得たＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ７及びＣＹＰ８１Ａ８の共修飾変異体を野生型と比べて、発現の表型または生物化学型の差異によりそれに関連していた生物学機能を推測した。
【００５５】
上述の実験ステップに、ｃｙｐ８１Ａ６−２の一塩基の欠失部位に対する修復の目的はその他の遺伝子の変異に選別作用を提供することにある。故に、理論から言うと、一つのサルフォニラリアスルフォニル・ターゲット酵素アセトラクテート合成酵素（ＡＬＳ）（Okuzaki及びToriyama、２００４）のような遺伝子部位は修飾されてから選別可能の特性があるだけで、修飾ターゲットとしてその目的に用いられる。
【００５６】
実施例４： 外来発現遺伝子の選別作用及びＲＣＯｓ分子の修飾機能を助けを借りた、未知の稲Ｐ４５０遺伝子の生物学機能の検討
抗生物質耐性マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌、動物またはその他の植物からの耐除草剤遺伝子及びＧＵＳ遺伝子などのような外来選択マーカー遺伝子は共導入、整合及び発現の方法を通じてＲＣＯｓ対ターゲット遺伝子の変異に選別作用を提供する。ここにハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を例にして説明する。機能未知のＰ４５０遺伝子に向けてＲＣＯｓ分子（図１４ ＲＣＯ６）を一つ設計して、同時にハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子を（ｈｐｈ）プラスミドベクターに構成して形質転換プラスミドｐＨＰＨ（図１５）を得た。次に公知のパーティクルバードメント（Tu et al、1998）を利用してプラスミドｐＨＰＨ及びＲＣＯｓ分子を共に受体の細胞に導入し、ハイグロマイシンリン酸転移酵素遺伝子の整合及び発現の発生したハイグロマイシン耐性を利用してＰ４５０遺伝子のＲＣＯ修飾変異体を選別した。次に、特異プライマーを利用して当変異体のターゲットＤＮＡ配列に対するＰＣＲ増幅及び配列測定検証を行い、得た稲Ｐ４５０修飾変異体を野生型のものと比べて、発現していた表型または生物化学型差異によりその関連した生物学機能を推測した。
【００５７】
実施例５： 稲の内在性Ｂｅｌ遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ断片の抑制効果に対する観察
クローンした稲の耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子のコーディング配列により、そのアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列（配列番号１の第１９３９位から第２４３９位までのヌクレオチド配列を参照）を設計して、それをアクチン１のような稲の組成型発現のプロモーターとつなぎで、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターｐＡＡＮＴＩ１（図１６）を構成して、アグロバクテリウムに仲介された（Agrobacterium-mediated transformation）標準の形質転換ステップによりそれをMinghui６３／Ｂｔのような野生型の品系に導入した。続いて、特異プライマーを利用して遺伝子組み換えのＴ０代の植株に対するＰＣＲ分析を行った。その結果により、すべての遺伝子組み換えの植株は対照プラスミドの拡充産物に一致していた断片を発現していて、外来のアンチセンスＲＮＡ断片にMinghui６３受体の遺伝子グループ（図１７）を導入していたと証明した。さらに、ベンタゾンを１２５０ｍｇ／Ｌ利用してそれらの遺伝子組み換えの植株の葉（株ごとに３枚の葉）に塗った。３６時間の後に、それらの処理された葉は枯れて死んだ（図１８）。稲の内在性Ｂｅｌ遺伝子の発現に対するアンチセンスＲＮＡ断片の抑制が有効的であったとその結果は証明した。
【００５８】
実施例６： 化学的に補充した除雄−温度感応性不稔系統の育成
上述の有効的であったと証明されたアンチセンスＲＮＡ断片を稲の下生え及びＯｓｇ６ＢまたはＲＡ３９のような花粉特異発現プロモーターにつないでから、遺伝形質転換用のアグロバクテリウム二元ベクターｐＯＡＮＴＩ１（図１９）を構成した。次に、アグロバクテリウムに仲介された標準の双遺伝子の共形質転換ステップによりそれをそれぞれ現在に稲の生産に大面積に利用していた光温度感応性不稔系統の低育成６４Ｓに導入して、それを特異性により温度感応性不稔系統の内在性耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子の下生え細胞及び花粉粒の中での発現を抑制させて、大面積の稲田での中間試験及び純系育成を通じて新たな化学的に補充した除雄−温度感応性不稔系統に転換できる。そんな二系不稔系統がハイブリッド種子生産の過程に真夏の異常な低温に遭って育成可能の花粉が出てくる場合、スルホニルウレア系除草剤でそれを死なせて、防雑保純の目的に達させる。
【００５９】
実施例７： 新たな耐除草剤選別マーカーの構成及び応用
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子の配列またはそのコーディング配列を３５Ｓ、Ｕｂｉ−１、アクチン１等及びｎｏｓターミネーター（terminator）などのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、現在常用のハイグロマイシン、カナマイシン耐性遺伝子またはＧＵＳ報告遺伝子などを替えた。当耐性遺伝子をベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤に感応性である稲８０７７Ｓ細胞に導入して、得た形質転換陽性傷ふさがりがＢＳＭの含んだ培養基で続いて成長できたが（図６左）、対照グループが当培養基で成長を停止し（図６右）、除草剤での耐性または陽性傷ふさがりの目的に達した。
【００６０】
実施例８： 耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換え植物の育成
耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤のＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子配列またはそのコーディング配列を３５Ｓ、Ｕｂｉ−１、アクチン１等及びｎｏｓターミネーターなどのような組成型の発現プロモーターにつないでから、アグロバクテリウム二元ベクターに構成して、直接に形質転換及び選別に用いられ、得た分子分析及び表型鑑定検証の行われた遺伝子組み換え植株は大面積の中間試験及び純系育成を経て耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換え系に転換できた。ＣＹＰ８１Ａ６遺伝子の全遺伝子配列を感応性稲の８０７７Ｓに導入して、耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子組み換えの新たな株系（図７左）を得られた。
【００６１】
実施例９： 稲の耐ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の相同クローン
シトクロムＰ４５０のメンバーに保存の配列が４つあり、触媒作用に重要な作用を発揮したヘム結合ドメイン（heme-binding domain）、膜の結合に重要なＮ−末端疎水領域、タンパク質の正確な組立の担当するグリシン／プロラインリッチ（glycine/proline-rich）領域及びヘムの結合領域の上位にある１５０のアミノ酸のＩへリックス（I helix）（Werch-Reichhart氏ら、２０００）を含む。故に、それらの保存領域でプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＣ−３’。リバースプライマー：５’−ＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣ−３’）を設計して、稲以外のイネ科または豆科植物の遺伝子に対する拡充を行い、高度に相同する配列して、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥ法により単離して相同配列の両端の配列の全部を得て、高度に相同した遺伝子を分離した。
【００６２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】第３染色体分子マーカー遺伝連鎖図上の本発明の稲ベンタゾン感応性致死遺伝部位ｂｅｌ及びそれと共に分離するＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーＤＰ１及びＤＰ２の位置。
【図２】農林８号ｍ及び８０７７Ｓの中のベンタゾン感応性致死位点の等位性テスト。 ａ： ベンタゾンで処理前の植株。左：農林８号ｍ、右：８０７７Ｓ、中：農林８号ｍと８０７７ＳとのＦ１ハイブリッド。ｂ： ベンタゾンで処理後一週間の植株。処理用のベンタゾンの濃度が１２５０ｍｇ／ｌである。
【図３】８０７７Ｓにあるｃｙｐ８１Ａ６−１一塩基の欠失変異部位を検証するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析のフローチャート。変異部位、ＰＣＲプライマーの配列、プライマー設計を利用して人工で導入する、変異部位の含むＢｇｌＩの酵素切断部位（Restriction Enzyme cutting site）、及びＢｇｌＩでＰＣＲ産物に対する切断の断片の長さの差異の詳細は図の中の注の通りである。
【図４】マッピング集団のＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーの分析結果。 Ｍ：１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（Ｔａｋａｒａ）、 １−５： Ｆ２マッピング集団（劣性感応性致死ホモ接合体）の５つのＤＮＡ混合サンプル（４６株／サンプル）、 ６： ９３−１１、 ７： 低育成６４ｍ。
【図５】農林８号ｍにあるｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基の欠失変異部位を検証するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析のフローチャート。変異部位、ＰＣＲプライマーの配列、ｃｙｐ８１Ａ６−２一塩基欠失変異部位に対応する野生型のＣＹＰ８１Ａ６コード配列にもとに存在していたＮａｅＩ酵素切断部位及びＮａｅＩでＰＣＲ産物に対する酵素切断の断片の長さの差異の詳細は図の中の注を参照すること。
【図６】８０７７Ｓを受体とするＣＹＰ８１Ａ６の形質転換して傷がふさがるベンスルフロンメチルの選別結果。 左：遺伝子組み換えの傷がふさがる、右： ８０７７Ｓ対照の傷がふさがる。
【図７】８０７７Ｓ受体とするＣＹＰ８１Ａ６遺伝子組み換えの苗のベンタゾン耐性の鑑定結果。左：８０７７Ｓ対照、中：遺伝子組み換えの苗、右： Ｗ６１５４Ｓ対照。
【図８】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ６の構造。 黒色の長方形：遺伝子の発現区域（expressed region）を表す、灰色の長方形：遺伝子の５’端及び３’端の非コード領域を表す、真中の実線：遺伝子の内部区域（Intervening region）を表す。それらの長さはそれぞれ図の上部に表示されている。図の下部に表示されているのは開始コドンのＡＴＧ、終止コドンのＴＧＡ及び編集点配列ＧＴ及びＡＧである。
【図９】遺伝子Ｗａｘａ のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ１。
【図１０】遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６−１のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ２。
【図１１】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ５、ＣＹＰ８１Ａ６、ＣＹＰ８１Ａ７、ＣＹＰ８１Ａ８のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ３．
【図１２】遺伝子ＣＹＰ８１Ａ８のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ４。
【図１３】遺伝子ｃｙｐ８１Ａ６−２のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ５。
【図１４】機能未知の稲Ｐ４５０（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｂ１１４７Ａ０４）遺伝子のターゲット配列及び該配列により設計されたＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドＲＣＯ６。
【図１５】ヒグロマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を運ぶｐＨＰＨプラスミド地図。
【図１６】プロモーター・アクチンＩに駆動されるＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子ｐＡＡＮＴＩ１プラスミド地図。
【図１７】Minghui６３回復系統を起源とするＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子形質転換植株のＰＣＲ鑑定結果。 Ｍ： ＤＬ２０００（Ｔａｋａｒａ）分子量マーカー。 １−２：遺伝子組み替え植株。 ３：野生型の対照植株； ４：プラスミド対照。
【図１８】Minghui６３回復系統を起源とするＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子形質転換植株のベンタゾン耐性の試験結果。 左：ベンタゾン感応性変異体のマイナス対照。中：アンチセンスＲＮＡ形質転換植株。右：Minghui６３野生型のプラス対照。ベンタゾン処理濃度：１２５０ｍｇ／Ｌ。
【図１９】組織特異型のプロモーターＯｓｇ６Ｂに駆動されるＣＹＰ８１Ａ６アンチセンスＲＮＡ遺伝子ｐＯＡＮＴＩ１プラスミド地図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子。
【請求項３】
下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりコードされてなる、ポリペプチド：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりによりコードされてなる、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド分子を転写または発現させるために必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
【請求項６】
転写調節エレメントと作動的に連結している請求項１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
転写もしくは発現に必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＭＡＲ配列及び５’側の上流の調節配列を含む、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項８】
ベクターが発現ベクターである、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求項１または３に記載のポリペプチドを含んでなる、植物細胞。
【請求項１０】
前記細胞がカヤツリグサ科荒地植物の細胞または豆科植物以外のほぼ全ての広葉植物を含む、請求項９に記載の植物細胞。
【請求項１１】
除草剤耐性の選別マーカーとしての、請求項１に記載のヌクレオチド配列または請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１２】
下記からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤感応性遺伝子，
（１） 配列番号１に示すヌクレオチド配列から第２４５５位塩基Ｃまたは第４００６位塩基Ｇを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号２に示すヌクレオチド配列から第５６０位塩基Ｃまたは第１３８５位塩基Ｇを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列；
（３） 前記（１）または（２）に記載のヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項１３】
人工のアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ断片を含んでなる組換え核酸分子であって、
前記アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ断片が請求項１、２または１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項１４】
化学的に補充された除雄で温度感応性雄性不稔系統の育成における、請求項１３に記載の組換え核酸分子の使用。
【請求項１５】
請求項１２に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド配列の転写もしくは発現に必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
【請求項１６】
転写または発現のために必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＭＡＲ配列または５’側の上流の調節配列を含む、請求項１５に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１２に記載のヌクレオチド配列または請求項１５もしくは１６に記載の組換えベクターを含んでなる、植物細胞。
【請求項１８】
ネガティブ選別マーカーとしての、請求項１２に記載のヌクレオチド配列または請求項１５もしくは１６に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１９】
生細胞内において遺伝子グループの二つまたは複数の部位におけるターゲット配列に対して、同時に部位特異的な共修飾を行う遺伝操作方法であって、
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド分子（ＲＣＯｓ）を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型（選別可能の表型）を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、変異したまたは変異していない耐除草剤遺伝子、耐抗生物質マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌もしくはＧＵＳ遺伝子など由来のコード配列または調節配列を含む、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２１】
選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、請求項１、２または１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列である、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２２】
スクリーニング可能な表型が、ＲＣＯｓ分子と共導入する外来遺伝子の発現によっても提供され得る、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２３】
付加修飾ターゲットが、機能未知の遺伝子である、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２４】
付加修飾ターゲットが、機能既知の遺伝子である請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２５】
請求項１〜８、１２、１５〜１６及び２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞、及び方法を利用する工程を含んでなる、遺伝子の生物学機能の調査方法。
【請求項２６】
請求項１〜８、１２、１５〜１６及び２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞及び方法を利用するの工程を含んでなる、生物の形質を改良する方法。
【請求項１】
下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤の耐性遺伝子。
【請求項３】
下記の（１）〜（５）からなる群より選択される何れかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりコードされてなる、ポリペプチド：
（１） 配列番号１に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号１の配列の第１９４９位から第４２１６位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（３） 配列番号２に示す配列を有する、ヌクレオチド配列；
（４） 配列番号２の塩基の第５４位から第１５９５位までのヌクレオチド配列と同等の機能を有する、断片または誘導体；
（５） 配列番号１または配列番号２に示すヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤耐性遺伝子によりによりコードされてなる、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド分子を転写または発現させるために必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
【請求項６】
転写調節エレメントと作動的に連結している請求項１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
転写もしくは発現に必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＭＡＲ配列及び５’側の上流の調節配列を含む、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項８】
ベクターが発現ベクターである、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求項１または３に記載のポリペプチドを含んでなる、植物細胞。
【請求項１０】
前記細胞がカヤツリグサ科荒地植物の細胞または豆科植物以外のほぼ全ての広葉植物を含む、請求項９に記載の植物細胞。
【請求項１１】
除草剤耐性の選別マーカーとしての、請求項１に記載のヌクレオチド配列または請求項５〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１２】
下記からなる群より選択されるいずれかのヌクレオチド配列を含んでなる、ベンタゾン及びスルホニルウレア系除草剤感応性遺伝子，
（１） 配列番号１に示すヌクレオチド配列から第２４５５位塩基Ｃまたは第４００６位塩基Ｇを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列；
（２） 配列番号２に示すヌクレオチド配列から第５６０位塩基Ｃまたは第１３８５位塩基Ｇを欠失することによって得られる、ヌクレオチド配列；
（３） 前記（１）または（２）に記載のヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件でハイブリダイズしうる、ヌクレオチド配列。
【請求項１３】
人工のアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ断片を含んでなる組換え核酸分子であって、
前記アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ断片が請求項１、２または１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項１４】
化学的に補充された除雄で温度感応性雄性不稔系統の育成における、請求項１３に記載の組換え核酸分子の使用。
【請求項１５】
請求項１２に記載のヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド配列の転写もしくは発現に必要な調節エレメントとを含んでなる、組換えベクター。
【請求項１６】
転写または発現のために必要な調節エレメントが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ＭＡＲ配列または５’側の上流の調節配列を含む、請求項１５に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１２に記載のヌクレオチド配列または請求項１５もしくは１６に記載の組換えベクターを含んでなる、植物細胞。
【請求項１８】
ネガティブ選別マーカーとしての、請求項１２に記載のヌクレオチド配列または請求項１５もしくは１６に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１９】
生細胞内において遺伝子グループの二つまたは複数の部位におけるターゲット配列に対して、同時に部位特異的な共修飾を行う遺伝操作方法であって、
第一の修飾ターゲットとして、修飾後の選別マーカーとして機能し得るヌクレオチド配列を使用し、付加修飾ターゲットとして、生細胞のターゲット内在性遺伝子のキー塩基対を使用し、
異なる修飾ターゲット配列に向けて設計された二または複数のＲＮＡ・ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド分子（ＲＣＯｓ）を、パーティクルガン介在共導入技術によって、ターゲット受容細胞に共導入して、前記二または複数のターゲット部位に対して同時に部位特異的な修飾または変異を行い、
更に選別マーカーとするヌクレオチド配列の修飾表型（選別可能の表型）を利用してターゲット内在性遺伝子の修復または変異の後の遺伝子の型に対して関係の選択を行うことを特徴とする、方法。
【請求項２０】
選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、変異したまたは変異していない耐除草剤遺伝子、耐抗生物質マーカー遺伝子、生物発光もしくは化学発光遺伝子、炭素源代謝キー酵素遺伝子、細菌もしくはＧＵＳ遺伝子など由来のコード配列または調節配列を含む、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２１】
選別マーカーとして使用されるヌクレオチド配列が、請求項１、２または１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列である、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２２】
スクリーニング可能な表型が、ＲＣＯｓ分子と共導入する外来遺伝子の発現によっても提供され得る、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２３】
付加修飾ターゲットが、機能未知の遺伝子である、請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２４】
付加修飾ターゲットが、機能既知の遺伝子である請求項１９に記載の遺伝操作方法。
【請求項２５】
請求項１〜８、１２、１５〜１６及び２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞、及び方法を利用する工程を含んでなる、遺伝子の生物学機能の調査方法。
【請求項２６】
請求項１〜８、１２、１５〜１６及び２１〜２４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列、ポリペプチド、組換えベクター、細胞及び方法を利用するの工程を含んでなる、生物の形質を改良する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公表番号】特表２００８−５４６４１９（Ｐ２００８−５４６４１９Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１８５８９（Ｐ２００８−５１８５８９）
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００００７７
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５０５０７２６５０）浙江大学 (10)
【出願人】（５０８００３９９６）武漢財富科技有限公司 (1)
【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＦＯＲＴＵＮＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２８日（２００５．６．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００５／０００９３６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００００７７
【国際公開日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【出願人】（５０５０７２６５０）浙江大学 (10)
【出願人】（５０８００３９９６）武漢財富科技有限公司 (1)
【氏名又は名称原語表記】ＷＵＨＡＮ ＦＯＲＴＵＮＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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