筋萎縮抑制剤
【課題】筋萎縮抑制作用がより効果的かつ安全であり、長期に使用可能な筋萎縮抑制剤を提供する。
【解決手段】本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、さらにクレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも１種類を含有する。ウコギ科人参としては田七人参が好ましく、さらに水抽出物とそのエタノ-ル洗浄物が好ましい。また、カゼイン分解ペプチドとしては、Ｃ１２ペプチドが好ましい。
【解決手段】本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、さらにクレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも１種類を含有する。ウコギ科人参としては田七人参が好ましく、さらに水抽出物とそのエタノ-ル洗浄物が好ましい。また、カゼイン分解ペプチドとしては、Ｃ１２ペプチドが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉の萎縮を効果的に抑制する筋萎縮抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨折等の怪我や罹病により長期に亘る臥床や安静を余儀なくされると、筋肉の萎縮が生じ、日常生活への復帰に時間がかかり、場合によっては、日常生活に支障を来すおそれもある。また、健康であっても、日常の運動不足や老化によって、筋肉の萎縮が生じ、同様に日常生活への支障が生じ得る。さらに、特殊なケースであるが、宇宙飛行などの無重力環境下におかれる人々にも、筋肉の萎縮が生じ、日常生活への順応に時間がかかることが知られている。
【０００３】
筋肉の萎縮が生じると、運動が困難になり、いわゆる生活の質が低下することになる。運動が困難になると、病人はさらに病状を悪化させ、老人は寿命を縮めることになりかねない。筋肉の萎縮が生じた場合、その回復には、適切な栄養を摂取しつつ、所定量の運動を持続的に実行することが重要であるとされている。かかる運動療法による筋肉の回復には、栄養の摂取量および運動量の設定が適切に行われ、かつ当人に継続実行する根気が必要とされる。そのため、怪我等によって一時的に運動不足となった健康者であれば、根気さえあれば、運動療法による筋肉の回復は可能であるが、病人や老人においては、運動療法による筋肉の回復ははなはだ困難であると言わざるを得ない。
【０００４】
そこで、病人や老人、さらには、何らかの理由で運動不足に陥った健康者が生活の質を低下させる原因となる筋肉の萎縮を生じないように抑制する薬剤や補助食品の開発が、検討され、従来、いくつかの提案がなされている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、果実ポリフェノールを有効成分として含有する筋萎縮抑制組成物が提案されている。
【０００６】
また、特許文献２には、筋肉不使用症候群を治療あるいは予防する目的で、クレアチンを有効成分としたクレアチン経口補充療法剤が提案されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−０８９３８７号公報
【特許文献２】特表２００２−５３０３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献１に開示の筋萎縮抑制組成物は、運動不足などから誘引される廃用性筋萎縮に酸化ストレスが関与しているとの示唆情報に基づいて開発されたもので、抗酸化作用を有する果実ポリフェノールを有効成分として用いることにより原因と推定される酸化ストレスを低減して筋萎縮を抑制しようとする筋萎縮抑制剤である。しかしながら、筋萎縮の原因は、臨床的には、運動不足にあることはほぼ明らかであると考えられるが、生理的、病理的には、未だ明確になっていない。この特許文献１に記載のように酸化ストレスが筋萎縮を誘引する場合もあれば、他の原因に基づくものもあると考えられ、実際にかかる特定のポリフェノールの摂取によって全ての筋萎縮の抑制が可能であるわけではなく、効果的にも限界がある。
【０００９】
前記特許文献２に開示のクレアチン経口補充療法剤は、筋肉のエネルギー産生に重要な素材としてクレアチンを補充することにより、筋萎縮を含む筋肉不使用症候群を治療あるいは予防するための医療薬剤である。この医療薬剤は、老化に伴う運動能力の低下が身体のクレアチンレベルの低下に起因しているとの示唆情報に基づき開発されたものであり、クレアチンの経口補充によって、高齢者の運動能力を回復させ、筋肉の再生、維持を促進しようとするものである。しかしながら、筋萎縮の原因は、未だ十分に明らかになっているわけではないので、クレアチン補充以外の別のアプローチ法もありえる。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その課題は、筋萎縮抑制作用がより効果的かつ安全であり、長期に使用可能な筋萎縮抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために、本願発明者らが鋭意、実験、検討を重ねたところ、以下のような知見を得るに到った。
【００１２】
すなわち、長期に亘る摂取にも安全で、従来から高い筋萎縮抑制作用のある成分を、広く植物抽出物の群を対象にしてスクリーニングした。
その結果、田七人参や御種人参などのウコギ科人参に高い筋萎縮抑制作用があることを確認することができた。
【００１３】
また、ウコギ科人参の使用形態としては、特に限定されないが、抽出物として用いることが好ましい。そして、抽出物としては、水抽出によるものが良く、さらに、水による粗抽出物を有機溶媒を用いて洗浄して精製する工程を包含させると、もっとも高い筋萎縮抑制作用を有することが明らかとなった。
【００１４】
本発明における筋萎縮抑制作用は、筋肉量の減少、筋肉の最大強度の減少、最大能力の減少、筋弛緩時間の増加、早発性筋肉疲労、糖取り込み量低下、脂質量の増加、筋肉エネルギー保持力の低下、筋肉血流の減少、運動制御障害などの筋肉に生じる減退症状を低減もしくは予防する作用である。
【００１５】
周知のように、ウコギ科人参は、各種文献に様々な作用があること、そしてその作用に基づく適用例が開示されている。しかしながら、どの開示にも、ウコギ科人参に前述の筋萎縮を抑制する効果があることは記載も示唆もない。例えば、特開２００４−１８９６１９号公報には、オタネニンジン、サンシチニンジン、アメリカニンジンおよびトチバニンジンからなる群より選ばれる１種または２種以上とビタミンＢ類を含有する組成物が開示されているが、ここで開示されている人参の効果は、滋養、強壮効果であって、筋萎縮の抑制効果については、なんら記載がないばかりでなく、示唆すらされていない。
【００１６】
本発明者らは、多くの植物およびその抽出物を対象に、筋萎縮抑制作用を有するか否か、有する場合、どの程度の効果が期待できるのかについて、度重なるスクリーニングをした結果、前述のように、ウコギ科人参に格別顕著な筋萎縮抑制作用があることを知見するに到った。このウコギ科人参による筋萎縮抑制作用について、さらに、その作用機序について探究したところ、後述の実施例に示すように、筋肉細胞の増強を促す結果をもたらす筋芽細胞の増殖作用と分化作用の両作用を有しており、これら両作用に基づいて筋萎縮抑制作用がもたらされる可能性があることが知見された。
【００１７】
さらに、このウコギ科人参の筋萎縮抑制作用を助長する化合物の有無についても数多くのスクリーニングをしたところ、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの少なくとも１種類をウコギ科人参の抽出物に添加して併用することによりウコギ科人参が有する筋萎縮抑制効果が増強されることが確認された。
【００１８】
本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明の筋萎縮抑制剤において、有効成分であるウコギ科人参の含有形態としては、水抽出物であることが好ましい。この水抽出物は、水を用いた粗抽出物をさらに有機溶媒を用いて洗浄して精製したものであることが好ましい。この場合の有機溶媒としては、８０〜１００％エタノールを用いることが好ましい。
また、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、好ましくは、さらにクレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも１種類を含有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る筋萎縮抑制剤は、筋芽細胞の増殖作用および分化作用の両作用を有し、係る作用に基づいて優れた筋萎縮抑制効果を発揮するウコギ科人参を有効成分として含有している。したがって、本発明に係る筋萎縮抑制剤を適宜に摂取することにより、罹病や怪我などにより長期に亘り運動不足となる場合などに生じる筋萎縮を効果的に抑制し、筋萎縮により生活の質が損なわれることを低減もしくは予防することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
前述のように、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴としている。さらに、好ましくは、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも一種類を含有する。
【００２１】
本発明における筋萎縮抑制作用は、筋肉量の減少、筋肉の最大強度の減少、最大能力の減少、筋弛緩時間の増加、早発性筋肉疲労、筋肉エネルギー保持力の低下、筋肉血流の減少、運動制御障害などの筋肉に生じる減退症状を低減もしくは予防する作用である。この筋萎縮作用は、有効成分であるウコギ科人参によって効果的にもたらされる。このウコギ科人参の筋萎縮抑制作用は、ウコギ科人参が筋芽細胞の増殖を促進する作用と筋芽細胞の分化を促進する作用の両作用を有することに伴って得られるものと思われる。
【００２２】
前記筋芽細胞の増殖を促進する作用とは、培養筋芽細胞にサンプル水溶液を添加した場合の細胞増殖が無添加のものより優れていることを意味する。そしてこの筋芽細胞の増殖作用は、無添加と比較してどの程度増殖が促進されたかを測定することによって、その程度を評価することができる。
【００２３】
一方、前記筋芽細胞の分化を促進する作用とは、培養筋芽細胞にサンプル水溶液を添加した場合の細胞増殖が無添加のものと比較して分化が進んでいることを意味する。そして、この筋芽細胞の分化作用は、細胞のクレアチンキナーゼ活性を測定することによって、その程度を評価することができる。
【００２４】
次に、本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるウコギ科人参と、任意の有効成分であるクレアチンとカゼイン分解ペプチドについて、個々に説明する。
【００２５】
本発明の筋萎縮抑制剤の必須有効成分として用いるウコギ科人参は、ウコギ科の草本植物として分類される周知の薬用植物である。このウコギ科人参としては、御種人参（朝鮮人参、高麗人参とも別称される）、田七人参などがある。
【００２６】
このウコギ科人参は、その根や根茎に特に有効成分を多く含んでいるので、その根や根茎部分を、原型に保った状態のまま、あるいは粉砕したもの、もしくは、さらに、溶媒抽出して濃縮した状態、乾燥して粉末とした抽出物の状態で使用することが望ましい。
【００２７】
使用する具体的な人参の抽出物としては、水抽出物が好ましく、その工程としては特に限定されるものではないが、人参（乾燥物）１重量に対して、１０倍から３０倍量の水を用いて、温度として４℃から２５℃、好ましくは１０℃から２０℃に保ちながら、２時間以上攪拌して有効成分を抽出するのが良い。通常、浸漬、攪拌することによって抽出を行い、得られる抽出物は、濾過、濃縮、凍結乾燥などの適当な処置を施して製剤化される。
【００２８】
さらに、上記の人参の抽出物から、抽出残査を分離する工程を包含することによって、筋萎縮抑制作用を向上し得る。残査分離の工程は、特に限定されるものではないが、濾過、遠心分離、有機溶媒洗浄など公知の方法によって実施される。好ましくは、エタノ-ルを用いた残査分離工程が用いられ、人参の水抽出物１重量に対して、１から３倍量の無水エタノールを添加してその残査から有効成分を得る。さらに、エタノ-ルを用いた残査有効成分の洗浄精製工程は、２回以上繰り返すのが有効成分の純化には好ましいが、５回以上の繰り返しは多量に溶媒が必要なことや収率の低下を招き不経済である。得られる抽出物は、通常、攪拌、遠心分離、ろ過、乾燥などの適当な処置を施して製剤化される。
【００２９】
ウコギ科人参として田七人参粉末を用いた場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、０．１ｇ／日から５０ｇ／日である。田七人参の水抽出物を用いた場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、５０ｍｇ／日から２５ｇ／日である。田七人参の水抽出物に無水エタノール洗浄工程を包含した場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、１０ｍｇ／日から１０ｇ／日である。かかる範囲において、服用者の年齢、性別、健康状態によって、最適な摂取量、摂取方法、摂取回数、摂取期間を適宜に決めればよい。前記摂取量として１００ｇ／日より増やしても効果の増強は高原状態となるので不経済であり、０．１ｍｇ／日未満とすると、筋萎縮抑制効果が期待できなくなる。
【００３０】
本発明の任意有効成分として用いるクレアチンは、生体内に存在するアミノ酸の一種であり、食肉や水産物、哺乳類の乳から抽出したり、工業的に製造したりすることにより得られる。調製法に関しては数多くの研究がなされている。例えば、乳又は乳製品を限外濾過処理する工程で得られる透過液を原料とし、電気透析装置、イオン交換樹脂、ナノ膜濾過装置等を使用したクレアチンの分離・精製法が報告されている。また、工業的製造法は、サルコシンもしくはナトリウムサルコシネートまたはカリウムサルコシネートをシアナミドまたはＯ−メチルイソ尿素と反応させることによって行なわれ、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第５版、第Ａ１２巻、第５５２頁、VCH-Verlagsgesellschaft,Weinheim (1987)ならびに、これらの中に引用された刊行物中に記載されている。
【００３１】
このクレアチンを本発明の筋萎縮抑制に添加して前記必須有効成分であるウコギ科人参抽出物と併用する場合の摂取量は、５ｇ／日から０．０５ｍｇ／日が好ましい。５ｇより増量しても効果の増加はわずかであるので不経済となる。また、０．０５ｍｇ未満とすると、所望の効果を得ることができなくなる。
【００３２】
また、本発明の任意有効成分として用いるカゼイン分解ペプチドは、カゼインのトリプシンやペプシン加水分解物から得られるもので、Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys（配列表）で表されるペプチドもしくはその酸付加塩を含有するものである。
【００３３】
前記カゼインは、広く食品添加物として用いられているカゼイン、例えば、牛乳由来のカゼイン、酸カゼイン、カゼイン塩類を用いることができる。トリプシン、ペプシンは市販のものを使用することができ、これらは、特公昭６０−２３０８５号公報、特公昭６１−５１５６２号公報に記載されている公知の加水分解法により得ることができる。
【００３４】
かかるカゼイン分解ペプチドとしては、具体的には、後述の実施例で使用したＣ１２ペプチド（ＤＭＶ社製）を挙げることができる。ここでいうＣ１２ペプチドとは、ミルクプロテインのカゼインを酵素分解して得られる１２個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００３５】
このカゼイン分解ペプチドを本発明の筋萎縮抑制に添加して前記必須有効成分であるウコギ科人参抽出物と併用する場合の摂取量は、０．０５ｍｇ／日から５ｇ／日が好ましい。５ｇより増量しても効果の増加はわずかであるので不経済となる。また、０．０５ｍｇ未満とすると、所望の効果を得ることができなくなる。
【００３６】
本発明の筋萎縮抑制剤には、必須有効成分としてウコギ科人参を含有し、好ましくは、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドから選ばれる少なくとも一種類を任意有効成分として添加、併用するが、その場合の配合割合は、人参を抽出物として使用する場合では、人参抽出物を成分Ａ、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドから選ばれる少なくとも一種類を成分Ｂとして表すと、Ａ：Ｂ＝１：９〜５：５であり、この範囲に設定すれば、併用効果が高い。服用者への最も適切な配合比は、年齢、性別、健康状態などによって、適宜、決めればよい。
【００３７】
本発明の筋萎縮抑制剤の製剤化は、公知の製剤技術により行なうことができ、製剤中には適当な添加物も加えることができる。本発明の筋萎縮抑制剤は経口的に投与するか、経皮的に投与するのが望ましい。
【実施例】
【００３８】
以下に、本発明にかかる筋萎縮抑制剤の実施例を説明する。なお、以下に示す実施例は、本発明を説明するための好適な例示であり、なんら本発明を限定するものではない。
【００３９】
（実施例１）
松浦薬業株式会社製の田七粉１００ｇを２０００ｇの水に拡散し、１５℃に保ちながら３時間攪拌した。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって得た上清を、ろ過し、約１５倍に濃縮して田七人参水抽出物とした。
【００４０】
さらに、上記の田七人参水抽出物に、９５％エタノール（和光純薬社製）を体積で３倍量添加し、室温で２時間攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、沈殿物（水による粗抽出物）を得た。この沈殿物を無水エタノール（和光純薬社製）で２回洗浄し、吸引ろ過、室温乾燥後、エタノールによって洗浄精製された「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を得た。
松浦薬業株式会社製の田七粉１００重量％に対し、得られた田七人参水抽出物エタノール洗浄品（水抽出物洗浄精製物）は約２５重量％の収率であった。
【００４１】
上記実施例で得られた「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を用いて、筋肉培養細胞、筋萎縮モデル動物に対して行なった試験方法及びその結果を、以下の実施例２において説明する。
【００４２】
（実施例２）
この実施例２では、本発明に係る筋萎縮抑制剤を構成する必須有効成分であるウコギ科人参（下記サンプル１，２）と、ＩＧＦ−１（比較対照の下記サンプル３）とに対して、以下のように筋芽細胞の増殖促進効果について評価した。なお、比較に用いたＩＧＦ−１とは、インシュリン様成長因子−１であり、筋芽細胞増殖作用を示す医薬品である。
【００４３】
対象とする筋芽細胞として、大日本住友製薬社製のマウス由来筋芽細胞（商品名「Ｃ２Ｃ１２」）を用いた。また、必須有効成分のサンプル１として松浦薬業株式会社製の「田七人参エキス末」を、サンプル２として上記実施例１で得た「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を、比較サンプル３として上述のＩＧＦ−１を用意した。また、培地は、インビトロジェン社製のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いた。
【００４４】
５×１０４個の前記筋芽細胞を４００μＬの培地（１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ）に縣濁し、２５ウェル・プレートに播種後、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間培養して定着させた。
【００４５】
その後、評価用の培地［０．５％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシン、各サンプル１〜３を含有したＤＭＥＭ］４００μＬに交換した。各サンプル１〜３の評価濃度を終濃度で０．１、１、１０、１００ｐｐｍとした。各サンプル１〜３について１％の水溶液（疎水性のサンプルはエタノール溶液）を調製し、終濃度となるように適宜添加した。
【００４６】
前述の培地を２日間培養後、培地を抜き取り、１０％アラマーブルー、０．５％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを２００μＬ添加し、３時間培養後、蛍光プレートリーダーにて蛍光値（Ｅｘ５４４，Ｅｍ５９０）を測定（蛍光強度が細胞数と比例）した。
相対増殖度は、以下の式（１）にて算出して求めた。
（相対増殖度）＝（サンプル添加時の蛍光強度）÷（サンプル無添加の蛍光強度）
・・・（１）
【００４７】
サンプル無添加の蛍光強度１．００に対して各サンプル添加による蛍光強度を測定した。サンプル３（ＩＧＦ−１）を添加したものの蛍光強度が１.４８であったのに対して、サンプル１（田七人参エキス末）を添加したものの蛍光強度は１.３６であり、サンプル２（田七人参水抽出物エタノール洗浄品）を添加したものの蛍光強度は１.４０であり、田七人参（サンプル１，２）の筋芽細胞増殖作用は、効果の高い医薬品であるＩＧＦ−１（サンプル３）添加の場合とほぼ同等であることが確認された。
【００４８】
（実施例３）
この実施例３では、本発明に係る筋萎縮抑制剤を構成する必須有効成分であるウコギ科人参に対して、以下のように筋芽細胞の分化促進効果について評価した。
【００４９】
対象とする筋芽細胞として、大日本住友製薬社製のマウス由来筋芽細胞（商品名「Ｃ２Ｃ１２」）を用いた。また、評価用サンプルとして、前記サンプル１及びサンプル２に加えて、比較サンプル４としてクレアチン（デグサバイオアクティブス社製の「クレアチンシトレート（商品名）」）を用意した。また、培地は、インビトロジェン社製のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いた。
【００５０】
１２ウェル細胞培養プレートに前記筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を播種し、培養液ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬにて、９０％コンフルエントまで培養した。前記筋芽細胞をＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬにて２回洗浄した後、ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬに、下記（表２）に示した、１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００００ｐｐｍの評価用サンプル１，２及び比較サンプル４を、１０μＬ添加して、終濃度１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの評価用培養液とした。
【００５１】
上記各評価用培養液に対して、３日後に同じ培養液で培地交換を行い、５日間培養して分化を誘導した。各サンプルは、蒸留水またはエタノールに１％濃度で溶解してフィルター滅菌し、ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンにて、１倍、１０倍、１００倍に希釈し、それぞれ１００００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００ｐｐｍ溶液とした。
【００５２】
筋芽細胞の分化の程度を定量化するために、文献（Z-Q cheng, Jornal of Endcrinology, 167, 175-182 (2000)）において分化マーカーとして利用されているクレアチンキナーゼ活性を測定した。クレアチンキナーゼ活性は、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を１％添加したＣｅｌｌｙｔｉｃ Ｍ（シグマ社）１００μＬにて細胞を溶解し、遠心上清をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて１００倍希釈したものをサンプルとして、ＣＰＫＩＩテストワコー（和光純薬株式会社製）の方法に従って測定した。評価用の各サンプルの効果を示す指標として、分化促進率（＝成分サンプル添加時のクレアチンキナーゼ活性／無添加時のクレアチンキナーゼ活性）を用いた。
【００５３】
測定された分化促進率は、田七人参エキス末のサンプル１では、１.１０倍であり、田七人参水抽出物エタノール洗浄品のサンプル２では、１．３６倍であり、比較サンプル４のクレアチンサンプルでは１.２５倍であり、ウコギ科人参（サンプル１，２）に筋芽細胞分化促進作用があることが、確認された。
【００５４】
（実施例４）
この実施例では、本発明に係る筋萎縮抑制剤の筋萎縮予防効果について評価した。
ラット（ウイスター系、♀、８週齢、各群１０匹）へ、標準餌ＡＩＮ−９３Ｇ（日本ＳＬＣ社製）に１％の割合で下記（表１）に示す評価用サンンプル１，１Ａ，２，２Ａ，２Ｂ，５，および６を添加したものを、１日１５ｇづつ３週間摂取させた。
【００５５】
ウコギ科人参としては、松浦薬業株式会社製の田七人参エキス末（サンプル１）と、田七人参粉末（サンプル１Ａ）と、御種人参エキス末（サンプル５）、田七人参水抽出物エタノール洗浄品（サンプル２、２Ａ、２Ｂ）とを用いた。また、クレアチンとしては、デグサバイオアクティブス社製のクレアチンシトレート（サンプル２Ａ）を用い、カゼイン分解ペプチドとしては、ＤＭＶ社製のＣ１２ペプチド（サンプル２Ｂ）を用い、果実ポリフェノールとしてはキッコ-マン株式会社製のグラヴィノ-ルスーパー（比較サンプル６）を用いた。これに対して、対照群には１％コーンスタ-チ（日本ＳＬＣ社製）を混ぜた標準餌を摂取させた。
【００５６】
試験開始１週間目から試験終了最終日（試験開始から１４日目）まで、ラットの右後肢をギプス固定し、筋萎縮を誘導した。試験終了最終日に右後肢を解剖し、ヒラメ筋の湿重量を測定した。筋萎縮率は、対照群の左後肢ヒラメ筋湿重量を１００としたときの右後肢ヒラメ筋湿重量平均相対値により求めた。測定結果を下記（表１）に併記した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（表１）から明らかなように、本発明の評価サンプル１，２，２Ａ，２Ｂ，５は、対照群および比較サンプル６に比べて、筋萎縮予防効果が高い。そして、本発明の評価サンプル１，２，２Ａ，２Ｂ，５のなかでも、田七人参水抽出物エタノール洗浄品（サンプル２）の筋萎縮予防効果が高く、さらに田七人参水抽出物エタノール洗浄品にＣ１２ペプチドを併用したサンプル２Ｂやクレアチンを併用したサンプル２Ａでは、さらに高い筋萎縮予防効果が得られることが確認された。
【００５９】
本発明の筋萎縮抑制剤の使用形態としては、経口剤または皮膚外用剤として用いることが好ましい。以下に、本発明の筋萎縮抑制剤を経口剤として用いた配合例（２例）、皮膚外用剤として用いた配合例（２例）とを例示する。
【００６０】
（配合例１：内服液（経口剤））
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：１０００ｍｇ、江崎グリコ（株）製「αＧヘスペリジン」：１０００ｍｇ、ビタミンＢ1硝酸塩：１０ｍｇ、アスコルビン酸：５００ｍｇ、マルチトール：１５０００ｍｇ、ビタミンＢ6：１０ｍｇ、イノシトール：５０ｍｇ、無水カフェイン：２０ｍｇ、リンゴ酸：１５０ｍｇ、クエン酸：７００ｍｇ、クエン酸ナトリウム：適量、グリセリン：６０ｍｇ、安息香酸ナトリウム：７０ｍｇ、および香料：微量を内服液成分とし、これらを精製水に混合し、溶解して、１００ｍｌの内服液（ｐＨ＝４．５）を得た。
【００６１】
（配合例２：タブレット（経口剤））
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：２０ｇ、ゼラチン：１３０ｇ、グリセリン：７０ｇ、水：１００ｇ、およびパラオキシ安息香酸エチル：０．５ｇを、加熱し攪拌して、均一なゼラチン分散液（Ｌ１）を得た。
一方、酵素分解レシチン：１００ｇとグリチルリチン酸ジカリウム：０．４ｇを、小麦胚芽油：２００ｇにホモミキサーを用いて分散させて均一な溶液状の小麦胚芽油液（Ｌ２）とした。
上記ゼラチン分散液（Ｌ１）を直径１２ｍｍのアルミ製のカプセル用の型に押し出し、ゼラチンカプセルを得た。
次いで、小麦胚芽油液（Ｌ２）をノズルによって押し出して前記ゼラチンカプセル内に注入し、充填、冷却、乾燥した。これにより液状の小麦胚芽油液（Ｌ２）の充填されたゼラチンのゲル状外層を有する固形製剤（タブレット経口剤：ゲル状組成物）を得た。
【００６２】
上記固形製剤１個あたりの組成および組成量を以下に示す。
ゼラチン：１３０ｍｇ（外層）
グリセリン：７０ｍｇ（外層）
パラオキシ安息香酸エチル：０．５ｍｇ（外層）
αＧヘスペリジンＰＳ：２０ｍｇ（筋萎縮抑制成分）
酵素分解レシチン：５０ｍｇ：（矯味、矯臭成分）
グリチルリチン酸ジカリウム：０．５ｍｇ（矯味、矯臭成分）
小麦胚芽油 １００ｍｇ：（内層）
以上、合計：３７１ｍｇ
【００６３】
（配合例３：貼付液（皮膚外用剤））
下記に示す油層成分および水層成分を用意した。
以下の配合量（数字）は特に断りがなければ、質量（％）を表す。
（水層成分）
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：５．０ｇ、セトステアリルアルコール：４．０ｇ、モノステアリン酸グリセリン：２．０ｇ、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート：２．０ｇ、グリコ-ル酸：０．２ｇ、サリチル酸：０．１ｇ、局方イオウ：５．０ｇ、ジグリセリン：５．０ｇ、レゾルシンーラボナイト複合体：１．０ｇ、水酸化ナトリウム：適量。
（油層成分）
スクワラン：１０．０ｇ、流動パラフィン：３．０ｇ、蜜ロウ：２．０ｇ。
香料：微量、精製水：バランス。
【００６４】
上記油層成分および水層成分を別々に７０℃で加熱した後、混合し乳化した。これを冷却しながら途中で香料を加えて、さらに室温まで冷却し、１００ｇの貼付液（皮膚外溶剤）を得た。
【００６５】
（配合例４：貼付剤シート（皮膚外用剤）
ポリエチレングリコール４００（質量平均分子量４００）：１０．００ｇ、田七人参水抽出物エタノール洗浄品：３．７５ｇ、Ｌ−メントール：２．００ｇを混合溶解して混合溶液（Ｌ３）：１５．７５ｇを得た。
次に、１５０℃に加熱したゴム系粘着剤ＳＩＳ（商品名「クレイトンＤ−１１０７」、クレイトンポリマージャパン社製）：７３．７ｇに対して、脂環族炭化水素（商品名「アルコンＰ−１００」、荒川化学社製）を１１０．５５ｇの割合で混合して、粘着成分（Ｍ）：１８４．２５ｇを得た。
次に、上記混合溶液（Ｌ３）：１５．７５ｇと、上記粘着成分（Ｍ）：１８４．２５ｇとを加えて混合し、膏体組成物：２００ｇを得た。
次いで、上記膏体組成物を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ライナー）上に、塗工量（膏体質量）が乾燥後に１００ｇ／ｍ２になるようにホットメルト法により塗工して、シート状の膏体を得た。
最後に、ポリウレタンフィルム／ポリエステルニット積層支持体（ニット目付け：３０ｇ／ｍ２、厚さ：１８０μｍ、透湿度：２２００ｇ、透明度：４９）を用いて、上記膏体の膏面を被覆し、貼付剤シートを得た。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように、本発明にかかる筋萎縮抑制剤は、筋芽細胞の増殖作用および分化作用の両作用を有し、係る作用に基づいて優れた筋萎縮抑制効果を発揮するウコギ科人参を有効成分として含有している。したがって、本発明に係る筋萎縮抑制剤を適宜に摂取することにより、罹病や怪我などにより長期に亘り運動不足となる場合などに生じる筋萎縮を効果的に抑制し、筋萎縮により生活の質が損なわれることを低減もしくは予防することが可能となる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉の萎縮を効果的に抑制する筋萎縮抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨折等の怪我や罹病により長期に亘る臥床や安静を余儀なくされると、筋肉の萎縮が生じ、日常生活への復帰に時間がかかり、場合によっては、日常生活に支障を来すおそれもある。また、健康であっても、日常の運動不足や老化によって、筋肉の萎縮が生じ、同様に日常生活への支障が生じ得る。さらに、特殊なケースであるが、宇宙飛行などの無重力環境下におかれる人々にも、筋肉の萎縮が生じ、日常生活への順応に時間がかかることが知られている。
【０００３】
筋肉の萎縮が生じると、運動が困難になり、いわゆる生活の質が低下することになる。運動が困難になると、病人はさらに病状を悪化させ、老人は寿命を縮めることになりかねない。筋肉の萎縮が生じた場合、その回復には、適切な栄養を摂取しつつ、所定量の運動を持続的に実行することが重要であるとされている。かかる運動療法による筋肉の回復には、栄養の摂取量および運動量の設定が適切に行われ、かつ当人に継続実行する根気が必要とされる。そのため、怪我等によって一時的に運動不足となった健康者であれば、根気さえあれば、運動療法による筋肉の回復は可能であるが、病人や老人においては、運動療法による筋肉の回復ははなはだ困難であると言わざるを得ない。
【０００４】
そこで、病人や老人、さらには、何らかの理由で運動不足に陥った健康者が生活の質を低下させる原因となる筋肉の萎縮を生じないように抑制する薬剤や補助食品の開発が、検討され、従来、いくつかの提案がなされている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、果実ポリフェノールを有効成分として含有する筋萎縮抑制組成物が提案されている。
【０００６】
また、特許文献２には、筋肉不使用症候群を治療あるいは予防する目的で、クレアチンを有効成分としたクレアチン経口補充療法剤が提案されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−０８９３８７号公報
【特許文献２】特表２００２−５３０３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献１に開示の筋萎縮抑制組成物は、運動不足などから誘引される廃用性筋萎縮に酸化ストレスが関与しているとの示唆情報に基づいて開発されたもので、抗酸化作用を有する果実ポリフェノールを有効成分として用いることにより原因と推定される酸化ストレスを低減して筋萎縮を抑制しようとする筋萎縮抑制剤である。しかしながら、筋萎縮の原因は、臨床的には、運動不足にあることはほぼ明らかであると考えられるが、生理的、病理的には、未だ明確になっていない。この特許文献１に記載のように酸化ストレスが筋萎縮を誘引する場合もあれば、他の原因に基づくものもあると考えられ、実際にかかる特定のポリフェノールの摂取によって全ての筋萎縮の抑制が可能であるわけではなく、効果的にも限界がある。
【０００９】
前記特許文献２に開示のクレアチン経口補充療法剤は、筋肉のエネルギー産生に重要な素材としてクレアチンを補充することにより、筋萎縮を含む筋肉不使用症候群を治療あるいは予防するための医療薬剤である。この医療薬剤は、老化に伴う運動能力の低下が身体のクレアチンレベルの低下に起因しているとの示唆情報に基づき開発されたものであり、クレアチンの経口補充によって、高齢者の運動能力を回復させ、筋肉の再生、維持を促進しようとするものである。しかしながら、筋萎縮の原因は、未だ十分に明らかになっているわけではないので、クレアチン補充以外の別のアプローチ法もありえる。
【００１０】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その課題は、筋萎縮抑制作用がより効果的かつ安全であり、長期に使用可能な筋萎縮抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために、本願発明者らが鋭意、実験、検討を重ねたところ、以下のような知見を得るに到った。
【００１２】
すなわち、長期に亘る摂取にも安全で、従来から高い筋萎縮抑制作用のある成分を、広く植物抽出物の群を対象にしてスクリーニングした。
その結果、田七人参や御種人参などのウコギ科人参に高い筋萎縮抑制作用があることを確認することができた。
【００１３】
また、ウコギ科人参の使用形態としては、特に限定されないが、抽出物として用いることが好ましい。そして、抽出物としては、水抽出によるものが良く、さらに、水による粗抽出物を有機溶媒を用いて洗浄して精製する工程を包含させると、もっとも高い筋萎縮抑制作用を有することが明らかとなった。
【００１４】
本発明における筋萎縮抑制作用は、筋肉量の減少、筋肉の最大強度の減少、最大能力の減少、筋弛緩時間の増加、早発性筋肉疲労、糖取り込み量低下、脂質量の増加、筋肉エネルギー保持力の低下、筋肉血流の減少、運動制御障害などの筋肉に生じる減退症状を低減もしくは予防する作用である。
【００１５】
周知のように、ウコギ科人参は、各種文献に様々な作用があること、そしてその作用に基づく適用例が開示されている。しかしながら、どの開示にも、ウコギ科人参に前述の筋萎縮を抑制する効果があることは記載も示唆もない。例えば、特開２００４−１８９６１９号公報には、オタネニンジン、サンシチニンジン、アメリカニンジンおよびトチバニンジンからなる群より選ばれる１種または２種以上とビタミンＢ類を含有する組成物が開示されているが、ここで開示されている人参の効果は、滋養、強壮効果であって、筋萎縮の抑制効果については、なんら記載がないばかりでなく、示唆すらされていない。
【００１６】
本発明者らは、多くの植物およびその抽出物を対象に、筋萎縮抑制作用を有するか否か、有する場合、どの程度の効果が期待できるのかについて、度重なるスクリーニングをした結果、前述のように、ウコギ科人参に格別顕著な筋萎縮抑制作用があることを知見するに到った。このウコギ科人参による筋萎縮抑制作用について、さらに、その作用機序について探究したところ、後述の実施例に示すように、筋肉細胞の増強を促す結果をもたらす筋芽細胞の増殖作用と分化作用の両作用を有しており、これら両作用に基づいて筋萎縮抑制作用がもたらされる可能性があることが知見された。
【００１７】
さらに、このウコギ科人参の筋萎縮抑制作用を助長する化合物の有無についても数多くのスクリーニングをしたところ、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの少なくとも１種類をウコギ科人参の抽出物に添加して併用することによりウコギ科人参が有する筋萎縮抑制効果が増強されることが確認された。
【００１８】
本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする。
本発明の筋萎縮抑制剤において、有効成分であるウコギ科人参の含有形態としては、水抽出物であることが好ましい。この水抽出物は、水を用いた粗抽出物をさらに有機溶媒を用いて洗浄して精製したものであることが好ましい。この場合の有機溶媒としては、８０〜１００％エタノールを用いることが好ましい。
また、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、好ましくは、さらにクレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも１種類を含有する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る筋萎縮抑制剤は、筋芽細胞の増殖作用および分化作用の両作用を有し、係る作用に基づいて優れた筋萎縮抑制効果を発揮するウコギ科人参を有効成分として含有している。したがって、本発明に係る筋萎縮抑制剤を適宜に摂取することにより、罹病や怪我などにより長期に亘り運動不足となる場合などに生じる筋萎縮を効果的に抑制し、筋萎縮により生活の質が損なわれることを低減もしくは予防することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
前述のように、本発明に係る筋萎縮抑制剤は、ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴としている。さらに、好ましくは、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドの内の少なくとも一種類を含有する。
【００２１】
本発明における筋萎縮抑制作用は、筋肉量の減少、筋肉の最大強度の減少、最大能力の減少、筋弛緩時間の増加、早発性筋肉疲労、筋肉エネルギー保持力の低下、筋肉血流の減少、運動制御障害などの筋肉に生じる減退症状を低減もしくは予防する作用である。この筋萎縮作用は、有効成分であるウコギ科人参によって効果的にもたらされる。このウコギ科人参の筋萎縮抑制作用は、ウコギ科人参が筋芽細胞の増殖を促進する作用と筋芽細胞の分化を促進する作用の両作用を有することに伴って得られるものと思われる。
【００２２】
前記筋芽細胞の増殖を促進する作用とは、培養筋芽細胞にサンプル水溶液を添加した場合の細胞増殖が無添加のものより優れていることを意味する。そしてこの筋芽細胞の増殖作用は、無添加と比較してどの程度増殖が促進されたかを測定することによって、その程度を評価することができる。
【００２３】
一方、前記筋芽細胞の分化を促進する作用とは、培養筋芽細胞にサンプル水溶液を添加した場合の細胞増殖が無添加のものと比較して分化が進んでいることを意味する。そして、この筋芽細胞の分化作用は、細胞のクレアチンキナーゼ活性を測定することによって、その程度を評価することができる。
【００２４】
次に、本発明の筋萎縮抑制剤の有効成分であるウコギ科人参と、任意の有効成分であるクレアチンとカゼイン分解ペプチドについて、個々に説明する。
【００２５】
本発明の筋萎縮抑制剤の必須有効成分として用いるウコギ科人参は、ウコギ科の草本植物として分類される周知の薬用植物である。このウコギ科人参としては、御種人参（朝鮮人参、高麗人参とも別称される）、田七人参などがある。
【００２６】
このウコギ科人参は、その根や根茎に特に有効成分を多く含んでいるので、その根や根茎部分を、原型に保った状態のまま、あるいは粉砕したもの、もしくは、さらに、溶媒抽出して濃縮した状態、乾燥して粉末とした抽出物の状態で使用することが望ましい。
【００２７】
使用する具体的な人参の抽出物としては、水抽出物が好ましく、その工程としては特に限定されるものではないが、人参（乾燥物）１重量に対して、１０倍から３０倍量の水を用いて、温度として４℃から２５℃、好ましくは１０℃から２０℃に保ちながら、２時間以上攪拌して有効成分を抽出するのが良い。通常、浸漬、攪拌することによって抽出を行い、得られる抽出物は、濾過、濃縮、凍結乾燥などの適当な処置を施して製剤化される。
【００２８】
さらに、上記の人参の抽出物から、抽出残査を分離する工程を包含することによって、筋萎縮抑制作用を向上し得る。残査分離の工程は、特に限定されるものではないが、濾過、遠心分離、有機溶媒洗浄など公知の方法によって実施される。好ましくは、エタノ-ルを用いた残査分離工程が用いられ、人参の水抽出物１重量に対して、１から３倍量の無水エタノールを添加してその残査から有効成分を得る。さらに、エタノ-ルを用いた残査有効成分の洗浄精製工程は、２回以上繰り返すのが有効成分の純化には好ましいが、５回以上の繰り返しは多量に溶媒が必要なことや収率の低下を招き不経済である。得られる抽出物は、通常、攪拌、遠心分離、ろ過、乾燥などの適当な処置を施して製剤化される。
【００２９】
ウコギ科人参として田七人参粉末を用いた場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、０．１ｇ／日から５０ｇ／日である。田七人参の水抽出物を用いた場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、５０ｍｇ／日から２５ｇ／日である。田七人参の水抽出物に無水エタノール洗浄工程を包含した場合、筋萎縮効果を得るための推奨摂取量としては、０．１ｍｇ／日から１００ｇ／日が好ましく、さらに好ましくは、１０ｍｇ／日から１０ｇ／日である。かかる範囲において、服用者の年齢、性別、健康状態によって、最適な摂取量、摂取方法、摂取回数、摂取期間を適宜に決めればよい。前記摂取量として１００ｇ／日より増やしても効果の増強は高原状態となるので不経済であり、０．１ｍｇ／日未満とすると、筋萎縮抑制効果が期待できなくなる。
【００３０】
本発明の任意有効成分として用いるクレアチンは、生体内に存在するアミノ酸の一種であり、食肉や水産物、哺乳類の乳から抽出したり、工業的に製造したりすることにより得られる。調製法に関しては数多くの研究がなされている。例えば、乳又は乳製品を限外濾過処理する工程で得られる透過液を原料とし、電気透析装置、イオン交換樹脂、ナノ膜濾過装置等を使用したクレアチンの分離・精製法が報告されている。また、工業的製造法は、サルコシンもしくはナトリウムサルコシネートまたはカリウムサルコシネートをシアナミドまたはＯ−メチルイソ尿素と反応させることによって行なわれ、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 第５版、第Ａ１２巻、第５５２頁、VCH-Verlagsgesellschaft,Weinheim (1987)ならびに、これらの中に引用された刊行物中に記載されている。
【００３１】
このクレアチンを本発明の筋萎縮抑制に添加して前記必須有効成分であるウコギ科人参抽出物と併用する場合の摂取量は、５ｇ／日から０．０５ｍｇ／日が好ましい。５ｇより増量しても効果の増加はわずかであるので不経済となる。また、０．０５ｍｇ未満とすると、所望の効果を得ることができなくなる。
【００３２】
また、本発明の任意有効成分として用いるカゼイン分解ペプチドは、カゼインのトリプシンやペプシン加水分解物から得られるもので、Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys（配列表）で表されるペプチドもしくはその酸付加塩を含有するものである。
【００３３】
前記カゼインは、広く食品添加物として用いられているカゼイン、例えば、牛乳由来のカゼイン、酸カゼイン、カゼイン塩類を用いることができる。トリプシン、ペプシンは市販のものを使用することができ、これらは、特公昭６０−２３０８５号公報、特公昭６１−５１５６２号公報に記載されている公知の加水分解法により得ることができる。
【００３４】
かかるカゼイン分解ペプチドとしては、具体的には、後述の実施例で使用したＣ１２ペプチド（ＤＭＶ社製）を挙げることができる。ここでいうＣ１２ペプチドとは、ミルクプロテインのカゼインを酵素分解して得られる１２個のアミノ酸からなるペプチドである。
【００３５】
このカゼイン分解ペプチドを本発明の筋萎縮抑制に添加して前記必須有効成分であるウコギ科人参抽出物と併用する場合の摂取量は、０．０５ｍｇ／日から５ｇ／日が好ましい。５ｇより増量しても効果の増加はわずかであるので不経済となる。また、０．０５ｍｇ未満とすると、所望の効果を得ることができなくなる。
【００３６】
本発明の筋萎縮抑制剤には、必須有効成分としてウコギ科人参を含有し、好ましくは、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドから選ばれる少なくとも一種類を任意有効成分として添加、併用するが、その場合の配合割合は、人参を抽出物として使用する場合では、人参抽出物を成分Ａ、クレアチンおよびカゼイン分解ペプチドから選ばれる少なくとも一種類を成分Ｂとして表すと、Ａ：Ｂ＝１：９〜５：５であり、この範囲に設定すれば、併用効果が高い。服用者への最も適切な配合比は、年齢、性別、健康状態などによって、適宜、決めればよい。
【００３７】
本発明の筋萎縮抑制剤の製剤化は、公知の製剤技術により行なうことができ、製剤中には適当な添加物も加えることができる。本発明の筋萎縮抑制剤は経口的に投与するか、経皮的に投与するのが望ましい。
【実施例】
【００３８】
以下に、本発明にかかる筋萎縮抑制剤の実施例を説明する。なお、以下に示す実施例は、本発明を説明するための好適な例示であり、なんら本発明を限定するものではない。
【００３９】
（実施例１）
松浦薬業株式会社製の田七粉１００ｇを２０００ｇの水に拡散し、１５℃に保ちながら３時間攪拌した。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって得た上清を、ろ過し、約１５倍に濃縮して田七人参水抽出物とした。
【００４０】
さらに、上記の田七人参水抽出物に、９５％エタノール（和光純薬社製）を体積で３倍量添加し、室温で２時間攪拌した後、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、沈殿物（水による粗抽出物）を得た。この沈殿物を無水エタノール（和光純薬社製）で２回洗浄し、吸引ろ過、室温乾燥後、エタノールによって洗浄精製された「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を得た。
松浦薬業株式会社製の田七粉１００重量％に対し、得られた田七人参水抽出物エタノール洗浄品（水抽出物洗浄精製物）は約２５重量％の収率であった。
【００４１】
上記実施例で得られた「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を用いて、筋肉培養細胞、筋萎縮モデル動物に対して行なった試験方法及びその結果を、以下の実施例２において説明する。
【００４２】
（実施例２）
この実施例２では、本発明に係る筋萎縮抑制剤を構成する必須有効成分であるウコギ科人参（下記サンプル１，２）と、ＩＧＦ−１（比較対照の下記サンプル３）とに対して、以下のように筋芽細胞の増殖促進効果について評価した。なお、比較に用いたＩＧＦ−１とは、インシュリン様成長因子−１であり、筋芽細胞増殖作用を示す医薬品である。
【００４３】
対象とする筋芽細胞として、大日本住友製薬社製のマウス由来筋芽細胞（商品名「Ｃ２Ｃ１２」）を用いた。また、必須有効成分のサンプル１として松浦薬業株式会社製の「田七人参エキス末」を、サンプル２として上記実施例１で得た「田七人参水抽出物エタノール洗浄品」を、比較サンプル３として上述のＩＧＦ−１を用意した。また、培地は、インビトロジェン社製のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いた。
【００４４】
５×１０４個の前記筋芽細胞を４００μＬの培地（１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ）に縣濁し、２５ウェル・プレートに播種後、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間培養して定着させた。
【００４５】
その後、評価用の培地［０．５％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシン、各サンプル１〜３を含有したＤＭＥＭ］４００μＬに交換した。各サンプル１〜３の評価濃度を終濃度で０．１、１、１０、１００ｐｐｍとした。各サンプル１〜３について１％の水溶液（疎水性のサンプルはエタノール溶液）を調製し、終濃度となるように適宜添加した。
【００４６】
前述の培地を２日間培養後、培地を抜き取り、１０％アラマーブルー、０．５％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μg／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭを２００μＬ添加し、３時間培養後、蛍光プレートリーダーにて蛍光値（Ｅｘ５４４，Ｅｍ５９０）を測定（蛍光強度が細胞数と比例）した。
相対増殖度は、以下の式（１）にて算出して求めた。
（相対増殖度）＝（サンプル添加時の蛍光強度）÷（サンプル無添加の蛍光強度）
・・・（１）
【００４７】
サンプル無添加の蛍光強度１．００に対して各サンプル添加による蛍光強度を測定した。サンプル３（ＩＧＦ−１）を添加したものの蛍光強度が１.４８であったのに対して、サンプル１（田七人参エキス末）を添加したものの蛍光強度は１.３６であり、サンプル２（田七人参水抽出物エタノール洗浄品）を添加したものの蛍光強度は１.４０であり、田七人参（サンプル１，２）の筋芽細胞増殖作用は、効果の高い医薬品であるＩＧＦ−１（サンプル３）添加の場合とほぼ同等であることが確認された。
【００４８】
（実施例３）
この実施例３では、本発明に係る筋萎縮抑制剤を構成する必須有効成分であるウコギ科人参に対して、以下のように筋芽細胞の分化促進効果について評価した。
【００４９】
対象とする筋芽細胞として、大日本住友製薬社製のマウス由来筋芽細胞（商品名「Ｃ２Ｃ１２」）を用いた。また、評価用サンプルとして、前記サンプル１及びサンプル２に加えて、比較サンプル４としてクレアチン（デグサバイオアクティブス社製の「クレアチンシトレート（商品名）」）を用意した。また、培地は、インビトロジェン社製のＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いた。
【００５０】
１２ウェル細胞培養プレートに前記筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を播種し、培養液ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬにて、９０％コンフルエントまで培養した。前記筋芽細胞をＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬにて２回洗浄した後、ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍＬに、下記（表２）に示した、１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００００ｐｐｍの評価用サンプル１，２及び比較サンプル４を、１０μＬ添加して、終濃度１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍの評価用培養液とした。
【００５１】
上記各評価用培養液に対して、３日後に同じ培養液で培地交換を行い、５日間培養して分化を誘導した。各サンプルは、蒸留水またはエタノールに１％濃度で溶解してフィルター滅菌し、ＤＭＥＭ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシンにて、１倍、１０倍、１００倍に希釈し、それぞれ１００００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００ｐｐｍ溶液とした。
【００５２】
筋芽細胞の分化の程度を定量化するために、文献（Z-Q cheng, Jornal of Endcrinology, 167, 175-182 (2000)）において分化マーカーとして利用されているクレアチンキナーゼ活性を測定した。クレアチンキナーゼ活性は、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を１％添加したＣｅｌｌｙｔｉｃ Ｍ（シグマ社）１００μＬにて細胞を溶解し、遠心上清をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて１００倍希釈したものをサンプルとして、ＣＰＫＩＩテストワコー（和光純薬株式会社製）の方法に従って測定した。評価用の各サンプルの効果を示す指標として、分化促進率（＝成分サンプル添加時のクレアチンキナーゼ活性／無添加時のクレアチンキナーゼ活性）を用いた。
【００５３】
測定された分化促進率は、田七人参エキス末のサンプル１では、１.１０倍であり、田七人参水抽出物エタノール洗浄品のサンプル２では、１．３６倍であり、比較サンプル４のクレアチンサンプルでは１.２５倍であり、ウコギ科人参（サンプル１，２）に筋芽細胞分化促進作用があることが、確認された。
【００５４】
（実施例４）
この実施例では、本発明に係る筋萎縮抑制剤の筋萎縮予防効果について評価した。
ラット（ウイスター系、♀、８週齢、各群１０匹）へ、標準餌ＡＩＮ−９３Ｇ（日本ＳＬＣ社製）に１％の割合で下記（表１）に示す評価用サンンプル１，１Ａ，２，２Ａ，２Ｂ，５，および６を添加したものを、１日１５ｇづつ３週間摂取させた。
【００５５】
ウコギ科人参としては、松浦薬業株式会社製の田七人参エキス末（サンプル１）と、田七人参粉末（サンプル１Ａ）と、御種人参エキス末（サンプル５）、田七人参水抽出物エタノール洗浄品（サンプル２、２Ａ、２Ｂ）とを用いた。また、クレアチンとしては、デグサバイオアクティブス社製のクレアチンシトレート（サンプル２Ａ）を用い、カゼイン分解ペプチドとしては、ＤＭＶ社製のＣ１２ペプチド（サンプル２Ｂ）を用い、果実ポリフェノールとしてはキッコ-マン株式会社製のグラヴィノ-ルスーパー（比較サンプル６）を用いた。これに対して、対照群には１％コーンスタ-チ（日本ＳＬＣ社製）を混ぜた標準餌を摂取させた。
【００５６】
試験開始１週間目から試験終了最終日（試験開始から１４日目）まで、ラットの右後肢をギプス固定し、筋萎縮を誘導した。試験終了最終日に右後肢を解剖し、ヒラメ筋の湿重量を測定した。筋萎縮率は、対照群の左後肢ヒラメ筋湿重量を１００としたときの右後肢ヒラメ筋湿重量平均相対値により求めた。測定結果を下記（表１）に併記した。
【００５７】
【表１】
【００５８】
（表１）から明らかなように、本発明の評価サンプル１，２，２Ａ，２Ｂ，５は、対照群および比較サンプル６に比べて、筋萎縮予防効果が高い。そして、本発明の評価サンプル１，２，２Ａ，２Ｂ，５のなかでも、田七人参水抽出物エタノール洗浄品（サンプル２）の筋萎縮予防効果が高く、さらに田七人参水抽出物エタノール洗浄品にＣ１２ペプチドを併用したサンプル２Ｂやクレアチンを併用したサンプル２Ａでは、さらに高い筋萎縮予防効果が得られることが確認された。
【００５９】
本発明の筋萎縮抑制剤の使用形態としては、経口剤または皮膚外用剤として用いることが好ましい。以下に、本発明の筋萎縮抑制剤を経口剤として用いた配合例（２例）、皮膚外用剤として用いた配合例（２例）とを例示する。
【００６０】
（配合例１：内服液（経口剤））
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：１０００ｍｇ、江崎グリコ（株）製「αＧヘスペリジン」：１０００ｍｇ、ビタミンＢ1硝酸塩：１０ｍｇ、アスコルビン酸：５００ｍｇ、マルチトール：１５０００ｍｇ、ビタミンＢ6：１０ｍｇ、イノシトール：５０ｍｇ、無水カフェイン：２０ｍｇ、リンゴ酸：１５０ｍｇ、クエン酸：７００ｍｇ、クエン酸ナトリウム：適量、グリセリン：６０ｍｇ、安息香酸ナトリウム：７０ｍｇ、および香料：微量を内服液成分とし、これらを精製水に混合し、溶解して、１００ｍｌの内服液（ｐＨ＝４．５）を得た。
【００６１】
（配合例２：タブレット（経口剤））
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：２０ｇ、ゼラチン：１３０ｇ、グリセリン：７０ｇ、水：１００ｇ、およびパラオキシ安息香酸エチル：０．５ｇを、加熱し攪拌して、均一なゼラチン分散液（Ｌ１）を得た。
一方、酵素分解レシチン：１００ｇとグリチルリチン酸ジカリウム：０．４ｇを、小麦胚芽油：２００ｇにホモミキサーを用いて分散させて均一な溶液状の小麦胚芽油液（Ｌ２）とした。
上記ゼラチン分散液（Ｌ１）を直径１２ｍｍのアルミ製のカプセル用の型に押し出し、ゼラチンカプセルを得た。
次いで、小麦胚芽油液（Ｌ２）をノズルによって押し出して前記ゼラチンカプセル内に注入し、充填、冷却、乾燥した。これにより液状の小麦胚芽油液（Ｌ２）の充填されたゼラチンのゲル状外層を有する固形製剤（タブレット経口剤：ゲル状組成物）を得た。
【００６２】
上記固形製剤１個あたりの組成および組成量を以下に示す。
ゼラチン：１３０ｍｇ（外層）
グリセリン：７０ｍｇ（外層）
パラオキシ安息香酸エチル：０．５ｍｇ（外層）
αＧヘスペリジンＰＳ：２０ｍｇ（筋萎縮抑制成分）
酵素分解レシチン：５０ｍｇ：（矯味、矯臭成分）
グリチルリチン酸ジカリウム：０．５ｍｇ（矯味、矯臭成分）
小麦胚芽油 １００ｍｇ：（内層）
以上、合計：３７１ｍｇ
【００６３】
（配合例３：貼付液（皮膚外用剤））
下記に示す油層成分および水層成分を用意した。
以下の配合量（数字）は特に断りがなければ、質量（％）を表す。
（水層成分）
田七人参水抽出物エタノール洗浄品：５．０ｇ、セトステアリルアルコール：４．０ｇ、モノステアリン酸グリセリン：２．０ｇ、ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート：２．０ｇ、グリコ-ル酸：０．２ｇ、サリチル酸：０．１ｇ、局方イオウ：５．０ｇ、ジグリセリン：５．０ｇ、レゾルシンーラボナイト複合体：１．０ｇ、水酸化ナトリウム：適量。
（油層成分）
スクワラン：１０．０ｇ、流動パラフィン：３．０ｇ、蜜ロウ：２．０ｇ。
香料：微量、精製水：バランス。
【００６４】
上記油層成分および水層成分を別々に７０℃で加熱した後、混合し乳化した。これを冷却しながら途中で香料を加えて、さらに室温まで冷却し、１００ｇの貼付液（皮膚外溶剤）を得た。
【００６５】
（配合例４：貼付剤シート（皮膚外用剤）
ポリエチレングリコール４００（質量平均分子量４００）：１０．００ｇ、田七人参水抽出物エタノール洗浄品：３．７５ｇ、Ｌ−メントール：２．００ｇを混合溶解して混合溶液（Ｌ３）：１５．７５ｇを得た。
次に、１５０℃に加熱したゴム系粘着剤ＳＩＳ（商品名「クレイトンＤ−１１０７」、クレイトンポリマージャパン社製）：７３．７ｇに対して、脂環族炭化水素（商品名「アルコンＰ−１００」、荒川化学社製）を１１０．５５ｇの割合で混合して、粘着成分（Ｍ）：１８４．２５ｇを得た。
次に、上記混合溶液（Ｌ３）：１５．７５ｇと、上記粘着成分（Ｍ）：１８４．２５ｇとを加えて混合し、膏体組成物：２００ｇを得た。
次いで、上記膏体組成物を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ、ライナー）上に、塗工量（膏体質量）が乾燥後に１００ｇ／ｍ２になるようにホットメルト法により塗工して、シート状の膏体を得た。
最後に、ポリウレタンフィルム／ポリエステルニット積層支持体（ニット目付け：３０ｇ／ｍ２、厚さ：１８０μｍ、透湿度：２２００ｇ、透明度：４９）を用いて、上記膏体の膏面を被覆し、貼付剤シートを得た。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように、本発明にかかる筋萎縮抑制剤は、筋芽細胞の増殖作用および分化作用の両作用を有し、係る作用に基づいて優れた筋萎縮抑制効果を発揮するウコギ科人参を有効成分として含有している。したがって、本発明に係る筋萎縮抑制剤を適宜に摂取することにより、罹病や怪我などにより長期に亘り運動不足となる場合などに生じる筋萎縮を効果的に抑制し、筋萎縮により生活の質が損なわれることを低減もしくは予防することが可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする筋萎縮抑制剤。
【請求項２】
前記ウコギ科人参を水抽出物の形態で含有することを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項３】
前記ウコギ科人参の水抽出物は水によるウコギ科人参の粗抽出物が有機溶媒により洗浄されて精製されたものであることを特徴とする請求項２に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項４】
前記有機溶媒が８０〜１００％エタノールであることを特徴とする行なわれる請求項３に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項５】
前記ウコギ科人参が田七人参であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項６】
さらに、クレアチン、カゼイン分解ペプチドから選ばれる一種または二種以上を含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項７】
前記カゼイン分解ペプチドを含む場合のカゼイン分解ペプチドがＣ１２ペプチドであることを特徴とする請求項６に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項８】
経口又は皮膚外用であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項１】
ウコギ科人参を有効成分として含有することを特徴とする筋萎縮抑制剤。
【請求項２】
前記ウコギ科人参を水抽出物の形態で含有することを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項３】
前記ウコギ科人参の水抽出物は水によるウコギ科人参の粗抽出物が有機溶媒により洗浄されて精製されたものであることを特徴とする請求項２に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項４】
前記有機溶媒が８０〜１００％エタノールであることを特徴とする行なわれる請求項３に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項５】
前記ウコギ科人参が田七人参であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項６】
さらに、クレアチン、カゼイン分解ペプチドから選ばれる一種または二種以上を含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項７】
前記カゼイン分解ペプチドを含む場合のカゼイン分解ペプチドがＣ１２ペプチドであることを特徴とする請求項６に記載の筋萎縮抑制剤。
【請求項８】
経口又は皮膚外用であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の筋萎縮抑制剤。
【公開番号】特開２００８−１７９６２０（Ｐ２００８−１７９６２０Ａ）
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３０６８１（Ｐ２００７−３３０６８１）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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