糖脂質を用いた、脂質系アジュバント製剤を安定化する組成物及び方法
【課題】
【解決手段】本発明は、物理的に安定なリポソーム製剤に関する。特に、本発明は、リポソーム内に糖脂質を組み込むことによるカチオン性リポソームの立体安定化に関する。安定化したリポソームは、抗原性成分のためのアジュバントとして、又は薬物送達システムとして用いることができる。特に、本発明は、免疫感作のための水性媒体アジュバントを用いたワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【解決手段】本発明は、物理的に安定なリポソーム製剤に関する。特に、本発明は、リポソーム内に糖脂質を組み込むことによるカチオン性リポソームの立体安定化に関する。安定化したリポソームは、抗原性成分のためのアジュバントとして、又は薬物送達システムとして用いることができる。特に、本発明は、免疫感作のための水性媒体アジュバントを用いたワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物理的に安定しているリポソーム製剤に関する。具体的には、本発明は、それによって糖脂質をリポソームの中に組み込む独特のフィルム法による、カチオン性リポソームの立体安定化に関する。安定化されたリポソームは、抗原性成分のアジュバントとして、又は薬物送達システムとして用いることができる。具体的には、本発明は、免疫感作のための、水性媒体中にアジュバントを含むワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症に対し免疫を産生するためにヒトに使用された最初のワクチンは、生きている、弱毒化病原体であった。弱毒化病原体の型は、自然に発生した近縁種であるか、又は連続継代培養で得られたものである。一つの例は、弱毒化されてはいるが生きているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ株を用いたワクチン（ＢＣＧワクチン）により有効である結核である。しかし、この処置の効力が、全ての集団のヒト結核症に対し十分な抵抗力を必ずしも与えるとは言えない。それゆえに、結核及びその他の感染症に対する免疫を生成する、新規の有効な方法が求められている。特に有望な方法は、初期分泌標的抗原（ＥＳＡＴ−６）及び抗原８５（Ａｇ８５）のような免疫優性抗原の組換え型を単離してワクチンとして使用することである。これらのワクチンは明確に定義され、副作用は最小限である。残念なことに、多くの、高度に精製された物質、例えば精製組換えタンパク質は、それほど免疫原性は高くなく、実際の感染症に対し防御する、効果的な免疫反応を起こさない。この事実は周知であり、該物質を、いわゆるアジュバントと組み合わせることによって免疫原特性を高める試みが多くなされている。病原菌によっては、防御は、優位的な液性反応又は細胞性反応を必要とする。特異的な免疫反応（液性又は細胞性）の発生は、アジュバントの選択によって決まる場合がある。
【０００３】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような細胞内病原菌に対する防御免疫は、細胞性免疫反応を必要とし、ＴＢに直接作用させるサブユニットワクチンに好適なアジュバントはＴｈ１反応を高める（Ｌｉｎｄｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＴＢに対する免疫では、抗体が重要は役割を果たしておらず、一方細胞性のＩＦＮ−ガンマ（インターフェロンガンマ）の放出は、防御に関与する、最も重要なサイトカインであると一般には信じられている（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｋａｕｆｍａｎｎ，２００１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞性免疫反応を誘導する数多くのアジュバントが提案されているが、一般的には全ての点に関して理想的なものはない。
【０００５】
細胞性免疫反応を促進する特に有効なタイプのアジュバントの１つは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）のような第四アンモニウム化合物である（Ｈｉｌｇｅｒｓ ａｎｄ Ｓｎｉｐｐｅ，１９９２）。ＤＤＡは、親水性の、正に帯電したジメチルアンモニウム頭部基と２本の長い疎水性のアルキル鎖とを含む合成両親媒性物質である。水性環境においてＤＤＡは自己集合し、中性リン脂質からできたリポソームに類似する小胞性の二重層を形成する。ＤＤＡとその他の免疫調節剤との組み合わせが記載されている。ＤＤＡを含むＡｒｑｕａｒｄ ２ＨＴのヒトへの投与は有望であり、顕著な副作用は誘導しない（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの培養液濾過タンパク質及びＤＤＡに基づく実験ワクチンは、マウスのＴＢに対し防御免疫反応を生成した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，１９９４）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質ＥＳＡＴ−６とＡｇ８５Ｂの融合タンパク質、及びＤＤＡ／ＭＰＬをアジュバントとして用いたマウスへのワクチン接種は、ＢＣＧワクチン接種により得られたものに類似した防御を提供する（Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらの研究は、たとえばミョウバンとは異なり、ＤＤＡ系アジュバントがマウスにおいてＴＢに対する防御免疫反応を誘導できることを証明している。更には、ＤＤＡは、Ｔ細胞反応及び抗ウイルス免疫を高める、仮性狂犬病ウイルスに対するＤＮＡワクチン用のアジュバントとして用いられている（ｖａｎ Ｒｏｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０００６】
熱死菌を基にしたＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓワクチン用のアジュバントとして、ＤＤＡ溶液へのＴＤＭ（アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート）の油乳剤の追加について、Ｗｏｏｄａｒｄら（１９８０）によって研究された。ＤＤＡ単独又はＤＤＡとＴＤＭとの混合物のいずれも防御を誘導できなかった。可溶性タンパク質抽出物を基にしたＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓサブユニットワクチンに関する別の研究では、ＤＤＡとＴＤＭの組み合わせもアジュバントとして用いられ（Ｄｚａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、この混合物が、ＤＤＡ単独に比べて観察される免疫反応（抗体レベル、皮膚試験反応、及びＩＬ−２レベル）を高めることが見いだされた。Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）は、ＤＤＡリポソームとＴＤＢ（アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘナート）懸濁液との組み合わせについて研究し、ＥＳＡＴ−６抗原をこのアジュバント混合物と一緒に投与すると、ＤＤＡリポソームの形でＥＳＡＴ−６を投与した場合より有意に高い、結核に対する強力な防御免疫反応を誘導することを見いだした。
【０００７】
残念なことに、ＤＤＡ単独又は、上記のようなＤＤＡとＭＰＬ、ＴＤＭ若しくはＴＤＢとの混合物といった、親水性の第四アンモニウム化合物の懸濁液は物理的に不安定であり、凝集及び沈殿を発生させることなしに４℃で長期保存することはできない。沈殿形成は調合物の臨床使用を妨げるため、ＤＤＡ製剤の安定性欠如は、これまでヒト応用への大きな障害となってきた。
【０００８】
英国特許第２１４７２６３−Ａ号においてＴａｋａｈａｓｈｉ及びＴｓｕｊｉは、２種類の第四アンモニウム化合物を一緒に混合するか、又は各種界面活性剤を第四アンモニウム化合物に加えることによる第四アンモニウム化合物の小胞の安定化を記載している。
【０００９】
米国特許第５，０２６，５４６号においてＨｉｇｅｒｓ及びＷｅｓｔｓｔｒａｔｅは、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸のポリマーを用いたＤＤＡアジュバント懸濁液の安定化を記載している。
【００１０】
細胞のトランスフェクションのためのカチオン性脂質−プロタミン−ＤＮＡ複合体の凍結乾燥がＬｉら（２０００）によって記載されている。単糖類及び二糖類のような従来からある凍結防止剤を加える効果が検討され、単糖類に比べると、二糖類が粒子サイズを良好に保存することが見いだされた。また、１０％のスクロースによって安定化された凍結乾燥していない、脂質−プロタミン−ＤＮＡ複合体も、４℃で８週間の保存後でも安定した粒子サイズを維持したが、トランスフェクション効率は、凍結乾燥されていないサンプルに比べ、凍結乾燥されたサンプルで高かった。
【００１１】
米国特許第５９２２３５０号は、リポソームを脱水する前にトレハロース及びスクロースといった糖を加えることによる、例えばリン脂質を基にしたリポソームの保管期間を延長する方法を記載している。更には、この特許は、濃度勾配及び脱水−再水和のプロセスの組み合わせによって、事前に作成し保管しておいたリポソームを後から加えることができるようになることも記載している。
【００１２】
ポリエチレングリコール誘導体で安定化された薬物送達のためのリン脂質のリポソーム（融合性リポソーム）は国際特許出願ＷＯ９６／１０３９２号に記載されている。国際特許出願ＷＯ０２／０３９５９号に記載されている別の薬物送達製剤は、カチオン性リポソーム及び中性リポソームを含み、各リポソーム群がそれぞれ同一又は別種の治療薬を担持する製剤を開示している。
【００１３】
好適なリポソームの調製方法が、Ｂａｎｇｈａｍにより記載されている（Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９６５）。この調製は、リン脂質を有機溶媒に溶解し、次に蒸発させて、試験管の内側に薄い脂質フィルムが残るまで乾燥させることを含む。次に乾燥脂質フィルムは適当量の水相に水和され、混合物を脂質の相転移温度を越えるまで加熱し、「膨潤」させる。こうして得られた、多重層小胞（ＭＬＶ）を構成するリポソームを、試験管を振盪することによって分散する。小胞二重膜を構成する脂質は、疎水性の炭化水素「尾部」が二重層の中心に向かい、一方親水性の「頭部」は内側及び外側の水相に向かうように配置される。この調製は、超音波（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９６７）又はＣｕｌｌｉｓらが米国特許第５，００８，０５０号に記載するような押し出しといった方法により単層小胞（ＵＶ）を生成する基盤を提供する。
【００１４】
小胞の調製に用いられる別の技術は、ＳｚｏｋａとＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓによって導入された逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｓ，１９７８、米国特許第４，２３５，８７１号）である。この技術は、有機溶媒、及びカプセル化対象となる物質を含有する水性緩衝液の中で、脂質の油中水型乳剤を形成させることからなる。減圧下で有機溶媒を除去すると、粘性のゲルが生じる。このゲルは圧潰すると、脂質小胞の水性懸濁液が形成される。
【００１５】
Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｂｅｉｒｏ及びＣｈａｉｍｏｖｉｃｈが記載した別の方法（Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｂｅｉｒｏ ａｎｄ Ｃｈａｉｍｏｖｉｃｈ，１９８３）は、所望の脂質の有機溶液、例えばクロロホルム、メタノール、エタノールの溶液を、水性緩衝液内に注入することを必要とするが、この場合溶媒が蒸発するときに、脂質は自発的にリポソームを形成する。
【００１６】
リポソームは、Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）がＤＤＡについて記載している、水性緩衝液のリポソーム形成化合物の懸濁液を例えば、間欠的に振盪しながら８０℃に２０分間加熱して、その後室温まで冷却する水熱法によっても調製できる。
【００１７】
Ｗｏｏｄａｒｄら（１９８０）、Ｄｉｚａｔａら（１９９１）及びＨｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）が用い、記載している上記の「水熱法（ａｑｕｅｏｕｓ ｈｅａｔ ｍｅｔｈｏｄ）」は、ＤＤＡ及びＴＤＢの溶液を安定化しない。
【００１８】
一つの、特に好ましい方法では、タンパク質抗原は事前に形成された小胞の中に、水相内のオリゴヌクレオチド、ペプチド又はタンパク質を、凍結乾燥後に凍結乾燥リポソームを再水和することによってカプセル化する脱水−再水和法（Ｋｉｒｂｙ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８４）によってカプセル化される。
【００１９】
或いは、抗原はＰｉｃｋ（Ｐｉｃｋ、１９８１）が記載する、及び米国特許第４，９７５，２８２号内にＢａｌｌｙらによって記載された凍結融解法を用いて組み込まれる。この技術では、小胞はタンパク質抗原と混合され、液体窒素中での急速凍結と、当該脂質の主相転移温度を超える温度までの加温とが繰り返される。小胞をさらに処理し、カプセル化されなかった抗原を、例えば洗浄及び遠心分離によって除いてもよい。
【００２０】
ＴＤＢ及びマイコバクテリアの細胞壁から単離されたコード因子、ＴＤＭのようなアシル化グリコシドがリン脂質小胞間の融合を阻止することが示されている（Ｓｐａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。親水性トレハロース部分は、小胞の表面に固定化しやすく、従って、融合にとって重要な一次障害である水和力を向上させる。或いは、固定されたトレハロース部分は、融合に対し立体障害として機能するかもしれない（Ｓｐａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【００２１】
現在、リン脂質からできた（ＴＤＢを含まない）リポソームは、例えばインフルエンザワクチン（Ｂｅｎ−Ｙｅｈｕｄａ ｅｔ ａｌ，２００３）においてアジュバントとして実験的に用いられている。別の例は、インフルエンザに対するＩＭＵＸＥＮ（商標）リポソームワクチンである（Ｌｉｐｏｘｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００２２】
第四アンモニウム化合物、特にＤＤＡは効果的なワクチンアジュバントとして非常に有望な候補であるが、水溶液の中では物理的に安定しておらず、保存中に凝集して沈殿するという大きな欠点があることから、形成した小胞を安定化させることが強く求められている。本発明は、ＤＤＡのようなカチオン性脂質から構成されるアジュバント製剤を安定化させる新規の方法を記載する。これに加えて、この方法により、本製剤のアジュバント効果は高められる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、糖脂質、例えば、アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）のようなアシル化グリコシドを、ＤＤＡ、ＤＯＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ又はＤＯＴＭＡのような親水性第四アンモニウム化合物から作られたリポソーム二重層内に組み込むことによって、カチオン性リポソーム懸濁液を安定化させる組成物及び方法を開示する。糖脂質の、強力に水和された糖頭部基はリポソーム二重層全体の水和度を高め、これが第四アンモニウムの頭部基の脱水、及びカチオン性小胞の電荷反発力の低下による凝集を防ぐ。このＤＤＡの安定化は、糖、例えばトレハロース又はスクロースを加えるだけで、又は第四アンモニウム化合物と糖脂質を単純に混合するだけでは得られない。本発明はまた、これら安定化したリポソームのワクチンアジュバントとしての使用も開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、糖脂質を用いた、水性製剤中のカチオン性リポソームを安定化させる新規の方法を開示する。カチオン性リポソーム、例えば両親媒性第四アンモニウム化合物から作られたものは、リポソームの膜内に糖脂質を組み込むことによって安定化される。
【００２５】
本発明の好ましい態様は、第四アンモニウム化合物がジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）又はジメチルジオクタデセニルアンモニウム（ＤＯＤＡ）化合物のブロミド塩、クロリド塩、硫酸塩、リン酸塩又はアセテート塩である場合である。
【００２６】
別の好ましい第四アンモニウム化合物は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）である。
【００２７】
リポソームを安定化する糖脂質は、アルファ，アルファ’−トリハロース６，６’ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ，アルファ’−トリハロース６，６’ジミコレート（ＴＤＭ）が好ましい。製剤での糖脂質のモル百分率は、０．５〜９５モル％でよいが、好ましくは２．５〜約２０モル％であり、より好ましくは約５〜約１８モル％である。
【００２８】
本発明はまた、これら安定化したリポソームのアジュバント、例えばワクチン組成物での使用のためのアジュバントとしての使用も示す。具体的には、本発明は免疫感作のための、アジュバントを加えた水性媒体ワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【００２９】
本発明はまた、ワクチンが、たとえば結核、マラリア、クラミジア等のいずれの疾患に対しても効果がある場合のワクチンアジュバントとしての使用する上記の方法によって安定化されたリポソーム生成物を開示する。
【００３０】
「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」は、水性核を取り囲む、１つ又はそれ以上の脂質二重層から出来た閉鎖小胞構造物として定義される。各脂質二重層は、２つの脂質単層からなっており、それぞれが疎水性の「尾部（ｔａｉｌ）」領域と親水性の「頭部（ｈｅａｄ）」領域を有している。二重層では、脂質単層の疎水性「尾部」は二重層の内側に向いており、一方疎水性の「頭部」は二重層の外側に向いている。リポソームは、サイズ、脂質組成、表面電荷、流動性及び二重層膜の数などの様々な物理化学特性を有することができる。脂質二重層の数に基づいて、リポソームは単一脂質相を含む単層小胞（ＵＶ）、又は水の層によって相互に隔てられている２又はそれ以上の同心的な二重層を含む多重層小胞（ＭＬＶ）に類別できる。水溶性化合物は水相／リポソームの核内に閉じこめられ、反対に脂溶性化合物は脂質二重層膜の核内に閉じこめられる。
【００３１】
「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅｓ）」は、両親媒性分子のコロイド凝集体として定義され、それは臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）として知られる、明確に定義されている濃度で生ずる。ミセル内の凝集分子の典型的な数は５０〜１００である。ミセルは、炭化水素の尾部が中心に向かい、極性の頭部が外部水環境に向かうように配置された界面活性剤分子からなる球体でよい。他の可能な構造としては、逆転ミセル及び円筒ミセルが挙げられる。
【００３２】
用語「カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）」は、合成脂質及び脂質類似体を含み、疎水性の極性頭部部分を持ち、生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有し、それ自体が水中において自発的に二重層小胞又はミセルを形成できる、両親媒性脂質を包含するものである。
【００３３】
本発明で用いられる、１つの特に好ましいタイプのカチオン性脂質は、一般式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４−Ｘを有する第四アンモニウム化合物であり、このときＲ１及びＲ２はそれぞれ独立に、１〜３個の炭素原子を含有する短鎖アルキル基であり、Ｒ３は独立に、水素若しくはメチル基、又は１２〜２０個、好ましくは１４〜１８個の炭素原子を含有するアルキル基であり、並びにＲ４は独立に、１２〜２０個の炭素原子、好ましくは１４〜１８個の炭素原子を含有する炭化水素基である。Ｘは薬学的に許容されるアニオンであり、それ自体無毒である。このようなアニオンの例は、ハロゲン化アニオン、クロリド、ブロミド及びヨードである。硫酸及びリン酸のような無機アニオン、又は酢酸のような単純な有機酸に由来する有機アニオンも用いてもよい。Ｒ１基及びＲ２基は、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基でよく、このときＲ３は水素、メチル基又はドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基でよく、並びにＲ４はドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基でよい。しかしながら、Ｒ３基及びＲ４基は分岐側鎖を持たずに飽和していることが好ましいが、それらはわずかな程度であれば分岐して、例えばメチル及びエチル側鎖を持ってもよいため、他のＣ１２〜Ｃ２０の炭化水素基であってもよい。Ｒ３及びＲ４はまた、極低い不飽和度を有してもよく、例えば１〜３個の二重結合をそれぞれ持つことができるが、好ましくは、それらは飽和アルキル基である。カチオン性脂質は、最も好ましくは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド若しくはクロリド（ＤＤＡ−Ｂ又はＤＤＡ−Ｃ）或いはその硫酸塩、リン酸塩若しくはアセテート塩（ＤＤＡ−Ｘ）又はジメチルジオクタデセニルアンモニウムブロミド若しくはクロリド（ＤＯＤＡ−Ｂ若しくはＤＯＤＡ−Ｃ）又はその硫酸化合物、リン酸化合物若しくはアセテート化合物（ＤＯＤＡ−Ｘ）である。別のタイプの、本発明での使用に好ましいカチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）である。
【００３４】
カチオン性リポソームは、リポソーム膜内に糖脂質を組み込むことによって安定化される。組み込みは、分子の疎水性領域及び親水性領域を、膜、ミセル、リポソーム又は二重層の対応する疎水性及び親水性領域又は分子部分内に、しっかり固定する手順を意味する。リポソーム内に糖脂質を組み込むための手順は、「薄フィルム法」、「逆相蒸発法」及び「有機溶液注入法」、並びにリポソーム膜内への糖脂質組み込みに同一の効果を有する将来−現時点では未知の方法でもよい。現在知られている全ての方法は、発明の背景の章に記されている。本発明にとって最も好ましい方法は、薄フィルム法である。
【００３５】
糖脂質は、長鎖脂肪酸、アシルグリセロール、スフィンゴイド、セラミド又はプレニルホスフェートのような疎水性部分と、グリコシド結合によって結合している１又はそれ以上の単糖残基を含有する化合物として定義される。本発明の糖脂質は、合成、植物若しくは微生物起源、例えばマイコバクテリア起源のものでよい。
【００３６】
本発明に用いられる１つの分類の糖脂質は、アシル化（又はアルキル化）グリコシドであり、それは１つ、２つ又は３つの脂肪酸にエステル化した１つ又は２つの糖残基からなる。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばミリスチン酸Ｃ１４：０、ペンタデカン酸Ｃ：１５、パルミチン酸Ｃ１６：０、ヘプタデカン酸Ｃ１７：０、ステアリン酸Ｃ１８：０、ノナデカン酸Ｃ：１９、アラキジン酸、Ｃ：２０、ヘンエイコサンＣ２１：０、ベヘン酸Ｃ：２２、及び不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸Ｃ１８：１ｎ−９、リノール酸Ｃ１８：２ｎ−６、又はミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸、エポキシミコール酸、及びコリノミコール酸（ｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）のような複合分岐脂肪酸を含む、いずれかの直鎖でよい。糖残基は、単糖類、例えばグルコース及びフルクトース、又は２つの共有結合した単糖を含む二糖類、例えばグルコースとフルクトースからなるスクロース、及び２つのグルコース単位がグリコシド結合により連結したトレハロースのいずれかでよい。本発明で用いる１つのタイプの糖脂質は、マイコバクテリアから単離される細胞壁糖脂質であり、１つ、２つ又は３ついずれかの、標準のパルミチン酸、Ｃ１６：０；オレイン酸、Ｃ１８：１ｎ−９；リノール酸、１８：２ｎ−６又は複合ヒドロキシ、分岐鎖脂肪酸、即ち長さ６０〜９０炭素原子の範囲のミコール酸残基にエステル化した二糖からなる。本発明で用いられる別の細菌糖脂質は、より短い脂肪酸鎖を有する、例えばコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から単離されるコリノミコール酸（ｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（２２〜３６炭素）又はノカルドミコール酸（ｎｏｃａｒｄｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（４４〜６０炭素）酸である。好ましいマイコバクテリア糖脂質は、コード因子と呼ばれることが多いアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）であり、これはマイコバクテリア細胞壁の最も重要な免疫調節成分の１つである。特に好ましい態様では、糖脂質は、２つのドコサン脂肪酸（ベヘン酸）にエステル化したアルファ，アルファ’−トレハロース、例えばアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）からなり、これはＴＤＭの純粋な合成類似体である。
【００３７】
本発明の用いられる別の分類の糖脂質としては、グリセロールに基づく次の糖脂質であるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
グリセロールに基づく糖脂質：これらの糖脂質は、１つ又は２つの脂肪酸でアシル化（又はアルキル化）していてもよいグリセロールのヒドロキシル基に、グリコシド結合した単糖又はオリゴ糖からなる。更には、これら糖脂質は電荷を持たなくともよく、それゆえに中性グリコグリセロ脂質と呼ばれることも多く、又は硫酸基若しくはリン酸基を含有してもよい。
【００３９】
セラミドに基づく糖脂質：スフィンゴ糖脂質は、炭化水素部分の構造に従って、置換されていないグリコシル基を含有する中性スフィンゴ糖脂質、及び酸性カルボキシル基、硫酸基、又はリン酸基を持つグリコシル基を含有する酸性スフィンゴ糖脂質に分けられている。
【００４０】
リポ多糖（ＬＰＳ）：これら複合化合物は、グラム陰性細菌の細胞壁に見いだされる内毒素抗原（Ｓ−リポ多糖）である。脂質部分（脂質Ａ）は、グリコシド結合を介して多糖と複合体を形成する。脂質Ａは、グルコサミンＩの１位及びグルコサミンＩＩの４位に２つのリン酸エステル基を持つｂ−１，６−グルコサミニル−グルコサミンの基幹からなる。グルコサミンＩＩの３位は、長鎖多糖と酸に不安定なグリコシド結合を形成している。他の基は、ヒドロキシミリステート（２つのエステル結合及び２つのアミド結合）のようなヒドロキシル化脂肪酸、並びに一般的な脂肪酸（ラウレート）で、（エシェリキア属において）置換される。特に好ましい本発明のリポ多糖は、脂質Ａのモノホスホリル誘導体（ＭＰＬ）であり、それらは無毒であり、優れたアジュバント特性を有している。
【００４１】
ステロールのグリコシド：この族は、１つのステロール分子のヒドロキシル基に結合した１つの炭化水素単位からなる。ステロール部分は、様々なステロールから構成されることが定められた。即ち、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、ブラシカステロール及びジヒドロシトステロールである。糖部分は、グルコース、キシロース及び、更にはアラビノースから構成される。
【００４２】
脂肪酸又はアルコールのグリコシド：細菌、酵母及び下等生物（海綿）には、極めて多数の単純糖脂質が見いだされている。これら化合物は、脂肪アルコール又はヒドロキシル脂肪酸の１つのヒドロキシル基に結合した、又は脂肪酸の１つのカルボキシル基に結合した（エステル結合）グリコシル部分（１つ若しくは複数単位）から構成される。これら化合物は、興味深い物理的又は生物学的特性を持つことが多い。その界面活性特性（アルキルグリコシド）を求めて工業生産されているものもある。
【００４３】
アルキル鎖は脂肪属炭化水素鎖を指し、それは直鎖でも分岐鎖でもよい。鎖は飽和してもよく、又はそれは１つ若しくはそれ以上の二重結合を有してもよく、例えば不飽和でもよい。
【００４４】
アシル鎖はアルキル−ＯＣ（Ｏ）基を指し、この場合、アルキル基は前述したものである。
【００４５】
脂肪酸鎖は、アルキル基又はアシル基の、分岐した、若しくは分岐していない、飽和若しくは不飽和の炭化水素鎖をさす。
【００４６】
薬学的に許容されるという用語は、活性成分の効力又は生物活性を妨害せず、かつ宿主若しくは患者に対し毒性でない物質を指す。
【００４７】
相転移温度又はＴｍは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定されるような、リポソームの二重層が、規則的な脂肪酸鎖を特徴とする低温のゲル相（固体−規則相）から、脂肪酸鎖が高い立体不規則性を有する（液体−不規則相）高温の流体相に移行する温度である。
【００４８】
医薬製剤の安定性とは、生成物の有効期間中、製剤が定義された限界値内に留まる能力を意味する。リポソーム分散液は、化学的だけでなく物理的安定特性も示す。
【００４９】
化学的安定性は、化学分解に関係しているが、物理的安定性は系のコロイド安定性に関係する。
【００５０】
リポソーム分散液の物理的安定性は、小胞内相互作用によって決まり、それは引力と斥力との間のバランスに依存する。コロイド系は、斥力、即ち静電気の斥力、及びバルクの水と相互作用領域内の水との化学ポテンシャルの差による立体斥力によって安定化される。
【００５１】
アジュバントは、抗原に対する免疫反応を非特異的に高める物質として定義される。アジュバントは、その特性により、細胞性免疫反応、液性免疫反応、又は２つの混合反応を促進できる。免疫反応の強化は非特異的であるため、同一のアジュバントを様々な抗原を用いて様々な標的に対する反応を促進できること、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原を用いてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫を促進するか、又は腫瘍由来の抗原を用いて、特定種類の腫瘍に対する免疫を促進できることは、当該技術分野では周知である。
【００５２】
例示の第四アンモニウム化合物、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、−クロリド、又はそれらのその他有機塩若しくは無機塩（ＤＤＡ−Ｂ、ＤＤＡ−Ｃ若しくはＤＤＡ−Ｘ）、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムクロリド、−ブロミド、又はそれらのその他有機塩若しくは無機塩（ＤＯＤＡ−Ｃ、ＤＯＤＡ−Ｂ又はＤＯＤＡ−Ｘ）、或いは１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は、水性媒体中に分散させた時に、脂質二重層、単層及び多重層両方のタイプのリポソーム、ミセル等の脂質凝集体を形成する能力を有している。これら構造物の脂質膜は、糖脂質のようなその他両親媒性化合物を閉じこめるための優れたマトリックスを提供し、それらは本発明の小胞体分散液を安定化することが示されている。
【００５３】
更には、糖脂質、例えばＴＤＢ及びＴＤＭは、それ自体が免疫活性化特性を有しており、第四アンモニウム化合物と相乗的に働いて免疫反応を高めることができる。更には、高分子、例えばオリゴヌクレオチド、ペプチド又はタンパク質の抗原を、単層及び多重層リポソーム両方の水相内に閉じこめることができる。
【００５４】
疎水性アシル鎖、例えばＴＤＢは、本発明の第四アンモニウム化合物から作られた脂質二重層の疎水性領域内に埋め込まれ、それにより親水性トレハロース頭部基を疎水性領域とバルク水との界面に固定すると期待されている。強く水和された糖頭部基は、界面全体の水和を高め、水和力のポテンシャルを増加させて、これが小胞の凝集又は融合にとって必要な、対抗する二重層の密な接触を阻止する。更には、界面が水和された結果として、二重層の流動性が増し、これも小胞を安定化させる傾向にもある。
【００５５】
本発明の製剤に用いられる分散媒体は、いずれか好適な水性溶媒でよい。しかしながら、リポソーム製剤の安定性は、リン酸イオン及び硫酸イオンのようなアニオンに影響を受けると思われる。それ故に、本発明のアジュバント組成物は、このようなイオンが存在しないか、又は低レベルで形成することが好ましい。
【００５６】
ワクチンアジュバントとして用いる場合には、抗原性成分をアジュバント溶液に、できればＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）又はその誘導体、ポリイノシンポリシチジル酸（ポリＩＣ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）又はその誘導体、ザイモサン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、及びタモキシフェンのようなその他の免疫賦活剤と一緒に加えることが好ましい。抗原性成分又は物質は、事前に形成しておいた抗体並びに／又はＴ及びＢ細胞の特異的受容体と反応する分子である。ワクチン接種という意味では、分子は特異的Ｔ又はＢ細胞の発生を促進でき、免疫細胞が抗原を二回目に経験した際に、より迅速な「記憶」反応を促進する免疫細胞の記憶集団を形成できる分子である。記憶集団がクローン性であることは稀であることから、実際的には、このことは抗原が、前にその抗原に暴露した個体に由来する免疫細胞が、その抗原と再度出会った時に免疫反応の上昇を刺激できるいずれかの分子又は分子の集まりを意味している。
【００５７】
抗原性成分又は物質は、ポリペプチド又はポリペプチドの一部分でよく、それらは本明細書に記載されているいずれかの生物学的検出法によって決定される、動物又は人類、及び／又は生物サンプルにおいて免疫反応を惹起する。ポリペプチドの免疫原性部分は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープでよい。免疫反応中に認識される、関連のＴ細胞エピトープを同定するために、「ブルートホース（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」法を用いることができる。つまり、Ｔ細胞エピトープは直線状であることから、ポリペプチドの欠失変異体は、体系的に構築すれば、ポリペプチドのどの領域が免疫認識にとって必須であるかを、例えばこれら欠失変異体を、例えば本明細書に記載されているＩＦＮガンマ測定に供することによって、明示する。別の方法は、ポリペプチドに由来する、重複するオリゴペプチド（好ましくは、例えば２０アミノ酸残基の長さを有する合成物）を利用する。これらポリペプチドは、生物学的検定法（例えば本明細書に記載されているＩＦＮガンマ測定）で試験でき、かつそのうちの幾つかはペプチド中のＴ細胞エピトープの存在の証明である陽性反応を示す（従って免疫原性である）。直線状Ｂ細胞エピトープは、例えばＨａｒｂｏｅらが１９９８年に記載しているように、関心対象のポリペプチド全体をカバーする、重複ペプチドに対するＢ細胞認識を解析することによって決定できる。
【００５８】
Ｔ細胞エピトープの最低長は、少なくとも６アミノ酸であることが示されているが、このようなエピトープがより長いアミノ酸のストレッチで構成されていることは一般的である。従って、本発明のポリペプチド断片は少なくとも７アミノ酸残基長を有する。例えば少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、及び少なくとも３０アミノ酸残基を有する。それゆえに、本発明の方法の重要な態様では、ポリペプチド断片は、せいぜい４０、３５、３０、２５、及び２０アミノ酸残基といった、最大５０アミノ酸残基長であることが好ましい。診断ツールとしては、１０〜２０アミノ酸残基の長さを持つペプチドが最も効果的でることが証明されると予想されることから、本発明の方法で用いられるポリペプチド断片の、特に好ましい長さは１８アミノ酸で、１５、１４、１３、１２アミノ酸、さらに１１アミノ酸もある。
【００５９】
ワクチンは、疾患に対する免疫を産生するための、死んだ、弱毒化された、又はその他改質された微生物（細菌、ウイルス若しくはリケッチア）、或いはそれらの一部の接種用懸濁物として定義される。ワクチンは、疾患を予防するための予防ワクチンとして、又は癌又は潜在性感染症のような既に存在している疾患を治療するための、またアレルギーや自己免疫疾患に関する治療ワクチンとして投与できる。ワクチンは、免疫反応を強化するために、好適アジュバントの形に乳化できる。
【００６０】
ワクチンは、製剤投与量にあった様式で、治療的に有効かつ免疫原性である量が投与される。投与する量は、免疫反応を展開する個体の免疫系の能力及び所望する保護の程度によって決まる。好適な投与量範囲は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム活性成分のオーダーであり、好ましい範囲は、約１μｇ〜３００μｇのような約０．１μｇ〜１０００μｇの範囲であり、特に好ましくは約１０μｇ〜５０μｇの範囲である。初回投与及び追加接種の好適レジメンもまた様々であるが、初回投与後に続けて接種するタイプ、又は別に投与するタイプに分けられる。
【００６１】
使用方法は極めて多様である。ワクチン投与のいずれの通常の方法も応用できる。これらは、固体の、生理学的に許容される基剤若しくは生理学的に許容される分散液を用いた経口又は粘膜用、注射による非経口用を含むと考えられる。ワクチンの投与量は投与経路により決まり、ワクチン接種対象となるヒトの年齢によって変わり、ある程度はワクチン接種対象となるヒトのサイズによっても変わる。
【００６２】
ワクチンは、通常は、注射によって、例えば皮下若しくは筋肉内に非経口的に投与される。その他の投与形態に適合する追加の製剤としては、坐薬及び、いくつかの例では、経口又は粘膜製剤が挙げられる。坐薬の場合は、伝統的な結合剤及びキャリアとしては、例えばポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）又はトリグリセリドが挙げられる。このような座薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、一般に用いられる賦形剤、例えば医薬品等級のマニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含む。これら組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放製剤又は粉末の形態を取り、かつ１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有すると有利である。
【００６３】
ワクチンは、例えば次のものから選択できる：
【００６４】
タンパク質ワクチン：ポリペプチド（少なくとも１つのその免疫原性部分）又は融合ポリペプチドを含むワクチン組成物。
【００６５】
生組換え体ワクチン：非病原性の微生物又はウイルスで、ワクチンの関連抗原を発現させたもの。このような微生物の周知例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであり、ウイルスの例は、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ及びＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓである。
【００６６】
これらワクチン構築物全てに関し、好適アジュバントを追加することで、ワクチン効力を増強する（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，２００３）。
【００６７】
本発明のさらに別の態様は、アジュバントを含む送達システムである。リポソームは、免疫アジュバント、感染症及び炎症の治療、癌治療、並びに遺伝子治療といった薬学及び医学での送達システムとして用いられている（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９９５）。リポソームのアジュバント効果に影響する可能性のある因子は、リポソームのサイズ、脂質組成、及び表面電荷である。更には、抗原の位置（例えばそれがリポソーム表面に吸着若しくは共有結合しているか、又はリポソーム水性コンパートメント内に閉じこめられているか）も重要であろう。樹枝状細胞は、抗原送達ビークルとして用いることができる。樹枝状細胞のような抗原提示細胞への抗原の負荷は、抗腫瘍免疫で役割を果たす活性なＴ細胞を生成する効果的な方法であることが示されている。
【００６８】
本発明のリポソームは、当技術分野周知の様々な方法によって作ることができる。
【００６９】
好ましくは、カチオン性脂質は、ジメチルアンモニウム頭部基及び１２〜２０個の炭素原子を含む２つの長い疎水性アルキル基、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ−Ｂ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡ−Ｃ）を有する第四アンモニウム化合物である。その他タイプの好ましいカチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
糖脂質は、好ましくは、１つから３つの脂肪酸が１又は２個の糖残基をアシル化しているものから作られたアシル化グリコシドである。脂肪酸は飽和又は不飽和の、直鎖又は複合分岐脂肪酸のいずれかである。糖は、単純な単糖又は２つの供給結合した単糖類を含む二糖のいずれかでよい。特に好ましい態様では、糖脂質は、１又は２本の、１４〜９０個の炭素原子を含むグリコシド結合脂肪酸鎖を持つトレハロース、例えばアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）及びアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）からなる。
【００７１】
一つの態様では、本発明のリポソームは、カチオン性脂質を形成する二重層、好ましくは第四アンモニウム頭部基及び２本の長い疎水性アルキル基を有する二重層である。特に好ましい態様では、頭部基はジメチルアンモニウムであり、かつ疎水性鎖はヘキサデシル、オクタデシ又はオクタデセニル鎖である。発明のカチオン性脂質は、単独又は組み合わせて用いることができる。更には、カチオン性脂質又はその混合物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のような中性リン脂質、又は他の二重層を形成する中性若しくは合成の、静電気的に中性な脂質と組み合わせて用いることができる。
【００７２】
カチオン性リポソームは、フィルム法を用いて糖脂質をリポソーム膜内に組み込むことによって安定化される。これに対し、この安定化効果は、既に述べた製剤であるＤＤＡ及びＴＤＢの事前生成溶液を混合しても得られない（Ｗｏｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ，１９８０、Ｄｚａｔａ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４）。糖脂質は、その疎水性部分は二重膜の疎水性領域内に埋め込まれ、またその極性頭部基部分は膜の親水性表面に向かって配置される形で、脂質二重層内に安定的に組み込まれなければならない。カチオン性リポソームに加える糖脂質のモル比は、製剤に用いられた糖脂質並びに潜在的賦形剤の性質によって決まる。特定の糖脂質のモル百分率は、０．５〜約９５モル％、好ましくは約２．５〜約２０モル％、さらに好ましくは約５〜約１８モル％である。
【００７３】
特に好ましい本発明の態様では、第四アンモニウム化合物／カチオン性脂質はＤＤＡ−Ｂであり、糖脂質はＴＤＢである。リポソームは、所定重量のＤＤＡ−Ｂ及びＴＤＢを、全脂質濃度が約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ又は１０ｍＭであるときに、５モル％又は１０モル％又は１５モル％のモル百分率になるように好適有機溶媒中に溶解して調製する。溶媒を蒸発させると、薄い脂質膜が試験管の内壁に残る。次に乾燥した脂質フィルムを、塩を含まないか、又は低濃度の塩を含む薬学的に許容される緩衝液で水和する。安定リポソーム構造体の形成は、イオン、特にリン酸塩及び硫酸塩のようなアニオンの存在に影響を受けると考えられる。好ましくは、有機緩衝液、例えばｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｏｍｅｔａｍｏｌｕｍ又は簡略してＴｒｉｓ）又は２−ビス（２−ヒロドキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）は、Ｔｒｉｓ又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ基剤をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、次にＨＣｌを加えてｐＨを調節して調製する。緩衝液は、Ｔｒｉｓ又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓに限定されるものでなく、任意の薬学的に許容される緩衝液又は緩衝物質が添加されていない純粋な水であってもよい。混合物を脂質混合物の相転移温度より高い温度まで加熱し、５分ごとに、２０分間激しく振盪する。得られたアジュバント製剤は、通常のカチオン性リポソームよりも、有意に改善された物理的安定性を有することを特徴とするＭＬＶからなる。
【００７４】
抗原性物質、即ちタンパク質又はペプチドを加え、アジュバント製剤と混合する。最も好ましくは、抗原性物質は静電引力又は疎水性相互作用によって小胞に結合する。本発明の特に好ましい態様では、結核に対する最終ワクチンは、ＴＤＢによって安定化したＤＤＡリポソームを含有するアジュバント製剤と融合タンパク質Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の溶液を混合することによって調製される。アジュバントは、本発明に従って、１ｍｌあたり２．５０ｍｇのＤＤＡ（４ｍＭ）及び１ｍｌ当たり０．２５ｍｇのＴＤＢ（０．２５ｍＭ）を含み、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液中に約５モル％のＴＤＢ濃度に相当するように調製される。このアジュバント製剤約４．５ｍｌを０．５ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６のＴｒｉｓ緩衝液に混合して、融合タンパク質の濃度を１００マイクログラム／ｍｌにして、最終的な、すぐに使用出来るワクチンを得る。
【００７５】
別の好ましい態様では、抗原性物質は、脱水−再水和法を用いて小胞内にカプセル化されるか、或いは抗原は凍結融解技術を用いて組み込まれる。
【００７６】
実施例
実施例１
濃度を増加させたＴＤＢを含有するＤＤＡ小胞の調製
ＴＤＢを含有するＤＤＡ小胞を、薄脂質フィルム法を用いて作った。ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ−Ｂ、重量平均分子量（Ｍｗ）＝６３０．９７）及びＤ−（＋）−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ、Ｍｗ＝９８７．５（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌ）をクロロホルムメタノール（９：１）に別々に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。指定容積の各化合物をガラス製試験管の中で混合した。緩やかなＮ２気流を用いて溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを一晩、低圧下で乾燥させ微量の溶媒を取り除いた。乾燥した脂質フィルムをＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で、表１に指定した濃度に水和し、７０℃の水槽に２０分間入れ、サンプルを５分ごとに激しく振盪した。
【００７７】
表１．本発明に従い調製されたアジュバント製剤の範囲一覧表
【００７８】
実施例２
ＴＤＢはＤＤＡ製剤の長期安定性を高める
濃度を増加したＴＤＢを含むＤＤＡ−Ｂ小胞の製剤を４℃に保存し、１日後及び２ヶ月後にもう一度、各製剤の外観を評価した（表２及び図２）。評価は、ＴＤＢがＤＤＡ小胞を安定化することを明瞭に証明した。１日後、ＴＤＢを含まない水性緩衝液のＤＤＡ懸濁液は沈殿を形成したが、一方１０モル％を超えるＴＤＢを含有するＤＤＡ懸濁液には沈殿は形成されなかった。ＴＤＢ濃度がせいぜい６％と低い懸濁液では、極少量の沈殿だけが形成され、これは軽く振盪することによって簡単に再懸濁された。
【００７９】
表２．様々なアジュバント製剤の範囲における２ヶ月安定性
【００８０】
長期保管を促進するために、懸濁液を３０００ｇで３０分間遠心分離した。２．５モル％を超えるＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂ懸濁液だけが極わずかな沈殿を形成したが、これは振盪によって再懸濁できた。
【００８１】
実施例３
ＴＤＢをＤＤＡ小胞の脂質二重層内に組み込む
合成ジアルキルジメチルアンモニウムから形成された脂質二重層は、特徴的な相転移温度Ｔｍにおいて、ゲルから液晶への主相転移を起こす。相転移は、小胞二重層中のジアルキル鎖の溶解を含み、鎖の構成が高い立体規則性を特徴とする状態から、不規則性がより高い状態へと変化する。鎖の溶解プロセスには、大きな転移エンタルピーを伴う。このエンタルピーの変化は、転移温度の最大値Ｔｍを示す熱容量曲線のピークとして検出される。転移温度並びに熱容量曲線の形は、極性頭部基の性質、対イオン、ジアルキル鎖の長さによって決まる。一般にＴｍ値は、鎖長が短くなるに従って、またアルキル鎖の非対称性が増加するほど上がる。サーモトロピック相の挙動に対する第２ジアルキル界面活性剤の影響は、２つの構成成分間の相互作用に関する有益な情報を提供できる。
【００８２】
熱容量曲線は、０．３４ｍｌのセル容積を持つパワー補正式ＶＰ−ＤＳＣ示差走査マイクロ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｒｏｖｏ）を用いて得た。０．３４ｍｌのサンプルのアップスキャンを三回連続して３０Ｃ／時の速度で行った。サンプルは開始温度で５０分間平衡化させた。
【００８３】
図３に示すＤＤＡ−Ｂ及びＤＯＢからなる２成分系のＤＳＣサーモグラムは、ＴＯＢのモル濃度上昇が、脂質膜の熱力学に大きな影響を与えることを示している。ＤＤＡリポソームの二重層の膜へＴＤＢが挿入されたことは、主相転移温度Ｔｍの低下によって証明される。純粋ＤＤＡ−Ｂリポソームのゲルから流体への転移は、４８℃における狭く、よく定義された熱容量ピークを特徴とする。ＴＤＢ濃度の上昇は、ゲルと流体相が同時に存在する流体相共存状態までゲルを広げる。
【００８４】
２０モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームの相転移温度は、純粋なＤＤＡ−Ｂの同温度よりも約５℃低温側にシフトする。ＤＤＡ−Ｂリポソーム膜内へのＴＤＢの挿入は、相転移ピークを二分割する傾向がある。これは、おそらくは、ゲルから流体への転移プロセス中の、脂質膜内の小規模な組成相分離によるものと考えられる。熱力学パラメータを表３に示す。
【００８５】
ＴＤＢの安定化作用は、おそらくは、ＤＤＡ−Ｂリポソーム膜内に固着している、ＴＤＢの強く水和されたトレハロース頭部基によるものであり、これが小胞二重層の脱水及び融合を阻止していると考えられる。
【００８６】
表３．３０℃／時の走査速度の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて得た、増加濃度のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームの熱力学パラメータ。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に分散させ、総脂質濃度は５ｍＭであった。
【００８７】
転移状態がタンパク質抗原の添加により影響を受けるか否かを評価するために、ＤＤＡおおびＴＤＢから構成されたリポソームを、マイコバクテリア融合タンパク質のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の濃度を上げながら加え、製剤を示差走査熱量測定により分析した。図４に示すように、相転移温度は、タンパク質組み込みによって変化しない。
【００８８】
実施例４
ＴＤＢ含有ＤＤＡリポソームの粒子サイズ
実施例４Ａ
ＴＤＢの組み込みによってＤＤＡ−Ｂの安定性を高める
増加濃度のＴＤＢを含有する、フィルム法で調製したＤＤＡ−Ｂの粒子安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により測定した。０モル％、６モル％、１１モル％及び２０モル％のＴＤＢを組み込んだＤＤＡ−Ｂ粒子製剤を、０日目にｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目及び１０５日目に測定を実施した（図５）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＴＤＢの組み込みがＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化し、それらが凝集を形成するのを防ぐことがわかる。逆に、ＤＤＡ単独の製剤は、４℃で数日保存後に凝集し、４２日後には凝集のために、それ以上のサイズ測定は不可能であった。これらのデータは、図２に示した、ＤＤＡ及びＤＤＡ／ＴＤＢ製剤の視覚的印象を裏付けるものである。
【００８９】
実施例４Ｂ
水熱法による２成分混合法、又はトレハロースである糖部分を加える代わりに、ＴＤＢを組み込むことでＤＤＡ−Ｂ粒子の安定性を効率的に高める
ＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化させるためのＤＤＡ−Ｂ粒子内へのＴＤＢを組み込みの必要性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により調べた。フィルム法で調製した１１モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂ粒子の粒子サイズを、１１モル％のＴＤＢと混合したＤＤＡ−Ｂ粒子（Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎにより前に記載されている水熱法）と比較した。両製剤をｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日後、１４日後及び２８日後に測定を実施した（図６）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＴＤＢの組み込みが、２成分を混合した場合に比べＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化し、それらが凝集するのを防ぐことがわかる。
【００９０】
ＴＤＢの脂質部分がＤＤＡ−Ｂ粒子の安定化にとって必要であるか否かを調べるために、フィルム法で調製した１１モル％ＴＤＢ含有ＤＤＡ−Ｂ粒子の粒子サイズを、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及びトレハロースをそれぞれ含有するＤＤＡ−Ｂ粒子と比較した。全ての製剤をｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日後、１４日後及び２８日後に測定を実施した（図７Ａ）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＤＤＡ−Ｂリポソームを安定化するには、ＴＤＢの脂質部分が必須であることがわかる。トレハロース及びスクロースではなくＴＤＢがＤＤＡ−ＴＤＢリポソームの凝集を阻止している。
【００９１】
実施例５
抗原をＴＤＢ含有ＤＤＡ小胞に吸着する
最終の、すぐに使用できるワクチンの、遠心分離したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の上清及び再懸濁した沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、カチオン性リポソームに吸着した抗原を視覚化した。アジュバントは、１５モル％の糖脂質ＴＤＢを組み込んで安定化したＤＤＡから構成されるカチオン性リポソームを含んでいた。最終ワクチンのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６（Ｍｗ４５ＫＤａ）は、４０マイクログラム／ｍｌ、８０マイクログラム／ｍｌ、１６０マイクログラム／ｍｌ及び２００マイクログラム／ｍｌであり、ＤＤＡ及びＴＤＢの濃度はそれぞれ１０ｍＭ及び０．６ｍＭであった。ワクチンを超遠心分離（１００，０００ｇ）に３０分間かけ、上清及び元の容積のＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁した沈殿物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した（図８）。Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を５０マイクログラム／ｍｌ含有する参照サンプルをレーン１にロードし、分子量マーカーをレーン２にロードした。タンパク質のバンドはクマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色で視覚化した。上清をロードしたレーンには肉眼で見えるバンドは無かったが、再懸濁した沈殿物をロードしたレーンには分子量約４５ＫＤａに明瞭なバンドが観察され、全ての、又はほとんど全ての抗原がカチオン性リポソームに吸着していることを示した。
【００９２】
実施例６
ＴＤＢと結びついたＤＤＡは、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６に対する効率的な免疫反応を促進する
アジュバントはある種の免疫反応の誘導に選択性を有することは、一般的に認められている。ＩＮＦ−γ産生に基づくＴｈ１サイトカイン放出の重要性が、ＴＢに対する耐性に必須であることが示されている（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。２０モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームを、本発明の実施例１に記載の通りに調製し、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６のＴｒｉｓ緩衝液と混合して最終ワクチンにした。最終ワクチンでの濃度は、ＤＤＡは２５０μｇ、ＴＤＢは１００μｇ、及びＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６は２μｇであった。比較のために、同一量のＤＤＡ及びＤＤＢからなるが、既に述べたようにＤＭＳＯ（Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４）で、即ちフィルム法によるリポソーム内へのＴＤＢの組み込みをしないで調製した。マウスを３回免疫感作させ、３回目のワクチン接種後１週目に血液細胞の特異的免疫反応を調べた（図９）。フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢを用いて免疫感作したものについては、既に述べた方法に比べはるかに高い反応が観察され、フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢ製剤がＤＤＡ／ＴＤＢの単純な混合物に比べ、アジュバント効果を高めることが証明された。
【００９３】
同様に、フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢの免疫反応を、臨床使用が既に許可されているアルミニウム系アジュバント、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌの免疫反応と比較した。図１０に見られるように、ＤＤＡ／ＴＤＢを用いた免疫感作は、高レベルのＩＦＮ−γ及び低レベルのＩＬ−５を導いたが、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで免疫感作したマウスは逆のパターンを示し、ＩＦＮ−γの分泌は無視できるほどであり、ＩＬ−５は高レベルであった。
【００９４】
液性免疫を産出するＤＤＡ／ＴＤＢの能力を、初回免疫感作後第５週時のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６特異ＩｇＧ抗体反応をモニタリングすることによって調べた。最終ワクチンでの濃度は、ＤＤＡは２５０μｇ、ＴＤＢは１００μｇ、及びＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６は２μｇであった。比較のために、一群のマウスにＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を投与した。表５に見られるように、ＤＤＡ／ＴＤＢを用いたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６でワクチン接種されたマウスの血清には、高力価の特異ＩｇＧが存在していた。Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌによる免疫感作で得た力価と比較して、ＤＤＡ／ＴＤＢを含むアジュバント製剤はより高レベルの特異抗体を誘導した。
【００９５】
表５．Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６免疫感作マウスより得た血清の抗原特異的抗体の中間点力価
【００９６】
実施例６Ａ
ＤＤＡ／ＴＤＢの組み合わせへ第３成分を組み込むことにより免疫反応を強化
最近、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンドが、新規アジュバント製剤に加えるべき魅力的な標的と考えられている。他の免疫刺激性成分、即ちＴＬＲリガンドをＤＤＡ／ＴＤＢ製剤に組み入れる効果を調べるために、マウスを、２５０μｇのＤＤＡ／５０μｇのＴＤＢに２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を加えたものと、選択した免疫調整剤を用いて免疫感作させた。これらに、前もって形成されたＤＤＡ−ＴＤＢリポソームに、ＴＬＲ３のリガンドとして知られるＰｏｌｙ ＩＣ（ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｇを加えたもの、並びに２５μｇのＴＬＲ２／ＴＬＲ４を活性化するムラミールジペプチド（ＭＤＰ）を含有させた。ＭＤＰは、水和前のＤＤＡ−ＴＤＢ脂質フィルムに含有させた。
【００９７】
最終免疫後３週目に個々のマウスから、脾細胞又は血液細胞（図の説明に示すように）を精製し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再刺激した後、ＩＦＮ−γ放出レベルを測定した。ＤＤＡ／ＴＤＢ単独又は第３成分（Ｐｏｌｙ ＩＣ及びＴＤＭ）単独で産生する免疫反応に比べて、３つ全ての成分を包含する製剤は高い免疫反応を起こし、ＤＤＡ／ＴＤＢと免疫調整剤との間の相乗作用を示した（図１１ａ及びｂ）。
【００９８】
実施例７
ＴＤＢ以外の糖脂質の組み込みによって、ＤＤＡ−Ｂ粒子の安定性を効率的に高める
ＤＤＡ−Ｂ粒子が、ＴＤＢ以外の糖脂質、１１モル％のβ−Ｄ−ラクトシルセラミド（β−ＬａｃＣｅｒ）、１１モル％のβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）及び４４ｗ／ｗ％Ｇ（Ｍ１）ガングリオシドそれぞれの組み込みによって安定化できることを例示する。製剤はフィルム法で調製し、０日目にｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に分散させた。粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により測定した。測定は調整後０日目、１４日目及び２８日目に実施した（図１２）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、糖脂質の組み込みがＤＤＡを安定化することがわかる。
【００９９】
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US5922350
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明で用いられる幾つかのカチオン性脂質の構造を示す図である。
【図２】４℃で２ヶ月間保存した後の１０ｍＭ ＤＤＡ製剤のデジタル画像である。（サンプル０２）は１６モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０３）は１２．５モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０４）は６モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０５）は２．５モル％のＴＤＢを含有し、サンプル（０６）は０．５モル％のＴＤＢを含有し、また参照サンプルはＤＤＡのみを含有している。この図より、ＴＤＢ含有懸濁液はより均一であり、沈殿がないことは明らかである。
【図３】ＴＤＢの濃度を増加させた（上から下に）ＤＤＡ−Ｂからなる多重層リポソームの、３０Ｃ／ｈの走査速度で得たＤＳＣサーモグラムである。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液に分散させた。サーモグラムは、ＴＤＢがＤＤＡリポソーム膜内に挿入されることを明瞭に示している。
【図４】抗原Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の濃度を増加させた（上から下に）ＤＤＡ−Ｂ及びＴＤＢからなる多重層リポソームの、３０Ｃ／ｈの走査速度で得たＤＳＣサーモグラムである。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液に分散させた。サーモグラムは、相転移温度が抗原をリポソーム内へ組み込むことによって変化しないことを明瞭に示している。
【図５】０モル％ＴＤＢ（−◆−）、６モル％ＴＤＢ（−▲−）、１１モル％ＴＤＢ（−★−）及び２０モル％ＴＤＢ（−■−）を含有するＤＤＡリポソームの平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、ＴＤＢを含まないＤＤＡリポソームに著しい増加が見られた。
【図６】ＤＤＡリポソーム（−◆−）、及び水熱法で調製した１１モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−▲−）、フィルム法で調製した１１％モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−■−）の平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、ＤＤＡリポソーム及び水熱法で調製されたＤＤＡ／ＴＤＢリポソームに著しい増加が見られた。
【図７Ａ】１１モル％ＴＤＢ（−■−）、１０％（ｗ／ｖ）トレハロース（−●−）及び１０％（ｗ／ｖ）スクロース（−Ｘ−）を含有するＤＤＡリポソームの平均粒子サイズの時間展開である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、トレハロース及びスクロースを含有するＤＤＡリポソームは、ＰＣＳによるそれ以上の測定を不可能にする程度まで凝集した。
【図７Ｂ】１０％（ｗ／ｖ）トレハロース及び１１モル％ＴＤＢをそれぞれ含有する１０ｍＭ ＤＤＡ製剤の、４℃で１４日間保存後のデジタル像である。トレハロースを含有する製剤において、著しい凝集が見られた。
【図８】最終的な、すぐ使用可能なワクチンを超遠心分離し、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の上清及び再懸濁沈殿物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、カチオン性リポソームへの抗原吸着を視覚化した図である。
【図９】本発明の実施例１に記載したように調製したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢ又はＨｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）が記載したように調製したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢで免疫感作を行ったＣ５７Ｂｌ／６ｊマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。リンパ球は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で刺激した。
【図１０】２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢ又は５００υｇのミョウバン（Ａｌｕｍ）に封じ込められたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢで免疫感作を行ったＣ５７Ｂｌ／６ｊマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマ及びＩＬ−５の放出を示す図である。リンパ球は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１１Ａ】２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ、１００ｕｇ ポリＩＣ、又は２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ／１００ｕｇ ポリＩＣのいずれかに封じ込められた２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫感作を行ったＢＡＬＢ／Ｃマウスから単離した脾細胞からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。脾細胞は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１１Ｂ】２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ、２５ｕｇ ＭＤＰ、又は２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ／２５ｕｇ ＭＤＰのいずれかに封じ込められた２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫感作を行ったＢＡＬＢ／Ｃマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。血液細胞は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１２】ＤＤＡリポソーム（−◆−）及び１１モル％ＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−●−）、１１％ラクトシルセラミドを含有するＤＤＡリポソーム（−＊−）及び１１モル％のアルファガラクトシルセラミド（−Ｘ−）を含有するＤＤＡリポソーム（−Ｘ−）の平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、糖脂質を含まないＤＤＡリポソームに著しい増加が見られた。これはＴＤＢ以外の糖脂質がＤＤＡを安定化できることを示唆している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物理的に安定しているリポソーム製剤に関する。具体的には、本発明は、それによって糖脂質をリポソームの中に組み込む独特のフィルム法による、カチオン性リポソームの立体安定化に関する。安定化されたリポソームは、抗原性成分のアジュバントとして、又は薬物送達システムとして用いることができる。具体的には、本発明は、免疫感作のための、水性媒体中にアジュバントを含むワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症に対し免疫を産生するためにヒトに使用された最初のワクチンは、生きている、弱毒化病原体であった。弱毒化病原体の型は、自然に発生した近縁種であるか、又は連続継代培養で得られたものである。一つの例は、弱毒化されてはいるが生きているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ株を用いたワクチン（ＢＣＧワクチン）により有効である結核である。しかし、この処置の効力が、全ての集団のヒト結核症に対し十分な抵抗力を必ずしも与えるとは言えない。それゆえに、結核及びその他の感染症に対する免疫を生成する、新規の有効な方法が求められている。特に有望な方法は、初期分泌標的抗原（ＥＳＡＴ−６）及び抗原８５（Ａｇ８５）のような免疫優性抗原の組換え型を単離してワクチンとして使用することである。これらのワクチンは明確に定義され、副作用は最小限である。残念なことに、多くの、高度に精製された物質、例えば精製組換えタンパク質は、それほど免疫原性は高くなく、実際の感染症に対し防御する、効果的な免疫反応を起こさない。この事実は周知であり、該物質を、いわゆるアジュバントと組み合わせることによって免疫原特性を高める試みが多くなされている。病原菌によっては、防御は、優位的な液性反応又は細胞性反応を必要とする。特異的な免疫反応（液性又は細胞性）の発生は、アジュバントの選択によって決まる場合がある。
【０００３】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような細胞内病原菌に対する防御免疫は、細胞性免疫反応を必要とし、ＴＢに直接作用させるサブユニットワクチンに好適なアジュバントはＴｈ１反応を高める（Ｌｉｎｄｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＴＢに対する免疫では、抗体が重要は役割を果たしておらず、一方細胞性のＩＦＮ−ガンマ（インターフェロンガンマ）の放出は、防御に関与する、最も重要なサイトカインであると一般には信じられている（Ｃｏｌｌｉｎｓ ＆ Ｋａｕｆｍａｎｎ，２００１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
細胞性免疫反応を誘導する数多くのアジュバントが提案されているが、一般的には全ての点に関して理想的なものはない。
【０００５】
細胞性免疫反応を促進する特に有効なタイプのアジュバントの１つは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）のような第四アンモニウム化合物である（Ｈｉｌｇｅｒｓ ａｎｄ Ｓｎｉｐｐｅ，１９９２）。ＤＤＡは、親水性の、正に帯電したジメチルアンモニウム頭部基と２本の長い疎水性のアルキル鎖とを含む合成両親媒性物質である。水性環境においてＤＤＡは自己集合し、中性リン脂質からできたリポソームに類似する小胞性の二重層を形成する。ＤＤＡとその他の免疫調節剤との組み合わせが記載されている。ＤＤＡを含むＡｒｑｕａｒｄ ２ＨＴのヒトへの投与は有望であり、顕著な副作用は誘導しない（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９７３）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの培養液濾過タンパク質及びＤＤＡに基づく実験ワクチンは、マウスのＴＢに対し防御免疫反応を生成した（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，１９９４）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質ＥＳＡＴ−６とＡｇ８５Ｂの融合タンパク質、及びＤＤＡ／ＭＰＬをアジュバントとして用いたマウスへのワクチン接種は、ＢＣＧワクチン接種により得られたものに類似した防御を提供する（Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらの研究は、たとえばミョウバンとは異なり、ＤＤＡ系アジュバントがマウスにおいてＴＢに対する防御免疫反応を誘導できることを証明している。更には、ＤＤＡは、Ｔ細胞反応及び抗ウイルス免疫を高める、仮性狂犬病ウイルスに対するＤＮＡワクチン用のアジュバントとして用いられている（ｖａｎ Ｒｏｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０００６】
熱死菌を基にしたＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓワクチン用のアジュバントとして、ＤＤＡ溶液へのＴＤＭ（アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート）の油乳剤の追加について、Ｗｏｏｄａｒｄら（１９８０）によって研究された。ＤＤＡ単独又はＤＤＡとＴＤＭとの混合物のいずれも防御を誘導できなかった。可溶性タンパク質抽出物を基にしたＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓサブユニットワクチンに関する別の研究では、ＤＤＡとＴＤＭの組み合わせもアジュバントとして用いられ（Ｄｚａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、この混合物が、ＤＤＡ単独に比べて観察される免疫反応（抗体レベル、皮膚試験反応、及びＩＬ−２レベル）を高めることが見いだされた。Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）は、ＤＤＡリポソームとＴＤＢ（アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘナート）懸濁液との組み合わせについて研究し、ＥＳＡＴ−６抗原をこのアジュバント混合物と一緒に投与すると、ＤＤＡリポソームの形でＥＳＡＴ−６を投与した場合より有意に高い、結核に対する強力な防御免疫反応を誘導することを見いだした。
【０００７】
残念なことに、ＤＤＡ単独又は、上記のようなＤＤＡとＭＰＬ、ＴＤＭ若しくはＴＤＢとの混合物といった、親水性の第四アンモニウム化合物の懸濁液は物理的に不安定であり、凝集及び沈殿を発生させることなしに４℃で長期保存することはできない。沈殿形成は調合物の臨床使用を妨げるため、ＤＤＡ製剤の安定性欠如は、これまでヒト応用への大きな障害となってきた。
【０００８】
英国特許第２１４７２６３−Ａ号においてＴａｋａｈａｓｈｉ及びＴｓｕｊｉは、２種類の第四アンモニウム化合物を一緒に混合するか、又は各種界面活性剤を第四アンモニウム化合物に加えることによる第四アンモニウム化合物の小胞の安定化を記載している。
【０００９】
米国特許第５，０２６，５４６号においてＨｉｇｅｒｓ及びＷｅｓｔｓｔｒａｔｅは、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸のポリマーを用いたＤＤＡアジュバント懸濁液の安定化を記載している。
【００１０】
細胞のトランスフェクションのためのカチオン性脂質−プロタミン−ＤＮＡ複合体の凍結乾燥がＬｉら（２０００）によって記載されている。単糖類及び二糖類のような従来からある凍結防止剤を加える効果が検討され、単糖類に比べると、二糖類が粒子サイズを良好に保存することが見いだされた。また、１０％のスクロースによって安定化された凍結乾燥していない、脂質−プロタミン−ＤＮＡ複合体も、４℃で８週間の保存後でも安定した粒子サイズを維持したが、トランスフェクション効率は、凍結乾燥されていないサンプルに比べ、凍結乾燥されたサンプルで高かった。
【００１１】
米国特許第５９２２３５０号は、リポソームを脱水する前にトレハロース及びスクロースといった糖を加えることによる、例えばリン脂質を基にしたリポソームの保管期間を延長する方法を記載している。更には、この特許は、濃度勾配及び脱水−再水和のプロセスの組み合わせによって、事前に作成し保管しておいたリポソームを後から加えることができるようになることも記載している。
【００１２】
ポリエチレングリコール誘導体で安定化された薬物送達のためのリン脂質のリポソーム（融合性リポソーム）は国際特許出願ＷＯ９６／１０３９２号に記載されている。国際特許出願ＷＯ０２／０３９５９号に記載されている別の薬物送達製剤は、カチオン性リポソーム及び中性リポソームを含み、各リポソーム群がそれぞれ同一又は別種の治療薬を担持する製剤を開示している。
【００１３】
好適なリポソームの調製方法が、Ｂａｎｇｈａｍにより記載されている（Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９６５）。この調製は、リン脂質を有機溶媒に溶解し、次に蒸発させて、試験管の内側に薄い脂質フィルムが残るまで乾燥させることを含む。次に乾燥脂質フィルムは適当量の水相に水和され、混合物を脂質の相転移温度を越えるまで加熱し、「膨潤」させる。こうして得られた、多重層小胞（ＭＬＶ）を構成するリポソームを、試験管を振盪することによって分散する。小胞二重膜を構成する脂質は、疎水性の炭化水素「尾部」が二重層の中心に向かい、一方親水性の「頭部」は内側及び外側の水相に向かうように配置される。この調製は、超音波（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９６７）又はＣｕｌｌｉｓらが米国特許第５，００８，０５０号に記載するような押し出しといった方法により単層小胞（ＵＶ）を生成する基盤を提供する。
【００１４】
小胞の調製に用いられる別の技術は、ＳｚｏｋａとＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓによって導入された逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｓ，１９７８、米国特許第４，２３５，８７１号）である。この技術は、有機溶媒、及びカプセル化対象となる物質を含有する水性緩衝液の中で、脂質の油中水型乳剤を形成させることからなる。減圧下で有機溶媒を除去すると、粘性のゲルが生じる。このゲルは圧潰すると、脂質小胞の水性懸濁液が形成される。
【００１５】
Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｂｅｉｒｏ及びＣｈａｉｍｏｖｉｃｈが記載した別の方法（Ｃａｒｍｏｎａ−Ｒｉｂｅｉｒｏ ａｎｄ Ｃｈａｉｍｏｖｉｃｈ，１９８３）は、所望の脂質の有機溶液、例えばクロロホルム、メタノール、エタノールの溶液を、水性緩衝液内に注入することを必要とするが、この場合溶媒が蒸発するときに、脂質は自発的にリポソームを形成する。
【００１６】
リポソームは、Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）がＤＤＡについて記載している、水性緩衝液のリポソーム形成化合物の懸濁液を例えば、間欠的に振盪しながら８０℃に２０分間加熱して、その後室温まで冷却する水熱法によっても調製できる。
【００１７】
Ｗｏｏｄａｒｄら（１９８０）、Ｄｉｚａｔａら（１９９１）及びＨｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）が用い、記載している上記の「水熱法（ａｑｕｅｏｕｓ ｈｅａｔ ｍｅｔｈｏｄ）」は、ＤＤＡ及びＴＤＢの溶液を安定化しない。
【００１８】
一つの、特に好ましい方法では、タンパク質抗原は事前に形成された小胞の中に、水相内のオリゴヌクレオチド、ペプチド又はタンパク質を、凍結乾燥後に凍結乾燥リポソームを再水和することによってカプセル化する脱水−再水和法（Ｋｉｒｂｙ ａｎｄ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８４）によってカプセル化される。
【００１９】
或いは、抗原はＰｉｃｋ（Ｐｉｃｋ、１９８１）が記載する、及び米国特許第４，９７５，２８２号内にＢａｌｌｙらによって記載された凍結融解法を用いて組み込まれる。この技術では、小胞はタンパク質抗原と混合され、液体窒素中での急速凍結と、当該脂質の主相転移温度を超える温度までの加温とが繰り返される。小胞をさらに処理し、カプセル化されなかった抗原を、例えば洗浄及び遠心分離によって除いてもよい。
【００２０】
ＴＤＢ及びマイコバクテリアの細胞壁から単離されたコード因子、ＴＤＭのようなアシル化グリコシドがリン脂質小胞間の融合を阻止することが示されている（Ｓｐａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ａｎｄ Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。親水性トレハロース部分は、小胞の表面に固定化しやすく、従って、融合にとって重要な一次障害である水和力を向上させる。或いは、固定されたトレハロース部分は、融合に対し立体障害として機能するかもしれない（Ｓｐａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。
【００２１】
現在、リン脂質からできた（ＴＤＢを含まない）リポソームは、例えばインフルエンザワクチン（Ｂｅｎ−Ｙｅｈｕｄａ ｅｔ ａｌ，２００３）においてアジュバントとして実験的に用いられている。別の例は、インフルエンザに対するＩＭＵＸＥＮ（商標）リポソームワクチンである（Ｌｉｐｏｘｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
【００２２】
第四アンモニウム化合物、特にＤＤＡは効果的なワクチンアジュバントとして非常に有望な候補であるが、水溶液の中では物理的に安定しておらず、保存中に凝集して沈殿するという大きな欠点があることから、形成した小胞を安定化させることが強く求められている。本発明は、ＤＤＡのようなカチオン性脂質から構成されるアジュバント製剤を安定化させる新規の方法を記載する。これに加えて、この方法により、本製剤のアジュバント効果は高められる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、糖脂質、例えば、アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）のようなアシル化グリコシドを、ＤＤＡ、ＤＯＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ又はＤＯＴＭＡのような親水性第四アンモニウム化合物から作られたリポソーム二重層内に組み込むことによって、カチオン性リポソーム懸濁液を安定化させる組成物及び方法を開示する。糖脂質の、強力に水和された糖頭部基はリポソーム二重層全体の水和度を高め、これが第四アンモニウムの頭部基の脱水、及びカチオン性小胞の電荷反発力の低下による凝集を防ぐ。このＤＤＡの安定化は、糖、例えばトレハロース又はスクロースを加えるだけで、又は第四アンモニウム化合物と糖脂質を単純に混合するだけでは得られない。本発明はまた、これら安定化したリポソームのワクチンアジュバントとしての使用も開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、糖脂質を用いた、水性製剤中のカチオン性リポソームを安定化させる新規の方法を開示する。カチオン性リポソーム、例えば両親媒性第四アンモニウム化合物から作られたものは、リポソームの膜内に糖脂質を組み込むことによって安定化される。
【００２５】
本発明の好ましい態様は、第四アンモニウム化合物がジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）又はジメチルジオクタデセニルアンモニウム（ＤＯＤＡ）化合物のブロミド塩、クロリド塩、硫酸塩、リン酸塩又はアセテート塩である場合である。
【００２６】
別の好ましい第四アンモニウム化合物は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）である。
【００２７】
リポソームを安定化する糖脂質は、アルファ，アルファ’−トリハロース６，６’ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ，アルファ’−トリハロース６，６’ジミコレート（ＴＤＭ）が好ましい。製剤での糖脂質のモル百分率は、０．５〜９５モル％でよいが、好ましくは２．５〜約２０モル％であり、より好ましくは約５〜約１８モル％である。
【００２８】
本発明はまた、これら安定化したリポソームのアジュバント、例えばワクチン組成物での使用のためのアジュバントとしての使用も示す。具体的には、本発明は免疫感作のための、アジュバントを加えた水性媒体ワクチンであって、最終生成物が安定しているワクチンに関する。
【００２９】
本発明はまた、ワクチンが、たとえば結核、マラリア、クラミジア等のいずれの疾患に対しても効果がある場合のワクチンアジュバントとしての使用する上記の方法によって安定化されたリポソーム生成物を開示する。
【００３０】
「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）」は、水性核を取り囲む、１つ又はそれ以上の脂質二重層から出来た閉鎖小胞構造物として定義される。各脂質二重層は、２つの脂質単層からなっており、それぞれが疎水性の「尾部（ｔａｉｌ）」領域と親水性の「頭部（ｈｅａｄ）」領域を有している。二重層では、脂質単層の疎水性「尾部」は二重層の内側に向いており、一方疎水性の「頭部」は二重層の外側に向いている。リポソームは、サイズ、脂質組成、表面電荷、流動性及び二重層膜の数などの様々な物理化学特性を有することができる。脂質二重層の数に基づいて、リポソームは単一脂質相を含む単層小胞（ＵＶ）、又は水の層によって相互に隔てられている２又はそれ以上の同心的な二重層を含む多重層小胞（ＭＬＶ）に類別できる。水溶性化合物は水相／リポソームの核内に閉じこめられ、反対に脂溶性化合物は脂質二重層膜の核内に閉じこめられる。
【００３１】
「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅｓ）」は、両親媒性分子のコロイド凝集体として定義され、それは臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）として知られる、明確に定義されている濃度で生ずる。ミセル内の凝集分子の典型的な数は５０〜１００である。ミセルは、炭化水素の尾部が中心に向かい、極性の頭部が外部水環境に向かうように配置された界面活性剤分子からなる球体でよい。他の可能な構造としては、逆転ミセル及び円筒ミセルが挙げられる。
【００３２】
用語「カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）」は、合成脂質及び脂質類似体を含み、疎水性の極性頭部部分を持ち、生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有し、それ自体が水中において自発的に二重層小胞又はミセルを形成できる、両親媒性脂質を包含するものである。
【００３３】
本発明で用いられる、１つの特に好ましいタイプのカチオン性脂質は、一般式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４−Ｘを有する第四アンモニウム化合物であり、このときＲ１及びＲ２はそれぞれ独立に、１〜３個の炭素原子を含有する短鎖アルキル基であり、Ｒ３は独立に、水素若しくはメチル基、又は１２〜２０個、好ましくは１４〜１８個の炭素原子を含有するアルキル基であり、並びにＲ４は独立に、１２〜２０個の炭素原子、好ましくは１４〜１８個の炭素原子を含有する炭化水素基である。Ｘは薬学的に許容されるアニオンであり、それ自体無毒である。このようなアニオンの例は、ハロゲン化アニオン、クロリド、ブロミド及びヨードである。硫酸及びリン酸のような無機アニオン、又は酢酸のような単純な有機酸に由来する有機アニオンも用いてもよい。Ｒ１基及びＲ２基は、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基でよく、このときＲ３は水素、メチル基又はドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基でよく、並びにＲ４はドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基及びエイコシル基でよい。しかしながら、Ｒ３基及びＲ４基は分岐側鎖を持たずに飽和していることが好ましいが、それらはわずかな程度であれば分岐して、例えばメチル及びエチル側鎖を持ってもよいため、他のＣ１２〜Ｃ２０の炭化水素基であってもよい。Ｒ３及びＲ４はまた、極低い不飽和度を有してもよく、例えば１〜３個の二重結合をそれぞれ持つことができるが、好ましくは、それらは飽和アルキル基である。カチオン性脂質は、最も好ましくは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド若しくはクロリド（ＤＤＡ−Ｂ又はＤＤＡ−Ｃ）或いはその硫酸塩、リン酸塩若しくはアセテート塩（ＤＤＡ−Ｘ）又はジメチルジオクタデセニルアンモニウムブロミド若しくはクロリド（ＤＯＤＡ−Ｂ若しくはＤＯＤＡ−Ｃ）又はその硫酸化合物、リン酸化合物若しくはアセテート化合物（ＤＯＤＡ−Ｘ）である。別のタイプの、本発明での使用に好ましいカチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）である。
【００３４】
カチオン性リポソームは、リポソーム膜内に糖脂質を組み込むことによって安定化される。組み込みは、分子の疎水性領域及び親水性領域を、膜、ミセル、リポソーム又は二重層の対応する疎水性及び親水性領域又は分子部分内に、しっかり固定する手順を意味する。リポソーム内に糖脂質を組み込むための手順は、「薄フィルム法」、「逆相蒸発法」及び「有機溶液注入法」、並びにリポソーム膜内への糖脂質組み込みに同一の効果を有する将来−現時点では未知の方法でもよい。現在知られている全ての方法は、発明の背景の章に記されている。本発明にとって最も好ましい方法は、薄フィルム法である。
【００３５】
糖脂質は、長鎖脂肪酸、アシルグリセロール、スフィンゴイド、セラミド又はプレニルホスフェートのような疎水性部分と、グリコシド結合によって結合している１又はそれ以上の単糖残基を含有する化合物として定義される。本発明の糖脂質は、合成、植物若しくは微生物起源、例えばマイコバクテリア起源のものでよい。
【００３６】
本発明に用いられる１つの分類の糖脂質は、アシル化（又はアルキル化）グリコシドであり、それは１つ、２つ又は３つの脂肪酸にエステル化した１つ又は２つの糖残基からなる。脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えばミリスチン酸Ｃ１４：０、ペンタデカン酸Ｃ：１５、パルミチン酸Ｃ１６：０、ヘプタデカン酸Ｃ１７：０、ステアリン酸Ｃ１８：０、ノナデカン酸Ｃ：１９、アラキジン酸、Ｃ：２０、ヘンエイコサンＣ２１：０、ベヘン酸Ｃ：２２、及び不飽和脂肪酸、例えばオレイン酸Ｃ１８：１ｎ−９、リノール酸Ｃ１８：２ｎ−６、又はミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸、エポキシミコール酸、及びコリノミコール酸（ｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）のような複合分岐脂肪酸を含む、いずれかの直鎖でよい。糖残基は、単糖類、例えばグルコース及びフルクトース、又は２つの共有結合した単糖を含む二糖類、例えばグルコースとフルクトースからなるスクロース、及び２つのグルコース単位がグリコシド結合により連結したトレハロースのいずれかでよい。本発明で用いる１つのタイプの糖脂質は、マイコバクテリアから単離される細胞壁糖脂質であり、１つ、２つ又は３ついずれかの、標準のパルミチン酸、Ｃ１６：０；オレイン酸、Ｃ１８：１ｎ−９；リノール酸、１８：２ｎ−６又は複合ヒドロキシ、分岐鎖脂肪酸、即ち長さ６０〜９０炭素原子の範囲のミコール酸残基にエステル化した二糖からなる。本発明で用いられる別の細菌糖脂質は、より短い脂肪酸鎖を有する、例えばコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から単離されるコリノミコール酸（ｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（２２〜３６炭素）又はノカルドミコール酸（ｎｏｃａｒｄｏｍｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（４４〜６０炭素）酸である。好ましいマイコバクテリア糖脂質は、コード因子と呼ばれることが多いアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）であり、これはマイコバクテリア細胞壁の最も重要な免疫調節成分の１つである。特に好ましい態様では、糖脂質は、２つのドコサン脂肪酸（ベヘン酸）にエステル化したアルファ，アルファ’−トレハロース、例えばアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）からなり、これはＴＤＭの純粋な合成類似体である。
【００３７】
本発明の用いられる別の分類の糖脂質としては、グリセロールに基づく次の糖脂質であるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
グリセロールに基づく糖脂質：これらの糖脂質は、１つ又は２つの脂肪酸でアシル化（又はアルキル化）していてもよいグリセロールのヒドロキシル基に、グリコシド結合した単糖又はオリゴ糖からなる。更には、これら糖脂質は電荷を持たなくともよく、それゆえに中性グリコグリセロ脂質と呼ばれることも多く、又は硫酸基若しくはリン酸基を含有してもよい。
【００３９】
セラミドに基づく糖脂質：スフィンゴ糖脂質は、炭化水素部分の構造に従って、置換されていないグリコシル基を含有する中性スフィンゴ糖脂質、及び酸性カルボキシル基、硫酸基、又はリン酸基を持つグリコシル基を含有する酸性スフィンゴ糖脂質に分けられている。
【００４０】
リポ多糖（ＬＰＳ）：これら複合化合物は、グラム陰性細菌の細胞壁に見いだされる内毒素抗原（Ｓ−リポ多糖）である。脂質部分（脂質Ａ）は、グリコシド結合を介して多糖と複合体を形成する。脂質Ａは、グルコサミンＩの１位及びグルコサミンＩＩの４位に２つのリン酸エステル基を持つｂ−１，６−グルコサミニル−グルコサミンの基幹からなる。グルコサミンＩＩの３位は、長鎖多糖と酸に不安定なグリコシド結合を形成している。他の基は、ヒドロキシミリステート（２つのエステル結合及び２つのアミド結合）のようなヒドロキシル化脂肪酸、並びに一般的な脂肪酸（ラウレート）で、（エシェリキア属において）置換される。特に好ましい本発明のリポ多糖は、脂質Ａのモノホスホリル誘導体（ＭＰＬ）であり、それらは無毒であり、優れたアジュバント特性を有している。
【００４１】
ステロールのグリコシド：この族は、１つのステロール分子のヒドロキシル基に結合した１つの炭化水素単位からなる。ステロール部分は、様々なステロールから構成されることが定められた。即ち、コレステロール、カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、ブラシカステロール及びジヒドロシトステロールである。糖部分は、グルコース、キシロース及び、更にはアラビノースから構成される。
【００４２】
脂肪酸又はアルコールのグリコシド：細菌、酵母及び下等生物（海綿）には、極めて多数の単純糖脂質が見いだされている。これら化合物は、脂肪アルコール又はヒドロキシル脂肪酸の１つのヒドロキシル基に結合した、又は脂肪酸の１つのカルボキシル基に結合した（エステル結合）グリコシル部分（１つ若しくは複数単位）から構成される。これら化合物は、興味深い物理的又は生物学的特性を持つことが多い。その界面活性特性（アルキルグリコシド）を求めて工業生産されているものもある。
【００４３】
アルキル鎖は脂肪属炭化水素鎖を指し、それは直鎖でも分岐鎖でもよい。鎖は飽和してもよく、又はそれは１つ若しくはそれ以上の二重結合を有してもよく、例えば不飽和でもよい。
【００４４】
アシル鎖はアルキル−ＯＣ（Ｏ）基を指し、この場合、アルキル基は前述したものである。
【００４５】
脂肪酸鎖は、アルキル基又はアシル基の、分岐した、若しくは分岐していない、飽和若しくは不飽和の炭化水素鎖をさす。
【００４６】
薬学的に許容されるという用語は、活性成分の効力又は生物活性を妨害せず、かつ宿主若しくは患者に対し毒性でない物質を指す。
【００４７】
相転移温度又はＴｍは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により測定されるような、リポソームの二重層が、規則的な脂肪酸鎖を特徴とする低温のゲル相（固体−規則相）から、脂肪酸鎖が高い立体不規則性を有する（液体−不規則相）高温の流体相に移行する温度である。
【００４８】
医薬製剤の安定性とは、生成物の有効期間中、製剤が定義された限界値内に留まる能力を意味する。リポソーム分散液は、化学的だけでなく物理的安定特性も示す。
【００４９】
化学的安定性は、化学分解に関係しているが、物理的安定性は系のコロイド安定性に関係する。
【００５０】
リポソーム分散液の物理的安定性は、小胞内相互作用によって決まり、それは引力と斥力との間のバランスに依存する。コロイド系は、斥力、即ち静電気の斥力、及びバルクの水と相互作用領域内の水との化学ポテンシャルの差による立体斥力によって安定化される。
【００５１】
アジュバントは、抗原に対する免疫反応を非特異的に高める物質として定義される。アジュバントは、その特性により、細胞性免疫反応、液性免疫反応、又は２つの混合反応を促進できる。免疫反応の強化は非特異的であるため、同一のアジュバントを様々な抗原を用いて様々な標的に対する反応を促進できること、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原を用いてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する免疫を促進するか、又は腫瘍由来の抗原を用いて、特定種類の腫瘍に対する免疫を促進できることは、当該技術分野では周知である。
【００５２】
例示の第四アンモニウム化合物、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、−クロリド、又はそれらのその他有機塩若しくは無機塩（ＤＤＡ−Ｂ、ＤＤＡ−Ｃ若しくはＤＤＡ−Ｘ）、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムクロリド、−ブロミド、又はそれらのその他有機塩若しくは無機塩（ＤＯＤＡ−Ｃ、ＤＯＤＡ−Ｂ又はＤＯＤＡ−Ｘ）、或いは１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は、水性媒体中に分散させた時に、脂質二重層、単層及び多重層両方のタイプのリポソーム、ミセル等の脂質凝集体を形成する能力を有している。これら構造物の脂質膜は、糖脂質のようなその他両親媒性化合物を閉じこめるための優れたマトリックスを提供し、それらは本発明の小胞体分散液を安定化することが示されている。
【００５３】
更には、糖脂質、例えばＴＤＢ及びＴＤＭは、それ自体が免疫活性化特性を有しており、第四アンモニウム化合物と相乗的に働いて免疫反応を高めることができる。更には、高分子、例えばオリゴヌクレオチド、ペプチド又はタンパク質の抗原を、単層及び多重層リポソーム両方の水相内に閉じこめることができる。
【００５４】
疎水性アシル鎖、例えばＴＤＢは、本発明の第四アンモニウム化合物から作られた脂質二重層の疎水性領域内に埋め込まれ、それにより親水性トレハロース頭部基を疎水性領域とバルク水との界面に固定すると期待されている。強く水和された糖頭部基は、界面全体の水和を高め、水和力のポテンシャルを増加させて、これが小胞の凝集又は融合にとって必要な、対抗する二重層の密な接触を阻止する。更には、界面が水和された結果として、二重層の流動性が増し、これも小胞を安定化させる傾向にもある。
【００５５】
本発明の製剤に用いられる分散媒体は、いずれか好適な水性溶媒でよい。しかしながら、リポソーム製剤の安定性は、リン酸イオン及び硫酸イオンのようなアニオンに影響を受けると思われる。それ故に、本発明のアジュバント組成物は、このようなイオンが存在しないか、又は低レベルで形成することが好ましい。
【００５６】
ワクチンアジュバントとして用いる場合には、抗原性成分をアジュバント溶液に、できればＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）又はその誘導体、ポリイノシンポリシチジル酸（ポリＩＣ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）又はその誘導体、ザイモサン、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、及びタモキシフェンのようなその他の免疫賦活剤と一緒に加えることが好ましい。抗原性成分又は物質は、事前に形成しておいた抗体並びに／又はＴ及びＢ細胞の特異的受容体と反応する分子である。ワクチン接種という意味では、分子は特異的Ｔ又はＢ細胞の発生を促進でき、免疫細胞が抗原を二回目に経験した際に、より迅速な「記憶」反応を促進する免疫細胞の記憶集団を形成できる分子である。記憶集団がクローン性であることは稀であることから、実際的には、このことは抗原が、前にその抗原に暴露した個体に由来する免疫細胞が、その抗原と再度出会った時に免疫反応の上昇を刺激できるいずれかの分子又は分子の集まりを意味している。
【００５７】
抗原性成分又は物質は、ポリペプチド又はポリペプチドの一部分でよく、それらは本明細書に記載されているいずれかの生物学的検出法によって決定される、動物又は人類、及び／又は生物サンプルにおいて免疫反応を惹起する。ポリペプチドの免疫原性部分は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープでよい。免疫反応中に認識される、関連のＴ細胞エピトープを同定するために、「ブルートホース（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ）」法を用いることができる。つまり、Ｔ細胞エピトープは直線状であることから、ポリペプチドの欠失変異体は、体系的に構築すれば、ポリペプチドのどの領域が免疫認識にとって必須であるかを、例えばこれら欠失変異体を、例えば本明細書に記載されているＩＦＮガンマ測定に供することによって、明示する。別の方法は、ポリペプチドに由来する、重複するオリゴペプチド（好ましくは、例えば２０アミノ酸残基の長さを有する合成物）を利用する。これらポリペプチドは、生物学的検定法（例えば本明細書に記載されているＩＦＮガンマ測定）で試験でき、かつそのうちの幾つかはペプチド中のＴ細胞エピトープの存在の証明である陽性反応を示す（従って免疫原性である）。直線状Ｂ細胞エピトープは、例えばＨａｒｂｏｅらが１９９８年に記載しているように、関心対象のポリペプチド全体をカバーする、重複ペプチドに対するＢ細胞認識を解析することによって決定できる。
【００５８】
Ｔ細胞エピトープの最低長は、少なくとも６アミノ酸であることが示されているが、このようなエピトープがより長いアミノ酸のストレッチで構成されていることは一般的である。従って、本発明のポリペプチド断片は少なくとも７アミノ酸残基長を有する。例えば少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、及び少なくとも３０アミノ酸残基を有する。それゆえに、本発明の方法の重要な態様では、ポリペプチド断片は、せいぜい４０、３５、３０、２５、及び２０アミノ酸残基といった、最大５０アミノ酸残基長であることが好ましい。診断ツールとしては、１０〜２０アミノ酸残基の長さを持つペプチドが最も効果的でることが証明されると予想されることから、本発明の方法で用いられるポリペプチド断片の、特に好ましい長さは１８アミノ酸で、１５、１４、１３、１２アミノ酸、さらに１１アミノ酸もある。
【００５９】
ワクチンは、疾患に対する免疫を産生するための、死んだ、弱毒化された、又はその他改質された微生物（細菌、ウイルス若しくはリケッチア）、或いはそれらの一部の接種用懸濁物として定義される。ワクチンは、疾患を予防するための予防ワクチンとして、又は癌又は潜在性感染症のような既に存在している疾患を治療するための、またアレルギーや自己免疫疾患に関する治療ワクチンとして投与できる。ワクチンは、免疫反応を強化するために、好適アジュバントの形に乳化できる。
【００６０】
ワクチンは、製剤投与量にあった様式で、治療的に有効かつ免疫原性である量が投与される。投与する量は、免疫反応を展開する個体の免疫系の能力及び所望する保護の程度によって決まる。好適な投与量範囲は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム活性成分のオーダーであり、好ましい範囲は、約１μｇ〜３００μｇのような約０．１μｇ〜１０００μｇの範囲であり、特に好ましくは約１０μｇ〜５０μｇの範囲である。初回投与及び追加接種の好適レジメンもまた様々であるが、初回投与後に続けて接種するタイプ、又は別に投与するタイプに分けられる。
【００６１】
使用方法は極めて多様である。ワクチン投与のいずれの通常の方法も応用できる。これらは、固体の、生理学的に許容される基剤若しくは生理学的に許容される分散液を用いた経口又は粘膜用、注射による非経口用を含むと考えられる。ワクチンの投与量は投与経路により決まり、ワクチン接種対象となるヒトの年齢によって変わり、ある程度はワクチン接種対象となるヒトのサイズによっても変わる。
【００６２】
ワクチンは、通常は、注射によって、例えば皮下若しくは筋肉内に非経口的に投与される。その他の投与形態に適合する追加の製剤としては、坐薬及び、いくつかの例では、経口又は粘膜製剤が挙げられる。坐薬の場合は、伝統的な結合剤及びキャリアとしては、例えばポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）又はトリグリセリドが挙げられる。このような座薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、一般に用いられる賦形剤、例えば医薬品等級のマニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含む。これら組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放製剤又は粉末の形態を取り、かつ１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含有すると有利である。
【００６３】
ワクチンは、例えば次のものから選択できる：
【００６４】
タンパク質ワクチン：ポリペプチド（少なくとも１つのその免疫原性部分）又は融合ポリペプチドを含むワクチン組成物。
【００６５】
生組換え体ワクチン：非病原性の微生物又はウイルスで、ワクチンの関連抗原を発現させたもの。このような微生物の周知例は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであり、ウイルスの例は、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ及びＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓである。
【００６６】
これらワクチン構築物全てに関し、好適アジュバントを追加することで、ワクチン効力を増強する（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０００；ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，２００３）。
【００６７】
本発明のさらに別の態様は、アジュバントを含む送達システムである。リポソームは、免疫アジュバント、感染症及び炎症の治療、癌治療、並びに遺伝子治療といった薬学及び医学での送達システムとして用いられている（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９９５）。リポソームのアジュバント効果に影響する可能性のある因子は、リポソームのサイズ、脂質組成、及び表面電荷である。更には、抗原の位置（例えばそれがリポソーム表面に吸着若しくは共有結合しているか、又はリポソーム水性コンパートメント内に閉じこめられているか）も重要であろう。樹枝状細胞は、抗原送達ビークルとして用いることができる。樹枝状細胞のような抗原提示細胞への抗原の負荷は、抗腫瘍免疫で役割を果たす活性なＴ細胞を生成する効果的な方法であることが示されている。
【００６８】
本発明のリポソームは、当技術分野周知の様々な方法によって作ることができる。
【００６９】
好ましくは、カチオン性脂質は、ジメチルアンモニウム頭部基及び１２〜２０個の炭素原子を含む２つの長い疎水性アルキル基、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ−Ｂ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡ−Ｃ）を有する第四アンモニウム化合物である。その他タイプの好ましいカチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、及びジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、並びにＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
糖脂質は、好ましくは、１つから３つの脂肪酸が１又は２個の糖残基をアシル化しているものから作られたアシル化グリコシドである。脂肪酸は飽和又は不飽和の、直鎖又は複合分岐脂肪酸のいずれかである。糖は、単純な単糖又は２つの供給結合した単糖類を含む二糖のいずれかでよい。特に好ましい態様では、糖脂質は、１又は２本の、１４〜９０個の炭素原子を含むグリコシド結合脂肪酸鎖を持つトレハロース、例えばアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）及びアルファ、アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）からなる。
【００７１】
一つの態様では、本発明のリポソームは、カチオン性脂質を形成する二重層、好ましくは第四アンモニウム頭部基及び２本の長い疎水性アルキル基を有する二重層である。特に好ましい態様では、頭部基はジメチルアンモニウムであり、かつ疎水性鎖はヘキサデシル、オクタデシ又はオクタデセニル鎖である。発明のカチオン性脂質は、単独又は組み合わせて用いることができる。更には、カチオン性脂質又はその混合物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のような中性リン脂質、又は他の二重層を形成する中性若しくは合成の、静電気的に中性な脂質と組み合わせて用いることができる。
【００７２】
カチオン性リポソームは、フィルム法を用いて糖脂質をリポソーム膜内に組み込むことによって安定化される。これに対し、この安定化効果は、既に述べた製剤であるＤＤＡ及びＴＤＢの事前生成溶液を混合しても得られない（Ｗｏｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ，１９８０、Ｄｚａｔａ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４）。糖脂質は、その疎水性部分は二重膜の疎水性領域内に埋め込まれ、またその極性頭部基部分は膜の親水性表面に向かって配置される形で、脂質二重層内に安定的に組み込まれなければならない。カチオン性リポソームに加える糖脂質のモル比は、製剤に用いられた糖脂質並びに潜在的賦形剤の性質によって決まる。特定の糖脂質のモル百分率は、０．５〜約９５モル％、好ましくは約２．５〜約２０モル％、さらに好ましくは約５〜約１８モル％である。
【００７３】
特に好ましい本発明の態様では、第四アンモニウム化合物／カチオン性脂質はＤＤＡ−Ｂであり、糖脂質はＴＤＢである。リポソームは、所定重量のＤＤＡ−Ｂ及びＴＤＢを、全脂質濃度が約１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ又は１０ｍＭであるときに、５モル％又は１０モル％又は１５モル％のモル百分率になるように好適有機溶媒中に溶解して調製する。溶媒を蒸発させると、薄い脂質膜が試験管の内壁に残る。次に乾燥した脂質フィルムを、塩を含まないか、又は低濃度の塩を含む薬学的に許容される緩衝液で水和する。安定リポソーム構造体の形成は、イオン、特にリン酸塩及び硫酸塩のようなアニオンの存在に影響を受けると考えられる。好ましくは、有機緩衝液、例えばｐＨ６．０〜８．０、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５の２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｏｍｅｔａｍｏｌｕｍ又は簡略してＴｒｉｓ）又は２−ビス（２−ヒロドキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）は、Ｔｒｉｓ又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓ基剤をＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、次にＨＣｌを加えてｐＨを調節して調製する。緩衝液は、Ｔｒｉｓ又はＢｉｓ−Ｔｒｉｓに限定されるものでなく、任意の薬学的に許容される緩衝液又は緩衝物質が添加されていない純粋な水であってもよい。混合物を脂質混合物の相転移温度より高い温度まで加熱し、５分ごとに、２０分間激しく振盪する。得られたアジュバント製剤は、通常のカチオン性リポソームよりも、有意に改善された物理的安定性を有することを特徴とするＭＬＶからなる。
【００７４】
抗原性物質、即ちタンパク質又はペプチドを加え、アジュバント製剤と混合する。最も好ましくは、抗原性物質は静電引力又は疎水性相互作用によって小胞に結合する。本発明の特に好ましい態様では、結核に対する最終ワクチンは、ＴＤＢによって安定化したＤＤＡリポソームを含有するアジュバント製剤と融合タンパク質Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の溶液を混合することによって調製される。アジュバントは、本発明に従って、１ｍｌあたり２．５０ｍｇのＤＤＡ（４ｍＭ）及び１ｍｌ当たり０．２５ｍｇのＴＤＢ（０．２５ｍＭ）を含み、ｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液中に約５モル％のＴＤＢ濃度に相当するように調製される。このアジュバント製剤約４．５ｍｌを０．５ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６のＴｒｉｓ緩衝液に混合して、融合タンパク質の濃度を１００マイクログラム／ｍｌにして、最終的な、すぐに使用出来るワクチンを得る。
【００７５】
別の好ましい態様では、抗原性物質は、脱水−再水和法を用いて小胞内にカプセル化されるか、或いは抗原は凍結融解技術を用いて組み込まれる。
【００７６】
実施例
実施例１
濃度を増加させたＴＤＢを含有するＤＤＡ小胞の調製
ＴＤＢを含有するＤＤＡ小胞を、薄脂質フィルム法を用いて作った。ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ−Ｂ、重量平均分子量（Ｍｗ）＝６３０．９７）及びＤ−（＋）−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ、Ｍｗ＝９８７．５（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌ）をクロロホルムメタノール（９：１）に別々に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。指定容積の各化合物をガラス製試験管の中で混合した。緩やかなＮ２気流を用いて溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを一晩、低圧下で乾燥させ微量の溶媒を取り除いた。乾燥した脂質フィルムをＴｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で、表１に指定した濃度に水和し、７０℃の水槽に２０分間入れ、サンプルを５分ごとに激しく振盪した。
【００７７】
表１．本発明に従い調製されたアジュバント製剤の範囲一覧表
【００７８】
実施例２
ＴＤＢはＤＤＡ製剤の長期安定性を高める
濃度を増加したＴＤＢを含むＤＤＡ−Ｂ小胞の製剤を４℃に保存し、１日後及び２ヶ月後にもう一度、各製剤の外観を評価した（表２及び図２）。評価は、ＴＤＢがＤＤＡ小胞を安定化することを明瞭に証明した。１日後、ＴＤＢを含まない水性緩衝液のＤＤＡ懸濁液は沈殿を形成したが、一方１０モル％を超えるＴＤＢを含有するＤＤＡ懸濁液には沈殿は形成されなかった。ＴＤＢ濃度がせいぜい６％と低い懸濁液では、極少量の沈殿だけが形成され、これは軽く振盪することによって簡単に再懸濁された。
【００７９】
表２．様々なアジュバント製剤の範囲における２ヶ月安定性
【００８０】
長期保管を促進するために、懸濁液を３０００ｇで３０分間遠心分離した。２．５モル％を超えるＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂ懸濁液だけが極わずかな沈殿を形成したが、これは振盪によって再懸濁できた。
【００８１】
実施例３
ＴＤＢをＤＤＡ小胞の脂質二重層内に組み込む
合成ジアルキルジメチルアンモニウムから形成された脂質二重層は、特徴的な相転移温度Ｔｍにおいて、ゲルから液晶への主相転移を起こす。相転移は、小胞二重層中のジアルキル鎖の溶解を含み、鎖の構成が高い立体規則性を特徴とする状態から、不規則性がより高い状態へと変化する。鎖の溶解プロセスには、大きな転移エンタルピーを伴う。このエンタルピーの変化は、転移温度の最大値Ｔｍを示す熱容量曲線のピークとして検出される。転移温度並びに熱容量曲線の形は、極性頭部基の性質、対イオン、ジアルキル鎖の長さによって決まる。一般にＴｍ値は、鎖長が短くなるに従って、またアルキル鎖の非対称性が増加するほど上がる。サーモトロピック相の挙動に対する第２ジアルキル界面活性剤の影響は、２つの構成成分間の相互作用に関する有益な情報を提供できる。
【００８２】
熱容量曲線は、０．３４ｍｌのセル容積を持つパワー補正式ＶＰ−ＤＳＣ示差走査マイクロ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｒｏｖｏ）を用いて得た。０．３４ｍｌのサンプルのアップスキャンを三回連続して３０Ｃ／時の速度で行った。サンプルは開始温度で５０分間平衡化させた。
【００８３】
図３に示すＤＤＡ−Ｂ及びＤＯＢからなる２成分系のＤＳＣサーモグラムは、ＴＯＢのモル濃度上昇が、脂質膜の熱力学に大きな影響を与えることを示している。ＤＤＡリポソームの二重層の膜へＴＤＢが挿入されたことは、主相転移温度Ｔｍの低下によって証明される。純粋ＤＤＡ−Ｂリポソームのゲルから流体への転移は、４８℃における狭く、よく定義された熱容量ピークを特徴とする。ＴＤＢ濃度の上昇は、ゲルと流体相が同時に存在する流体相共存状態までゲルを広げる。
【００８４】
２０モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームの相転移温度は、純粋なＤＤＡ−Ｂの同温度よりも約５℃低温側にシフトする。ＤＤＡ−Ｂリポソーム膜内へのＴＤＢの挿入は、相転移ピークを二分割する傾向がある。これは、おそらくは、ゲルから流体への転移プロセス中の、脂質膜内の小規模な組成相分離によるものと考えられる。熱力学パラメータを表３に示す。
【００８５】
ＴＤＢの安定化作用は、おそらくは、ＤＤＡ−Ｂリポソーム膜内に固着している、ＴＤＢの強く水和されたトレハロース頭部基によるものであり、これが小胞二重層の脱水及び融合を阻止していると考えられる。
【００８６】
表３．３０℃／時の走査速度の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて得た、増加濃度のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームの熱力学パラメータ。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に分散させ、総脂質濃度は５ｍＭであった。
【００８７】
転移状態がタンパク質抗原の添加により影響を受けるか否かを評価するために、ＤＤＡおおびＴＤＢから構成されたリポソームを、マイコバクテリア融合タンパク質のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の濃度を上げながら加え、製剤を示差走査熱量測定により分析した。図４に示すように、相転移温度は、タンパク質組み込みによって変化しない。
【００８８】
実施例４
ＴＤＢ含有ＤＤＡリポソームの粒子サイズ
実施例４Ａ
ＴＤＢの組み込みによってＤＤＡ−Ｂの安定性を高める
増加濃度のＴＤＢを含有する、フィルム法で調製したＤＤＡ−Ｂの粒子安定性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により測定した。０モル％、６モル％、１１モル％及び２０モル％のＴＤＢを組み込んだＤＤＡ−Ｂ粒子製剤を、０日目にｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目及び１０５日目に測定を実施した（図５）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＴＤＢの組み込みがＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化し、それらが凝集を形成するのを防ぐことがわかる。逆に、ＤＤＡ単独の製剤は、４℃で数日保存後に凝集し、４２日後には凝集のために、それ以上のサイズ測定は不可能であった。これらのデータは、図２に示した、ＤＤＡ及びＤＤＡ／ＴＤＢ製剤の視覚的印象を裏付けるものである。
【００８９】
実施例４Ｂ
水熱法による２成分混合法、又はトレハロースである糖部分を加える代わりに、ＴＤＢを組み込むことでＤＤＡ−Ｂ粒子の安定性を効率的に高める
ＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化させるためのＤＤＡ−Ｂ粒子内へのＴＤＢを組み込みの必要性を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により調べた。フィルム法で調製した１１モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂ粒子の粒子サイズを、１１モル％のＴＤＢと混合したＤＤＡ−Ｂ粒子（Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎにより前に記載されている水熱法）と比較した。両製剤をｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日後、１４日後及び２８日後に測定を実施した（図６）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＴＤＢの組み込みが、２成分を混合した場合に比べＤＤＡ−Ｂ粒子を安定化し、それらが凝集するのを防ぐことがわかる。
【００９０】
ＴＤＢの脂質部分がＤＤＡ−Ｂ粒子の安定化にとって必要であるか否かを調べるために、フィルム法で調製した１１モル％ＴＤＢ含有ＤＤＡ−Ｂ粒子の粒子サイズを、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及びトレハロースをそれぞれ含有するＤＤＡ−Ｂ粒子と比較した。全ての製剤をｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液中に分散した。調製後０日後、１４日後及び２８日後に測定を実施した（図７Ａ）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、ＤＤＡ−Ｂリポソームを安定化するには、ＴＤＢの脂質部分が必須であることがわかる。トレハロース及びスクロースではなくＴＤＢがＤＤＡ−ＴＤＢリポソームの凝集を阻止している。
【００９１】
実施例５
抗原をＴＤＢ含有ＤＤＡ小胞に吸着する
最終の、すぐに使用できるワクチンの、遠心分離したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の上清及び再懸濁した沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、カチオン性リポソームに吸着した抗原を視覚化した。アジュバントは、１５モル％の糖脂質ＴＤＢを組み込んで安定化したＤＤＡから構成されるカチオン性リポソームを含んでいた。最終ワクチンのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６（Ｍｗ４５ＫＤａ）は、４０マイクログラム／ｍｌ、８０マイクログラム／ｍｌ、１６０マイクログラム／ｍｌ及び２００マイクログラム／ｍｌであり、ＤＤＡ及びＴＤＢの濃度はそれぞれ１０ｍＭ及び０．６ｍＭであった。ワクチンを超遠心分離（１００，０００ｇ）に３０分間かけ、上清及び元の容積のＴｒｉｓ緩衝液に再懸濁した沈殿物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した（図８）。Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を５０マイクログラム／ｍｌ含有する参照サンプルをレーン１にロードし、分子量マーカーをレーン２にロードした。タンパク質のバンドはクマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染色で視覚化した。上清をロードしたレーンには肉眼で見えるバンドは無かったが、再懸濁した沈殿物をロードしたレーンには分子量約４５ＫＤａに明瞭なバンドが観察され、全ての、又はほとんど全ての抗原がカチオン性リポソームに吸着していることを示した。
【００９２】
実施例６
ＴＤＢと結びついたＤＤＡは、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６に対する効率的な免疫反応を促進する
アジュバントはある種の免疫反応の誘導に選択性を有することは、一般的に認められている。ＩＮＦ−γ産生に基づくＴｈ１サイトカイン放出の重要性が、ＴＢに対する耐性に必須であることが示されている（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。２０モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡ−Ｂリポソームを、本発明の実施例１に記載の通りに調製し、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６のＴｒｉｓ緩衝液と混合して最終ワクチンにした。最終ワクチンでの濃度は、ＤＤＡは２５０μｇ、ＴＤＢは１００μｇ、及びＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６は２μｇであった。比較のために、同一量のＤＤＡ及びＤＤＢからなるが、既に述べたようにＤＭＳＯ（Ｈｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２００４）で、即ちフィルム法によるリポソーム内へのＴＤＢの組み込みをしないで調製した。マウスを３回免疫感作させ、３回目のワクチン接種後１週目に血液細胞の特異的免疫反応を調べた（図９）。フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢを用いて免疫感作したものについては、既に述べた方法に比べはるかに高い反応が観察され、フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢ製剤がＤＤＡ／ＴＤＢの単純な混合物に比べ、アジュバント効果を高めることが証明された。
【００９３】
同様に、フィルム法で調製したＤＤＡ／ＴＤＢの免疫反応を、臨床使用が既に許可されているアルミニウム系アジュバント、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌの免疫反応と比較した。図１０に見られるように、ＤＤＡ／ＴＤＢを用いた免疫感作は、高レベルのＩＦＮ−γ及び低レベルのＩＬ−５を導いたが、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで免疫感作したマウスは逆のパターンを示し、ＩＦＮ−γの分泌は無視できるほどであり、ＩＬ−５は高レベルであった。
【００９４】
液性免疫を産出するＤＤＡ／ＴＤＢの能力を、初回免疫感作後第５週時のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６特異ＩｇＧ抗体反応をモニタリングすることによって調べた。最終ワクチンでの濃度は、ＤＤＡは２５０μｇ、ＴＤＢは１００μｇ、及びＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６は２μｇであった。比較のために、一群のマウスにＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を投与した。表５に見られるように、ＤＤＡ／ＴＤＢを用いたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６でワクチン接種されたマウスの血清には、高力価の特異ＩｇＧが存在していた。Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌによる免疫感作で得た力価と比較して、ＤＤＡ／ＴＤＢを含むアジュバント製剤はより高レベルの特異抗体を誘導した。
【００９５】
表５．Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６免疫感作マウスより得た血清の抗原特異的抗体の中間点力価
【００９６】
実施例６Ａ
ＤＤＡ／ＴＤＢの組み合わせへ第３成分を組み込むことにより免疫反応を強化
最近、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンドが、新規アジュバント製剤に加えるべき魅力的な標的と考えられている。他の免疫刺激性成分、即ちＴＬＲリガンドをＤＤＡ／ＴＤＢ製剤に組み入れる効果を調べるために、マウスを、２５０μｇのＤＤＡ／５０μｇのＴＤＢに２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を加えたものと、選択した免疫調整剤を用いて免疫感作させた。これらに、前もって形成されたＤＤＡ−ＴＤＢリポソームに、ＴＬＲ３のリガンドとして知られるＰｏｌｙ ＩＣ（ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）１００μｇを加えたもの、並びに２５μｇのＴＬＲ２／ＴＬＲ４を活性化するムラミールジペプチド（ＭＤＰ）を含有させた。ＭＤＰは、水和前のＤＤＡ−ＴＤＢ脂質フィルムに含有させた。
【００９７】
最終免疫後３週目に個々のマウスから、脾細胞又は血液細胞（図の説明に示すように）を精製し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再刺激した後、ＩＦＮ−γ放出レベルを測定した。ＤＤＡ／ＴＤＢ単独又は第３成分（Ｐｏｌｙ ＩＣ及びＴＤＭ）単独で産生する免疫反応に比べて、３つ全ての成分を包含する製剤は高い免疫反応を起こし、ＤＤＡ／ＴＤＢと免疫調整剤との間の相乗作用を示した（図１１ａ及びｂ）。
【００９８】
実施例７
ＴＤＢ以外の糖脂質の組み込みによって、ＤＤＡ−Ｂ粒子の安定性を効率的に高める
ＤＤＡ−Ｂ粒子が、ＴＤＢ以外の糖脂質、１１モル％のβ−Ｄ−ラクトシルセラミド（β−ＬａｃＣｅｒ）、１１モル％のβ−ガラクトシルセラミド（β−ＧａｌＣｅｒ）及び４４ｗ／ｗ％Ｇ（Ｍ１）ガングリオシドそれぞれの組み込みによって安定化できることを例示する。製剤はフィルム法で調製し、０日目にｐＨ７．４の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に分散させた。粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ−Ｓｉｚｅｒ ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．ＵＫ）を用いた動的光散乱測定により測定した。測定は調整後０日目、１４日目及び２８日目に実施した（図１２）。経時的に粒子サイズ安定性を比較すると、糖脂質の組み込みがＤＤＡを安定化することがわかる。
【００９９】
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US5922350
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】本発明で用いられる幾つかのカチオン性脂質の構造を示す図である。
【図２】４℃で２ヶ月間保存した後の１０ｍＭ ＤＤＡ製剤のデジタル画像である。（サンプル０２）は１６モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０３）は１２．５モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０４）は６モル％のＴＤＢを含有し、（サンプル０５）は２．５モル％のＴＤＢを含有し、サンプル（０６）は０．５モル％のＴＤＢを含有し、また参照サンプルはＤＤＡのみを含有している。この図より、ＴＤＢ含有懸濁液はより均一であり、沈殿がないことは明らかである。
【図３】ＴＤＢの濃度を増加させた（上から下に）ＤＤＡ−Ｂからなる多重層リポソームの、３０Ｃ／ｈの走査速度で得たＤＳＣサーモグラムである。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液に分散させた。サーモグラムは、ＴＤＢがＤＤＡリポソーム膜内に挿入されることを明瞭に示している。
【図４】抗原Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の濃度を増加させた（上から下に）ＤＤＡ−Ｂ及びＴＤＢからなる多重層リポソームの、３０Ｃ／ｈの走査速度で得たＤＳＣサーモグラムである。リポソームはｐＨ７．４の１０ｍＭトリス緩衝液に分散させた。サーモグラムは、相転移温度が抗原をリポソーム内へ組み込むことによって変化しないことを明瞭に示している。
【図５】０モル％ＴＤＢ（−◆−）、６モル％ＴＤＢ（−▲−）、１１モル％ＴＤＢ（−★−）及び２０モル％ＴＤＢ（−■−）を含有するＤＤＡリポソームの平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、ＴＤＢを含まないＤＤＡリポソームに著しい増加が見られた。
【図６】ＤＤＡリポソーム（−◆−）、及び水熱法で調製した１１モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−▲−）、フィルム法で調製した１１％モル％のＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−■−）の平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、ＤＤＡリポソーム及び水熱法で調製されたＤＤＡ／ＴＤＢリポソームに著しい増加が見られた。
【図７Ａ】１１モル％ＴＤＢ（−■−）、１０％（ｗ／ｖ）トレハロース（−●−）及び１０％（ｗ／ｖ）スクロース（−Ｘ−）を含有するＤＤＡリポソームの平均粒子サイズの時間展開である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、トレハロース及びスクロースを含有するＤＤＡリポソームは、ＰＣＳによるそれ以上の測定を不可能にする程度まで凝集した。
【図７Ｂ】１０％（ｗ／ｖ）トレハロース及び１１モル％ＴＤＢをそれぞれ含有する１０ｍＭ ＤＤＡ製剤の、４℃で１４日間保存後のデジタル像である。トレハロースを含有する製剤において、著しい凝集が見られた。
【図８】最終的な、すぐ使用可能なワクチンを超遠心分離し、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６の上清及び再懸濁沈殿物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、カチオン性リポソームへの抗原吸着を視覚化した図である。
【図９】本発明の実施例１に記載したように調製したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢ又はＨｏｌｔｅｎ−Ａｎｄｅｒｓｅｎら（２００４）が記載したように調製したＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢで免疫感作を行ったＣ５７Ｂｌ／６ｊマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。リンパ球は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で刺激した。
【図１０】２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢ又は５００υｇのミョウバン（Ａｌｕｍ）に封じ込められたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６／ＤＤＡ／ＴＤＢで免疫感作を行ったＣ５７Ｂｌ／６ｊマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマ及びＩＬ−５の放出を示す図である。リンパ球は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１１Ａ】２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ、１００ｕｇ ポリＩＣ、又は２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ／１００ｕｇ ポリＩＣのいずれかに封じ込められた２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫感作を行ったＢＡＬＢ／Ｃマウスから単離した脾細胞からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。脾細胞は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１１Ｂ】２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ、２５ｕｇ ＭＤＰ、又は２５０ｕｇ ＤＤＡ／５０ｕｇ ＴＤＢ／２５ｕｇ ＭＤＰのいずれかに封じ込められた２μｇのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫感作を行ったＢＡＬＢ／Ｃマウスから単離した血液リンパ球からのＩＦＮガンマの放出を示す図である。血液細胞は、三回目の免疫感作１週後に単離し、５μｇ／ｍｌのＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いてインビトロで再び刺激した。
【図１２】ＤＤＡリポソーム（−◆−）及び１１モル％ＴＤＢを含有するＤＤＡリポソーム（−●−）、１１％ラクトシルセラミドを含有するＤＤＡリポソーム（−＊−）及び１１モル％のアルファガラクトシルセラミド（−Ｘ−）を含有するＤＤＡリポソーム（−Ｘ−）の平均粒子サイズの時間展開図である。リポソームは、ｐＨ７．４に調節された１０ｍＭトリス緩衝液中に分散された。１４日後、糖脂質を含まないＤＤＡリポソームに著しい増加が見られた。これはＴＤＢ以外の糖脂質がＤＤＡを安定化できることを示唆している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム内に糖脂質を組み込むことによって、水性製剤中のカチオン性リポソームを安定化する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のカチオン性リポソームを安定化する方法において、前記カチオン性脂質が、両親媒性第四アンモニウム化合物であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載のリポソームを安定化する方法において、前記両親媒性第四アンモニウム化合物が、１本又は２本の脂肪鎖を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のリポソームを安定化する方法において、前記各脂肪鎖が、１２〜２０個の炭素原子を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載のリポソームを安定化する方法において、前記両親媒性第四アンモニウム化合物が、ＤＤＡ−Ｂ、ＤＤＡ−Ｃ、ＤＤＡ−Ｘ、ＤＯＤＡ−Ｂ、ＤＯＤＡ−Ｃ、ＤＯＤＡ−Ｘ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ又はＤＯＴＭＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のリポソームを安定化する方法において、前記糖脂質が、１つ又は２つの糖残基に結合した１本又は３本までの脂肪族炭化水素鎖から形成されるアシル化グリコシドであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のリポソームを安定化する方法において、前記糖脂質が、２本のアシル鎖を有する二糖であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のリポソームを安定化する方法において、前記アシル鎖が、１５〜９０個の炭素原子を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載のリポソームを安定化する方法において、糖脂質が、アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載のリポソームを安定化する方法において、特定の糖脂質のモル百分率が、０．５〜約９５モル％、好ましくは約２．５〜約２０モル％、より好ましくは約５〜約１８モル％であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法により安定化されたリポソーム生成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のリポソーム生成物において、抗原性化合物がリポソームにカプセル化されていることを特徴とするリポソーム生成物。
【請求項１３】
薬物送達に使用することを特徴とする請求項１０又は１１に記載のリポソーム生成物。
【請求項１４】
アジュバントとして使用することを特徴とする請求項１２に記載のリポソーム生成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のリポソーム生成物を含むことを特徴とするワクチンアジュバント。
【請求項１６】
クラミジア、マラリア又は結核に対するワクチンで使用することを特徴とする請求項１５に記載のアジュバント。
【請求項１７】
請求項１５に記載のアジュバントを含むことを特徴とするクラミジア、マラリア又は結核に対するワクチン。
【請求項１８】
請求項１１に記載のリポソーム生成物を含むことを特徴とする送達システム。
【請求項１】
リポソーム内に糖脂質を組み込むことによって、水性製剤中のカチオン性リポソームを安定化する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のカチオン性リポソームを安定化する方法において、前記カチオン性脂質が、両親媒性第四アンモニウム化合物であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載のリポソームを安定化する方法において、前記両親媒性第四アンモニウム化合物が、１本又は２本の脂肪鎖を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のリポソームを安定化する方法において、前記各脂肪鎖が、１２〜２０個の炭素原子を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載のリポソームを安定化する方法において、前記両親媒性第四アンモニウム化合物が、ＤＤＡ−Ｂ、ＤＤＡ−Ｃ、ＤＤＡ−Ｘ、ＤＯＤＡ−Ｂ、ＤＯＤＡ−Ｃ、ＤＯＤＡ−Ｘ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＰ又はＤＯＴＭＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のリポソームを安定化する方法において、前記糖脂質が、１つ又は２つの糖残基に結合した１本又は３本までの脂肪族炭化水素鎖から形成されるアシル化グリコシドであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のリポソームを安定化する方法において、前記糖脂質が、２本のアシル鎖を有する二糖であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のリポソームを安定化する方法において、前記アシル鎖が、１５〜９０個の炭素原子を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載のリポソームを安定化する方法において、糖脂質が、アルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）又はアルファ，アルファ’−トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載のリポソームを安定化する方法において、特定の糖脂質のモル百分率が、０．５〜約９５モル％、好ましくは約２．５〜約２０モル％、より好ましくは約５〜約１８モル％であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法により安定化されたリポソーム生成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のリポソーム生成物において、抗原性化合物がリポソームにカプセル化されていることを特徴とするリポソーム生成物。
【請求項１３】
薬物送達に使用することを特徴とする請求項１０又は１１に記載のリポソーム生成物。
【請求項１４】
アジュバントとして使用することを特徴とする請求項１２に記載のリポソーム生成物。
【請求項１５】
請求項１１に記載のリポソーム生成物を含むことを特徴とするワクチンアジュバント。
【請求項１６】
クラミジア、マラリア又は結核に対するワクチンで使用することを特徴とする請求項１５に記載のアジュバント。
【請求項１７】
請求項１５に記載のアジュバントを含むことを特徴とするクラミジア、マラリア又は結核に対するワクチン。
【請求項１８】
請求項１１に記載のリポソーム生成物を含むことを特徴とする送達システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５０５１３１（Ｐ２００８−５０５１３１Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１９６１５（Ｐ２００７−５１９６１５）
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２６４２
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０７００６４２２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月５日（２００５．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００２６４２
【国際公開日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（５０７００６４２２）
【Ｆターム（参考）】
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