糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法
【課題】
基質特異性の優れた糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨを組換え体にて高発現生産する方法、および該方法にて得られたＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質、および該タンパク質を用いたグルコース測定試薬を提供する。
【解決手段】
アスペルギルス・オリゼより単離したＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨを高発現することが可能になった。また、その培養生産時にｐＨ７．１〜７．３以下となるようにｐＨ制御を施すことにより安定的なＦＡＤ−ＧＤＨの生産が可能になった。
基質特異性の優れた糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨを組換え体にて高発現生産する方法、および該方法にて得られたＦＡＤ−ＧＤＨタンパク質、および該タンパク質を用いたグルコース測定試薬を提供する。
【解決手段】
アスペルギルス・オリゼより単離したＦＡＤ−ＧＤＨ遺伝子のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することにより、ＦＡＤ−ＧＤＨを高発現することが可能になった。また、その培養生産時にｐＨ７．１〜７．３以下となるようにｐＨ制御を施すことにより安定的なＦＡＤ−ＧＤＨの生産が可能になった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを組換え体にて高発現させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。
【０００４】
文献１〜４にはアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼについて報告されているが、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子に関しては報告されていない。
また、非特許文献１〜４には、遺伝子組み換えによりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを製造することについての記載はない。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【０００５】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性（以下、耐熱性とも表記）についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ ２００６／１０１２３９
【０００６】
しかしながら、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼともいう。）の製造は、組換えＤＮＡ技術を用いても困難を極めている。実際、特許文献２において開示されているＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌Ｋ１２株において０．０９Ｕ／ｍｌと、極めて低いレベルであった。大腸菌Ｋ１２株は、組換え生産において最も汎用され、組換え操作が簡便で、培養のし易さ、安全性の面などから工業的に多用されている宿主である。したがって、大腸菌Ｋ１２株を宿主とした組換え体により、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産する方法が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を提供することである。より具体的には、基質特異性ばかりでなく、生産コストの優れた糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を大量に取得し、利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために、まず、アスペルギルス・オリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。また、ゲノム情報からアミノ酸配列を推定し、該アミノ酸配列のＮ末端領域にシグナルペプチドと思われるアミノ酸配列が存在することを見出した。
シグナルペプチドは、ペリプラズム空間への移行シグナルとなり、該空間のスペース上、発現量に制限が生じる可能性が危惧されたので、該シグナルペプチドの機能を欠失させる検討を行ったところ、ＧＤＨの生産性が約１０倍向上して、生産コストを１／１０に抑えることが可能となった。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法。
項２．
糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法
項３．
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法。
項４．
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列に、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法。
項５．
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼのＮ末端に存在するＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、１〜２５個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
項６．
糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）において、そのＮ末端に存在するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の一部、あるいは全てを置換または／及び欠損させたＧＤＨ遺伝子をコードする項１〜５のいずれかの生産方法に使用されるＤＮＡ配列。
項７．
項６のＤＮＡ配列を含んでなる組換えベクター。
項８．
項７に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
項９．
項８に記載の形質転換体を用いて生産したＧＤＨタンパク質。
項１０．
項９に記載のＧＤＨタンパク質を含む組成物。
項１１．
項１０記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
項１２．
項１１記載の組成物を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。
本発明によれば、アスペルギルス属、またはペニシリウム属より単離したグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子からアミノ酸配列を推定し、シグナルペプチド領域を予測して、シグナルペプチドの一部または全部をコードするＤＮＡ配列を欠失させたり、シグナルペプチドをコードされたアミノ酸配列にアミノ酸置換やアミノ酸挿入を施すことにより、組換え体にてグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産させることができ、かつ、産業利用の観点からより実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態は、糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法である。
【００１２】
本発明者らは、大収量のＧＤＨタンパク質を取得するために鋭意努力した結果、上記目的を達成するために、まずその改変の元になる遺伝子ＤＮＡとして、先の発明でアスペルギルス・オリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出している。
【００１３】
本発明者らは、ＮＣＢＩのデータベースを利用し、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出した。
【００１４】
本発明者らは、非特許文献１〜４、ＮＣＢＩのデータベースなどから、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の同定は容易になしうると予想していた。そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献１〜４に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、ＧＤＨをコードする遺伝子を単離することを試みた。
【００１５】
本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼ培養上清から、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の１つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。
【００１６】
また、本発明者らは他起源のＧＤＨ遺伝子の取得についても種々検討し、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）由来のＧＤＨをコードする遺伝子、およびアスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細も実施例に後述する。
【００１７】
本発明の遺伝子ＤＮＡは本ＧＤＨの発現をさらに向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００１８】
シグナルペプチドは、成熟型タンパク質のＮ末端に残基数１５〜３０個に及ぶ延長ペプチドとして存在する。該ペプチド配列中には、疎水性アミノ酸領域を持ち、新生ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過に先導役を務め、膜通過後は切断されるものである。
【００１９】
本発明における糸状菌由来のＧＤＨ組換え体は特に限定されるものではないが、アスペルギルス属やペニシリウム属などをＧＤＨ遺伝子の給源としたＧＤＨ組換え体が例示できる。好ましくはアスペルギルス属のＧＤＨであり、さらに好ましくはアスペルギルス・オリゼである。最も好ましくは配列番号４、１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨが例示できる。
【００２０】
これらＧＤＨ組換え体は、該ＧＤＨをコードする遺伝子をＰＣＲ法にて入手し、この遺伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化してＧＤＨを含む水溶性画分として得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２１】
本発明においては、ＧＤＨのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することによりシグナルペプチドの機能を低下できる。
例えば、配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨでは、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除することによりシグナルペプチドの機能を低下することができる。あるいは、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことによっても可能である。
具体的な置換位置は例えばシグナルペプチド切断部が例示できる。好ましくはシグナルペプチドのＣ末端に相当するアラニンを他のアミノ酸に置換することにより、機能低下が可能である。
【００２２】
該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液１ｍｌあたりの総活性値を比較して確認することが出来る。また、シグナルペプチド配列の改変は、エドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸シーケンスにより確かめることができる。
【００２３】
Ｎ末端領域に存在するシグナルペプチドの機能を欠失することにより、ＧＤＨタンパク質の発現量が向上することを見出した。
【００２４】
シグナルペプチドの予測ツールとしては、ＰＳＯＲＴ、ＳｉｇｎａｌＰソフトがよく利用されている。それぞれ、ｗｅｂにて「ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／」、あるいは「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」のアドレスから利用することができる。
【００２５】
ＳｉｇｎａｌＰソフトを用いて、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子から推定されたアミノ酸配列（配列番号２）のシグナルペプチド切断位置を予測したところ、１６番目のアラニンと１７番目のセリンの間、あるいは２２番目のアラニンと２３番目のリジンの間で切断される可能性が高いと予想された（図１）。
【００２６】
例えば、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２７】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２８】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００２９】
本発明はさらに、ＧＤＨをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。
【００３０】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
【００３１】
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。
【００３２】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００３３】
本発明において、糸状菌由来ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。まず、アスペルギルス・オリゼのＧＤＨ遺伝子の配列情報を参照し、目的とする糸状菌の予測ＧＤＨ遺伝子を取得することができる。該糸状菌よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子を増幅させ、該遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００３４】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００３５】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００３６】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列を持つものでもよい。
【００３７】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００３８】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３９】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４０】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。糸状菌由来ＧＤＨの組換え体の培養においては、培地のｐＨを制御することが特に重要であり、ｐＨ７．１〜７．３以下に制御することが望ましく、ｐＨ６．０〜７．３の範囲で制御して培養することが特に好ましい。この様にｐＨを制御して培養することにより、糸状菌ＧＤＨタンパク質を大量に調製することが可能になる。
【００４１】
しかしながら、糸状菌由来のＧＤＨは、ｐＨ７．０以下の酸性域では高い安定性を保持するが、ｐＨ７．１〜７．３以上では不安定となり、急速な活性低下が見られる。
したがって本発明においては、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を組換え生産において、培養時のｐＨを７．３以下に制御することが好ましい。
【００４２】
糸状菌由来ＧＤＨ組換え体の培養生産時においては、この活性低下割合が、ｐＨ０．２高くなることにより、元の活性値と比べて１０％以上低下しており、ＧＤＨによっては最大で３０％程度も低下していた。そこで、本特許においては、ｐＨ０．２上昇により、元の活性値と比べて１０％以上が低下する現象における活性低下前の培養液のｐＨ以下、具体的には、７．３以下、好ましくは７．１以下でｐＨ制御することの有効性を推測し、実際に検討して確認した。
【００４３】
組換え体の培養において、菌体の死滅や目的タンパク質の分解を懸念して、ｐＨ制御することは一般的に行われているが、通常は中性域のｐＨを保つことが一般的であり、糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼのように中性以下のｐＨ制御の必要性を説いた例はない。
【００４４】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００４５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００４６】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４７】
試験例
本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００４８】
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
【００４９】
活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／（１６．３×０．１×１．０）
【００５０】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＮＣＢＩのデータベースから予測される、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列からイントロンを除去したものである。配列番号２はその対応アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、ＮＣＩＢのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。
【００５４】
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルス・オリゼ ＴＩ株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。配列番号４はその対応アミノ酸配列である。また、
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。
【００５５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。また、
配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。
【００５６】
後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。
【００５７】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実験例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
【００５８】
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実験例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実験例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実験例１［５］）、取得した。
【００５９】
＜実験例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなってるのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
【００６０】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００６１】
［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００６２】
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号１５）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号１６）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００６３】
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００６４】
＜実施例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入
ＡＯＧＤＨ遺伝子を、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号５，６に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子（野生型）増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号３）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４）であった。
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。また、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端のＫをＭにアミノ酸置換して、ｍＦＡＤ−ＧＤＨとアミノ酸総数を同じにしたものをＳ３と表現した。Ｓ２では、配列番号７のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号６のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。Ｓ３では、配列番号８のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号６のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、Ｓ３をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。なお、それぞれの改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
配列番号９は、上記で決定したシグナルペプチド欠質変異体Ｓ２のＤＮＡ配列を示す。配列番号１０はその対応するアミノ酸配列を示す。
これら形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。各種形質転換体の培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表１,２,３および図２，３，４に示す。なお、アスペルギルス・オリゼ野生株を液体培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４ ・７水和物、２％グルコース、０．０５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）にて、１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて３０℃、１日間培養し、菌体内あるいは菌体外の活性を確認したところ、いずれも約０．２Ｕ／ｍｌ培養液程度のＧＤＨ活性であった。
【００６５】
なお、本特許においては、１ｍｌ培養液あたりのＧＤＨ活性量を比較することにより発現量の比較を行っている。
野生型ＦＡＤ−ＧＤＨ（ＷＴ）では、培養１６〜１８時間でピーク（６．６Ｕ／ｍｌ−ｂ）が見られ、以後活性の低下が見られた。一方、改変型ＦＡＤ−ＧＤＨのＳ２では２２〜２５時間目（７２〜７３Ｕ／ｍｌ−ｂ）、Ｓ３では２０〜２３時間目（７４〜７５Ｕ／ｍｌ−ｂ）でピークが見られ、ＷＴと同様にその後は、ＧＤＨ活性の低下が見られた。
それぞれのピークにおける培養力価を比較したところ、シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が１０倍以上増大することが明らかにされた。
また、シグナルペプチドの削除前後でＦＡＤＧＤＨ精製標品の比活性（Ｕ／ｍｇ）を比較したところ、野生型ＦＡＤＧＤＨ（ＷＴ）２７０Ｕ／ｍｇのところ、削除後の改変型ＦＡＤＧＤＨのＳ２では６７０Ｕ／ｍｇであり、比活性が２．５倍増大していた。シグナルペプチドを削除することにより比活性も増大することが示唆されている。
比活性の増大を考慮しても、少なくとも４．４倍は活性量が増大しているものと思われる。
【００６６】
さらに我々は鋭意検討の結果、糸状菌由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、ｐＨ７．１以上のｐＨ域において、その安定性が低下することを発見した。そして今回の検討で、糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨの組換え体での生産培養において、ｐＨ７．１〜７．３以下、好ましくはｐＨ７．１以下でｐＨ制御を行うことが如何に大切であるか明らかにされた。なお、当該ｐＨ以下となるように培養制御を入れることによりＧＤＨ活性のピークが保てることを確認している。
また、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入したものでは、培養制御ｐＨを７．３まで上げることができる。
【００６７】
＜実施例２＞
アスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＴＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入
ＡＴＧＤＨ遺伝子を、アスペルギルス・テレウスの菌体（寄託番号ＮＢＲＣ ３３０２６として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。）よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号１３，１４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてＡＴＧＤＨ遺伝子（予想シグナルペプチド配列を除去した遺伝子配列）を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＴＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１１）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５６８アミノ酸（配列番号１２）であった。
これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地にて３０℃，１晩培養した後、再度、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地にて３０℃，８時間培養して種菌を調製した。
調製した種菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地にて、Ｋｄ・Ｐ ０．５〜１．５の範囲で１０Ｌ−ジャーファーメンターにて６日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表４,５,６,７および図４,５,６,７に示す。なお、アスペルギルス・テレウス野生株を液体培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４ ・７水和物、２％グルコース、０．０５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）にて、１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて３０℃、１日間培養し、菌体内のＧＤＨ活性を確認したところ、約０．１Ｕ／ｍｌ培養液がピークであった。
一方、ＦＡＤ−ＧＤＨ組換え体では、ピークで約９〜２１Ｕ／ｍｌ−ｂの活性が見られ、
１００〜２００倍程度の培養力価の増大が認められた。また、培養条件を検討したところ、Ｋｄ・Ｐを０．５と低く設定することにより、Ｋｄ・Ｐ ０．７５の時の約１．５倍、Ｋｄ・Ｐ １〜１．５の時の約２倍の培養力価が認められた。なお、Ｋｄ・Ｐを２以上に設定した場合には、培養力価が約５Ｕ／ｍｌ−ｂ以下となることを確認している。
培養温度に関しては、培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表８,９,１０,１１および図８,９,１０,１１に示す。培養温度は２６〜２８℃が最適であり、少なくとも２３〜２８℃で培養する必要があり、２９℃よりも高い温度にて培養した場合、培養力価が半減する傾向が認められた。
ＡＴＧＤＨ遺伝子組換え体の培養においても、培養液のｐＨを７．３以下に保つことが酵素活性を安定に保つために非常に重要であり、ＡＴＧＤＨにおいては、ＡＯＧＤＨよりも、むしろ低いｐＨで培養を終了することが必要になるようであった。
なお、ＡＴＧＤＨ遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列から予想されるシグナルペプチド（ＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡ）（配列番号１７）配列部分のＤＮＡを切除したものである。シグナルペプチド配列を含むものは、Ａ．オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨと同様、ＦＡＤ−ＧＤＨの発現量が乏しかったため、当初からシグナルペプチドを含まないものを用いて培養の検討を行なっている。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
【表４】
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
【表１０】
【００７８】
【表１１】
【００７９】
表１〜表３は、各種変異体の１０Ｌジャーファーメンター培養における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表１は図２に、表２は図３に、表３は図４にそれぞれ対応する。
【００８０】
表４〜表７は、１０Ｌジャーファーメンター培養における夫々Ｋｄ・Ｐ ０．５、０．７５、１、１．５における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表４は図５に、表５は図６に、表６は図７に、表７は図８にそれぞれ対応する。
【００８１】
表８〜表１１は、１０Ｌジャーファーメンター培養における夫々培養温度 ２０、２３、２６、３０℃における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表８は図９に、表９は図１０に、表１０は図１１に、表１１は図１２にそれぞれ対応する。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。また、本発明により広い意味でマルトースに作用しない、グルコースセンサ等に適したグルコースデヒドロゲナーゼを生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのシグナルペプチド切断部位の予測
【図２】Ａ.オリゼ野生型ＧＤＨ（シグナルペプチド有）の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図３】Ａ.オリゼ変異型ＧＤＨ‐Ｓ２の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図４】Ａ.オリゼ変異型ＧＤＨ‐Ｓ３の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図５】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図６】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ０．７５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図７】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ１．０における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図８】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ１．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図９】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２０℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１０】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２３℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１１】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２６℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１２】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２９℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼを組換え体にて高発現させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定は、糖尿病患者が通常の自分の血糖値を把握し治療に生かすために重要である。血糖自己測定に用いられるセンサにはグルコースを基質とする酵素が利用されている。そのような酵素の例としては、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が挙げられる。グルコースオキシダーゼはグルコースに対する特異性が高く、熱安定性に優れているという利点を有していることから血糖センサ用酵素として古くから利用されており、その最初の発表は実に４０年ほど前に遡る。グルコースオキシダーゼを利用した血糖センサにおいては、グルコースを酸化してＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換する過程で生じる電子がメディエーターを介して電極に渡されることで測定がなされるが、グルコースオキシダーゼは反応で生じたプロトンを酸素に渡しやすいため溶存酸素が測定値に影響してしまうという問題があった。
【０００３】
このような問題を回避するために、例えばＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４７）あるいはピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．５．２（旧 ＥＣ１．１．９９．１７））が血糖センサ用酵素として用いられている。これらは溶存酸素の影響を受けない点で優位であるが、前者のＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼは安定性の乏しさや補酵素の添加が必要という煩雑性がある。一方後者のピロロキノリンキノン依存型グルコースデヒドロゲナーゼは、基質特異性に乏しくマルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため、測定値の正確性を損ねる可能性があるという欠点がある。
【０００４】
文献１〜４にはアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼについて報告されているが、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子に関しては報告されていない。
また、非特許文献１〜４には、遺伝子組み換えによりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを製造することについての記載はない。
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２６５−７６
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９６７ Ｊｕｌ １１；１３９（２）：２７７−９３
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３１７−２７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４６（２）：３２８−３５
【０００５】
また、特許文献１にはアスペルギルス属由来フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼが開示されている。本酵素は基質特異性に優れかつ溶存酸素の影響を受けない点で優位である。熱安定性については５０℃１５分処理で８９％程度の活性残存率であり安定性（以下、耐熱性とも表記）についても優れているとされている。特許文献２には、その遺伝子配列、アミノ酸配列が報告されている。
【特許文献１】ＷＯ ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ ２００６／１０１２３９
【０００６】
しかしながら、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼともいう。）の製造は、組換えＤＮＡ技術を用いても困難を極めている。実際、特許文献２において開示されているＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの組換え大腸菌Ｋ１２株において０．０９Ｕ／ｍｌと、極めて低いレベルであった。大腸菌Ｋ１２株は、組換え生産において最も汎用され、組換え操作が簡便で、培養のし易さ、安全性の面などから工業的に多用されている宿主である。したがって、大腸菌Ｋ１２株を宿主とした組換え体により、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産する方法が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、より実用面において有利な血糖センサ用酵素を提供することである。より具体的には、基質特異性ばかりでなく、生産コストの優れた糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を大量に取得し、利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために、まず、アスペルギルス・オリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定、取得し、該遺伝子を用い、大腸菌よりアスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを取得できることを見出した。また、ゲノム情報からアミノ酸配列を推定し、該アミノ酸配列のＮ末端領域にシグナルペプチドと思われるアミノ酸配列が存在することを見出した。
シグナルペプチドは、ペリプラズム空間への移行シグナルとなり、該空間のスペース上、発現量に制限が生じる可能性が危惧されたので、該シグナルペプチドの機能を欠失させる検討を行ったところ、ＧＤＨの生産性が約１０倍向上して、生産コストを１／１０に抑えることが可能となった。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法。
項２．
糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法
項３．
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法。
項４．
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列に、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする項１記載のＧＤＨの生産方法。
項５．
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼのＮ末端に存在するＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、１〜２５個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
項６．
糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）において、そのＮ末端に存在するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の一部、あるいは全てを置換または／及び欠損させたＧＤＨ遺伝子をコードする項１〜５のいずれかの生産方法に使用されるＤＮＡ配列。
項７．
項６のＤＮＡ配列を含んでなる組換えベクター。
項８．
項７に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
項９．
項８に記載の形質転換体を用いて生産したＧＤＨタンパク質。
項１０．
項９に記載のＧＤＨタンパク質を含む組成物。
項１１．
項１０記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
項１２．
項１１記載の組成物を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、グルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産しかつ、より実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。
本発明によれば、アスペルギルス属、またはペニシリウム属より単離したグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子からアミノ酸配列を推定し、シグナルペプチド領域を予測して、シグナルペプチドの一部または全部をコードするＤＮＡ配列を欠失させたり、シグナルペプチドをコードされたアミノ酸配列にアミノ酸置換やアミノ酸挿入を施すことにより、組換え体にてグルコースデヒドロゲナーゼを効率的に生産させることができ、かつ、産業利用の観点からより実用的なグルコースデヒドロゲナーゼを取得することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態は、糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法である。
【００１２】
本発明者らは、大収量のＧＤＨタンパク質を取得するために鋭意努力した結果、上記目的を達成するために、まずその改変の元になる遺伝子ＤＮＡとして、先の発明でアスペルギルス・オリゼのゲノム情報を利用し、グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出している。
【００１３】
本発明者らは、ＮＣＢＩのデータベースを利用し、ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと示す）と推測される遺伝子ＤＮＡを見出した。
【００１４】
本発明者らは、非特許文献１〜４、ＮＣＢＩのデータベースなどから、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の同定は容易になしうると予想していた。そしてさらに、当該遺伝子を含有する組換えベクターを作製し、形質転換した形質転換体を作り、形質転換体が発現する当該遺伝子がコードするタンパク質を精製することも容易になしうると考えていた。具体的には、非特許文献１〜４に記載された方法や公知技術を参考にしてアスペルギルス・オリゼを培養し、その培養上清から各種クロマトグラフィーを用いてＧＤＨを精製して、その末端アミノ酸配列などを分析してプローブを作製し、ＧＤＨをコードする遺伝子を単離することを試みた。
【００１５】
本発明者らは種々検討したが、通常行う塩析、クロマトグラフィー等を用いた精製法では、アスペルギルス・オリゼ培養上清から、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得るのは困難であることが分かった。酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が精製、確認を困難にしている原因の１つであると推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得ないと判断した。このため、遺伝子取得には多くの試行錯誤をともない、非常な困難を極めたが、鋭意検討の結果、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細は実施例に後述する。
【００１６】
また、本発明者らは他起源のＧＤＨ遺伝子の取得についても種々検討し、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）由来のＧＤＨをコードする遺伝子、およびアスペルギルス・テレウス由来のＧＤＨをコードする遺伝子を単離した。その詳細も実施例に後述する。
【００１７】
本発明の遺伝子ＤＮＡは本ＧＤＨの発現をさらに向上させるように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更したものを含みうる。
【００１８】
シグナルペプチドは、成熟型タンパク質のＮ末端に残基数１５〜３０個に及ぶ延長ペプチドとして存在する。該ペプチド配列中には、疎水性アミノ酸領域を持ち、新生ポリペプチド鎖の小胞体膜への付着および膜通過に先導役を務め、膜通過後は切断されるものである。
【００１９】
本発明における糸状菌由来のＧＤＨ組換え体は特に限定されるものではないが、アスペルギルス属やペニシリウム属などをＧＤＨ遺伝子の給源としたＧＤＨ組換え体が例示できる。好ましくはアスペルギルス属のＧＤＨであり、さらに好ましくはアスペルギルス・オリゼである。最も好ましくは配列番号４、１０のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨが例示できる。
【００２０】
これらＧＤＨ組換え体は、該ＧＤＨをコードする遺伝子をＰＣＲ法にて入手し、この遺伝子を発現用ベクターに挿入し、適当な宿主に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化してＧＤＨを含む水溶性画分として得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２１】
本発明においては、ＧＤＨのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することによりシグナルペプチドの機能を低下できる。
例えば、配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有するＧＤＨでは、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除することによりシグナルペプチドの機能を低下することができる。あるいは、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことによっても可能である。
具体的な置換位置は例えばシグナルペプチド切断部が例示できる。好ましくはシグナルペプチドのＣ末端に相当するアラニンを他のアミノ酸に置換することにより、機能低下が可能である。
【００２２】
該目的酵素の発現量がシグナルペプチド配列の存在する状態と比べて高まったかどうかは、該配列への変異導入前後における培養液１ｍｌあたりの総活性値を比較して確認することが出来る。また、シグナルペプチド配列の改変は、エドマン分解を用いたＮ末端アミノ酸シーケンスにより確かめることができる。
【００２３】
Ｎ末端領域に存在するシグナルペプチドの機能を欠失することにより、ＧＤＨタンパク質の発現量が向上することを見出した。
【００２４】
シグナルペプチドの予測ツールとしては、ＰＳＯＲＴ、ＳｉｇｎａｌＰソフトがよく利用されている。それぞれ、ｗｅｂにて「ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／」、あるいは「ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／」のアドレスから利用することができる。
【００２５】
ＳｉｇｎａｌＰソフトを用いて、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子から推定されたアミノ酸配列（配列番号２）のシグナルペプチド切断位置を予測したところ、１６番目のアラニンと１７番目のセリンの間、あるいは２２番目のアラニンと２３番目のリジンの間で切断される可能性が高いと予想された（図１）。
【００２６】
例えば、アスペルギルス・オリゼ由来のＧＤＨ遺伝子を発現用ベクター（プラスミド等多くのものが当該技術分野において知られている）に挿入し、適当な宿主（大腸菌等多くのものが当該技術分野において知られている）に形質転換させた形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じてＥＤＴＡなどのキレート剤や界面活性剤等を添加して可溶化し、ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。または適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＤＨを直接培養液中に分泌させることが出来る。
【００２７】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。また、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＦＡＤＧＤＨを得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００２８】
これらは、例えば、以下の文献に従って進めることができる。
（ａ）タンパク質実験プロトコール第１巻 機能解析編，第２巻 構造解析編 （秀潤社） 西村善文，大野茂男 監修
（ｂ）改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 （洋土社） 岡田雅人，宮崎香
編集
（ｃ）タンパク質実験の進めかた （洋土社） 岡田雅人，宮崎香 編集
あるいは以下に例示する方法によって進めることもできる。
【００２９】
本発明はさらに、ＧＤＨをコードする遺伝子を含むベクター、さらには該ベクターで形質転換された形質転換体を含む。
【００３０】
作製されたタンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて宿主微生物中に移入され、改変タンパク質を生産する形質転換体となる。
【００３１】
ベクターとしてプラスミドを用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合にはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＵＣ１８などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリー Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５αなどが利用できる。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移入を行なう方法などを採用することができ、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いても良い。
【００３２】
このような遺伝子はこれらの菌株より抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらに、ＰＣＲ法の利用により、ＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００３３】
本発明において、糸状菌由来ＧＤＨをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。まず、アスペルギルス・オリゼのＧＤＨ遺伝子の配列情報を参照し、目的とする糸状菌の予測ＧＤＨ遺伝子を取得することができる。該糸状菌よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成する。こうして得られたｃＤＮＡをテンペレートとして、ＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子を増幅させ、該遺伝子をベクターと両ＤＮＡの平滑末端または付着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーを利用してＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００３４】
ＧＤＨ遺伝子の塩基配列は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ，第２１４巻，１２０５（１９８１）に記載されたジデオキシ法により解読した。また、ＧＤＨのアミノ酸配列は上記のように決定された塩基配列より推定した。
【００３５】
上記のようにして、一度選択されたＧＤＨ遺伝子を保有する組換えベクターより、他の微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＧＤＨ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりＧＤＨ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。また、これらのベクターによる他の微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法、プロトプラスト法などを用いることができる。
【００３６】
なお、本発明のＧＤＨ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、該遺伝子の翻訳後のアミノ酸配列の各アミノ酸残基の一部が欠失または置換されるようなＤＮＡ配列をもつものでもよく、また他のアミノ酸残基が付加または置換されるようなＤＮＡ配列を持つものでもよい。
【００３７】
野生型ＧＤＨをコードする遺伝子を改変する方法としては、通常行われる遺伝情報を改変する手法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するＤＮＡの特定の塩基を変換することにより、或いは特定の塩基を挿入または欠失させることにより、改変蛋白質の遺伝情報を有するＤＮＡが作成される。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、或いはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。
【００３８】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００３９】
培地の栄養源としては，微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００４０】
培養温度は菌が成育し、ＧＤＨを生産する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。糸状菌由来ＧＤＨの組換え体の培養においては、培地のｐＨを制御することが特に重要であり、ｐＨ７．１〜７．３以下に制御することが望ましく、ｐＨ６．０〜７．３の範囲で制御して培養することが特に好ましい。この様にｐＨを制御して培養することにより、糸状菌ＧＤＨタンパク質を大量に調製することが可能になる。
【００４１】
しかしながら、糸状菌由来のＧＤＨは、ｐＨ７．０以下の酸性域では高い安定性を保持するが、ｐＨ７．１〜７．３以上では不安定となり、急速な活性低下が見られる。
したがって本発明においては、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）を組換え生産において、培養時のｐＨを７．３以下に制御することが好ましい。
【００４２】
糸状菌由来ＧＤＨ組換え体の培養生産時においては、この活性低下割合が、ｐＨ０．２高くなることにより、元の活性値と比べて１０％以上低下しており、ＧＤＨによっては最大で３０％程度も低下していた。そこで、本特許においては、ｐＨ０．２上昇により、元の活性値と比べて１０％以上が低下する現象における活性低下前の培養液のｐＨ以下、具体的には、７．３以下、好ましくは７．１以下でｐＨ制御することの有効性を推測し、実際に検討して確認した。
【００４３】
組換え体の培養において、菌体の死滅や目的タンパク質の分解を懸念して、ｐＨ制御することは一般的に行われているが、通常は中性域のｐＨを保つことが一般的であり、糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼのように中性以下のｐＨ制御の必要性を説いた例はない。
【００４４】
培養物中のＧＤＨを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には、常法に従って、ＧＤＨが培養液中に存在する場合はろ過、遠心分離などにより、ＧＤＨ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。ＧＤＨが菌体内に存在する場合には、得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００４５】
上記のようにして得られたＧＤＨ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーを行うことにより、精製されたＧＤＨを得ることができる。
【００４６】
例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ファルマシアバイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ （ファルマシアバイオテク）等のカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００４７】
試験例
本発明において、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．５（０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
１４ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース溶液
上記ＰＩＰＥＳ緩衝液１５．８ｍｌ、ＤＣＰＩＰ溶液０．２ｍｌ、Ｄ―グルコース溶液４ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００４８】
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量として定義している。
【００４９】
活性（Ｕ／ｍｌ）＝｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率｝／（１６．３×０．１×１．０）
【００５０】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍｌ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍｌ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、ＮＣＢＩのデータベースから予測される、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株由来のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（遺伝子）を含む、イントロンを除去していないゲノム遺伝子配列からイントロンを除去したものである。配列番号２はその対応アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、ＮＣＩＢのデータベースから予測されるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の全配列を示す。
【００５４】
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（遺伝子）は、本願発明者が同定した、後述のアスペルギルス・オリゼ ＴＩ株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。配列番号４はその対応アミノ酸配列である。また、
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。
【００５５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子とは、後述のアスペルギルス・オリゼ TI株由来のグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の全配列を示す。また、
配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加（挿入）されたアミノ酸配列からなり、かつグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）も、本発明の適用範囲に含まれる。
【００５６】
後述の実施例に記載される、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子の取得手順の概略は以下の通りである。
【００５７】
アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨ遺伝子を取得するために、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス培養上清から、塩析、クロマトグラフィー等を用いてＧＤＨの精製を試みたが、高純度のＧＤＨを得るのは困難であった。（実験例１［１］）
よって、遺伝子取得の常法の１つである部分アミノ酸配列を利用したクローニングは断念せざるを得なくなった。
【００５８】
そこで、我々はＧＤＨを生産する微生物を上記以外に求め鋭意探索した結果、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１株がＧＤＨを生産することを見出し、本菌株の培養液から高純度の精製酵素を得ることに成功した。（実験例１［２］）
次いで、該酵素を用いて部分アミノ酸配列を決定することに成功し、決定したアミノ酸配列を元に、ＰＣＲ法により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ遺伝子を一部取得し、塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。（実験例１［３］［４］）
最終的に、この塩基配列を元に、公開されているアスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースより、アスペルギルス・オリゼＧＤＨ遺伝子を推定（実験例１［５］）、取得した。
【００５９】
＜実験例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨとも記載）遺伝子の推定
［１］アスペルギルス・オリゼ由来ＧＤＨの取得
アスペルギルス・オリゼは、土壌より入手し定法に従ってＬ乾燥菌株とし保管していたものを使用した。以下これをアスペルギルス・オリゼＴＩ株と呼ぶ。アスペルギルス・オリゼＴＩ株のＬ乾燥菌株をポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ製）に植菌し２５℃でインキュベートすることにより復元した。復元させたプレート上の菌糸を寒天ごと回収してフィルター滅菌水に懸濁した。２基の１０Ｌ容ジャーファーメンター中に生産培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４・７水和物、２％グルコース、ｐＨ６．５）６Ｌを調製し、１２０℃１５分オートクレーブ滅菌して放冷した後、上記の菌糸懸濁液を接種し、３０℃、通気攪拌培養を行った。培養開始から６４時間後に培養を停止し、菌糸体を濾過により除去してＧＤＨ活性を含む濾過液を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（分子量１０，０００カット）により低分子物質を除去した。次いで、硫酸アンモニウムを６０％飽和度となるように添加、溶解し、硫安分画を行い、遠心機によりＧＤＨを含む上清画分を回収後、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。得られたＧＤＨ溶液を、Ｇ−２５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて脱塩を行った後、６０％飽和度の硫酸アンモニウムを添加、溶解し、これをＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させ、硫酸アンモニウム飽和度６０％〜０％でグラジエント溶出してＧＤＨ活性のある画分を回収した。更にこれを５０℃で４５分加温した後、遠心分離を行って上清を得た。以上の工程を経て得られた溶液を精製ＧＤＨ標品（ＡＯＧＤＨ）とした。尚、上記精製過程においては、緩衝液として２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用した。さらに、ＡＯＧＤＨの部分アミノ酸配列を決定するため、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの各種手段により精製を試みたものの、部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。また、我々はアスペルギルス・テレウスに属する微生物を独自に探索入手し、上記と同様にその培養上清より、塩析、Ｏｃｔｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等による精製を試みたが、アスペルギルス・オリゼ同様部分アミノ酸配列決定に供することのできる精製標品を得ることはできなかった。通常、一般的に行われる精製法を用いて、高純度で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではっきりと確認できるＧＤＨ標品を得ることができなかったのは、酵素タンパク質に結合しているであろう糖鎖が原因の一つとなってるのではないかと推察した。したがって、遺伝子取得の常法の１つである該タンパク質の部分アミノ酸配列を利用したクローニングを断念せざるを得なくなった。
【００６０】
［２］ペニシリウム属糸状菌由来ＧＤＨの取得
ペニシリウム属糸状菌由来のＧＤＨ生産菌としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１（独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を用い、上記アスペルギルス・オリゼＴＩ株と同用の手順に従って、培養および精製を行い、ＳＤＳ電気泳動でほぼ均一な精製標品を取得した。
【００６１】
［３］ｃＤＮＡの作製
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１について上記方法に従い（ただしジャーファーメンターでの培養時間は２４時間）培養を実施し、濾紙濾過により菌糸体を回収した。得られた菌糸は直ちに液体窒素中に入れて凍結させ、クールミル（東洋紡社製）を用いて菌糸を粉砕した。粉砕菌体より直ちにセパゾールＲＮＡ Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて本キットのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡからはＯｒｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（第一化学薬品社製）をもちいてｍＲＮＡを精製し、これをテンプレートにＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−ＴＭ（東洋紡社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた産物はアガロース電気泳動を行い、鎖長０．５〜４．０ｋｂに相当する部分を切り出した。切り出したゲル断片からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ―（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡを抽出・精製してｃＤＮＡサンプルとした。
【００６２】
［４］ＧＤＨ遺伝子部分配列の決定
上記で精製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨを０．１％ＳＤＳ、１０％グリセロールを含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ここにＧｌｕ特異的Ｖ８エンドプロテアーゼを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し３７℃１６時間インキュベートすることで部分分解を行った。このサンプルをアクリルアミド濃度１６％のゲルを用いて電気泳動してペプチドを分離した。このゲル中に存在するペプチド分子を、ブロット用バッファー（1.4％グリシン、0.3％トリス、20％エタノール）を用いてセミドライ法によりＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＶＤＦ膜上に転写したペプチドはＣＢＢ染色キット（ＰＩＥＲＣＥ社製ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて染色し、可視化されたペプチド断片のバンド部分２箇所を切り取ってペプチドシーケンサーにより内部アミノ酸配列の解析を行った。得られたアミノ酸配列はＩＧＧＶＶＤＴＳＬＫＶＹＧＴ（配列番号１５）およびＷＧＧＧＴＫＱＴＶＲＡＧＫＡＬＧＧＴＳＴ（配列番号１６）であった。この配列を元にミックス塩基を含有するディジェネレートプライマーを作製し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ｃＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを実施したところ増幅産物が得られ、アガロースゲル電気泳動により確認したところ１．４ｋｂ程度のシングルバンドであった。このバンドを切り出して東洋紡製ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆Ｇｅｌ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ−を用いて抽出・精製した。精製ＤＮＡ断片はＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）によりＴＡクローニングし、得られたベクターで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）をヒートショックにより形質転換した。形質転換クローンのうち青白判定でインサート挿入が確認されたコロニーについてＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡社製）を用いてプラスミドをミニプレップ抽出・精製し、プラスミド配列特異的プライマーを用いてインサートの塩基配列を決定した（１３５６ｂｐ）。
【００６３】
［５］ＡＯＧＤＨ遺伝子の推定
決定した塩基配列を元に「ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ」のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）からホモロジー検索を実施し、ＡＯＧＤＨ遺伝子を推定した。検索により推定したＡＯＧＤＨとＰ．ｌｉｌａｃｉｎｏｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ ＮＢＲＣ６２３１由来ＧＤＨ部分配列とのアミノ酸レベルでの相同性は４９％であった。
【００６４】
＜実施例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＯＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入
ＡＯＧＤＨ遺伝子を、アスペルギルス・オリゼの菌体よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号５，６に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてＡＯＧＤＨ遺伝子（野生型）増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＯＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号３）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５９３アミノ酸（配列番号４）であった。
シグナルペプチド切断後のＦＡＤ−ＧＤＨをｍＦＡＤ−ＧＤＨとした場合、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端にＭのみ付加してｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端が１アミノ酸分のびた形態となっているものをＳ２と表現した。また、ｍＦＡＤ−ＧＤＨのＮ末端のＫをＭにアミノ酸置換して、ｍＦＡＤ−ＧＤＨとアミノ酸総数を同じにしたものをＳ３と表現した。Ｓ２では、配列番号７のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号６のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、同様手順にて、Ｓ２をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。Ｓ３では、配列番号８のオリゴヌクレオチドをＮ末端側プライマーとして、配列番号６のプライマーとの組合せでＰＣＲを行い、Ｓ３をコードするＤＮＡ配列をもつ組換えプラスミドを構築し、同様に形質転換体を取得した。なお、それぞれの改変ＦＡＤ−ＧＤＨのＤＮＡ配列を持つプラスミドは、ＤＮＡシーケンシングにて配列上誤りがないことを確かめた。
配列番号９は、上記で決定したシグナルペプチド欠質変異体Ｓ２のＤＮＡ配列を示す。配列番号１０はその対応するアミノ酸配列を示す。
これら形質転換体をＴＢ培地にて１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて１〜２日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。各種形質転換体の培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表１,２,３および図２，３，４に示す。なお、アスペルギルス・オリゼ野生株を液体培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４ ・７水和物、２％グルコース、０．０５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）にて、１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて３０℃、１日間培養し、菌体内あるいは菌体外の活性を確認したところ、いずれも約０．２Ｕ／ｍｌ培養液程度のＧＤＨ活性であった。
【００６５】
なお、本特許においては、１ｍｌ培養液あたりのＧＤＨ活性量を比較することにより発現量の比較を行っている。
野生型ＦＡＤ−ＧＤＨ（ＷＴ）では、培養１６〜１８時間でピーク（６．６Ｕ／ｍｌ−ｂ）が見られ、以後活性の低下が見られた。一方、改変型ＦＡＤ−ＧＤＨのＳ２では２２〜２５時間目（７２〜７３Ｕ／ｍｌ−ｂ）、Ｓ３では２０〜２３時間目（７４〜７５Ｕ／ｍｌ−ｂ）でピークが見られ、ＷＴと同様にその後は、ＧＤＨ活性の低下が見られた。
それぞれのピークにおける培養力価を比較したところ、シグナルペプチドと思われるアミノ酸配列を削除することにより、そのＧＤＨ生産性が１０倍以上増大することが明らかにされた。
また、シグナルペプチドの削除前後でＦＡＤＧＤＨ精製標品の比活性（Ｕ／ｍｇ）を比較したところ、野生型ＦＡＤＧＤＨ（ＷＴ）２７０Ｕ／ｍｇのところ、削除後の改変型ＦＡＤＧＤＨのＳ２では６７０Ｕ／ｍｇであり、比活性が２．５倍増大していた。シグナルペプチドを削除することにより比活性も増大することが示唆されている。
比活性の増大を考慮しても、少なくとも４．４倍は活性量が増大しているものと思われる。
【００６６】
さらに我々は鋭意検討の結果、糸状菌由来のＦＡＤ−ＧＤＨは、ｐＨ７．１以上のｐＨ域において、その安定性が低下することを発見した。そして今回の検討で、糸状菌由来ＦＡＤ−ＧＤＨの組換え体での生産培養において、ｐＨ７．１〜７．３以下、好ましくはｐＨ７．１以下でｐＨ制御を行うことが如何に大切であるか明らかにされた。なお、当該ｐＨ以下となるように培養制御を入れることによりＧＤＨ活性のピークが保てることを確認している。
また、糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入したものでは、培養制御ｐＨを７．３まで上げることができる。
【００６７】
＜実施例２＞
アスペルギルス・テレウス由来グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＡＴＧＤＨと示す）遺伝子の大腸菌への導入
ＡＴＧＤＨ遺伝子を、アスペルギルス・テレウスの菌体（寄託番号ＮＢＲＣ ３３０２６として製品評価技術基盤機構・生物資源部門に登録されている。）よりｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。配列番号１３，１４に示す２種類のオリゴＤＮＡを合成し、調製したｃＤＮＡをテンプレートとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡績製）を用いてＡＴＧＤＨ遺伝子（予想シグナルペプチド配列を除去した遺伝子配列）を増幅した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅI、ＢａｍＨＩで処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＬａｃＺの翻訳開始コドンａｔｇに合わせＮｄｅＩ認識配列のａｔｇを合わせる形でＮｄｅＩサイトを導入したもの）ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、組換えプラスミドを構築した。この組換えプラスミドを、コンピテントハイ ＤＨ５α（東洋紡績製）を用いて導入した。常法に従いプラスミドを抽出し、ＡＴＧＤＨ遺伝子の塩基配列の決定を行った（配列番号１１）。ｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸残基は５６８アミノ酸（配列番号１２）であった。
これら形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地にて３０℃，１晩培養した後、再度、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培地にて３０℃，８時間培養して種菌を調製した。
調製した種菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地にて、Ｋｄ・Ｐ ０．５〜１．５の範囲で１０Ｌ−ジャーファーメンターにて６日間液体培養した。各培養フェーズの菌体を集菌した後、超音波破砕してＧＤＨ活性を確認した。培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表４,５,６,７および図４,５,６,７に示す。なお、アスペルギルス・テレウス野生株を液体培地（１％麦芽エキス、１．５％大豆ペプチド、０．１％ＭｇＳＯ４ ・７水和物、２％グルコース、０．０５ｍＭ ｐ−ベンゾキノン、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）にて、１０Ｌ−ジャーファーメンターを用いて３０℃、１日間培養し、菌体内のＧＤＨ活性を確認したところ、約０．１Ｕ／ｍｌ培養液がピークであった。
一方、ＦＡＤ−ＧＤＨ組換え体では、ピークで約９〜２１Ｕ／ｍｌ−ｂの活性が見られ、
１００〜２００倍程度の培養力価の増大が認められた。また、培養条件を検討したところ、Ｋｄ・Ｐを０．５と低く設定することにより、Ｋｄ・Ｐ ０．７５の時の約１．５倍、Ｋｄ・Ｐ １〜１．５の時の約２倍の培養力価が認められた。なお、Ｋｄ・Ｐを２以上に設定した場合には、培養力価が約５Ｕ／ｍｌ−ｂ以下となることを確認している。
培養温度に関しては、培養フェーズとＯＤ，ｐＨ，ＧＤＨ活性の関係を表８,９,１０,１１および図８,９,１０,１１に示す。培養温度は２６〜２８℃が最適であり、少なくとも２３〜２８℃で培養する必要があり、２９℃よりも高い温度にて培養した場合、培養力価が半減する傾向が認められた。
ＡＴＧＤＨ遺伝子組換え体の培養においても、培養液のｐＨを７．３以下に保つことが酵素活性を安定に保つために非常に重要であり、ＡＴＧＤＨにおいては、ＡＯＧＤＨよりも、むしろ低いｐＨで培養を終了することが必要になるようであった。
なお、ＡＴＧＤＨ遺伝子は、アスペルギルス・テレウス由来ＦＡＤ−ＧＤＨをコードするＤＮＡ配列から予想されるシグナルペプチド（ＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡ）（配列番号１７）配列部分のＤＮＡを切除したものである。シグナルペプチド配列を含むものは、Ａ．オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨと同様、ＦＡＤ−ＧＤＨの発現量が乏しかったため、当初からシグナルペプチドを含まないものを用いて培養の検討を行なっている。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
【表４】
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】
【表７】
【００７５】
【表８】
【００７６】
【表９】
【００７７】
【表１０】
【００７８】
【表１１】
【００７９】
表１〜表３は、各種変異体の１０Ｌジャーファーメンター培養における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表１は図２に、表２は図３に、表３は図４にそれぞれ対応する。
【００８０】
表４〜表７は、１０Ｌジャーファーメンター培養における夫々Ｋｄ・Ｐ ０．５、０．７５、１、１．５における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表４は図５に、表５は図６に、表６は図７に、表７は図８にそれぞれ対応する。
【００８１】
表８〜表１１は、１０Ｌジャーファーメンター培養における夫々培養温度 ２０、２３、２６、３０℃における培養フェーズと培養液の菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示す。表８は図９に、表９は図１０に、表１０は図１１に、表１１は図１２にそれぞれ対応する。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、組換え大腸菌を用いることにより、アスペルギルス・オリゼ由来のグルコースデヒドロゲナーゼを、大量に生産することを可能にするものである。また、本発明により広い意味でマルトースに作用しない、グルコースセンサ等に適したグルコースデヒドロゲナーゼを生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤ−ＧＤＨのシグナルペプチド切断部位の予測
【図２】Ａ.オリゼ野生型ＧＤＨ（シグナルペプチド有）の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図３】Ａ.オリゼ変異型ＧＤＨ‐Ｓ２の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図４】Ａ.オリゼ変異型ＧＤＨ‐Ｓ３の培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図５】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図６】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ０．７５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図７】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ１．０における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図８】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２８℃，Ｋｄ・Ｐ１．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図９】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２０℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１０】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２３℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１１】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２６℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【図１２】Ａ.テレウス野生型ＧＤＨ（予想シグナルペプチド配列切除）の培養温度２９℃，Ｋｄ・Ｐ０．５における培養フェーズと菌体濁度(ＯＤ)、ｐＨ、ＧＤＨ活性値の関係を示すグラフ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法。
【請求項２】
糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法
【請求項３】
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項４】
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列に、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項５】
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼのＮ末端に存在するＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、１〜２５個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項６】
糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）において、そのＮ末端に存在するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の一部、あるいは全てを置換または／及び欠損させたＧＤＨ遺伝子をコードする請求項１〜５のいずれかの生産方法に使用されるＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項６のＤＮＡ配列を含んでなる組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を用いて生産したＧＤＨタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のＧＤＨタンパク質を含む組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物を含むグルコースセンサ。
【請求項１】
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチド配列に変異を導入することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とするＧＤＨの生産方法。
【請求項２】
糸状菌由来のＧＤＨを組換え生産する方法において、そのＮ末端領域に存在するシグナルペプチドのアミノ酸配列の一部を欠損、あるいは置換することにより、該目的酵素の発現量を変異導入前と比べて高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法
【請求項３】
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項４】
配列番号２、４のいずれかに記載されたアミノ酸配列のうち、そのＮ末端に存在するＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡのアミノ酸配列に、１〜２２個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項５】
糸状菌由来のグルコースデヒドロゲナーゼのＮ末端に存在するＭＬＧＫＬＳＦＬＳＡＬＳＬＡＶＡＡＴＬＳＮＳＴＳＡのアミノ酸配列の一部、あるいは全てを削除して発現させることによりこれらのアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現量を高めるか、もしくは、１〜２５個のアミノ酸置換または／及びアミノ酸挿入を行うことにより、元のアミノ酸配列が存在する場合と比べて発現活性を高めることを特徴とする請求項１記載のＧＤＨの生産方法。
【請求項６】
糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）において、そのＮ末端に存在するシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の一部、あるいは全てを置換または／及び欠損させたＧＤＨ遺伝子をコードする請求項１〜５のいずれかの生産方法に使用されるＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項６のＤＮＡ配列を含んでなる組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を用いて生産したＧＤＨタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載のＧＤＨタンパク質を含む組成物。
【請求項１１】
請求項１０記載の組成物を用いるグルコース濃度の測定方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物を含むグルコースセンサ。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【公開番号】特開２００８−１５４５７４（Ｐ２００８−１５４５７４Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７５９４２（Ｐ２００７−７５９４２）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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