細胞の中に核酸を導入する医薬組成物及びその方法
本発明は、多量体タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）又はスペーサ組み込み型ＰＴＤを含む核酸結合分子を用いて、細胞の中に核酸を導入する方法に関する。また、本発明は、核酸結合分子と複合又は接合している核酸を含む新規の組成物に関する。核酸結合分子は、多量体ＰＴＤ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤを含んでいてもよく、さらに核酸結合領域を含んでいてもよい。本発明の核酸複合体又は核酸接合体は、標的遺伝子の発現の阻害及び／又は標的遺伝子の機能の判定に用いられてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ又はインビトロにおいて、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む核酸結合分子を用いて、細胞の中に核酸を導入する方法に関する。また、本発明は、核酸結合分子と複合又は接合している核酸を含む新規の組成物に関する。さらに、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する方法、及び標的遺伝子の機能を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡの分解を誘導してｍＲＮＡのタンパク質合成を阻害するために、低分子ＲＮＡ断片を遺伝子発現における重要なメディエーターであるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と干渉させる方法である。低分子ＲＮＡ断片の塩基がｍＲＮＡと対になると、２本鎖ＲＮＡが形成され、細胞内においてその部分が分解される。遺伝子発現におけるＲＮＡｉの選択的な作用は、特異的な遺伝子の機能を調べる際の有用な研究手段となる。また、ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制する新規の薬物の開発に頻繁に用いられている。
【０００３】
低分子ＲＮＡ断片は、その起源に依存して、これが細胞外の原料に由来する場合はスモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分類され（Elbashir, S. M.等.,Nature 411:494-498(2001)）、細胞自身のゲノムにおけるＲＮＡにコードされた遺伝子から生成された場合はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に分類される。
【０００４】
ｓｉＲＮＡの使用は、大きく２つの分類に分けられる。（１）化学合成又は生物学合成によりインビトロにおいて生成されたｓｉＲＮＡ又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が細胞内に直接に導入される。（２）ｓｉＲＮＡを発現できる種々のＤＮＡベクターが細胞内に導入され、導入された細胞がｓｉＲＮＡを生成する（例えば、米国特許第６２７８０３９号、米国特許出願２００２／０００６６６４号、国際公開ＷＯ９９／３２６１９号、国際公開ＷＯ０１／２９０５８号、国際公開ＷＯ０１／６８８３６号及び国際公開ＷＯ０１／９６５８４号を参照）。これら２つの分類に基づいた種々の応用技術は、これらの利点が効果的に利用されるように用いられることができる。近年、後者において、癌のような病気を起こす遺伝子を下方制御するために、ｓｉＲＮＡを生成できる導入ベクターを作ることが試されている（Mayer,M及びWagner,E.,Hum,Gene Ther.17(11):1062-1076(2006)）。
【０００５】
ＲＮＡｉにおいて、インビボ又はインビトロにおける細胞内に核酸が導入される効率が、ＲＮＡｉの効率を決定する。しかしながら、細胞内にｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを生成するためのＤＮＡベクターを導入する効率は、この２つの技術の実用的な適応のための主な障害として残存する。この原因は、ＲＮＡ又はＤＮＡのような核酸が細胞膜を透過するのに大きすぎることである。実験においては、その機構がはっきりとわからなくても、それらの核酸は、物理的又は化学的手段の必要が無く細胞内に導入され得た。しかしながら、核酸の導入は、非常に低い効率であるため、実用的に用いることは困難である。
【０００６】
研究室内のインビトロの実験において、最もよく用いられる一方法は、核酸の導入を助けるリポソームを用いることである。しかしながら、この場合の効率は、インビトロの実験では高く、インビボでは血液又は体液が原因で顕著に減少する。また、リポソームは毒性が強く、多量のリポソームを用いることは困難であるため、ヒトの体内にこれを適用することは制限される。
【０００７】
細胞内に核酸を導入するための他の方法としては、ウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターは、効率的なキャリアとして用いられるが、細胞の発癌のような重大な副作用を有することが発見されており、さらに、ヒトの細胞内に外来性の遺伝子を導入するという倫理的な問題もあるため、安全を保証するために詳細な臨床研究が強く要求されている。このため、現代の状況において、インビボにおけるウイルスベクターの導入は、多くの研究にもかかわらず、信頼して臨床又は産業に用いることはできない。
【０００８】
インビボにおいて、直接的に裸の核酸（すなわち、核酸の導入を助けるための組成物を有さない核酸）を物理的に導入する他の方法は、例えば、電気穿孔法及び水力学的導入法があり、これらも研究されてきた。近年の研究結果は、静脈、腹腔又は眼球の中への裸のＲＮＡの導入が特異的な遺伝子の発現を減少させることができることを示している（Herweijer,H.及びWolff,J.A.,Gene Ther.10(6):453-458(2003); Hagstrom,J.E.等.,Mol.Ther.10(2):386-398(2004)）。しかしながら、これらの方法の特性は、実用的な適用に制限がある。
【０００９】
さらに、導入ベクターとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等を含むナノ粒子を用いることに着目した研究が活発に行われている。
【００１０】
実用的にｓｉＲＮＡを用いるための障害は、低い導入効率の他に、インビボにおいてその半減期が短いことであり、その使用量を増やすことが必要となる。ＲＮＡｓｅに耐性があるホスホロチオエート等をＲＮＡのリン酸骨格に修飾する試みが行われている。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコレステロール等を用いて、ＲＮＡを修飾してＲＮＡの半減期を増大させることに注目した研究が行われている。しかしながら、種々の試み及び研究にもかかわらず、核酸の低い導入効率が、ＲＮＡｉの実用的な利用における主な問題である。
【００１１】
近年、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を用いることが提案されている。ＰＴＤｓは、細胞内に生物学的活性分子の導入のために有用な低分子量のペプチドである（VIehl C.T.等.,Ann.Surg.Oncol.12:517-525(2005); Noguchi H.等.,Nat.Med.10:305-309(2004); Fu A.L.等.,Neurosci.Lett.368:258-62(2004)）。種々のＰＴＤｓは公知であり、ほとんどの場合、ＰＴＤにおける正電荷アミノ酸の数は非常に多い。一般に知られているＰＴＤは、ＨＩＶのＴａｔであり、さらに、Ａｎｔｐ、ＶＰ２２及び合成ポリアルギニン等である。近年、ＭＰＨ−１及びＳｉｍ−２等が発見された。
【００１２】
ＰＴＤｓは、その種類又は細胞の種類に関係なく、インビトロ又はインビボにおいて、分子の効率的な導入をできることが知られている。ほとんどのＰＴＤｓは、核酸と安定な非共有結合を形成することができ、細胞内に核酸を導入できる。アンテナペディアホメオドメインの第３螺旋は、安定な非共有結合により低分子のオリゴヌクレオチドと複合体を形成し、それらの内部移行を促進する（Dom,G.等.,Nucleic Acid Res.31:556-561(2003)）。Ｐｅｐ−３は非共有結合的な相互作用を介してペプチド核酸と安定な複合体を形成し、それらの細胞内への導入を促進することが報告されている（Morris,M.C.,等,Nucleic Acids Res.35(2007)）。ＨＩＶ ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメイン及びＳＶ４０ Ｔ-抗原の核移行配列由来の親水性ドメインを含むＭＰＧペプチドは、培養哺乳動物の細胞内にオリゴヌクレオチドを導入するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非共有結合を形成することが証明されている（Morris.M.C.等.,Nucleic Acid Res.25:2730-2736(1997)）。Ｔａｔペプチドの２量体、３量体及び４量体は、非共有結合的な相互作用を介してプラスミドＤＮＡと安定な粒子を形成し、細胞内へのそれらの導入を促進することが報告されている。（Rudolph,C.,等.,J.Biol.Chem.278:11411-11418(2003)）。
【００１３】
また、ＰＴＤｓは、核酸の導入を促進するために、核酸と安定な共有結合を形成できる。リポソームに共有結合的に吸着したＴａｔペプチドは、ＤＮＡの急速な導入を促進する（Torchilin,V.P.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8786-8791(2001), Torchilin,V.P.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:1972-1977(2003)）。ジスルフィド結合のような不安定な結合を介して、ペプチド核酸分子が細胞膜を通過して導入されるために、ペネトラチン及びトランスポータンを用いることも提示されている（米国特許第６０２５１４０号を参照）。
【００１４】
ｓｉＲＮＡと共有結合を形成するＰＴＤは提示されている。ｓｉＲＮＡと共有結合的に吸着したＴａｔペプチドは、ｓｉＲＮＡの核への導入を促進する（Chiu,Y.等.,Chem.Biol.11(8):1165-1175(2004)）。ｓｉＲＮＡと共有結合的に吸着したペネトラチン及びトランスポータンは、ｓｉＲＮＡの細胞への効率的な導入を促進する（Davidson,.T.J.等.,J.Neurosci.24(45):10040-10046(2004); Muratovska,A及びEccles,M.R.,FEBS 558:63-68(2004)）。
【００１５】
いくつかの研究において、高い効率の導入が達成されているが、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するためのＤＮＡベクターの導入にＰＴＤを用いて、安定且つ高効率のＲＮＡｉ効果は見られていない。また、ＰＴＤを用いてもわずかな効果しか見られないという報告がある。ＴａＴ又はペネトラチンペプチドと共有結合的に吸着したｓｉＲＮＡは、インビボにおいてＲＮＡｉの効果は示さなかった（Moschos,S.A.等.,ＵＫ生化学会フォーカスミーティングにおけるポスター発表(2007)）。
【００１６】
前記の通り、ほとんどのＰＴＤｓは、正電荷を有するアミノ酸を多く含んでおり、これは負電荷を有する核酸のリン酸骨格と結合できる。この核酸とＰＴＤｓとの結合は、ＰＴＤｓと核酸とが非共有結合を形成すること、及びこれらが共有結合を形成することの両方が可能である。ほとんどの研究では、単一のＰＴＤのみを用いている。ＰＴＤと核酸との弱い結合でさえも、その導入機能の維持のために重要なＰＴＤの構造に影響する。従って、ＰＴＤの導入効率は、顕著に減少され得る。核酸と結合していないＰＴＤは、細胞内に導入される特性を維持するが、核酸の導入に用いることはできない。また、核酸と結合しているＰＴＤは、細胞内に導入される特性が減弱している。結果として、従来の研究におけるＰＴＤｓを用いた細胞内への核酸の導入法は、効果がない又は非効率的である。
【００１７】
従って、細胞内に核酸を導入するために、本発明は、多量体ＰＴＤ分子又はスペーサ組み込み型ＰＴＤ分子を設計し、この多量体ＰＴＤ分子又はスペーサ組み込み型ＰＴＤ分子は、細胞内への導入特性を維持することを特徴とする。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の１つの目的は、インビボ又はインビトロにおいて、核酸結合分子を用いて細胞内への核酸の導入を効率的に行うことである。
【００１９】
前記の目的を達成するために、本発明は、１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合した核酸を含む複合体又は接合体を提供する。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、１ｋｄ〜２５０ｋｄ、５ｋｄ〜１８０ｋｄ、５ｋｄ〜１５０ｋｄ又は５ｋｄ〜３０ｋｄの分子量相当の長さを有してもよい。核酸と核酸結合分子との結合はＰＴＤの構造に影響しないため、細胞内への核酸の導入効率は顕著に増大し、これにより、この導入機能は維持される。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を含む１本鎖核酸である。
【００２１】
他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００２２】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸とである。
【００２３】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００２４】
また、本発明は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を含む１本鎖核酸を備える組成物を含む。
【００２５】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡを備える組成物である。
【００２６】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤを含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸を備える組成物である。
【００２７】
また、本発明は、１つ又はそれ以上のＰＴＤを含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子を含む。
【００２８】
また、本発明は、前記の１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸分子のいずれか１つを製造する方法を含む。
【００２９】
また、この発明は、前記の１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸分子のいずれか１つが細胞内に導入されるのを促進する方法を含む。
【００３０】
また、この発明は、１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法を含む。
【００３１】
また、この発明は、１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。
【００３２】
前記の全ての実施例において、核酸結合分子は、さらに１つ又はそれ以上の核酸結合領域を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】核酸と核酸結合分子との関係を示す図である。Ａは核酸結合領域を有する核酸結合分子を示し、ＰＴＤが核酸と複合していない様子を示す模式図である。Ｂは核酸結合領域を有する核酸結合分子を示し、核酸と複合したＰＴＤ及びたの物質との組み合わせを示す模式図である。Ｃは核酸と複合したＰＴＤである核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。Ｄは核酸と結合した核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。Ｅは核酸と複合した核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。核酸結合領域は、多量体ＰＴＤと、多量体ＰＴＤの中又は端部のいずれかに設けられたスペーサとを含む。スペーサは立体障害効果を有している。
【図２Ａ】Sim-2UB(v)PTD(2)、Sim-2UB(v)PTD(4)、AntpUB(v)PTD(2)及びAntpUB(v)PTD(4)の組み換え型タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｂ】Sim-2UB(v)PTD(2)、Sim-2UB(v)PTD(4)、AntpUB(v)PTD(2)及びAntpUB(v)PTD(4)のＮ末端ユビキチン融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｃ】PTD(2)UB及びPTD(4)UBのＮ末端ユビキチン融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２ＤのＰＴＤｓは、ＨＰｈ−１を表している。
【図２Ｄ】ユビキチンを有するMPH-1-PTDの８量体の融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｅ】ユビキチンを有するMPH-1-PTDの４量体及び６量体の融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図３】ユビキチンを有するＮ末端融合タンパク質を発現させる際に、可溶性タンパク質として多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを精製する方法を示す図である。
【図４】Ｓｒｃ様アダプタータンパク質（ＳＬＡＰ）を有する融合タンパク質を発現させる際に、難溶性タンパク質として多量体ＰＴＤを精製する方法を示す図である。
【図５】ジスルフィド結合を介した接合により、２つのＰＴＤ２量体からＰＴＤ４量体を合成し、ＰＴＤ４量体とＰＴＤ２量体とからＰＴＤ６量体を合成する方法を示す図である。
【図６】異なる共有結合を介した接合により、ｓｉＲＮＡ−多量体ＰＴＤを合成する方法を示す図である。
【図７】スペーサ組み込み型タンパク質によるｓｉＲＮＡの導入効率を示すグラフである。ｓｉＲＮＡの１つの鎖をカルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）により標識した。ｓｉＲＮＡを単独（siRNA CTL）でした場合、又はＡＵＢＰ２（AntpUB(v)PTD(2)）、ＳＵＢＰ２（Sim-2UB(v)PTD(2)）、Ｐ２ＵＢ（PTD(2)UB）若しくはリポソーム（Lipo）と複合して導入した場合を示している。導入された細胞は、ＦＡＣＳにより解析した。
【図８】ｓｉＲＮＡの導入と多量体ＰＴＤにおけるＰＴＤの数量との関係を示すグラフである。導入細胞はＦＡＣＳにより解析した。図８は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【図９】細胞内への相対的な導入効率におけるＰＴＤとｓｉＲＮＡとの比率の影響を示すグラフである。ｓｉＲＮＡは、多量体のＰＴＤ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓと複合体又は接合体を形成したものを用いた。導入細胞はＦＡＣＳにより解析した。図９は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【図１０】スペーサ組み込み型タンパク質と共に導入されたｓｉＲＮＡは、標的遺伝子であるＰＫＣＡの転写を阻害する能力を保持していることを示すグラフである。
【図１１】多量体ＰＴＤｓと共に導入されたｓｉＲＮＡは、標的遺伝子であるＧＡＰＤＨの活性を阻害する能力を保持していることを示すグラフである。
【図１２】ＰＴＤ４量体はＥＧＦＰをコードしているプラスミドＤＮＡを細胞内に導入できることを示すグラフである。導入効率は、ＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰの蛍光を測定することにより解析した。図１２は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、インビボ又はインビトロにおいて、１つ又はそれ以上の核酸結合分子を用いて細胞内に核酸を効率的に導入する方法を含む。核酸結合分子は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含み、核酸と結合する能力を有し、細胞内に核酸を導入する分子として定義されてもよい。細胞内に導入された核酸は、生物学的に活性でも活性でなくてもよい。
【００３５】
本発明の一実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える１つ又はそれ以上の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を備える１本鎖核酸である。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、３つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を備える１本鎖核酸である。
【００３７】
リン酸骨格を備える１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）であってもよい。
【００３８】
本明細書において用いられる「低分子ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、低分子のループ部を有し、基部は１９対〜２７対の塩基対を有するＲＮＡ分子を意味する。ｓｈＲＮＡは、２本鎖の基部における配列と相同な遺伝子を選択的に発現抑制することができる。哺乳動物の細胞は、選択的な遺伝子発現の抑制を媒介するためにｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換できる（Paddison等.,Genes and Dev.16(8):948-58(2002)）。ｓｈＲＮＡは、２本鎖構造を形成するために１本鎖ＲＮＡが折り畳まれたものであり（ヘアピン基部−ループ構造）、２本鎖核酸と同様でありながら１本鎖とみなされ得る。
【００３９】
本明細書において用いられる「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、核酸及び他のポリ核酸塩基鎖と配列特異的にハイブリッド形成できる合成核酸塩基オリゴマー類を意味する。ＰＮＡ骨格は、ＤＮＡ及びＲＮＡにおける荷電したリン酸群を有するデオキシリボース及びリボース糖骨格ではなく、ペプチド結合により結合されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しにより構成される。ポリ核酸塩基鎖の核酸塩基同士のハイブリッド形成は、一般に水素結合における確立した法則に従う。ワトソン−クリックの塩基対形成の法則によると、一般に、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と塩基対を形成する。他の種々の塩基対のモチーフは、当業者に知られている。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備えている１つ又はそれ以上の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００４１】
好ましい実施形態は、２又はそれ以上のＰＴＤ分子を備えている多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００４２】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、その中又はＰＴＤ（ｓ）のＣ末端若しくはＮ末端に１又はそれ以上のスペーサを含むことができる。スペーサは、核酸と複合できないタンパク質又はタンパク質のドメインであってもよい。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、１ｋｄ〜２５０ｋｄ、５ｋｄ〜１８０ｋｄ、５ｋｄ〜１５０ｋｄ又は５ｋｄ〜３０ｋｄの分子量に相当する長さを有していてもよい。例えば、抗体のＦｃドメイン、全抗体、アルブミン、アデュシン（α）、アデュシン（β）、α−シヌクレイン、αＡクリスタリン（ヒートショックタンパク質β−４、ＨｓｐＢ４）、αＢクリスタリン（ヒートショックタンパク質β−５、Ｈｓｐ５）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ−Ａ１）、β−ガラクトシダーゼ、クラスリンコートアセンブリタンパク質 ＡＰ５０、シトクロム−ｃ−オキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＴＰ結合タンパク質 Ｒｈｅｂ、赤血球凝集素、Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼ−活性化タンパク質（ｐ５０−ＲｈｏＧＡＰ）、スモールプロリン−リッチタンパク質２Ｅ（ＳＰＲ−２Ｅ）、チューブリンαー１、チューブリンβ−１、ユビキチン様タンパク質１−活性化酵素 Ｅ１Ａ、又はユビキチン様タンパク質１−活性化酵素 Ｅ１Ｂは、スペーサとして用いられ得る。好ましいスペーサは、ユビキチン（ＵＢ）である。
【００４３】
本発明の一実施形態は、スペーサ組み込み型ＰＴＤを含む核酸結合分子であり、このスペーサ組み込み型ＰＴＤは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサを含む（例えば、配列番号１〜６０）。従って、スペーサ組み込み型ＰＴＤは、１個〜２０個、２個〜１５個、２個〜１０個、１個〜５個、２個〜８個、２個〜５個、又は２個〜４個のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサを含んでいてもよい。スペーサは、核酸と結合しないアミノ酸の配列である。
【００４４】
２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は操作型ＲＮＡ前駆体を含むがこれらだけに限られない。２本鎖ＲＮＡは、化学合成、インビトロにおけるＤＮＡの鋳型からの転写、又はインビボにおける操作型ＲＮＡ前駆体からの転写をされることができる。
【００４５】
本明細書において用いられる「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を備えている２本鎖ＲＮＡ分子を意味し、ここで、アンチセンス領域は、発現を下方制御させる標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的な核酸配列を含んでおり、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を含む。センス領域は、標的核酸配列又はその一部と実質的に同一の配列を有する。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１６個〜３０個のヌクレオチドを有する２本鎖ＲＮＡを備え、より好ましくは、１９個のヌクレオチドを有する２本鎖領域と５’末端及び３’末端のそれぞれにおける２つのヌクレオチドの突出部を有するように、２１個のヌクレオチドを有するセンス鎖と２１個のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖との対を備えている。３’末端における２つのヌクレオチドの突出部は、２’デオキシヌクレオチドを含むことが好ましい（例えば、ヌクレアーゼに耐性があるＴＴ）。
【００４７】
本明細書において用いられる「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、細胞自身のゲノムにおけるＲＮＡコード化遺伝子から生成された約２２個のヌクレオチドの長さを有する非常に低分子の非コード化ＲＮＡを意味し、これはｍＲＮＡの制御及び分解の種々の面に関わることが示されている（Zeng等.,Proc.natl.acad.sci.USA,100(17):9779-84(2003)）。
【００４８】
架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体は、米国特許出願１０／６７２０６９号に提示され、これは、参照として全て本明細書に援用される。架橋化は組成物の薬物動態を変化させるために、例えば、体内における半減期を増大させるために用いられることができる。従って、本発明は、２本鎖が架橋されるように、核酸の２つの相補鎖を有するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ誘導体を含む。例えば、２本鎖のうちの１つの鎖の３’ＯＨ末端は、修飾されていてもよく、また、２本鎖が架橋され且つ３’ＯＨ末端が修飾されていてもよい。ｓｉＲＮＡ誘導体は単一の架橋を含んでいてもよい（例えば、ソラレン架橋）。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡ誘導体は、３’末端にビオチン分子（例えば、光切断性ビオチン）、ペプチド、ペプチド模倣体、ナノ粒子、有機化合物（例えば、蛍光色素のような色素）、又はデンドリマーを有する。このような修飾ｓｉＲＮＡ誘導体によると、細胞の取り込みを改善できる、又はｓｉＲＮＡ誘導体を対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞標的活性を増大できる。また、細胞内におけるｓｉＲＮＡの追跡に有用となる、又は対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性が改善する。従って、架橋型ｓｉＲＮＡが一般に知られているＲＮＡｉを媒介する特性を保持している間に、改善された特性を有するかどうかを判定するために、当業者は、種々の方法を用いて修飾された架橋型ｓｉＲＮＡを選別できる。
【００４９】
本明細書において用いられる、操作型ＲＮＡ前駆体の「操作型」という用語は、自然界において発見されていない前駆体を指し、その前駆体の核酸配列の全部又は一部はヒトにより作られている又は選択されている。一度作られた又は選択された配列は、細胞内の機構による複製、翻訳、転写又はその他の過程を行われ得る。従って、例えば導入遺伝子といった操作型核酸分子により、細胞内において生成されたＲＮＡ前駆体は、操作型ＲＮＡ前駆体である。操作型ＲＮＡ前駆体は、体内においてｓｉＲＮＡに加工され、自然に生じる低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の前駆体に類似する人工のコンストラクトである。操作型ＲＮＡ前駆体は、この分野において公知の標準の方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成を用いる（バイオサーチ社及びアプライドバイオシステムズ社等から入手できる）又は核酸分子にコードさせることにより合成できる。
【００５０】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である１つ又はそれ以上のＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸である。
【００５１】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸である。
【００５２】
２本鎖核酸は、ｓｉＲＮＡを発現できる２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡを含むがこれらだけに限られない。
【００５３】
本明細書において用いられる「ＤＮＡベクター」という用語は、細胞内においてｓｉＲＮＡ部分を生成するＲＮＡを発現するために用いられ、複製できる核酸コンストラクトを意味し、このコンストラクトは細胞内において発現される。このようなベクターは、（１）例えば、プロモーター、オペレーター又はエンハンサーのような遺伝子発現における制御的役割を有する遺伝子配列、それに効果的に連結された（２）２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに加工され得るｓｈＲＮＡ）を生成するために転写されるコード化配列、及び（３）適当な転写開始配列及び終止配列のアセンブリを備えている転写単位を含む。一般に、プロモーター及び他の制御配列は、対象となる宿主細胞によって異なる。ＤＮＡベクターは、環状若しくは線状プラスミド、又は非感染性で且つ組み込まれない（すなわち、脊椎動物の細胞のゲノムの中に組み込まれない）他の線状のＤＮＡであってもよい。線状プラスミドは、環状であったプラスミドを、例えば制限酵素を用いて切断することにより線状化されたプラスミドである。線状ＤＮＡは、例えば、Cherng,J.Y.等.,J.Control.Release 60:343-53(1999),及びChen,Z.Y.等.,Mol.Ther.3:403-10(2001)において述べられているように、状況によっては有利である。また、これらの文献は、参照として本明細書に援用される。ＤＮＡベクターにおいて、転写を調節する制御配列は、一般に、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来する。通常、複製の開始点により与えられる宿主における複製の能力、及び翻訳の認識を促進するための選択遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。レトロウイルス及びアデノウイルス等のウイルス由来のベクターが用いられてもよい。
【００５４】
本明細書において用いられる「ハイブリッド２本鎖核酸」という用語は、２本鎖ＲＮＡと類似の機能を有する２本鎖核酸を意味する。ハイブリッド２本鎖核酸は、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖を含んでいてもよい。ＲＮＡ鎖はアンチセンス鎖であり、標的ｍＲＮＡに結合することが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖のハイブリッドにより形成されたハイブリッド２本鎖核酸は、ハイブリッド化された相補的部分、及び好ましくは少なくとも１つの突出している３’末端を有している。
【００５５】
本明細書において用いられる「環状ＲＮＡ」という用語は、２つのループモチーフを含むＲＮＡ分子を意味し、環状ＲＮＡの１つ又は両方のループ部は、生分解性である。例えば、本発明の環状ＲＮＡは、インビボにおけるループ部の分解により、３’末端が突出した２本鎖ｓｉＲＮＡを生成できるように設計されており、ここで、３’末端は、約２つのヌクレオチドが突出している。
【００５６】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体ＰＴＤを含む核酸結合分子に複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００５７】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）
ＰＴＤはインビボ及びインビトロにおいて、所望のタンパク質、ペプチド、核酸及び化合物を細胞内に導入する又は細胞に取り込ませることを効率的にできることで知られている。
【００５８】
本発明における多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤとして用いるために、本発明の発明者は、組み換え型タンパク質生成工程又は化学合成工程により生成された数種のペプチドを作成した。他の種類のＰＴＤは、所望の導入領域及び用いたリンカーの種類に依存して用いられることが理解される。ＰＴＤは３個〜３０個のアミノ酸、好ましくは５個〜１５個のアミノ酸からなり、そのうちアルギニン残基が１０％〜３０％含まれていることが好ましい。しかしながら、アルギニン残基を含まないＰＴＤｓも考えられる。
【００５９】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、例えば、複数のホモ２量体、ホモ４量体、ホモ６量体及びホモ多量体を含むホモ多量体、又は例えば、複数のヘテロ２量体、ヘテロ４量体、ヘテロ６量体及び他のヘテロ多量体を含むヘテロ多量体であってもよい。本発明の実施形態は、以下の一又はそれ以上の組み合わせを含み、ホモ多量体若しくはヘテロ多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む。
マウス転写因子（ＭＰＨ−１）又はヒト転写因子（ＨＰＨ−１）
ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ（配列番号１）、
Ｔａｔ−ＰＴＤ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号２）、
Ａｎｔｐ又はペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号３）、
トランスポータン（ＣＬＩＫＫＡＬＡＡＬＡＫＬＮＩＫＬＬＹＧＡＳＮＬＴＷＧ）（配列番号４）、
ＨＳＶ−１構築タンパク質Ｖｐ２２
（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ）（配列番号５）、
ポリアルギニンＲ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号６）、
膜移行配列（ＭＴＳ）
（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＡＡＡＤＱＮＱＬＭＰ）（配列番号８）、
少なくとも以下のＰｅｐ−１、Ｐｅｐ−２及びＰｅｐ−３のいずれかを含む低分子両親媒性ペプチドキャリア
Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号９）
Ｐｅｐ−２（ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１０）
Ｐｅｐ−３（ＹＧＦＫＫＦＲＫＰＷＴＷＷＥＴＷＷＴＥ）（配列番号１１）、
Ｓｉｍ−２（ＡＫＡＡＲＱＡＡＲ）（配列番号１２）、
ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１３）、
ＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ）（配列番号１４）、及び
分枝型ポリリジン（米国特許出願２００６／００４１０５８号及びEom,K.D.等.,J.Nanosci.Nanotechnol.6(11):3532-3538(2006)に記載）。
【００６０】
Ｃ末端に括弧書きのシステインを有する本発明の配列（配列番号１５〜２０、２１、３１〜４２、４５及び５７〜６０）において、そのシステインは任意であることを意味する（［表１］及び［表２］を参照）。従って、そのＣ末端のシステインを除いた配列も本発明として考えられ、本発明の実施形態である。Ｃ末端のシステインは、ｓｉＲＮＡと接合するために用いられてもよい。逆に、Ｃ末端にＣｙｓを有さない本発明の配列（配列番号１〜１４、２２〜３０、４３、４４及び４６〜５６）は、ｓｉＲＮＡと接合する際にＣ末端にシステインを含んでもよい。
【００６１】
本発明の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓの特異的な例を［表１］及び［表２］に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
これらのＰＴＤｓに実質的に類似な変異体、例えば、それらと少なくとも６５％は同一である変異体も考えられる。もちろん、同一性の割合は、例えば、６５％、６７％、６９％、７０％、７３％、７５％、７７％、８３％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のように、より高くてもよい。一般に、置換は、保存的な置換である。ＰＴＤの変異体を作る方法は、この分野においては、機械的である。
【００６５】
また、ＰＴＤｓ又はこれらの変異体は、これらの中の置換、欠損又は付加があってもよい。これらの変更は、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠損又は付加であってもよい。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠損又は付加である。当業者は、タンパク質の機能に有意な影響がほとんど無い又は全く無いアミノ酸の置換を十分に知っている（例えば、２次脂肪族アミノ酸を用いた１つの脂肪族アミノ酸の置換）。例えば、表現型においては変化の無いアミノ酸の置換の方法は、Bowie,J,U.等の「タンパク質配列のメッセージの解読：アミノ酸置換の寛容性」Science 247:1306-1310(1990)に示されている。
【００６６】
ＰＴＤ又はそれらの変異体は、修飾骨格、例えば、オリゴカルバミン酸骨格又はオリゴ尿素骨格を有していてもよい（例えば、Wang等.,J.Am.Chem.Soc.119:6444-6445(1997)；Tamilarasu等.,J.Am.Chem.Soc.121:1597-1598(1999)；Tamilarasu等.,Bioorg.Of Med Chem.Lett.11:505-507(2001)を参照）。
【００６７】
核酸結合領域
前記で説明した全ての実施形態において、核酸結合分子は、さらに、１つ又はそれ以上の核酸結合領域を備えてもよい。「核酸結合領域」は、核酸に結合できる領域として定義される。核酸に静電気的に結合できるカチオン性物質、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、その他の塩基性側鎖を有するアミノ酸のポリマー又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等が用いられてもよい。カチオン性物質は、カチオン性物質とアニオン性の核酸のリン酸骨格との静電気的相互作用を介して、配列非依存的に核酸と結合すると考えられている。カチオン性物質とＤＮＡとの相互作用の力は、数ある中でも、カチオン性物質の全体の純電荷を反映すると当業者には理解されている。
【００６８】
適当なカチオン性物質は、ポリリジン、例えば、１０個〜２０個のリジン残基又は１５個〜１７個の残基、特に１６個の残基、すなわち、Ｋ１６を有する。また、３．４ｋＤａの分子量を有するポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジン（分子毎に平均１６個の正電荷を有する）が好ましい。他の適当なポリマーは、２ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ（中性ｐＨにおいて分子毎に平均１２個の正電荷を有する）を含む。ＰＴＤ自身は、高正電荷分子であり、同様によく用いられ得る。「核酸結合領域」という用語は、前記に示した物質と同一の機構を用いて核酸と結合できる物質を含むことを意図する。
【００６９】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤに加えて、核酸結合領域が核酸結合分子の一部である際に、核酸結合領域が核酸と結合すると、核酸とＰＴＤとの結合の可能性が減少され得る。従って、細胞内に核酸を導入させるために、これらがＰＴＤの特性を維持するようにＰＴＤ本来の構造を維持させる可能性を増大させることができる。細胞内に核酸を導入させるＰＴＤの特性は、核酸に直接に結合していなくても発揮される。核酸結合領域が存在し、核酸とＰＴＤとの直接の結合を妨げる場合でさえ、ＰＴＤの導入効果は維持される（図１Ａ）。
【００７０】
従って、ＰＴＤが核酸結合領域として用いられ、また、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤが、細胞内に核酸を導入するための核酸キャリアとして用いられる場合に、細胞内に核酸を導入する効率は顕著に増大する（図１Ｂ）。
【００７１】
製造方法
本発明は、核酸結合領域を有する又は有さない多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを備える核酸結合分子と複合又は接合している前記の核酸分子のいずれか１つを製造する方法も含む。
【００７２】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、化学合成又は組み換え型タンパク質の生成により製造され得る。４量体又は６量体を製造するために、ジスルフィド結合のような共有結合を介した複数の２量体の接合を用いることができる。好ましい実施形態としては、システイン残基は２つのＰＴＤ２量体の末端に位置する。ジスルフィド結合の誘導は、ｐＨ８〜ｐＨ１１の低温における緩やかな撹拌による大気酸化法を用いて行われる。６量体はこの方法おける２量体と４量体との組み合わせにより調製され得る。
【００７３】
核酸と核酸結合分子との結合が静電気的相互作用を介する場合、その結合は非共有結合であってもよい。核酸と核酸結合分子とが所定の比率で混合されると、複合体が形成される。１：１〜１：２０、１：１〜１：３又は１：２である核酸と核酸結合分子との比率は、複合体を生成するために用いられ得る。
【００７４】
核酸と核酸結合分子との結合は、ジスルフィド結合又はアミド結合のような共有結合を介して生じることができる。適当な結合（例えば、エステル結合、カルバメート結合、スルホネート結合、チオエステル結合及びチオエーテル結合等）は、一般的な方法及び当業者に知られた方法に従って形成されてもよい。核酸と核酸結合分子とのジスルフィド結合を形成するために、これらの２つの分子はチオール基を生じるように誘導されてもよく、それらのうちの１つは脱離基を生じてもよい。核酸と核酸結合分子とのジスルフィド結合を形成するための十分な時間（また、温度、ｐＨ及びモル濃度の比率等の適当な条件下）において、修飾型核酸を、結合を形成するために調製された核酸結合分子と共に温置する。共有結合を形成するための多数の方法及びストラテジは、効率的な結合に必要な条件として、当業者に知られている。
【００７５】
本発明は、核酸結合分子と複合又は接合された前記の核酸分子のいずれか１つの細胞内への導入を促進する方法を含み、この方法は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している核酸を生成する工程（ｉ）と、細胞培養培地の中に核酸結合分子と複合又は接合している核酸を加える工程（ii）と、工程（ii）において調製された細胞培養培地の中で細胞を培養する工程（iii）とを備えている。
【００７６】
細胞培養培地の中の細胞を培養する工程は、細胞内に核酸が導入されるような培養時間並びに濃度、温度及びｐＨ等の培養条件において、細胞が培養されることとして定義される。特に、本発明において用いられるプロトコールは、多くの要因（細胞の型、核酸の大きさ及び用いられるＰＴＤ等）に従って異なる。但し、当業者には明白である。
【００７７】
生物学的使用
本発明は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合された核酸を用いて細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法を含み、この方法は、細胞培養培地の中に核酸結合分子と複合又は接合している核酸を加える工程（ｉ）と、工程（ｉ）において調製された細胞培養培地の中で細胞を培養する工程（ii）と、細胞を維持し、標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、その細胞の表現型と対照細胞の表現型とを観察及び比較し、それによって細胞内の標的遺伝子の機能に関する情報を得る工程（iv）とを備えている。
【００７８】
多くの選択肢が標的遺伝子の発現の直接的な阻害のために有用である。適当な試験法は、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイツハイブリッド法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法及び酵素機能を用いた方法等のような当業者に知られている技術、また当業者に知られている他の試験法を用いて、標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベル又は標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルの測定法を含む。多くの方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを検出するのに有用である。そのような方法は、例えば、ドットブロット法、インサイツハイブリッド法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量性逆転写ＰＣＲ法、ノーザンブロット法及び核酸プローブアレイ法を含む。同様に、種々の方法は、タンパク質のレベルの変化を検出するのに有用である。例えばその方法は、タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて免疫学的試験を行い、抗体とタンパク質とにより形成された複合体を検出するウエスタンブロット法、及び用意されたタンパク質が検出できる活性を有するかどうかを試験する活性試験法を含むがそれらに限られない。一般に、核酸が細胞内に導入され、標的遺伝子の発現が阻害されているかどうかを判定するために、核酸結合分子と複合又は接合された核酸と共に培養された細胞の中のタンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、核酸結合分子と複合又は接合された核酸と共に培養されていない対照細胞と比較される。
【００７９】
標的遺伝子の発現の阻害と相関する表現型の変化を検出するために、細胞の表現型を観察することができる。このような表現型の変化は、例えば、アポトーシス、形態的変化及び細胞増殖の変化、また、他の細胞活性の変化を含み得る。特定の遺伝子発現との干渉が、前記の細胞活性のうちの１つ又はそれ以上の減少又は増大を引き起こす場合、標的遺伝子の機能は、細胞の経路のうちの１つ又はそれ以上に起因し得る。本発明は、標的遺伝子の発現を抑制する又は活性化する治療的方法にも向けられる。
【００８０】
「標的遺伝子」とは、その発現を選択的に阻害又は抑制される遺伝子である。この抑制は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体、ハイブリッド２本鎖核酸又は環状ＲＮＡと標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合により誘導される標的遺伝子のｍＲＮＡの分解が促進されて起こる。これらの分子の１つの部分又はセグメントは、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部、例えば、約１６個〜約４０個又はそれ以上のヌクレオチドと実質的に相補的であるアンチセンス鎖である。これまでに、遺伝学的に又は配列決定により同定された遺伝子は、標的となり得る。標的遺伝子は、発生に関わる遺伝子及び制御遺伝子、また、代謝若しくは構造に関わる遺伝子又は酵素をコードしている遺伝子を含んでもよい。本発明の標的遺伝子は、制御遺伝子又は天然型のタンパク質をコードしている遺伝子の場合では細胞内在性の遺伝子であり、逆に、ウイルス若しくは細菌の遺伝子、トランスポゾン又は導入遺伝子の場合、異種起源又は細胞外因性の遺伝子であってもよい。
【００８１】
本明細書において用いられる「細胞」は、通常の生物学的な意味で用いられ、多細胞生物全体を意味するのでなく、例えば、特異的にヒトを意味するのでない。ここでの細胞とは、例えば、鳥類、植物並びにヒト、牛、羊、霊長類、猿、豚、犬及び猫のような哺乳動物といった生物に含まれていてもよい。ここでの細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳動物細胞又は植物細胞）であってもよい。ここでの細胞は、体細胞系又は生殖系起源、全能性又は多能性、及び、分裂性又は非分裂性の細胞であってもよい。ここでの細胞は、生殖母細胞、胚細胞、幹細胞又は完全に分化した細胞に由来する又はこれらを含んでいてもよい。
【００８２】
本発明は、単一の標的遺伝子の機能を判定する方法に限られず、また、ゲノム全体の遺伝子の機能を判定する方法も含む。ゲノムの機能におけるＲＮＡｉライブラリを設計するためのアプローチは、Huesken,D.等.,Nat.Biotechnol.23(8):995-1001(2005), Vanhecke,D.及びJanitz,M.Drug Dicov.Today 10(3):205-12(2005),及びJanitz,M.等.,Handb.Exp.Pharmacol.97-104(2006)に提示されている。
【００８３】
治療的使用
本発明は、核酸結合分子と複合又は接合された核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する治療的方法も含む。従って、本発明の一実施形態は、遺伝子発現の変更により治療できる広範な疾病及び疾患を治療する方法を含む。本発明は、患者の病状又は他の有害状態の防止、その発生率若しくは重症度の調節、又はその治療（検出できる又は測定できる範囲の１つ又はそれ以上の症状の緩和）のために、効果的に用いられることができる。これら及びこれらに関連する治療的組成物及び方法の中において、架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体の使用は、その修飾されたｓｉＲＮＡの特性を未変性のｓｉＲＮＡ分子の特性と比較して改善させる。これは、例えば、インビボにおけるヌクレアーゼ分解に対する耐性が増大される及び／又は細胞の取り込みが改善されることによる。複数の化学修飾を有する架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を維持することは、本明細書において提示している方法に従って容易に判定され得る。従って、本発明は、種々の治療、診断、標的確認、ゲノムの発見、ゲノムの操作及びゲノム薬理学の適用のために有用な試薬及び方法を提供する。
【００８４】
本発明は、患者における特定の病状又は他の有害状態に関する遺伝子発現を変化させる核酸又はその断片を提供することにより、付加的な目的及び利点を満足する。一般に、ここでの核酸は、患者の病状又は有害状態に関して原因となる又は寄与する因子として発現レベルが増大している遺伝子を標的とする。これと関連して、遺伝子の発現は、病状に関する１つ又はそれ以上を阻害する、緩和する又は重症度若しくは再発率を減少するレベルに効果的に下方制御される。また、疾病又は他の有害状態の結果又はその後の状態として、標的遺伝子の発現が増大されることは必然でない種々の異なる疾病モデルにおいて、標的遺伝子の下方制御は、遺伝子発現をより低下すること（すなわち、選択された標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の生成のレベルを減少させるための低下）による治療結果を生じる。
【００８５】
また、本発明は、一遺伝子のより低い発現を目的とし、その遺伝子は、結果として標的遺伝子の生成又は活性化により発現が抑制される「下流」の遺伝子を活性化させる。また、同等の方法としては、対象動物の選択された病状に関する１つ又はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的にし、ここでの遺伝子とは選択された病状に関して原因となる又は寄与する因子として、発現が異常に増大することが知られている多数の遺伝子のいずれかを含む。本発明は、標的とされる病状のための他の標準的な治療剤と組み合わせて投与され得る。
【００８６】
「遺伝子発現の調節」は、標的遺伝子の発現が上方制御又は下方制御されることを意味し、その上方制御又は下方制御は、標的遺伝子によりコードされた細胞内に存在するｍＲＮＡレベル、ｍＲＮＡの翻訳又はタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制御又は下方制御を含むことができる。遺伝子発現の調節は、対象のタンパク質又はタンパク質のサブユニットの発現、レベル又は活性が修飾因子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の非存在下において観察された場合よりも大きい又は小さいように上方制御又は下方制御をさせる標的遺伝子によりコードされた１つ又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットの存在、質又は活性により判定されることができる。例えば、「調節」という用語は、「阻害する」又は「低減する」ことを意味し得るが、これらに限られない。
【００８７】
発現を「阻害する」、「下方制御する」又は「減少する」とは、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子のレベル、１つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードしている同等のＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によりコードされている１つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、本発明の核酸分子の非存在下において観察されるよりも減少することを意味する。一実施形態において、阻害、下方制御又は減少とは、不活性化又は減弱化分子の存在下において観察されるレベルよりも低いことを意味する。他の実施形態において、阻害、下方制御又は減少とは、例えば、スクランブル配列又はミスマッチ配列を有する核酸の存在下において観察されるレベルよりも低いことを意味する。他の実施形態において、本発明の核酸を用いた遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、その核酸の非存在下よりも存在下の方が顕著である。
【００８８】
「標的遺伝子の発現阻害」という用語は、標的遺伝子を下方制御するための本発明の分子の特性を意味する。下方制御の程度を判定するために、特定のコンストラクトを発現している目的の生物又は培養細胞の治療対象体又は分析物は、そのコンストラクトの発現が欠損している対照体と比較される。対照体（コンストラクトの発現が欠損している）の相対値を１００％とする。標的遺伝子の発現阻害は、対照体に対する測定値が約９０％、多くは５０％、また、所定の実施形態では２５％〜０％の際に達成される。適当な試験法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイツハイブリッド法、ＥＬＩＳＡ法、免役沈降法、酵素の機能を用いた方法、及び当業者に知られた表現型アッセイのような当業者に知られた技術を用いてタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００８９】
「治療対象体」とは、生物、組織又は細胞を意味し、これらは、治療対象体となる生物、移植細胞の提供側若しくは受取側となるような生物又は自身が核酸導入の対象である細胞を含む。従って、「治療対象体」は、生物、臓器、組織又は細胞を意味し、これらは、インビトロ又はエクスビボにおける臓器、組織又は細胞を含み、本発明の核酸分子は、本明細書において提示されたポリヌクレオチド導入増強ポリペプチドにより投与され増強される。治療対象体の例としては、哺乳動物の個体又は細胞、例えば、ヒトの患者又は細胞である。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明の組成物又は方法は、関節リウマチ（ＲＡ）の症状の治療又は予防をするために、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を制御する治療手段として有用である。これと関連して、さらに本発明は、２本鎖ＲＮＡを用いるＲＮＡｉによってＴＮＦ−αの発現及び活性を調節するのに有用な化合物、組成物及び方法を提供する。さらに詳細な実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのような２本鎖ＲＮＡ並びにこれに関連する方法を提供し、これらは、哺乳動物の治療対象体におけるＲＡの症状の抑制又は緩和をするために、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を調節するのに効果的である。
【００９１】
本発明は、種々の形式、例えば、経皮的に又は局所注射により投与してもよい（例えば、乾癬の治療のために乾癬プラークの領域に局所注射を行う、又は乾癬性関節炎又はＲＡによって痛みのある患者の関節内に局所注射を行う）。さらに詳細な実施形態において、本発明は、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対して作用する２本鎖ＲＮＡの治療上効果的な量を投与するための製剤及び方法を提供し、それは、ＴＮＦ−αＲＮＡを効果的に下方制御し、また、これにより１つ又はそれ以上のＴＮＦ−αに関連する炎症状態を抑制する又は予防する。他の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞における上方制御遺伝子又は細胞分裂に関わる遺伝子を抑制することにより、癌の治療をする方法も含む。
【００９２】
本発明の分子は、当業者に知られている種々の方法により細胞に投与され、これは、核酸結合分子単独又はこれに薬剤的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤、免疫賦活剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤及び保存剤等の１つ又はそれ以上の付加成分をさらに備えた物質と複合又は接合している核酸を含む製剤を投与することを含むが、これらに限られない。他の実施形態において、核酸結合分子と複合又は接合している核酸は、リポソームに被抱され得る、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性のナノカプセル、生物接着性の微粒子若しくはタンパク質性のベクターのような媒体に組み込まれ得る（例えば、ＰＣＴの国際公開ＷＯ００／５３７２２号を参照）。あるいは、核酸、核酸結合分子及び媒体の組み合わせは、直接注入又は注入ポンプを用いることにより局所的に導入できる。皮下、筋肉内又は皮内のいずれの直接注入であっても、標準的な針及びシリンジを用いて、又はConry等.,Clin.Cancer Res.5:2330-2337(1999)及びＰＣＴの国際公開ＷＯ９９／３１２６２号に提示されているような針を用いない技術を用いて行われ得る。本発明の組成物は、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、注射投与のための無菌溶液又は懸濁液、及び当業者に知られている他の組成物として調製され、用いられることができる。
【００９３】
薬理学的組成物又は製剤は、例えば、細胞又はヒトを含む患者の中への全身投与といった投与法に適する形式の組成物又は製剤を意味する。適する形式は、その用途又は例えば、経口的、経皮的又は注射による移行経路に部分的に依存する。このような形式は、組成物又は製剤を標的細胞に送ることを妨げるべきでない（すなわち、細胞に導入するには負電荷を有する核酸が望ましい）。例えば、血流内に注入される薬理学的組成物は、可溶性であるべきである。他の要因は、当業者に知られており、毒性等の配慮をすることを含む。
【００９４】
「全身投与」とは、インビボにおいて、薬剤が体全体にくまなく分配され、全身の血流内において薬剤を吸収する又は集積することを意味する。全身に吸収させるための投与経路は、静脈内、皮下、腹腔、吸入、経口、肺内及び筋肉内を含むが、これらに限られない。これらのそれぞれの投与経路によって、到達可能な病気の組織に、所望の負電荷を有する核酸が曝露される。血液循環内に薬剤が入る割合は、分子量又は大きさで決定すると示されてきた。本発明の組成物を含むリポソーム又は他の薬剤キャリアの使用は、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織のような所定の組織の型に、薬剤を強く局在化させることができる。リポソーム製剤は、リンパ球及びマクロファージのような細胞の表面と薬剤との結合を促進できるため有用である。このアプローチは、ガン細胞のような異常細胞に対するマクロファージ及びリンパ球に特異的な免疫認識の利点を用いることによって、標的細胞への薬剤の導入を増強させることができる。
【００９５】
「薬剤的に許容できる製剤」とは、組成物又は製剤の所望の活性に最も適する身体の部位に本発明の核酸分子を効果的に分配できる組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子を有する製剤に適する薬剤の例としては、ＣＮＳ内への薬剤の移行を増強できるＰ−糖タンパク質阻害剤（例えば、プルロニックＰ８５）（Jolliet-Riant及びTillement,Fundam.Clin.Pharmacol.13:16-26(1999)）、脳内への移行の後に放出し導入を維持するためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微粒子のような生分解性ポリマー（Emerich,D.F.等.,Cell Transplant8:47-58(1999)）、及び血液脳関門を渡って薬剤を移行させ、神経細胞の取り込み機構を変更させることができるポリブチルシアノアクチレートからなる荷電ナノ粒子（Schroeder,U.等.,Prog.Neuropsychopharmacol.Biol.Psychiatry23(5):941-949(1999)）を含むが、これらに限られない。他の本発明の核酸分子のための導入ストラテジの例としては、Boado等.,J.Pharm.Sci.87:1308-1315(1998)、Tyler等.,FEBS Lett.421:280-284(1999)、Pardridge等.,PNAS USA 92:5592-5596(1995)、Boado,Adv.Drug Delivery Rev.15:73-107(1995)、Aldrian-Herrada等.,Nucleic Acids Res.26:4910-4916(1998)、及びTyler等.,PNAS USA 96:7053-7058(1999)に提示された材料を含むが、これらに限られない。
【００９６】
本発明は、保存又は投与のために調製された組成物を含み、これは、薬剤的に許容されるキャリア又は希釈剤において、所望の化合物の薬剤的有効量を含む。治療的用途のために受け入れられるキャリア又は希釈剤は、医薬品分野においてよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素及び香味料が挙げられる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。さらに、酸化防止剤及び懸濁剤が用いられてもよい。
【００９７】
「薬剤的有効量」とは、病状を予防する、病状の発生を阻害する、又は病状を治療する（ある程度の症状、好ましくは全ての症状を緩和する）のに必要な量である。薬剤的有効量は、病気の型、用いられる組成物、投与経路、治療する哺乳動物の分類、治療する哺乳動物の特異的な身体的特徴、併用する薬物及び当業者が認識する他の要因に依存する。このような化合物の投与量は、循環させる濃度が毒性がほとんど無い又は全く無いＥＤ５０を含む範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に依存する範囲内において変動してもよい。投与量は、循環血漿濃度が細胞培養において測定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の阻害を半分達成する試験化合物の濃度）を含む範囲にある動物モデルにおいて調製されてもよい。このような情報は、ヒトにおける有効量をより正確に決定するために用いられ得る。血漿内のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定されてもよい。
【００９８】
本明細書において定義されたように、本発明の薬剤的有効量は、選択された核酸に依存する。例えば、ｓｈＲＮＡがコードされたプラスミドが選択された場合、約１μｇ〜１０００ｍｇの範囲内の単一用量が投与され、一実施形態においては、１０μｇ、３０μｇ、１００μｇ又は１０００μｇが投与され得る。他の実施形態においては、１ｇ〜５ｇの組成物を投与できる。組成物は、１日〜１週間に１回又はそれ以上の回数を投与され得る。ここでは１日おきの投与も含まれる。当業者は、これらに限られないが、病気若しくは障害の重症度、以前の処置、全身の健康状態及び／又は治療対象体の年齢という要因、さらに、その他の病気の存在を含むいくらかの要因が治療対象体の効果的な処置に必要な投与量及び回数に影響することを理解している。さらに、治療対象体の処置は単一の処置を含み、好ましくは、一連の処置を含む。
【００９９】
経口投与のために、本発明は、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤又は懸濁剤としてもよい。経口組成物は、うがい薬として用いられるために液体キャリアを用いて調製されることもできる。薬剤適合性結合剤及び／又は補助材料を組成物の一部として含むこともできる。錠剤、丸剤、カプセル剤及びトローチ剤等は、以下の成分又は性質が類似した化合物のいずれかを含むことができる。それは、結晶セルロース、トラガントゴム若しくはゼラチンのような結合剤、ゼラチン若しくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチのような分解剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはステローツのような潤滑剤、コロイド性二酸化シリコンのような流動促進剤、スクロース若しくはサッカリンのような甘味剤、又はペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ甘味剤のような甘味剤である。組成物は、簡便な単位量形状に調製されてもよく、また、放出調節製剤、緩衝剤及び／又は腸液コーティングを用いて調製されてもよい。
【０１００】
水性の懸濁液は、これを製造するのに適する賦形剤を有する混合物内の活性材料を含む。このような賦形剤は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム及びアラビアゴムのような懸濁剤であってもよい。また、分散剤又は湿潤剤は、例えばレクチンのような天然のリン脂質、例えばステアリン酸ポリオキシエチレンのような脂肪酸を有するアルキレンの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールのような長鎖脂肪族アルコールを有するエチレン酸化物の縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸のような脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルを有するエチレン酸化物の縮合物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレイン酸のような脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルを有するエチレン酸化物の縮合物であってもよい。水性の懸濁液は、１つ又はそれ以上の、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸のような保存剤、１つ又はそれ以上の着色剤、１つ又はそれ以上の香味剤、及び１つ又はそれ以上のスクロース又はサッカリンのような甘味剤を含むことができる。
【０１０１】
油性の懸濁液は、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油又は液体パラフィンのような鉱物油に活性成分を懸濁することにより調製され得る。油性の懸濁液は、例えば、ミツロウ、硬質のパラフィン又はセチルアルコールのような増粘安定剤を含むことができる。甘味剤及び香味剤により、美味な経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を加えられることにより、保存され得る。
【０１０２】
水の添加によって水性の懸濁液を調製するのに適する分散性の粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ又はそれ以上の保存剤を有する混合物の活性成分を提供する。適当な分散若しくは湿潤剤又は懸濁剤は、前記に例証した通りである。例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤のような賦形剤をさらに加えることもできる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、水に油を含む乳濁液の形態であってもよい。油層は、植物油、鉱物油又はそれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤は、例えばアラビアゴム又はトラガントゴムのような天然のゴム、例えば大豆、レシチン、脂肪酸及びヘキシトールに由来するエステル若しくは部分エステルのような天然のリン脂質、例えばソルビタンモノオレイン酸のような無水物、並びに、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸のようなエチレン酸化物を有する部分エステルの懸濁物であってもよい。乳濁液は、甘味剤及び香味剤も含むことができる。
【０１０４】
医薬組成物は、無菌の注射用の水性懸濁液又は油性懸濁液の形態にできる。この懸濁液は、前記の適当な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知の技術に従って調製され得る。無菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオールのような非毒性の許容できる希釈剤及び溶剤による無菌注射用の溶液又は懸濁液であってもよい。許容される溶媒及び溶剤の中で用いられ得るのは、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌固定油は、溶剤又は懸濁剤として従来から用いられている。この目的のために、無菌固定油は、合成モノ又はジグリセリドを含ませて用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が注射用に調製するのに用いられ得る。
【０１０５】
本発明は、例えば、薬剤の直腸投与のために坐薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では個体であり、直腸の温度では液体となる適当な非刺激性の賦形剤を有する薬剤を混合することにより調製され得る。従って、これは、薬剤が放出されるために直腸において融解される。このような材料は、カカオバター及びポリエチレングリコールを含む。
【０１０６】
吸入による投与のために、本発明は、例えば、二酸化炭素のようなガスである適当な噴霧剤を含む圧力容器若しくは分注器、又はネブライザからエアロゾルスプレの形態で導入されてもよい。このような方法は、米国特許第６４６８７９８号に提示されているものを含む。
【０１０７】
全身投与は、経粘膜的又は経皮的手段により行うことができる。経粘膜又は経皮投与のために、障害を透過するのに適する浸潤剤は、調製の際に用いられる。このような浸潤剤は、一般に当業者に知られ、また、例えば、経粘膜的投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬又は坐薬を用いて投与できる。経皮投与のために、活性化合物は、当業者に一般に知られている軟膏剤、ゲル剤、又はクリーム剤の中に入れられている。
【０１０８】
本発明は、例えば遺伝子銃、バイオインジェクタ及び皮膚に対するパッチのような核酸剤の投与に適する方法、また、米国特許第６１９４３８９号に提示された微粒子ＤＮＡワクチン技術のような針を用いない方法、及び米国特許第６１６８５８７号に提示された粉末状ワクチンを用いた哺乳動物における針を使用しない経皮的なワクチン接種により投与できる。さらに、鼻腔内導入は、特に、Hamajima等.,Clin.Immunol.Immunopathol.88(2):205-210(1998)に提示されるように可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６４７２３７５号に提示されている）及びマイクロカプセル化も用いられ得る（例えば、米国特許第６４７１９９６号に提示されている）。
【０１０９】
定義
便宜上、明細書、実施例及び添付した特許請求の範囲において用いた用語を、ここにまとめる。他に定義されない限り、本明細書において用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明の分野における当業者により一般に理解される意味と同様の意味を有する。
【０１１０】
本明細書において用いられている「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び適当な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。この用語は、１本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）ポリヌクレオチド及び２本鎖ポリヌクレオチドが開示された実施形態に適用できるものとして理解されるべきである。この用語は、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾骨格の残基若しくは結合を含む核酸、また、それは合成物、天然物及び非天然物の核酸、さらに、それは参照の核酸と類似の結合特性を有する核酸、さらに、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される核酸を含む。このようなアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホン酸、キラルメチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含むが、これらに限られない。
【０１１１】
糖、塩基及びリン酸の修飾は、血清リボヌクレアーゼによる核酸の分解を防ぐために核酸分子に対して行われ、これにより効果が増大する。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル及び２’−Ｈヌクレオチド塩基の修飾といったヌクレアーゼ耐性基を用いた修飾による安定性の増強及び／又は生化学活性の増強のために修飾され得る（Usman及びCedergren,TIBS 17:34(1992)、Usman等.,Nucleic Acid Symp.Ser.31:163(1994)、及びBurgin等.,Biochemistry 35:14090(1996)を参照）。核酸分子の糖の修飾は、この分野において広く提示されている。これについて、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／０３１６２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０７０６５号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／１５１８７号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／２６２７０号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／１３５２６号、米国特許第５３３４７１１号、米国特許第５６２７０５３号、米国特許第５７１６８２４号、米国特許第６３０００７４号、Perrault等.,Nature 344:565-568(1990)、Pieken等.,Science 253:314-317(1991)、Usman及びCedergren,Trend in Biochem.Sci.17:334-339(1992)、Beigelman等.,J.Biol.Chem.270:25702(1995)、Karpeisky等.,Tetrahedron Lett.39:1131(1998)、Earnshaw及びGait,Biopolymers (Nucleic Acid Science) 48:39-55(1998)、Verma及びEskstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134(1998)、及びBurlina等.,Bioorg.Med.Chem.5:1999-2010(1997)を参照するとよい。前記の参考文献の全ては、触媒作用を調節することなく核酸分子の中に、糖、塩基及び／又はリン酸の修飾等を組み込む位置を決定するための一般的な方法及びストラテジが記載されている。
【０１１２】
このような方法等の観点において、同様の修飾は、細胞内のＲＮＡｉを促進するための能力が有意に阻害されない限り、本発明の核酸を修飾するために本明細書において記載されたように用いられることができる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及び／又は５’−メチルホスホン酸結合を有するオリゴヌクレオチドのインターヌクレオチド結合の化学修飾は、安定性を改善する一方で、過剰な修飾は、毒性を又は活性の減少を引き起こし得る。従って、核酸分子を設計する際に、これらのインターヌクレオチド結合の量を最小化するべきである。これらの結合の量を減少することは、毒性をより低下させ、これらの分子の効力の増大及び特異性の増大を引き起こす。
【０１１３】
例えば、核酸をＣｙ３、フルオレセイン又はローダミンのようなフルオロフォアを用いて標識するといった公知の方法を用いて、本発明の核酸を標識できる。この標識は、例えば、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ標識キット（アンビオン）のようなキットを用いて行うことができる。さらに、核酸を例えば、３Ｈ、３２Ｐ又は他の適当な同位体を用いて放射標識できる。
【０１１４】
「ＲＮＡ」は少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボ−フラノース部の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。その用語は、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡのような分離ＲＮＡ、本質的に精製されたＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより生成されたＲＮＡ、並びに１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／又は改変により天然型のＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡを含む。このような改変は、ヌクレオチドでない材料を、ｓｉＲＮＡの末端に、又は、例えば、ＲＮＡの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの内部に付加することを含むことができる。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然型のヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含むこともできる。このような改変型ＲＮＡ分子は、ＲＮＡアナログ又は天然型ＲＮＡのアナログとして適用され得る。
【０１１５】
「センス領域」とは、核酸のアンチセンス領域と相補性を有する核酸のヌクレオチド配列を意味する。さらに、核酸のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１１６】
「アンチセンス領域」とは、核酸のセンス領域と相補性を有する核酸のヌクレオチド配列を意味する。さらに、核酸のアンチセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１１７】
本明細書において用いられている「複合する」という用語は、非共有結合を介して２つの分子が相互作用していることを意味する。非共有結合には、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力及び疎水結合の４つの主たる型がある。正に荷電したＰＤＴは、凝集体、ナノ粒子又は可溶性複合体として、負に荷電した核酸と静電気的に非共有結合による複合体を形成することができる。
【０１１８】
本明細書において用いられている「接合する」という用語は、共有結合を介して２つの分子が相互作用していることを意味する。共有結合は一般に、安定である。共有結合の例は、ジスルフィド結合又はアミド結合を含むがこれらに限られない。しかしながら、種々の共有結合が許容されるように、種々の官能基が用いられることは当業者には明白である（例えば、エステル結合、カルバミン酸結合、スルホン酸結合、チオエステル結合又はチオエーテル結合）。共有結合は、化学修飾された核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はその両方の鎖における３’末端、５’末端又はその両方に形成され得る。
【０１１９】
本明細書において用いられている「多量体ＰＴＤ」という用語は、１つよりも多くドメインを含み、そのドメイン同士が結合しているペプチド鎖を意味する。本発明の多量体ペプチドの中のドメインは、ホモ多量体を形成するために同一となり得る、又はヘテロ多量体を形成するために互いに異なり得る。ホモ多量体又はヘテロ多量体は、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体又はそれ以上の多量体を含むことができる。一般に、リンカーは、他の単量体と架橋が形成できるシステイン残基のようなアミノ酸残基に続く１つ〜５つのアミノ酸からなる。システイン残基は２つのペプチド分子の間にジスルフィド架橋を形成できるため、システイン残基を用いることが好ましい。但し、他の多量体ペプチド鎖の形成の手段も当業者に知られている。例えば、システイン残基の位置において、アミノ酸残基又は人工のアミノ酸のような化学物質は、化学的な架橋形性能を含み得る（例えば、糖残基、Marcaurelle等.,Tetrahedron Lett.39:8417-8420(1998)、これは、本明細書に参照として援用される）。
【０１２０】
「標的遺伝子」は、発現を選択的に阻害又は抑制される遺伝子である。この発現抑制は、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を促進することにより、又は標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより達成される。その分解又は翻訳の阻害は、標的遺伝子のｍＲＮＡと、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体、ハイブリッド２本鎖核酸又は環状ＲＮＡとの結合により誘導される。前記の分子の一部又は一セグメントは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの約１６個〜約４０個のヌクレオチドを有する部分と実質的に相補的であるアンチセンス鎖である。遺伝学的に又は配列決定によりこれまでに同定された遺伝子は、標的となり得る。標的遺伝子は、発生に関わる遺伝子及び制御遺伝子を含んでもよく、また、代謝若しくは構造に関わる遺伝子又は酵素をコードしている遺伝子を含んでもよい。標的遺伝子は、表現型が研究されている細胞、又は表現型の特徴に直接的又は間接的に影響する態様を有する生物において発現されてもよい。本発明の標的遺伝子が、制御遺伝子又は未変性のタンパク質をコードしている遺伝子の場合は、細胞に内在的な遺伝子であり、また、標的遺伝子がウイルス若しくは微生物の遺伝子、トランスポゾン又は導入遺伝子の場合は、細胞に関して異種性又は外因性であってもよい。いずれかの場合において、阻害されない標的遺伝子の発現は、病気又は異常を引き起こし得る。
【０１２１】
２つの核酸の関係における「実質的に同一」という用語は、例えば、以下に記載されているような配列比較アルゴリズムを用いて、又は視覚的な検査により測定できるように、比較され且つ最大限に一致するように整列させた場合に、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％又は８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチドの同一性を有する２又はそれ以上の配列又はサブ配列を意味する。実質的な同一性は、少なくとも約１６個〜４０個のヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約４０個〜６０個のヌクレオチドの長さの配列の領域にわたって存在し、他の例では、少なくとも６０個〜８０個のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在し、さらに他の例では、少なくとも９０個〜１００個のヌクレオチドの長さにわたって存在し、さらに他の例では、ヌクレオチドのコード領域のような比較される配列の全長の配列が実質的に同一である。
【０１２２】
本明細書において用いられている「実質的に相補的」という用語は、特定化された条件下において、ハイブリッド形成するために十分に相補的である２つの配列として定義される。ハイブリッド形成の多様な条件は、本発明において用いられてもよく、それは、高い厳密性、中程度の厳密性及び低い厳密性の条件を含む。高い厳密性を有する条件は、当業者に知られており、例えば、Maniatis等.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版(1989)、及びAusubel等.,Short Protocols in Molecular Biology(1989)を参照するとよく、これらは参照として本明細書に援用される。一般に、高い厳密性を有する条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低いように選定される。Ｔｍは、平衡状態における標的配列に対して、標的配列に相補的なプローブの５０％がハイブリッド形成する（規定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度における）温度である（Ｔｍにおいて、標的配列が過剰に存在する条件で、平衡状態に５０％のプローブが占められる）。高い厳密性を有する条件は、塩濃度としてナトリウムイオンが約１．０Ｍよりも低く、例えば、ｐＨが７．０〜８．３であり、短いプローブ（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では低くとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチドよりも長い）では低くとも約６０℃の温度において、ナトリウムイオン（又は他の塩）が約０．０１Ｍ〜１．０Ｍの濃度である。高い厳密性を有する条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成されてもよい。中程度の厳密性又は低い厳密性を有する条件は、この分野において公知なものを用いてもよい。
【０１２３】
本発明は、本発明の理解を助けるために明らかにした実施例を以下に記載し、これにより、いかなる場合もその後の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を限定するように解釈されない。
【実施例】
【０１２４】
（第１の実施例）
多量体ＰＴＤの化学合成
ペプチドは、ペプチドオートシンセサイザ（Symphony,PTI,Tucson,Arizona）を有する２−クロロトリチルリジンを用いて、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相法の標準的な段階に従って合成させた。Ｆｍｏｃアミノ酸は、０．２Ｍの１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液に保存した。カップリング試薬は、０．２ＭのＮＭＰ溶液に前溶解した。全てのＦｍｏｃアミノ酸は、カップリング試薬の５倍以上とした。カップリングは３０分間行った。Ｆｍｏｃの脱保護は、ＮＭＰ溶液に溶解した２０％ピペリジンを用いて行った。アミノ酸側鎖の樹脂からのペプチド切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水（９５：５）を用いて３時間行った。樹脂はＴＦＡを用いて洗浄し、膜は部分的に蒸発させた。未精製の生成物は、ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離により収集し、水に溶解し、凍結乾燥した。ペプチドは、ＵＶ検出器（２３０ｎｍ）を備えているＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ Ｓｈｉｍａｄｚｕ装置及びＳｈｉｍａｄｚｕ Ｓｈｉｍ−ＰａｃｋＣ１８カラム（250×4.6mm,5μm,100Å,流速1ml/分）を用い、ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析及び精製させた。精製された多量体ＰＴＤｓのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ単量体：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ（Ｃ）（配列番号１５）、
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体ａ：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧ（Ｃ）（配列番号１６）、
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体ｂ：ＣＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧ（Ｃ）（配列番号１７)、及び
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ３量体：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧ（Ｃ）（配列番号１８）。
【０１２５】
（第２の実施例）
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である多量体ＰＴＤの可溶性発現
多量体ＰＴＤの化学合成は、比較的簡便であるが、化学合成による大きな多量体ＰＴＤｓの調製は、技術的及び経済的に制限され得る。この理由のために、２量体を含むオリゴマーを、組み換えタンパク質技術を組み合わせた化学合成を介して調製し、また、４量体よりも大きなオリゴマー及びスペーサ組み込み型ＰＴＤを、組み換え型タンパク質として調製した。本発明の組み換え型タンパク質の発現のために調製したベクターを図２に示している。
【０１２６】
ＰＴＤｓは、強い正電荷を有する低分子ペプチドであるため、それらは、単独で発現すると、容易に分解される傾向がある。従って、種々のＰＴＤｓ及びスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを、ユビキチン（ＵＢ）を有する融合タンパク質の調製、調製された融合タンパク質の精製、及びその後のユビキチンタンパク質分解酵素（ＵＢＰ）を用いて精製された融合タンパク質を分離することにより構築した（図３に示す）。
【０１２７】
多量体であり且つ／又はスペーサを有してスペーサ組み込み型であることを満たすＰＴＤｓを、Ｎ末端ＵＢ融合タンパク質又は非融合タンパク質として調製した。スペーサとして用いられるＵＢは、ＵＢＰにより分離されるため、ＵＢＰによる分離を防ぐために、ＵＢスペーサのＣ末端のグリシン残基をバリンに置換した。この変異ドメインは、ＵＢ（ｖ）として表している（図２に示す）。ＰＴＤ（２）ＵＢのようにＣ末端にＵＢが位置する場合、Ｃ末端のＵＢはＵＢＰにより分離されないため、野生型ＵＢを用いた。
【０１２８】
大腸菌（ＢＬ２１）を、従来のヒートショック法に従い、図２及び図３に示すプラスミドにより形質転換した（Sambrook等.,Molecular cloning 第２版）。組み換え型タンパク質の発現は、ＩＰＴＧを加えることにより誘導させた。誘導から２時間〜８時間後に、細胞を遠心分離により収集し、沈殿した細胞を適当な溶解緩衝液を用いて再懸濁した。細胞懸濁液に対して２０分間の超音波処理を行い、それを遠心分離により清澄化した。組み換え型タンパク質を精製するために、遠心分離による上清をイオン交換クロマトグラフィカラム（ＳＰ ＦＦ、ＧＥヘルスケア）に通した。ＰＴＤのアルギニン残基は、中性ｐＨにおいて正電荷を有しているため、その組み換え型タンパク質は、高いｐＩ値を有している。従って、大腸菌自身のタンパク質のほとんどは高い伝導率においてＳＰ ＦＦ樹脂に結合しない一方で、組み換え型タンパク質は、高い伝導率においてＳＰ ＦＦカラムから溶出された。ＩＥＸにおける選択的Ｎ末端ＵＢ融合又は非融合タンパク質は、より質の高い精製のために逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製させ、その後に凍結乾燥させた。
【０１２９】
ＵＢ融合タンパク質の場合、凍結乾燥させたその融合タンパク質は、適当な緩衝液に再懸濁させ、ＵＢとＰＴＤｓとの分離を誘導するためにＵＢＰをそれに加えた。その後に、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し、凍結乾燥した。
【０１３０】
調製された多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓのアミノ酸配列は以下のようになる。
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号１９）、
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ３量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号２０）、
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ８量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号２１）、
組み換え型ペネトラチン−ＵＢ（ｖ）＋ＭＰＨ（２）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５２）、
組み換え型ペネトラチン−ＵＢ（ｖ）＋ＭＰＨ（４）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５８）、
組み換え型Ｓｉｍ−２−ＵＢ（ｖ）＋ＰＴＤ（Ｈｐｈ−１）−（２）
ＡＫＡＡＲＱＡＡＲＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５９）、
組み換え型Ｓｉｍ−２−ＵＢ（ｖ）＋ＰＴＤ（Ｈｐｈ−１）−（４）
ＡＫＡＡＲＱＡＡＲＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号６０）、
組み換え型ＰＴＤ（２）ＵＢ
ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号４４）、及び
組み換え型ＰＴＤ（４）ＵＢ
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号４６）。
【０１３１】
（第３の実施例）
接合による多量体ＰＴＤの拡大
多量体ＰＴＤの大きさを大きくするために、ジスルフィド結合を２つのＰＴＤ分子同士の間に形成させるには、システイン残基をＰＴＤの末端のいずれか一方又は両方に位置させる。例えば、システインを有する２つのＰＴＤ２量体同士がジスルフィド結合を介して結合すると、４量体が形成され、２量体と４量体とが結合すると、６量体が形成される（図５を参照）。
【０１３２】
ジスルフィド結合の誘導は、ｐＨ８〜１１且つ低温で、緩やかに撹拌した状態における大気酸化法を用いて行われる。
【０１３３】
前記の方法を用いて調製された多量体ＰＴＤｓは、Ｎ末端配列決定法及び飛行時間型マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて解析される。
【０１３４】
多量体ＰＴＤの強い正電荷は、負に荷電したドデシル硫酸ナトリウムと複合体を形成するため、多量体ＰＴＤの最終生成物を分離するためにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いることは困難である。また、多量体ＰＴＤの高いｐＩのため、一般的なＰＡＧＥ分析法を行うことも困難である。この理由のため、多量体ＰＴＤのＰＡＧＥ分析は、ＰＡＧＥのｐＨを変化させ、電極を逆に接続した後に行われる。
【０１３５】
（第４の実施例）
組み換え型多量体ＰＴＤの難溶性発現
多量体ＰＴＤｓは、大腸菌から発現すると毒性を示し、また、急速に分解される傾向にある。さらに、ＰＴＤｓのうちのいくつか、例えば、ＴＡＴ−ＰＴＤ又はＭＰＨ−１−ＰＴＤは、メチオニンを含まない。従って、本発明は、融合する相手と多量体ＰＴＤとの間にメチオニンを挿入することを含む方法を用いた。さらに、本発明は、ユビキチン、例えば、Ｓｒｃ様アダプタタンパク質（ＳＬＡＰ）又はゼータ鎖結合タンパク質キナーゼ（Ｚａｐ７０）の代わりに、容易に凝集するタンパク質を用いて多量体ＰＴＤと融合する相手を置換することを含む方法も用いた。容易に凝集するタンパク質は、封入体に集積するため、これらの融合は簡便であり、従って、一般に毒性は低い。さらに、比較的容易に、それらが分解することを防ぎ、それらを精製することができる。しかしながら、封入体は、中程度の条件及び生理学的条件において溶解されない。封入体を溶解するために尿素、塩酸グアニジンのようなカオトロビック剤若しくは界面活性剤が用いられ、又は極度の範囲のｐＨの緩衝液が用いられる。一般に、生物のタンパク質分解酵素は、このような条件においては活性化されない。従って、本発明は化学的な分離を採用する。臭化シアン（ＣＮＢｒ）は、メチオニン残基のカルボキシル末端側におけるペプチド結合を特異的に切断する。多くのＰＴＤｓはメチオニン残基を有さないため、ＣＮＢｒを用いて融合タンパク質を分離して多量体ＰＴＤｓを精製できるように、メチオニンをＰＴＤのアミノ末端に挿入する（図４）。
【０１３６】
例えば、第２の実施例と同様のベクターのおいて、ＵＢの代わりの融合タンパク質としてＳＬＡＰを用いることにより難溶性発現をさせる。ＳＬＡＰベクターの構築は、第２の実施例に記載したように行った。発酵、誘導、細胞の収集及び細胞の溶解は、第２の実施例に記載したように行った。細胞の溶解の後に、細胞懸濁液を遠心分離し、その後の上清を除去した。残存した封入体を８Ｍの尿素緩衝液に溶解し、ＩＥＸ（ＳＰ ＦＦ、ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。０．３Ｍ〜１Ｍの範囲における精製された融合タンパク質の分画にＨＣｌを加えた。分離のためにＣＮＢｒを加え、その溶液を遮光し、室温で１２時間静置した。ＣＮＢｒを用いた分離の後に、多量体ＰＴＤを第２の実施例に記載の方法と同一のＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し、その後に、それを凍結乾燥した。ＳＬＡＰは数個のメチオニン残基を有するため、ＣＮＢｒを用いた融合タンパク質の分離により、ＵＢ−融合タンパク質における２つのみのピークと比較して、多くのピークを示すいくつかの分画が生成された。
【０１３７】
（第５の実施例）
核酸と多量体ＰＴＤとの複合体の生成
ＰＴＤと核酸とは、これらの間の安定な非共有結合の形成を介して複合体を形成できる（図１）。核酸と多量体ＰＴＤとの複合体を形成するために、核酸と多量体ＰＴＤｓとを規定された比率で混合した。過剰量の多量体ＰＴＤｓは、難溶性の凝集体の形成を引き起こすため、その比率は重要である。対照的に、過剰量の核酸は、複合体の導入効率を低減させる。これは、以下の実験により証明された。
【０１３８】
４量体ＰＴＤとｓｉＲＮＡとは凍結乾燥粉末の状態で準備した。４量体ＰＴＤを２×ＰＢＳ溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡを脱イオン水（Ｄ．Ｗ．）に溶解した。ＰＴＤ及びｓｉＲＮＡの濃度は１μＭとした。１００μｌのＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡ溶液を含む遠心チューブに、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、４００μｌ、７００μｌ又は１０００μｌの第２の実施例の４量体ＰＴＤを加えた。チューブ内の溶液をよく混合し、室温で２０分間静置させた。それぞれの混合液に対して、ＦＡＣＳ装置を用いて導入効率を分析した。その結果を図９に示している。その混合液は、１００μｌのｓｉＲＮＡに対してＰＴＤの量が７００μｌ以上の場合、凝集し、濁りが見られるようになる。従って、核酸の効率的な導入は、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが１：１〜７：１の比率の場合に起こる。特に効率的な導入は、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが３：１の場合に達成される。最低限のタンパク質の凝集と効率的な核酸の導入とは、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが２：１の場合に見られる。
【０１３９】
（第６の実施例）
核酸と多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤとの接合体の生成
第４の実施例における多量体ＰＴＤｓを拡大する方法と同様に、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である満たすＰＴＤの末端におけるシステイン残基と接合できるように、核酸の５’末端にチオール基（−ＳＨ）が導入される。接合体は、第２の実施例に記載された大気酸化法を用いて形成される。
【０１４０】
多量体である且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤと核酸とが接合するために、他の化学結合を用いることもできる。例えば、核酸にアルデヒドを導入することにより、ペプチドのアミン基と接合させることを誘導させる。核酸にカルボキシル基を導入すると、ペプチドのアミン基とアミド結合を形成することができる（図６）。
【０１４１】
（第７の実施例）
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤ−ｓｉＲＮＡの細胞内導入の媒介
ｓｉＲＮＡの細胞内導入を媒介するための多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓの特性を調べた。ここでの実験において、ｓｉＲＮＡを、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓ、例えば、スペーサを有するＭＰＨ−１の２量体（配列番号４４〜４７）、ＭＰＨ−１の単量体（配列番号１９）又はＭＰＨ−１の４量体（配列番号２０）と複合させた。ＭＰＨ−１の単量体は化学的に合成した。２量体及び４量体は、第２の実施例に記載のように組み替えにより生成した。細胞内のｓｉＲＮＡを定量化するために、蛍光材料であるカルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）を用いてｓｉＲＮＡの１つの鎖を標識した。多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓと複合したｓｉＲＮＡは、凍結乾燥粉末として準備した。多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、２×ＰＢＳ溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡはＤ．Ｗ．に溶解した。ｓｉＲＮＡの濃度は１μＭとした。スペーサ組み込み型の単量体、２量体及び４量体ＰＴＤｓの濃度は、それぞれ４μＭ、２μＭ及び１μＭとした。異なるＰＴＤ多量体同士の異なる濃度は、それぞれ異なる電荷の割合を補償するためである。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓにおいて、タンパク質の濃度は、試験デザインに依存する。ｓｉＲＮＡ溶液とＰＴＤ溶液とは、同量で混合した。混合液におけるｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭとした。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡと多量体ＰＴＤとの複合体は、培養ＨｅＬａ細胞に導入させた。ＣＯ２インキュベータ内で０．５時間〜２時間培養した後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳを添加し、ゴム製のスクレイパを用いて細胞を収集した。収集した細胞を遠心分離した。その後の上清を除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。この洗浄工程を３度繰り返した。
【０１４３】
洗浄の後、蛍光活性細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ｓｉＲＮＡの導入効率を分析した。その結果を図７及び図８に示している。図８は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【０１４４】
予想されたとおり、単量体ＰＴＤの導入効率は低かった。これは、導入単位としてのＰＴＤの機能を損失している単量体ＰＴＤとｓｉＲＮＡとの相互作用のためである。２量体ＰＴＤは中程度の導入効率を示し、４量体ＰＴＤは最も高い効率を示した。これらの結果は、ＰＴＤ多量体のＰＴＤｓの数に比例してｓｉＲＮＡの導入効率が増大することを証明している。これは、導入効率は導入単位としての機能を利用できるフリーのＰＴＤｓに依存することを示している。
【０１４５】
スペーサが組み込まれたＰＴＤｓの場合、全ての検体が高い導入効率を示した。
【０１４６】
（第８の実施例）
細胞内に導入されたｓｉＲＮＡの活性
ＰＴＤにより導入されたｓｉＲＮＡの活性を評価した。ここでの試験において、第７の実施例に記載した４量体のＭＰＨ−１ ＰＴＤ(配列番号２０）及びスペーサ組み込み型ＰＴＤｓ（配列番号４３〜６０）を用いた。４量体ＰＴＤを、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｓｉＲＮＡと複合させた。この複合体をＨｅＬａ細胞に導入し、ＧＡＰＤＨの発現に対する影響を試験した。ＧＡＰＤＨの発現レベルは、ＧＡＰＤＨの酵素活性を測定することにより評価した。
【０１４７】
スペーサ組み込み型タンパク質を、ヒトプロテインキナーゼＣのａ−サブユニット（ＰＫＣＡ）を標的とするｓｉＲＮＡと複合させた。この複合体をＨｅＬａ細胞に導入し、ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルに対する影響を試験した。ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルを定量性リアルタイムＰＣＲにより測定した。その複合体の混合液を、培養したＤＭＥＭ培地を用いてＨｅＬａ細胞に導入した。その２時間後、新鮮な培地を用いて、細胞を３度洗浄した。洗浄後に、細胞に再び新鮮な培地を加え、２４時間培養した。２４時間の培養後、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロジェン（Carlsbad,CA)）の説明書に従って、細胞からＲＮＡｓを抽出した。High capacity RNA to cDNAキット（アプライドバイオシステムズ, Foster city,CA）を用い、その説明書に従って、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造者の説明書（アプライドバイオシステムズ 7500 system）に従って、合成したｃＤＮＡを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。内部補償のために、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。
【０１４８】
図１０に示すように、ＰＫＣＡのｓｉＲＮＡを単独で導入すると、ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルは減少しなかった。しかしながら、ＰＫＣＡのｓｉＲＮＡをスペーサ組み込み型ＰＴＤと複合させた場合、全ての検体においてＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルは減少した。このデータは、スペーサ組み込み型ＰＴＤによりｓｉＲＮＡｓが導入されると、ｓｉＲＮＡｓは阻害活性を保持することを証明している。
【０１４９】
これらの試験において、４量体ＰＴＤを第２の実施例に記載されたように調製し、第４の実施例に記載された方法と同一の方法により、ｓｉＲＮＡと混合した。培養したＤＭＥＭ培地を用いて、その混合液をＨｅＬａ細胞に導入した。その２時間後、細胞を新鮮な培地を用いて３度洗浄した。洗浄した後に、新鮮な培地を細胞に再び加え、２日間培養し、その後に、ＫＤａｌｅｒｔ（アンビオン（アプライドバイオシステムズ,Forster city,CA））の説明書に従いＧＡＰＤＨの活性を分析した。
【０１５０】
図１１に示すように、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡを単独で導入すると、ＧＡＰＤＨの活性は減少しなかった。しかしながら、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡを４量体ＰＴＤと複合させると、その濃度依存的にＧＡＰＤＨの活性は減少した。このデータは、４量体ＰＴＤにより導入すると、ｓｉＲＮＡｓは活性を保持することを証明している。
【０１５１】
（第９の実施例）
ＤＮＡベクターの細胞内の導入を媒介する多量体ＰＴＤ
ＨｅＬａ細胞の中にＤＮＡベクターを導入するための多量体ＰＴＤの特性を評価した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードしているベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック,Mountain Viee,CA））をここでの試験に用いた。
【０１５２】
４量体ＰＴＤを第２の実施例に記載したように調製し、ＤＮＡベクターをＤＮＡ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（プロメガ,Madison,Wiscconsin）を用いて調製した。ＰＴＤを濃度が０．４ｍｇ／ｍｌになるように２×ＰＢＳを用いて溶解した。ＤＮＡの濃度をＤ．Ｗ．を用いて０．１ｍｇ／ｍｌに調製した。それぞれ等量のＤＮＡ溶液とＰＴＤ溶液とを混合した。それを室温で３０分間静置した後に、２０μｌの混合液を６ｍｍ培養皿内の培地に加えた。細胞内へのＤＮＡベクターの導入の後、ＥＧＦＰの発現のために細胞を４８時間培養した。ＤＮＡベクターの導入効率を評価するために、ＦＡＣＳによりＥＧＦＰの蛍光を測定した。陽性対照としてlipofectamine 2000（インビトロジェン,Carlbad,CA）導入試薬を用いて、同様の導入を行った。
【０１５３】
図１２に示すように、ＤＮＡの導入効率は、lipofectamineを用いるよりも４量体ＰＴＤを用いた方が高かった。図１２は、５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ又はインビトロにおいて、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む核酸結合分子を用いて、細胞の中に核酸を導入する方法に関する。また、本発明は、核酸結合分子と複合又は接合している核酸を含む新規の組成物に関する。さらに、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する方法、及び標的遺伝子の機能を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡの分解を誘導してｍＲＮＡのタンパク質合成を阻害するために、低分子ＲＮＡ断片を遺伝子発現における重要なメディエーターであるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と干渉させる方法である。低分子ＲＮＡ断片の塩基がｍＲＮＡと対になると、２本鎖ＲＮＡが形成され、細胞内においてその部分が分解される。遺伝子発現におけるＲＮＡｉの選択的な作用は、特異的な遺伝子の機能を調べる際の有用な研究手段となる。また、ＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制する新規の薬物の開発に頻繁に用いられている。
【０００３】
低分子ＲＮＡ断片は、その起源に依存して、これが細胞外の原料に由来する場合はスモールインターフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分類され（Elbashir, S. M.等.,Nature 411:494-498(2001)）、細胞自身のゲノムにおけるＲＮＡにコードされた遺伝子から生成された場合はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に分類される。
【０００４】
ｓｉＲＮＡの使用は、大きく２つの分類に分けられる。（１）化学合成又は生物学合成によりインビトロにおいて生成されたｓｉＲＮＡ又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が細胞内に直接に導入される。（２）ｓｉＲＮＡを発現できる種々のＤＮＡベクターが細胞内に導入され、導入された細胞がｓｉＲＮＡを生成する（例えば、米国特許第６２７８０３９号、米国特許出願２００２／０００６６６４号、国際公開ＷＯ９９／３２６１９号、国際公開ＷＯ０１／２９０５８号、国際公開ＷＯ０１／６８８３６号及び国際公開ＷＯ０１／９６５８４号を参照）。これら２つの分類に基づいた種々の応用技術は、これらの利点が効果的に利用されるように用いられることができる。近年、後者において、癌のような病気を起こす遺伝子を下方制御するために、ｓｉＲＮＡを生成できる導入ベクターを作ることが試されている（Mayer,M及びWagner,E.,Hum,Gene Ther.17(11):1062-1076(2006)）。
【０００５】
ＲＮＡｉにおいて、インビボ又はインビトロにおける細胞内に核酸が導入される効率が、ＲＮＡｉの効率を決定する。しかしながら、細胞内にｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを生成するためのＤＮＡベクターを導入する効率は、この２つの技術の実用的な適応のための主な障害として残存する。この原因は、ＲＮＡ又はＤＮＡのような核酸が細胞膜を透過するのに大きすぎることである。実験においては、その機構がはっきりとわからなくても、それらの核酸は、物理的又は化学的手段の必要が無く細胞内に導入され得た。しかしながら、核酸の導入は、非常に低い効率であるため、実用的に用いることは困難である。
【０００６】
研究室内のインビトロの実験において、最もよく用いられる一方法は、核酸の導入を助けるリポソームを用いることである。しかしながら、この場合の効率は、インビトロの実験では高く、インビボでは血液又は体液が原因で顕著に減少する。また、リポソームは毒性が強く、多量のリポソームを用いることは困難であるため、ヒトの体内にこれを適用することは制限される。
【０００７】
細胞内に核酸を導入するための他の方法としては、ウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターは、効率的なキャリアとして用いられるが、細胞の発癌のような重大な副作用を有することが発見されており、さらに、ヒトの細胞内に外来性の遺伝子を導入するという倫理的な問題もあるため、安全を保証するために詳細な臨床研究が強く要求されている。このため、現代の状況において、インビボにおけるウイルスベクターの導入は、多くの研究にもかかわらず、信頼して臨床又は産業に用いることはできない。
【０００８】
インビボにおいて、直接的に裸の核酸（すなわち、核酸の導入を助けるための組成物を有さない核酸）を物理的に導入する他の方法は、例えば、電気穿孔法及び水力学的導入法があり、これらも研究されてきた。近年の研究結果は、静脈、腹腔又は眼球の中への裸のＲＮＡの導入が特異的な遺伝子の発現を減少させることができることを示している（Herweijer,H.及びWolff,J.A.,Gene Ther.10(6):453-458(2003); Hagstrom,J.E.等.,Mol.Ther.10(2):386-398(2004)）。しかしながら、これらの方法の特性は、実用的な適用に制限がある。
【０００９】
さらに、導入ベクターとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等を含むナノ粒子を用いることに着目した研究が活発に行われている。
【００１０】
実用的にｓｉＲＮＡを用いるための障害は、低い導入効率の他に、インビボにおいてその半減期が短いことであり、その使用量を増やすことが必要となる。ＲＮＡｓｅに耐性があるホスホロチオエート等をＲＮＡのリン酸骨格に修飾する試みが行われている。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコレステロール等を用いて、ＲＮＡを修飾してＲＮＡの半減期を増大させることに注目した研究が行われている。しかしながら、種々の試み及び研究にもかかわらず、核酸の低い導入効率が、ＲＮＡｉの実用的な利用における主な問題である。
【００１１】
近年、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を用いることが提案されている。ＰＴＤｓは、細胞内に生物学的活性分子の導入のために有用な低分子量のペプチドである（VIehl C.T.等.,Ann.Surg.Oncol.12:517-525(2005); Noguchi H.等.,Nat.Med.10:305-309(2004); Fu A.L.等.,Neurosci.Lett.368:258-62(2004)）。種々のＰＴＤｓは公知であり、ほとんどの場合、ＰＴＤにおける正電荷アミノ酸の数は非常に多い。一般に知られているＰＴＤは、ＨＩＶのＴａｔであり、さらに、Ａｎｔｐ、ＶＰ２２及び合成ポリアルギニン等である。近年、ＭＰＨ−１及びＳｉｍ−２等が発見された。
【００１２】
ＰＴＤｓは、その種類又は細胞の種類に関係なく、インビトロ又はインビボにおいて、分子の効率的な導入をできることが知られている。ほとんどのＰＴＤｓは、核酸と安定な非共有結合を形成することができ、細胞内に核酸を導入できる。アンテナペディアホメオドメインの第３螺旋は、安定な非共有結合により低分子のオリゴヌクレオチドと複合体を形成し、それらの内部移行を促進する（Dom,G.等.,Nucleic Acid Res.31:556-561(2003)）。Ｐｅｐ−３は非共有結合的な相互作用を介してペプチド核酸と安定な複合体を形成し、それらの細胞内への導入を促進することが報告されている（Morris,M.C.,等,Nucleic Acids Res.35(2007)）。ＨＩＶ ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメイン及びＳＶ４０ Ｔ-抗原の核移行配列由来の親水性ドメインを含むＭＰＧペプチドは、培養哺乳動物の細胞内にオリゴヌクレオチドを導入するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと非共有結合を形成することが証明されている（Morris.M.C.等.,Nucleic Acid Res.25:2730-2736(1997)）。Ｔａｔペプチドの２量体、３量体及び４量体は、非共有結合的な相互作用を介してプラスミドＤＮＡと安定な粒子を形成し、細胞内へのそれらの導入を促進することが報告されている。（Rudolph,C.,等.,J.Biol.Chem.278:11411-11418(2003)）。
【００１３】
また、ＰＴＤｓは、核酸の導入を促進するために、核酸と安定な共有結合を形成できる。リポソームに共有結合的に吸着したＴａｔペプチドは、ＤＮＡの急速な導入を促進する（Torchilin,V.P.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8786-8791(2001), Torchilin,V.P.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:1972-1977(2003)）。ジスルフィド結合のような不安定な結合を介して、ペプチド核酸分子が細胞膜を通過して導入されるために、ペネトラチン及びトランスポータンを用いることも提示されている（米国特許第６０２５１４０号を参照）。
【００１４】
ｓｉＲＮＡと共有結合を形成するＰＴＤは提示されている。ｓｉＲＮＡと共有結合的に吸着したＴａｔペプチドは、ｓｉＲＮＡの核への導入を促進する（Chiu,Y.等.,Chem.Biol.11(8):1165-1175(2004)）。ｓｉＲＮＡと共有結合的に吸着したペネトラチン及びトランスポータンは、ｓｉＲＮＡの細胞への効率的な導入を促進する（Davidson,.T.J.等.,J.Neurosci.24(45):10040-10046(2004); Muratovska,A及びEccles,M.R.,FEBS 558:63-68(2004)）。
【００１５】
いくつかの研究において、高い効率の導入が達成されているが、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するためのＤＮＡベクターの導入にＰＴＤを用いて、安定且つ高効率のＲＮＡｉ効果は見られていない。また、ＰＴＤを用いてもわずかな効果しか見られないという報告がある。ＴａＴ又はペネトラチンペプチドと共有結合的に吸着したｓｉＲＮＡは、インビボにおいてＲＮＡｉの効果は示さなかった（Moschos,S.A.等.,ＵＫ生化学会フォーカスミーティングにおけるポスター発表(2007)）。
【００１６】
前記の通り、ほとんどのＰＴＤｓは、正電荷を有するアミノ酸を多く含んでおり、これは負電荷を有する核酸のリン酸骨格と結合できる。この核酸とＰＴＤｓとの結合は、ＰＴＤｓと核酸とが非共有結合を形成すること、及びこれらが共有結合を形成することの両方が可能である。ほとんどの研究では、単一のＰＴＤのみを用いている。ＰＴＤと核酸との弱い結合でさえも、その導入機能の維持のために重要なＰＴＤの構造に影響する。従って、ＰＴＤの導入効率は、顕著に減少され得る。核酸と結合していないＰＴＤは、細胞内に導入される特性を維持するが、核酸の導入に用いることはできない。また、核酸と結合しているＰＴＤは、細胞内に導入される特性が減弱している。結果として、従来の研究におけるＰＴＤｓを用いた細胞内への核酸の導入法は、効果がない又は非効率的である。
【００１７】
従って、細胞内に核酸を導入するために、本発明は、多量体ＰＴＤ分子又はスペーサ組み込み型ＰＴＤ分子を設計し、この多量体ＰＴＤ分子又はスペーサ組み込み型ＰＴＤ分子は、細胞内への導入特性を維持することを特徴とする。
【発明の概要】
【００１８】
本発明の１つの目的は、インビボ又はインビトロにおいて、核酸結合分子を用いて細胞内への核酸の導入を効率的に行うことである。
【００１９】
前記の目的を達成するために、本発明は、１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合した核酸を含む複合体又は接合体を提供する。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、１ｋｄ〜２５０ｋｄ、５ｋｄ〜１８０ｋｄ、５ｋｄ〜１５０ｋｄ又は５ｋｄ〜３０ｋｄの分子量相当の長さを有してもよい。核酸と核酸結合分子との結合はＰＴＤの構造に影響しないため、細胞内への核酸の導入効率は顕著に増大し、これにより、この導入機能は維持される。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を含む１本鎖核酸である。
【００２１】
他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００２２】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸とである。
【００２３】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００２４】
また、本発明は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を含む１本鎖核酸を備える組成物を含む。
【００２５】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡを備える組成物である。
【００２６】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤを含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸を備える組成物である。
【００２７】
また、本発明は、１つ又はそれ以上のＰＴＤを含む１つ又はそれ以上の多量体ＰＴＤｓ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備えている核酸結合分子を含む。
【００２８】
また、本発明は、前記の１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸分子のいずれか１つを製造する方法を含む。
【００２９】
また、この発明は、前記の１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸分子のいずれか１つが細胞内に導入されるのを促進する方法を含む。
【００３０】
また、この発明は、１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法を含む。
【００３１】
また、この発明は、１つ又はそれ以上の核酸結合分子と複合又は接合している核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。
【００３２】
前記の全ての実施例において、核酸結合分子は、さらに１つ又はそれ以上の核酸結合領域を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】核酸と核酸結合分子との関係を示す図である。Ａは核酸結合領域を有する核酸結合分子を示し、ＰＴＤが核酸と複合していない様子を示す模式図である。Ｂは核酸結合領域を有する核酸結合分子を示し、核酸と複合したＰＴＤ及びたの物質との組み合わせを示す模式図である。Ｃは核酸と複合したＰＴＤである核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。Ｄは核酸と結合した核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。Ｅは核酸と複合した核酸結合領域を有する核酸結合分子を示す模式図である。核酸結合領域は、多量体ＰＴＤと、多量体ＰＴＤの中又は端部のいずれかに設けられたスペーサとを含む。スペーサは立体障害効果を有している。
【図２Ａ】Sim-2UB(v)PTD(2)、Sim-2UB(v)PTD(4)、AntpUB(v)PTD(2)及びAntpUB(v)PTD(4)の組み換え型タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｂ】Sim-2UB(v)PTD(2)、Sim-2UB(v)PTD(4)、AntpUB(v)PTD(2)及びAntpUB(v)PTD(4)のＮ末端ユビキチン融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｃ】PTD(2)UB及びPTD(4)UBのＮ末端ユビキチン融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２ＤのＰＴＤｓは、ＨＰｈ−１を表している。
【図２Ｄ】ユビキチンを有するMPH-1-PTDの８量体の融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図２Ｅ】ユビキチンを有するMPH-1-PTDの４量体及び６量体の融合タンパク質の発現ベクターの製造方法を示す図である。
【図３】ユビキチンを有するＮ末端融合タンパク質を発現させる際に、可溶性タンパク質として多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを精製する方法を示す図である。
【図４】Ｓｒｃ様アダプタータンパク質（ＳＬＡＰ）を有する融合タンパク質を発現させる際に、難溶性タンパク質として多量体ＰＴＤを精製する方法を示す図である。
【図５】ジスルフィド結合を介した接合により、２つのＰＴＤ２量体からＰＴＤ４量体を合成し、ＰＴＤ４量体とＰＴＤ２量体とからＰＴＤ６量体を合成する方法を示す図である。
【図６】異なる共有結合を介した接合により、ｓｉＲＮＡ−多量体ＰＴＤを合成する方法を示す図である。
【図７】スペーサ組み込み型タンパク質によるｓｉＲＮＡの導入効率を示すグラフである。ｓｉＲＮＡの１つの鎖をカルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）により標識した。ｓｉＲＮＡを単独（siRNA CTL）でした場合、又はＡＵＢＰ２（AntpUB(v)PTD(2)）、ＳＵＢＰ２（Sim-2UB(v)PTD(2)）、Ｐ２ＵＢ（PTD(2)UB）若しくはリポソーム（Lipo）と複合して導入した場合を示している。導入された細胞は、ＦＡＣＳにより解析した。
【図８】ｓｉＲＮＡの導入と多量体ＰＴＤにおけるＰＴＤの数量との関係を示すグラフである。導入細胞はＦＡＣＳにより解析した。図８は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【図９】細胞内への相対的な導入効率におけるＰＴＤとｓｉＲＮＡとの比率の影響を示すグラフである。ｓｉＲＮＡは、多量体のＰＴＤ又はスペーサ組み込み型ＰＴＤｓと複合体又は接合体を形成したものを用いた。導入細胞はＦＡＣＳにより解析した。図９は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【図１０】スペーサ組み込み型タンパク質と共に導入されたｓｉＲＮＡは、標的遺伝子であるＰＫＣＡの転写を阻害する能力を保持していることを示すグラフである。
【図１１】多量体ＰＴＤｓと共に導入されたｓｉＲＮＡは、標的遺伝子であるＧＡＰＤＨの活性を阻害する能力を保持していることを示すグラフである。
【図１２】ＰＴＤ４量体はＥＧＦＰをコードしているプラスミドＤＮＡを細胞内に導入できることを示すグラフである。導入効率は、ＦＡＣＳを用いてＥＧＦＰの蛍光を測定することにより解析した。図１２は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、インビボ又はインビトロにおいて、１つ又はそれ以上の核酸結合分子を用いて細胞内に核酸を効率的に導入する方法を含む。核酸結合分子は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含み、核酸と結合する能力を有し、細胞内に核酸を導入する分子として定義されてもよい。細胞内に導入された核酸は、生物学的に活性でも活性でなくてもよい。
【００３５】
本発明の一実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える１つ又はそれ以上の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を備える１本鎖核酸である。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態は、３つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合しているリン酸骨格を備える１本鎖核酸である。
【００３７】
リン酸骨格を備える１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）であってもよい。
【００３８】
本明細書において用いられる「低分子ヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」という用語は、低分子のループ部を有し、基部は１９対〜２７対の塩基対を有するＲＮＡ分子を意味する。ｓｈＲＮＡは、２本鎖の基部における配列と相同な遺伝子を選択的に発現抑制することができる。哺乳動物の細胞は、選択的な遺伝子発現の抑制を媒介するためにｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換できる（Paddison等.,Genes and Dev.16(8):948-58(2002)）。ｓｈＲＮＡは、２本鎖構造を形成するために１本鎖ＲＮＡが折り畳まれたものであり（ヘアピン基部−ループ構造）、２本鎖核酸と同様でありながら１本鎖とみなされ得る。
【００３９】
本明細書において用いられる「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、核酸及び他のポリ核酸塩基鎖と配列特異的にハイブリッド形成できる合成核酸塩基オリゴマー類を意味する。ＰＮＡ骨格は、ＤＮＡ及びＲＮＡにおける荷電したリン酸群を有するデオキシリボース及びリボース糖骨格ではなく、ペプチド結合により結合されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しにより構成される。ポリ核酸塩基鎖の核酸塩基同士のハイブリッド形成は、一般に水素結合における確立した法則に従う。ワトソン−クリックの塩基対形成の法則によると、一般に、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と塩基対を形成する。他の種々の塩基対のモチーフは、当業者に知られている。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備えている１つ又はそれ以上の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００４１】
好ましい実施形態は、２又はそれ以上のＰＴＤ分子を備えている多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００４２】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、その中又はＰＴＤ（ｓ）のＣ末端若しくはＮ末端に１又はそれ以上のスペーサを含むことができる。スペーサは、核酸と複合できないタンパク質又はタンパク質のドメインであってもよい。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、１ｋｄ〜２５０ｋｄ、５ｋｄ〜１８０ｋｄ、５ｋｄ〜１５０ｋｄ又は５ｋｄ〜３０ｋｄの分子量に相当する長さを有していてもよい。例えば、抗体のＦｃドメイン、全抗体、アルブミン、アデュシン（α）、アデュシン（β）、α−シヌクレイン、αＡクリスタリン（ヒートショックタンパク質β−４、ＨｓｐＢ４）、αＢクリスタリン（ヒートショックタンパク質β−５、Ｈｓｐ５）、アポリポタンパク質Ａ−１（Ａｐｏ−Ａ１）、β−ガラクトシダーゼ、クラスリンコートアセンブリタンパク質 ＡＰ５０、シトクロム−ｃ−オキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＴＰ結合タンパク質 Ｒｈｅｂ、赤血球凝集素、Ｒａｓ ＧＴＰアーゼ、Ｒｈｏ−ＧＴＰアーゼ−活性化タンパク質（ｐ５０−ＲｈｏＧＡＰ）、スモールプロリン−リッチタンパク質２Ｅ（ＳＰＲ−２Ｅ）、チューブリンαー１、チューブリンβ−１、ユビキチン様タンパク質１−活性化酵素 Ｅ１Ａ、又はユビキチン様タンパク質１−活性化酵素 Ｅ１Ｂは、スペーサとして用いられ得る。好ましいスペーサは、ユビキチン（ＵＢ）である。
【００４３】
本発明の一実施形態は、スペーサ組み込み型ＰＴＤを含む核酸結合分子であり、このスペーサ組み込み型ＰＴＤは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサを含む（例えば、配列番号１〜６０）。従って、スペーサ組み込み型ＰＴＤは、１個〜２０個、２個〜１５個、２個〜１０個、１個〜５個、２個〜８個、２個〜５個、又は２個〜４個のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサを含んでいてもよい。スペーサは、核酸と結合しないアミノ酸の配列である。
【００４４】
２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又は操作型ＲＮＡ前駆体を含むがこれらだけに限られない。２本鎖ＲＮＡは、化学合成、インビトロにおけるＤＮＡの鋳型からの転写、又はインビボにおける操作型ＲＮＡ前駆体からの転写をされることができる。
【００４５】
本明細書において用いられる「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」という用語は、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を備えている２本鎖ＲＮＡ分子を意味し、ここで、アンチセンス領域は、発現を下方制御させる標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的な核酸配列を含んでおり、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に相当するヌクレオチド配列を含む。センス領域は、標的核酸配列又はその一部と実質的に同一の配列を有する。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、１６個〜３０個のヌクレオチドを有する２本鎖ＲＮＡを備え、より好ましくは、１９個のヌクレオチドを有する２本鎖領域と５’末端及び３’末端のそれぞれにおける２つのヌクレオチドの突出部を有するように、２１個のヌクレオチドを有するセンス鎖と２１個のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖との対を備えている。３’末端における２つのヌクレオチドの突出部は、２’デオキシヌクレオチドを含むことが好ましい（例えば、ヌクレアーゼに耐性があるＴＴ）。
【００４７】
本明細書において用いられる「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、細胞自身のゲノムにおけるＲＮＡコード化遺伝子から生成された約２２個のヌクレオチドの長さを有する非常に低分子の非コード化ＲＮＡを意味し、これはｍＲＮＡの制御及び分解の種々の面に関わることが示されている（Zeng等.,Proc.natl.acad.sci.USA,100(17):9779-84(2003)）。
【００４８】
架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体は、米国特許出願１０／６７２０６９号に提示され、これは、参照として全て本明細書に援用される。架橋化は組成物の薬物動態を変化させるために、例えば、体内における半減期を増大させるために用いられることができる。従って、本発明は、２本鎖が架橋されるように、核酸の２つの相補鎖を有するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ誘導体を含む。例えば、２本鎖のうちの１つの鎖の３’ＯＨ末端は、修飾されていてもよく、また、２本鎖が架橋され且つ３’ＯＨ末端が修飾されていてもよい。ｓｉＲＮＡ誘導体は単一の架橋を含んでいてもよい（例えば、ソラレン架橋）。他の実施形態において、ｓｉＲＮＡ誘導体は、３’末端にビオチン分子（例えば、光切断性ビオチン）、ペプチド、ペプチド模倣体、ナノ粒子、有機化合物（例えば、蛍光色素のような色素）、又はデンドリマーを有する。このような修飾ｓｉＲＮＡ誘導体によると、細胞の取り込みを改善できる、又はｓｉＲＮＡ誘導体を対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞標的活性を増大できる。また、細胞内におけるｓｉＲＮＡの追跡に有用となる、又は対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性が改善する。従って、架橋型ｓｉＲＮＡが一般に知られているＲＮＡｉを媒介する特性を保持している間に、改善された特性を有するかどうかを判定するために、当業者は、種々の方法を用いて修飾された架橋型ｓｉＲＮＡを選別できる。
【００４９】
本明細書において用いられる、操作型ＲＮＡ前駆体の「操作型」という用語は、自然界において発見されていない前駆体を指し、その前駆体の核酸配列の全部又は一部はヒトにより作られている又は選択されている。一度作られた又は選択された配列は、細胞内の機構による複製、翻訳、転写又はその他の過程を行われ得る。従って、例えば導入遺伝子といった操作型核酸分子により、細胞内において生成されたＲＮＡ前駆体は、操作型ＲＮＡ前駆体である。操作型ＲＮＡ前駆体は、体内においてｓｉＲＮＡに加工され、自然に生じる低分子テンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の前駆体に類似する人工のコンストラクトである。操作型ＲＮＡ前駆体は、この分野において公知の標準の方法により、例えば、自動ＤＮＡ合成を用いる（バイオサーチ社及びアプライドバイオシステムズ社等から入手できる）又は核酸分子にコードさせることにより合成できる。
【００５０】
さらなる実施形態は、１つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である１つ又はそれ以上のＰＴＤｓを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸である。
【００５１】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している２本鎖核酸である。
【００５２】
２本鎖核酸は、ｓｉＲＮＡを発現できる２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡを含むがこれらだけに限られない。
【００５３】
本明細書において用いられる「ＤＮＡベクター」という用語は、細胞内においてｓｉＲＮＡ部分を生成するＲＮＡを発現するために用いられ、複製できる核酸コンストラクトを意味し、このコンストラクトは細胞内において発現される。このようなベクターは、（１）例えば、プロモーター、オペレーター又はエンハンサーのような遺伝子発現における制御的役割を有する遺伝子配列、それに効果的に連結された（２）２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに加工され得るｓｈＲＮＡ）を生成するために転写されるコード化配列、及び（３）適当な転写開始配列及び終止配列のアセンブリを備えている転写単位を含む。一般に、プロモーター及び他の制御配列は、対象となる宿主細胞によって異なる。ＤＮＡベクターは、環状若しくは線状プラスミド、又は非感染性で且つ組み込まれない（すなわち、脊椎動物の細胞のゲノムの中に組み込まれない）他の線状のＤＮＡであってもよい。線状プラスミドは、環状であったプラスミドを、例えば制限酵素を用いて切断することにより線状化されたプラスミドである。線状ＤＮＡは、例えば、Cherng,J.Y.等.,J.Control.Release 60:343-53(1999),及びChen,Z.Y.等.,Mol.Ther.3:403-10(2001)において述べられているように、状況によっては有利である。また、これらの文献は、参照として本明細書に援用される。ＤＮＡベクターにおいて、転写を調節する制御配列は、一般に、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来する。通常、複製の開始点により与えられる宿主における複製の能力、及び翻訳の認識を促進するための選択遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。レトロウイルス及びアデノウイルス等のウイルス由来のベクターが用いられてもよい。
【００５４】
本明細書において用いられる「ハイブリッド２本鎖核酸」という用語は、２本鎖ＲＮＡと類似の機能を有する２本鎖核酸を意味する。ハイブリッド２本鎖核酸は、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖を含んでいてもよい。ＲＮＡ鎖はアンチセンス鎖であり、標的ｍＲＮＡに結合することが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖のハイブリッドにより形成されたハイブリッド２本鎖核酸は、ハイブリッド化された相補的部分、及び好ましくは少なくとも１つの突出している３’末端を有している。
【００５５】
本明細書において用いられる「環状ＲＮＡ」という用語は、２つのループモチーフを含むＲＮＡ分子を意味し、環状ＲＮＡの１つ又は両方のループ部は、生分解性である。例えば、本発明の環状ＲＮＡは、インビボにおけるループ部の分解により、３’末端が突出した２本鎖ｓｉＲＮＡを生成できるように設計されており、ここで、３’末端は、約２つのヌクレオチドが突出している。
【００５６】
一実施形態は、５つ又はそれ以上のＰＴＤ分子を備える多量体ＰＴＤを含む核酸結合分子に複合又は接合している２本鎖ＲＮＡである。
【００５７】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）
ＰＴＤはインビボ及びインビトロにおいて、所望のタンパク質、ペプチド、核酸及び化合物を細胞内に導入する又は細胞に取り込ませることを効率的にできることで知られている。
【００５８】
本発明における多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤとして用いるために、本発明の発明者は、組み換え型タンパク質生成工程又は化学合成工程により生成された数種のペプチドを作成した。他の種類のＰＴＤは、所望の導入領域及び用いたリンカーの種類に依存して用いられることが理解される。ＰＴＤは３個〜３０個のアミノ酸、好ましくは５個〜１５個のアミノ酸からなり、そのうちアルギニン残基が１０％〜３０％含まれていることが好ましい。しかしながら、アルギニン残基を含まないＰＴＤｓも考えられる。
【００５９】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、例えば、複数のホモ２量体、ホモ４量体、ホモ６量体及びホモ多量体を含むホモ多量体、又は例えば、複数のヘテロ２量体、ヘテロ４量体、ヘテロ６量体及び他のヘテロ多量体を含むヘテロ多量体であってもよい。本発明の実施形態は、以下の一又はそれ以上の組み合わせを含み、ホモ多量体若しくはヘテロ多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓを含む。
マウス転写因子（ＭＰＨ−１）又はヒト転写因子（ＨＰＨ−１）
ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ（配列番号１）、
Ｔａｔ−ＰＴＤ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号２）、
Ａｎｔｐ又はペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号３）、
トランスポータン（ＣＬＩＫＫＡＬＡＡＬＡＫＬＮＩＫＬＬＹＧＡＳＮＬＴＷＧ）（配列番号４）、
ＨＳＶ−１構築タンパク質Ｖｐ２２
（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ）（配列番号５）、
ポリアルギニンＲ７（ＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号６）、
膜移行配列（ＭＴＳ）
（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＡＡＡＤＱＮＱＬＭＰ）（配列番号８）、
少なくとも以下のＰｅｐ−１、Ｐｅｐ−２及びＰｅｐ−３のいずれかを含む低分子両親媒性ペプチドキャリア
Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号９）
Ｐｅｐ−２（ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１０）
Ｐｅｐ−３（ＹＧＦＫＫＦＲＫＰＷＴＷＷＥＴＷＷＴＥ）（配列番号１１）、
Ｓｉｍ−２（ＡＫＡＡＲＱＡＡＲ）（配列番号１２）、
ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号１３）、
ＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ）（配列番号１４）、及び
分枝型ポリリジン（米国特許出願２００６／００４１０５８号及びEom,K.D.等.,J.Nanosci.Nanotechnol.6(11):3532-3538(2006)に記載）。
【００６０】
Ｃ末端に括弧書きのシステインを有する本発明の配列（配列番号１５〜２０、２１、３１〜４２、４５及び５７〜６０）において、そのシステインは任意であることを意味する（［表１］及び［表２］を参照）。従って、そのＣ末端のシステインを除いた配列も本発明として考えられ、本発明の実施形態である。Ｃ末端のシステインは、ｓｉＲＮＡと接合するために用いられてもよい。逆に、Ｃ末端にＣｙｓを有さない本発明の配列（配列番号１〜１４、２２〜３０、４３、４４及び４６〜５６）は、ｓｉＲＮＡと接合する際にＣ末端にシステインを含んでもよい。
【００６１】
本発明の多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓの特異的な例を［表１］及び［表２］に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
これらのＰＴＤｓに実質的に類似な変異体、例えば、それらと少なくとも６５％は同一である変異体も考えられる。もちろん、同一性の割合は、例えば、６５％、６７％、６９％、７０％、７３％、７５％、７７％、８３％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のように、より高くてもよい。一般に、置換は、保存的な置換である。ＰＴＤの変異体を作る方法は、この分野においては、機械的である。
【００６５】
また、ＰＴＤｓ又はこれらの変異体は、これらの中の置換、欠損又は付加があってもよい。これらの変更は、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠損又は付加であってもよい。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠損又は付加である。当業者は、タンパク質の機能に有意な影響がほとんど無い又は全く無いアミノ酸の置換を十分に知っている（例えば、２次脂肪族アミノ酸を用いた１つの脂肪族アミノ酸の置換）。例えば、表現型においては変化の無いアミノ酸の置換の方法は、Bowie,J,U.等の「タンパク質配列のメッセージの解読：アミノ酸置換の寛容性」Science 247:1306-1310(1990)に示されている。
【００６６】
ＰＴＤ又はそれらの変異体は、修飾骨格、例えば、オリゴカルバミン酸骨格又はオリゴ尿素骨格を有していてもよい（例えば、Wang等.,J.Am.Chem.Soc.119:6444-6445(1997)；Tamilarasu等.,J.Am.Chem.Soc.121:1597-1598(1999)；Tamilarasu等.,Bioorg.Of Med Chem.Lett.11:505-507(2001)を参照）。
【００６７】
核酸結合領域
前記で説明した全ての実施形態において、核酸結合分子は、さらに、１つ又はそれ以上の核酸結合領域を備えてもよい。「核酸結合領域」は、核酸に結合できる領域として定義される。核酸に静電気的に結合できるカチオン性物質、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、その他の塩基性側鎖を有するアミノ酸のポリマー又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等が用いられてもよい。カチオン性物質は、カチオン性物質とアニオン性の核酸のリン酸骨格との静電気的相互作用を介して、配列非依存的に核酸と結合すると考えられている。カチオン性物質とＤＮＡとの相互作用の力は、数ある中でも、カチオン性物質の全体の純電荷を反映すると当業者には理解されている。
【００６８】
適当なカチオン性物質は、ポリリジン、例えば、１０個〜２０個のリジン残基又は１５個〜１７個の残基、特に１６個の残基、すなわち、Ｋ１６を有する。また、３．４ｋＤａの分子量を有するポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジン（分子毎に平均１６個の正電荷を有する）が好ましい。他の適当なポリマーは、２ｋＤａの分子量を有するＰＥＩ（中性ｐＨにおいて分子毎に平均１２個の正電荷を有する）を含む。ＰＴＤ自身は、高正電荷分子であり、同様によく用いられ得る。「核酸結合領域」という用語は、前記に示した物質と同一の機構を用いて核酸と結合できる物質を含むことを意図する。
【００６９】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤに加えて、核酸結合領域が核酸結合分子の一部である際に、核酸結合領域が核酸と結合すると、核酸とＰＴＤとの結合の可能性が減少され得る。従って、細胞内に核酸を導入させるために、これらがＰＴＤの特性を維持するようにＰＴＤ本来の構造を維持させる可能性を増大させることができる。細胞内に核酸を導入させるＰＴＤの特性は、核酸に直接に結合していなくても発揮される。核酸結合領域が存在し、核酸とＰＴＤとの直接の結合を妨げる場合でさえ、ＰＴＤの導入効果は維持される（図１Ａ）。
【００７０】
従って、ＰＴＤが核酸結合領域として用いられ、また、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤが、細胞内に核酸を導入するための核酸キャリアとして用いられる場合に、細胞内に核酸を導入する効率は顕著に増大する（図１Ｂ）。
【００７１】
製造方法
本発明は、核酸結合領域を有する又は有さない多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを備える核酸結合分子と複合又は接合している前記の核酸分子のいずれか１つを製造する方法も含む。
【００７２】
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、化学合成又は組み換え型タンパク質の生成により製造され得る。４量体又は６量体を製造するために、ジスルフィド結合のような共有結合を介した複数の２量体の接合を用いることができる。好ましい実施形態としては、システイン残基は２つのＰＴＤ２量体の末端に位置する。ジスルフィド結合の誘導は、ｐＨ８〜ｐＨ１１の低温における緩やかな撹拌による大気酸化法を用いて行われる。６量体はこの方法おける２量体と４量体との組み合わせにより調製され得る。
【００７３】
核酸と核酸結合分子との結合が静電気的相互作用を介する場合、その結合は非共有結合であってもよい。核酸と核酸結合分子とが所定の比率で混合されると、複合体が形成される。１：１〜１：２０、１：１〜１：３又は１：２である核酸と核酸結合分子との比率は、複合体を生成するために用いられ得る。
【００７４】
核酸と核酸結合分子との結合は、ジスルフィド結合又はアミド結合のような共有結合を介して生じることができる。適当な結合（例えば、エステル結合、カルバメート結合、スルホネート結合、チオエステル結合及びチオエーテル結合等）は、一般的な方法及び当業者に知られた方法に従って形成されてもよい。核酸と核酸結合分子とのジスルフィド結合を形成するために、これらの２つの分子はチオール基を生じるように誘導されてもよく、それらのうちの１つは脱離基を生じてもよい。核酸と核酸結合分子とのジスルフィド結合を形成するための十分な時間（また、温度、ｐＨ及びモル濃度の比率等の適当な条件下）において、修飾型核酸を、結合を形成するために調製された核酸結合分子と共に温置する。共有結合を形成するための多数の方法及びストラテジは、効率的な結合に必要な条件として、当業者に知られている。
【００７５】
本発明は、核酸結合分子と複合又は接合された前記の核酸分子のいずれか１つの細胞内への導入を促進する方法を含み、この方法は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している核酸を生成する工程（ｉ）と、細胞培養培地の中に核酸結合分子と複合又は接合している核酸を加える工程（ii）と、工程（ii）において調製された細胞培養培地の中で細胞を培養する工程（iii）とを備えている。
【００７６】
細胞培養培地の中の細胞を培養する工程は、細胞内に核酸が導入されるような培養時間並びに濃度、温度及びｐＨ等の培養条件において、細胞が培養されることとして定義される。特に、本発明において用いられるプロトコールは、多くの要因（細胞の型、核酸の大きさ及び用いられるＰＴＤ等）に従って異なる。但し、当業者には明白である。
【００７７】
生物学的使用
本発明は、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合された核酸を用いて細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法を含み、この方法は、細胞培養培地の中に核酸結合分子と複合又は接合している核酸を加える工程（ｉ）と、工程（ｉ）において調製された細胞培養培地の中で細胞を培養する工程（ii）と、細胞を維持し、標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、その細胞の表現型と対照細胞の表現型とを観察及び比較し、それによって細胞内の標的遺伝子の機能に関する情報を得る工程（iv）とを備えている。
【００７８】
多くの選択肢が標的遺伝子の発現の直接的な阻害のために有用である。適当な試験法は、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイツハイブリッド法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法及び酵素機能を用いた方法等のような当業者に知られている技術、また当業者に知られている他の試験法を用いて、標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベル又は標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルの測定法を含む。多くの方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルを検出するのに有用である。そのような方法は、例えば、ドットブロット法、インサイツハイブリッド法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量性逆転写ＰＣＲ法、ノーザンブロット法及び核酸プローブアレイ法を含む。同様に、種々の方法は、タンパク質のレベルの変化を検出するのに有用である。例えばその方法は、タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて免疫学的試験を行い、抗体とタンパク質とにより形成された複合体を検出するウエスタンブロット法、及び用意されたタンパク質が検出できる活性を有するかどうかを試験する活性試験法を含むがそれらに限られない。一般に、核酸が細胞内に導入され、標的遺伝子の発現が阻害されているかどうかを判定するために、核酸結合分子と複合又は接合された核酸と共に培養された細胞の中のタンパク質又はｍＲＮＡのレベルは、核酸結合分子と複合又は接合された核酸と共に培養されていない対照細胞と比較される。
【００７９】
標的遺伝子の発現の阻害と相関する表現型の変化を検出するために、細胞の表現型を観察することができる。このような表現型の変化は、例えば、アポトーシス、形態的変化及び細胞増殖の変化、また、他の細胞活性の変化を含み得る。特定の遺伝子発現との干渉が、前記の細胞活性のうちの１つ又はそれ以上の減少又は増大を引き起こす場合、標的遺伝子の機能は、細胞の経路のうちの１つ又はそれ以上に起因し得る。本発明は、標的遺伝子の発現を抑制する又は活性化する治療的方法にも向けられる。
【００８０】
「標的遺伝子」とは、その発現を選択的に阻害又は抑制される遺伝子である。この抑制は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体、ハイブリッド２本鎖核酸又は環状ＲＮＡと標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合により誘導される標的遺伝子のｍＲＮＡの分解が促進されて起こる。これらの分子の１つの部分又はセグメントは、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部、例えば、約１６個〜約４０個又はそれ以上のヌクレオチドと実質的に相補的であるアンチセンス鎖である。これまでに、遺伝学的に又は配列決定により同定された遺伝子は、標的となり得る。標的遺伝子は、発生に関わる遺伝子及び制御遺伝子、また、代謝若しくは構造に関わる遺伝子又は酵素をコードしている遺伝子を含んでもよい。本発明の標的遺伝子は、制御遺伝子又は天然型のタンパク質をコードしている遺伝子の場合では細胞内在性の遺伝子であり、逆に、ウイルス若しくは細菌の遺伝子、トランスポゾン又は導入遺伝子の場合、異種起源又は細胞外因性の遺伝子であってもよい。
【００８１】
本明細書において用いられる「細胞」は、通常の生物学的な意味で用いられ、多細胞生物全体を意味するのでなく、例えば、特異的にヒトを意味するのでない。ここでの細胞とは、例えば、鳥類、植物並びにヒト、牛、羊、霊長類、猿、豚、犬及び猫のような哺乳動物といった生物に含まれていてもよい。ここでの細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）又は真核生物（例えば、哺乳動物細胞又は植物細胞）であってもよい。ここでの細胞は、体細胞系又は生殖系起源、全能性又は多能性、及び、分裂性又は非分裂性の細胞であってもよい。ここでの細胞は、生殖母細胞、胚細胞、幹細胞又は完全に分化した細胞に由来する又はこれらを含んでいてもよい。
【００８２】
本発明は、単一の標的遺伝子の機能を判定する方法に限られず、また、ゲノム全体の遺伝子の機能を判定する方法も含む。ゲノムの機能におけるＲＮＡｉライブラリを設計するためのアプローチは、Huesken,D.等.,Nat.Biotechnol.23(8):995-1001(2005), Vanhecke,D.及びJanitz,M.Drug Dicov.Today 10(3):205-12(2005),及びJanitz,M.等.,Handb.Exp.Pharmacol.97-104(2006)に提示されている。
【００８３】
治療的使用
本発明は、核酸結合分子と複合又は接合された核酸を用いて、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する治療的方法も含む。従って、本発明の一実施形態は、遺伝子発現の変更により治療できる広範な疾病及び疾患を治療する方法を含む。本発明は、患者の病状又は他の有害状態の防止、その発生率若しくは重症度の調節、又はその治療（検出できる又は測定できる範囲の１つ又はそれ以上の症状の緩和）のために、効果的に用いられることができる。これら及びこれらに関連する治療的組成物及び方法の中において、架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体の使用は、その修飾されたｓｉＲＮＡの特性を未変性のｓｉＲＮＡ分子の特性と比較して改善させる。これは、例えば、インビボにおけるヌクレアーゼ分解に対する耐性が増大される及び／又は細胞の取り込みが改善されることによる。複数の化学修飾を有する架橋型ｓｉＲＮＡ誘導体がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）活性を維持することは、本明細書において提示している方法に従って容易に判定され得る。従って、本発明は、種々の治療、診断、標的確認、ゲノムの発見、ゲノムの操作及びゲノム薬理学の適用のために有用な試薬及び方法を提供する。
【００８４】
本発明は、患者における特定の病状又は他の有害状態に関する遺伝子発現を変化させる核酸又はその断片を提供することにより、付加的な目的及び利点を満足する。一般に、ここでの核酸は、患者の病状又は有害状態に関して原因となる又は寄与する因子として発現レベルが増大している遺伝子を標的とする。これと関連して、遺伝子の発現は、病状に関する１つ又はそれ以上を阻害する、緩和する又は重症度若しくは再発率を減少するレベルに効果的に下方制御される。また、疾病又は他の有害状態の結果又はその後の状態として、標的遺伝子の発現が増大されることは必然でない種々の異なる疾病モデルにおいて、標的遺伝子の下方制御は、遺伝子発現をより低下すること（すなわち、選択された標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の生成のレベルを減少させるための低下）による治療結果を生じる。
【００８５】
また、本発明は、一遺伝子のより低い発現を目的とし、その遺伝子は、結果として標的遺伝子の生成又は活性化により発現が抑制される「下流」の遺伝子を活性化させる。また、同等の方法としては、対象動物の選択された病状に関する１つ又はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的にし、ここでの遺伝子とは選択された病状に関して原因となる又は寄与する因子として、発現が異常に増大することが知られている多数の遺伝子のいずれかを含む。本発明は、標的とされる病状のための他の標準的な治療剤と組み合わせて投与され得る。
【００８６】
「遺伝子発現の調節」は、標的遺伝子の発現が上方制御又は下方制御されることを意味し、その上方制御又は下方制御は、標的遺伝子によりコードされた細胞内に存在するｍＲＮＡレベル、ｍＲＮＡの翻訳又はタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの合成の上方制御又は下方制御を含むことができる。遺伝子発現の調節は、対象のタンパク質又はタンパク質のサブユニットの発現、レベル又は活性が修飾因子（例えば、ｓｉＲＮＡ）の非存在下において観察された場合よりも大きい又は小さいように上方制御又は下方制御をさせる標的遺伝子によりコードされた１つ又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットの存在、質又は活性により判定されることができる。例えば、「調節」という用語は、「阻害する」又は「低減する」ことを意味し得るが、これらに限られない。
【００８７】
発現を「阻害する」、「下方制御する」又は「減少する」とは、遺伝子の発現、ＲＮＡ分子のレベル、１つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードしている同等のＲＮＡ分子のレベル、又は標的遺伝子によりコードされている１つ若しくはそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットのレベル若しくは活性が、本発明の核酸分子の非存在下において観察されるよりも減少することを意味する。一実施形態において、阻害、下方制御又は減少とは、不活性化又は減弱化分子の存在下において観察されるレベルよりも低いことを意味する。他の実施形態において、阻害、下方制御又は減少とは、例えば、スクランブル配列又はミスマッチ配列を有する核酸の存在下において観察されるレベルよりも低いことを意味する。他の実施形態において、本発明の核酸を用いた遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、その核酸の非存在下よりも存在下の方が顕著である。
【００８８】
「標的遺伝子の発現阻害」という用語は、標的遺伝子を下方制御するための本発明の分子の特性を意味する。下方制御の程度を判定するために、特定のコンストラクトを発現している目的の生物又は培養細胞の治療対象体又は分析物は、そのコンストラクトの発現が欠損している対照体と比較される。対照体（コンストラクトの発現が欠損している）の相対値を１００％とする。標的遺伝子の発現阻害は、対照体に対する測定値が約９０％、多くは５０％、また、所定の実施形態では２５％〜０％の際に達成される。適当な試験法としては、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、インサイツハイブリッド法、ＥＬＩＳＡ法、免役沈降法、酵素の機能を用いた方法、及び当業者に知られた表現型アッセイのような当業者に知られた技術を用いてタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００８９】
「治療対象体」とは、生物、組織又は細胞を意味し、これらは、治療対象体となる生物、移植細胞の提供側若しくは受取側となるような生物又は自身が核酸導入の対象である細胞を含む。従って、「治療対象体」は、生物、臓器、組織又は細胞を意味し、これらは、インビトロ又はエクスビボにおける臓器、組織又は細胞を含み、本発明の核酸分子は、本明細書において提示されたポリヌクレオチド導入増強ポリペプチドにより投与され増強される。治療対象体の例としては、哺乳動物の個体又は細胞、例えば、ヒトの患者又は細胞である。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明の組成物又は方法は、関節リウマチ（ＲＡ）の症状の治療又は予防をするために、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を制御する治療手段として有用である。これと関連して、さらに本発明は、２本鎖ＲＮＡを用いるＲＮＡｉによってＴＮＦ−αの発現及び活性を調節するのに有用な化合物、組成物及び方法を提供する。さらに詳細な実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのような２本鎖ＲＮＡ並びにこれに関連する方法を提供し、これらは、哺乳動物の治療対象体におけるＲＡの症状の抑制又は緩和をするために、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を調節するのに効果的である。
【００９１】
本発明は、種々の形式、例えば、経皮的に又は局所注射により投与してもよい（例えば、乾癬の治療のために乾癬プラークの領域に局所注射を行う、又は乾癬性関節炎又はＲＡによって痛みのある患者の関節内に局所注射を行う）。さらに詳細な実施形態において、本発明は、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対して作用する２本鎖ＲＮＡの治療上効果的な量を投与するための製剤及び方法を提供し、それは、ＴＮＦ−αＲＮＡを効果的に下方制御し、また、これにより１つ又はそれ以上のＴＮＦ−αに関連する炎症状態を抑制する又は予防する。他の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞における上方制御遺伝子又は細胞分裂に関わる遺伝子を抑制することにより、癌の治療をする方法も含む。
【００９２】
本発明の分子は、当業者に知られている種々の方法により細胞に投与され、これは、核酸結合分子単独又はこれに薬剤的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤、免疫賦活剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤及び保存剤等の１つ又はそれ以上の付加成分をさらに備えた物質と複合又は接合している核酸を含む製剤を投与することを含むが、これらに限られない。他の実施形態において、核酸結合分子と複合又は接合している核酸は、リポソームに被抱され得る、又はハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性のナノカプセル、生物接着性の微粒子若しくはタンパク質性のベクターのような媒体に組み込まれ得る（例えば、ＰＣＴの国際公開ＷＯ００／５３７２２号を参照）。あるいは、核酸、核酸結合分子及び媒体の組み合わせは、直接注入又は注入ポンプを用いることにより局所的に導入できる。皮下、筋肉内又は皮内のいずれの直接注入であっても、標準的な針及びシリンジを用いて、又はConry等.,Clin.Cancer Res.5:2330-2337(1999)及びＰＣＴの国際公開ＷＯ９９／３１２６２号に提示されているような針を用いない技術を用いて行われ得る。本発明の組成物は、経口投与のための錠剤、カプセル又はエリキシル剤、直腸投与のための坐薬、注射投与のための無菌溶液又は懸濁液、及び当業者に知られている他の組成物として調製され、用いられることができる。
【００９３】
薬理学的組成物又は製剤は、例えば、細胞又はヒトを含む患者の中への全身投与といった投与法に適する形式の組成物又は製剤を意味する。適する形式は、その用途又は例えば、経口的、経皮的又は注射による移行経路に部分的に依存する。このような形式は、組成物又は製剤を標的細胞に送ることを妨げるべきでない（すなわち、細胞に導入するには負電荷を有する核酸が望ましい）。例えば、血流内に注入される薬理学的組成物は、可溶性であるべきである。他の要因は、当業者に知られており、毒性等の配慮をすることを含む。
【００９４】
「全身投与」とは、インビボにおいて、薬剤が体全体にくまなく分配され、全身の血流内において薬剤を吸収する又は集積することを意味する。全身に吸収させるための投与経路は、静脈内、皮下、腹腔、吸入、経口、肺内及び筋肉内を含むが、これらに限られない。これらのそれぞれの投与経路によって、到達可能な病気の組織に、所望の負電荷を有する核酸が曝露される。血液循環内に薬剤が入る割合は、分子量又は大きさで決定すると示されてきた。本発明の組成物を含むリポソーム又は他の薬剤キャリアの使用は、例えば、細網内皮系（ＲＥＳ）の組織のような所定の組織の型に、薬剤を強く局在化させることができる。リポソーム製剤は、リンパ球及びマクロファージのような細胞の表面と薬剤との結合を促進できるため有用である。このアプローチは、ガン細胞のような異常細胞に対するマクロファージ及びリンパ球に特異的な免疫認識の利点を用いることによって、標的細胞への薬剤の導入を増強させることができる。
【００９５】
「薬剤的に許容できる製剤」とは、組成物又は製剤の所望の活性に最も適する身体の部位に本発明の核酸分子を効果的に分配できる組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子を有する製剤に適する薬剤の例としては、ＣＮＳ内への薬剤の移行を増強できるＰ−糖タンパク質阻害剤（例えば、プルロニックＰ８５）（Jolliet-Riant及びTillement,Fundam.Clin.Pharmacol.13:16-26(1999)）、脳内への移行の後に放出し導入を維持するためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微粒子のような生分解性ポリマー（Emerich,D.F.等.,Cell Transplant8:47-58(1999)）、及び血液脳関門を渡って薬剤を移行させ、神経細胞の取り込み機構を変更させることができるポリブチルシアノアクチレートからなる荷電ナノ粒子（Schroeder,U.等.,Prog.Neuropsychopharmacol.Biol.Psychiatry23(5):941-949(1999)）を含むが、これらに限られない。他の本発明の核酸分子のための導入ストラテジの例としては、Boado等.,J.Pharm.Sci.87:1308-1315(1998)、Tyler等.,FEBS Lett.421:280-284(1999)、Pardridge等.,PNAS USA 92:5592-5596(1995)、Boado,Adv.Drug Delivery Rev.15:73-107(1995)、Aldrian-Herrada等.,Nucleic Acids Res.26:4910-4916(1998)、及びTyler等.,PNAS USA 96:7053-7058(1999)に提示された材料を含むが、これらに限られない。
【００９６】
本発明は、保存又は投与のために調製された組成物を含み、これは、薬剤的に許容されるキャリア又は希釈剤において、所望の化合物の薬剤的有効量を含む。治療的用途のために受け入れられるキャリア又は希釈剤は、医薬品分野においてよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Science,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素及び香味料が挙げられる。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。さらに、酸化防止剤及び懸濁剤が用いられてもよい。
【００９７】
「薬剤的有効量」とは、病状を予防する、病状の発生を阻害する、又は病状を治療する（ある程度の症状、好ましくは全ての症状を緩和する）のに必要な量である。薬剤的有効量は、病気の型、用いられる組成物、投与経路、治療する哺乳動物の分類、治療する哺乳動物の特異的な身体的特徴、併用する薬物及び当業者が認識する他の要因に依存する。このような化合物の投与量は、循環させる濃度が毒性がほとんど無い又は全く無いＥＤ５０を含む範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に依存する範囲内において変動してもよい。投与量は、循環血漿濃度が細胞培養において測定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の阻害を半分達成する試験化合物の濃度）を含む範囲にある動物モデルにおいて調製されてもよい。このような情報は、ヒトにおける有効量をより正確に決定するために用いられ得る。血漿内のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定されてもよい。
【００９８】
本明細書において定義されたように、本発明の薬剤的有効量は、選択された核酸に依存する。例えば、ｓｈＲＮＡがコードされたプラスミドが選択された場合、約１μｇ〜１０００ｍｇの範囲内の単一用量が投与され、一実施形態においては、１０μｇ、３０μｇ、１００μｇ又は１０００μｇが投与され得る。他の実施形態においては、１ｇ〜５ｇの組成物を投与できる。組成物は、１日〜１週間に１回又はそれ以上の回数を投与され得る。ここでは１日おきの投与も含まれる。当業者は、これらに限られないが、病気若しくは障害の重症度、以前の処置、全身の健康状態及び／又は治療対象体の年齢という要因、さらに、その他の病気の存在を含むいくらかの要因が治療対象体の効果的な処置に必要な投与量及び回数に影響することを理解している。さらに、治療対象体の処置は単一の処置を含み、好ましくは、一連の処置を含む。
【００９９】
経口投与のために、本発明は、カプセル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤又は懸濁剤としてもよい。経口組成物は、うがい薬として用いられるために液体キャリアを用いて調製されることもできる。薬剤適合性結合剤及び／又は補助材料を組成物の一部として含むこともできる。錠剤、丸剤、カプセル剤及びトローチ剤等は、以下の成分又は性質が類似した化合物のいずれかを含むことができる。それは、結晶セルロース、トラガントゴム若しくはゼラチンのような結合剤、ゼラチン若しくはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチのような分解剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはステローツのような潤滑剤、コロイド性二酸化シリコンのような流動促進剤、スクロース若しくはサッカリンのような甘味剤、又はペパーミント、サリチル酸メチル若しくはオレンジ甘味剤のような甘味剤である。組成物は、簡便な単位量形状に調製されてもよく、また、放出調節製剤、緩衝剤及び／又は腸液コーティングを用いて調製されてもよい。
【０１００】
水性の懸濁液は、これを製造するのに適する賦形剤を有する混合物内の活性材料を含む。このような賦形剤は、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム及びアラビアゴムのような懸濁剤であってもよい。また、分散剤又は湿潤剤は、例えばレクチンのような天然のリン脂質、例えばステアリン酸ポリオキシエチレンのような脂肪酸を有するアルキレンの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールのような長鎖脂肪族アルコールを有するエチレン酸化物の縮合物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸のような脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルを有するエチレン酸化物の縮合物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレイン酸のような脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルを有するエチレン酸化物の縮合物であってもよい。水性の懸濁液は、１つ又はそれ以上の、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸のような保存剤、１つ又はそれ以上の着色剤、１つ又はそれ以上の香味剤、及び１つ又はそれ以上のスクロース又はサッカリンのような甘味剤を含むことができる。
【０１０１】
油性の懸濁液は、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油又は液体パラフィンのような鉱物油に活性成分を懸濁することにより調製され得る。油性の懸濁液は、例えば、ミツロウ、硬質のパラフィン又はセチルアルコールのような増粘安定剤を含むことができる。甘味剤及び香味剤により、美味な経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を加えられることにより、保存され得る。
【０１０２】
水の添加によって水性の懸濁液を調製するのに適する分散性の粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ又はそれ以上の保存剤を有する混合物の活性成分を提供する。適当な分散若しくは湿潤剤又は懸濁剤は、前記に例証した通りである。例えば、甘味剤、香味剤及び着色剤のような賦形剤をさらに加えることもできる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、水に油を含む乳濁液の形態であってもよい。油層は、植物油、鉱物油又はそれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤は、例えばアラビアゴム又はトラガントゴムのような天然のゴム、例えば大豆、レシチン、脂肪酸及びヘキシトールに由来するエステル若しくは部分エステルのような天然のリン脂質、例えばソルビタンモノオレイン酸のような無水物、並びに、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸のようなエチレン酸化物を有する部分エステルの懸濁物であってもよい。乳濁液は、甘味剤及び香味剤も含むことができる。
【０１０４】
医薬組成物は、無菌の注射用の水性懸濁液又は油性懸濁液の形態にできる。この懸濁液は、前記の適当な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて公知の技術に従って調製され得る。無菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオールのような非毒性の許容できる希釈剤及び溶剤による無菌注射用の溶液又は懸濁液であってもよい。許容される溶媒及び溶剤の中で用いられ得るのは、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌固定油は、溶剤又は懸濁剤として従来から用いられている。この目的のために、無菌固定油は、合成モノ又はジグリセリドを含ませて用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が注射用に調製するのに用いられ得る。
【０１０５】
本発明は、例えば、薬剤の直腸投与のために坐薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、室温では個体であり、直腸の温度では液体となる適当な非刺激性の賦形剤を有する薬剤を混合することにより調製され得る。従って、これは、薬剤が放出されるために直腸において融解される。このような材料は、カカオバター及びポリエチレングリコールを含む。
【０１０６】
吸入による投与のために、本発明は、例えば、二酸化炭素のようなガスである適当な噴霧剤を含む圧力容器若しくは分注器、又はネブライザからエアロゾルスプレの形態で導入されてもよい。このような方法は、米国特許第６４６８７９８号に提示されているものを含む。
【０１０７】
全身投与は、経粘膜的又は経皮的手段により行うことができる。経粘膜又は経皮投与のために、障害を透過するのに適する浸潤剤は、調製の際に用いられる。このような浸潤剤は、一般に当業者に知られ、また、例えば、経粘膜的投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬又は坐薬を用いて投与できる。経皮投与のために、活性化合物は、当業者に一般に知られている軟膏剤、ゲル剤、又はクリーム剤の中に入れられている。
【０１０８】
本発明は、例えば遺伝子銃、バイオインジェクタ及び皮膚に対するパッチのような核酸剤の投与に適する方法、また、米国特許第６１９４３８９号に提示された微粒子ＤＮＡワクチン技術のような針を用いない方法、及び米国特許第６１６８５８７号に提示された粉末状ワクチンを用いた哺乳動物における針を使用しない経皮的なワクチン接種により投与できる。さらに、鼻腔内導入は、特に、Hamajima等.,Clin.Immunol.Immunopathol.88(2):205-210(1998)に提示されるように可能である。リポソーム（例えば、米国特許第６４７２３７５号に提示されている）及びマイクロカプセル化も用いられ得る（例えば、米国特許第６４７１９９６号に提示されている）。
【０１０９】
定義
便宜上、明細書、実施例及び添付した特許請求の範囲において用いた用語を、ここにまとめる。他に定義されない限り、本明細書において用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明の分野における当業者により一般に理解される意味と同様の意味を有する。
【０１１０】
本明細書において用いられている「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び適当な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを意味する。この用語は、１本鎖（例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖）ポリヌクレオチド及び２本鎖ポリヌクレオチドが開示された実施形態に適用できるものとして理解されるべきである。この用語は、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾骨格の残基若しくは結合を含む核酸、また、それは合成物、天然物及び非天然物の核酸、さらに、それは参照の核酸と類似の結合特性を有する核酸、さらに、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される核酸を含む。このようなアナログの例は、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、メチルホスホン酸、キラルメチルホスホン酸、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含むが、これらに限られない。
【０１１１】
糖、塩基及びリン酸の修飾は、血清リボヌクレアーゼによる核酸の分解を防ぐために核酸分子に対して行われ、これにより効果が増大する。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル及び２’−Ｈヌクレオチド塩基の修飾といったヌクレアーゼ耐性基を用いた修飾による安定性の増強及び／又は生化学活性の増強のために修飾され得る（Usman及びCedergren,TIBS 17:34(1992)、Usman等.,Nucleic Acid Symp.Ser.31:163(1994)、及びBurgin等.,Biochemistry 35:14090(1996)を参照）。核酸分子の糖の修飾は、この分野において広く提示されている。これについて、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／０３１６２号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０７０６５号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／１５１８７号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／２６２７０号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／１３５２６号、米国特許第５３３４７１１号、米国特許第５６２７０５３号、米国特許第５７１６８２４号、米国特許第６３０００７４号、Perrault等.,Nature 344:565-568(1990)、Pieken等.,Science 253:314-317(1991)、Usman及びCedergren,Trend in Biochem.Sci.17:334-339(1992)、Beigelman等.,J.Biol.Chem.270:25702(1995)、Karpeisky等.,Tetrahedron Lett.39:1131(1998)、Earnshaw及びGait,Biopolymers (Nucleic Acid Science) 48:39-55(1998)、Verma及びEskstein,Annu.Rev.Biochem.67:99-134(1998)、及びBurlina等.,Bioorg.Med.Chem.5:1999-2010(1997)を参照するとよい。前記の参考文献の全ては、触媒作用を調節することなく核酸分子の中に、糖、塩基及び／又はリン酸の修飾等を組み込む位置を決定するための一般的な方法及びストラテジが記載されている。
【０１１２】
このような方法等の観点において、同様の修飾は、細胞内のＲＮＡｉを促進するための能力が有意に阻害されない限り、本発明の核酸を修飾するために本明細書において記載されたように用いられることができる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及び／又は５’−メチルホスホン酸結合を有するオリゴヌクレオチドのインターヌクレオチド結合の化学修飾は、安定性を改善する一方で、過剰な修飾は、毒性を又は活性の減少を引き起こし得る。従って、核酸分子を設計する際に、これらのインターヌクレオチド結合の量を最小化するべきである。これらの結合の量を減少することは、毒性をより低下させ、これらの分子の効力の増大及び特異性の増大を引き起こす。
【０１１３】
例えば、核酸をＣｙ３、フルオレセイン又はローダミンのようなフルオロフォアを用いて標識するといった公知の方法を用いて、本発明の核酸を標識できる。この標識は、例えば、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ標識キット（アンビオン）のようなキットを用いて行うことができる。さらに、核酸を例えば、３Ｈ、３２Ｐ又は他の適当な同位体を用いて放射標識できる。
【０１１４】
「ＲＮＡ」は少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボ−フラノース部の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。その用語は、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡのような分離ＲＮＡ、本質的に精製されたＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより生成されたＲＮＡ、並びに１つ又はそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換及び／又は改変により天然型のＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡを含む。このような改変は、ヌクレオチドでない材料を、ｓｉＲＮＡの末端に、又は、例えば、ＲＮＡの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの内部に付加することを含むことができる。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然型のヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含むこともできる。このような改変型ＲＮＡ分子は、ＲＮＡアナログ又は天然型ＲＮＡのアナログとして適用され得る。
【０１１５】
「センス領域」とは、核酸のアンチセンス領域と相補性を有する核酸のヌクレオチド配列を意味する。さらに、核酸のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１１６】
「アンチセンス領域」とは、核酸のセンス領域と相補性を有する核酸のヌクレオチド配列を意味する。さらに、核酸のアンチセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【０１１７】
本明細書において用いられている「複合する」という用語は、非共有結合を介して２つの分子が相互作用していることを意味する。非共有結合には、水素結合、イオン間相互作用、ファンデルワールス力及び疎水結合の４つの主たる型がある。正に荷電したＰＤＴは、凝集体、ナノ粒子又は可溶性複合体として、負に荷電した核酸と静電気的に非共有結合による複合体を形成することができる。
【０１１８】
本明細書において用いられている「接合する」という用語は、共有結合を介して２つの分子が相互作用していることを意味する。共有結合は一般に、安定である。共有結合の例は、ジスルフィド結合又はアミド結合を含むがこれらに限られない。しかしながら、種々の共有結合が許容されるように、種々の官能基が用いられることは当業者には明白である（例えば、エステル結合、カルバミン酸結合、スルホン酸結合、チオエステル結合又はチオエーテル結合）。共有結合は、化学修飾された核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖又はその両方の鎖における３’末端、５’末端又はその両方に形成され得る。
【０１１９】
本明細書において用いられている「多量体ＰＴＤ」という用語は、１つよりも多くドメインを含み、そのドメイン同士が結合しているペプチド鎖を意味する。本発明の多量体ペプチドの中のドメインは、ホモ多量体を形成するために同一となり得る、又はヘテロ多量体を形成するために互いに異なり得る。ホモ多量体又はヘテロ多量体は、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体又はそれ以上の多量体を含むことができる。一般に、リンカーは、他の単量体と架橋が形成できるシステイン残基のようなアミノ酸残基に続く１つ〜５つのアミノ酸からなる。システイン残基は２つのペプチド分子の間にジスルフィド架橋を形成できるため、システイン残基を用いることが好ましい。但し、他の多量体ペプチド鎖の形成の手段も当業者に知られている。例えば、システイン残基の位置において、アミノ酸残基又は人工のアミノ酸のような化学物質は、化学的な架橋形性能を含み得る（例えば、糖残基、Marcaurelle等.,Tetrahedron Lett.39:8417-8420(1998)、これは、本明細書に参照として援用される）。
【０１２０】
「標的遺伝子」は、発現を選択的に阻害又は抑制される遺伝子である。この発現抑制は、標的遺伝子のｍＲＮＡの分解を促進することにより、又は標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより達成される。その分解又は翻訳の阻害は、標的遺伝子のｍＲＮＡと、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体、ハイブリッド２本鎖核酸又は環状ＲＮＡとの結合により誘導される。前記の分子の一部又は一セグメントは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの約１６個〜約４０個のヌクレオチドを有する部分と実質的に相補的であるアンチセンス鎖である。遺伝学的に又は配列決定によりこれまでに同定された遺伝子は、標的となり得る。標的遺伝子は、発生に関わる遺伝子及び制御遺伝子を含んでもよく、また、代謝若しくは構造に関わる遺伝子又は酵素をコードしている遺伝子を含んでもよい。標的遺伝子は、表現型が研究されている細胞、又は表現型の特徴に直接的又は間接的に影響する態様を有する生物において発現されてもよい。本発明の標的遺伝子が、制御遺伝子又は未変性のタンパク質をコードしている遺伝子の場合は、細胞に内在的な遺伝子であり、また、標的遺伝子がウイルス若しくは微生物の遺伝子、トランスポゾン又は導入遺伝子の場合は、細胞に関して異種性又は外因性であってもよい。いずれかの場合において、阻害されない標的遺伝子の発現は、病気又は異常を引き起こし得る。
【０１２１】
２つの核酸の関係における「実質的に同一」という用語は、例えば、以下に記載されているような配列比較アルゴリズムを用いて、又は視覚的な検査により測定できるように、比較され且つ最大限に一致するように整列させた場合に、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％又は８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のヌクレオチドの同一性を有する２又はそれ以上の配列又はサブ配列を意味する。実質的な同一性は、少なくとも約１６個〜４０個のヌクレオチドの長さ、又は少なくとも約４０個〜６０個のヌクレオチドの長さの配列の領域にわたって存在し、他の例では、少なくとも６０個〜８０個のヌクレオチドの長さの領域にわたって存在し、さらに他の例では、少なくとも９０個〜１００個のヌクレオチドの長さにわたって存在し、さらに他の例では、ヌクレオチドのコード領域のような比較される配列の全長の配列が実質的に同一である。
【０１２２】
本明細書において用いられている「実質的に相補的」という用語は、特定化された条件下において、ハイブリッド形成するために十分に相補的である２つの配列として定義される。ハイブリッド形成の多様な条件は、本発明において用いられてもよく、それは、高い厳密性、中程度の厳密性及び低い厳密性の条件を含む。高い厳密性を有する条件は、当業者に知られており、例えば、Maniatis等.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版(1989)、及びAusubel等.,Short Protocols in Molecular Biology(1989)を参照するとよく、これらは参照として本明細書に援用される。一般に、高い厳密性を有する条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜１０℃低いように選定される。Ｔｍは、平衡状態における標的配列に対して、標的配列に相補的なプローブの５０％がハイブリッド形成する（規定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度における）温度である（Ｔｍにおいて、標的配列が過剰に存在する条件で、平衡状態に５０％のプローブが占められる）。高い厳密性を有する条件は、塩濃度としてナトリウムイオンが約１．０Ｍよりも低く、例えば、ｐＨが７．０〜８．３であり、短いプローブ（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）では低くとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチドよりも長い）では低くとも約６０℃の温度において、ナトリウムイオン（又は他の塩）が約０．０１Ｍ〜１．０Ｍの濃度である。高い厳密性を有する条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成されてもよい。中程度の厳密性又は低い厳密性を有する条件は、この分野において公知なものを用いてもよい。
【０１２３】
本発明は、本発明の理解を助けるために明らかにした実施例を以下に記載し、これにより、いかなる場合もその後の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲を限定するように解釈されない。
【実施例】
【０１２４】
（第１の実施例）
多量体ＰＴＤの化学合成
ペプチドは、ペプチドオートシンセサイザ（Symphony,PTI,Tucson,Arizona）を有する２−クロロトリチルリジンを用いて、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相法の標準的な段階に従って合成させた。Ｆｍｏｃアミノ酸は、０．２Ｍの１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）溶液に保存した。カップリング試薬は、０．２ＭのＮＭＰ溶液に前溶解した。全てのＦｍｏｃアミノ酸は、カップリング試薬の５倍以上とした。カップリングは３０分間行った。Ｆｍｏｃの脱保護は、ＮＭＰ溶液に溶解した２０％ピペリジンを用いて行った。アミノ酸側鎖の樹脂からのペプチド切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水（９５：５）を用いて３時間行った。樹脂はＴＦＡを用いて洗浄し、膜は部分的に蒸発させた。未精製の生成物は、ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離により収集し、水に溶解し、凍結乾燥した。ペプチドは、ＵＶ検出器（２３０ｎｍ）を備えているＳＣＬ−１０Ａ ＶＰ Ｓｈｉｍａｄｚｕ装置及びＳｈｉｍａｄｚｕ Ｓｈｉｍ−ＰａｃｋＣ１８カラム（250×4.6mm,5μm,100Å,流速1ml/分）を用い、ＲＰ−ＨＰＬＣにより解析及び精製させた。精製された多量体ＰＴＤｓのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ単量体：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲ（Ｃ）（配列番号１５）、
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体ａ：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧ（Ｃ）（配列番号１６）、
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体ｂ：ＣＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧ（Ｃ）（配列番号１７)、及び
化学合成によるＭＰＨ−１−ＰＴＤ３量体：ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧ（Ｃ）（配列番号１８）。
【０１２５】
（第２の実施例）
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である多量体ＰＴＤの可溶性発現
多量体ＰＴＤの化学合成は、比較的簡便であるが、化学合成による大きな多量体ＰＴＤｓの調製は、技術的及び経済的に制限され得る。この理由のために、２量体を含むオリゴマーを、組み換えタンパク質技術を組み合わせた化学合成を介して調製し、また、４量体よりも大きなオリゴマー及びスペーサ組み込み型ＰＴＤを、組み換え型タンパク質として調製した。本発明の組み換え型タンパク質の発現のために調製したベクターを図２に示している。
【０１２６】
ＰＴＤｓは、強い正電荷を有する低分子ペプチドであるため、それらは、単独で発現すると、容易に分解される傾向がある。従って、種々のＰＴＤｓ及びスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを、ユビキチン（ＵＢ）を有する融合タンパク質の調製、調製された融合タンパク質の精製、及びその後のユビキチンタンパク質分解酵素（ＵＢＰ）を用いて精製された融合タンパク質を分離することにより構築した（図３に示す）。
【０１２７】
多量体であり且つ／又はスペーサを有してスペーサ組み込み型であることを満たすＰＴＤｓを、Ｎ末端ＵＢ融合タンパク質又は非融合タンパク質として調製した。スペーサとして用いられるＵＢは、ＵＢＰにより分離されるため、ＵＢＰによる分離を防ぐために、ＵＢスペーサのＣ末端のグリシン残基をバリンに置換した。この変異ドメインは、ＵＢ（ｖ）として表している（図２に示す）。ＰＴＤ（２）ＵＢのようにＣ末端にＵＢが位置する場合、Ｃ末端のＵＢはＵＢＰにより分離されないため、野生型ＵＢを用いた。
【０１２８】
大腸菌（ＢＬ２１）を、従来のヒートショック法に従い、図２及び図３に示すプラスミドにより形質転換した（Sambrook等.,Molecular cloning 第２版）。組み換え型タンパク質の発現は、ＩＰＴＧを加えることにより誘導させた。誘導から２時間〜８時間後に、細胞を遠心分離により収集し、沈殿した細胞を適当な溶解緩衝液を用いて再懸濁した。細胞懸濁液に対して２０分間の超音波処理を行い、それを遠心分離により清澄化した。組み換え型タンパク質を精製するために、遠心分離による上清をイオン交換クロマトグラフィカラム（ＳＰ ＦＦ、ＧＥヘルスケア）に通した。ＰＴＤのアルギニン残基は、中性ｐＨにおいて正電荷を有しているため、その組み換え型タンパク質は、高いｐＩ値を有している。従って、大腸菌自身のタンパク質のほとんどは高い伝導率においてＳＰ ＦＦ樹脂に結合しない一方で、組み換え型タンパク質は、高い伝導率においてＳＰ ＦＦカラムから溶出された。ＩＥＸにおける選択的Ｎ末端ＵＢ融合又は非融合タンパク質は、より質の高い精製のために逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製させ、その後に凍結乾燥させた。
【０１２９】
ＵＢ融合タンパク質の場合、凍結乾燥させたその融合タンパク質は、適当な緩衝液に再懸濁させ、ＵＢとＰＴＤｓとの分離を誘導するためにＵＢＰをそれに加えた。その後に、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓをＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し、凍結乾燥した。
【０１３０】
調製された多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓのアミノ酸配列は以下のようになる。
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ２量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号１９）、
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ３量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号２０）、
組み換え型ＭＰＨ−１−ＰＴＤ８量体
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号２１）、
組み換え型ペネトラチン−ＵＢ（ｖ）＋ＭＰＨ（２）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５２）、
組み換え型ペネトラチン−ＵＢ（ｖ）＋ＭＰＨ（４）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５８）、
組み換え型Ｓｉｍ−２−ＵＢ（ｖ）＋ＰＴＤ（Ｈｐｈ−１）−（２）
ＡＫＡＡＲＱＡＡＲＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号５９）、
組み換え型Ｓｉｍ−２−ＵＢ（ｖ）＋ＰＴＤ（Ｈｐｈ−１）−（４）
ＡＫＡＡＲＱＡＡＲＧＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＶＳＲＶＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶ（Ｃ）（配列番号６０）、
組み換え型ＰＴＤ（２）ＵＢ
ＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＳＳＤＴＩＤＮＶＫＳＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号４４）、及び
組み換え型ＰＴＤ（４）ＵＢ
ＹＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＦＹＡＲＶＲＲＲＧＰＲＲＧＧＡＲＶＱＩＦＶＫＴＬＴＧＫＴＩＴＬＥＶＥＰＳＤＴＩＥＮＶＫＡＫＩＱＤＫＥＧＩＰＰＤＱＱＲＬＩＦＡＧＫＱＬＥＤＧＲＴＬＳＤＹＮＩＱＫＥＳＴＬＨＬＶＬＲＬＲＧＧ（配列番号４６）。
【０１３１】
（第３の実施例）
接合による多量体ＰＴＤの拡大
多量体ＰＴＤの大きさを大きくするために、ジスルフィド結合を２つのＰＴＤ分子同士の間に形成させるには、システイン残基をＰＴＤの末端のいずれか一方又は両方に位置させる。例えば、システインを有する２つのＰＴＤ２量体同士がジスルフィド結合を介して結合すると、４量体が形成され、２量体と４量体とが結合すると、６量体が形成される（図５を参照）。
【０１３２】
ジスルフィド結合の誘導は、ｐＨ８〜１１且つ低温で、緩やかに撹拌した状態における大気酸化法を用いて行われる。
【０１３３】
前記の方法を用いて調製された多量体ＰＴＤｓは、Ｎ末端配列決定法及び飛行時間型マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて解析される。
【０１３４】
多量体ＰＴＤの強い正電荷は、負に荷電したドデシル硫酸ナトリウムと複合体を形成するため、多量体ＰＴＤの最終生成物を分離するためにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いることは困難である。また、多量体ＰＴＤの高いｐＩのため、一般的なＰＡＧＥ分析法を行うことも困難である。この理由のため、多量体ＰＴＤのＰＡＧＥ分析は、ＰＡＧＥのｐＨを変化させ、電極を逆に接続した後に行われる。
【０１３５】
（第４の実施例）
組み換え型多量体ＰＴＤの難溶性発現
多量体ＰＴＤｓは、大腸菌から発現すると毒性を示し、また、急速に分解される傾向にある。さらに、ＰＴＤｓのうちのいくつか、例えば、ＴＡＴ−ＰＴＤ又はＭＰＨ−１−ＰＴＤは、メチオニンを含まない。従って、本発明は、融合する相手と多量体ＰＴＤとの間にメチオニンを挿入することを含む方法を用いた。さらに、本発明は、ユビキチン、例えば、Ｓｒｃ様アダプタタンパク質（ＳＬＡＰ）又はゼータ鎖結合タンパク質キナーゼ（Ｚａｐ７０）の代わりに、容易に凝集するタンパク質を用いて多量体ＰＴＤと融合する相手を置換することを含む方法も用いた。容易に凝集するタンパク質は、封入体に集積するため、これらの融合は簡便であり、従って、一般に毒性は低い。さらに、比較的容易に、それらが分解することを防ぎ、それらを精製することができる。しかしながら、封入体は、中程度の条件及び生理学的条件において溶解されない。封入体を溶解するために尿素、塩酸グアニジンのようなカオトロビック剤若しくは界面活性剤が用いられ、又は極度の範囲のｐＨの緩衝液が用いられる。一般に、生物のタンパク質分解酵素は、このような条件においては活性化されない。従って、本発明は化学的な分離を採用する。臭化シアン（ＣＮＢｒ）は、メチオニン残基のカルボキシル末端側におけるペプチド結合を特異的に切断する。多くのＰＴＤｓはメチオニン残基を有さないため、ＣＮＢｒを用いて融合タンパク質を分離して多量体ＰＴＤｓを精製できるように、メチオニンをＰＴＤのアミノ末端に挿入する（図４）。
【０１３６】
例えば、第２の実施例と同様のベクターのおいて、ＵＢの代わりの融合タンパク質としてＳＬＡＰを用いることにより難溶性発現をさせる。ＳＬＡＰベクターの構築は、第２の実施例に記載したように行った。発酵、誘導、細胞の収集及び細胞の溶解は、第２の実施例に記載したように行った。細胞の溶解の後に、細胞懸濁液を遠心分離し、その後の上清を除去した。残存した封入体を８Ｍの尿素緩衝液に溶解し、ＩＥＸ（ＳＰ ＦＦ、ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。０．３Ｍ〜１Ｍの範囲における精製された融合タンパク質の分画にＨＣｌを加えた。分離のためにＣＮＢｒを加え、その溶液を遮光し、室温で１２時間静置した。ＣＮＢｒを用いた分離の後に、多量体ＰＴＤを第２の実施例に記載の方法と同一のＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製し、その後に、それを凍結乾燥した。ＳＬＡＰは数個のメチオニン残基を有するため、ＣＮＢｒを用いた融合タンパク質の分離により、ＵＢ−融合タンパク質における２つのみのピークと比較して、多くのピークを示すいくつかの分画が生成された。
【０１３７】
（第５の実施例）
核酸と多量体ＰＴＤとの複合体の生成
ＰＴＤと核酸とは、これらの間の安定な非共有結合の形成を介して複合体を形成できる（図１）。核酸と多量体ＰＴＤとの複合体を形成するために、核酸と多量体ＰＴＤｓとを規定された比率で混合した。過剰量の多量体ＰＴＤｓは、難溶性の凝集体の形成を引き起こすため、その比率は重要である。対照的に、過剰量の核酸は、複合体の導入効率を低減させる。これは、以下の実験により証明された。
【０１３８】
４量体ＰＴＤとｓｉＲＮＡとは凍結乾燥粉末の状態で準備した。４量体ＰＴＤを２×ＰＢＳ溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡを脱イオン水（Ｄ．Ｗ．）に溶解した。ＰＴＤ及びｓｉＲＮＡの濃度は１μＭとした。１００μｌのＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡ溶液を含む遠心チューブに、１００μｌ、１５０μｌ、２００μｌ、４００μｌ、７００μｌ又は１０００μｌの第２の実施例の４量体ＰＴＤを加えた。チューブ内の溶液をよく混合し、室温で２０分間静置させた。それぞれの混合液に対して、ＦＡＣＳ装置を用いて導入効率を分析した。その結果を図９に示している。その混合液は、１００μｌのｓｉＲＮＡに対してＰＴＤの量が７００μｌ以上の場合、凝集し、濁りが見られるようになる。従って、核酸の効率的な導入は、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが１：１〜７：１の比率の場合に起こる。特に効率的な導入は、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが３：１の場合に達成される。最低限のタンパク質の凝集と効率的な核酸の導入とは、ＰＴＤ：ｓｉＲＮＡが２：１の場合に見られる。
【０１３９】
（第６の実施例）
核酸と多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤとの接合体の生成
第４の実施例における多量体ＰＴＤｓを拡大する方法と同様に、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型である満たすＰＴＤの末端におけるシステイン残基と接合できるように、核酸の５’末端にチオール基（−ＳＨ）が導入される。接合体は、第２の実施例に記載された大気酸化法を用いて形成される。
【０１４０】
多量体である且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤと核酸とが接合するために、他の化学結合を用いることもできる。例えば、核酸にアルデヒドを導入することにより、ペプチドのアミン基と接合させることを誘導させる。核酸にカルボキシル基を導入すると、ペプチドのアミン基とアミド結合を形成することができる（図６）。
【０１４１】
（第７の実施例）
多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤ−ｓｉＲＮＡの細胞内導入の媒介
ｓｉＲＮＡの細胞内導入を媒介するための多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓの特性を調べた。ここでの実験において、ｓｉＲＮＡを、多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓ、例えば、スペーサを有するＭＰＨ−１の２量体（配列番号４４〜４７）、ＭＰＨ−１の単量体（配列番号１９）又はＭＰＨ−１の４量体（配列番号２０）と複合させた。ＭＰＨ−１の単量体は化学的に合成した。２量体及び４量体は、第２の実施例に記載のように組み替えにより生成した。細胞内のｓｉＲＮＡを定量化するために、蛍光材料であるカルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）を用いてｓｉＲＮＡの１つの鎖を標識した。多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤｓと複合したｓｉＲＮＡは、凍結乾燥粉末として準備した。多量体であり且つ／又はスペーサ組み込み型であるＰＴＤは、２×ＰＢＳ溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡはＤ．Ｗ．に溶解した。ｓｉＲＮＡの濃度は１μＭとした。スペーサ組み込み型の単量体、２量体及び４量体ＰＴＤｓの濃度は、それぞれ４μＭ、２μＭ及び１μＭとした。異なるＰＴＤ多量体同士の異なる濃度は、それぞれ異なる電荷の割合を補償するためである。スペーサ組み込み型ＰＴＤｓにおいて、タンパク質の濃度は、試験デザインに依存する。ｓｉＲＮＡ溶液とＰＴＤ溶液とは、同量で混合した。混合液におけるｓｉＲＮＡの最終濃度は１００ｎＭとした。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡと多量体ＰＴＤとの複合体は、培養ＨｅＬａ細胞に導入させた。ＣＯ２インキュベータ内で０．５時間〜２時間培養した後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳを添加し、ゴム製のスクレイパを用いて細胞を収集した。収集した細胞を遠心分離した。その後の上清を除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。この洗浄工程を３度繰り返した。
【０１４３】
洗浄の後、蛍光活性細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ｓｉＲＮＡの導入効率を分析した。その結果を図７及び図８に示している。図８は５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【０１４４】
予想されたとおり、単量体ＰＴＤの導入効率は低かった。これは、導入単位としてのＰＴＤの機能を損失している単量体ＰＴＤとｓｉＲＮＡとの相互作用のためである。２量体ＰＴＤは中程度の導入効率を示し、４量体ＰＴＤは最も高い効率を示した。これらの結果は、ＰＴＤ多量体のＰＴＤｓの数に比例してｓｉＲＮＡの導入効率が増大することを証明している。これは、導入効率は導入単位としての機能を利用できるフリーのＰＴＤｓに依存することを示している。
【０１４５】
スペーサが組み込まれたＰＴＤｓの場合、全ての検体が高い導入効率を示した。
【０１４６】
（第８の実施例）
細胞内に導入されたｓｉＲＮＡの活性
ＰＴＤにより導入されたｓｉＲＮＡの活性を評価した。ここでの試験において、第７の実施例に記載した４量体のＭＰＨ−１ ＰＴＤ(配列番号２０）及びスペーサ組み込み型ＰＴＤｓ（配列番号４３〜６０）を用いた。４量体ＰＴＤを、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｓｉＲＮＡと複合させた。この複合体をＨｅＬａ細胞に導入し、ＧＡＰＤＨの発現に対する影響を試験した。ＧＡＰＤＨの発現レベルは、ＧＡＰＤＨの酵素活性を測定することにより評価した。
【０１４７】
スペーサ組み込み型タンパク質を、ヒトプロテインキナーゼＣのａ−サブユニット（ＰＫＣＡ）を標的とするｓｉＲＮＡと複合させた。この複合体をＨｅＬａ細胞に導入し、ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルに対する影響を試験した。ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルを定量性リアルタイムＰＣＲにより測定した。その複合体の混合液を、培養したＤＭＥＭ培地を用いてＨｅＬａ細胞に導入した。その２時間後、新鮮な培地を用いて、細胞を３度洗浄した。洗浄後に、細胞に再び新鮮な培地を加え、２４時間培養した。２４時間の培養後、Ｔｒｉｚｏｌ（インビトロジェン（Carlsbad,CA)）の説明書に従って、細胞からＲＮＡｓを抽出した。High capacity RNA to cDNAキット（アプライドバイオシステムズ, Foster city,CA）を用い、その説明書に従って、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。製造者の説明書（アプライドバイオシステムズ 7500 system）に従って、合成したｃＤＮＡを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行った。内部補償のために、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定した。
【０１４８】
図１０に示すように、ＰＫＣＡのｓｉＲＮＡを単独で導入すると、ＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルは減少しなかった。しかしながら、ＰＫＣＡのｓｉＲＮＡをスペーサ組み込み型ＰＴＤと複合させた場合、全ての検体においてＰＫＣＡのｍＲＮＡレベルは減少した。このデータは、スペーサ組み込み型ＰＴＤによりｓｉＲＮＡｓが導入されると、ｓｉＲＮＡｓは阻害活性を保持することを証明している。
【０１４９】
これらの試験において、４量体ＰＴＤを第２の実施例に記載されたように調製し、第４の実施例に記載された方法と同一の方法により、ｓｉＲＮＡと混合した。培養したＤＭＥＭ培地を用いて、その混合液をＨｅＬａ細胞に導入した。その２時間後、細胞を新鮮な培地を用いて３度洗浄した。洗浄した後に、新鮮な培地を細胞に再び加え、２日間培養し、その後に、ＫＤａｌｅｒｔ（アンビオン（アプライドバイオシステムズ,Forster city,CA））の説明書に従いＧＡＰＤＨの活性を分析した。
【０１５０】
図１１に示すように、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡを単独で導入すると、ＧＡＰＤＨの活性は減少しなかった。しかしながら、ＧＡＰＤＨのｓｉＲＮＡを４量体ＰＴＤと複合させると、その濃度依存的にＧＡＰＤＨの活性は減少した。このデータは、４量体ＰＴＤにより導入すると、ｓｉＲＮＡｓは活性を保持することを証明している。
【０１５１】
（第９の実施例）
ＤＮＡベクターの細胞内の導入を媒介する多量体ＰＴＤ
ＨｅＬａ細胞の中にＤＮＡベクターを導入するための多量体ＰＴＤの特性を評価した。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードしているベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クロンテック,Mountain Viee,CA））をここでの試験に用いた。
【０１５２】
４量体ＰＴＤを第２の実施例に記載したように調製し、ＤＮＡベクターをＤＮＡ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（プロメガ,Madison,Wiscconsin）を用いて調製した。ＰＴＤを濃度が０．４ｍｇ／ｍｌになるように２×ＰＢＳを用いて溶解した。ＤＮＡの濃度をＤ．Ｗ．を用いて０．１ｍｇ／ｍｌに調製した。それぞれ等量のＤＮＡ溶液とＰＴＤ溶液とを混合した。それを室温で３０分間静置した後に、２０μｌの混合液を６ｍｍ培養皿内の培地に加えた。細胞内へのＤＮＡベクターの導入の後、ＥＧＦＰの発現のために細胞を４８時間培養した。ＤＮＡベクターの導入効率を評価するために、ＦＡＣＳによりＥＧＦＰの蛍光を測定した。陽性対照としてlipofectamine 2000（インビトロジェン,Carlbad,CA）導入試薬を用いて、同様の導入を行った。
【０１５３】
図１２に示すように、ＤＮＡの導入効率は、lipofectamineを用いるよりも４量体ＰＴＤを用いた方が高かった。図１２は、５３０／３０フィルタ（ＦＬ−１Ｈ）における蛍光強度の高さを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸の配列を備え、
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上のタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）と１つ又はそれ以上のスペーサとを含む１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含み、
前記スペーサは、前記核酸の配列と結合しない１つ又はそれ以上のアミノ酸の配列を含む複合体又は接合体。
【請求項２】
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖核酸である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項３】
前記スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、２つ若しくはそれ以上、３つ若しくはそれ以上、４つ若しくはそれ以上又は５つ若しくはそれ以上のＰＴＤｓを含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項４】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＤＮＡからなる群から選択される請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項５】
前記スペーサ組み込み型ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項６】
前記ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項７】
前記ＰＴＤは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０からなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項８】
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上の核酸結合領域をさらに含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項９】
前記核酸結合領域は、カチオン性物質を含む請求項８に記載の複合体又は接合体。
【請求項１０】
前記カチオン性物質は、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される請求項９に記載の複合体又は接合体。
【請求項１１】
前記ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンからなる群から選択される請求項１０に記載の複合体又は接合体。
【請求項１２】
前記核酸結合分子に複合又は接合している前記核酸の配列は、ナノ粒子を形成する請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１３】
可溶性である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１４】
前記核酸は、２本鎖ＲＮＡであり、２本の鎖のうちの１つは実質的に標的遺伝子と相補的である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１５】
前記２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される請求項１４に記載の複合体又は接合体。
【請求項１６】
前記核酸は、２本鎖核酸である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１７】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖又は２本鎖の核酸であり、
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサとを含む１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含み、
前記スペーサは、前記核酸と結合しない１つ又はそれ以上のアミノ酸の配列を含む組成物。
【請求項１８】
１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備え、
前記ＰＴＤｓは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される核酸結合分子。
【請求項１９】
１本鎖核酸と結合する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２０】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選択される請求項１９に記載の核酸結合分子。
【請求項２１】
２本鎖核酸と結合する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２２】
前記２本鎖核酸は、２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡからなる群から選択される請求項２１に記載の核酸結合分子。
【請求項２３】
１つ又はそれ以上の核酸結合領域をさらに備えている請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２４】
前記核酸結合領域は、カチオン性物質を含む請求項２３に記載の核酸結合分子。
【請求項２５】
前記カチオン性物質は、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される請求項２４に記載の核酸結合分子。
【請求項２６】
前記ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンからなる群から選択される請求項２５に記載の核酸結合分子。
【請求項２７】
核酸と複合又は接合することにより、ナノ粒子を形成する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２８】
核酸との複合又は接合により形成された複合体又は接合体は可溶性である請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２９】
組み換え型タンパク質の生成又は合成工程により請求項１８に記載の核酸結合分子を生成する工程（ｉ）と、
複合体を形成するために核酸と前記核酸結合分子とを混合する工程（ii）とを備えている前記核酸結合分子と複合している核酸の製造方法。
【請求項３０】
前記複合体は、前記核酸結合分子と前記核酸とを１：１から４：１までの間の比率で含む請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３１】
前記比率は、２：１から３：１までの間である請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記比率は、２：１である請求項３１に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記核酸結合分子と複合している前記核酸は、ナノ粒子を形成する請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３４】
前記核酸結合分子と複合している前記核酸は、可溶性である請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３５】
スペーサ組み込み型ＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している核酸を生成する工程（ｉ）と、
細胞培養培地の中に、前記核酸結合分子と複合又は接合している前記核酸を加える工程（ii）と、
前記細胞培養培地を、培養する工程（iii）とを備え、
前記核酸は、細胞の中に導入される、細胞内への核酸の導入を促進する方法。
【請求項３６】
前記核酸は、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡからなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞培養培地の中に請求項２に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項３８】
細胞培養培地の中に請求項１４に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項３９】
細胞培養培地の中に請求項１６に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項４０】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖核酸であり、
前記核酸結合分子は、３個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４１】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選択される請求項４０に記載の複合体又は接合体。
【請求項４２】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４０に記載の複合体又は接合体。
【請求項４３】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項４２に記載の複合体又は接合体。
【請求項４４】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、２本鎖ＲＮＡであり、２本の鎖のうちの１つは標的遺伝子と実質的に相補的であり、
前記核酸結合分子は、２個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４５】
前記２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される請求項４４に記載の複合体又は接合体。
【請求項４６】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４４に記載の複合体又は接合体。
【請求項４７】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項４６に記載の複合体又は接合体。
【請求項４８】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、２本鎖核酸であり、
前記核酸結合分子は、５個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４９】
前記核酸は、２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡからなる群から選択される請求項４８に記載の複合体又は接合体。
【請求項５０】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４８に記載の複合体又は接合体。
【請求項５１】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項５０に記載の複合体又は接合体。
【請求項５２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される２つ又はそれ以上のＰＴＤｓを含む多量体ＰＴＤを備えている核酸結合分子。
【請求項５３】
１本鎖核酸と結合する請求項５２に記載の核酸結合分子。
【請求項５４】
２本鎖核酸と結合する請求項５２に記載の核酸結合分子。
【請求項５５】
細胞培養培地の中に請求項１に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５６】
細胞培養培地の中に請求項４０に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５７】
細胞培養培地の中に請求項４４に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５８】
細胞培養培地の中に請求項４８に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項１】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸の配列を備え、
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上のタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤｓ）と１つ又はそれ以上のスペーサとを含む１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含み、
前記スペーサは、前記核酸の配列と結合しない１つ又はそれ以上のアミノ酸の配列を含む複合体又は接合体。
【請求項２】
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖核酸である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項３】
前記スペーサ組み込み型ＰＴＤｓは、２つ若しくはそれ以上、３つ若しくはそれ以上、４つ若しくはそれ以上又は５つ若しくはそれ以上のＰＴＤｓを含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項４】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＤＮＡからなる群から選択される請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項５】
前記スペーサ組み込み型ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項６】
前記ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項７】
前記ＰＴＤは、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０からなる群から選択される配列を含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項８】
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上の核酸結合領域をさらに含む請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項９】
前記核酸結合領域は、カチオン性物質を含む請求項８に記載の複合体又は接合体。
【請求項１０】
前記カチオン性物質は、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される請求項９に記載の複合体又は接合体。
【請求項１１】
前記ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンからなる群から選択される請求項１０に記載の複合体又は接合体。
【請求項１２】
前記核酸結合分子に複合又は接合している前記核酸の配列は、ナノ粒子を形成する請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１３】
可溶性である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１４】
前記核酸は、２本鎖ＲＮＡであり、２本の鎖のうちの１つは実質的に標的遺伝子と相補的である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１５】
前記２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される請求項１４に記載の複合体又は接合体。
【請求項１６】
前記核酸は、２本鎖核酸である請求項１に記載の複合体又は接合体。
【請求項１７】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖又は２本鎖の核酸であり、
前記核酸結合分子は、１つ又はそれ以上のＰＴＤｓと１つ又はそれ以上のスペーサとを含む１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを含み、
前記スペーサは、前記核酸と結合しない１つ又はそれ以上のアミノ酸の配列を含む組成物。
【請求項１８】
１つ又はそれ以上のスペーサ組み込み型ＰＴＤｓを備え、
前記ＰＴＤｓは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される核酸結合分子。
【請求項１９】
１本鎖核酸と結合する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２０】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選択される請求項１９に記載の核酸結合分子。
【請求項２１】
２本鎖核酸と結合する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２２】
前記２本鎖核酸は、２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡからなる群から選択される請求項２１に記載の核酸結合分子。
【請求項２３】
１つ又はそれ以上の核酸結合領域をさらに備えている請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２４】
前記核酸結合領域は、カチオン性物質を含む請求項２３に記載の核酸結合分子。
【請求項２５】
前記カチオン性物質は、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリエチレンイミンからなる群から選択される請求項２４に記載の核酸結合分子。
【請求項２６】
前記ポリリジンは、ポリ−Ｌ−リジン及びポリ−Ｄ−リジンからなる群から選択される請求項２５に記載の核酸結合分子。
【請求項２７】
核酸と複合又は接合することにより、ナノ粒子を形成する請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２８】
核酸との複合又は接合により形成された複合体又は接合体は可溶性である請求項１８に記載の核酸結合分子。
【請求項２９】
組み換え型タンパク質の生成又は合成工程により請求項１８に記載の核酸結合分子を生成する工程（ｉ）と、
複合体を形成するために核酸と前記核酸結合分子とを混合する工程（ii）とを備えている前記核酸結合分子と複合している核酸の製造方法。
【請求項３０】
前記複合体は、前記核酸結合分子と前記核酸とを１：１から４：１までの間の比率で含む請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３１】
前記比率は、２：１から３：１までの間である請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記比率は、２：１である請求項３１に記載の製造方法。
【請求項３３】
前記核酸結合分子と複合している前記核酸は、ナノ粒子を形成する請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３４】
前記核酸結合分子と複合している前記核酸は、可溶性である請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３５】
スペーサ組み込み型ＰＴＤを含む核酸結合分子と複合又は接合している核酸を生成する工程（ｉ）と、
細胞培養培地の中に、前記核酸結合分子と複合又は接合している前記核酸を加える工程（ii）と、
前記細胞培養培地を、培養する工程（iii）とを備え、
前記核酸は、細胞の中に導入される、細胞内への核酸の導入を促進する方法。
【請求項３６】
前記核酸は、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＤＮＡ及び２本鎖ＤＮＡからなる群から選択される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞培養培地の中に請求項２に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項３８】
細胞培養培地の中に請求項１４に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項３９】
細胞培養培地の中に請求項１６に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項４０】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、リン酸骨格を含む１本鎖核酸であり、
前記核酸結合分子は、３個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４１】
前記１本鎖核酸は、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｃＲＮＡからなる群から選択される請求項４０に記載の複合体又は接合体。
【請求項４２】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４０に記載の複合体又は接合体。
【請求項４３】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項４２に記載の複合体又は接合体。
【請求項４４】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、２本鎖ＲＮＡであり、２本の鎖のうちの１つは標的遺伝子と実質的に相補的であり、
前記核酸結合分子は、２個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４５】
前記２本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、操作型ＲＮＡ前駆体及びｓｈＲＮＡからなる群から選択される請求項４４に記載の複合体又は接合体。
【請求項４６】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４４に記載の複合体又は接合体。
【請求項４７】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項４６に記載の複合体又は接合体。
【請求項４８】
核酸結合分子と複合又は接合している核酸を備え、
前記核酸は、２本鎖核酸であり、
前記核酸結合分子は、５個から１０個までのＰＴＤｓを有する多量体ＰＴＤを含む複合体又は接合体。
【請求項４９】
前記核酸は、２本鎖ＤＮＡベクター、２本鎖ＲＮＡ、ハイブリッド２本鎖核酸及び環状ＲＮＡからなる群から選択される請求項４８に記載の複合体又は接合体。
【請求項５０】
前記多量体ＰＴＤは、ホモマーＰＴＤ及びヘテロマーＰＴＤからなる群から選択される請求項４８に記載の複合体又は接合体。
【請求項５１】
前記多量体ＰＴＤは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される配列を含む請求項５０に記載の複合体又は接合体。
【請求項５２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２及び分枝型ポリリジンからなる群から選択される２つ又はそれ以上のＰＴＤｓを含む多量体ＰＴＤを備えている核酸結合分子。
【請求項５３】
１本鎖核酸と結合する請求項５２に記載の核酸結合分子。
【請求項５４】
２本鎖核酸と結合する請求項５２に記載の核酸結合分子。
【請求項５５】
細胞培養培地の中に請求項１に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５６】
細胞培養培地の中に請求項４０に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５７】
細胞培養培地の中に請求項４４に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
前記工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【請求項５８】
細胞培養培地の中に請求項４８に記載の複合体又は接合体を加える工程（ｉ）と、
工程（ｉ）において調製された前記細胞培養培地を培養して、標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の前記複合体又は前記接合体を細胞内に導入させる工程（ii）と、
前記細胞を維持し、前記標的遺伝子に対応するｍＲＮＡを分解させる工程（iii）と、
前記細胞の表現型と、適当な対照細胞の表現型とを観察及び比較する工程（iv）とを備え、
前記細胞内の前記標的遺伝子の機能に関する情報を得る、細胞内の標的遺伝子の機能を判定する方法。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０４３７５（Ｐ２０１１−５０４３７５Ａ）
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３５８７６（Ｐ２０１０−５３５８７６）
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６９６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９９３５
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（５０９０２５５８８）フォーヒューマンテック カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００６９６２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０６９９３５
【国際公開日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【出願人】（５０９０２５５８８）フォーヒューマンテック カンパニー リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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