細胞の培養方法及び細胞培養装置
【課題】筒状部材の表面に対する細胞等の付着を防止することで、効率的に細胞を培養する培養方法、及び培養装置を提供する。
【解決手段】培養槽１内に対して、筒状部材２の一方端部が外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ細胞を培養する方法であって、酸素含有ガスを、筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給する培養方法、及び培養装置。
【解決手段】培養槽１内に対して、筒状部材２の一方端部が外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ細胞を培養する方法であって、酸素含有ガスを、筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給する培養方法、及び培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液に筒状部材を配置し、当該筒状部材内部に酸素含有ガスを供給しながら当該筒状部材外部において細胞を培養する細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、動物細胞や、植物細胞、細菌などを対象として培養槽内に張り込んだ培養液で培養することで細胞自体或いは細胞が産生する物質を製造することが行われており、特に培養規模を大きくしてより生産性を高めることが望まれている。このような細胞培養においては、嫌気性の細胞を対象とする以外、培地中に酸素を供給する必要がある。例えば、特許文献１には、コイル状に整形した多孔質チューブの表面から酸素供給を行うことを特徴とする培養装置に関する記載がある。また、特許文献２には，撹拌翼にガス透過膜を固定して回転させる培養槽に関する記載がある。
【０００３】
生体細胞の培養では、目的生産物の生産性向上のために生体細胞を高密度で培養することが望まれている。しかし、高密度で細胞を培養した場合など、細胞や細胞塊が酸素供給を行うガス透過膜や上記多孔質チューブ等に付着してしまい、効率的な酸素供給を行えないといった問題が生じることがある。
【０００４】
細胞のなかでも、付着依存性を有する細胞の場合には、表面または内部に細胞が付着して増殖することが可能な培養面を有するマイクロキャリアと称される微細な粒子が使用される。非特許文献１には、マイクロキャリア培養において、培養に好適なマイクロキャリア密度があること、及び過剰な撹拌は大きな増殖阻害を引き起こすことが記載されている。
【０００５】
マイクロキャリア培養において培養液に酸素を供給するシステムとしては以下のような特許文献３〜６が挙げられる。特許文献３には、培養槽外に酸素供給槽を設け、培養槽内に設置した振動スクリーンによってマイクロキャリアを除いた培養液を酸素供給槽に導き、酸素供給槽内で液中通気法によって酸素を溶解させた後、培養槽に循環させることを特徴とする培養装置に関する記載がある。特許文献４には、培養槽外に酸素供給用の循環管路を設け，培養槽内に設置したスクリーンによって生体細胞を含む固形粒子を除いた培養液を循環させ、循環管路の途中に酸素含有ガスを注入して酸素を溶解させることを特徴とする生体触媒反応装置に関する記載がある。特許文献５には、細胞増殖用の充填ボデイを充填した円筒カラム型培養装置において、培養装置底部に接する部分に前記の充填ボデイの侵入を防止しかつ培養液を通過せしめる穴を設けた空気拡散管を配し、該空気拡散菅内部に空気入り口を設けて酸素供給と培養液の循環を行わせることを特徴とする培養装置に関する記載がある。特許文献６には、培養槽内にマイクロキャリアの通過を阻止し培養液を通過せしめる微細な孔を有する部材で囲まれ、撹拌軸の回転によって振動する酸素供給ゾーンを設け、マイクロキャリアの存在しない酸素供給ゾーンに酸素含有ガスを液中通気することを特徴とする培養装置に関する記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平3-272678公報
【特許文献２】特開平5-304943公報
【特許文献３】特開平6-269274公報
【特許文献４】特開平3-43070公報
【特許文献５】特開平5-276926公報
【特許文献６】特開平5-252933公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）第32巻975頁〜982頁（1988年発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、上述した従来の手法は、細胞やマイクロキャリア等の密度を高密度化するために必要となる酸素の供給方法に主眼がおかれて開発されたものであるが、酸素供給手段の表面や、酸素供給ゾーンを区画する微細な孔を有する部材の表面に細胞やマイクロキャリア等が付着してしまうといった問題があった。このような問題が生じると、培養液中の溶存酸素濃度を適切に制御することが困難となり、効率的な細胞培養を達成できないといった問題が生じる。
【０００９】
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、培養液に筒状部材を配置し、当該筒状部材内部に酸素含有ガスを供給しながら当該筒状部材外部において細胞を培養するに際して、当該筒状部材の表面に対する細胞等の付着を防止することで、効率的に細胞を培養することができる細胞の培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成する本発明は、以下の内容を包含する。
【００１１】
すなわち、本発明に係る細胞の培養方法は、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える細胞培養装置を使用する。また、本発明に係る細胞培養方法は、上記培養槽内に対して、上記筒状部材の一方端部が液外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ、細胞を培養する方法であって、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として上記散気手段から供給することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明に係る細胞培養法では、上記散気手段から供給された気泡が上記筒状部材の内部を上方向に移動することによって、当該気泡より下側の部分が陰圧となり細孔を介して筒状部材の内部に培養液が流入することとなる。また、当該気泡より上側の部分では、圧力が高まり、筒状内部の培養液が細孔を介して外側に流出する。このように、本発明に係る細胞培養方法においては、筒状部材の内部と外部との間で細孔を介して培養液の流入及び流出が繰り返されることとなる。これにより、筒状部材の側面に対する細胞等の付着を防止することができる。
【００１３】
特に、本発明に係る細胞培養法においては、上記散気手段は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給することが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る細胞培養法においては、培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養する方法にも適用することができる。
【００１５】
さらに、本発明に係る細胞培養方法においては、上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることが好ましく、上記筒状部材の側面における細孔を50〜150μmの直径を有する貫通孔とすることがより好ましい。
【００１６】
さらにまた、上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましく、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することが好ましい。
【００１７】
なお、本発明に係る細胞培養方法において、上記培養装置は、培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものを使用することがより好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る細胞培養装置は、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える。本発明に係る細胞培養装置において、上記散気手段は、上記筒状部材の内部に培養液が張り込まれた状態において、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給するものである。
【００１９】
本発明に係る細胞培養装置では、上記散気手段から供給された気泡が上記筒状部材の内部を上方向に移動することによって、当該気泡より下側の部分が陰圧となり細孔を介して筒状部材の内部に培養液が流入することとなる。また、当該気泡より上側の部分では、圧力が高まり、筒状内部の培養液が細孔を介して外側に流出する。このように、本発明に係る細胞培養装置においては、筒状部材の内部と外部との間で細孔を介して培養液の流入及び流出が繰り返されることとなる。これにより、筒状部材の側面に対する細胞等の付着を防止することができる。
【００２０】
また、本発明に係る細胞培養装置は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給するように、上記散気手段を制御する制御装置を更に備えることが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明に係る細胞培養装置においては、培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することができる。
【００２２】
さらにまた、本発明に係る細胞培養装置において、上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることが好ましく、上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることがより好ましい。
【００２３】
さらにまた、本発明に係る細胞培養装置において、上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましく、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することが好ましい。
【００２４】
なお、本発明に係る細胞培養装置は、上記培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したもとすることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、筒状部材の内部を分割する気泡を当該筒状部材内部に通過させることで、筒状部材の側面に対する細胞やマイクロキャリア等の付着を防止することができ、より効率的に細胞を培養することができる。したがって、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、細胞自体或いは細胞が産生する物質を製造する際の生産性を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明を適用した細胞培養装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明の酸素供給方法の作用メカニズムを説明する概要図である。
【図３】本発明を適用した細胞培養装置における酸素供給能力を示す特性図である。
【図４】本発明を適用した細胞培養装置における培養特性を示す特性図である。
【図５】本発明を適用した細胞培養装置の他の例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置について、図面を用いて詳細に説明する。
【００２８】
本発明において、培養対象の細胞としては、特に限定されず、例えば医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞の培養に適用することができる。生産対象の物質としては、培養した細胞自体、細胞が産生する抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物若しくは高分子化合物等の生理活性物質及びウイルスを挙げることができる。また、培養対象の細胞としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、抗体や酵素等のタンパク質、ウイルスを生産する動物細胞を培養対象とすることが好ましい。また、培養対象の細胞は、表面及び/又は内部に細胞が付着して増殖することが可能な培養面を有するマイクロキャリアを使用して培養するものであっても良い。マイクロキャリアを用いた培養は、特に、付着依存性を有する動物培養に適用することが好ましい。
【００２９】
本発明を適用した細胞培養装置の一例を図１に示す。細胞培養装置は、培養液を張り込むことができる培養槽１と、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材２とを備えている。筒状部材２は、培養槽１の内部に配設されている。筒状部材２は、培養槽１の内部において、その長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、封止されている上記他方端部が下方になるように配設されている。ここで、筒状部材２は、その長手方向が鉛直下方向に対して厳密に平行な方向となるように配設しても良い。また、詳細を後述するように、筒状部材２の内部に供給した気泡が上昇することが可能であれば、筒状部材２は、その長手方向が鉛直下方向に対してやや傾斜するように配設しても良い。上述した「鉛直下方向と略平行」とは、このように、筒状部材２の長手方向が鉛直下方向に対してやや傾斜した形態を包含する意味である。
【００３０】
また、細胞培養装置は、培養槽１内の培養液に含まれる溶存酸素を測定するためのセンサー３と、センサー３からのシグナルを入力し溶存酸素濃度を算出する溶存酸素濃度計測手段４とを備えていても良い。センサー３は、培養槽１の底部近傍（例えば、底部から50ｍｍの位置）に配置されていることが望ましい。
【００３１】
さらに、細胞培養装置は、溶存酸素濃度計測手段４で測定した溶存酸素濃度値を入力する第１の制御装置５、第２の制御装置６及び第３の制御装置７と、第１の制御装置５により動作制御されるガス分圧調節装置８と、第２の制御装置６により動作制御される撹拌機駆動モータ９と、第３の制御装置７により動作制御される通気ガス調節装置１０と、撹拌機駆動モータ９に接続された撹拌軸１１、撹拌翼１２ａ及び１２ｂとを備えていてもよい。なお、この場合、細胞培養装置は、図示しないが、ガス分圧調節装置８及び通気ガス調節装置１０に接続され、これらガス分圧調節装置８及び通気ガス調節装置１０に酸素含有ガス（通気ガス）を供給するガス供給装置を備えている。なお、撹拌翼１２ａ及び１２ｂとしては、例えば回転直径100ｍｍのパドル形のものを使用することができる。
【００３２】
さらにまた、細胞培養装置は、通気ガス調節装置１０が筒状部材２の封止された他方端部に接続されている。通気ガス調節装置１０は、酸素含有ガス（通気ガス）を排出するノズル（図示せず）を有している。このノズルは、封止された他方端部を介して筒状部材２の内部に臨んでいる。
【００３３】
特に、筒状部材２は、側面に細孔が形成されており、細孔を介して培養液が内部へ流入したり、内部の培養液が外部へ流出したりすることができる。ここで、細孔としては、培養液の流出入が可能であり、且つ、細胞又はマイクロキャリアの通過が阻止できる大きさ及び形状であればよい。例えば、培養対象の細胞をマイクロキャリアに担持させて培養する場合、筒状部材２の側面における細孔は50〜150μmの直径を有する貫通孔とすることが好ましい。
【００３４】
また、筒状部材２の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましい。可塑性を有する材質としては、例えばポリプロピレン等の樹脂を挙げることができる。このような樹脂を使用したメッシュシートを筒状に加工することで、筒状部材２の側面を形成することができる。また、筒状部材２は、メッシュシートを筒状に加工した後、一方の端部を封止部材２ｓによって封止することで作製することができる。例えば、ガラス製で直径240ｍｍ、培養液張り込み高さ230ｍｍ、培養容積10Lの培養槽１を使用してマイクロキャリアを使用した細胞培養を行う場合、100×100μｍの細孔を有するポリプロピレン製メッシュシートで構成された内径30ｍｍ、高さ250ｍｍの形状を有する筒状部材２を使用することができる。この筒状部材２を、その長手方向を鉛直下方向に対して略平行とし、且つ、封止された端部を培養槽１の底部近傍に位置するように、培養槽１に設置することで、筒状部材における開放された一方端部が培養液入り込み高さを超える位置となる。
【００３５】
また、筒状部材２の材質としては、ポリプロピレン樹脂のほかに、ステンレス材、四フッ化エチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂など、スチーム殺菌に耐え、酸及びアルカリ性の洗浄剤を用いた洗浄操作に安定で、細胞への毒性を示さない材料からなるメッシュシートを使用することができる。
【００３６】
以上のように構成された本発明に係る細胞培養装置を用いることで、上述した細胞を培養することができる。以下では、マイクロキャリアを使用して動物細胞を培養する形態について説明するが、本発明の技術的範囲はこの形態に限定されるものではない。
【００３７】
培養槽１内に張り込まれた培養液１３中には、微細粒子であるマイクロキャリア１４が浮遊している。マイクロキャリア１４には、付着依存性を有する細胞が増殖するための培養面が設けられている。細胞はマイクロキャリア１４に接触することにより培養面に付着し、増殖を開始する。マイクロキャリア１４は、培養液１３よりもわずかに比重が大きく、細胞が増殖するとさらに比重が大きくなる。このため、マイクロキャリア１４は、静置状態では培養槽１の底部に沈降する。細胞培養装置では、第２の制御装置６が撹拌機駆動モータ９の回転速度を制御して、撹拌翼１２ａ及び１２ｂを回転させて培養液１３を流動させることにより、マイクロキャリア１４を浮遊させている。特に、培養期間が長くなるほど、細胞の増殖によってマイクロキャリアを含む微粒子の比重が大きくなり、より沈降しやすくなる。この場合、撹拌回転数を増加させるように制御することで、マイクロキャリアを良好に培養液１３中に浮遊させることができる。
【００３８】
細胞培養装置を使用した細胞培養においては、培養液１３を所望の溶存酸素濃度となるように適宜、調節を行いながら培養を継続する。細胞培養装置においては、溶存酸素濃度計測手段４を備えており、センサー３及び溶存酸素濃度計測手段４で測定した溶存酸素濃度値を基に、撹拌機の回転数を増減する方法、気相部の酸素濃度を増減する方法、及び筒状部材２へ酸素含有ガスを吹き込む方法のいずれか又はこれらの３つの方法を併用することによって、培養液１３中の溶存酸素濃度を制御することができる。
【００３９】
撹拌機の回転数を増減する方法は、溶存酸素濃度計測手段４で測定した培養液１３中の溶存酸素濃度値に基づいて、上述したように、第２の制御装置６が撹拌機駆動モータ９の回転速度を制御する方法である。撹拌回転数が増加すると混合が強化され、酸素溶解量が増加する。
【００４０】
また、気相部の酸素濃度を増減する方法は、第１の制御装置５がガス分圧調節装置８を制御し、培養液１３上方の気相部に対する酸素含有ガス（通気ガス）の供給量を調整する方法である。また、第１の制御装置５及びガス分圧調節装置８により、培養液１３のｐＨの変化に対応して炭酸ガス分圧の増減を行うようにしてもよい。なお、第１の制御装置５及びガス分圧調節装置８による溶存酸素濃度のコントロールは、細胞播種後の低細胞密度の時期に主に使用することが好ましい。
【００４１】
さらに、筒状部材２へ酸素含有ガスを吹き込む方法は、筒状部材２、第３の制御装置７及び通気ガス調節装置１０により、培養液１３の溶存酸素濃度を調整する方法である。具体的には、図２に模式的に示すように、封止部材２ｓに設けられたノズルより通気ガスが筒状部材２の内部に供給されると気泡２ｂが形成され、気泡２ｂより培養液１３へ酸素が供給される。このとき、気泡２ｂは、筒状部材２の内部に張り込んだ培養液１３を上下に分割することとなる。また、気泡２ｂは液面に向かって上昇する。気泡２ｂは、いわばプラグとして機能することとなる。気泡２ｂが筒状部材２内部を上昇するとき、筒状部材２に細孔が無いと仮定すると、内部では気泡２ｂが入ることによって見かけの培養液１３の比重が減少して液面が上昇し、ΔPに相当する負の圧力差が生じる。このときの筒状部材２内部の圧力は外部に比べて、気泡２ｂより下では−ΔP、気泡２ｂより上ではΔPとなる。細孔を有する筒状部材２においても同様な関係が生じるため、気泡２ｂより下では培養液１３が内部に流入し、気泡２ｂより上では内部の培養液１３が外部に流出する。また、筒状部材２の側面において、気泡２ｂの上昇に伴って、培養液１３が流入する部分と流出する部分が変化する。
【００４２】
これによって、筒状部材２の細孔部分に付着したマイクロキャリア等を剥離することができる。以上のように、本発明に係る細胞培養装置において、筒状部材２の内部を上下方向に分割するような気泡２ｂを筒状部材２に通過させることによって、筒状部材２の側面に対して細胞やマイクロキャリア等が付着することを防止できる。このため、筒状部材２内部において、培養槽１に張り込まれた培養液１３の溶存酸素濃度を所期の値に制御することが可能となる。
【００４３】
特に、上述したように筒状部材２内部に対して培養液を流出入させるには、気泡２ｂを介して上記圧力差を形成することが必要であるため通気ガスは間歇的に供給される。なお、1回あたりの通気時間は０．５〜１．５ｓの短時間とすることで、上述したようにプラグ状の気泡２ｂを形成することができる。また、１回あたりの通気ガス吹き込み量Ｖ(ｍｌ)は下記の式１によって決定される。なお、式１は筒状部材２が円筒状である場合に適用される。
【００４４】
〔式１〕 Ｖ＝β・Ｄ３・π／４
ここで、β：通気計数（−）
Ｄ：円筒直径（ｃｍ）
【００４５】
通気計数βの値は、筒状部材２の長さによって経験的に決定されるもので、長さ０．２ｍ〜１．５ｍの範囲では１〜５となる。
【００４６】
そして、筒状部材２内部を通過した気泡２ｂは、筒状部材２における開放された一方端部付近で破裂し、消泡する。このとき、筒状部材２における一方端部は、培養液１３の液面より外方に露出しているため、気泡２ｂは筒状部材２の内部で破裂することとなる。このため、気泡２ｂの破裂に伴う衝撃により、培養液１３に浮遊する細胞やマイクロキャリアが損傷されることを防止できる。
【００４７】
また、筒状部材２内部に通気ガスを吹き込むタイミングとしては、前回の吹き込みで生じた気泡２ｂが液面上に達した後とすることが好ましい。若しくは、筒状部材２内部に通気ガスを吹き込むタイミングとしては、前回の吹き込みで生じた気泡２ｂが液面付近で消泡した後とすることが好ましい。筒状部材２の内部において、上下方向に複数の気泡２ｂを生じさせた場合、気泡と気泡の間に上述したような圧力差が形成されず、培養液１３の流出入が達成できないからである。
【００４８】
さらに、細胞培養装置において筒状部材２を可撓性の材質で構成した場合には、気泡２ｂの移動によって筒状部材２の側面に揺動と伸縮する動きが生じ、これらの動きがマイクロキャリア等を剥離させる作用として働く。このため、筒状部材２を可撓性の材質で構成した場合には、筒状部材２の側面に対するマイクロキャリア等の付着をより効果的に除去することができる。
【００４９】
また、図１や図２に示すように、単一の気泡２ｂが筒状部材２内部をプラグフロー状態で上昇することがもっとも好ましい。筒状部材２の内径を大きくすることによって単一気泡によるプラグフローを実現し得ない場合は、前記の式１にて決定した容積のガスを１〜１．５秒の短時間に供給することで得られる気泡群によって筒状部材２の内部を分割しても良い。
【００５０】
図１及び２に示した細胞培養装置を用いて実際に計測した酸素溶解経過を図３に示す。図１に示す培養槽１に、マイクロキャリア（サイトデックス１、GEヘルスケア製）を乾燥重量で5％の濃度になるよう分散させた生理的リン酸緩衝液2Ｌを張り込み、30rpmで撹拌しながら37℃に加温した。ついで、生理的リン酸緩衝液中に窒素を注入して溶存酸素濃度がほぼ0％まで低下させた。つぎに筒状部材２内に10秒間隔で25ml/回の空気を1秒間で注入して溶存酸素濃度の変化を計測した。計測結果を図３中にＡで示す。比較として、図３中Ｂは筒状部材２から円筒部分を取り外して封止部材２ｓから空気を150ml/分で直接通気した場合の溶存酸素濃度の変化をしめす。また、図中Ｃは筒状部材２内に空気を１５０ｍｌ／分で連続して通気した場合の溶存酸素濃度の変化を示す。図３中のＡに示すように、筒状部材２を使用した場合、直接液中に通気したＢに比較して酸素溶解速度が劣ることは否めないが、気泡が培養細胞と接触しない状況下で酸素供給を行うことができることを示す。また筒状部材２を使用した場合においても、連続的に通気したＣに比べると、気泡２ｂを形成するように供給したＡのほうがより大きな酸素供給速度が得られることがわかる。この結果から、気泡２ｂを筒状部材２の内部に形成することによって、細孔の目詰まりが少なくなっていることが理解できる。
【００５１】
また、図１に示した細胞培養装置を用いて実際に動物細胞の培養を行った結果を図４に示す。図４に結果を示す実験例において、動物細胞としてはCHO-K1細胞を使用した。また、培地としては、CD-CHO培地（インビトロジェン製）を使用した。マイクロキャリアとしては、サイトデックス１（GEヘルスケア製）を乾燥重量で５％の比率で培地に加えた。培養中の酸素の通気は、溶存酸素濃度が制御値を下回ったときに筒状部材２中に酸素を断続的に通気した。通気は25ml/回の酸素を1秒間で噴出させるもので、これを10秒間隔で行った。培養を開始するに当たっては、あらかじめ別容器にて調製したCHO-K1細胞をトリプシン処理で剥離させ、細胞密度が2×10-5（個/ml）となるように播種して培養を開始した。なお、溶存酸素濃度計測手段４による溶存酸素濃度の制御値は3.0mg/Lに設定した。また、本培養装置の場合、撹拌回転数が20rpm以下ではマイクロキャリアの一部が培養槽底に沈積するため、培養開始持の回転数を30rpmとした。培養期間中、１日に１回の頻度で培養液を採取し、マイクロキャリア上で増殖した細胞量を計測した。なお、培養液採取の際は、マイクロキャリアが均一に培養液中に分散するよう、手動にて回転数を50rpmに増加させた。マイクロキャリア上の細胞の計測はトリプシン処理によって細胞を剥離させて計測した。結果、図４にＡで示すように最高細胞到達密度は、培養６日目の6.6×106（個/ml）であった。培養６日目のマイクロキャリアを光学顕微鏡で観察すると、その表面の全面が細胞によって覆われたいわゆるコンフルエントの状態であり、マイクロキャリアの損傷もほとんど認められなかった。
【００５２】
比較として、筒状部材２の筒状部を取り外した封止部材２ｓから空気を直接通気した場合の培養結果を図４中のＢで示した。なお、通気は溶存酸素濃度が制御値を下回ったときに150ml/分で行った。実験装置としては前記の実験と同じ装置を使用し、培養手法も上記のとおりである。この場合、撹拌速度は全期間を通じて25rpmとした。最高細胞到達密度は、培養７日目の5.8×106（個/ml）であった。培養７日目のマイクロキャリアの表面には細胞の増殖していない部分が残されていた。
【００５３】
図４に示した結果から、筒状部材２の内部に対して気泡２ｂを生じさせることで、筒状部材２の側面に対するマイクロキャリア等の付着を防止することができ、より効率的に細胞培養を行えることが明らかとなった。
【００５４】
ところで、細胞培養装置は、図１に示したような構成に限定されず、例えば図５に示すように、複数の筒状部材２を培養槽１内に設置したような構成であってもよい。なお、図５に示した細胞培養装置は、追加供給用の培地１６を収容する培地槽１５と、使用済みの培養液１８を収容する廃液槽１７とを備え、培養中に培地の交換を実施できるタイプの培養装置である。培地槽１５は移送管路２１、廃液槽１７は移送管路２２によって培養槽１と連通している。移送管路２１には弁３１，移送管路２２には弁３２が設置されている。なお、図５中には図示していないが、図５に示す細胞培養装置は、空気、酸素、窒素及び炭酸ガス等のガス供給設備、温水冷水供給設備、蒸気供給設備、給排水設備及び各種の計測手段を具備している。
【００５５】
また、図５示す細胞培養装置は培養槽１内に４基の筒状部材２を備えている。これら４基の筒状部材２に対する通気ガスの供給は、それぞれ独立して制御しても良い、全て同時となるように制御しても良い。
【００５６】
さらに、細胞培養装置は、培養槽１の内圧を測定する圧力計２５を備え、圧力計２５による計測結果をもとに、圧力調整弁２６によって一定の圧力に保持することができる。通常、外部からの細菌等の侵入を防ぐため、培養槽１内部を0.01〜0.05MPaに加圧している。
なお、使用されるガス類はあらかじめ細菌等の微粒子を除去したものを使用する。
【００５７】
図５に示した細胞培養装置においても、図１に示した細胞培養装置と同様に、筒状部材２内部を上下方向に分割する気泡として通気ガスを供給することで、筒状部材２の側面に対する細胞やマイクロキャリア等の付着を防止して細胞培養、培地交換等の作業を行うことができる。また、細胞培養装置によれば、筒状部材２に形成された気泡が培養細胞と非接触の状態となる。このため、培養細胞が高濃度の酸素と接触することを防止するとともに、気泡の破裂の衝撃による損傷を防止することができる。したがって、培養細胞が直接高濃度の酸素ガスと接触することによる増殖阻害、気泡に同伴されたマイクロキャリアに付着した細胞が泡沫槽内に長時間閉じ込められることによる増殖阻害、及び気泡の破裂の衝撃による損傷などを原因とする培養への悪影響を防止でき、マイクロキャリアでの培養を良好に実施できる。
【符号の説明】
【００５８】
１…培養槽、２…筒状部材、４…溶存酸素濃度計測手段、５…第１の制御装置、６…第２の制御装置、７…第３の制御装置、１３…培養液、１４・・・マイクロキャリア
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液に筒状部材を配置し、当該筒状部材内部に酸素含有ガスを供給しながら当該筒状部材外部において細胞を培養する細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、動物細胞や、植物細胞、細菌などを対象として培養槽内に張り込んだ培養液で培養することで細胞自体或いは細胞が産生する物質を製造することが行われており、特に培養規模を大きくしてより生産性を高めることが望まれている。このような細胞培養においては、嫌気性の細胞を対象とする以外、培地中に酸素を供給する必要がある。例えば、特許文献１には、コイル状に整形した多孔質チューブの表面から酸素供給を行うことを特徴とする培養装置に関する記載がある。また、特許文献２には，撹拌翼にガス透過膜を固定して回転させる培養槽に関する記載がある。
【０００３】
生体細胞の培養では、目的生産物の生産性向上のために生体細胞を高密度で培養することが望まれている。しかし、高密度で細胞を培養した場合など、細胞や細胞塊が酸素供給を行うガス透過膜や上記多孔質チューブ等に付着してしまい、効率的な酸素供給を行えないといった問題が生じることがある。
【０００４】
細胞のなかでも、付着依存性を有する細胞の場合には、表面または内部に細胞が付着して増殖することが可能な培養面を有するマイクロキャリアと称される微細な粒子が使用される。非特許文献１には、マイクロキャリア培養において、培養に好適なマイクロキャリア密度があること、及び過剰な撹拌は大きな増殖阻害を引き起こすことが記載されている。
【０００５】
マイクロキャリア培養において培養液に酸素を供給するシステムとしては以下のような特許文献３〜６が挙げられる。特許文献３には、培養槽外に酸素供給槽を設け、培養槽内に設置した振動スクリーンによってマイクロキャリアを除いた培養液を酸素供給槽に導き、酸素供給槽内で液中通気法によって酸素を溶解させた後、培養槽に循環させることを特徴とする培養装置に関する記載がある。特許文献４には、培養槽外に酸素供給用の循環管路を設け，培養槽内に設置したスクリーンによって生体細胞を含む固形粒子を除いた培養液を循環させ、循環管路の途中に酸素含有ガスを注入して酸素を溶解させることを特徴とする生体触媒反応装置に関する記載がある。特許文献５には、細胞増殖用の充填ボデイを充填した円筒カラム型培養装置において、培養装置底部に接する部分に前記の充填ボデイの侵入を防止しかつ培養液を通過せしめる穴を設けた空気拡散管を配し、該空気拡散菅内部に空気入り口を設けて酸素供給と培養液の循環を行わせることを特徴とする培養装置に関する記載がある。特許文献６には、培養槽内にマイクロキャリアの通過を阻止し培養液を通過せしめる微細な孔を有する部材で囲まれ、撹拌軸の回転によって振動する酸素供給ゾーンを設け、マイクロキャリアの存在しない酸素供給ゾーンに酸素含有ガスを液中通気することを特徴とする培養装置に関する記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平3-272678公報
【特許文献２】特開平5-304943公報
【特許文献３】特開平6-269274公報
【特許文献４】特開平3-43070公報
【特許文献５】特開平5-276926公報
【特許文献６】特開平5-252933公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バイオテクノロジー アンド バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）第32巻975頁〜982頁（1988年発行）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、上述した従来の手法は、細胞やマイクロキャリア等の密度を高密度化するために必要となる酸素の供給方法に主眼がおかれて開発されたものであるが、酸素供給手段の表面や、酸素供給ゾーンを区画する微細な孔を有する部材の表面に細胞やマイクロキャリア等が付着してしまうといった問題があった。このような問題が生じると、培養液中の溶存酸素濃度を適切に制御することが困難となり、効率的な細胞培養を達成できないといった問題が生じる。
【０００９】
そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、培養液に筒状部材を配置し、当該筒状部材内部に酸素含有ガスを供給しながら当該筒状部材外部において細胞を培養するに際して、当該筒状部材の表面に対する細胞等の付着を防止することで、効率的に細胞を培養することができる細胞の培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成する本発明は、以下の内容を包含する。
【００１１】
すなわち、本発明に係る細胞の培養方法は、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える細胞培養装置を使用する。また、本発明に係る細胞培養方法は、上記培養槽内に対して、上記筒状部材の一方端部が液外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ、細胞を培養する方法であって、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として上記散気手段から供給することを特徴とするものである。
【００１２】
本発明に係る細胞培養法では、上記散気手段から供給された気泡が上記筒状部材の内部を上方向に移動することによって、当該気泡より下側の部分が陰圧となり細孔を介して筒状部材の内部に培養液が流入することとなる。また、当該気泡より上側の部分では、圧力が高まり、筒状内部の培養液が細孔を介して外側に流出する。このように、本発明に係る細胞培養方法においては、筒状部材の内部と外部との間で細孔を介して培養液の流入及び流出が繰り返されることとなる。これにより、筒状部材の側面に対する細胞等の付着を防止することができる。
【００１３】
特に、本発明に係る細胞培養法においては、上記散気手段は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給することが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る細胞培養法においては、培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養する方法にも適用することができる。
【００１５】
さらに、本発明に係る細胞培養方法においては、上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることが好ましく、上記筒状部材の側面における細孔を50〜150μmの直径を有する貫通孔とすることがより好ましい。
【００１６】
さらにまた、上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましく、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することが好ましい。
【００１７】
なお、本発明に係る細胞培養方法において、上記培養装置は、培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものを使用することがより好ましい。
【００１８】
また、本発明に係る細胞培養装置は、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える。本発明に係る細胞培養装置において、上記散気手段は、上記筒状部材の内部に培養液が張り込まれた状態において、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給するものである。
【００１９】
本発明に係る細胞培養装置では、上記散気手段から供給された気泡が上記筒状部材の内部を上方向に移動することによって、当該気泡より下側の部分が陰圧となり細孔を介して筒状部材の内部に培養液が流入することとなる。また、当該気泡より上側の部分では、圧力が高まり、筒状内部の培養液が細孔を介して外側に流出する。このように、本発明に係る細胞培養装置においては、筒状部材の内部と外部との間で細孔を介して培養液の流入及び流出が繰り返されることとなる。これにより、筒状部材の側面に対する細胞等の付着を防止することができる。
【００２０】
また、本発明に係る細胞培養装置は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給するように、上記散気手段を制御する制御装置を更に備えることが好ましい。
【００２１】
さらに、本発明に係る細胞培養装置においては、培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することができる。
【００２２】
さらにまた、本発明に係る細胞培養装置において、上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることが好ましく、上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることがより好ましい。
【００２３】
さらにまた、本発明に係る細胞培養装置において、上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましく、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することが好ましい。
【００２４】
なお、本発明に係る細胞培養装置は、上記培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したもとすることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、筒状部材の内部を分割する気泡を当該筒状部材内部に通過させることで、筒状部材の側面に対する細胞やマイクロキャリア等の付着を防止することができ、より効率的に細胞を培養することができる。したがって、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置によれば、細胞自体或いは細胞が産生する物質を製造する際の生産性を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明を適用した細胞培養装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明の酸素供給方法の作用メカニズムを説明する概要図である。
【図３】本発明を適用した細胞培養装置における酸素供給能力を示す特性図である。
【図４】本発明を適用した細胞培養装置における培養特性を示す特性図である。
【図５】本発明を適用した細胞培養装置の他の例を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置について、図面を用いて詳細に説明する。
【００２８】
本発明において、培養対象の細胞としては、特に限定されず、例えば医薬品等の主原料となる物質を生産する細胞の培養に適用することができる。生産対象の物質としては、培養した細胞自体、細胞が産生する抗体や酵素等のタンパク質、低分子化合物若しくは高分子化合物等の生理活性物質及びウイルスを挙げることができる。また、培養対象の細胞としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、真菌及び藻類等を挙げることができる。特に、抗体や酵素等のタンパク質、ウイルスを生産する動物細胞を培養対象とすることが好ましい。また、培養対象の細胞は、表面及び/又は内部に細胞が付着して増殖することが可能な培養面を有するマイクロキャリアを使用して培養するものであっても良い。マイクロキャリアを用いた培養は、特に、付着依存性を有する動物培養に適用することが好ましい。
【００２９】
本発明を適用した細胞培養装置の一例を図１に示す。細胞培養装置は、培養液を張り込むことができる培養槽１と、側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材２とを備えている。筒状部材２は、培養槽１の内部に配設されている。筒状部材２は、培養槽１の内部において、その長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、封止されている上記他方端部が下方になるように配設されている。ここで、筒状部材２は、その長手方向が鉛直下方向に対して厳密に平行な方向となるように配設しても良い。また、詳細を後述するように、筒状部材２の内部に供給した気泡が上昇することが可能であれば、筒状部材２は、その長手方向が鉛直下方向に対してやや傾斜するように配設しても良い。上述した「鉛直下方向と略平行」とは、このように、筒状部材２の長手方向が鉛直下方向に対してやや傾斜した形態を包含する意味である。
【００３０】
また、細胞培養装置は、培養槽１内の培養液に含まれる溶存酸素を測定するためのセンサー３と、センサー３からのシグナルを入力し溶存酸素濃度を算出する溶存酸素濃度計測手段４とを備えていても良い。センサー３は、培養槽１の底部近傍（例えば、底部から50ｍｍの位置）に配置されていることが望ましい。
【００３１】
さらに、細胞培養装置は、溶存酸素濃度計測手段４で測定した溶存酸素濃度値を入力する第１の制御装置５、第２の制御装置６及び第３の制御装置７と、第１の制御装置５により動作制御されるガス分圧調節装置８と、第２の制御装置６により動作制御される撹拌機駆動モータ９と、第３の制御装置７により動作制御される通気ガス調節装置１０と、撹拌機駆動モータ９に接続された撹拌軸１１、撹拌翼１２ａ及び１２ｂとを備えていてもよい。なお、この場合、細胞培養装置は、図示しないが、ガス分圧調節装置８及び通気ガス調節装置１０に接続され、これらガス分圧調節装置８及び通気ガス調節装置１０に酸素含有ガス（通気ガス）を供給するガス供給装置を備えている。なお、撹拌翼１２ａ及び１２ｂとしては、例えば回転直径100ｍｍのパドル形のものを使用することができる。
【００３２】
さらにまた、細胞培養装置は、通気ガス調節装置１０が筒状部材２の封止された他方端部に接続されている。通気ガス調節装置１０は、酸素含有ガス（通気ガス）を排出するノズル（図示せず）を有している。このノズルは、封止された他方端部を介して筒状部材２の内部に臨んでいる。
【００３３】
特に、筒状部材２は、側面に細孔が形成されており、細孔を介して培養液が内部へ流入したり、内部の培養液が外部へ流出したりすることができる。ここで、細孔としては、培養液の流出入が可能であり、且つ、細胞又はマイクロキャリアの通過が阻止できる大きさ及び形状であればよい。例えば、培養対象の細胞をマイクロキャリアに担持させて培養する場合、筒状部材２の側面における細孔は50〜150μmの直径を有する貫通孔とすることが好ましい。
【００３４】
また、筒状部材２の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成されることが好ましい。可塑性を有する材質としては、例えばポリプロピレン等の樹脂を挙げることができる。このような樹脂を使用したメッシュシートを筒状に加工することで、筒状部材２の側面を形成することができる。また、筒状部材２は、メッシュシートを筒状に加工した後、一方の端部を封止部材２ｓによって封止することで作製することができる。例えば、ガラス製で直径240ｍｍ、培養液張り込み高さ230ｍｍ、培養容積10Lの培養槽１を使用してマイクロキャリアを使用した細胞培養を行う場合、100×100μｍの細孔を有するポリプロピレン製メッシュシートで構成された内径30ｍｍ、高さ250ｍｍの形状を有する筒状部材２を使用することができる。この筒状部材２を、その長手方向を鉛直下方向に対して略平行とし、且つ、封止された端部を培養槽１の底部近傍に位置するように、培養槽１に設置することで、筒状部材における開放された一方端部が培養液入り込み高さを超える位置となる。
【００３５】
また、筒状部材２の材質としては、ポリプロピレン樹脂のほかに、ステンレス材、四フッ化エチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂など、スチーム殺菌に耐え、酸及びアルカリ性の洗浄剤を用いた洗浄操作に安定で、細胞への毒性を示さない材料からなるメッシュシートを使用することができる。
【００３６】
以上のように構成された本発明に係る細胞培養装置を用いることで、上述した細胞を培養することができる。以下では、マイクロキャリアを使用して動物細胞を培養する形態について説明するが、本発明の技術的範囲はこの形態に限定されるものではない。
【００３７】
培養槽１内に張り込まれた培養液１３中には、微細粒子であるマイクロキャリア１４が浮遊している。マイクロキャリア１４には、付着依存性を有する細胞が増殖するための培養面が設けられている。細胞はマイクロキャリア１４に接触することにより培養面に付着し、増殖を開始する。マイクロキャリア１４は、培養液１３よりもわずかに比重が大きく、細胞が増殖するとさらに比重が大きくなる。このため、マイクロキャリア１４は、静置状態では培養槽１の底部に沈降する。細胞培養装置では、第２の制御装置６が撹拌機駆動モータ９の回転速度を制御して、撹拌翼１２ａ及び１２ｂを回転させて培養液１３を流動させることにより、マイクロキャリア１４を浮遊させている。特に、培養期間が長くなるほど、細胞の増殖によってマイクロキャリアを含む微粒子の比重が大きくなり、より沈降しやすくなる。この場合、撹拌回転数を増加させるように制御することで、マイクロキャリアを良好に培養液１３中に浮遊させることができる。
【００３８】
細胞培養装置を使用した細胞培養においては、培養液１３を所望の溶存酸素濃度となるように適宜、調節を行いながら培養を継続する。細胞培養装置においては、溶存酸素濃度計測手段４を備えており、センサー３及び溶存酸素濃度計測手段４で測定した溶存酸素濃度値を基に、撹拌機の回転数を増減する方法、気相部の酸素濃度を増減する方法、及び筒状部材２へ酸素含有ガスを吹き込む方法のいずれか又はこれらの３つの方法を併用することによって、培養液１３中の溶存酸素濃度を制御することができる。
【００３９】
撹拌機の回転数を増減する方法は、溶存酸素濃度計測手段４で測定した培養液１３中の溶存酸素濃度値に基づいて、上述したように、第２の制御装置６が撹拌機駆動モータ９の回転速度を制御する方法である。撹拌回転数が増加すると混合が強化され、酸素溶解量が増加する。
【００４０】
また、気相部の酸素濃度を増減する方法は、第１の制御装置５がガス分圧調節装置８を制御し、培養液１３上方の気相部に対する酸素含有ガス（通気ガス）の供給量を調整する方法である。また、第１の制御装置５及びガス分圧調節装置８により、培養液１３のｐＨの変化に対応して炭酸ガス分圧の増減を行うようにしてもよい。なお、第１の制御装置５及びガス分圧調節装置８による溶存酸素濃度のコントロールは、細胞播種後の低細胞密度の時期に主に使用することが好ましい。
【００４１】
さらに、筒状部材２へ酸素含有ガスを吹き込む方法は、筒状部材２、第３の制御装置７及び通気ガス調節装置１０により、培養液１３の溶存酸素濃度を調整する方法である。具体的には、図２に模式的に示すように、封止部材２ｓに設けられたノズルより通気ガスが筒状部材２の内部に供給されると気泡２ｂが形成され、気泡２ｂより培養液１３へ酸素が供給される。このとき、気泡２ｂは、筒状部材２の内部に張り込んだ培養液１３を上下に分割することとなる。また、気泡２ｂは液面に向かって上昇する。気泡２ｂは、いわばプラグとして機能することとなる。気泡２ｂが筒状部材２内部を上昇するとき、筒状部材２に細孔が無いと仮定すると、内部では気泡２ｂが入ることによって見かけの培養液１３の比重が減少して液面が上昇し、ΔPに相当する負の圧力差が生じる。このときの筒状部材２内部の圧力は外部に比べて、気泡２ｂより下では−ΔP、気泡２ｂより上ではΔPとなる。細孔を有する筒状部材２においても同様な関係が生じるため、気泡２ｂより下では培養液１３が内部に流入し、気泡２ｂより上では内部の培養液１３が外部に流出する。また、筒状部材２の側面において、気泡２ｂの上昇に伴って、培養液１３が流入する部分と流出する部分が変化する。
【００４２】
これによって、筒状部材２の細孔部分に付着したマイクロキャリア等を剥離することができる。以上のように、本発明に係る細胞培養装置において、筒状部材２の内部を上下方向に分割するような気泡２ｂを筒状部材２に通過させることによって、筒状部材２の側面に対して細胞やマイクロキャリア等が付着することを防止できる。このため、筒状部材２内部において、培養槽１に張り込まれた培養液１３の溶存酸素濃度を所期の値に制御することが可能となる。
【００４３】
特に、上述したように筒状部材２内部に対して培養液を流出入させるには、気泡２ｂを介して上記圧力差を形成することが必要であるため通気ガスは間歇的に供給される。なお、1回あたりの通気時間は０．５〜１．５ｓの短時間とすることで、上述したようにプラグ状の気泡２ｂを形成することができる。また、１回あたりの通気ガス吹き込み量Ｖ(ｍｌ)は下記の式１によって決定される。なお、式１は筒状部材２が円筒状である場合に適用される。
【００４４】
〔式１〕 Ｖ＝β・Ｄ３・π／４
ここで、β：通気計数（−）
Ｄ：円筒直径（ｃｍ）
【００４５】
通気計数βの値は、筒状部材２の長さによって経験的に決定されるもので、長さ０．２ｍ〜１．５ｍの範囲では１〜５となる。
【００４６】
そして、筒状部材２内部を通過した気泡２ｂは、筒状部材２における開放された一方端部付近で破裂し、消泡する。このとき、筒状部材２における一方端部は、培養液１３の液面より外方に露出しているため、気泡２ｂは筒状部材２の内部で破裂することとなる。このため、気泡２ｂの破裂に伴う衝撃により、培養液１３に浮遊する細胞やマイクロキャリアが損傷されることを防止できる。
【００４７】
また、筒状部材２内部に通気ガスを吹き込むタイミングとしては、前回の吹き込みで生じた気泡２ｂが液面上に達した後とすることが好ましい。若しくは、筒状部材２内部に通気ガスを吹き込むタイミングとしては、前回の吹き込みで生じた気泡２ｂが液面付近で消泡した後とすることが好ましい。筒状部材２の内部において、上下方向に複数の気泡２ｂを生じさせた場合、気泡と気泡の間に上述したような圧力差が形成されず、培養液１３の流出入が達成できないからである。
【００４８】
さらに、細胞培養装置において筒状部材２を可撓性の材質で構成した場合には、気泡２ｂの移動によって筒状部材２の側面に揺動と伸縮する動きが生じ、これらの動きがマイクロキャリア等を剥離させる作用として働く。このため、筒状部材２を可撓性の材質で構成した場合には、筒状部材２の側面に対するマイクロキャリア等の付着をより効果的に除去することができる。
【００４９】
また、図１や図２に示すように、単一の気泡２ｂが筒状部材２内部をプラグフロー状態で上昇することがもっとも好ましい。筒状部材２の内径を大きくすることによって単一気泡によるプラグフローを実現し得ない場合は、前記の式１にて決定した容積のガスを１〜１．５秒の短時間に供給することで得られる気泡群によって筒状部材２の内部を分割しても良い。
【００５０】
図１及び２に示した細胞培養装置を用いて実際に計測した酸素溶解経過を図３に示す。図１に示す培養槽１に、マイクロキャリア（サイトデックス１、GEヘルスケア製）を乾燥重量で5％の濃度になるよう分散させた生理的リン酸緩衝液2Ｌを張り込み、30rpmで撹拌しながら37℃に加温した。ついで、生理的リン酸緩衝液中に窒素を注入して溶存酸素濃度がほぼ0％まで低下させた。つぎに筒状部材２内に10秒間隔で25ml/回の空気を1秒間で注入して溶存酸素濃度の変化を計測した。計測結果を図３中にＡで示す。比較として、図３中Ｂは筒状部材２から円筒部分を取り外して封止部材２ｓから空気を150ml/分で直接通気した場合の溶存酸素濃度の変化をしめす。また、図中Ｃは筒状部材２内に空気を１５０ｍｌ／分で連続して通気した場合の溶存酸素濃度の変化を示す。図３中のＡに示すように、筒状部材２を使用した場合、直接液中に通気したＢに比較して酸素溶解速度が劣ることは否めないが、気泡が培養細胞と接触しない状況下で酸素供給を行うことができることを示す。また筒状部材２を使用した場合においても、連続的に通気したＣに比べると、気泡２ｂを形成するように供給したＡのほうがより大きな酸素供給速度が得られることがわかる。この結果から、気泡２ｂを筒状部材２の内部に形成することによって、細孔の目詰まりが少なくなっていることが理解できる。
【００５１】
また、図１に示した細胞培養装置を用いて実際に動物細胞の培養を行った結果を図４に示す。図４に結果を示す実験例において、動物細胞としてはCHO-K1細胞を使用した。また、培地としては、CD-CHO培地（インビトロジェン製）を使用した。マイクロキャリアとしては、サイトデックス１（GEヘルスケア製）を乾燥重量で５％の比率で培地に加えた。培養中の酸素の通気は、溶存酸素濃度が制御値を下回ったときに筒状部材２中に酸素を断続的に通気した。通気は25ml/回の酸素を1秒間で噴出させるもので、これを10秒間隔で行った。培養を開始するに当たっては、あらかじめ別容器にて調製したCHO-K1細胞をトリプシン処理で剥離させ、細胞密度が2×10-5（個/ml）となるように播種して培養を開始した。なお、溶存酸素濃度計測手段４による溶存酸素濃度の制御値は3.0mg/Lに設定した。また、本培養装置の場合、撹拌回転数が20rpm以下ではマイクロキャリアの一部が培養槽底に沈積するため、培養開始持の回転数を30rpmとした。培養期間中、１日に１回の頻度で培養液を採取し、マイクロキャリア上で増殖した細胞量を計測した。なお、培養液採取の際は、マイクロキャリアが均一に培養液中に分散するよう、手動にて回転数を50rpmに増加させた。マイクロキャリア上の細胞の計測はトリプシン処理によって細胞を剥離させて計測した。結果、図４にＡで示すように最高細胞到達密度は、培養６日目の6.6×106（個/ml）であった。培養６日目のマイクロキャリアを光学顕微鏡で観察すると、その表面の全面が細胞によって覆われたいわゆるコンフルエントの状態であり、マイクロキャリアの損傷もほとんど認められなかった。
【００５２】
比較として、筒状部材２の筒状部を取り外した封止部材２ｓから空気を直接通気した場合の培養結果を図４中のＢで示した。なお、通気は溶存酸素濃度が制御値を下回ったときに150ml/分で行った。実験装置としては前記の実験と同じ装置を使用し、培養手法も上記のとおりである。この場合、撹拌速度は全期間を通じて25rpmとした。最高細胞到達密度は、培養７日目の5.8×106（個/ml）であった。培養７日目のマイクロキャリアの表面には細胞の増殖していない部分が残されていた。
【００５３】
図４に示した結果から、筒状部材２の内部に対して気泡２ｂを生じさせることで、筒状部材２の側面に対するマイクロキャリア等の付着を防止することができ、より効率的に細胞培養を行えることが明らかとなった。
【００５４】
ところで、細胞培養装置は、図１に示したような構成に限定されず、例えば図５に示すように、複数の筒状部材２を培養槽１内に設置したような構成であってもよい。なお、図５に示した細胞培養装置は、追加供給用の培地１６を収容する培地槽１５と、使用済みの培養液１８を収容する廃液槽１７とを備え、培養中に培地の交換を実施できるタイプの培養装置である。培地槽１５は移送管路２１、廃液槽１７は移送管路２２によって培養槽１と連通している。移送管路２１には弁３１，移送管路２２には弁３２が設置されている。なお、図５中には図示していないが、図５に示す細胞培養装置は、空気、酸素、窒素及び炭酸ガス等のガス供給設備、温水冷水供給設備、蒸気供給設備、給排水設備及び各種の計測手段を具備している。
【００５５】
また、図５示す細胞培養装置は培養槽１内に４基の筒状部材２を備えている。これら４基の筒状部材２に対する通気ガスの供給は、それぞれ独立して制御しても良い、全て同時となるように制御しても良い。
【００５６】
さらに、細胞培養装置は、培養槽１の内圧を測定する圧力計２５を備え、圧力計２５による計測結果をもとに、圧力調整弁２６によって一定の圧力に保持することができる。通常、外部からの細菌等の侵入を防ぐため、培養槽１内部を0.01〜0.05MPaに加圧している。
なお、使用されるガス類はあらかじめ細菌等の微粒子を除去したものを使用する。
【００５７】
図５に示した細胞培養装置においても、図１に示した細胞培養装置と同様に、筒状部材２内部を上下方向に分割する気泡として通気ガスを供給することで、筒状部材２の側面に対する細胞やマイクロキャリア等の付着を防止して細胞培養、培地交換等の作業を行うことができる。また、細胞培養装置によれば、筒状部材２に形成された気泡が培養細胞と非接触の状態となる。このため、培養細胞が高濃度の酸素と接触することを防止するとともに、気泡の破裂の衝撃による損傷を防止することができる。したがって、培養細胞が直接高濃度の酸素ガスと接触することによる増殖阻害、気泡に同伴されたマイクロキャリアに付着した細胞が泡沫槽内に長時間閉じ込められることによる増殖阻害、及び気泡の破裂の衝撃による損傷などを原因とする培養への悪影響を防止でき、マイクロキャリアでの培養を良好に実施できる。
【符号の説明】
【００５８】
１…培養槽、２…筒状部材、４…溶存酸素濃度計測手段、５…第１の制御装置、６…第２の制御装置、７…第３の制御装置、１３…培養液、１４・・・マイクロキャリア
【特許請求の範囲】
【請求項１】
側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、
上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、
上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える細胞培養装置を使用し、上記培養槽内に対して、上記筒状部材の一方端部が液外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ、細胞を培養する方法であって、
上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として上記散気手段から供給することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
上記散気手段は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成され、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
上記培養装置は、培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものであることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、
上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、
上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備え、
上記散気手段は、上記筒状部材の内部に培養液が張り込まれた状態において、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給するものであることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給するように、上記散気手段を制御する制御装置を更に備えることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成され、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
上記培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものであることを特徴とする請求項８記載の細胞の細胞培養装置。
【請求項１】
側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、
上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、
上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備える細胞培養装置を使用し、上記培養槽内に対して、上記筒状部材の一方端部が液外方へ露出するように細胞を培養するための培地が張り込められ、細胞を培養する方法であって、
上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として上記散気手段から供給することを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
上記散気手段は、上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成され、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
上記培養装置は、培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものであることを特徴とする請求項１記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
側面に細孔を有し、長手方向の一方端部が開放されるとともに他方端部が封止された筒状部材と、
上記他方端部側から上記筒状部材の内部に酸素含有ガスを供給する散気手段と、
上記筒状部材の長手方向が鉛直下方向と略平行かつ、上記他方端部が下方になるように配設した培養槽とを備え、
上記散気手段は、上記筒状部材の内部に培養液が張り込まれた状態において、上記酸素含有ガスを、上記筒状部材の内部を上下方向に分割する気泡として供給するものであることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
上記気泡が上記筒状部材の内部を通って上記一方端部側で消泡したタイミングで次の気泡を供給するように、上記散気手段を制御する制御装置を更に備えることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
培養対象の細胞が付着依存性を有する生体細胞であって、当該生体細胞の足場となる培養面を有するマイクロキャリアとともに当該生体細胞を培養することを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
上記筒状部材の側面における細孔は、培養対象の細胞又は当該細胞の足場となるマイクロキャリアよりも小径であることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
上記筒状部材の側面における細孔は、50〜150μmの直径を有する貫通孔であることを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
上記筒状部材の少なくとも側面は可撓性を有する材質から形成され、上記気泡の通過に伴って当該側面が変形することを特徴とする請求項８記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
上記培養槽内に複数の上記筒状部材を配設したものであることを特徴とする請求項８記載の細胞の細胞培養装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１７７０４６（Ｐ２０１１−１７７０４６Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４２０７６（Ｐ２０１０−４２０７６）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
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