細胞増殖抑制剤
【課題】細胞増殖抑制作用をもつ遺伝子を見出し、新たながんの治療の手段を提供する。
【解決手段】Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディンクフレームを形成するポリペプチドを含む細胞増殖抑制剤、およびがん治療のための遺伝子治療用組成物。Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制またはがん治療剤をスクリーニングする方法。
【解決手段】Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディンクフレームを形成するポリペプチドを含む細胞増殖抑制剤、およびがん治療のための遺伝子治療用組成物。Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制またはがん治療剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子を含む細胞増殖抑制剤、およびがん治療のための遺伝子治療用組成物、細胞増殖抑制に関与するタンパク質、並びに細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの発生や進行には種々の遺伝子が関与しており、がん遺伝子の活性化やがん抑制遺伝子の不活性化の蓄積により細胞の腫瘍化、がん化へつながると考えられている。がん抑制遺伝子としてはこれまで、ｐ５３、ＲＢ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＷＴ１、ＭＥＮ１、ＢＲＣＡ１などが見出されている。このようながん抑制遺伝子は、がんの診断、治療などに有用であり、具体的にはｐ５３によるがんの遺伝子治療も試みられている。従って、新たながん抑制遺伝子の発見ががんの診断や治療への有効な手段を提供する可能性がある。がん抑制遺伝子の遺伝子産物には、細胞周期、シグナル伝達、転写、細胞接着、突然変異修復などにかかわるタンパク質が知られており、これらの遺伝子の不活性化や異常により細胞増殖を抑制できなくなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、細胞増殖の抑制に関与する遺伝子を新たに見出し、これを利用して新規ながんの診断や治療の手段の開発を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用を調べる過程において、細胞増殖抑制に関連する遺伝子を見出し、これが、従来インフルエンザ耐性を付与する遺伝子として知られていたＭｘ１遺伝子であることを確認した。この遺伝子が細胞増殖抑制の機能を有することは全く予想されておらず、本発明者により初めて明らかにされた知見である。本発明によれば、この遺伝子の細胞増殖抑制機能を利用して細胞増殖抑制剤およびがん治療のための遺伝子治療用組成物を提供することができる。また、被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングして、細胞増殖抑制剤やがん治療剤の開発を行うことができる。
【０００５】
さらに、本発明者は、マウスのＭｘ１遺伝子において特定の部分に欠損があり、インフルエンザ耐性の機能を消失した遺伝子においても、細胞増殖調節に対する機能が失われていないことも見出した。従って、この欠損部分を有するＭｘ１遺伝子がコードするタンパク質の検討によって細胞増殖調節の機構を解明する手段を提供することができる。
【０００６】
即ち、本発明は、(1) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤、(2) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む、がん治療のための遺伝子治療用組成物、(3) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを、細胞増殖抑制剤の製造に使用する方法、(4) 被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法、(5) 配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞増殖の抑制に関与する遺伝子を新たに提供することができる。この遺伝子の細胞増殖調節の機構を利用して、新規ながんの診断や治療の手段の開発が可能になる。また、この遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤やがん治療薬の開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（Ａ）Ｍｘ１遺伝子の細胞増殖抑制作用
Ｍｘ１遺伝子の細胞増殖抑制作用は以下のようにして確認された。
(1) 性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用
まず、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用について、下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞（ゴナドトロフ）の株化細胞であるＬβＴ２細胞を用いて検討した。ＬβＴ２細胞は、がん抑制遺伝子であるｐ５３を抑制するＳＶ４０のＴ抗原を過剰発現するようにしたトランスジェニックマウスの下垂体から樹立された細胞であり、がん化した細胞である。
【０００９】
性腺刺激ホルモン放出ホルモンは、視床下部から分泌されるアミノ酸１０個からなるペプチドホルモンであり、生殖を調節する神経ホルモンとして知られる。このホルモンの細胞増殖に対する抑制作用は、前立腺腫瘍、卵巣がん、子宮内膜症などの細胞で示されており、前立腺腫瘍の治療において実際に使用されている。但し、その機構としては、ＧｎＲＨの過剰量が性腺刺激ホルモン、ひいては男性ホルモンの分泌を抑制することにより前立腺腫瘍の進行を止めていると解されている。
【００１０】
これに対し、本発明者はＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）が用量依存的にＬβＴ２細胞数を減少させることを確かめ、ＧｎＲＨが直接細胞増殖を抑制していることを見出した。さらにＧｎＲＨの標準的拮抗阻害薬（セトロレリックスおよびアンタイド）もＬβＴ２細胞数を減少させることが判明し、ＧｎＲＨａと拮抗薬が同じ細胞内の機序を動かすことによって細胞増殖を抑制していることを示した。(2) ＧｎＲＨａの投与およびＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の投与により共通して変動する遺伝子
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａの投与により変動する遺伝子と、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の投与により変動する遺伝子を網羅的に調べ、共通して変動した２７個の遺伝子を見出した。この中に増殖関連遺伝子があると考えられ、特に変動幅の大きい２つの遺伝子に注目した。これらはアデニルシクラーゼ２およびチトクロームｐ４５０ ２ｃ３７というリポキシゲナーゼ活性をもつ酵素の遺伝子である。これらの酵素の産物、ｃＡＭＰと１２ＨＥＴＥの細胞増殖に対する影響を調べると、ｃＡＭＰについてはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗した。さらにｃＡＭＰは、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の細胞増殖抑制作用にも完全に拮抗した。従って、ＧｎＲＨａも拮抗薬も共にｃＡＭＰ産生を抑えることにより細胞増殖を抑制することが明らかとなった。
【００１１】
ｃＡＭＰはリン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化することが知られているので、細胞増殖が抑制されるときにはＰＫＡ活性の抑制が起こっている可能性がある。そこで、ＰＫＡ活性の抑制剤であるＨ８９を用いて細胞増殖に対する効果を調べた。その結果、アデニルシクラーゼ２の抑制に引き続いてＰＫＡ活性が抑制されることがシグナルとなって細胞増殖を抑制していることが判明した。
(3) ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子を調べた結果、４つの遺伝子（遺伝子Ａ〜Ｄ）が見出された。
【００１２】
リアルタイムＰＣＲ法により、ＧｎＲＨａ投与後の４つの遺伝子の経時的変化を調べると、いずれの遺伝子もＧｎＲＨａ投与後かなり早期に一過性に発現が増加していることが明らかになった。
(4) ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響
各遺伝子の働きをＲＮＡ干渉法により抑制した。具体的には、各遺伝子の働きを抑制するｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入後、ＧｎＲＨａを投与した。その結果、遺伝子Ａを抑制した場合にのみ細胞増殖抑制効果が観察されなくなった。これは、遺伝子Ａが細胞増殖抑制に関与していることを示す。
【００１３】
遺伝子Ａは、後述するように、インフルエンザウイルス抵抗性遺伝子として知られているＭｘ１と称される遺伝子である。
さらに、Ｈ８９によってＰＫＡを抑制すると、Ｍｘ１遺伝子の発現が促進されることを確認した。また、ＧｎＲＨａによるＭｘ１発現の増加に他の遺伝子産物が必要かどうかを調べた。その結果、Ｍｘ１はＧｎＲＨによって他のタンパク質合成なしに誘導される遺伝子（イミディエート・アーリー）であることが判明した。また、ＧｎＲＨａ投与５分後のＭｘ１遺伝子の発現率を調べ、Ｍｘ１遺伝子が早期に変動することを確認した。
(5) 遺伝子Ａ
遺伝子Ａは、インフルエンザ耐性を付与するとして知られているＭｘ１と称される遺伝子である。また、インターフェロンにより誘導されることが知られている。この遺伝子が細胞増殖抑制作用を有することは本発明において初めて明らかになった。従って、この遺伝子を細胞増殖抑制剤やがん治療剤として利用することが可能になった。
【００１４】
ヒトＭｘ１のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示される（ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＭ＿００２４６２）。
また、本発明で用いるマウスＭｘ１のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ２１０３９）に示す通りである。一般の実験動物として使用されているマウスのほとんどは、Ｍｘ１遺伝子に欠損があり、本発明において使用したマウス由来細胞でもＭｘ１遺伝子に欠損があり、ＮＭ＿０１０８４６として登録されているマウスＭｘ１遺伝子の塩基配列のうち１１２１〜１５４４位が欠損したものである。このような欠損遺伝子をもった実験動物のマウスではインフルエンザを感染させると死亡する、即ち欠損Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性を失なっている。しかし、インフルエンザ耐性に対しては機能を失っているこの欠損Ｍｘ１遺伝子も、細胞増殖調節に対する機能は失っていないことが本発明において明らかになった。
【００１５】
このように、Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性以外の機能、即ち細胞増殖抑制の機能を有し、それはインフルエンザ耐性を失ったマウスの欠損Ｍｘ１遺伝子でも保持されている。
【００１６】
マウスの欠損Ｍｘ１遺伝子により発現されるタンパク質は、市販のヒトＭｘ１蛋白質のＮ末端側配列に特異的なポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット法により確認された。
（Ｂ）細胞増殖抑制剤、がん治療のための遺伝子治療用組成物
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチド、例えば配列番号１で示される塩基配列のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドは、その細胞増殖抑制機能により細胞増殖抑制剤またはがん治療のための遺伝子治療用組成物として使用できる。例えば、このポリヌクレオチドを適宜発現ベクターに組み込み、遺伝子治療用組成物を調製し、このポリヌクレオチドがコードするＭｘ１タンパク質を標的細胞内で発現させるように、対象患者に投与する。投与方法としては、患者から取り出した細胞に目的の遺伝子を導入し、それを患者の体内に戻すex vivo 遺伝子治療や、患者に遺伝子を直接投与するin vivo 遺伝子治療が使用できる。ベクターとしてはアデノウイルスベクターが好ましく使用できる。
（Ｃ）スクリーニング方法
被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現率を調べることによりＭｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することができ、これを細胞増殖抑制剤やがん治療剤のスクリーニングに利用できる。
【００１７】
以下の実施例において本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００１８】
細胞増殖抑制作用をもつ遺伝子の同定
(1) 性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用の検討
継代維持しているＬβＴ２細胞を用いて、ＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）の影響を調べた。ＧｎＲＨ作動薬を用量を変えて（０〜１０-7Ｍ）細胞培養液に加え、２４時間培養した。２４時間ＧｎＲＨａを投与し続けた場合を図１ａに、最初の３０分投与し、その後２３時間３０分培養を続けた場合を図１ｂに示す。細胞数は、実験終了後に細胞を酵素で分離し、顕微鏡下で細胞を数えることにより計測した。ＧｎＲＨａは用量依存的に２４時間後の細胞数を減少させた（２４時間で観察されるべき増殖を抑制した）。
(2) ＧｎＲＨ拮抗阻害薬の細胞増殖抑制作用
上記(1) で観察されたＧｎＲＨａの効果がＧｎＲＨ受容体を介していることを確認するために、標準的に用いられるＧｎＲＨ拮抗阻害薬であるセトロレリックスおよびアンタイドを用いて、ＬβＴ２細胞での細胞増殖抑制効果を調べた。意外にもＧｎＲＨａとの併用の場合、ＧｎＲＨａに拮抗しないばかりか、拮抗薬単独でも細胞数の減少が見られた。結果を図２に示す。図２ａは９６時間試薬を入れ続けた場合、図２ｂは最初の３０分のみ作用させて９６時間後の細胞数を計測した場合である。
【００１９】
この結果より、細胞増殖に関しては拮抗阻害薬が作動薬として働くことが明らかである。
さらに、拮抗阻害薬の効果を経時的に観察した結果を図３に示す。ＬβＴ２細胞培養液に試薬を９６時間添加し続けた場合の細胞数の経時的変化を図３ａに、最初の３０分のみ試薬を作用させた場合の経時的変化を図３ｂに示す。拮抗薬（セトロレリックス）はＧｎＲＨａと同様に細胞増殖を抑制することが判明した。上記の実験と同様、最初の３０分で効果が決まることが再確認され、また、一度増えた細胞が減るのではなく、増殖が抑えられていることも分かる。
【００２０】
以上の結果は、ＧｎＲＨａと拮抗薬が、同じ細胞内の機序を動かすことにより細胞増殖を抑制していることを示す。
(3) ＧｎＲＨａおよび拮抗薬（セトロレリックス）の投与により共通して変動する遺伝子の検討
ＤＮＡマイクロアレイ法解析により、ＧｎＲＨａ投与によって変動する遺伝子と、拮抗薬（セトロレリックス）の投与によって変動する遺伝子を調べ、共通して変動した２７個の遺伝子を見出した（図４）。その中で特に変動幅の大きい遺伝子は、アデニルシクラーゼ２およびチトクロームｐ４５０ ２ｃ３７というリポキシゲナーゼ活性をもつ酵素の遺伝子である。これらの酵素の産物、ｃＡＭＰと１２ＨＥＴＥについてＬβＴ２細胞を用いて増殖に対する影響を調べた結果、１２ＨＥＴＥではＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に拮抗しなかった。ｃＡＭＰについてはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗した（図５）。図５ａは、試薬を９６時間添加し続けた場合の細胞数の経時的変化を、図５ｂは、最初の３０分のみ試薬を作用させた場合の経時的変化を示す。ｃＡＭＰはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）として投与した。結果より、ｄｂｃＡＭＰはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗することが分かる。
【００２１】
また、ｃＡＭＰは、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の細胞増殖抑制作用にも完全に拮抗した（図６）。従って、ＧｎＲＨａも拮抗薬も共にｃＡＭＰ産生を抑えることにより細胞増殖を抑制することが明らかとなった。
【００２２】
ｃＡＭＰはリン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化することが知られているので、細胞増殖が抑制されるときにはＰＫＡ活性の抑制が起こっている可能性がある。そこで、ＰＫＡ活性の抑制剤であるＨ８９を用いて細胞増殖に対する効果を確認した。図７にＰＫＡ抑制薬のＨ８９の細胞増殖抑制効果を示す。用量反応的に細胞数を減少させた。即ち、アデニルシクラーゼ２の抑制に引き続いてＰＫＡ活性が抑制されることがシグナルとなって細胞増殖を抑制していることが判明した。
(3) ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子の検討
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子を調べた。投与３時間後にＲＮＡを回収してＤＮＡマイクロアレイにより変動する遺伝子を調べるという方法によった。Ｈ８９の投与による遺伝子発現を調べ、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）で変動した遺伝子と比較した結果、４つの遺伝子（遺伝子Ａ〜Ｄ）が見出された。
【００２３】
ＤＮＡマイクロアレイでは３時間目のサンプルのみであったので、リアルタイムＰＣＲ法により、ＧｎＲＨａ投与後の遺伝子Ａ〜Ｄの経時的変化を調べた。その結果、いずれの遺伝子もＧｎＲＨａ投与後かなり早期に一過性に発現が増加していることが明らかになった（図８）。
(4) ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響
各遺伝子の働きをＲＮＡ干渉法により抑制した。具体的には、各遺伝子の働きを抑制するｓｉＲＮＡ分子をＬβＴ２細胞内に導入後、ＧｎＲＨａを投与した。その結果、遺伝子Ａを抑制した場合にのみ細胞増殖抑制効果が観察されなくなった（図９）。これは、遺伝子Ａが細胞増殖抑制に関与していることを示す。
【００２４】
遺伝子Ａは、インフルエンザウイルス抵抗性遺伝子として知られているＭｘ１遺伝子である。本発明で用いたマウスＭｘ１の塩基配列は配列番号２（ＮＣＢＩデータベース、Ｍ２１０３９）に示す通りであるが、一般の実験動物として使用されているマウスのほとんどは、Ｍｘ１遺伝子の１１２１〜１５４４位に欠損があり、本発明において使用したマウス由来細胞でもＭｘ１遺伝子に同様の欠損があることを確認した。このような欠損遺伝子をもった実験動物のマウスではインフルエンザを感染させると死亡する、即ち欠損Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性に対する機能を失なっている。しかし、このインフルエンザ耐性に対しては機能を失っているＭｘ１遺伝子も、細胞増殖調節に対する機能は失っていないことが明らかである。
【００２５】
さらに、ＰＫＡ抑制剤（Ｈ８９）によってＰＫＡを抑制すると、Ｍｘ１遺伝子の発現が促進されることを確認した（図１０）。これは、Ｍｘ１遺伝子に特異的なリアルタイムＰＣＲ法を確立してｍＲＮＡの発現率を定量することにより行った。即ち、Ｈ８９を加えた細胞のＲＮＡを回収して、Ｍｘ１遺伝子の転写活性をリアルタイムＰＣＲ法で測定することにより確認した。
【００２６】
また、ＧｎＲＨａによるＭｘ１発現の増加に他の遺伝子産物が必要かどうかを調べるために、培養細胞にシクロヘキシミド（蛋白質合成阻害薬）を作用させながらＧｎＲＨａを添加した。他の遺伝子はＧｎＲＨａに反応しなくなったが、Ｍｘ１遺伝子のみはＧｎＲＨａによって転写活性が増加した。従って、Ｍｘ１はＧｎＲＨによって他のタンパク質合成なしに誘導される遺伝子（イミディエート・アーリー）であることが判明した（図１１）。
【００２７】
ＧｎＲＨａのＬβＴ２細胞増殖抑制に対する百日咳毒素（ＰＴＸ）併用投与の影響を調べることにより、ＧｎＲＨがＧｎＲＨ受容体からＧαｉを介することを確認した。
また、ＧｎＲＨａ投与５分後のＭｘ１遺伝子の発現率を調べ、Ｍｘ１遺伝子が早期に変動することを確認した。
【００２８】
以上の結果から、図１２に示すようにＧｎＲＨはＧｎＲＨ受容体に結合し、Ｇαｉを介してアデニルレートシクラーゼが抑制され、次いでＰＫＡが抑制されると、Ｍｘ１合成が促進され、これによって細胞増殖が抑制されると考えられる。このように、Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性以外に、細胞増殖抑制の機能を有し、それはインフルエンザ耐性を失ったマウスの欠損Ｍｘ１遺伝子でも保持されている。
【００２９】
マウスの欠損Ｍｘ１遺伝子により発現されるタンパク質は、ヒトＭｘ１蛋白質のＮ末端側配列に特異的なポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、Ｓｃ−３４１２８）を用いて、ウエスタンブロット法により確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＬβＴ２細胞数に与えるＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）の影響を示す図である。
【図２】ＧｎＲＨａと拮抗薬併用投与の効果を示す図である。
【図３】ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬の細胞増殖抑制作用を示す図である。
【図４】ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果の概要を示す図である。
【図５】ＧｎＲＨａの作用に対するｄｂｃＡＭＰの拮抗作用を示す図である。
【図６】セトロリックスの作用に対するｄｂｃＡＭＰの拮抗作用を示す図である。
【図７】ＰＫＡ抑制薬（Ｈ８９）の増殖抑制作用を示す図である。
【図８】ＧｎＲＨａ投与後の遺伝子Ａ〜Ｄの経時的変化を示す図である。
【図９】ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響を示す図である。
【図１０】ＰＫＡの抑制が遺伝子Ａの発現を促進することを示す図である。
【図１１】ＧｎＲＨａの遺伝子Ａ〜Ｄの発現促進効果へのシクロヘキシミドの影響を示す図である。
【図１２】ＧｎＲＨによるシグナル伝達を示す模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子を含む細胞増殖抑制剤、およびがん治療のための遺伝子治療用組成物、細胞増殖抑制に関与するタンパク質、並びに細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの発生や進行には種々の遺伝子が関与しており、がん遺伝子の活性化やがん抑制遺伝子の不活性化の蓄積により細胞の腫瘍化、がん化へつながると考えられている。がん抑制遺伝子としてはこれまで、ｐ５３、ＲＢ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＷＴ１、ＭＥＮ１、ＢＲＣＡ１などが見出されている。このようながん抑制遺伝子は、がんの診断、治療などに有用であり、具体的にはｐ５３によるがんの遺伝子治療も試みられている。従って、新たながん抑制遺伝子の発見ががんの診断や治療への有効な手段を提供する可能性がある。がん抑制遺伝子の遺伝子産物には、細胞周期、シグナル伝達、転写、細胞接着、突然変異修復などにかかわるタンパク質が知られており、これらの遺伝子の不活性化や異常により細胞増殖を抑制できなくなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、細胞増殖の抑制に関与する遺伝子を新たに見出し、これを利用して新規ながんの診断や治療の手段の開発を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用を調べる過程において、細胞増殖抑制に関連する遺伝子を見出し、これが、従来インフルエンザ耐性を付与する遺伝子として知られていたＭｘ１遺伝子であることを確認した。この遺伝子が細胞増殖抑制の機能を有することは全く予想されておらず、本発明者により初めて明らかにされた知見である。本発明によれば、この遺伝子の細胞増殖抑制機能を利用して細胞増殖抑制剤およびがん治療のための遺伝子治療用組成物を提供することができる。また、被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングして、細胞増殖抑制剤やがん治療剤の開発を行うことができる。
【０００５】
さらに、本発明者は、マウスのＭｘ１遺伝子において特定の部分に欠損があり、インフルエンザ耐性の機能を消失した遺伝子においても、細胞増殖調節に対する機能が失われていないことも見出した。従って、この欠損部分を有するＭｘ１遺伝子がコードするタンパク質の検討によって細胞増殖調節の機構を解明する手段を提供することができる。
【０００６】
即ち、本発明は、(1) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤、(2) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む、がん治療のための遺伝子治療用組成物、(3) Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを、細胞増殖抑制剤の製造に使用する方法、(4) 被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法、(5) 配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞増殖の抑制に関与する遺伝子を新たに提供することができる。この遺伝子の細胞増殖調節の機構を利用して、新規ながんの診断や治療の手段の開発が可能になる。また、この遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤やがん治療薬の開発が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（Ａ）Ｍｘ１遺伝子の細胞増殖抑制作用
Ｍｘ１遺伝子の細胞増殖抑制作用は以下のようにして確認された。
(1) 性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用
まず、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用について、下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞（ゴナドトロフ）の株化細胞であるＬβＴ２細胞を用いて検討した。ＬβＴ２細胞は、がん抑制遺伝子であるｐ５３を抑制するＳＶ４０のＴ抗原を過剰発現するようにしたトランスジェニックマウスの下垂体から樹立された細胞であり、がん化した細胞である。
【０００９】
性腺刺激ホルモン放出ホルモンは、視床下部から分泌されるアミノ酸１０個からなるペプチドホルモンであり、生殖を調節する神経ホルモンとして知られる。このホルモンの細胞増殖に対する抑制作用は、前立腺腫瘍、卵巣がん、子宮内膜症などの細胞で示されており、前立腺腫瘍の治療において実際に使用されている。但し、その機構としては、ＧｎＲＨの過剰量が性腺刺激ホルモン、ひいては男性ホルモンの分泌を抑制することにより前立腺腫瘍の進行を止めていると解されている。
【００１０】
これに対し、本発明者はＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）が用量依存的にＬβＴ２細胞数を減少させることを確かめ、ＧｎＲＨが直接細胞増殖を抑制していることを見出した。さらにＧｎＲＨの標準的拮抗阻害薬（セトロレリックスおよびアンタイド）もＬβＴ２細胞数を減少させることが判明し、ＧｎＲＨａと拮抗薬が同じ細胞内の機序を動かすことによって細胞増殖を抑制していることを示した。(2) ＧｎＲＨａの投与およびＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の投与により共通して変動する遺伝子
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａの投与により変動する遺伝子と、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の投与により変動する遺伝子を網羅的に調べ、共通して変動した２７個の遺伝子を見出した。この中に増殖関連遺伝子があると考えられ、特に変動幅の大きい２つの遺伝子に注目した。これらはアデニルシクラーゼ２およびチトクロームｐ４５０ ２ｃ３７というリポキシゲナーゼ活性をもつ酵素の遺伝子である。これらの酵素の産物、ｃＡＭＰと１２ＨＥＴＥの細胞増殖に対する影響を調べると、ｃＡＭＰについてはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗した。さらにｃＡＭＰは、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の細胞増殖抑制作用にも完全に拮抗した。従って、ＧｎＲＨａも拮抗薬も共にｃＡＭＰ産生を抑えることにより細胞増殖を抑制することが明らかとなった。
【００１１】
ｃＡＭＰはリン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化することが知られているので、細胞増殖が抑制されるときにはＰＫＡ活性の抑制が起こっている可能性がある。そこで、ＰＫＡ活性の抑制剤であるＨ８９を用いて細胞増殖に対する効果を調べた。その結果、アデニルシクラーゼ２の抑制に引き続いてＰＫＡ活性が抑制されることがシグナルとなって細胞増殖を抑制していることが判明した。
(3) ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子を調べた結果、４つの遺伝子（遺伝子Ａ〜Ｄ）が見出された。
【００１２】
リアルタイムＰＣＲ法により、ＧｎＲＨａ投与後の４つの遺伝子の経時的変化を調べると、いずれの遺伝子もＧｎＲＨａ投与後かなり早期に一過性に発現が増加していることが明らかになった。
(4) ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響
各遺伝子の働きをＲＮＡ干渉法により抑制した。具体的には、各遺伝子の働きを抑制するｓｉＲＮＡ分子を細胞内に導入後、ＧｎＲＨａを投与した。その結果、遺伝子Ａを抑制した場合にのみ細胞増殖抑制効果が観察されなくなった。これは、遺伝子Ａが細胞増殖抑制に関与していることを示す。
【００１３】
遺伝子Ａは、後述するように、インフルエンザウイルス抵抗性遺伝子として知られているＭｘ１と称される遺伝子である。
さらに、Ｈ８９によってＰＫＡを抑制すると、Ｍｘ１遺伝子の発現が促進されることを確認した。また、ＧｎＲＨａによるＭｘ１発現の増加に他の遺伝子産物が必要かどうかを調べた。その結果、Ｍｘ１はＧｎＲＨによって他のタンパク質合成なしに誘導される遺伝子（イミディエート・アーリー）であることが判明した。また、ＧｎＲＨａ投与５分後のＭｘ１遺伝子の発現率を調べ、Ｍｘ１遺伝子が早期に変動することを確認した。
(5) 遺伝子Ａ
遺伝子Ａは、インフルエンザ耐性を付与するとして知られているＭｘ１と称される遺伝子である。また、インターフェロンにより誘導されることが知られている。この遺伝子が細胞増殖抑制作用を有することは本発明において初めて明らかになった。従って、この遺伝子を細胞増殖抑制剤やがん治療剤として利用することが可能になった。
【００１４】
ヒトＭｘ１のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示される（ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＭ＿００２４６２）。
また、本発明で用いるマウスＭｘ１のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｍ２１０３９）に示す通りである。一般の実験動物として使用されているマウスのほとんどは、Ｍｘ１遺伝子に欠損があり、本発明において使用したマウス由来細胞でもＭｘ１遺伝子に欠損があり、ＮＭ＿０１０８４６として登録されているマウスＭｘ１遺伝子の塩基配列のうち１１２１〜１５４４位が欠損したものである。このような欠損遺伝子をもった実験動物のマウスではインフルエンザを感染させると死亡する、即ち欠損Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性を失なっている。しかし、インフルエンザ耐性に対しては機能を失っているこの欠損Ｍｘ１遺伝子も、細胞増殖調節に対する機能は失っていないことが本発明において明らかになった。
【００１５】
このように、Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性以外の機能、即ち細胞増殖抑制の機能を有し、それはインフルエンザ耐性を失ったマウスの欠損Ｍｘ１遺伝子でも保持されている。
【００１６】
マウスの欠損Ｍｘ１遺伝子により発現されるタンパク質は、市販のヒトＭｘ１蛋白質のＮ末端側配列に特異的なポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット法により確認された。
（Ｂ）細胞増殖抑制剤、がん治療のための遺伝子治療用組成物
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチド、例えば配列番号１で示される塩基配列のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドは、その細胞増殖抑制機能により細胞増殖抑制剤またはがん治療のための遺伝子治療用組成物として使用できる。例えば、このポリヌクレオチドを適宜発現ベクターに組み込み、遺伝子治療用組成物を調製し、このポリヌクレオチドがコードするＭｘ１タンパク質を標的細胞内で発現させるように、対象患者に投与する。投与方法としては、患者から取り出した細胞に目的の遺伝子を導入し、それを患者の体内に戻すex vivo 遺伝子治療や、患者に遺伝子を直接投与するin vivo 遺伝子治療が使用できる。ベクターとしてはアデノウイルスベクターが好ましく使用できる。
（Ｃ）スクリーニング方法
被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現率を調べることによりＭｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することができ、これを細胞増殖抑制剤やがん治療剤のスクリーニングに利用できる。
【００１７】
以下の実施例において本発明をより具体的に説明する。
【実施例１】
【００１８】
細胞増殖抑制作用をもつ遺伝子の同定
(1) 性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の細胞増殖抑制作用の検討
継代維持しているＬβＴ２細胞を用いて、ＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）の影響を調べた。ＧｎＲＨ作動薬を用量を変えて（０〜１０-7Ｍ）細胞培養液に加え、２４時間培養した。２４時間ＧｎＲＨａを投与し続けた場合を図１ａに、最初の３０分投与し、その後２３時間３０分培養を続けた場合を図１ｂに示す。細胞数は、実験終了後に細胞を酵素で分離し、顕微鏡下で細胞を数えることにより計測した。ＧｎＲＨａは用量依存的に２４時間後の細胞数を減少させた（２４時間で観察されるべき増殖を抑制した）。
(2) ＧｎＲＨ拮抗阻害薬の細胞増殖抑制作用
上記(1) で観察されたＧｎＲＨａの効果がＧｎＲＨ受容体を介していることを確認するために、標準的に用いられるＧｎＲＨ拮抗阻害薬であるセトロレリックスおよびアンタイドを用いて、ＬβＴ２細胞での細胞増殖抑制効果を調べた。意外にもＧｎＲＨａとの併用の場合、ＧｎＲＨａに拮抗しないばかりか、拮抗薬単独でも細胞数の減少が見られた。結果を図２に示す。図２ａは９６時間試薬を入れ続けた場合、図２ｂは最初の３０分のみ作用させて９６時間後の細胞数を計測した場合である。
【００１９】
この結果より、細胞増殖に関しては拮抗阻害薬が作動薬として働くことが明らかである。
さらに、拮抗阻害薬の効果を経時的に観察した結果を図３に示す。ＬβＴ２細胞培養液に試薬を９６時間添加し続けた場合の細胞数の経時的変化を図３ａに、最初の３０分のみ試薬を作用させた場合の経時的変化を図３ｂに示す。拮抗薬（セトロレリックス）はＧｎＲＨａと同様に細胞増殖を抑制することが判明した。上記の実験と同様、最初の３０分で効果が決まることが再確認され、また、一度増えた細胞が減るのではなく、増殖が抑えられていることも分かる。
【００２０】
以上の結果は、ＧｎＲＨａと拮抗薬が、同じ細胞内の機序を動かすことにより細胞増殖を抑制していることを示す。
(3) ＧｎＲＨａおよび拮抗薬（セトロレリックス）の投与により共通して変動する遺伝子の検討
ＤＮＡマイクロアレイ法解析により、ＧｎＲＨａ投与によって変動する遺伝子と、拮抗薬（セトロレリックス）の投与によって変動する遺伝子を調べ、共通して変動した２７個の遺伝子を見出した（図４）。その中で特に変動幅の大きい遺伝子は、アデニルシクラーゼ２およびチトクロームｐ４５０ ２ｃ３７というリポキシゲナーゼ活性をもつ酵素の遺伝子である。これらの酵素の産物、ｃＡＭＰと１２ＨＥＴＥについてＬβＴ２細胞を用いて増殖に対する影響を調べた結果、１２ＨＥＴＥではＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に拮抗しなかった。ｃＡＭＰについてはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗した（図５）。図５ａは、試薬を９６時間添加し続けた場合の細胞数の経時的変化を、図５ｂは、最初の３０分のみ試薬を作用させた場合の経時的変化を示す。ｃＡＭＰはジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）として投与した。結果より、ｄｂｃＡＭＰはＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に完全に拮抗することが分かる。
【００２１】
また、ｃＡＭＰは、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）の細胞増殖抑制作用にも完全に拮抗した（図６）。従って、ＧｎＲＨａも拮抗薬も共にｃＡＭＰ産生を抑えることにより細胞増殖を抑制することが明らかとなった。
【００２２】
ｃＡＭＰはリン酸化酵素であるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化することが知られているので、細胞増殖が抑制されるときにはＰＫＡ活性の抑制が起こっている可能性がある。そこで、ＰＫＡ活性の抑制剤であるＨ８９を用いて細胞増殖に対する効果を確認した。図７にＰＫＡ抑制薬のＨ８９の細胞増殖抑制効果を示す。用量反応的に細胞数を減少させた。即ち、アデニルシクラーゼ２の抑制に引き続いてＰＫＡ活性が抑制されることがシグナルとなって細胞増殖を抑制していることが判明した。
(3) ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子の検討
ＤＮＡマイクロアレイ解析により、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）、ＰＫＡ活性抑制剤（Ｈ８９）で共通して変動する遺伝子を調べた。投与３時間後にＲＮＡを回収してＤＮＡマイクロアレイにより変動する遺伝子を調べるという方法によった。Ｈ８９の投与による遺伝子発現を調べ、ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬（セトロレリックス）で変動した遺伝子と比較した結果、４つの遺伝子（遺伝子Ａ〜Ｄ）が見出された。
【００２３】
ＤＮＡマイクロアレイでは３時間目のサンプルのみであったので、リアルタイムＰＣＲ法により、ＧｎＲＨａ投与後の遺伝子Ａ〜Ｄの経時的変化を調べた。その結果、いずれの遺伝子もＧｎＲＨａ投与後かなり早期に一過性に発現が増加していることが明らかになった（図８）。
(4) ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響
各遺伝子の働きをＲＮＡ干渉法により抑制した。具体的には、各遺伝子の働きを抑制するｓｉＲＮＡ分子をＬβＴ２細胞内に導入後、ＧｎＲＨａを投与した。その結果、遺伝子Ａを抑制した場合にのみ細胞増殖抑制効果が観察されなくなった（図９）。これは、遺伝子Ａが細胞増殖抑制に関与していることを示す。
【００２４】
遺伝子Ａは、インフルエンザウイルス抵抗性遺伝子として知られているＭｘ１遺伝子である。本発明で用いたマウスＭｘ１の塩基配列は配列番号２（ＮＣＢＩデータベース、Ｍ２１０３９）に示す通りであるが、一般の実験動物として使用されているマウスのほとんどは、Ｍｘ１遺伝子の１１２１〜１５４４位に欠損があり、本発明において使用したマウス由来細胞でもＭｘ１遺伝子に同様の欠損があることを確認した。このような欠損遺伝子をもった実験動物のマウスではインフルエンザを感染させると死亡する、即ち欠損Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性に対する機能を失なっている。しかし、このインフルエンザ耐性に対しては機能を失っているＭｘ１遺伝子も、細胞増殖調節に対する機能は失っていないことが明らかである。
【００２５】
さらに、ＰＫＡ抑制剤（Ｈ８９）によってＰＫＡを抑制すると、Ｍｘ１遺伝子の発現が促進されることを確認した（図１０）。これは、Ｍｘ１遺伝子に特異的なリアルタイムＰＣＲ法を確立してｍＲＮＡの発現率を定量することにより行った。即ち、Ｈ８９を加えた細胞のＲＮＡを回収して、Ｍｘ１遺伝子の転写活性をリアルタイムＰＣＲ法で測定することにより確認した。
【００２６】
また、ＧｎＲＨａによるＭｘ１発現の増加に他の遺伝子産物が必要かどうかを調べるために、培養細胞にシクロヘキシミド（蛋白質合成阻害薬）を作用させながらＧｎＲＨａを添加した。他の遺伝子はＧｎＲＨａに反応しなくなったが、Ｍｘ１遺伝子のみはＧｎＲＨａによって転写活性が増加した。従って、Ｍｘ１はＧｎＲＨによって他のタンパク質合成なしに誘導される遺伝子（イミディエート・アーリー）であることが判明した（図１１）。
【００２７】
ＧｎＲＨａのＬβＴ２細胞増殖抑制に対する百日咳毒素（ＰＴＸ）併用投与の影響を調べることにより、ＧｎＲＨがＧｎＲＨ受容体からＧαｉを介することを確認した。
また、ＧｎＲＨａ投与５分後のＭｘ１遺伝子の発現率を調べ、Ｍｘ１遺伝子が早期に変動することを確認した。
【００２８】
以上の結果から、図１２に示すようにＧｎＲＨはＧｎＲＨ受容体に結合し、Ｇαｉを介してアデニルレートシクラーゼが抑制され、次いでＰＫＡが抑制されると、Ｍｘ１合成が促進され、これによって細胞増殖が抑制されると考えられる。このように、Ｍｘ１遺伝子はインフルエンザ耐性以外に、細胞増殖抑制の機能を有し、それはインフルエンザ耐性を失ったマウスの欠損Ｍｘ１遺伝子でも保持されている。
【００２９】
マウスの欠損Ｍｘ１遺伝子により発現されるタンパク質は、ヒトＭｘ１蛋白質のＮ末端側配列に特異的なポリクローナル抗体（サンタクルーズ社、Ｓｃ−３４１２８）を用いて、ウエスタンブロット法により確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＬβＴ２細胞数に与えるＧｎＲＨ作動薬（ＧｎＲＨａ）の影響を示す図である。
【図２】ＧｎＲＨａと拮抗薬併用投与の効果を示す図である。
【図３】ＧｎＲＨａ、ＧｎＲＨ拮抗薬の細胞増殖抑制作用を示す図である。
【図４】ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果の概要を示す図である。
【図５】ＧｎＲＨａの作用に対するｄｂｃＡＭＰの拮抗作用を示す図である。
【図６】セトロリックスの作用に対するｄｂｃＡＭＰの拮抗作用を示す図である。
【図７】ＰＫＡ抑制薬（Ｈ８９）の増殖抑制作用を示す図である。
【図８】ＧｎＲＨａ投与後の遺伝子Ａ〜Ｄの経時的変化を示す図である。
【図９】ＧｎＲＨａの細胞増殖抑制作用に対する各遺伝子ノックダウンの影響を示す図である。
【図１０】ＰＫＡの抑制が遺伝子Ａの発現を促進することを示す図である。
【図１１】ＧｎＲＨａの遺伝子Ａ〜Ｄの発現促進効果へのシクロヘキシミドの影響を示す図である。
【図１２】ＧｎＲＨによるシグナル伝達を示す模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む、がん治療のための遺伝子治療用組成物。
【請求項３】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを、細胞増殖抑制剤の製造に使用する方法。
【請求項４】
被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項５】
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【請求項１】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む、がん治療のための遺伝子治療用組成物。
【請求項３】
Ｍｘ１遺伝子のオープンリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを、細胞増殖抑制剤の製造に使用する方法。
【請求項４】
被検物質をＭｘ１遺伝子を発現する細胞に接触させ、Ｍｘ１遺伝子の発現に影響する物質を選択することにより、細胞増殖抑制剤またはがん治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項５】
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００９−９１２６５（Ｐ２００９−９１２６５Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６１００８（Ｐ２００７−２６１００８）
【出願日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里研究所 (180)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]