細胞外マトリックス分解酵素阻害剤
【課題】酵母エキスの新たな用途を提供すること。
【解決手段】酵母エキスが細胞外マトリックス分解酵素阻害剤として機能することが見出された。酵母エキスは、ビール酵母エキス、パン酵母エキス及びトルラ酵母エキスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。
【解決手段】酵母エキスが細胞外マトリックス分解酵素阻害剤として機能することが見出された。酵母エキスは、ビール酵母エキス、パン酵母エキス及びトルラ酵母エキスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、ビールの原料として用いられてきた、安全性の高い食品素材である。酵母エキスは、酵母細胞内に含まれる成分を抽出したものであり、従来、生鮮物の変色防止剤（特許文献１参照）、大腸菌用選択培地（特許文献２参照）、免疫機能賦活剤（特許文献３参照）等に用いられている。
【特許文献１】特開平８−２６６２４５号公報
【特許文献２】特開１１−２６２３８３号公報
【特許文献３】特開２０００−１６９３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、安全性の高い自然食品素材である酵母から容易に入手可能な酵母エキスには、更なる有用な用途が見出されることが期待されている。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、酵母エキスの新たな用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、酵母エキスについて、更なる有用な用途に関する検討を行なった結果、酵母エキスが細胞外マトリックス分解酵素活性阻害作用を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、酵母エキスからなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供するものである。
【０００７】
酵母エキスの原料となる酵母としては、清酒酵母、ブドウ酒酵母、パン酵母、ビール酵母、トルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等が知られているが、これらの中でもビール酵母、パン酵母又はトルラ酵母を用いることが好ましい。すなわち、酵母エキスは、ビール酵母エキス、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスが好ましい。ビール酵母エキス、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスを用いることにより、細胞外マトリックス分解酵素の阻害活性が優れるようになる。
【０００８】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、特にゼラチナーゼＡ阻害活性又はコラゲナーゼ阻害活性を有することによって、優れた抗シワ効果を発揮する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、酵母エキスの細胞外マトリックス分解酵素阻害剤としての新たな用途を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、酵母エキスからなる。
【００１２】
酵母エキスは、酵母に含まれる成分を抽出したものである。酵母エキスとしては、（１）酵母自身が有する酵素で酵母内容物を分解させる方法（以下「自己消化法」という。）、（２）外部から酵素を加えて酵母内容物や細胞壁成分を分解させる方法（以下「酵素分解法」という。）、（３）酸やアルカリを用いて酵母内容物を分解させる方法（以下、「酸やアルカリによる加水分解法」という。）、（４）酵母菌体を熱水で処理してエキス分を抽出する方法（以下「熱水抽出法」という。）又は（５）酵母菌体若しくは酵母消化液を、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、濃グリセリン等で抽出する方法（以下「有機溶媒抽出法」という。）により抽出したエキスが好適である。これらの方法は、単独で用いられる他、適宜組み合わせて用いられている。
【００１３】
上記（１）自己消化法は、酵素分解法と同様に反応が穏やかである点、食塩の生成が少ない点、外部から酵素を添加する必要がない点、作業が簡便である点、製造コストが安価である点、及び不安定な成分も抽出可能である点で有利である。
【００１４】
（２）酵素分解法は、反応が穏やかである点、食塩の生成が少ない点、及び収率を高めることができる点で有利である。
【００１５】
（３）酸やアルカリによる加水分解法は、アミノ酸等内容物の収得率が高い点で有利である。
【００１６】
（４）熱水抽出法は、親水性のアミノ酸や有機酸が主に抽出され、自己消化法で得られる酵母エキスと比較して疎水性成分が少なく、色のうすい酵母エキスが得られる点で有利である。
【００１７】
（５）有機溶媒抽出法は、脂溶性成分の収率を向上させる点で有利である。
【００１８】
これらの方法によって製造される酵母エキスのうち、特別な設備を必要としない点、温和な条件のためランニングコストが低い点、分解のコントロールが容易である点等から、自己消化法又は酵素分解法によって製造される酵母エキスが好ましい。自己消化法による酵母エキスは、例えば、培養した酵母の液胞を、物理的方法や界面活性剤等で破壊させて、ｐH３〜７、３０〜６０℃で、１〜２日程度自己消化させることにより得ることができる。一方、酵素分解法による酵母エキスは、例えば、酵母菌体懸濁液にプロテアーゼ、β−グルカナーゼ等の酵素を添加して酵母を分解させて得ることができる。なお、いずれの方法においても、更に抽出・濃縮等を行ってもよい。抽出は、上記方法で得られたエキスを４０〜１００℃（好ましくは６０〜１００℃）の水（熱水）で行うことが好ましい。
【００１９】
酵母エキスは、一般に、タンパク成分、核酸成分及びその他微量成分から構成されている。タンパク成分としてはタンパク質のみならず、その分解物であるアミノ酸等が含まれる。また、核酸成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのみならず、その分解物であるアデニル酸、グアニル酸、イノシン酸等が含まれる。細胞外マトリックス分解酵素阻害剤としての酵母エキスの有効成分は必ずしも明らかではないが、酵素阻害は、酵母エキスの、多糖類、タンパク成分、核酸成分、微量成分のいずれかによるものであるか、これらの成分が協働して発現しているものと想定される。これらの成分の中でも、少なくとも、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、酢酸、ピログルタミン酸が酵素阻害に寄与する成分であると考えられる。
【００２０】
すなわち、酵母エキスは、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、酢酸及びピログルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。このような成分を含有することで、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤の阻害活性が優れるようになる。
【００２１】
原料となる酵母としては、毒性のないものであれば特に制限はなく、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等に属する酵母が挙げられる。特に、食品工業で用いられている酵母である、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、キャンディダ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、アルコール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、清酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｂａｙａｎｕｓ）等を用いることができる。これらの酵母は、１種のみを用いてもよく、２種以上の酵母を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
特に、ビール酵母は、ビール醸造において余剰となり、安全かつ安価に入手可能であるため、好ましい。ビール酵母エキスは、ビール酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものである。ビール酵母は、子嚢菌門に属する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）のうち、ビール製造の副生成物として分離されるものである。
【００２３】
ビール酵母エキスを用いることにより、上述した有効成分に富んだエキスを得ることが容易となる。例えば、自己消化法により抽出されたビール酵母エキスは、典型的には、３００〜１６００ｐｐｍのコハク酸、１０〜４０ｐｐｍのリンゴ酸、３００〜１１００ｐｐｍの乳酸、９０〜１４０ｐｐｍの蟻酸、３００〜１１００ｐｐｍの酢酸、及び２００〜１０００ｐｐｍのピログルタミン酸を含有する。
【００２４】
また、酵素分解法により抽出されたビール酵母エキスは、典型的には、３００〜１６００ｐｐｍのコハク酸、１０〜４０ｐｐｍのリンゴ酸、３００〜１１００ｐｐｍの乳酸、９０〜１４０ｐｐｍの蟻酸、３００〜１１００ｐｐｍの酢酸、及び２００〜１０００ｐｐｍのピログルタミン酸を含有する。
【００２５】
ビール酵母エキスとしては、サッポロビール社製の「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」、「ＲＮ７」（以上、商品名）等を用いることができる。このうち、「ＲＴ」は酵素分解法により抽出されたものであり、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」及び「ＲＮ７」は自己消化法により抽出されたものである。
【００２６】
また、酵母エキスは、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスであることが好ましい。パン酵母エキスは、パン酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものであり、トルラ酵母エキスは、トルラ酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものである。パン酵母は、子嚢菌門に属する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いることができ、トルラ酵母は、一般に飼料や食品用に普及しているキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属を用いることができる。
【００２７】
細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害作用を有する物質である。細胞外マトリックス分解酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ：Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等とも呼ばれる、細胞外マトリックスの代謝に関わる酵素である。
【００２８】
一般に、動物の結合組織は、コラーゲンやプロテオグリカンを主成分とする細胞外マトリックスにより構成されている。細胞外マトリックスの代謝は、細胞外マトリックス分解酵素（以下「ＭＭＰ」という。）と生体内阻害因子（ＴＩＭＰ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とのバランスにより調節されているが、このうち、ＭＭＰは、細胞外マトリックスを分解又は変性することにより、皮膚の弾力性の低下、及びそれに伴うシワやタルミの発生の原因となると考えられている。
【００２９】
ＭＭＰのうち、ＭＭＰ１（コラゲナーゼ）は、真皮に分布する膠原繊維であるＩ型コラーゲン等を基質とし、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）は、基底膜に分布するＩＶ型コラーゲンや変性コラーゲンであるゼラチン、真皮に分布するＶ型コラーゲンや弾性繊維であるエラスチン、軟結合組織及び基底膜に分布する糖タンパク質であるフィブロネクチン等を基質とする。
【００３０】
ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、このように、皮膚のハリを保つ上で重要な基質を分解又は変性するため、皮膚のシワやタルミの発生と特に関わりがあると考えられている。また、ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、皮膚に紫外線が当たると活性化されるため、紫外線による皮膚マトリックスの損傷にも関わっていると考えられている。
【００３１】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、これらＭＭＰのうち特にＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）又はMMP１（コラゲナーゼ）の活性を阻害することにより、皮膚のシワやタルミを防止し、皮膚のハリを保つ効果を発揮する。すなわち、本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚シワ防止剤、皮膚タルミ防止剤、皮膚ハリ改善剤等として機能する。
【００３２】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚外用剤として用いることができる。その場合、直接皮膚に塗布することもできるし、他の物質を混ぜて用いてもよい。
【００３３】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品に含ませて用いることができる。本発明のＭＭＰ阻害剤を含む化粧品、食品、飲料又は医薬品は、有効成分である有機酸の他、浸潤剤、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、分散助剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、賦形剤、防菌防黴剤、消臭・脱臭剤、歯磨粉、酵素、精製水又はアルコールを含んでもよい。また、他のＭＭＰ阻害剤を添加してもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「質量％」を表す。
【００３５】
（実施例１）
酵母エキスの熱水抽出物におけるＭＭＰ２阻害活性
〈試料の調製〉
サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」及び「ＲＮ７」（以上、商品名）０．１ｇにそれぞれ蒸留水１ｍＬを加え、１００℃にて３０分間保持した後、遠心して上清を試料とした。
【００３６】
〈ＭＭＰ２阻害活性試験〉
反応容器に、５８ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ２酵素液と、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、 ０．０５％Ｂｒｉｊ−３５、 １ｍＭ ＤＴＮＢ、ｐＨ７．５）と、試料を添加し、反応液を調製した。３７℃にて６０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として１ｍＭ Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ溶液（主成分はオリゴタンパク質Ａｃ−ＰＬＧ−［２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−ＬＧ−ＯＣ２Ｈ５）を反応液に加えた。ＭＭＰ２がＴｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを切断して生じるｓｕｌｆｈｙｄｒｙ（スルフヒドリル）基がＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｖ ａｃｉｄ）のジスルフィド結合を切断して生じるチオールを、４１２ｎｍの吸光度で検出した。
【００３７】
インキュベート後に細胞外マトリックス模擬溶液を加えた時点から４１２ｎｍにおける吸光度を６０分間測定した。測定開始から６０分間の経時的な吸光度の上昇を一次式で近似し、その傾きを吸光度変化量（ΔＡＢＳ）とした。コントロールには、試料の代わりに緩衝液を加えたものを用いた。この吸光度変化量を用いて下記式より阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（ΔＡＢＳコントロール）−（ΔＡＢＳ試料））／（ΔＡＢＳコントロール）×１００
【００３８】
更に、上記阻害率をもとに、ＭＭＰ２活性を５０％阻害するときの濃度（ＩＣ５０値：５０％阻害濃度）を算出した。
【００３９】
（比較例１）
ウコン及びレモンのメタノール抽出物におけるＭＭＰ２阻害活性
〈試料の調製〉
山本漢方製薬社製の「紫ウコン」（商品名）及び市販のレモンの果皮０．１ｇにそれぞれメタノール１ｍＬを加え、３０分間振とうした。遠心後、上清５００μＬをとり、減圧乾固し、蒸留水１００μＬに再溶解したものを試料とした。
【００４０】
〈ＭＭＰ２阻害活性試験〉
実施例１と同様の方法で、ＩＣ５０値を算出した。
【００４１】
表１は、各酵母エキス並びにウコン及びレモンのＭＭＰ２阻害活性を、実施例１及び比較例１で算出したＩＣ５０値により評価した結果を示すものである。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１に示されるように、酵母エキスの熱水抽出物は、従来からＭＭＰ２活性阻害作用を有することが知られているウコン及びレモンのメタノール抽出物と比較して、同等以上のＭＭＰ２阻害活性を示すことが明らかになった。特に、サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」（商品名）は、極めて高いＭＭＰ２阻害活性を有することが明らかになった。
【００４４】
（実施例２）
酵母エキスの熱水抽出物におけるＭＭＰ１阻害活性
〈試料の調製〉
サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」、「ＲＮ７」、「ＦＬａｖＲＭａｘ」、「酵味」及び「スーパーミーストＡ」（以上、商品名）０．１ｇにそれぞれ蒸留水１ｍＬを加え、１００℃にて３０分間保持した後、遠心して上清を試料とした。
【００４５】
〈ＭＭＰ１阻害活性試験〉
反応容器に、７６５ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ１酵素液と、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、 ０．０５％Ｂｒｉｊ−３５、 １ｍＭ ＤＴＮＢ、ｐＨ７．５）と、試料を添加し、反応液を調製した。３７℃にて６０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として１ｍＭ Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ溶液（主成分はオリゴタンパク質Ａｃ−ＰＬＧ−［２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−ＬＧ−ＯＣ２Ｈ５）を反応液に加えた。ＭＭＰ１がＴｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを切断して生じるｓｕｌｆｈｙｄｒｙ（スルフヒドリル）基がＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｖ ａｃｉｄ）のジスルフィド結合を切断して生じるチオールを、４１２ｎｍの吸光度で検出した。
【００４６】
インキュベート後に細胞外マトリックス模擬溶液を加えた時点から４１２ｎｍにおける吸光度を６０分間測定した。測定開始から６０分間の経時的な吸光度の上昇を一次式で近似し、その傾きを吸光度変化量（ΔＡＢＳ）とした。コントロールには、試料の代わりに緩衝液を加えたものを用いた。この吸光度変化量を用いて下記式より阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（ΔＡＢＳコントロール）−（ΔＡＢＳ試料））／（ΔＡＢＳコントロール）×１００
【００４７】
更に、上記阻害率をもとに、ＭＭＰ１活性を５０％阻害するときの濃度（ＩＣ５０値：５０％阻害濃度）を算出した。
【００４８】
（比較例２）
ウコン及びレモンのメタノール抽出物におけるＭＭＰ１阻害活性
〈試料の調製〉
山本漢方製薬社製の「紫ウコン」（商品名）、リアルネット社製の「ウコン」（商品名）及び市販のレモンの果皮０．１ｇにそれぞれメタノール１ｍＬを加え、３０分間振とうした。遠心後、上清５００μＬをとり、減圧乾固し、蒸留水１００μＬに再溶解したものを試料とした。
【００４９】
〈ＭＭＰ１阻害活性試験〉
実施例２と同様の方法で、ＩＣ５０値を算出した。
【００５０】
表２は、各酵母エキス並びにウコン及びレモンのＭＭＰ１阻害活性を、実施例２及び比較例２で算出したＩＣ５０値により評価した結果を示すものである。
【００５１】
【表２】
【００５２】
表２に示されるように、酵母エキスの熱水抽出物は、従来からＭＭＰ１活性阻害作用を有することが知られているウコン及びレモンのメタノール抽出物と比較して、非常に高いＭＭＰ１阻害活性を示すことが明らかになった。特に、サッポロビール社製の酵母エキス「ＲN７」（商品名）は、極めて高いＭＭＰ１阻害活性を有することが明らかになった。
【００５３】
（製造例１）
実施例１で製造した酵母エキスを用いて、表３に示す処方の化粧水を常法により調製した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
（実施例３）
製造例１で調製した化粧水について、女性パネル１６名（年齢２０〜３９歳）に使用してもらい、使用感をアンケート形式で質問した。なお、対照として製造例１において酵母エキスを含まない（精製水の配合量を９０．０％とした）化粧水を同様に製造し、使用した。使用感について比較したところ、１６名中１１名が、酵母エキスを含む化粧水の方が好ましいとした。好ましい理由は、肌のコンディションに関わる「しっとり感」、「ハリ」等であった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により提供されるＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品として好適に用いられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、ビールの原料として用いられてきた、安全性の高い食品素材である。酵母エキスは、酵母細胞内に含まれる成分を抽出したものであり、従来、生鮮物の変色防止剤（特許文献１参照）、大腸菌用選択培地（特許文献２参照）、免疫機能賦活剤（特許文献３参照）等に用いられている。
【特許文献１】特開平８−２６６２４５号公報
【特許文献２】特開１１−２６２３８３号公報
【特許文献３】特開２０００−１６９３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、安全性の高い自然食品素材である酵母から容易に入手可能な酵母エキスには、更なる有用な用途が見出されることが期待されている。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、酵母エキスの新たな用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、酵母エキスについて、更なる有用な用途に関する検討を行なった結果、酵母エキスが細胞外マトリックス分解酵素活性阻害作用を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、酵母エキスからなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤を提供するものである。
【０００７】
酵母エキスの原料となる酵母としては、清酒酵母、ブドウ酒酵母、パン酵母、ビール酵母、トルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等が知られているが、これらの中でもビール酵母、パン酵母又はトルラ酵母を用いることが好ましい。すなわち、酵母エキスは、ビール酵母エキス、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスが好ましい。ビール酵母エキス、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスを用いることにより、細胞外マトリックス分解酵素の阻害活性が優れるようになる。
【０００８】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、特にゼラチナーゼＡ阻害活性又はコラゲナーゼ阻害活性を有することによって、優れた抗シワ効果を発揮する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、酵母エキスの細胞外マトリックス分解酵素阻害剤としての新たな用途を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、酵母エキスからなる。
【００１２】
酵母エキスは、酵母に含まれる成分を抽出したものである。酵母エキスとしては、（１）酵母自身が有する酵素で酵母内容物を分解させる方法（以下「自己消化法」という。）、（２）外部から酵素を加えて酵母内容物や細胞壁成分を分解させる方法（以下「酵素分解法」という。）、（３）酸やアルカリを用いて酵母内容物を分解させる方法（以下、「酸やアルカリによる加水分解法」という。）、（４）酵母菌体を熱水で処理してエキス分を抽出する方法（以下「熱水抽出法」という。）又は（５）酵母菌体若しくは酵母消化液を、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、濃グリセリン等で抽出する方法（以下「有機溶媒抽出法」という。）により抽出したエキスが好適である。これらの方法は、単独で用いられる他、適宜組み合わせて用いられている。
【００１３】
上記（１）自己消化法は、酵素分解法と同様に反応が穏やかである点、食塩の生成が少ない点、外部から酵素を添加する必要がない点、作業が簡便である点、製造コストが安価である点、及び不安定な成分も抽出可能である点で有利である。
【００１４】
（２）酵素分解法は、反応が穏やかである点、食塩の生成が少ない点、及び収率を高めることができる点で有利である。
【００１５】
（３）酸やアルカリによる加水分解法は、アミノ酸等内容物の収得率が高い点で有利である。
【００１６】
（４）熱水抽出法は、親水性のアミノ酸や有機酸が主に抽出され、自己消化法で得られる酵母エキスと比較して疎水性成分が少なく、色のうすい酵母エキスが得られる点で有利である。
【００１７】
（５）有機溶媒抽出法は、脂溶性成分の収率を向上させる点で有利である。
【００１８】
これらの方法によって製造される酵母エキスのうち、特別な設備を必要としない点、温和な条件のためランニングコストが低い点、分解のコントロールが容易である点等から、自己消化法又は酵素分解法によって製造される酵母エキスが好ましい。自己消化法による酵母エキスは、例えば、培養した酵母の液胞を、物理的方法や界面活性剤等で破壊させて、ｐH３〜７、３０〜６０℃で、１〜２日程度自己消化させることにより得ることができる。一方、酵素分解法による酵母エキスは、例えば、酵母菌体懸濁液にプロテアーゼ、β−グルカナーゼ等の酵素を添加して酵母を分解させて得ることができる。なお、いずれの方法においても、更に抽出・濃縮等を行ってもよい。抽出は、上記方法で得られたエキスを４０〜１００℃（好ましくは６０〜１００℃）の水（熱水）で行うことが好ましい。
【００１９】
酵母エキスは、一般に、タンパク成分、核酸成分及びその他微量成分から構成されている。タンパク成分としてはタンパク質のみならず、その分解物であるアミノ酸等が含まれる。また、核酸成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡのみならず、その分解物であるアデニル酸、グアニル酸、イノシン酸等が含まれる。細胞外マトリックス分解酵素阻害剤としての酵母エキスの有効成分は必ずしも明らかではないが、酵素阻害は、酵母エキスの、多糖類、タンパク成分、核酸成分、微量成分のいずれかによるものであるか、これらの成分が協働して発現しているものと想定される。これらの成分の中でも、少なくとも、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、酢酸、ピログルタミン酸が酵素阻害に寄与する成分であると考えられる。
【００２０】
すなわち、酵母エキスは、コハク酸、リンゴ酸、乳酸、蟻酸、酢酸及びピログルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種を含有することが好ましい。このような成分を含有することで、細胞外マトリックス分解酵素阻害剤の阻害活性が優れるようになる。
【００２１】
原料となる酵母としては、毒性のないものであれば特に制限はなく、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｉｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等に属する酵母が挙げられる。特に、食品工業で用いられている酵母である、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、キャンディダ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、アルコール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、清酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｂａｙａｎｕｓ）等を用いることができる。これらの酵母は、１種のみを用いてもよく、２種以上の酵母を組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
特に、ビール酵母は、ビール醸造において余剰となり、安全かつ安価に入手可能であるため、好ましい。ビール酵母エキスは、ビール酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものである。ビール酵母は、子嚢菌門に属する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又は、ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）のうち、ビール製造の副生成物として分離されるものである。
【００２３】
ビール酵母エキスを用いることにより、上述した有効成分に富んだエキスを得ることが容易となる。例えば、自己消化法により抽出されたビール酵母エキスは、典型的には、３００〜１６００ｐｐｍのコハク酸、１０〜４０ｐｐｍのリンゴ酸、３００〜１１００ｐｐｍの乳酸、９０〜１４０ｐｐｍの蟻酸、３００〜１１００ｐｐｍの酢酸、及び２００〜１０００ｐｐｍのピログルタミン酸を含有する。
【００２４】
また、酵素分解法により抽出されたビール酵母エキスは、典型的には、３００〜１６００ｐｐｍのコハク酸、１０〜４０ｐｐｍのリンゴ酸、３００〜１１００ｐｐｍの乳酸、９０〜１４０ｐｐｍの蟻酸、３００〜１１００ｐｐｍの酢酸、及び２００〜１０００ｐｐｍのピログルタミン酸を含有する。
【００２５】
ビール酵母エキスとしては、サッポロビール社製の「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」、「ＲＮ７」（以上、商品名）等を用いることができる。このうち、「ＲＴ」は酵素分解法により抽出されたものであり、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」及び「ＲＮ７」は自己消化法により抽出されたものである。
【００２６】
また、酵母エキスは、パン酵母エキス又はトルラ酵母エキスであることが好ましい。パン酵母エキスは、パン酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものであり、トルラ酵母エキスは、トルラ酵母に含まれる成分を上記のような方法で抽出したものである。パン酵母は、子嚢菌門に属する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いることができ、トルラ酵母は、一般に飼料や食品用に普及しているキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属を用いることができる。
【００２７】
細胞外マトリックス分解酵素阻害剤は、細胞外マトリックス分解酵素の活性阻害作用を有する物質である。細胞外マトリックス分解酵素は、マトリックスメタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ：Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）等とも呼ばれる、細胞外マトリックスの代謝に関わる酵素である。
【００２８】
一般に、動物の結合組織は、コラーゲンやプロテオグリカンを主成分とする細胞外マトリックスにより構成されている。細胞外マトリックスの代謝は、細胞外マトリックス分解酵素（以下「ＭＭＰ」という。）と生体内阻害因子（ＴＩＭＰ：Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とのバランスにより調節されているが、このうち、ＭＭＰは、細胞外マトリックスを分解又は変性することにより、皮膚の弾力性の低下、及びそれに伴うシワやタルミの発生の原因となると考えられている。
【００２９】
ＭＭＰのうち、ＭＭＰ１（コラゲナーゼ）は、真皮に分布する膠原繊維であるＩ型コラーゲン等を基質とし、ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）は、基底膜に分布するＩＶ型コラーゲンや変性コラーゲンであるゼラチン、真皮に分布するＶ型コラーゲンや弾性繊維であるエラスチン、軟結合組織及び基底膜に分布する糖タンパク質であるフィブロネクチン等を基質とする。
【００３０】
ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、このように、皮膚のハリを保つ上で重要な基質を分解又は変性するため、皮膚のシワやタルミの発生と特に関わりがあると考えられている。また、ＭＭＰ１及びＭＭＰ２は、皮膚に紫外線が当たると活性化されるため、紫外線による皮膚マトリックスの損傷にも関わっていると考えられている。
【００３１】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、これらＭＭＰのうち特にＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）又はMMP１（コラゲナーゼ）の活性を阻害することにより、皮膚のシワやタルミを防止し、皮膚のハリを保つ効果を発揮する。すなわち、本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚シワ防止剤、皮膚タルミ防止剤、皮膚ハリ改善剤等として機能する。
【００３２】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、皮膚外用剤として用いることができる。その場合、直接皮膚に塗布することもできるし、他の物質を混ぜて用いてもよい。
【００３３】
本発明のＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品に含ませて用いることができる。本発明のＭＭＰ阻害剤を含む化粧品、食品、飲料又は医薬品は、有効成分である有機酸の他、浸潤剤、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、分散助剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、賦形剤、防菌防黴剤、消臭・脱臭剤、歯磨粉、酵素、精製水又はアルコールを含んでもよい。また、他のＭＭＰ阻害剤を添加してもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、特に明記しない限り、「％」は「質量％」を表す。
【００３５】
（実施例１）
酵母エキスの熱水抽出物におけるＭＭＰ２阻害活性
〈試料の調製〉
サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」及び「ＲＮ７」（以上、商品名）０．１ｇにそれぞれ蒸留水１ｍＬを加え、１００℃にて３０分間保持した後、遠心して上清を試料とした。
【００３６】
〈ＭＭＰ２阻害活性試験〉
反応容器に、５８ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ２酵素液と、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、 ０．０５％Ｂｒｉｊ−３５、 １ｍＭ ＤＴＮＢ、ｐＨ７．５）と、試料を添加し、反応液を調製した。３７℃にて６０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として１ｍＭ Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ溶液（主成分はオリゴタンパク質Ａｃ−ＰＬＧ−［２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−ＬＧ−ＯＣ２Ｈ５）を反応液に加えた。ＭＭＰ２がＴｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを切断して生じるｓｕｌｆｈｙｄｒｙ（スルフヒドリル）基がＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｖ ａｃｉｄ）のジスルフィド結合を切断して生じるチオールを、４１２ｎｍの吸光度で検出した。
【００３７】
インキュベート後に細胞外マトリックス模擬溶液を加えた時点から４１２ｎｍにおける吸光度を６０分間測定した。測定開始から６０分間の経時的な吸光度の上昇を一次式で近似し、その傾きを吸光度変化量（ΔＡＢＳ）とした。コントロールには、試料の代わりに緩衝液を加えたものを用いた。この吸光度変化量を用いて下記式より阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（ΔＡＢＳコントロール）−（ΔＡＢＳ試料））／（ΔＡＢＳコントロール）×１００
【００３８】
更に、上記阻害率をもとに、ＭＭＰ２活性を５０％阻害するときの濃度（ＩＣ５０値：５０％阻害濃度）を算出した。
【００３９】
（比較例１）
ウコン及びレモンのメタノール抽出物におけるＭＭＰ２阻害活性
〈試料の調製〉
山本漢方製薬社製の「紫ウコン」（商品名）及び市販のレモンの果皮０．１ｇにそれぞれメタノール１ｍＬを加え、３０分間振とうした。遠心後、上清５００μＬをとり、減圧乾固し、蒸留水１００μＬに再溶解したものを試料とした。
【００４０】
〈ＭＭＰ２阻害活性試験〉
実施例１と同様の方法で、ＩＣ５０値を算出した。
【００４１】
表１は、各酵母エキス並びにウコン及びレモンのＭＭＰ２阻害活性を、実施例１及び比較例１で算出したＩＣ５０値により評価した結果を示すものである。
【００４２】
【表１】
【００４３】
表１に示されるように、酵母エキスの熱水抽出物は、従来からＭＭＰ２活性阻害作用を有することが知られているウコン及びレモンのメタノール抽出物と比較して、同等以上のＭＭＰ２阻害活性を示すことが明らかになった。特に、サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」（商品名）は、極めて高いＭＭＰ２阻害活性を有することが明らかになった。
【００４４】
（実施例２）
酵母エキスの熱水抽出物におけるＭＭＰ１阻害活性
〈試料の調製〉
サッポロビール社製の酵母エキス「ＲＴ」、「ＲＢ２Ｐ」、「ＲＮ７Ｐ３」、「ＲＮ７」、「ＦＬａｖＲＭａｘ」、「酵味」及び「スーパーミーストＡ」（以上、商品名）０．１ｇにそれぞれ蒸留水１ｍＬを加え、１００℃にて３０分間保持した後、遠心して上清を試料とした。
【００４５】
〈ＭＭＰ１阻害活性試験〉
反応容器に、７６５ｍＵ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ（大腸菌組み換えヒト）ＭＭＰ１酵素液と、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、 ０．０５％Ｂｒｉｊ−３５、 １ｍＭ ＤＴＮＢ、ｐＨ７．５）と、試料を添加し、反応液を調製した。３７℃にて６０分間インキュベートした後、細胞外マトリックス模擬基質溶液として１ｍＭ Ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ溶液（主成分はオリゴタンパク質Ａｃ−ＰＬＧ−［２−ｍｅｒｃａｐｔｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｎｏｙｌ］−ＬＧ−ＯＣ２Ｈ５）を反応液に加えた。ＭＭＰ１がＴｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅを切断して生じるｓｕｌｆｈｙｄｒｙ（スルフヒドリル）基がＤＴＮＢ（５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｖ ａｃｉｄ）のジスルフィド結合を切断して生じるチオールを、４１２ｎｍの吸光度で検出した。
【００４６】
インキュベート後に細胞外マトリックス模擬溶液を加えた時点から４１２ｎｍにおける吸光度を６０分間測定した。測定開始から６０分間の経時的な吸光度の上昇を一次式で近似し、その傾きを吸光度変化量（ΔＡＢＳ）とした。コントロールには、試料の代わりに緩衝液を加えたものを用いた。この吸光度変化量を用いて下記式より阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（ΔＡＢＳコントロール）−（ΔＡＢＳ試料））／（ΔＡＢＳコントロール）×１００
【００４７】
更に、上記阻害率をもとに、ＭＭＰ１活性を５０％阻害するときの濃度（ＩＣ５０値：５０％阻害濃度）を算出した。
【００４８】
（比較例２）
ウコン及びレモンのメタノール抽出物におけるＭＭＰ１阻害活性
〈試料の調製〉
山本漢方製薬社製の「紫ウコン」（商品名）、リアルネット社製の「ウコン」（商品名）及び市販のレモンの果皮０．１ｇにそれぞれメタノール１ｍＬを加え、３０分間振とうした。遠心後、上清５００μＬをとり、減圧乾固し、蒸留水１００μＬに再溶解したものを試料とした。
【００４９】
〈ＭＭＰ１阻害活性試験〉
実施例２と同様の方法で、ＩＣ５０値を算出した。
【００５０】
表２は、各酵母エキス並びにウコン及びレモンのＭＭＰ１阻害活性を、実施例２及び比較例２で算出したＩＣ５０値により評価した結果を示すものである。
【００５１】
【表２】
【００５２】
表２に示されるように、酵母エキスの熱水抽出物は、従来からＭＭＰ１活性阻害作用を有することが知られているウコン及びレモンのメタノール抽出物と比較して、非常に高いＭＭＰ１阻害活性を示すことが明らかになった。特に、サッポロビール社製の酵母エキス「ＲN７」（商品名）は、極めて高いＭＭＰ１阻害活性を有することが明らかになった。
【００５３】
（製造例１）
実施例１で製造した酵母エキスを用いて、表３に示す処方の化粧水を常法により調製した。
【００５４】
【表３】
【００５５】
（実施例３）
製造例１で調製した化粧水について、女性パネル１６名（年齢２０〜３９歳）に使用してもらい、使用感をアンケート形式で質問した。なお、対照として製造例１において酵母エキスを含まない（精製水の配合量を９０．０％とした）化粧水を同様に製造し、使用した。使用感について比較したところ、１６名中１１名が、酵母エキスを含む化粧水の方が好ましいとした。好ましい理由は、肌のコンディションに関わる「しっとり感」、「ハリ」等であった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により提供されるＭＭＰ阻害剤は、化粧品、トイレタリー、オーラルケア製品、食品、飲料又は医薬品として好適に用いられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母エキスからなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項２】
前記酵母エキスが、酵母自身が有する酵素で酵母を分解させて得られる酵母エキスである、請求項１に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項３】
前記酵母エキスが、分解酵素を添加して酵母を分解させて得られる酵母エキスである、請求項１に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項４】
前記酵母エキスがビール酵母エキス、パン酵母エキス及びトルラ酵母エキスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項５】
ゼラチナーゼＡ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項６】
コラゲナーゼ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項１】
酵母エキスからなる細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項２】
前記酵母エキスが、酵母自身が有する酵素で酵母を分解させて得られる酵母エキスである、請求項１に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項３】
前記酵母エキスが、分解酵素を添加して酵母を分解させて得られる酵母エキスである、請求項１に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項４】
前記酵母エキスがビール酵母エキス、パン酵母エキス及びトルラ酵母エキスからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項５】
ゼラチナーゼＡ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【請求項６】
コラゲナーゼ阻害剤である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス分解酵素阻害剤。
【公開番号】特開２００８−２６６１４６（Ｐ２００８−２６６１４６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０７３３７（Ｐ２００７−１０７３３７）
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
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