細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シート
【課題】細胞シートを、使用するその場で迅速に製造する方法の提供。
【解決手段】水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体。また、基板の表面を、温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップＳ１と、該膜形成ステップＳ１において形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップＳ２と、該抗体保持ステップＳ２においてポリマ膜に抗体を保持させた基板上に、上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、細胞を播種する播種ステップＳ３と、該播種ステップＳ３の後に、上限臨界溶解温度より高い温度、または、下限溶解臨界温度低い温度において、基板から細胞を剥離する剥離ステップＳ４とを備える細胞シート製造方法。
【解決手段】水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体。また、基板の表面を、温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップＳ１と、該膜形成ステップＳ１において形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップＳ２と、該抗体保持ステップＳ２においてポリマ膜に抗体を保持させた基板上に、上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、細胞を播種する播種ステップＳ３と、該播種ステップＳ３の後に、上限臨界溶解温度より高い温度、または、下限溶解臨界温度低い温度において、基板から細胞を剥離する剥離ステップＳ４とを備える細胞シート製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、水に対して臨界溶解温度を有するポリマによって表面が被覆された細胞培養支持体上で細胞を培養した後、温度を変化させてポリマを水に溶解させることにより、シート状に形成された細胞の集合体（以下、細胞シートという。）をそのままの形状で回収する細胞の培養方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−１９２１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の場合、細胞シートを製造するためには、細胞培養支持体上に細胞を播種した後に一定期間細胞を培養して細胞が十分に密な状態にまで増殖するのを待つ必要がある。したがって、患者の体内から採取した組織から細胞を分離し、分離した細胞から細胞シートをその場で製造して患者に移植したい場合には、細胞培養支持体上で細胞を培養する時間を十分に確保することができないために細胞シートを製造することが難しいという問題がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞シートを、使用するその場で迅速に製造することができる細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体を提供する。
【０００７】
本発明によれば、表面をポリマ膜で被覆した基板上に、上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上の温度において十分な数の細胞を播種した後、温度を上限臨界溶解温度より高くまたは下限臨界溶解温度より低くして温度応答性ポリマを水に溶解させることにより、基板上で平面状に集合体を形成した細胞をその形状を保持させたまま基板から剥離して細胞シートを製造することができる。
この場合に、抗体を介して細胞が迅速にポリマ膜に結合して集合体を形成するので培養が不要であり、その場で迅速に細胞シートを製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体であってもよい。
このようにすることで、脂肪組織から分離された、種類や状態が異なる細胞を含む脂肪由来細胞群を播種した場合に、脂肪由来細胞群の中からＣＤ９０を発現している治療効果の高い脂肪由来細胞を選択的にポリマ膜に結合させて、脂肪由来細胞群からなる治療効果の高い細胞シートを製造することができる。
また、上記発明においては、前記ポリマ膜が、前記抗体をその表面に露出させていることが好ましい。
このようにすることで、細胞をより効率的にポリマ膜に結合させることができる。
【０００９】
また、本発明は、基板の表面を、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップと、該膜形成ステップにおいて形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップと、該抗体保持ステップにおいて前記ポリマ膜に前記抗体を保持させた前記基板上に、前記上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、前記細胞を播種する播種ステップと、該播種ステップの後に、前記上限臨界溶解温度より高い温度、または、前記下限溶解臨界温度低い温度において、前記基板から前記細胞を剥離する剥離ステップとを備える細胞シート製造方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、膜形成ステップにおいてポリマ膜が形成された基板上に播種ステップにおいて細胞を播種した後、剥離ステップで温度応答性ポリマを溶解させて細胞を集合体のまま基板上から剥離することにより細胞シートを製造することができる。この場合に、抗体保持ステップにおいてポリマ膜に保持させた抗体を介して細胞が迅速にポリマ膜に結合して集合体を形成するので、細胞を播種した後に培養する必要がなく、迅速に細胞シートを製造することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記細胞が、脂肪組織から分離された脂肪由来細胞群であり、前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体であってもよい。
また、上記発明においては、前記抗体保持ステップが、前記ポリマ膜の表面に前記抗体を保持させることが好ましい。
また、本発明は、上記いずれかに記載の細胞シート製造方法により製造された細胞シートを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞シートを、使用するその場で迅速に製造することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞シート製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の抗体保持ステップで製造された細胞支持体の全体構成図である。
【図３】図１の剥離ステップにおいて基板から剥離された細胞シートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の一実施形態に係る細胞支持体１、細胞シート製造方法および細胞シート１０について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞シート製造方法は、脂肪由来細胞群の細胞シート１０を製造する方法であり、図１に示されるように、基板２の表面を温度応答性ポリマＡで被覆する膜形成ステップＳ１と、ポリマ膜に抗ＣＤ９０抗体Ｂを保持させる抗体保持ステップＳ２と、基板２上に脂肪由来細胞群を播種する播種ステップＳ３と、基板２上でシート状になった脂肪由来細胞群を剥離する剥離ステップＳ４とを備えている。
【００１５】
膜形成ステップＳ１は、基板２と温度応答性ポリマＡまたは該温度応答性ポリマＡを構成するモノマを含む溶液とを接触させた状態で、これらに電子照射、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理を施す、または、有機重合反応させることによって行われる。これにより、温度応答性ポリマが基板表面に結合し、基板表面が温度応答性ポリマからなるポリマ膜により被覆される。膜形成ステップＳ１は、温度応答性ポリマを基板２上に塗布または物理的に吸着させることにより行われてもよい。
【００１６】
基板２は、その表面に温度応答性ポリマＡを安定に保持可能であればよく、通常細胞培養に使用されるガラス、ポリスチレンまたはポリメタクリレートなどのプラスチック、あるいは、セラミックス金属類などからなるものが用いられる。
【００１７】
温度応答性ポリマＡは、水に対して０〜８０℃、より好ましくは２０〜５０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有するものが用いられる。これにより、上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下の温度では、ポリマ膜が固相化して疎水性を呈し、細胞がポリマ膜上に接着しやすくなる。一方、上限臨界溶解温度より低いまたは下限臨界溶解温度より高い温度では、ポリマ膜が水に溶解して親水性を呈し、細胞がポリマ膜上に接着し難くなる。
【００１８】
温度応答性ポリマＡの上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が、０℃を下回るまたは８０℃を上回ると、後述する播種ステップＳ３または剥離ステップＳ４において細胞に与える影響が大きくなり好ましくない。
温度応答性ポリマＡとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（またはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、および、ビニルエーテル誘導体のうち、１種類以上をモノマとして重合したものが用いられる。
【００１９】
抗体保持ステップＳ２は、抗ＣＤ９０抗体Ｂを、水溶性のスペーサを介してポリマ膜と結合させることにより行われる。例えば、スペーサとしてビオチンＣとストレプトアビジンＤとを用い、抗ＣＤ９０抗体Ｂと温度応答性ポリマＡの両方をビオチン化し、ストレプトアビジンＤを介して温度応答性ポリマＡに抗ＣＤ９０抗体Ｂを結合させる。これにより、ポリマ膜が固相化した状態において抗ＣＤ９０抗体Ｂがポリマ膜内に埋もれてしまうことなくポリマ膜の表面に露出される。
【００２０】
以上の膜形成ステップＳ１と抗体保持ステップＳ２とにより、図２に示されるように、基板２の表面を被覆し抗ＣＤ９０抗体Ｂをその表面に保持したポリマ膜からなる、本実施形態に係る細胞支持体１が製造される。
【００２１】
播種ステップＳ３は、脂肪由来細胞群を、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度以上または上限臨界溶解温度以下の温度において、細胞支持体１で被覆された基板２上に播種することにより行われる。脂肪由来細胞群は、生体内から採取した脂肪組織を消化酵素で分解して得られた脂肪由来細胞群の懸濁液を遠心分離することにより、脂肪組織から分離される。分離された脂肪由来細胞群には、血管内皮細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、血球系の細胞、脂肪由来幹細胞などが含まれる。
【００２２】
分離された脂肪由来細胞群は、その場で培地や緩衝液などに懸濁されて基板２上に播種された後、例えば、数分〜数十分間、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度以上または上限臨界溶解温度以下に温度を保ったまま静置される。これにより、細胞は基板２上に沈降し、脂肪由来細胞群の中の細胞膜にＣＤ９０を発現している細胞が抗ＣＤ９０抗体Ｂを介して細胞支持体１の表面に結合する。このときに、細胞支持体１表面が細胞によって密に覆われるように十分な細胞数を含む脂肪由来細胞群を播種することにより、細胞支持体１上で密着状態となった細胞同士が互いに水平方向に接着し、脂肪由来細胞群からなるシート形状の集合体が形成される。
【００２３】
剥離ステップＳ４は、基板２の温度を、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度より低く、または上限臨界溶解温度より高くしてポリマ膜を周囲の水に溶解させ、細胞支持体１表面から細胞の集合体をシート形状のまま剥離することにより行われる。これにより、図３に示されるように、本実施形態に係る細胞シート１０が製造される。
【００２４】
このように、本実施形態によれば、抗ＣＤ９０抗体Ｂを介して細胞が効率良くポリマ膜に結合して細胞の集合体が迅速に形成される。したがって、従来細胞と細胞支持体１および細胞同士を自発的に接着させるために必要だった数日〜１週間程度の培養期間が不要となる。これにより、例えば、患者から採取した脂肪組織から脂肪由来細胞群を分離した後に、その脂肪由来細胞群をその場で十分に短い時間で細胞シートに製造して治療に使用するなど、使用するその場でも迅速に細胞シートを製造することができるという利点がある。
【００２５】
また、分離された脂肪由来細胞群には複数種類の細胞が含まれ、細胞の種類によって細胞支持体１への接着性が異なる。また、脂肪由来細胞群の中に残留した脂肪組織の残渣や血球などによって細胞の細胞支持体１への接着が阻害されやすい。しかしながら、特異性が高く結合力が強い抗体を用いることにより、各種の細胞を効率良く細胞支持体１に結合させることができるという利点がある。また、その抗体として抗ＣＤ９０抗体Ｂを採用することにより、脂肪由来細胞群に含まれる細胞のうち、治療効果の高いとされる細胞を選択的に細胞支持体１に結合させて脂肪由来細胞群の治療効果の高い細胞シート１０を製造することができるという利点がある。
【実施例】
【００２６】
次に、上述した実施形態に係る細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートの実施例について説明する。
膜形成ステップは、基板としてポリスチレン製のディッシュを用い、９９モル％のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ）と１モル％の２−カルボキシイソプロピルアクリルアミド（ＣＩＰＡＡｍ）とを含むモノマ溶液を収容したディッシュに電子線を照射することにより行った。
【００２７】
これにより、ＩＰＡＡｍとＣＩＰＡＡｍとをＩＰＡＡｍ：ＣＩＰＡＡｍ＝９９：１のモル比率で重合させて温度応答性ポリマを生成するとともに、該温度応答性ポリマのアミノ基側の末端をディッシュの底面に共有結合させ、底面上に固定されたポリマ膜を形成した。生成した温度応答性ポリマは、水に対して３２℃の下限臨界溶解温度を有した。
【００２８】
次に、抗体保持ステップは、温度応答性ポリマのカルボキシル基側の自由末端に抗ＣＤ９０抗体を結合させることにより行った。具体的には、ディッシュ内に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を添加した５−（ビオチンアミド）−ペンチルアミンの溶液を収容し、２５℃で１６時間反応させることにより、温度応答性ポリマの自由末端のカルボキシル基にビオチンを結合させた。
【００２９】
次に、ディッシュ内の溶液をストレプトアビジンの溶液に交換し、２５℃で１．５時間反応させることにより、ビオチンにストレプトアビジンを結合させた。次に、ディッシュ内の溶液を、予めビオチン化した抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１．５時間反応させることにより、ストレプトアビジンに抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
【００３０】
また、抗体保持ステップとして、上述のビオチンとストレプトアビジンを用いた固定法に代えて、以下の２種類の固定法を用いて抗ＣＤ９０抗体を温度応答性ポリマに結合させた。
１つ目の固定法は、温度応答性ポリマと抗ＣＤ９０抗体とを結合させるリンカとしてポリエチレンングリコール（ＰＥＧ）を用いた方法である。すなわち、ディッシュ内に、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを添加した溶液を入れ、２５℃で１６時間反応させることにより、ディッシュ表面上の温度応答性ポリマの側鎖のカルボキシル基を活性化させた。
【００３１】
次に、ディッシュ内の溶液を、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基を有するＰＥＧの溶液に交換し、３７℃で１６時間反応させることにより、活性化したカルボキシル基にＰＥＧを結合させた。次に、ディッシュ内の溶液をＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、ＰＥＧ末端のカルボキシル基を活性化させた。次に、ディシュ内の溶液を抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、ＰＥＧ末端の活性化カルボキシル基に抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
【００３２】
２つ目の固定法は、温度応答性ポリマに抗ＣＤ９０抗体を直接結合させる方法である。すなわち、ディッシュ内に、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを添加した溶液を入れ、２５℃で１６時間反応させることにより、ディッシュ表面上の温度応答性ポリマの側鎖のカルボキシル基を活性化させた。次に、ディッシュ内の溶液を、抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、温度応答性ポリマの自由末端に抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
以上の３種類の固定法を用いて、その表面に抗ＣＤ９０抗体を露出させた状態で保持したポリマ膜からなる、本実施例に係る細胞支持体を製造した。
【００３３】
播種ステップは、本実施例に係る細胞支持体によって底面を被覆したディッシュ内に３７℃で十分な細胞数の脂肪由来細胞群を播種することにより行った。播種後、ディッシュを３７℃で３０分間静置した。これにより、脂肪由来細胞群をディッシュ内で沈降させ、細胞膜にＣＤ９０抗体を発現している細胞をポリマ膜上の抗ＣＤ９０抗体に結合させるとともに、底面上で平面方向に密着状態となった細胞を互いに接着させて脂肪由来細胞群のシート形状の集合体を形成した。
【００３４】
剥離ステップは、ディッシュの温度を２０℃まで下げてポリマ膜を十分に水に溶解させてから、細胞の集合体をシート状のまま剥離することにより行った。これにより、本実施例に係る細胞シートを得た。
【００３５】
このように、本実施例に係る細胞支持体および細胞シート製造方法によれば、脂肪由来細胞群をディッシュ内に播種した後に十分に短い時間ディッシュを静置するだけで細胞をシート状の集合体に形成することが可能であり、従来の細胞シートの製造方法に比べて飛躍的に製造に要する時間を短縮することができた。
【符号の説明】
【００３６】
１ 細胞支持体
２ 基板
１０ 細胞シート
Ａ 温度応答性ポリマ
Ｂ 抗ＣＤ９０抗体
Ｃ ビオチン
Ｄ ストレプトアビジン
Ｓ１ 膜形成ステップ
Ｓ２ 抗体保持ステップ
Ｓ３ 播種ステップ
Ｓ４ 剥離ステップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、水に対して臨界溶解温度を有するポリマによって表面が被覆された細胞培養支持体上で細胞を培養した後、温度を変化させてポリマを水に溶解させることにより、シート状に形成された細胞の集合体（以下、細胞シートという。）をそのままの形状で回収する細胞の培養方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−１９２１３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の場合、細胞シートを製造するためには、細胞培養支持体上に細胞を播種した後に一定期間細胞を培養して細胞が十分に密な状態にまで増殖するのを待つ必要がある。したがって、患者の体内から採取した組織から細胞を分離し、分離した細胞から細胞シートをその場で製造して患者に移植したい場合には、細胞培養支持体上で細胞を培養する時間を十分に確保することができないために細胞シートを製造することが難しいという問題がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞シートを、使用するその場で迅速に製造することができる細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体を提供する。
【０００７】
本発明によれば、表面をポリマ膜で被覆した基板上に、上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上の温度において十分な数の細胞を播種した後、温度を上限臨界溶解温度より高くまたは下限臨界溶解温度より低くして温度応答性ポリマを水に溶解させることにより、基板上で平面状に集合体を形成した細胞をその形状を保持させたまま基板から剥離して細胞シートを製造することができる。
この場合に、抗体を介して細胞が迅速にポリマ膜に結合して集合体を形成するので培養が不要であり、その場で迅速に細胞シートを製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体であってもよい。
このようにすることで、脂肪組織から分離された、種類や状態が異なる細胞を含む脂肪由来細胞群を播種した場合に、脂肪由来細胞群の中からＣＤ９０を発現している治療効果の高い脂肪由来細胞を選択的にポリマ膜に結合させて、脂肪由来細胞群からなる治療効果の高い細胞シートを製造することができる。
また、上記発明においては、前記ポリマ膜が、前記抗体をその表面に露出させていることが好ましい。
このようにすることで、細胞をより効率的にポリマ膜に結合させることができる。
【０００９】
また、本発明は、基板の表面を、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップと、該膜形成ステップにおいて形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップと、該抗体保持ステップにおいて前記ポリマ膜に前記抗体を保持させた前記基板上に、前記上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、前記細胞を播種する播種ステップと、該播種ステップの後に、前記上限臨界溶解温度より高い温度、または、前記下限溶解臨界温度低い温度において、前記基板から前記細胞を剥離する剥離ステップとを備える細胞シート製造方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、膜形成ステップにおいてポリマ膜が形成された基板上に播種ステップにおいて細胞を播種した後、剥離ステップで温度応答性ポリマを溶解させて細胞を集合体のまま基板上から剥離することにより細胞シートを製造することができる。この場合に、抗体保持ステップにおいてポリマ膜に保持させた抗体を介して細胞が迅速にポリマ膜に結合して集合体を形成するので、細胞を播種した後に培養する必要がなく、迅速に細胞シートを製造することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記細胞が、脂肪組織から分離された脂肪由来細胞群であり、前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体であってもよい。
また、上記発明においては、前記抗体保持ステップが、前記ポリマ膜の表面に前記抗体を保持させることが好ましい。
また、本発明は、上記いずれかに記載の細胞シート製造方法により製造された細胞シートを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、細胞シートを、使用するその場で迅速に製造することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞シート製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の抗体保持ステップで製造された細胞支持体の全体構成図である。
【図３】図１の剥離ステップにおいて基板から剥離された細胞シートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明の一実施形態に係る細胞支持体１、細胞シート製造方法および細胞シート１０について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞シート製造方法は、脂肪由来細胞群の細胞シート１０を製造する方法であり、図１に示されるように、基板２の表面を温度応答性ポリマＡで被覆する膜形成ステップＳ１と、ポリマ膜に抗ＣＤ９０抗体Ｂを保持させる抗体保持ステップＳ２と、基板２上に脂肪由来細胞群を播種する播種ステップＳ３と、基板２上でシート状になった脂肪由来細胞群を剥離する剥離ステップＳ４とを備えている。
【００１５】
膜形成ステップＳ１は、基板２と温度応答性ポリマＡまたは該温度応答性ポリマＡを構成するモノマを含む溶液とを接触させた状態で、これらに電子照射、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理を施す、または、有機重合反応させることによって行われる。これにより、温度応答性ポリマが基板表面に結合し、基板表面が温度応答性ポリマからなるポリマ膜により被覆される。膜形成ステップＳ１は、温度応答性ポリマを基板２上に塗布または物理的に吸着させることにより行われてもよい。
【００１６】
基板２は、その表面に温度応答性ポリマＡを安定に保持可能であればよく、通常細胞培養に使用されるガラス、ポリスチレンまたはポリメタクリレートなどのプラスチック、あるいは、セラミックス金属類などからなるものが用いられる。
【００１７】
温度応答性ポリマＡは、水に対して０〜８０℃、より好ましくは２０〜５０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有するものが用いられる。これにより、上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下の温度では、ポリマ膜が固相化して疎水性を呈し、細胞がポリマ膜上に接着しやすくなる。一方、上限臨界溶解温度より低いまたは下限臨界溶解温度より高い温度では、ポリマ膜が水に溶解して親水性を呈し、細胞がポリマ膜上に接着し難くなる。
【００１８】
温度応答性ポリマＡの上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が、０℃を下回るまたは８０℃を上回ると、後述する播種ステップＳ３または剥離ステップＳ４において細胞に与える影響が大きくなり好ましくない。
温度応答性ポリマＡとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（またはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、および、ビニルエーテル誘導体のうち、１種類以上をモノマとして重合したものが用いられる。
【００１９】
抗体保持ステップＳ２は、抗ＣＤ９０抗体Ｂを、水溶性のスペーサを介してポリマ膜と結合させることにより行われる。例えば、スペーサとしてビオチンＣとストレプトアビジンＤとを用い、抗ＣＤ９０抗体Ｂと温度応答性ポリマＡの両方をビオチン化し、ストレプトアビジンＤを介して温度応答性ポリマＡに抗ＣＤ９０抗体Ｂを結合させる。これにより、ポリマ膜が固相化した状態において抗ＣＤ９０抗体Ｂがポリマ膜内に埋もれてしまうことなくポリマ膜の表面に露出される。
【００２０】
以上の膜形成ステップＳ１と抗体保持ステップＳ２とにより、図２に示されるように、基板２の表面を被覆し抗ＣＤ９０抗体Ｂをその表面に保持したポリマ膜からなる、本実施形態に係る細胞支持体１が製造される。
【００２１】
播種ステップＳ３は、脂肪由来細胞群を、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度以上または上限臨界溶解温度以下の温度において、細胞支持体１で被覆された基板２上に播種することにより行われる。脂肪由来細胞群は、生体内から採取した脂肪組織を消化酵素で分解して得られた脂肪由来細胞群の懸濁液を遠心分離することにより、脂肪組織から分離される。分離された脂肪由来細胞群には、血管内皮細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、血球系の細胞、脂肪由来幹細胞などが含まれる。
【００２２】
分離された脂肪由来細胞群は、その場で培地や緩衝液などに懸濁されて基板２上に播種された後、例えば、数分〜数十分間、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度以上または上限臨界溶解温度以下に温度を保ったまま静置される。これにより、細胞は基板２上に沈降し、脂肪由来細胞群の中の細胞膜にＣＤ９０を発現している細胞が抗ＣＤ９０抗体Ｂを介して細胞支持体１の表面に結合する。このときに、細胞支持体１表面が細胞によって密に覆われるように十分な細胞数を含む脂肪由来細胞群を播種することにより、細胞支持体１上で密着状態となった細胞同士が互いに水平方向に接着し、脂肪由来細胞群からなるシート形状の集合体が形成される。
【００２３】
剥離ステップＳ４は、基板２の温度を、温度応答性ポリマＡの下限臨界溶解温度より低く、または上限臨界溶解温度より高くしてポリマ膜を周囲の水に溶解させ、細胞支持体１表面から細胞の集合体をシート形状のまま剥離することにより行われる。これにより、図３に示されるように、本実施形態に係る細胞シート１０が製造される。
【００２４】
このように、本実施形態によれば、抗ＣＤ９０抗体Ｂを介して細胞が効率良くポリマ膜に結合して細胞の集合体が迅速に形成される。したがって、従来細胞と細胞支持体１および細胞同士を自発的に接着させるために必要だった数日〜１週間程度の培養期間が不要となる。これにより、例えば、患者から採取した脂肪組織から脂肪由来細胞群を分離した後に、その脂肪由来細胞群をその場で十分に短い時間で細胞シートに製造して治療に使用するなど、使用するその場でも迅速に細胞シートを製造することができるという利点がある。
【００２５】
また、分離された脂肪由来細胞群には複数種類の細胞が含まれ、細胞の種類によって細胞支持体１への接着性が異なる。また、脂肪由来細胞群の中に残留した脂肪組織の残渣や血球などによって細胞の細胞支持体１への接着が阻害されやすい。しかしながら、特異性が高く結合力が強い抗体を用いることにより、各種の細胞を効率良く細胞支持体１に結合させることができるという利点がある。また、その抗体として抗ＣＤ９０抗体Ｂを採用することにより、脂肪由来細胞群に含まれる細胞のうち、治療効果の高いとされる細胞を選択的に細胞支持体１に結合させて脂肪由来細胞群の治療効果の高い細胞シート１０を製造することができるという利点がある。
【実施例】
【００２６】
次に、上述した実施形態に係る細胞支持体、細胞シート製造方法および細胞シートの実施例について説明する。
膜形成ステップは、基板としてポリスチレン製のディッシュを用い、９９モル％のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ）と１モル％の２−カルボキシイソプロピルアクリルアミド（ＣＩＰＡＡｍ）とを含むモノマ溶液を収容したディッシュに電子線を照射することにより行った。
【００２７】
これにより、ＩＰＡＡｍとＣＩＰＡＡｍとをＩＰＡＡｍ：ＣＩＰＡＡｍ＝９９：１のモル比率で重合させて温度応答性ポリマを生成するとともに、該温度応答性ポリマのアミノ基側の末端をディッシュの底面に共有結合させ、底面上に固定されたポリマ膜を形成した。生成した温度応答性ポリマは、水に対して３２℃の下限臨界溶解温度を有した。
【００２８】
次に、抗体保持ステップは、温度応答性ポリマのカルボキシル基側の自由末端に抗ＣＤ９０抗体を結合させることにより行った。具体的には、ディッシュ内に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を添加した５−（ビオチンアミド）−ペンチルアミンの溶液を収容し、２５℃で１６時間反応させることにより、温度応答性ポリマの自由末端のカルボキシル基にビオチンを結合させた。
【００２９】
次に、ディッシュ内の溶液をストレプトアビジンの溶液に交換し、２５℃で１．５時間反応させることにより、ビオチンにストレプトアビジンを結合させた。次に、ディッシュ内の溶液を、予めビオチン化した抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１．５時間反応させることにより、ストレプトアビジンに抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
【００３０】
また、抗体保持ステップとして、上述のビオチンとストレプトアビジンを用いた固定法に代えて、以下の２種類の固定法を用いて抗ＣＤ９０抗体を温度応答性ポリマに結合させた。
１つ目の固定法は、温度応答性ポリマと抗ＣＤ９０抗体とを結合させるリンカとしてポリエチレンングリコール（ＰＥＧ）を用いた方法である。すなわち、ディッシュ内に、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを添加した溶液を入れ、２５℃で１６時間反応させることにより、ディッシュ表面上の温度応答性ポリマの側鎖のカルボキシル基を活性化させた。
【００３１】
次に、ディッシュ内の溶液を、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基を有するＰＥＧの溶液に交換し、３７℃で１６時間反応させることにより、活性化したカルボキシル基にＰＥＧを結合させた。次に、ディッシュ内の溶液をＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、ＰＥＧ末端のカルボキシル基を活性化させた。次に、ディシュ内の溶液を抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、ＰＥＧ末端の活性化カルボキシル基に抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
【００３２】
２つ目の固定法は、温度応答性ポリマに抗ＣＤ９０抗体を直接結合させる方法である。すなわち、ディッシュ内に、ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳを添加した溶液を入れ、２５℃で１６時間反応させることにより、ディッシュ表面上の温度応答性ポリマの側鎖のカルボキシル基を活性化させた。次に、ディッシュ内の溶液を、抗ＣＤ９０抗体の溶液に交換し、２５℃で１６時間反応させることにより、温度応答性ポリマの自由末端に抗ＣＤ９０抗体を結合させた。なお、各反応の後にはディッシュ内を緩衝液などで十分に洗浄して試薬を除去してから、次の反応用の溶液に交換した。
以上の３種類の固定法を用いて、その表面に抗ＣＤ９０抗体を露出させた状態で保持したポリマ膜からなる、本実施例に係る細胞支持体を製造した。
【００３３】
播種ステップは、本実施例に係る細胞支持体によって底面を被覆したディッシュ内に３７℃で十分な細胞数の脂肪由来細胞群を播種することにより行った。播種後、ディッシュを３７℃で３０分間静置した。これにより、脂肪由来細胞群をディッシュ内で沈降させ、細胞膜にＣＤ９０抗体を発現している細胞をポリマ膜上の抗ＣＤ９０抗体に結合させるとともに、底面上で平面方向に密着状態となった細胞を互いに接着させて脂肪由来細胞群のシート形状の集合体を形成した。
【００３４】
剥離ステップは、ディッシュの温度を２０℃まで下げてポリマ膜を十分に水に溶解させてから、細胞の集合体をシート状のまま剥離することにより行った。これにより、本実施例に係る細胞シートを得た。
【００３５】
このように、本実施例に係る細胞支持体および細胞シート製造方法によれば、脂肪由来細胞群をディッシュ内に播種した後に十分に短い時間ディッシュを静置するだけで細胞をシート状の集合体に形成することが可能であり、従来の細胞シートの製造方法に比べて飛躍的に製造に要する時間を短縮することができた。
【符号の説明】
【００３６】
１ 細胞支持体
２ 基板
１０ 細胞シート
Ａ 温度応答性ポリマ
Ｂ 抗ＣＤ９０抗体
Ｃ ビオチン
Ｄ ストレプトアビジン
Ｓ１ 膜形成ステップ
Ｓ２ 抗体保持ステップ
Ｓ３ 播種ステップ
Ｓ４ 剥離ステップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体。
【請求項２】
前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体である請求項１に記載の細胞支持体。
【請求項３】
前記ポリマ膜が、前記抗体をその表面に露出させている請求項１に記載の細胞支持体。
【請求項４】
基板の表面を、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップと、
該膜形成ステップにおいて形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップと、
該抗体保持ステップにおいて前記ポリマ膜に前記抗体を保持させた前記基板上に、前記上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、前記細胞を播種する播種ステップと、
該播種ステップの後に、前記上限臨界溶解温度より高い温度、または、前記下限溶解臨界温度低い温度において、前記基板から前記細胞を剥離する剥離ステップとを備える細胞シート製造方法。
【請求項５】
前記細胞が、脂肪組織から分離された脂肪由来細胞群であり、
前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体である請求項４に記載の細胞シート製造方法。
【請求項６】
前記抗体保持ステップが、前記ポリマ膜の表面に前記抗体を保持させる請求項４に記載の細胞シート製造方法。
【請求項７】
請求項４から請求項６のいずれかに記載の細胞シート製造方法により製造された細胞シート。
【請求項１】
水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマからなり、細胞に対する抗体を保持するポリマ膜を備える細胞支持体。
【請求項２】
前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体である請求項１に記載の細胞支持体。
【請求項３】
前記ポリマ膜が、前記抗体をその表面に露出させている請求項１に記載の細胞支持体。
【請求項４】
基板の表面を、水に対して０〜８０℃の上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマによって被覆することによりポリマ膜を形成する膜形成ステップと、
該膜形成ステップにおいて形成されたポリマ膜に、細胞に対する抗体を保持させる抗体保持ステップと、
該抗体保持ステップにおいて前記ポリマ膜に前記抗体を保持させた前記基板上に、前記上限臨界溶解温度以下または下限溶解臨界温度以上の温度で、前記細胞を播種する播種ステップと、
該播種ステップの後に、前記上限臨界溶解温度より高い温度、または、前記下限溶解臨界温度低い温度において、前記基板から前記細胞を剥離する剥離ステップとを備える細胞シート製造方法。
【請求項５】
前記細胞が、脂肪組織から分離された脂肪由来細胞群であり、
前記抗体が、抗ＣＤ９０抗体である請求項４に記載の細胞シート製造方法。
【請求項６】
前記抗体保持ステップが、前記ポリマ膜の表面に前記抗体を保持させる請求項４に記載の細胞シート製造方法。
【請求項７】
請求項４から請求項６のいずれかに記載の細胞シート製造方法により製造された細胞シート。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１０５５８７（Ｐ２０１２−１０５５８７Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５６８９６（Ｐ２０１０−２５６８９６）
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（５９１１７３１９８）学校法人東京女子医科大学 (48)
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【出願人】（５９１１７３１９８）学校法人東京女子医科大学 (48)
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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