細胞観察方法および走査型顕微鏡装置
【課題】刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察する。
【解決手段】光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させるケージドグルタミン酸および細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程ＳＡ１と、参照画像に対して刺激領域および観察領域を参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程ＳＡ２と、刺激領域にレーザ光を照射し、ケージドグルタミン酸により細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程ＳＡ３と、刺激工程ＳＡ３後に、観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて膜電位感受性色素を励起し、膜電位感受性色素から発せられる蛍光の光強度を検出して観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程ＳＡ４とを含む細胞観察方法を提供する。
【解決手段】光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させるケージドグルタミン酸および細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程ＳＡ１と、参照画像に対して刺激領域および観察領域を参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程ＳＡ２と、刺激領域にレーザ光を照射し、ケージドグルタミン酸により細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程ＳＡ３と、刺激工程ＳＡ３後に、観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて膜電位感受性色素を励起し、膜電位感受性色素から発せられる蛍光の光強度を検出して観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程ＳＡ４とを含む細胞観察方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞観察方法および走査型顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生細胞の膜電位活動を観察する方法が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。特許文献１に記載の膜電位の測定方法は、膜電位感受性色素により染色した生細胞に励起光を照射し、フォトダイオードアレイやＣＣＤ等の２次元光センサにより膜電位感受性色素の吸光反応または蛍光反応を撮影する。膜電位感受性色素の吸光強度または蛍光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、膜電位感受性色素の吸光強度または蛍光強度を測定することにより、間接的に細胞の膜電位活動を観察することができる。また、特許文献２に記載の多点同時計測方法は、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡とＣＣＤとを組み合わせて、速い膜電位応答を共焦点イメージ像として捕えることとしている。
【０００３】
ここで、生細胞の膜電位活動の観察においては、パッチクランプ等の刺入電極により細胞を電気刺激して膜電位変化を生じさせる方法が一般的に用いられている。しかしながら、刺入電極による細胞の電気刺激は、複数の細胞を刺激したい場合に試料に対して多数の電極を刺入しなければならず現実的ではない。また、刺激点を変更するには電極を他の位置に刺し直す必要があり、手間と時間がかかるうえに生細胞へのダメージとなってしまうというデメリットがある。
【０００４】
これに対し、細胞に刺激を与える方法として電極による電気刺激以外の方法も知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置は、ケージドコンパウンド試薬を使用して生細胞に刺激を与えることとしている。具体的には、特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置は、ガルバノミラー走査方式によってケージドコンパウンドに紫外レーザ光を照射することにより、ケージドコンパウンドから神経伝達物質を放出させて細胞の活動電位を誘発するようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１１５６９３号公報
【特許文献２】特開２００４−２１２１３２号公報
【特許文献３】特開平７−３３３５１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置では、膜電位のイメージングを行うには時間分解能が足りず、高い時間分解能で細胞の膜電位を測定することができないという不都合がある。このように、従来は、細胞への刺激と膜電位の測定について、それぞれ一方のみを高い空間自由度および時間分解能で行うことはできたが、これら両方を高い空間自由度および時間分解能で両立して行うことはできなかった。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができる細胞観察方法および走査型顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質および前記細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程と、該参照画像取得工程により取得された前記参照画像に対して、レーザ照射により前記細胞に刺激を与える刺激領域およびレーザ照射により前記膜電位感受性色素を励起する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程と、該領域指定工程により指定された前記刺激領域にレーザ光を照射し、前記生理活性物質により前記細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程と、前記観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて前記膜電位感受性色素を励起し、該膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して前記観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程とを含む細胞観察方法を提供する。
【０００９】
本発明によれば、参照画像取得工程により取得された生体試料の参照画像に対して刺激領域および観察領域を指定することで、刺激工程および観察画像取得工程により所望の細胞を簡易に刺激したりその観察画像を取得したりすることができる。また、観察領域を参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定することにより、観察画像取得工程において走査にかかる時間を短縮し迅速に観察領域を観察することができる。
【００１０】
この場合において、刺激工程において刺激領域の生理活性物質により細胞の膜電位活動が誘発されると、刺激領域から観察領域にその膜電位活動が伝播される。また、膜電位感受性色素の光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、観察領域に細胞の膜電位活動が伝播されると膜電位感受性色素の光強度が変化する。
【００１１】
したがって、膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して得られる観察領域の観察画像を観察すれば、刺激した部位（刺激領域）に生じた膜電位応答の伝播に伴う観察部位（観察領域）での膜電位の経時変化を間接的に観察することができる。これにより、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができる。
【００１２】
観察画像取得工程においては、観察領域に照射するレーザ光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させることとしてもよい。このようにすることで、３次元的に観察領域を観察することができ空間自由度の向上を図ることができる。なお、刺激工程と観察画像取得工程は、どちらの工程を先に始めてもよいし、両工程を同時に始めてもよい。
【００１３】
上記発明においては、前記領域指定工程がライン状の前記観察領域を指定することとしてもよい。
このように構成することで、立体状や平面状の観察領域を走査する場合と比較して走査範囲を一方向に制限することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記領域指定工程がポイント状の前記観察領域を指定することとしてもよい。
このように構成することで、ライン状の観察領域を走査する場合より走査範囲をさらに狭い範囲に制限することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記刺激工程による前記刺激領域へのレーザ照射と前記観察画像取得工程による前記観察領域へのレーザ照射を異なる光学系により行うこととしてもよい。
このように構成することで、刺激領域へのレーザ照射と観察領域へのレーザ照射を時間的および空間的に独立して制御することができる。したがって、細胞の刺激と細胞の観察との時間的および空間的な自由度を高めることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記観察画像取得工程が、同一の前記観察領域の観察画像を時間間隔をあけて複数回取得することとしてもよい。
このように構成することで、時間経過とともに細胞の膜電位上昇部位が移動する様子を観察することができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、前記観察画像取得工程により取得された前記観察画像の光強度を各前記観察パターンの前記取得タイミングごとに加算して平均を算出する平均算出工程を含むこととしてもよい。
このように構成することで、平均算出工程により時間経過ごとの観察画像における光強度のノイズ成分を低減し、刺激に対する細胞の膜電位応答の時系列変化を高Ｓ／Ｎで観察することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを、前記細胞を刺激してから最初の前記観察画像を取得するまでのタイミングを１回の前記走査にかかる時間よりも短い時間間隔で前記観察パターンごとにずらして複数回行うこととしてもよい。
このように構成することで、１回の走査にかかる時間よりも速い膜電位の変化を補完して検出することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記観察画像取得工程により取得された複数の前記観察画像に基づいて、前記観察領域の各点における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程を含むこととしてもよい。
このように構成することで、観察領域の各点における光強度の時間変化に基づいて、観察領域の各点における細胞の膜電位応答の時系列変化を間接的に簡易に観察することができる。
【００２０】
本発明は、生体試料に照射する光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記生体試料の３次元的な参照画像および観察画像を取得可能な観察光学系と、前記生体試料に光を照射して細胞を刺激する刺激光学系と、前記観察光学系により取得された前記参照画像に対して、前記刺激光学系により前記細胞を刺激する刺激領域および前記観察画像を取得する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定部と、該領域指定部により指定された細胞の刺激領域に対する前記刺激光学系による刺激後に、前記領域指定部により指定された細胞の観察領域を前記観察光学系により複数回にわたって走査して異なる時刻に取得された複数の観察画像から、走査経路上の位置と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性を算出する位置特性算出部と、該位置特性算出部により算出された複数の光強度の位置特性から走査経路上の所望の位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【００２１】
本発明によれば、観察光学系により取得された生体試料の３次元的な参照画像上で領域指定部により指定された刺激領域の細胞に対し刺激光学系により刺激が与えられ、また、同様に領域指定部により指定された観察領域の３次元的な観察画像が観察光学系により取得される。
【００２２】
ここで、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質と細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料に対し、領域指定部により刺激領域および観察領域を指定し、刺激光学系により刺激領域に光を照射し生理活性物質により細胞の膜電位活動を誘発させると、刺激領域から観察領域にその膜電位活動が伝播される。また、膜電位感受性色素の光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、観察領域に細胞の膜電位活動が伝播されると膜電位感受性色素の光強度が変化する。したがって、刺激光学系による刺激領域の細胞の刺激後に観察光学系により観察領域の観察画像を取得すれば、刺激領域における刺激に対する細胞の膜電位の変化を観察領域における光強度の変化に反映させて間接的に観察することができる。
【００２３】
また、刺激光学系による刺激領域の細胞の刺激後に観察光学系により観察領域を複数回にわたって走査して異なる時刻に取得される複数の観察画像から、位置特性算出部により走査経路上の所望の位置における光強度の位置特性を算出し、時間特性算出部によりその位置における光強度の時間変化を算出することで、刺激に対する細胞の膜電位応答の時間変化を高い空間自由度および時間分解能で簡易に観察することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞観察方法のフローチャートである。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図３】参照画像取得工程により取得される参照画像を示す図である。
【図４】領域指定工程により参照画像に刺激領域および観察領域が指定された様子を示す図である。
【図５】観察画像取得工程により観察画像を複数回取得する動作を示す図である。
【図６】各観察画像における取得タイミングごとのライン方向と蛍光強度との関係を示す図である。
【図７】観察領域に膜電位の経時変化を観察するための各点を示した図である。
【図８】各観察画像における取得タイミングごとのライン方向と蛍光強度との関係を示す図である。
【図９】細胞を刺激してからの時間と観察画像の蛍光強度との関係を示した図である。
【図１０】（ａ）は本実施形態の第１の変形例に係る細胞観察方法による各観察パターンを示す図であり、（ｂ）は平均算出工程により（ａ）を各観察パターンの平均に置き換えた図である。
【図１１】本実施形態の第２の変形例に係る細胞観察方法による各観察パターンを示す図である。
【図１２】本実施形態の第３の変形例に係る細胞観察方法により、参照画像に刺激領域および観察領域が指定された様子を示す図である。
【図１３】図１２の観察領域の拡大図である。
【図１４】（ａ）は刺激から１２ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｂ）は刺激から１４ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｃ）は刺激から１６ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｄ）は刺激から１８ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｅ）は刺激から２０ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｆ）は刺激から２２ｍｓ経過後の観察画像を示す図である。
【図１５】（ａ）は観察領域に観察位置（Ａ点〜Ｄ点）を指定した様子を示し、（ｂ）は（ａ）の各観察位置での膜電位の経時変化を示した図である。
【図１６】本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図１７】本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
まず、本実施形態に係る細胞観察方法は、図１のフローチャートに示されるように、標本（生体試料）の参照画像を取得する参照画像取得工程ＳＡ１と、取得された参照画像上で刺激領域および観察領域を指定する領域指定工程ＳＡ２と、指定された刺激領域にレーザ光を照射し細胞を刺激する刺激工程ＳＡ３と、刺激工程ＳＡ３後に観察領域にレーザ光を照射し細胞から発せられる蛍光（シグナル光）を検出して観察画像を取得する観察画像取得工程ＳＡ４と、取得された複数の観察画像に基づいて観察領域の各位置における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程ＳＡ５とを含んでいる。
【００２７】
この細胞観察方法により細胞の刺激および細胞の観察を行う場合は、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質と、細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を予め標本に導入しておく。
【００２８】
参照画像取得工程ＳＡ１は、参照画像として標本の３次元的な蛍光画像を取得するようになっている（プリスキャン）。
領域指定工程ＳＡ２は、参照画像の視野範囲より小さい範囲で３次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域として指定するようになっている。刺激領域および観察領域としては、例えば、立体状の領域、平面状の領域、ポイント状の領域（点領域）、または、ライン状の領域（線領域）等が挙げられる。
【００２９】
刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４は、刺激領域および観察領域に照射するレーザ光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させるようになっている。刺激工程ＳＡ３は、例えば、刺激領域に対して所定のタイミングで所定の波長の刺激用ＵＶレーザ光を照射するようになっている。また、観察画像取得工程ＳＡ４は、同一の観察領域の観察画像を所定の時間間隔をあけて所定の取得タイミングで複数回取得するようになっている。
【００３０】
次に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）１について図２を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、例えば、図２に示すように、レーザ光を発する光源ユニット１０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を標本Ａ上で走査するスキャナユニット２０と、スキャナユニット２０により走査されるレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る蛍光を集光する照射ユニット３０と、標本Ａからの蛍光を検出する検出ユニット４０と、これらの各ユニットを制御する制御部５１を有するコンピュータ５０とを備えている。
【００３１】
光源ユニット１０は、標本Ａに照射して生理活性物質により細胞を刺激する刺激光（レーザ光）を発する刺激用光源ユニット１２と、標本Ａに照射して膜電位感受性色素を励起する励起光（レーザ光）を発する観察用光源ユニット１６と、刺激用光源ユニット１２からの刺激光の光路と観察用光源ユニット１６からの励起光の光路とを合成する光路合成ユニット１９とを備えている。
【００３２】
刺激用光源ユニット１２は、波長３５１ｎｍのＵＶレーザ１１と、ＵＶレーザ１１から発せられる刺激光の光強度を０％〜１００％まで変調可能な音響光学素子１３とを備えている。音響光学素子１３は、コンピュータ５０の制御部５１の制御により、刺激光の透過率を０％にして刺激光を遮断したり所定の光強度の刺激光を透過したりするようになっている。
【００３３】
観察用光源ユニット１６は、波長５１５ｎｍのアルゴンレーザ１５と、アルゴンレーザ１５から発せられる励起光の光強度を０％〜１００％まで変調可能な音響光学素子１７とを備えている。音響光学素子１７は、制御部５１の制御により、励起光の透過率を０％にして励起光を遮断したり所定の光強度の励起光を透過したりするようになっている。
【００３４】
光路合成ユニット１９は、波長３５１ｎｍの刺激光を反射し、波長５１５ｎｍの励起光を透過する特性を有している。
スキャナユニット２０は、制御部５１の制御により、標本Ａに照射するレーザ光（刺激光および励起光）のスポット位置が光軸に交差する方向、すなわち、Ｘ、Ｙの２次元方向に走査することができるようになっている。
【００３５】
照射ユニット３０は、スキャナユニット２０から射出されたレーザ光を中間像として結像させる瞳投影レンズ３１と、瞳投影レンズ３１により結像された中間像を反射するミラー３３と、ミラー３３により反射された中間像からの光束を集光し平行光にする結像レンズ３５と、結像レンズ３５により平行光とされたレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａの照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズ３７と、対物レンズ３７から射出されるレーザ光の光軸方向（Ｚ方向）に標本Ａを移動可能な準焦部３９とを備えている。
【００３６】
準焦部３９は、標本Ａが載置されるステージ３８を備えている。この準焦部３９は、制御部５１の制御により、標本Ａに集光するレーザ光の集光面Ｆが光軸方向に対して任意の位置になるようにステージ３８を移動させることができるようになっている。
【００３７】
検出ユニット４０は、光路合成ユニット１９により合成されたレーザ光を透過する一方、標本Ａで発生し照射ユニット３０およびスキャナユニット２０を経由して戻る蛍光を反射するダイクロイックミラー４１と、ダイクロイックミラー４１により反射された蛍光から不必要な波長の光を除去する波長分離フィルタ４３と、波長分離フィルタ４３から射出された蛍光を集光する集光レンズ４５と、集光レンズ４５により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール４７と、共焦点ピンホールを通過した蛍光を検出する光検出器４９とを備えている。
【００３８】
ダイクロイックミラー４１は、波長３５１ｎｍの刺激光および波長５１５ｎｍの励起光を透過する一方、励起光の波長より長波長側の光を反射する特性を有している。
光検出器４９は、検出した蛍光を電気信号に変換してコンピュータ５０に出力するようになっている。
【００３９】
コンピュータ５０は、制御部５１の他、光検出器４９から出力される出力信号に基づき参照画像および観察画像を構築する画像構築部５３と、観察光学系５により取得された参照画像上に刺激領域および観察領域を指定する領域指定部５５と、観察光学系５により取得された観察画像から走査経路上の所定の観察位置と光強度との関係を示す光強度の位置特性を算出する位置特性算出部５７と、位置特性算出部５７により算出された光強度の位置特性から観察位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部５９とを備えている。これら画像構築部５３、領域指定部５５、位置特性算出部５７および時間特性算出部５９は制御部５１を介して各種処理を行うようになっている。
【００４０】
このように構成された刺激用光学ユニット１２、スキャナユニット２０および照射ユニット３０は刺激光学系３を構成し、標本Ａの細胞を刺激することができるようになっている。また、観察用光学ユニット１６、スキャナユニット２０、照射ユニット３０、検出ユニット４０、および、コンピュータ５０は観察光学系５を構成し、標本Ａの参照画像および観察画像を取得することができるようになっている。
【００４１】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法において用いる試薬について説明する。
本実施形態においては、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質として、例えば、生理活性物質であるグルタミン酸に、グルタミン酸の生理活性を不活化させる側鎖（ケージドコンパウンド）がついたケージドグルタミン酸を用いる。このケージドグルタミン酸は、普段は不活性であるが、紫外線を照射するとそのコンパウンドが開裂しグルタミン酸が解離して生理活性を誘導する。また、膜電位感受性色素として、例えば、膜電位感受性色素ＲＨ−７９５を用いる。
【００４２】
ケージドグルタミン酸が注入された生体組織にＵＶレーザ光を照射すると、照射された部位のケージドグルタミン酸のケージドコンパウンドが開裂し、活性化したグルタミン酸が放出される。放出されたグルタミン酸はその近傍にある神経細胞のシナプスに対して興奮性伝達物質として作用し、シナプス後電位を引き起こす。シナプス後電位が蓄積されてシナプス発火閾値を超えると、シナプスは活動電位を発生する。したがって、ケージドグルタミン酸を導入した標本Ａの刺激領域に刺激光（ＵＶレーザ光）を照射すると、刺激領域の細胞に興奮性の刺激を与え細胞の活動電位を誘発することができる。
【００４３】
一方、膜電位感受性色素ＲＨ−７９５（以下、単に「膜電位感受性色素」という。）は、最大励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長７１２ｎｍの蛍光色素である。この膜電位感受性色素は細胞の膜電位の大きさによって蛍光強度が最大で１％程度変化する特性を有している。また、膜電位感受性色素は、細胞が興奮性の刺激を受けて脱分極が起こり細胞の膜電位が上昇するほど蛍光の光強度も大きくなる。
【００４４】
以下、このように構成された細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１の作用について説明する。
まず、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により標本Ａの細胞を刺激する場合について説明する。
細胞を刺激する場合は刺激光学系３により細胞を刺激する。具体的には、まず、ＵＶレーザ１１から波長３５１ｎｍの刺激光を射出し、音響光学素子１３を通過させて出射パワーを変調する。音響光学素子１３により変調された刺激光は、光路合成ユニット１９により反射された後、ダイクロイックミラー４１を透過してスキャナユニット２０によりＸＹの２次元方向に偏向される。
【００４５】
スキャナユニット２０により偏向された刺激光は、瞳投影レンズ３１で中間像を結ぶように集光され、ミラー３３で反射される。ミラー３３により反射された刺激光は、結像レンズ３５で再び集光されて平行光になり、対物レンズ３７により標本Ａ上の集光面Ｆに集光される。
【００４６】
この場合において、制御部５１により準焦部３９を制御し、標本Ａ上の集光面Ｆが光軸方向に対して任意の位置になるように対物レンズ３７と標本Ａとの距離を調整することにより、所定のタイミングで標本Ａ上のＸＹＺの３次元空間の任意の領域に刺激光を照射することができる。
【００４７】
標本Ａの任意の領域に刺激光が照射されると、照射された部位のケージドグルタミン酸のケージドコンパウンドが開裂してグルタミン酸が放出され、近傍にある神経細胞の興奮性活動電位が誘発される。これにより、所望の細胞を刺激することができる。
【００４８】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により標本Ａの細胞を観察する場合について説明する。
細胞を観察する場合は、観察光学系５により標本Ａの観察画像を取得する。具体的には、まず、アルゴンレーザ１５から波長５１５ｎｍの励起光を射出し、音響光学素子１７を通過させて出射パワーを変調する。音響光学素子１７より変調された励起光は、光路合成ユニット１９およびダイクロイックミラー４１を透過した後、スキャナユニット２０によりＸＹの２次元方向に偏向される。
【００４９】
スキャナユニット２０により偏向された励起光は、瞳投影レンズ３１により中間像を結ぶように集光され、ミラー３３で反射される。ミラー３３により反射された励起光は、結像レンズ３５により再び集光されて平行光となり、対物レンズ３７により標本Ａ上の集光面Ｆに集光される。そして、刺激光と同様に、制御部５１により準焦部３９を制御し、所定のタイミングで標本Ａ上のＸＹＺの３次元空間の任意の領域に励起光を照射することができる。
【００５０】
この場合において、スキャナユニット２０により標本Ａの集光面Ｆ上で励起光が走査されると、膜電位感受性色素が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ３７により集光されて励起光と同じ光路を逆方向に進み、結像レンズ３５、ミラー３３、瞳投影レンズ３１、スキャナユニット２０を介してダイクロイックミラー４１により反射される。
【００５１】
ダイクロイックミラー４１により反射された蛍光は波長分離フィルタ４３に入射し、特定の波長の光が選択的に透過される。そして、波長分離フィルタ４３を透過した光は集光レンズ４５により集光されて共焦点ピンホール４７に入射し、標本Ａの集光面Ｆからの光のみが選択的に通過して光検出器４９により検出される。
【００５２】
光検出器４９により光が検出されるとその出力信号がＡ/Ｄインターフェース（図示略）によりスキャナユニット２０の走査制御に同期したデジタル信号に変換され、コンピュータ５０に取り込まれる。コンピュータ５０に取り込まれたデジタル信号は、画像構築部５３によりスキャナユニット２０の走査位置に対応してディスプレイ（図示略）に表示される。これにより、標本Ａの集光面Ｆにおける蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）が取得される。
【００５３】
例えば、同一の観察領域の蛍光画像を繰り返し取得するように制御部５１にプログラムすることにより、標本Ａの観察領域の蛍光強度の経時変化を観察することができる。この場合において、観察領域に存在する細胞の膜電位に変化が生じていない場合には、蛍光強度の経時変化は生じない。一方、刺激光の照射により生じたシナプスの興奮活動が観察領域の細胞に伝播されて細胞の膜電位が上昇した場合は、蛍光強度の経時変化にもその膜電位の上昇が反映され、蛍光強度の上昇変化となって観察される。
【００５４】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により、刺激による標本Ａの膜電位の変化を観察する方法について説明する。
まず、参照画像取得工程ＳＡ１において、観察光学系５により、図３に示すような標本Ａの参照画像を取得する（プリスキャン）。ここでは、参照画像をＸＹの平面画像として説明する。符合Ｃは細胞を示している。
【００５５】
続いて、領域指定工程ＳＡ２において、領域指定部５５により、参照画像に対して刺激領域と観察領域の２つのＲＯＩを指定する。これら２つのＲＯＩは、スキャナユニット２０の走査および準焦部３９の作動により、ＸＹＺの３次元空間で任意の立体図形として指定することができる。ＲＯＩの次元が高くそのボリューム（容積、面積、長さ）が大きいほど、レーザ光でＲＯＩを満遍なく走査するのに要する時間が長くなる。逆に、ＲＯＩの次元が低いほど、また、同じ次元であればボリュームが小さいほど、レーザ光でＲＯＩを満遍なく走査するのに要する時間が短くなる。
【００５６】
したがって、ＲＯＩは必要十分な範囲でできるだけ次元を低くし、また、ボリュームを小さくすることで、刺激と観察の時間分解能を最大限向上することができる。本実施形態においては、例えば、図４に示すように、参照画像上にポイント状の刺激領域Ｐとライン状の観察領域Ｌを指定する。
【００５７】
ポイント状の刺激領域Ｐは、例えば、神経細胞の樹状突起の単一スパインを刺激する場合などにおいて適用することが考えられる。また、ライン状の観察領域Ｌは、例えば、神経細胞の軸索に沿うように指定することで、細胞の活動電位が軸索を伝播していく様子を観察することができる。
【００５８】
次に、刺激工程ＳＡ３において、刺激光学系３により、刺激領域Ｐに対して所定のタイミングで刺激光を照射する（ポイントスキャン）。また、観察画像取得工程ＳＡ４において、観察光学系５により、刺激領域Ｐに対する刺激光の照射後に観察領域Ｌにおいて走査（ラインスキャン）を繰り返し実行し、観察領域Ｌの観察画像を所定の時間間隔をあけて所定の取得タイミングで複数回取得する。
【００５９】
例えば、観察領域Ｌにおける１ラインのラインスキャンに要する時間を１ｍｓとすると、図５に示すように、刺激光の照射から１ｍｓ後に１回目のラインスキャン（Ｌ−１）を行い、刺激光の照射から２ｍｓ後に２回目のラインスキャン（Ｌ−２）を行う。以下、１ｍｓ間隔の取得タイミングで同様の動作が繰り返される。
【００６０】
なお、観察領域Ｌのラインスキャンは刺激光を照射する前から行ってもよいが、ラインスキャンによる励起光の照射は膜電位感受性色素の蛍光退色を引き起こすため、観察に不必要な刺激前はラインスキャンをしない方が、すなわち、励起光の照射をしない方が望ましい。
【００６１】
各取得タイミングにより検出される蛍光の光強度は、ラインスキャンの走査制御に同期して光検出器４９からコンピュータ５０に取り込まれ、画像構築部５３により観察領域Ｌにおけるラインの始点から終点までの各走査位置に対する蛍光強度のプロットとしてディスプレイに表示される。
【００６２】
例えば、刺激光の照射から１ｍｓ後に観察領域Ｌの始点で活動電位、すなわち、膜電位の上昇が発生し、観察領域Ｌの終点に向けて６ｍｓかけて移動伝播していくとすると、各取得タイミングで観察される蛍光強度のプロットは図６のＬｉｎｅ１〜Ｌｉｎｅ６のようになる。
【００６３】
次に、時間変化算出工程ＳＡ５において、観察領域Ｌの各点における光強度の時間変化が算出される。観察者が観察領域Ｌの各位置における膜電位の経時変化を求める場合、それを表すプロットは時間軸に対する蛍光強度のプロットである。図６は観察位置に対する蛍光強度のプロットであるので、これを時間軸に対する蛍光強度のプロットに変換する方法を図７および図８を用いて説明する。
【００６４】
例えば、図７に示すように、膜電位の経時変化を観察する走査経路上の観察位置をＡ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点とすると、位置特性算出部５７の作動により、各観察位置Ａ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性が算出される。この時点では、算出された光強度の位置特性をディスプレイに表示しなくてもよいし、あるいは、図８に示すように算出された光強度の位置特性をディスプレイに表示することとしてもよい。図８はＡ点〜Ｄ点の位置をプロットの横軸に図示している。
【００６５】
次に、時間特性算出部５９の作動により、位置特性算出部５７により算出された光強度の位置特性から各観察位置Ａ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点における光強度の時間変化が算出される。例えば、Ａ点の光強度の経時変化を算出すると、図８のＡ点におけるＬｉｎｅ１〜Ｌｉｎｅ６の蛍光強度を、横軸に時間（ｍｓ）を取り縦軸にそれらの蛍光強度を取ったものでプロットし直すことができる。
【００６６】
厳密には、観察領域Ｌの始点から終点まで励起光を走査している間にも時間は経過しているため、時間特性算出部５９により、１回目のラインスキャン開始から励起光の走査点がＡ点に至るまでの時間を計算し、Ａ点での蛍光検出を行った時間を忠実に時間軸上にとる。
【００６７】
また、２回目のラインスキャン〜６回目のラインスキャンについても同様に忠実にＡ点での蛍光検出を行った時間を計算し、それぞれの時間での蛍光強度をプロットする。これにより、図９に示すような膜電位の経時変化をあらわすプロットが求められる。このプロットをディスプレイに表示することで、観察者はＡ点における膜電位の経時変化を知ることができる。
【００６８】
なお、本実施形態においてはＡ点〜Ｄ点の４点のみの膜電位の経時変化をプロットする過程を説明したが、これを観察領域Ｌの全ての位置において行えば、観察領域Ｌの全ての画素点における膜電位の経時変化プロットを求めることができる。
【００６９】
以上説明したように本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１によれば、参照画像の視野範囲より小さい範囲の刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌを指定することで、観察画像取得工程ＳＡ４において走査にかかる時間を短縮し３次元的に迅速に観察領域Ｌを観察することができる。また、ケージドグルタミン酸および膜電位感受性色素を用いて観察領域Ｌの観察画像を観察することにより、刺激した刺激領域Ｐの細胞Ｃの膜電位の経時変化を間接的に観察することができる。これにより、刺激に対する膜電位応答の時間変化を高い空間自由度および時間分解能で簡易に観察することができる。
【００７０】
本実施形態においては、刺激工程後に観察画像取得工程を始めることとしたが、これに代えて、例えば、観察画像取得工程を先に始めておいてから刺激工程を行うこととしてもよいし、刺激工程と観察画像取得工程とを同時に始めることとしてもよい。
【００７１】
また、本実施形態においては、参照画像取得工程ＳＡ１において３次元的な蛍光画像を取得し、領域指定工程ＳＡ２において３次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域と指定し、刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４によりこれらの３次元的な刺激領域および観察領域に刺激光を照射したり励起光を照射したりすることとしたが、これに代えて、参照画像取得工程ＳＡ１において２次元的な蛍光画像を取得し、領域指定工程ＳＡ２において２次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域と指定し、刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４によりこれらの２次元的な刺激領域および観察領域に刺激光を照射したり励起光を照射したりすることとしてもよい。
【００７２】
また、本実施形態においては、参照画像上に刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌをそれぞれ１箇所ずつ指定することとしたが、これに代えて、例えば、参照画像上に刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌをそれぞれ複数箇所指定し、各刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌを時系列で走査することとしてもよい。例えば、参照画像上に刺激領域Ｐを１箇所指定し、観察領域Ｐを複数箇所指定することとしてもよいし、また、参照画像上に刺激領域Ｐを複数箇所指定し、観察領域Ｐも複数箇所指定することとしてもよい。
【００７３】
また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、第１の変形例として、標本Ａの刺激に対する膜電位の変化に繰り返し再現性が認められるような場合には、観察画像取得工程ＳＡ４により複数回取得された観察画像の光強度の平均を算出する平均算出工程を含むこととしてもよい。
【００７４】
この場合、刺激工程ＳＡ３後に観察画像取得工程ＳＡ４が所定の取得タイミングで観察画像を複数回取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、平均算出工程により、観察画像取得工程ＳＡ４により取得された複数の観察画像の光強度を各観察パターンの取得タイミングごとに加算して平均を算出することとすればよい。
【００７５】
具体的には、図１０（ａ）に示すように、刺激領域Ｐへの刺激後、所定の時間間隔を空けた後、観察領域Ｌにて一定のタイミングでラインスキャンを複数回取得する一連の動作を１トライアルとし、この１回のトライアル終了後、細胞が再び活性化できるだけの時間間隔をあけた後、次のトライアルを実施するということを繰り返し行う。
【００７６】
そして、平均算出工程により、各トライアルの１回目のラインスキャン（Ｌ１−１，Ｌ２−１，Ｌ３−１・・）の蛍光強度を加算平均し、図１０（ｂ）に示すように、刺激後１回目のラインスキャンの蛍光強度分布ＡｖｅＬ−１を算出する。同様に、各トライアルの２回目のラインスキャン（Ｌ１−２，Ｌ２−２，Ｌ３−２・・）の蛍光強度についても加算平均し、刺激後２回目のラインスキャンの蛍光強度分布ＡｖｅＬ−２を算出する。以下同様にして、膜電位の経時変化プロットを各トライアルを加算平均した強度で置き換えることとすればよい。
【００７７】
このようにすることで、平均算出工程により時間経過ごとの観察画像における光強度のノイズ成分を低減し、精度のよい膜電位の経時変化プロットを得ることができる。これにより、刺激に対する細胞の膜電位応答の時系列変化を高Ｓ／Ｎで観察することができる。
【００７８】
また、第２の変形例としては、例えば、刺激工程ＳＡ３後に観察画像取得工程ＳＡ４が所定の取得タイミングで観察画像を複数回取得する観察パターンを、細胞を刺激してから最初の観察画像を取得するまでのタイミングを１回の走査にかかる時間よりも短い時間間隔で観察パターンごとにずらして複数回行うこととしてもよい。
【００７９】
具体的には、図１１に示すように、刺激してからラインスキャンを開始するまでのタイミングをラインスキャン１回ごとにかかる時間より細かい時間刻みで少しずつずらしながら観察画像を取得し、それらの結果を刺激からラインスキャン開始までのタイミングの順に並べたものを蛍光強度の時系列変化として置き変えることとすればよい。
このようにすることで、１回の走査にかかる時間よりも速い膜電位の変化を補完して検出することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００８０】
また、本実施形態においては、領域指定工程ＳＡ２においてポイント状の刺激領域Ｐとライン状の観察領域Ｌを指定することとしたが、例えば、第３の変形例として、図１２および図１３に示すように、領域指定工程ＳＡ２において、領域指定部５５により、ある細胞Ｃの細胞体を模る形状の刺激領域Ｍと、正方形（クリップスキャン領域）の観察領域Ｓを指定することとしてもよい。図１３は、図１２の観察領域Ｓを拡大した画像である。
【００８１】
図１４（ａ）は、図１３に示す観察領域Ｓにおいて、刺激領域Ｍへの刺激から１２ｍｓ後に観察領域Ｓの樹状突起に膜電位の上昇が伝播してきた様子を示している。刺激から１２ｍｓ後に観察領域Ｓまで伝播してきた膜電位の上昇部位は、図１４（ｂ）〜（ｆ）に示すように、刺激から２２ｍｓかけて観察領域Ｓ内の細胞Ｃの細胞膜を伝播していく。本変形例においては、観察領域Ｓの１回の画像取得にかかる時間を２ｍｓとしている。
【００８２】
図１５（ａ）は観察領域ＳにおいてＡ点〜Ｄ点の４つの観察位置を指定した様子を示し、図１５（ｂ）は各観察位置での膜電位の経時変化を示した図である。例えば、図１５（ａ）に示すＡ点での膜電位の経時変化は、図１４（ａ）〜（ｆ）に示すような刺激から１２ｍｓ後〜２２ｍｓ後までの各蛍光画像で励起光がＡ点を走査している時間を時間特性算出部５９により算出し、刺激光を照射した時間を時間原点として時間軸上にそれらの輝度をプロットし直すことで、図１５（ｂ）に示すように再現することができる。点Ｂ〜点Ｄについても同様である。ここでは観察領域の蛍光画像取得にかかる時間を２ｍｓとしている。
【００８３】
なお、本変形例において、刺激に対する膜電位の伝播の様子に繰り返し再現性がある場合には、複数トライアルの加算平均を取ることとしてもよい。このようにすることで、得られる膜電位経時変化の精度を向上することができる。また、刺激開始から蛍光画像の取得開始までのタイミングを１回の走査にかかる時間より細かい時間刻みで少しずつずらしながら蛍光画像を取得し、コンピュータ５０でそれらの蛍光画像を時間順に並べ替えることとしてもよい。このようにすることで、１回の走査にかかる時間より細かい時間分解能で膜電位の経時変化を測定することが可能となる。
【００８４】
また、第４の変形例としては、例えば、蛍光画像を表示したディスプレイに使用者が蛍光画像内のある位置を指定すると、指定した位置の膜電位の経時変化プロットがディスプレイ上に表示されるようにコンピュータ５０の制御部５１にプログラムしてもよい。このようにすることで、使用者がより直感的に標本Ａの各位置とその各位置での膜電位経時変化の様子とを認識することができる。
【００８５】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る細胞観察方法は、刺激工程ＳＡ３による刺激領域へのレーザ照射と観察画像取得工程ＳＡ４による観察領域へのレーザ照射とを異なる光学系により行う点で第１の実施形態と異なる。
以下、第１の実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８６】
まず、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）１００は、図１６に示すように、励起光を走査するスキャナユニット２０とは別に刺激光を走査するスキャナユニット１２０を備え、さらに、スキャナユニット１２０により走査される刺激光を中間像として結像させる瞳投影レンズ１３１と、瞳投影レンズ１３１により結像した中間像からの光の光路と励起光の光路とを合成するダイクロイックミラー１３３とを備えている。
【００８７】
本実施形態に係る細胞観察方法においては、ＵＶレーザ１１から射出された刺激光は、制御部５１の制御により、音響光学素子１３において遮断／透過の制御を受けた後、スキャナユニット１２０により標本Ａの集光面Ｆ上でＸＹの２次元方向に走査される。そして、スキャナユニット１２０により偏向された刺激光は、瞳投影レンズ１３１により中間像を結像するよう集光され、ダイクロイックミラー１３３で励起光の光路と合成された後、結像レンズ３５により平行光にもどされて対物レンズ３７により標本Ａの集光面Ｆに焦点を結ぶよう集光される。以下、第１の実施形態と同様に、標本Ａにおいて発生した蛍光が検出器４９により検出され、コンピュータ５０で処理されて膜電位の経時変化として観察される。
【００８８】
以上説明したように、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１００によれば、刺激光と励起光とを互いに独立した別々のスキャナユニット２０、１２０により走査することで、刺激領域へのレーザ照射と観察領域へのレーザ照射を時間的および空間的に独立して制御することができる。したがって、第１の実施形態では、細胞を刺激した後、スキャナユニット２０の観察領域に偏向する動作が完了してからでないと観察領域に励起光を照射することができなかったが、本実施形態では、スキャナユニット２０、１２０により、例えば、刺激領域に刺激光を照射しながら同時に観察領域に励起光を照射することができる。これにより、細胞の刺激と細胞の観察との時間的および空間的な自由度を高めることができる。
【００８９】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る細胞観察方法は、図１７に示すように、多光子励起観察が可能な走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）２００を用いて細胞観察を行う点で第１の実施形態および第２の実施形態と異なる。
以下、また、第１の実施形態または第２の実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１，１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００９０】
まず、本実施形態に係る細胞観察方法において用いる試薬について説明する。
本実施形態においては、例えば、生理活性物質としてケージドグルタミン酸を用い、膜電位感受性色素として蛍光色素ＦＭ４−６４を用いる。蛍光色素ＦＭ４−６４（以下、単に「蛍光色素」という。）は、例えば、レンズにより赤外超短パルスレーザを集光したような光子密度が非常に高い環境におかれると、非線形光学効果により、入射した光の波長の半分の波長をもつ第二高調波（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、以下「ＳＨＧ」という。）シグナル光を出すことが知られている。
【００９１】
この蛍光色素（蛍光色素ＦＭ４−６４）が発するＳＨＧシグナル光の光強度は細胞膜の膜電位に依存して変化する。例えば、細胞膜の膜電位が１００ｍＶ変化した場合には、ＳＨＧシグナル光の光強度は約１０％程度変化する。一般的な膜電位感受性色素により発せられる蛍光の光強度は、細胞の膜電位が１００ｍＶ変化した場合に０．１％〜１％変化することに比べると、非常に大きな光強度の変化率である。
【００９２】
本実施形態に係る細胞観察方法においては、このＳＨＧシグナル光の膜電位感受性による光強度の変化を膜電位の光学測定法として用いることで、従来の数倍〜数十倍の信号強度で測定することが可能になる。したがって、ケージドグルタミン酸と蛍光色素を導入した標本Ｂに対して超短パルスレーザ光源を用いてＳＨＧシグナル光を発生させることにより、細胞の膜電位の経時変化をＳＨＧシグナル光の経時変化として間接的に観察することができる。
【００９３】
次に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００について説明する。
走査型レーザ顕微鏡２００は、アルゴンレーザ１５に代えて赤外パルスレーザ光源２１５を備えている。赤外パルスレーザ光源２１５は、波長９５０ｎｍのフェムト秒パルスレーザ光源である。また、光検出器４９が標本Ｂの透過側に配置され、標本Ｂと光検出器４９との間には、標本Ｂにおいて発生したＳＨＧシグナル光を集光する集光レンズ２４２、２４５と、目的のＳＨＧシグナル光の波長だけを選択的に透過させる波長選択フィルタ２４３とが配置されている。
【００９４】
以下、このように構成された細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００の作用について説明する。
刺激工程ＳＡ２において、ＵＶレーザ１１から射出された刺激光は、標本Ｂの集光面Ｆ上で刺激領域に所定のタイミングで照射される。一方、観察画像取得工程ＳＡ４において、赤外パルスレーザ光源２１５から射出された励起用赤外パルスレーザ光は、標本Ｂの集光面Ｆ上で焦点を結んだポイントがＸＹの２次元方向に走査される。
【００９５】
ここで、標本Ｂの集光面Ｆ上で集光した赤外パルスレーザが時間的、空間的に非常に高い光子密度を有することにより、標本Ｂに導入された蛍光色素に対して非線形光学効果をもたらす。これにより、蛍光色素から波長４７５ｎｍのＳＨＧシグナル光Ｓが、赤外パルスレーザが進行する方向と同方向に発生する。標本Ｂ上でＳＨＧ光が発生する部位は、赤外パルスレーザ光の空間密度が非常に高くなる対物レンズ３７の集光面Ｆ上である。
【００９６】
このＳＨＧシグナル光は集光レンズ２４２により集光され、波長分離フィルタ２４３でＳＨＧ光以外の波長の光が遮断されて集光レンズ２４５により検出器４９の検出部分に集光される。これにより、検出器４９において、標本Ｂの集光面Ｆで発生したＳＨＧ光シグナルのみを検出することができる。したがって、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００によれば、検出器４９の手前に共焦点ピンホールがなくても擬似的に共焦点観察を行っていることになる。
【００９７】
光検出器４９によりＳＨＧシグナル光が検出されるとその出力信号がＡ/Ｄインターフェースによりスキャナユニット２０の走査制御に同期したデジタル信号に変換され、コンピュータ５０に取り込まれる。コンピュータ５０に取り込まれたデジタル信号は、画像構築部５３によりスキャナユニット２０の走査位置に対応してディスプレイに表示される。これにより、標本Ｂの集光面ＦにおけるＳＨＧ光画像（ＳＨＧ光輝度の２次元分布）が取得される。
【００９８】
このようにして取得されたＳＨＧ光画像は、試料Ｂの集光面Ｆ上に存在する細胞の膜電位に依存してＳＨＧ光強度が変化するので、ＵＶレーザ１１による標本Ｂの刺激後、ＳＨＧ光画像を繰り返し取得するように制御部５１をプログラムしておくと、取得されたＳＨＧ光画像のある位置の光強度の経時変化は、標本Ｂのその位置における膜電位の経時変化を反映したものとして置き変えて観察することができる。
【００９９】
以上説明したように、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００によれば、膜電位依存の光強度変化媒体として膜電位変化に対する光強度変化の大きいＳＨＧ光シグナルを用いることにより、高Ｓ／Ｎで膜電位の経時変化を観察することができる。
【０１００】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および各変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【０１０１】
また、例えば、上記各実施形態および各変形例においては、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質としてケージドグルタミン酸を例示して説明したが、これに代えて、例えば、チャネルロドプシン２のような光感受性を有するタンパク質を遺伝子導入した標本を用いてもよい。遺伝子導入によりチャネルロドプシン２を神経細胞に発現させ、そこに波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの光を照射すると、チャネルロドプシン２は陽イオンを透過するようになり、神経細胞の脱分極（興奮性の膜電位の上昇）をもたらす。
【０１０２】
したがって、光源として波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの刺激用レーザ光を発するレーザ光源を用い、チャネルロドプシン２を一様に発現させた生細胞標本に４００ｎｍ〜５００ｎｍの刺激用レーザ光を照射すると、刺激用レーザ光を照射した位置にだけ膜電位の上昇をもたらす刺激を細胞に加えることができる。
【０１０３】
また、上記各実施形態および各変形例においては、ケージドコンパウンドにグルタミン酸を結びつけたケージドグルタミン酸に代えて、例えば、生理活性を誘導するアミノ酸、環状ヌクレオチド（ｃＮＭＰｓ)、または、カルシウム等をケージドコンパウンドに結びつけたケージド試薬を採用することとしてもよい。
また、膜電位感受性色素としては、ＲＨ−７９５以外にも、例えば、色素分子構造、励起波長、蛍光波長、または、光強度変化の度合いなどが異なる多種多様な色素が多数開発されている。本発明の励起・観察が可能なものであれば、観察の目的や標本に応じて適切な色素を採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【０１０４】
１，１００ 走査型顕微鏡装置
３ 刺激光学系
５ 観察光学系
５５ 領域指定部
５７ 位置特性算出部
５９ 時間特性算出部
２００ 走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）
ＳＡ１ 参照画像取得工程
ＳＡ２ 領域指定工程
ＳＡ３ 刺激工程
ＳＡ４ 観察画像取得工程
ＳＡ５ 時間変化算出工程
Ｃ 細胞
Ｌ，Ｓ 観察領域
Ｐ，Ｍ 刺激領域
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞観察方法および走査型顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生細胞の膜電位活動を観察する方法が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。特許文献１に記載の膜電位の測定方法は、膜電位感受性色素により染色した生細胞に励起光を照射し、フォトダイオードアレイやＣＣＤ等の２次元光センサにより膜電位感受性色素の吸光反応または蛍光反応を撮影する。膜電位感受性色素の吸光強度または蛍光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、膜電位感受性色素の吸光強度または蛍光強度を測定することにより、間接的に細胞の膜電位活動を観察することができる。また、特許文献２に記載の多点同時計測方法は、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡とＣＣＤとを組み合わせて、速い膜電位応答を共焦点イメージ像として捕えることとしている。
【０００３】
ここで、生細胞の膜電位活動の観察においては、パッチクランプ等の刺入電極により細胞を電気刺激して膜電位変化を生じさせる方法が一般的に用いられている。しかしながら、刺入電極による細胞の電気刺激は、複数の細胞を刺激したい場合に試料に対して多数の電極を刺入しなければならず現実的ではない。また、刺激点を変更するには電極を他の位置に刺し直す必要があり、手間と時間がかかるうえに生細胞へのダメージとなってしまうというデメリットがある。
【０００４】
これに対し、細胞に刺激を与える方法として電極による電気刺激以外の方法も知られている（例えば、特許文献３参照。）。特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置は、ケージドコンパウンド試薬を使用して生細胞に刺激を与えることとしている。具体的には、特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置は、ガルバノミラー走査方式によってケージドコンパウンドに紫外レーザ光を照射することにより、ケージドコンパウンドから神経伝達物質を放出させて細胞の活動電位を誘発するようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１１５６９３号公報
【特許文献２】特開２００４−２１２１３２号公報
【特許文献３】特開平７−３３３５１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３に記載の走査型共焦点顕微鏡装置では、膜電位のイメージングを行うには時間分解能が足りず、高い時間分解能で細胞の膜電位を測定することができないという不都合がある。このように、従来は、細胞への刺激と膜電位の測定について、それぞれ一方のみを高い空間自由度および時間分解能で行うことはできたが、これら両方を高い空間自由度および時間分解能で両立して行うことはできなかった。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができる細胞観察方法および走査型顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質および前記細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程と、該参照画像取得工程により取得された前記参照画像に対して、レーザ照射により前記細胞に刺激を与える刺激領域およびレーザ照射により前記膜電位感受性色素を励起する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程と、該領域指定工程により指定された前記刺激領域にレーザ光を照射し、前記生理活性物質により前記細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程と、前記観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて前記膜電位感受性色素を励起し、該膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して前記観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程とを含む細胞観察方法を提供する。
【０００９】
本発明によれば、参照画像取得工程により取得された生体試料の参照画像に対して刺激領域および観察領域を指定することで、刺激工程および観察画像取得工程により所望の細胞を簡易に刺激したりその観察画像を取得したりすることができる。また、観察領域を参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定することにより、観察画像取得工程において走査にかかる時間を短縮し迅速に観察領域を観察することができる。
【００１０】
この場合において、刺激工程において刺激領域の生理活性物質により細胞の膜電位活動が誘発されると、刺激領域から観察領域にその膜電位活動が伝播される。また、膜電位感受性色素の光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、観察領域に細胞の膜電位活動が伝播されると膜電位感受性色素の光強度が変化する。
【００１１】
したがって、膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して得られる観察領域の観察画像を観察すれば、刺激した部位（刺激領域）に生じた膜電位応答の伝播に伴う観察部位（観察領域）での膜電位の経時変化を間接的に観察することができる。これにより、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができる。
【００１２】
観察画像取得工程においては、観察領域に照射するレーザ光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させることとしてもよい。このようにすることで、３次元的に観察領域を観察することができ空間自由度の向上を図ることができる。なお、刺激工程と観察画像取得工程は、どちらの工程を先に始めてもよいし、両工程を同時に始めてもよい。
【００１３】
上記発明においては、前記領域指定工程がライン状の前記観察領域を指定することとしてもよい。
このように構成することで、立体状や平面状の観察領域を走査する場合と比較して走査範囲を一方向に制限することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記領域指定工程がポイント状の前記観察領域を指定することとしてもよい。
このように構成することで、ライン状の観察領域を走査する場合より走査範囲をさらに狭い範囲に制限することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記刺激工程による前記刺激領域へのレーザ照射と前記観察画像取得工程による前記観察領域へのレーザ照射を異なる光学系により行うこととしてもよい。
このように構成することで、刺激領域へのレーザ照射と観察領域へのレーザ照射を時間的および空間的に独立して制御することができる。したがって、細胞の刺激と細胞の観察との時間的および空間的な自由度を高めることができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記観察画像取得工程が、同一の前記観察領域の観察画像を時間間隔をあけて複数回取得することとしてもよい。
このように構成することで、時間経過とともに細胞の膜電位上昇部位が移動する様子を観察することができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、前記観察画像取得工程により取得された前記観察画像の光強度を各前記観察パターンの前記取得タイミングごとに加算して平均を算出する平均算出工程を含むこととしてもよい。
このように構成することで、平均算出工程により時間経過ごとの観察画像における光強度のノイズ成分を低減し、刺激に対する細胞の膜電位応答の時系列変化を高Ｓ／Ｎで観察することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを、前記細胞を刺激してから最初の前記観察画像を取得するまでのタイミングを１回の前記走査にかかる時間よりも短い時間間隔で前記観察パターンごとにずらして複数回行うこととしてもよい。
このように構成することで、１回の走査にかかる時間よりも速い膜電位の変化を補完して検出することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記観察画像取得工程により取得された複数の前記観察画像に基づいて、前記観察領域の各点における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程を含むこととしてもよい。
このように構成することで、観察領域の各点における光強度の時間変化に基づいて、観察領域の各点における細胞の膜電位応答の時系列変化を間接的に簡易に観察することができる。
【００２０】
本発明は、生体試料に照射する光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記生体試料の３次元的な参照画像および観察画像を取得可能な観察光学系と、前記生体試料に光を照射して細胞を刺激する刺激光学系と、前記観察光学系により取得された前記参照画像に対して、前記刺激光学系により前記細胞を刺激する刺激領域および前記観察画像を取得する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定部と、該領域指定部により指定された細胞の刺激領域に対する前記刺激光学系による刺激後に、前記領域指定部により指定された細胞の観察領域を前記観察光学系により複数回にわたって走査して異なる時刻に取得された複数の観察画像から、走査経路上の位置と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性を算出する位置特性算出部と、該位置特性算出部により算出された複数の光強度の位置特性から走査経路上の所望の位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部とを備える走査型顕微鏡装置を提供する。
【００２１】
本発明によれば、観察光学系により取得された生体試料の３次元的な参照画像上で領域指定部により指定された刺激領域の細胞に対し刺激光学系により刺激が与えられ、また、同様に領域指定部により指定された観察領域の３次元的な観察画像が観察光学系により取得される。
【００２２】
ここで、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質と細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料に対し、領域指定部により刺激領域および観察領域を指定し、刺激光学系により刺激領域に光を照射し生理活性物質により細胞の膜電位活動を誘発させると、刺激領域から観察領域にその膜電位活動が伝播される。また、膜電位感受性色素の光強度は膜電位感受性色素が付着している細胞の膜電位に依存して変化するので、観察領域に細胞の膜電位活動が伝播されると膜電位感受性色素の光強度が変化する。したがって、刺激光学系による刺激領域の細胞の刺激後に観察光学系により観察領域の観察画像を取得すれば、刺激領域における刺激に対する細胞の膜電位の変化を観察領域における光強度の変化に反映させて間接的に観察することができる。
【００２３】
また、刺激光学系による刺激領域の細胞の刺激後に観察光学系により観察領域を複数回にわたって走査して異なる時刻に取得される複数の観察画像から、位置特性算出部により走査経路上の所望の位置における光強度の位置特性を算出し、時間特性算出部によりその位置における光強度の時間変化を算出することで、刺激に対する細胞の膜電位応答の時間変化を高い空間自由度および時間分解能で簡易に観察することができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、刺激に対する細胞の膜電位応答を高い空間自由度および時間分解能で観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞観察方法のフローチャートである。
【図２】本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図３】参照画像取得工程により取得される参照画像を示す図である。
【図４】領域指定工程により参照画像に刺激領域および観察領域が指定された様子を示す図である。
【図５】観察画像取得工程により観察画像を複数回取得する動作を示す図である。
【図６】各観察画像における取得タイミングごとのライン方向と蛍光強度との関係を示す図である。
【図７】観察領域に膜電位の経時変化を観察するための各点を示した図である。
【図８】各観察画像における取得タイミングごとのライン方向と蛍光強度との関係を示す図である。
【図９】細胞を刺激してからの時間と観察画像の蛍光強度との関係を示した図である。
【図１０】（ａ）は本実施形態の第１の変形例に係る細胞観察方法による各観察パターンを示す図であり、（ｂ）は平均算出工程により（ａ）を各観察パターンの平均に置き換えた図である。
【図１１】本実施形態の第２の変形例に係る細胞観察方法による各観察パターンを示す図である。
【図１２】本実施形態の第３の変形例に係る細胞観察方法により、参照画像に刺激領域および観察領域が指定された様子を示す図である。
【図１３】図１２の観察領域の拡大図である。
【図１４】（ａ）は刺激から１２ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｂ）は刺激から１４ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｃ）は刺激から１６ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｄ）は刺激から１８ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｅ）は刺激から２０ｍｓ経過後の観察画像を示し、（ｆ）は刺激から２２ｍｓ経過後の観察画像を示す図である。
【図１５】（ａ）は観察領域に観察位置（Ａ点〜Ｄ点）を指定した様子を示し、（ｂ）は（ａ）の各観察位置での膜電位の経時変化を示した図である。
【図１６】本発明の第２の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【図１７】本発明の第３の実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
まず、本実施形態に係る細胞観察方法は、図１のフローチャートに示されるように、標本（生体試料）の参照画像を取得する参照画像取得工程ＳＡ１と、取得された参照画像上で刺激領域および観察領域を指定する領域指定工程ＳＡ２と、指定された刺激領域にレーザ光を照射し細胞を刺激する刺激工程ＳＡ３と、刺激工程ＳＡ３後に観察領域にレーザ光を照射し細胞から発せられる蛍光（シグナル光）を検出して観察画像を取得する観察画像取得工程ＳＡ４と、取得された複数の観察画像に基づいて観察領域の各位置における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程ＳＡ５とを含んでいる。
【００２７】
この細胞観察方法により細胞の刺激および細胞の観察を行う場合は、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質と、細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を予め標本に導入しておく。
【００２８】
参照画像取得工程ＳＡ１は、参照画像として標本の３次元的な蛍光画像を取得するようになっている（プリスキャン）。
領域指定工程ＳＡ２は、参照画像の視野範囲より小さい範囲で３次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域として指定するようになっている。刺激領域および観察領域としては、例えば、立体状の領域、平面状の領域、ポイント状の領域（点領域）、または、ライン状の領域（線領域）等が挙げられる。
【００２９】
刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４は、刺激領域および観察領域に照射するレーザ光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させるようになっている。刺激工程ＳＡ３は、例えば、刺激領域に対して所定のタイミングで所定の波長の刺激用ＵＶレーザ光を照射するようになっている。また、観察画像取得工程ＳＡ４は、同一の観察領域の観察画像を所定の時間間隔をあけて所定の取得タイミングで複数回取得するようになっている。
【００３０】
次に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）１について図２を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡１は、例えば、図２に示すように、レーザ光を発する光源ユニット１０と、光源ユニット１０から発せられたレーザ光を標本Ａ上で走査するスキャナユニット２０と、スキャナユニット２０により走査されるレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る蛍光を集光する照射ユニット３０と、標本Ａからの蛍光を検出する検出ユニット４０と、これらの各ユニットを制御する制御部５１を有するコンピュータ５０とを備えている。
【００３１】
光源ユニット１０は、標本Ａに照射して生理活性物質により細胞を刺激する刺激光（レーザ光）を発する刺激用光源ユニット１２と、標本Ａに照射して膜電位感受性色素を励起する励起光（レーザ光）を発する観察用光源ユニット１６と、刺激用光源ユニット１２からの刺激光の光路と観察用光源ユニット１６からの励起光の光路とを合成する光路合成ユニット１９とを備えている。
【００３２】
刺激用光源ユニット１２は、波長３５１ｎｍのＵＶレーザ１１と、ＵＶレーザ１１から発せられる刺激光の光強度を０％〜１００％まで変調可能な音響光学素子１３とを備えている。音響光学素子１３は、コンピュータ５０の制御部５１の制御により、刺激光の透過率を０％にして刺激光を遮断したり所定の光強度の刺激光を透過したりするようになっている。
【００３３】
観察用光源ユニット１６は、波長５１５ｎｍのアルゴンレーザ１５と、アルゴンレーザ１５から発せられる励起光の光強度を０％〜１００％まで変調可能な音響光学素子１７とを備えている。音響光学素子１７は、制御部５１の制御により、励起光の透過率を０％にして励起光を遮断したり所定の光強度の励起光を透過したりするようになっている。
【００３４】
光路合成ユニット１９は、波長３５１ｎｍの刺激光を反射し、波長５１５ｎｍの励起光を透過する特性を有している。
スキャナユニット２０は、制御部５１の制御により、標本Ａに照射するレーザ光（刺激光および励起光）のスポット位置が光軸に交差する方向、すなわち、Ｘ、Ｙの２次元方向に走査することができるようになっている。
【００３５】
照射ユニット３０は、スキャナユニット２０から射出されたレーザ光を中間像として結像させる瞳投影レンズ３１と、瞳投影レンズ３１により結像された中間像を反射するミラー３３と、ミラー３３により反射された中間像からの光束を集光し平行光にする結像レンズ３５と、結像レンズ３５により平行光とされたレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａの照射位置において発生した蛍光を集光する対物レンズ３７と、対物レンズ３７から射出されるレーザ光の光軸方向（Ｚ方向）に標本Ａを移動可能な準焦部３９とを備えている。
【００３６】
準焦部３９は、標本Ａが載置されるステージ３８を備えている。この準焦部３９は、制御部５１の制御により、標本Ａに集光するレーザ光の集光面Ｆが光軸方向に対して任意の位置になるようにステージ３８を移動させることができるようになっている。
【００３７】
検出ユニット４０は、光路合成ユニット１９により合成されたレーザ光を透過する一方、標本Ａで発生し照射ユニット３０およびスキャナユニット２０を経由して戻る蛍光を反射するダイクロイックミラー４１と、ダイクロイックミラー４１により反射された蛍光から不必要な波長の光を除去する波長分離フィルタ４３と、波長分離フィルタ４３から射出された蛍光を集光する集光レンズ４５と、集光レンズ４５により集光された蛍光を部分的に通過させる共焦点ピンホール４７と、共焦点ピンホールを通過した蛍光を検出する光検出器４９とを備えている。
【００３８】
ダイクロイックミラー４１は、波長３５１ｎｍの刺激光および波長５１５ｎｍの励起光を透過する一方、励起光の波長より長波長側の光を反射する特性を有している。
光検出器４９は、検出した蛍光を電気信号に変換してコンピュータ５０に出力するようになっている。
【００３９】
コンピュータ５０は、制御部５１の他、光検出器４９から出力される出力信号に基づき参照画像および観察画像を構築する画像構築部５３と、観察光学系５により取得された参照画像上に刺激領域および観察領域を指定する領域指定部５５と、観察光学系５により取得された観察画像から走査経路上の所定の観察位置と光強度との関係を示す光強度の位置特性を算出する位置特性算出部５７と、位置特性算出部５７により算出された光強度の位置特性から観察位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部５９とを備えている。これら画像構築部５３、領域指定部５５、位置特性算出部５７および時間特性算出部５９は制御部５１を介して各種処理を行うようになっている。
【００４０】
このように構成された刺激用光学ユニット１２、スキャナユニット２０および照射ユニット３０は刺激光学系３を構成し、標本Ａの細胞を刺激することができるようになっている。また、観察用光学ユニット１６、スキャナユニット２０、照射ユニット３０、検出ユニット４０、および、コンピュータ５０は観察光学系５を構成し、標本Ａの参照画像および観察画像を取得することができるようになっている。
【００４１】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法において用いる試薬について説明する。
本実施形態においては、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質として、例えば、生理活性物質であるグルタミン酸に、グルタミン酸の生理活性を不活化させる側鎖（ケージドコンパウンド）がついたケージドグルタミン酸を用いる。このケージドグルタミン酸は、普段は不活性であるが、紫外線を照射するとそのコンパウンドが開裂しグルタミン酸が解離して生理活性を誘導する。また、膜電位感受性色素として、例えば、膜電位感受性色素ＲＨ−７９５を用いる。
【００４２】
ケージドグルタミン酸が注入された生体組織にＵＶレーザ光を照射すると、照射された部位のケージドグルタミン酸のケージドコンパウンドが開裂し、活性化したグルタミン酸が放出される。放出されたグルタミン酸はその近傍にある神経細胞のシナプスに対して興奮性伝達物質として作用し、シナプス後電位を引き起こす。シナプス後電位が蓄積されてシナプス発火閾値を超えると、シナプスは活動電位を発生する。したがって、ケージドグルタミン酸を導入した標本Ａの刺激領域に刺激光（ＵＶレーザ光）を照射すると、刺激領域の細胞に興奮性の刺激を与え細胞の活動電位を誘発することができる。
【００４３】
一方、膜電位感受性色素ＲＨ−７９５（以下、単に「膜電位感受性色素」という。）は、最大励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長７１２ｎｍの蛍光色素である。この膜電位感受性色素は細胞の膜電位の大きさによって蛍光強度が最大で１％程度変化する特性を有している。また、膜電位感受性色素は、細胞が興奮性の刺激を受けて脱分極が起こり細胞の膜電位が上昇するほど蛍光の光強度も大きくなる。
【００４４】
以下、このように構成された細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１の作用について説明する。
まず、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により標本Ａの細胞を刺激する場合について説明する。
細胞を刺激する場合は刺激光学系３により細胞を刺激する。具体的には、まず、ＵＶレーザ１１から波長３５１ｎｍの刺激光を射出し、音響光学素子１３を通過させて出射パワーを変調する。音響光学素子１３により変調された刺激光は、光路合成ユニット１９により反射された後、ダイクロイックミラー４１を透過してスキャナユニット２０によりＸＹの２次元方向に偏向される。
【００４５】
スキャナユニット２０により偏向された刺激光は、瞳投影レンズ３１で中間像を結ぶように集光され、ミラー３３で反射される。ミラー３３により反射された刺激光は、結像レンズ３５で再び集光されて平行光になり、対物レンズ３７により標本Ａ上の集光面Ｆに集光される。
【００４６】
この場合において、制御部５１により準焦部３９を制御し、標本Ａ上の集光面Ｆが光軸方向に対して任意の位置になるように対物レンズ３７と標本Ａとの距離を調整することにより、所定のタイミングで標本Ａ上のＸＹＺの３次元空間の任意の領域に刺激光を照射することができる。
【００４７】
標本Ａの任意の領域に刺激光が照射されると、照射された部位のケージドグルタミン酸のケージドコンパウンドが開裂してグルタミン酸が放出され、近傍にある神経細胞の興奮性活動電位が誘発される。これにより、所望の細胞を刺激することができる。
【００４８】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により標本Ａの細胞を観察する場合について説明する。
細胞を観察する場合は、観察光学系５により標本Ａの観察画像を取得する。具体的には、まず、アルゴンレーザ１５から波長５１５ｎｍの励起光を射出し、音響光学素子１７を通過させて出射パワーを変調する。音響光学素子１７より変調された励起光は、光路合成ユニット１９およびダイクロイックミラー４１を透過した後、スキャナユニット２０によりＸＹの２次元方向に偏向される。
【００４９】
スキャナユニット２０により偏向された励起光は、瞳投影レンズ３１により中間像を結ぶように集光され、ミラー３３で反射される。ミラー３３により反射された励起光は、結像レンズ３５により再び集光されて平行光となり、対物レンズ３７により標本Ａ上の集光面Ｆに集光される。そして、刺激光と同様に、制御部５１により準焦部３９を制御し、所定のタイミングで標本Ａ上のＸＹＺの３次元空間の任意の領域に励起光を照射することができる。
【００５０】
この場合において、スキャナユニット２０により標本Ａの集光面Ｆ上で励起光が走査されると、膜電位感受性色素が励起されて蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ３７により集光されて励起光と同じ光路を逆方向に進み、結像レンズ３５、ミラー３３、瞳投影レンズ３１、スキャナユニット２０を介してダイクロイックミラー４１により反射される。
【００５１】
ダイクロイックミラー４１により反射された蛍光は波長分離フィルタ４３に入射し、特定の波長の光が選択的に透過される。そして、波長分離フィルタ４３を透過した光は集光レンズ４５により集光されて共焦点ピンホール４７に入射し、標本Ａの集光面Ｆからの光のみが選択的に通過して光検出器４９により検出される。
【００５２】
光検出器４９により光が検出されるとその出力信号がＡ/Ｄインターフェース（図示略）によりスキャナユニット２０の走査制御に同期したデジタル信号に変換され、コンピュータ５０に取り込まれる。コンピュータ５０に取り込まれたデジタル信号は、画像構築部５３によりスキャナユニット２０の走査位置に対応してディスプレイ（図示略）に表示される。これにより、標本Ａの集光面Ｆにおける蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）が取得される。
【００５３】
例えば、同一の観察領域の蛍光画像を繰り返し取得するように制御部５１にプログラムすることにより、標本Ａの観察領域の蛍光強度の経時変化を観察することができる。この場合において、観察領域に存在する細胞の膜電位に変化が生じていない場合には、蛍光強度の経時変化は生じない。一方、刺激光の照射により生じたシナプスの興奮活動が観察領域の細胞に伝播されて細胞の膜電位が上昇した場合は、蛍光強度の経時変化にもその膜電位の上昇が反映され、蛍光強度の上昇変化となって観察される。
【００５４】
次に、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１により、刺激による標本Ａの膜電位の変化を観察する方法について説明する。
まず、参照画像取得工程ＳＡ１において、観察光学系５により、図３に示すような標本Ａの参照画像を取得する（プリスキャン）。ここでは、参照画像をＸＹの平面画像として説明する。符合Ｃは細胞を示している。
【００５５】
続いて、領域指定工程ＳＡ２において、領域指定部５５により、参照画像に対して刺激領域と観察領域の２つのＲＯＩを指定する。これら２つのＲＯＩは、スキャナユニット２０の走査および準焦部３９の作動により、ＸＹＺの３次元空間で任意の立体図形として指定することができる。ＲＯＩの次元が高くそのボリューム（容積、面積、長さ）が大きいほど、レーザ光でＲＯＩを満遍なく走査するのに要する時間が長くなる。逆に、ＲＯＩの次元が低いほど、また、同じ次元であればボリュームが小さいほど、レーザ光でＲＯＩを満遍なく走査するのに要する時間が短くなる。
【００５６】
したがって、ＲＯＩは必要十分な範囲でできるだけ次元を低くし、また、ボリュームを小さくすることで、刺激と観察の時間分解能を最大限向上することができる。本実施形態においては、例えば、図４に示すように、参照画像上にポイント状の刺激領域Ｐとライン状の観察領域Ｌを指定する。
【００５７】
ポイント状の刺激領域Ｐは、例えば、神経細胞の樹状突起の単一スパインを刺激する場合などにおいて適用することが考えられる。また、ライン状の観察領域Ｌは、例えば、神経細胞の軸索に沿うように指定することで、細胞の活動電位が軸索を伝播していく様子を観察することができる。
【００５８】
次に、刺激工程ＳＡ３において、刺激光学系３により、刺激領域Ｐに対して所定のタイミングで刺激光を照射する（ポイントスキャン）。また、観察画像取得工程ＳＡ４において、観察光学系５により、刺激領域Ｐに対する刺激光の照射後に観察領域Ｌにおいて走査（ラインスキャン）を繰り返し実行し、観察領域Ｌの観察画像を所定の時間間隔をあけて所定の取得タイミングで複数回取得する。
【００５９】
例えば、観察領域Ｌにおける１ラインのラインスキャンに要する時間を１ｍｓとすると、図５に示すように、刺激光の照射から１ｍｓ後に１回目のラインスキャン（Ｌ−１）を行い、刺激光の照射から２ｍｓ後に２回目のラインスキャン（Ｌ−２）を行う。以下、１ｍｓ間隔の取得タイミングで同様の動作が繰り返される。
【００６０】
なお、観察領域Ｌのラインスキャンは刺激光を照射する前から行ってもよいが、ラインスキャンによる励起光の照射は膜電位感受性色素の蛍光退色を引き起こすため、観察に不必要な刺激前はラインスキャンをしない方が、すなわち、励起光の照射をしない方が望ましい。
【００６１】
各取得タイミングにより検出される蛍光の光強度は、ラインスキャンの走査制御に同期して光検出器４９からコンピュータ５０に取り込まれ、画像構築部５３により観察領域Ｌにおけるラインの始点から終点までの各走査位置に対する蛍光強度のプロットとしてディスプレイに表示される。
【００６２】
例えば、刺激光の照射から１ｍｓ後に観察領域Ｌの始点で活動電位、すなわち、膜電位の上昇が発生し、観察領域Ｌの終点に向けて６ｍｓかけて移動伝播していくとすると、各取得タイミングで観察される蛍光強度のプロットは図６のＬｉｎｅ１〜Ｌｉｎｅ６のようになる。
【００６３】
次に、時間変化算出工程ＳＡ５において、観察領域Ｌの各点における光強度の時間変化が算出される。観察者が観察領域Ｌの各位置における膜電位の経時変化を求める場合、それを表すプロットは時間軸に対する蛍光強度のプロットである。図６は観察位置に対する蛍光強度のプロットであるので、これを時間軸に対する蛍光強度のプロットに変換する方法を図７および図８を用いて説明する。
【００６４】
例えば、図７に示すように、膜電位の経時変化を観察する走査経路上の観察位置をＡ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点とすると、位置特性算出部５７の作動により、各観察位置Ａ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性が算出される。この時点では、算出された光強度の位置特性をディスプレイに表示しなくてもよいし、あるいは、図８に示すように算出された光強度の位置特性をディスプレイに表示することとしてもよい。図８はＡ点〜Ｄ点の位置をプロットの横軸に図示している。
【００６５】
次に、時間特性算出部５９の作動により、位置特性算出部５７により算出された光強度の位置特性から各観察位置Ａ点、Ｂ点、Ｃ点、Ｄ点における光強度の時間変化が算出される。例えば、Ａ点の光強度の経時変化を算出すると、図８のＡ点におけるＬｉｎｅ１〜Ｌｉｎｅ６の蛍光強度を、横軸に時間（ｍｓ）を取り縦軸にそれらの蛍光強度を取ったものでプロットし直すことができる。
【００６６】
厳密には、観察領域Ｌの始点から終点まで励起光を走査している間にも時間は経過しているため、時間特性算出部５９により、１回目のラインスキャン開始から励起光の走査点がＡ点に至るまでの時間を計算し、Ａ点での蛍光検出を行った時間を忠実に時間軸上にとる。
【００６７】
また、２回目のラインスキャン〜６回目のラインスキャンについても同様に忠実にＡ点での蛍光検出を行った時間を計算し、それぞれの時間での蛍光強度をプロットする。これにより、図９に示すような膜電位の経時変化をあらわすプロットが求められる。このプロットをディスプレイに表示することで、観察者はＡ点における膜電位の経時変化を知ることができる。
【００６８】
なお、本実施形態においてはＡ点〜Ｄ点の４点のみの膜電位の経時変化をプロットする過程を説明したが、これを観察領域Ｌの全ての位置において行えば、観察領域Ｌの全ての画素点における膜電位の経時変化プロットを求めることができる。
【００６９】
以上説明したように本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１によれば、参照画像の視野範囲より小さい範囲の刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌを指定することで、観察画像取得工程ＳＡ４において走査にかかる時間を短縮し３次元的に迅速に観察領域Ｌを観察することができる。また、ケージドグルタミン酸および膜電位感受性色素を用いて観察領域Ｌの観察画像を観察することにより、刺激した刺激領域Ｐの細胞Ｃの膜電位の経時変化を間接的に観察することができる。これにより、刺激に対する膜電位応答の時間変化を高い空間自由度および時間分解能で簡易に観察することができる。
【００７０】
本実施形態においては、刺激工程後に観察画像取得工程を始めることとしたが、これに代えて、例えば、観察画像取得工程を先に始めておいてから刺激工程を行うこととしてもよいし、刺激工程と観察画像取得工程とを同時に始めることとしてもよい。
【００７１】
また、本実施形態においては、参照画像取得工程ＳＡ１において３次元的な蛍光画像を取得し、領域指定工程ＳＡ２において３次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域と指定し、刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４によりこれらの３次元的な刺激領域および観察領域に刺激光を照射したり励起光を照射したりすることとしたが、これに代えて、参照画像取得工程ＳＡ１において２次元的な蛍光画像を取得し、領域指定工程ＳＡ２において２次元空間の任意の領域を刺激領域および観察領域と指定し、刺激工程ＳＡ３および観察画像取得工程ＳＡ４によりこれらの２次元的な刺激領域および観察領域に刺激光を照射したり励起光を照射したりすることとしてもよい。
【００７２】
また、本実施形態においては、参照画像上に刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌをそれぞれ１箇所ずつ指定することとしたが、これに代えて、例えば、参照画像上に刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌをそれぞれ複数箇所指定し、各刺激領域Ｐおよび観察領域Ｌを時系列で走査することとしてもよい。例えば、参照画像上に刺激領域Ｐを１箇所指定し、観察領域Ｐを複数箇所指定することとしてもよいし、また、参照画像上に刺激領域Ｐを複数箇所指定し、観察領域Ｐも複数箇所指定することとしてもよい。
【００７３】
また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、第１の変形例として、標本Ａの刺激に対する膜電位の変化に繰り返し再現性が認められるような場合には、観察画像取得工程ＳＡ４により複数回取得された観察画像の光強度の平均を算出する平均算出工程を含むこととしてもよい。
【００７４】
この場合、刺激工程ＳＡ３後に観察画像取得工程ＳＡ４が所定の取得タイミングで観察画像を複数回取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、平均算出工程により、観察画像取得工程ＳＡ４により取得された複数の観察画像の光強度を各観察パターンの取得タイミングごとに加算して平均を算出することとすればよい。
【００７５】
具体的には、図１０（ａ）に示すように、刺激領域Ｐへの刺激後、所定の時間間隔を空けた後、観察領域Ｌにて一定のタイミングでラインスキャンを複数回取得する一連の動作を１トライアルとし、この１回のトライアル終了後、細胞が再び活性化できるだけの時間間隔をあけた後、次のトライアルを実施するということを繰り返し行う。
【００７６】
そして、平均算出工程により、各トライアルの１回目のラインスキャン（Ｌ１−１，Ｌ２−１，Ｌ３−１・・）の蛍光強度を加算平均し、図１０（ｂ）に示すように、刺激後１回目のラインスキャンの蛍光強度分布ＡｖｅＬ−１を算出する。同様に、各トライアルの２回目のラインスキャン（Ｌ１−２，Ｌ２−２，Ｌ３−２・・）の蛍光強度についても加算平均し、刺激後２回目のラインスキャンの蛍光強度分布ＡｖｅＬ−２を算出する。以下同様にして、膜電位の経時変化プロットを各トライアルを加算平均した強度で置き換えることとすればよい。
【００７７】
このようにすることで、平均算出工程により時間経過ごとの観察画像における光強度のノイズ成分を低減し、精度のよい膜電位の経時変化プロットを得ることができる。これにより、刺激に対する細胞の膜電位応答の時系列変化を高Ｓ／Ｎで観察することができる。
【００７８】
また、第２の変形例としては、例えば、刺激工程ＳＡ３後に観察画像取得工程ＳＡ４が所定の取得タイミングで観察画像を複数回取得する観察パターンを、細胞を刺激してから最初の観察画像を取得するまでのタイミングを１回の走査にかかる時間よりも短い時間間隔で観察パターンごとにずらして複数回行うこととしてもよい。
【００７９】
具体的には、図１１に示すように、刺激してからラインスキャンを開始するまでのタイミングをラインスキャン１回ごとにかかる時間より細かい時間刻みで少しずつずらしながら観察画像を取得し、それらの結果を刺激からラインスキャン開始までのタイミングの順に並べたものを蛍光強度の時系列変化として置き変えることとすればよい。
このようにすることで、１回の走査にかかる時間よりも速い膜電位の変化を補完して検出することができ、刺激に対する細胞の膜電位応答をより高い時間分解能で観察することができる。
【００８０】
また、本実施形態においては、領域指定工程ＳＡ２においてポイント状の刺激領域Ｐとライン状の観察領域Ｌを指定することとしたが、例えば、第３の変形例として、図１２および図１３に示すように、領域指定工程ＳＡ２において、領域指定部５５により、ある細胞Ｃの細胞体を模る形状の刺激領域Ｍと、正方形（クリップスキャン領域）の観察領域Ｓを指定することとしてもよい。図１３は、図１２の観察領域Ｓを拡大した画像である。
【００８１】
図１４（ａ）は、図１３に示す観察領域Ｓにおいて、刺激領域Ｍへの刺激から１２ｍｓ後に観察領域Ｓの樹状突起に膜電位の上昇が伝播してきた様子を示している。刺激から１２ｍｓ後に観察領域Ｓまで伝播してきた膜電位の上昇部位は、図１４（ｂ）〜（ｆ）に示すように、刺激から２２ｍｓかけて観察領域Ｓ内の細胞Ｃの細胞膜を伝播していく。本変形例においては、観察領域Ｓの１回の画像取得にかかる時間を２ｍｓとしている。
【００８２】
図１５（ａ）は観察領域ＳにおいてＡ点〜Ｄ点の４つの観察位置を指定した様子を示し、図１５（ｂ）は各観察位置での膜電位の経時変化を示した図である。例えば、図１５（ａ）に示すＡ点での膜電位の経時変化は、図１４（ａ）〜（ｆ）に示すような刺激から１２ｍｓ後〜２２ｍｓ後までの各蛍光画像で励起光がＡ点を走査している時間を時間特性算出部５９により算出し、刺激光を照射した時間を時間原点として時間軸上にそれらの輝度をプロットし直すことで、図１５（ｂ）に示すように再現することができる。点Ｂ〜点Ｄについても同様である。ここでは観察領域の蛍光画像取得にかかる時間を２ｍｓとしている。
【００８３】
なお、本変形例において、刺激に対する膜電位の伝播の様子に繰り返し再現性がある場合には、複数トライアルの加算平均を取ることとしてもよい。このようにすることで、得られる膜電位経時変化の精度を向上することができる。また、刺激開始から蛍光画像の取得開始までのタイミングを１回の走査にかかる時間より細かい時間刻みで少しずつずらしながら蛍光画像を取得し、コンピュータ５０でそれらの蛍光画像を時間順に並べ替えることとしてもよい。このようにすることで、１回の走査にかかる時間より細かい時間分解能で膜電位の経時変化を測定することが可能となる。
【００８４】
また、第４の変形例としては、例えば、蛍光画像を表示したディスプレイに使用者が蛍光画像内のある位置を指定すると、指定した位置の膜電位の経時変化プロットがディスプレイ上に表示されるようにコンピュータ５０の制御部５１にプログラムしてもよい。このようにすることで、使用者がより直感的に標本Ａの各位置とその各位置での膜電位経時変化の様子とを認識することができる。
【００８５】
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る細胞観察方法は、刺激工程ＳＡ３による刺激領域へのレーザ照射と観察画像取得工程ＳＡ４による観察領域へのレーザ照射とを異なる光学系により行う点で第１の実施形態と異なる。
以下、第１の実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８６】
まず、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）１００は、図１６に示すように、励起光を走査するスキャナユニット２０とは別に刺激光を走査するスキャナユニット１２０を備え、さらに、スキャナユニット１２０により走査される刺激光を中間像として結像させる瞳投影レンズ１３１と、瞳投影レンズ１３１により結像した中間像からの光の光路と励起光の光路とを合成するダイクロイックミラー１３３とを備えている。
【００８７】
本実施形態に係る細胞観察方法においては、ＵＶレーザ１１から射出された刺激光は、制御部５１の制御により、音響光学素子１３において遮断／透過の制御を受けた後、スキャナユニット１２０により標本Ａの集光面Ｆ上でＸＹの２次元方向に走査される。そして、スキャナユニット１２０により偏向された刺激光は、瞳投影レンズ１３１により中間像を結像するよう集光され、ダイクロイックミラー１３３で励起光の光路と合成された後、結像レンズ３５により平行光にもどされて対物レンズ３７により標本Ａの集光面Ｆに焦点を結ぶよう集光される。以下、第１の実施形態と同様に、標本Ａにおいて発生した蛍光が検出器４９により検出され、コンピュータ５０で処理されて膜電位の経時変化として観察される。
【００８８】
以上説明したように、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１００によれば、刺激光と励起光とを互いに独立した別々のスキャナユニット２０、１２０により走査することで、刺激領域へのレーザ照射と観察領域へのレーザ照射を時間的および空間的に独立して制御することができる。したがって、第１の実施形態では、細胞を刺激した後、スキャナユニット２０の観察領域に偏向する動作が完了してからでないと観察領域に励起光を照射することができなかったが、本実施形態では、スキャナユニット２０、１２０により、例えば、刺激領域に刺激光を照射しながら同時に観察領域に励起光を照射することができる。これにより、細胞の刺激と細胞の観察との時間的および空間的な自由度を高めることができる。
【００８９】
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る細胞観察方法および走査型顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る細胞観察方法は、図１７に示すように、多光子励起観察が可能な走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）２００を用いて細胞観察を行う点で第１の実施形態および第２の実施形態と異なる。
以下、また、第１の実施形態または第２の実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡１，１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００９０】
まず、本実施形態に係る細胞観察方法において用いる試薬について説明する。
本実施形態においては、例えば、生理活性物質としてケージドグルタミン酸を用い、膜電位感受性色素として蛍光色素ＦＭ４−６４を用いる。蛍光色素ＦＭ４−６４（以下、単に「蛍光色素」という。）は、例えば、レンズにより赤外超短パルスレーザを集光したような光子密度が非常に高い環境におかれると、非線形光学効果により、入射した光の波長の半分の波長をもつ第二高調波（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、以下「ＳＨＧ」という。）シグナル光を出すことが知られている。
【００９１】
この蛍光色素（蛍光色素ＦＭ４−６４）が発するＳＨＧシグナル光の光強度は細胞膜の膜電位に依存して変化する。例えば、細胞膜の膜電位が１００ｍＶ変化した場合には、ＳＨＧシグナル光の光強度は約１０％程度変化する。一般的な膜電位感受性色素により発せられる蛍光の光強度は、細胞の膜電位が１００ｍＶ変化した場合に０．１％〜１％変化することに比べると、非常に大きな光強度の変化率である。
【００９２】
本実施形態に係る細胞観察方法においては、このＳＨＧシグナル光の膜電位感受性による光強度の変化を膜電位の光学測定法として用いることで、従来の数倍〜数十倍の信号強度で測定することが可能になる。したがって、ケージドグルタミン酸と蛍光色素を導入した標本Ｂに対して超短パルスレーザ光源を用いてＳＨＧシグナル光を発生させることにより、細胞の膜電位の経時変化をＳＨＧシグナル光の経時変化として間接的に観察することができる。
【００９３】
次に、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡２００について説明する。
走査型レーザ顕微鏡２００は、アルゴンレーザ１５に代えて赤外パルスレーザ光源２１５を備えている。赤外パルスレーザ光源２１５は、波長９５０ｎｍのフェムト秒パルスレーザ光源である。また、光検出器４９が標本Ｂの透過側に配置され、標本Ｂと光検出器４９との間には、標本Ｂにおいて発生したＳＨＧシグナル光を集光する集光レンズ２４２、２４５と、目的のＳＨＧシグナル光の波長だけを選択的に透過させる波長選択フィルタ２４３とが配置されている。
【００９４】
以下、このように構成された細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００の作用について説明する。
刺激工程ＳＡ２において、ＵＶレーザ１１から射出された刺激光は、標本Ｂの集光面Ｆ上で刺激領域に所定のタイミングで照射される。一方、観察画像取得工程ＳＡ４において、赤外パルスレーザ光源２１５から射出された励起用赤外パルスレーザ光は、標本Ｂの集光面Ｆ上で焦点を結んだポイントがＸＹの２次元方向に走査される。
【００９５】
ここで、標本Ｂの集光面Ｆ上で集光した赤外パルスレーザが時間的、空間的に非常に高い光子密度を有することにより、標本Ｂに導入された蛍光色素に対して非線形光学効果をもたらす。これにより、蛍光色素から波長４７５ｎｍのＳＨＧシグナル光Ｓが、赤外パルスレーザが進行する方向と同方向に発生する。標本Ｂ上でＳＨＧ光が発生する部位は、赤外パルスレーザ光の空間密度が非常に高くなる対物レンズ３７の集光面Ｆ上である。
【００９６】
このＳＨＧシグナル光は集光レンズ２４２により集光され、波長分離フィルタ２４３でＳＨＧ光以外の波長の光が遮断されて集光レンズ２４５により検出器４９の検出部分に集光される。これにより、検出器４９において、標本Ｂの集光面Ｆで発生したＳＨＧ光シグナルのみを検出することができる。したがって、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００によれば、検出器４９の手前に共焦点ピンホールがなくても擬似的に共焦点観察を行っていることになる。
【００９７】
光検出器４９によりＳＨＧシグナル光が検出されるとその出力信号がＡ/Ｄインターフェースによりスキャナユニット２０の走査制御に同期したデジタル信号に変換され、コンピュータ５０に取り込まれる。コンピュータ５０に取り込まれたデジタル信号は、画像構築部５３によりスキャナユニット２０の走査位置に対応してディスプレイに表示される。これにより、標本Ｂの集光面ＦにおけるＳＨＧ光画像（ＳＨＧ光輝度の２次元分布）が取得される。
【００９８】
このようにして取得されたＳＨＧ光画像は、試料Ｂの集光面Ｆ上に存在する細胞の膜電位に依存してＳＨＧ光強度が変化するので、ＵＶレーザ１１による標本Ｂの刺激後、ＳＨＧ光画像を繰り返し取得するように制御部５１をプログラムしておくと、取得されたＳＨＧ光画像のある位置の光強度の経時変化は、標本Ｂのその位置における膜電位の経時変化を反映したものとして置き変えて観察することができる。
【００９９】
以上説明したように、本実施形態に係る細胞観察方法および走査型レーザ顕微鏡２００によれば、膜電位依存の光強度変化媒体として膜電位変化に対する光強度変化の大きいＳＨＧ光シグナルを用いることにより、高Ｓ／Ｎで膜電位の経時変化を観察することができる。
【０１００】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態および各変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【０１０１】
また、例えば、上記各実施形態および各変形例においては、光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質としてケージドグルタミン酸を例示して説明したが、これに代えて、例えば、チャネルロドプシン２のような光感受性を有するタンパク質を遺伝子導入した標本を用いてもよい。遺伝子導入によりチャネルロドプシン２を神経細胞に発現させ、そこに波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの光を照射すると、チャネルロドプシン２は陽イオンを透過するようになり、神経細胞の脱分極（興奮性の膜電位の上昇）をもたらす。
【０１０２】
したがって、光源として波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの刺激用レーザ光を発するレーザ光源を用い、チャネルロドプシン２を一様に発現させた生細胞標本に４００ｎｍ〜５００ｎｍの刺激用レーザ光を照射すると、刺激用レーザ光を照射した位置にだけ膜電位の上昇をもたらす刺激を細胞に加えることができる。
【０１０３】
また、上記各実施形態および各変形例においては、ケージドコンパウンドにグルタミン酸を結びつけたケージドグルタミン酸に代えて、例えば、生理活性を誘導するアミノ酸、環状ヌクレオチド（ｃＮＭＰｓ)、または、カルシウム等をケージドコンパウンドに結びつけたケージド試薬を採用することとしてもよい。
また、膜電位感受性色素としては、ＲＨ−７９５以外にも、例えば、色素分子構造、励起波長、蛍光波長、または、光強度変化の度合いなどが異なる多種多様な色素が多数開発されている。本発明の励起・観察が可能なものであれば、観察の目的や標本に応じて適切な色素を採用することとしてもよい。
【符号の説明】
【０１０４】
１，１００ 走査型顕微鏡装置
３ 刺激光学系
５ 観察光学系
５５ 領域指定部
５７ 位置特性算出部
５９ 時間特性算出部
２００ 走査型レーザ顕微鏡（走査型顕微鏡装置）
ＳＡ１ 参照画像取得工程
ＳＡ２ 領域指定工程
ＳＡ３ 刺激工程
ＳＡ４ 観察画像取得工程
ＳＡ５ 時間変化算出工程
Ｃ 細胞
Ｌ，Ｓ 観察領域
Ｐ，Ｍ 刺激領域
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質および前記細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程と、
該参照画像取得工程により取得された前記参照画像に対して、レーザ照射により前記細胞に刺激を与える刺激領域およびレーザ照射により前記膜電位感受性色素を励起する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程と、
該領域指定工程により指定された前記刺激領域にレーザ光を照射し、前記生理活性物質により前記細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程と、
前記観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて前記膜電位感受性色素を励起し、該膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して前記観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程とを含む細胞観察方法。
【請求項２】
前記領域指定工程が、ライン状の前記観察領域を指定する請求項１に記載の細胞観察方法。
【請求項３】
前記領域指定工程が、ポイント状の前記観察領域を指定する請求項１に記載の細胞観察方法。
【請求項４】
前記刺激工程による前記刺激領域へのレーザ照射と前記観察画像取得工程による前記観察領域へのレーザ照射を異なる光学系により行う請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞観察方法。
【請求項５】
前記観察画像取得工程が、同一の前記観察領域の観察画像を時間間隔をあけて複数回取得する請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞観察方法。
【請求項６】
前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、
前記観察画像取得工程により取得された前記観察画像の光強度を各前記観察パターンの前記取得タイミングごとに加算して平均を算出する平均算出工程を含む請求項５に記載の細胞観察方法。
【請求項７】
前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを、前記細胞を刺激してから最初の前記観察画像を取得するまでのタイミングを１回の前記走査にかかる時間よりも短い時間間隔で前記観察パターンごとにずらして複数回行う請求項６に記載の細胞観察方法。
【請求項８】
前記観察画像取得工程により取得された複数の前記観察画像に基づいて、前記観察領域の各点における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程を含む請求項６または請求項７に記載の細胞観察方法。
【請求項９】
生体試料に照射する光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記生体試料の３次元的な参照画像および観察画像を取得可能な観察光学系と、
前記生体試料に光を照射して細胞を刺激する刺激光学系と、
前記観察光学系により取得された前記参照画像に対して、前記刺激光学系により前記細胞を刺激する刺激領域および前記観察画像を取得する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定部と、
該領域指定部により指定された細胞の刺激領域に対する前記刺激光学系による刺激後に、前記領域指定部により指定された細胞の観察領域を前記観察光学系により複数回にわたって走査して異なる時刻に取得された複数の観察画像から、走査経路上の位置と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性を算出する位置特性算出部と、
該位置特性算出部により算出された複数の光強度の位置特性から走査経路上の所望の位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部とを備える走査型顕微鏡装置。
【請求項１】
光を受けると細胞を活性させて膜電位活動を誘発させる生理活性物質および前記細胞の膜電位の大きさに応じて発生する光強度が変化する膜電位感受性色素を導入した生体試料の参照画像を取得する参照画像取得工程と、
該参照画像取得工程により取得された前記参照画像に対して、レーザ照射により前記細胞に刺激を与える刺激領域およびレーザ照射により前記膜電位感受性色素を励起する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定工程と、
該領域指定工程により指定された前記刺激領域にレーザ光を照射し、前記生理活性物質により前記細胞を刺激して膜電位活動を誘発させる刺激工程と、
前記観察領域にレーザ光を照射し、その集光位置を走査させて前記膜電位感受性色素を励起し、該膜電位感受性色素から発せられるシグナル光の光強度を検出して前記観察領域の観察画像を取得する観察画像取得工程とを含む細胞観察方法。
【請求項２】
前記領域指定工程が、ライン状の前記観察領域を指定する請求項１に記載の細胞観察方法。
【請求項３】
前記領域指定工程が、ポイント状の前記観察領域を指定する請求項１に記載の細胞観察方法。
【請求項４】
前記刺激工程による前記刺激領域へのレーザ照射と前記観察画像取得工程による前記観察領域へのレーザ照射を異なる光学系により行う請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞観察方法。
【請求項５】
前記観察画像取得工程が、同一の前記観察領域の観察画像を時間間隔をあけて複数回取得する請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞観察方法。
【請求項６】
前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを同一のタイミングで複数回行い、
前記観察画像取得工程により取得された前記観察画像の光強度を各前記観察パターンの前記取得タイミングごとに加算して平均を算出する平均算出工程を含む請求項５に記載の細胞観察方法。
【請求項７】
前記刺激工程後に前記観察画像取得工程が所定の取得タイミングで前記観察画像を取得する観察パターンを、前記細胞を刺激してから最初の前記観察画像を取得するまでのタイミングを１回の前記走査にかかる時間よりも短い時間間隔で前記観察パターンごとにずらして複数回行う請求項６に記載の細胞観察方法。
【請求項８】
前記観察画像取得工程により取得された複数の前記観察画像に基づいて、前記観察領域の各点における光強度の時間変化を算出する時間変化算出工程を含む請求項６または請求項７に記載の細胞観察方法。
【請求項９】
生体試料に照射する光の集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記生体試料の３次元的な参照画像および観察画像を取得可能な観察光学系と、
前記生体試料に光を照射して細胞を刺激する刺激光学系と、
前記観察光学系により取得された前記参照画像に対して、前記刺激光学系により前記細胞を刺激する刺激領域および前記観察画像を取得する観察領域を前記参照画像の視野範囲より小さい範囲で指定する領域指定部と、
該領域指定部により指定された細胞の刺激領域に対する前記刺激光学系による刺激後に、前記領域指定部により指定された細胞の観察領域を前記観察光学系により複数回にわたって走査して異なる時刻に取得された複数の観察画像から、走査経路上の位置と光強度との関係を示す複数の光強度の位置特性を算出する位置特性算出部と、
該位置特性算出部により算出された複数の光強度の位置特性から走査経路上の所望の位置における光強度の時間変化を算出する時間特性算出部とを備える走査型顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１２−１４０６６（Ｐ２０１２−１４０６６Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５２２０６（Ｐ２０１０−１５２２０６）
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２日（２０１０．７．２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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