細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及びこれを有効成分として含有する抗癌組成物
本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８に巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）が融合され、細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の発現ベクター及び前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有するｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物に関する。本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、ハプロ不全腫瘍抑制因子であるｐ１８を細胞内に伝達し、ＤＮＡ損傷又は腫瘍形成信号による細胞周期の阻害とアポトーシスを誘導するＡＴＭとｐ５３の活性化に関連する信号伝達機構を効果的に再活性化するので、これを有効成分として含有する組成物は、抗癌剤として有用に用いられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されて細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の発現ベクター及び前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有するｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）と呼ばれる一定の規則的な過程を経て分裂、増殖する。細胞周期とは、細胞分裂が起こり、再度次の細胞分裂が起こるまでの一連の過程を意味するが、細胞分裂を準備する休止期であるＧ１期を始めとし、染色体ＤＮＡを複製するＳ期を経て、他の休止期で、かつ最後の有糸分裂に備えて活発なタンパク質の合成がなされるＧ２期、及びその後に倍加したそれぞれの染色体が均等に分配されるＭ期、即ち、分裂期につながる秩序ある過程を経るようになる。このような一連の過程を循環、反復して細胞が増殖し完成する。
【０００３】
また、細胞には、細胞周期を促進させる機構と共に「細胞周期のチェックポイント（ｃｈｅｃｋ ｐｏｉｎｔ）」という細胞周期の進行を点検する段階があり、異常が感知されれば細胞周期を停止させ、これを矯正する機構を作動させる。例えば、ＤＮＡが損傷を受けたり、放射線が照射された細胞では、腫瘍形成反応を進行する間、Ｇ１期からＳ期への進行を阻止するＧ１期のチェックポイント、Ｓ期の進行を延ばすＳ期のチェックポイント、細胞周期をＧ２期で停止させ、Ｍ期への進行を阻止するＧ２期のチェックポイントを通じて細胞周期の進行が遮断される（Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）（非特許文献１））。
【０００４】
このような細胞周期の精巧な調節は、様々な調節因子により誘導されるが、その中で最も重要な役割を果たすのが、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＣＤＫ）である。ＣＤＫは、細胞周期の各段階ごとに特異的に発現されるサイクリンという調節タンパク質と結合して機能的な単位を形成するようになるが、これにより細胞周期の各段階ごとに活性化される特異的で多様な組合わせのサイクリン−ＣＤＫ複合体が製造される。もし、Ｇ１チェックポイントで細胞が成長過程に行けると判断されればＳ期に細胞周期が進行されるが、まずサイクリンＤとサイクリン依存性タンパク質キナーゼ２（ＣＤＫ２）又は６（ＣＤＫ６）が活性化され、Ｓ期の進入時にサイクリンＥとＣＤＫ２の複合体が活性化され、サイクリンＡは、Ｇ１後期とＳ期の初期にＣＤＫ２と結合して細胞周期の進行を実行する。
【０００５】
前述のように、細胞周期の進行は、多様なサイクリンとこれに結合するキナーゼにより調節され、ＣＤＫの活性化を抑制するＣＤＫ４インヒビター（ＩＮＫ４）とＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ抑制タンパク質（ＣＤＫ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＩＰ／ＫＩＰ）ファミリーなどのＣＤＫ抑制因子の結合が重要に作用する（Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）（非特許文献２））。また、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ；ＰＩＫＫ）ファミリーのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼであるＡＴＭ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）は、ＤＮＡ損傷や腫瘍形成信号を受けると、細胞周期のチェックポイントを調節することにより、ゲノムの完全性と安全性を維持することが知られているが、ｐ５３、ＭＤＭ２（ｍｕｒｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）、ＢＲＣＡ１のような下流の基質タンパク質を活性化させて細胞のＤＮＡ損傷反応を抑制することとなる（Ｌｕ、Ｓ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７：８４８−５５（２００６）（非特許文献３））。例えば、二本鎖ＤＮＡの損傷のような著しい遺伝子の損傷信号が細胞内に伝達されれば、ＡＴＭが細胞周期の抑制、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導に関連する標的タンパク質を活性化させて遺伝子の転写を調節し、損傷した遺伝子を復旧することとなる（Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４））。
【０００６】
このようなＡＴＭに関連するｐ１８は、ヒトとマウスを対象とした実験において、腫瘍抑制因子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）として作用することが確認された。ｐ１８の欠損又は機能の消失は、ＤＮＡ損傷や突然変異を引き起こした細胞のアポトーシスを抑制することにより、癌に対する感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増加させるが、これは細胞を悪性形態（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に変化させる（Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４））。ｐ１８の機能を調査するために、この遺伝子の機能が破壊されたノックアウトマウス（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ）を対象とした研究において、ｐ１８の機能を完全に消失した場合は、受精後に胚致死が示され、ｐ１８機能が正常より低くなった場合は、成長しながら肝癌、乳癌、肺癌など多種の癌が発病していることが報告されている（Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５）） 。また、ｐ１８は、ＤＮＡ損傷に反応して核中へ伝達され活性化されるが、ｐ１８の発現が増加すれば細胞増殖と死滅を調節する機構を有する他の腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３がリン酸化されて活性化され（Ｆｒｅｎｃｈ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２２：９９−１０６（２００１）（非特許文献６）及びＩｄｅ、F．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７２９−３３（２００３）（非特許文献７））、反対にｐ１８が欠乏すれば、ｐ５３の発現が抑制される（Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））。
【０００７】
このようなｐ１８遺伝子は、リンパ腫でヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ：ｌｏｓｓ−ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が発見された染色体の６Ｐ２４−２５部位に位置しており、この染色体部分における遺伝子の欠損がｐ１８の低い発現の原因になり、癌が発生するという主張も提起されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、Ａ．Ｋ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１５０９−１６（２００３）（非特許文献８））。更に、最近の研究によれば、多様なヒト癌細胞株でも一般的に、高頻度でｐ１８の機能が低下していることが発見されており、これはｐ１８がハプロ不全腫瘍抑制因子（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）であり、ＡＴＭと相互作用を通じたｐ５３の重要な調節子として機構内で進行速度を制限する速度制限因子（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であることを提示するものである（Ｐａｒｋ, Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））。
【０００８】
そこで、本発明者は、ＤＮＡ損傷のような腫瘍形成信号に反応して細胞周期を制御しアポトーシスを誘導するｐ５３の活性のためにｐ１８が直接ＡＴＭに作用するということから（Ｓａｖｉｔｓｋｙ、Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２０２５−３２（１９９５）（非特許文献９））、ＡＴＭとｐ５３を含む細胞周期のチェックポイントの信号伝達の経路内でｐ１８がハプロ不全腫瘍抑制因子として重要な標的タンパク質であることを確信し（Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）（非特許文献１）；Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）（非特許文献２）；Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ.Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４）；及びＰａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））、これを用いて新規抗癌剤の開発のために鋭意研究をした。
【０００９】
一方、合成化合物または天然物の小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できるが、タンパク質、ペプチド、核酸のような巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できない。これらは、分子量５００以上の巨大分子で、生きている細胞の原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、即ち、二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を通過することができないことが広く知られている。これを克服するための方法として、「巨大分子細胞内伝達技術（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭＩＴＴ）」が開発されたが（Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）（非特許文献１０））、これは疾病治療性巨大分子の生体内伝達を可能にすることによって、既存の医薬品開発技術では不可能であったペプチド、タンパク質、遺伝子自体を用いるバイオ新薬物の開発を可能にする。この技術によると、巨大分子は「疎水性巨大分子伝達ドメイン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）」と他の様々な細胞内運搬体と融合され、組換えタンパク質の形態で合成または発現、精製され、細胞内に伝達された後、特定位置に正確かつ迅速に運搬され、所要の様々な役割を効果的に発揮できる。このように巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成化合物などと融合されて細胞内に入れない多くの不透過性物質の伝達を可能にする。
【００１０】
そこで、本発明者は、腫瘍抑制因子ｐ１８に巨大分子の伝達ドメインを融合させて細胞透過性を付与したｐ１８組換えタンパク質を製造し、この組換えタンパク質がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）だけでなくインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）環境下でも細胞外部から大量の腫瘍抑制因子ｐ１８を細胞内へ効果的に伝達し、ヒトの多様な癌で発生するｐ１８欠損又は機能消失を治療できる抗癌剤として用いられることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）
【非特許文献２】Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）
【非特許文献３】Ｌｕ、Ｓ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７：８４８−５５（２００６）
【非特許文献４】Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ.Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ.１１：２５７−８（２００５）
【非特許文献５】Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ１２０：２０９−２１（２００５）
【非特許文献６】Ｆｒｅｎｃｈ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２２：９９−１０６（２００１）
【非特許文献７】Ｉｄｅ、Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７２９−３３（２００３）
【非特許文献８】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、Ａ．Ｋ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１５０９−１６（２００３）
【非特許文献９】Ｓａｖｉｔｓｋｙ、Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２０２５−３２（１９９５）
【非特許文献１０】Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）
【発明の概要】
【００１２】
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、腫瘍抑制因子ｐ１８に細胞透過性を付与し、これを細胞内に高効率で導入することにより、ヒトの多様な癌で発生するｐ１８欠損又は機能消失が治療できる抗癌剤として細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を提供することである。
【００１３】
課題を解決するための手段
前記目的を達成するために、本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合で細胞透過性が付与され、ｐ１８を細胞内に高効率で導入する細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を提供する。
【００１４】
また、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
更に、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びこの発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００１６】
また、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１７】
最後に、前記ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有する細胞透過性ｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
発明の効果
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、腫瘍抑制因子であるｐ１８を細胞内に高効率で導入し、ＤＮＡ損傷又は腫瘍形成信号による細胞周期の阻害とアポトーシスを誘導するＡＴＭとｐ５３の活性化に関連する信号伝達機構を再活性化させることにより、ヒトの多様な癌に対する抗癌剤として有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１ａは、本発明によって全長形及び切頭形として考案されたｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の構造を示したものであり、図１ｂは、本発明によって全長形として考案されたＪＯ−１０１及びＪＯ−１０３ＭＴＤがそれぞれ融合されたｐ１８組換えタンパク質の構造を示したものである。
【図２】図２ａは、図１ａで考案された全長形及び切頭形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果であり、図２ｂは、図１ｂで考案された全長形のＪＯ−１０１及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果である。
【図３】図３ａは、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＰＣＲ増幅産物をサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）する過程を示した模式図であり、図３ｂ、図３ｃは、それぞれ図２ａ及び２ｂのＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングされたことを示したものである。
【図４】図４ａは、本発明の組換え断片をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングして組換え発現ベクターを作製する過程を示した模式図であり、図４ｂ、図４ｃは、本発明の組換え発現ベクターにそれぞれの組換え断片がクローニングされたことを示したものである。
【図５】図５ａは、本発明のｐ１８組換えタンパク質の発現を多様な宿主細胞を対象として調査した結果であり、図５ｂは、本発明のｐ１８組換えタンパク質の発現をタンパク質発現誘導剤であるＩＰＴＧの存在（＋）又は非存在（−）下で調査した結果である。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、それぞれ本発明の組換え発現ベクターが形質転換された細菌から発現された全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質を精製した結果である。
【図７】図７ａ〜図７ｃは、それぞれ本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性をフローサイトメトリーで分析した結果である。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、それぞれ本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性をマウス線維芽細胞で共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果である。
【図９】図９は、本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性を多様なマウス組織で共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果である。
【図１０】図１０は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１の細胞内機能をウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果である。
【図１１】図１１は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ２、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ３及びＨＭ３ｐ１８Ｍ３の細胞内機能をウエスタンブロッティングで分析した結果である。
【図１２】図１２は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８のアポトーシス誘導効果を細胞内ＤＮＡ含量分析を通じて調査した結果である。
【図１３】図１３は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８のアポトーシス誘導効果をインビボのアネキシン−Ｖ（ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）染色を通じて調査した結果である。
【図１４】図１４ａ、図１４ｂは、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腫瘍が形成されたマウスに腹腔注射で２１日間処理した後、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１５】図１５は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腹腔注射で２１日間投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図１６】図１６ａ、図１６ｂは、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腫瘍が形成されたマウスに腹腔注射で２１日間処理した後、７日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１７】図１７ａ、図１７ｂは、腫瘍が形成されたマウスを、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８により静脈注射を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１８】図１８は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに静脈注射で１４日間投与した後、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図１９】図１９は、腫瘍が形成されたマウスを、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８をにより静脈注射を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２０】図２０ａ、図２０ｂは、腫瘍が形成されたマウスを、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８により腫瘍直接注射（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図２１】図２１は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに腫瘍直接注射で１４日間投与した後、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２２】図２２は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに静脈注射で１４日間投与した後、１４日間投与を中止し、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２３】図２３は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織における細胞の組織学的な変化をヘマトキシリンおよびエオシン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ）染色で観察した結果である。
【図２４】図２４は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織における細胞の組織学的な変化をヘマトキシリンおよびエオシン染色で観察した結果である。
【図２５】図２５は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析で観察した結果である。
【図２６】図２６は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をアポタグ（ＡｐｏｐＴａｇ）分析で観察した結果である。
【図２７】図２７は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ分析で観察した結果である。
【図２８】図２８は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をアポタグ分析で観察した結果である。
【図２９】図２９は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８Ｍ２を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織における遺伝子発現の変化をマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）で分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合により細胞透過性が付与され、ｐ１８を細胞内に高効率で導入する細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明の特徴は、細胞内への導入が容易でない巨大分子である腫瘍抑制因子ｐ１８に特定の巨大分子伝達ドメイン（以下、「ＭＴＤ」と略称する）を融合させて細胞透過性を付与することにより、ｐ１８を細胞内に高効率で伝達することにある。この時、巨大分子伝達ドメインは、癌転移の抑制因子であるＮｍ２３の片末端にのみ融合されるか、あるいはその両末端の両方に融合されてもよい。
【００２２】
本発明では腫瘍抑制因子であるｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）、すなわち、細胞内への巨大分子の伝達を可能にする３種のペプチドドメインそれぞれに前記ｐ１８を融合し、細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質を開発した。
【００２３】
本発明において「細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質」とは、巨大分子伝達ドメインと腫瘍抑制因子ｐ１８を含み、これらの遺伝的な融合や化学的な結合で形成された共有結合複合体を意味する。ここで「遺伝的な融合」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝的な発現を通じて形成された線状の共有結合からなる連結を意味する。
【００２４】
ＤＮＡ損傷のような腫瘍形成信号に反応して細胞周期を制御し、アポトーシスを誘導するｐ５３の活性化のために直接ＡＴＭに作用するｐ１８は、配列番号：１の塩基配列及び配列番号：２のアミノ酸配列を有する腫瘍抑制因子であって、ＡＴＭとｐ５３を含む細胞周期のチェックポイントの信号伝達の経路内で重要な標的タンパク質として作用する。
【００２５】
腫瘍抑制因子ｐ１８は、配列番号：２のアミノ酸配列における１位から６０位までのアミノ酸を含むＮ末端ドメイン、６１位から１２０位までのアミノ酸を含むＳ末端ドメイン、及び１２１位から１６８位までのアミノ酸を含むＣ末端ドメインで構成される（図１ａ参照）。
【００２６】
前記腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性を有するポリペプチドを用いてもよい。前記配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する巨大分子伝達ドメインは、細胞膜を貫通してポリペプチド、タンパク質ドメイン、又は全長タンパク質を含む生物学的な活性分子の細胞内への流入を媒介できる細胞透過性ポリペプチドである。本発明による巨大分子伝達ドメインは、Ｎ末端領域、疎水性領域及びＣ末端の分泌タンパク質切断部位（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）の３部分からなるシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）においてヘリックス（ｈｅｌｉｘ）を形成し、細胞膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）活性を付与する疎水性領域を有するように考案されたものである。このような巨大分子伝達ドメインは、細胞に損傷を加えず、かつ直接細胞膜を透過することにより、標的タンパク質を細胞内に移動させて目的とする機能を発揮させることができる。
【００２７】
本発明により腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメインを下記表１ａ〜１ｌに示す。
【００２８】
【表１ａ】
【００２９】
【表１ｂ】
【００３０】
【表１ｃ】
【００３１】
【表１ｄ】
【００３２】
【表１ｅ】
【００３３】
【表１ｆ】
【００３４】
【表１ｇ】
【００３５】
【表１ｈ】
【００３６】
【表１ｉ】
【００３７】
【表１ｊ】
【００３８】
【表１ｋ】
【００３９】
【表１ｌ】
【００４０】
本発明の好ましい実施態様では、腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしてカポジ線維芽細胞成長因子（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４；ｋＦＧＦ４）に由来する配列番号：３の塩基配列及び配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ1」と略称する）、タイレリア・アンヌラータ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ａｎｎｕｌａｔａ）に由来する機能未知タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）である配列番号：５の塩基配列及び配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ２」と略称する）、及びヒトのＴＭＥＭ９ドメインファミリー、メンバーＢ（ＴＭＥＭ９ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ Ｂ）由来の配列番号：７の塩基配列及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ3」と略称する）を用いる。
【００４１】
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、巨大分子伝達ドメインとして前記３種のＭＴＤ（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ：ＭＴＤ1、ＪＯ−１０１：ＭＴＤ２、ＪＯ−１０３：ＭＴＤ３）のいずれか１つが癌転移の抑制因子ｐ１８の一方又は両末端に融合され、この融合コンストラクトの片末端に配列番号：９の塩基配列を有するＳＶ４０巨大Ｔ抗原（ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ、配列番号：１０のアミノ酸配列）と、容易な精製のために、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ；Ｈｉｓ−Ｔａｇ）親和性ドメインが融合されている構造を有してもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質として３つの全長形（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍｓ）と５つの切頭形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ）を考案する。
【００４３】
本発明において、用語「全長形」は、腫瘍抑制因子ｐ１８のＮ、Ｓ及びＣ末端ドメインの全てを含む形態を意味し、用語「切頭形」はＮ、Ｓ及びＣ末端ドメインのいずれか１つ又は２つのドメインが欠失された形態を意味する。
【００４４】
図１ａを参考とすれば、本発明による全長形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）全長のｐ１８のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１、及び
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８Ｍ１
である。
【００４５】
前記全長形のｐ１８組換えタンパク質において、ＨＭ１ｐ１８は、配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ１は、配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ１ｐ１８Ｍ１は、配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４６】
また、本発明による切頭形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）Ｓ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＮＭ１、
２）Ｎ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＳＭ１、
３）Ｎ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＣＭ１、
４）Ｃ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＮＳＭ１、及び
５）Ｎ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＳＣＭ１
である。
【００４７】
前記切頭形のｐ１８組換えタンパク質において、Ｈｐ１８ＮＭ１は、配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＳＭ１は、配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＣＭ１は、配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＮＳＭ１は、配列番号：３８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＳＣＭ１は、配列番号：４０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４８】
本発明の他の実施形態では、巨大分子伝達ドメインとしてＪＯ−１０１ＭＴＤとＪＯ−１０３ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質としてそれぞれ３つの全長形を考案する。
【００４９】
図１ｂを参考とすれば、本発明による全長形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８、
２）そのＣ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ２、
３）その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、
４）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８、
５）そのＣ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ３、及び
６）その両末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８Ｍ３
である。
【００５０】
前記全長形のｐ１８組換えタンパク質において、ＨＭ２ｐ１８は、配列番号：４２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ２は、配列番号：４４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ２ｐ１８Ｍ２は、配列番号：４６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ３ｐ１８は、配列番号：４８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ３は、配列番号：５０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ３ｐ１８Ｍ３は、配列番号：５２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：５１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５１】
本発明においては、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の対照群としてＭＴＤが融合されず、ヒスチジンタグとＮＬＳのみが融合されたｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８を製造する。この対照群タンパク質は、配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５２】
また本発明は、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター及びこの組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００５３】
本発明において、「組換え発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において標的タンパク質または標的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結されている必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００５４】
本発明において、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を担うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコードする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野によく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造でき、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結には、当該技術分野に一般に知られた酵素などを用いる。
【００５５】
本発明に使用可能な発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、終結コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、目的に応じて多様に製造されてもよい。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製が可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。
【００５６】
このように製造された本発明の組換え発現ベクターは、例えばｐＨｐ１８Ｍ１であってもよい。前記組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１は、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＭＣＳ）のＮｄｅＩ制限酵素部位に、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質として全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１をコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを意味する。
【００５７】
本発明の一実施例では、タンパク質の精製を容易にする目的で、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のＮ末端部位に人為的に６つのヒスチジンタグを含めて発現させるために、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に本発明のヌクレオチドをクローニングした。
【００５８】
前記組換え発現ベクターから発現される細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、全長又は切頭形のｐ１８にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤの１つが融合され、そのＮ末端部位にヒスチジンタグとＮＬＳが連結されている。
【００５９】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。本発明の形質転換細菌は、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌を本発明の組換え発現ベクター、例えば本発明による全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１を用いることにより、多量の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を発現させることができる。形質転換には、核酸を宿主細胞に導入するいかなる方法も含まれ、当業者に公知となった形質転換技術により行ってもよい。好ましくは、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、ＰＥＧ媒介性融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソーム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）などが含まれるが、これに制限されない。
【００６０】
本発明の好ましい実施例では、前記方法で製造された全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１、その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、及びそのＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８それぞれを含む組換え発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた形質転換細菌を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）内の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ−１１０３１０ＢＰ、ＫＣＴＣ−１１０３１１ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１０３１２ＢＰとして寄託した。
【００６１】
本発明はまた、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００６２】
前記製造方法は、本発明の形質転換細菌に導入された組換え発現ベクターにおいて本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現されるように形質転換細菌を適切な培地及び条件下で培養することにより行われる。前記形質転換細菌を培養して組換えタンパク質を発現させる方法は、当該分野で公知となっており、例えば、形質転換細菌が成長できる適切な培地に接種して継代培養した後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件、例えば、遺伝子発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）の存在下で培養することによって、タンパク質の発現を誘導できる。培養が完了すると、前記培養物から実質的に純粋な組換えタンパク質を回収できる。本発明において用語「実質的に純粋な」とは、本発明の組換えタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドの配列が宿主細胞由来の他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００６３】
前記形質転換細菌で発現された組換えタンパク質の回収は、当業界で公知の様々な分離及び精製方法を通じて行ってもよく、通常、細胞残屑（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿及びリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行ってもよく、透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行ってもよい。前記クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ぎクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性カラムクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独で用い、または併用してもよい（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。
【００６４】
一方、組換え発現ベクターで形質転換された細菌で発現された組換えタンパク質は、タンパク質分離の際、タンパク質の特性に応じて溶解性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶解性分画（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に区分され得る。発現されたタンパク質のほとんどが溶解性分画である場合には、前述の方法に従って容易にタンパク質を分離及び精製することができる。しかし、発現されたタンパク質の大部分が不溶解性分画、即ち、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在する場合には、尿素（ｕｒｅａ）、界面活性剤などのタンパク質変性剤が含まれた溶液で最大限タンパク質を溶解させた後、遠心分離して透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行うことによって精製することができる。この際、タンパク質変性剤が含まれた溶液によりタンパク質の構造が変形されてその活性を失うことがあるので、不溶解性分画からタンパク質を精製する過程中には脱塩及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要である。即ち、前記脱塩及びリフォールディング段階は、タンパク質変性剤が含まれていない溶液を用いて透析及び希釈を行うか、またはフィルターを用いて遠心分離してもよい。また、前記溶解性分画からタンパク質を精製する過程中にも、精製時に用いる溶液中の塩濃度が高い場合は、このような脱塩及びリフォールディング段階を行ってもよい。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が封入体の形態で不溶解性分画に存在することを確認し、不溶解性分画からこれを精製するために、不溶解性分画をトリトンＸ−１００のような非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液に溶解させた後、超音波で処理し、遠心分離して沈殿物を得る。前記得られた沈殿物を変性剤である尿素が含まれている溶液に溶解させた後、遠心分離して上清を得る。尿素を用いて不溶解性分画から最大限溶解した本発明の組換えタンパク質は、ヒスチジン結合精製キットを用いて精製し、その後精製されたタンパク質は、アミコンフィルターなどを用いた遠心分離により塩分の除去及びタンパク質構造のリフォールディング過程を行うことによって、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００６６】
さらに、本発明は、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有するｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物を提供する。
【００６７】
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、腫瘍抑制因子であるｐ１８が欠損するか、機能が消失した場合、ｐ１８を細胞内に高効率で導入し、ＤＮＡ損傷又は腫瘍形成信号による細胞周期の阻害とアポトーシスを誘導するＡＴＭとｐ５３の活性化に関連する信号伝達機構を再活性化させることにより、ヒトの多様な癌を予防及び／又は治療するための抗癌剤として有用に用いられる。
【００６８】
本発明による組換えタンパク質を有効成分として含有する組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。経口投与用の場合、本発明による組換えタンパク質は、賦形剤と混合してチュアブル錠、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ及びウエハーなどの形態で用いてもよい。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含み、安定化剤及び保存剤をさらに含んでもよい。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にして用いてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５））。
【００６９】
本発明による組成物は、種々の非経口または経口投与の形態に剤形化してもよい。非経口投与用剤形の代表的なものは注射用剤形であり、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤形は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術によって製造してもよい。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化してもよい。また、経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）と滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。前記錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含んでもよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含んでもよい。前記剤形は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造してもよい。
【００７０】
本発明の組成物は、防腐剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤のような補助剤とその他治療的に有用な物質をさらに含んでもよく、通常の方法に従って製剤化してもよい。
【００７１】
また、本発明による組成物の投与経路としては、経口的、または静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内などのように非経口的にヒトと動物に投与してもよい。経口投与は、舌下適用も含む。非経口的投与は、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、腫瘍直接注射のような注射法及び点滴法を含む。
【００７２】
本発明の組成物において、本発明の組換えタンパク質の合計有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与してもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与してもよい。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にしてもよいが、通常、成人を基準に１回投与時、５〜２０ｍｇの有効投与量で１日に数回繰り返し投与してもよい。しかし、前記組換えタンパク質の濃度は、薬物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重篤度、食餌及び排泄率等の様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量を決定してもよい。従って、このような点を考慮すると、当該分野の通常の知識を有する者であれば、前記組換えタンパク質の抗癌剤としての特定の用途に応じる適切な有効投与量を決定できるであろう。本発明による組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者に自明であろう。
【００７４】
実施例１：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）の製造
<１−１>ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質の製造
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）を用いて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を製造するために、下記の通り３つの全長形と５つの切頭形を考案した（図１ａ）。
【００７５】
まず、全長形のｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にｋＦＧＦ４−由来ＭＴＤが融合されたＭ１ｐ１８；２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ１；及び３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＭ１ｐ１８Ｍ１を製造するために、それぞれについて特異的に考案されたプライマー対とヒトｐ１８ ｃＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った（図２ａ）。この時、Ｍ１ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１４の塩基配列を有し；Ｍ１ｐ１８Ｍ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１４の塩基配列を有する。
【００７６】
また、切頭形のｐ１８組換えタンパク質として、１）Ｓ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＮＭ１；２）Ｎ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＳＭ１；３）Ｎ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＣＭ１；４）Ｃ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＮＳＭ１；及び５）Ｎ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＳＣＭ１を製造するために、前記のようにＰＣＲを行った（図２ａ）。この時、ｐ１８ＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１５の塩基配列を有し；ｐ１８ＳＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１６及び１７の塩基配列を有し；ｐ１８ＣＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１４及び１８の塩基配列を有し；ｐ１８ＮＳＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１７の塩基配列を有し；ｐ１８ＳＣＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１４及び１６の塩基配列を有する。
【００７７】
ＰＣＲ反応は、鋳型としてヒトｐ１８ｃＤＮＡ１００ng、各０．２ｍＭの最終濃度ｄＮＴＰ混合物、０．６μＭの各プライマー、１０×Ｔａｑ緩衝液５μｌ、及びＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）１μｌを含む溶液を最終体積５０μｌ反応液として行った。ＰＣＲ反応条件は、まず９４℃で３分間熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させた後、９４℃で４５秒、５７℃で４５秒及び７２℃で４５秒の反応を３０回反復し、最終的に７２℃で４分間増幅した。反応が終わった後、１．０％アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行い、増幅された生成物を確認した。図２ａに示すように、それぞれのＭＴＤが融合された組換え断片が目的とするサイズに増幅されたことを確認した。
【００７８】
アガロースゲルで増幅された組換え断片を回収した後、これらそれぞれを商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ;Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて抽出、精製した。抽出した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入した後（図３ａ）、前記ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質遺伝子断片が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを大腸菌ＪＭ１０９感応細胞（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させた。これを１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれた平板ＬＢ培地上で培養し、形質転換された大腸菌を選別し、これを再度液体ＬＢ培地で培養した後、これからそれぞれのｐ１８組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを多量に得た。
【００７９】
図３ｂは、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００８０】
前記でそれぞれのｐ１８組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、制限酵素ＮｄｅＩを用いて３７℃で1時間切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）し、それぞれの組換え断片を得た。一方、ヒスチジンタグとＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−２８（＋）aベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）も制限酵素ＮｄｅＩを用いて前記と同じ条件で切断した。前記組換え断片と、切断されたｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターとを電気泳動で分離し、商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ;Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製した。これらの混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ;Ｔａｋａｒａ、日本）を添加し、１６℃で１２時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した後、ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換させて組換えタンパク質発現ベクターを得た（図４ａ）。
【００８１】
図４ｂは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００８２】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターをそれぞれｐＨｐ１８、ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ１ｐ１８Ｍ１、ｐＨｐ１８ＮＭ１、ｐＨｐ１８ＳＭ１、ｐＨｐ１８ＣＭ１、ｐＨｐ１８ＮＳＭ１、及びｐＨｐ１８ＳＣＭ１と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１で大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて得られた形質転換細菌ＤＨ５α／Ｈｐ１８Ｍ１を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３１０ＢＰとして寄託した。
【００８３】
<１−２>ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質の製造
ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）を用いて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を製造するために、下記の通りそれぞれのＭＴＤに対し３つの全長形を考案した。
【００８４】
まず、ＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＭ２ｐ１８；２）そのＣ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ２；及び３）その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＭ２ｐ１８Ｍ２を製造するために、前記実施例<１−１>の通りＰＣＲを行った（図２ｂ）。この時、Ｍ２ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１９及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び２０の塩基配列を有し、Ｍ２ｐ１８Ｍ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１９及び２０の塩基配列を有する。
【００８５】
また、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＭ３ｐ１８；２）そのＣ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ３；及び３）その両末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＭ３ｐ１８M3を製造するために、前記実施例<１−１>の通りＰＣＲを行った。この時、Ｍ３ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：２１及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び２２の塩基配列を有し；Ｍ３ｐ１８Ｍ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：２１及び２２の塩基配列を有する。
【００８６】
これから増幅されたそれぞれの組換え断片を前記実施例<１−１>と同様な方法でｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入してサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）を確保した後、これを再度ｐＥＴ−２８（＋）aベクターに挿入し、それぞれの組換えタンパク質発現ベクターを得た。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター及びｐＥＴ−２８（＋）aベクターへのそれぞれの組換え断片の挿入は、図３ｃ及び４ｃで確認した。
【００８７】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターをそれぞれｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びｐＨＭ３ｐ１８それぞれに大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた形質転換細菌ＤＨ５α／ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＤＨ５α／ＨＭ３ｐ１８を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１０３１１ＢＰ及びＫＣＴＣ−１０３１２ＢＰとして寄託した。
【００８８】
前記実施例<１−１>及び<１−２>でそれぞれの組換え断片の増幅のために用いられた正方向及び逆方向プライマー対を下記表２に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
実施例２：組換えタンパク質の発現
<２−１>最適な宿主菌株の選抜
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の発現誘導に最も適する宿主菌株を選抜するために、LacIプロモーターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を対象に下記実験を行った。
【００９１】
まず、前記実施例<１−１>で製造された組換え発現ベクター ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、及びｐＨｐ１８（対照群）それぞれを前記大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳそれぞれに熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法で形質転換させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した。その後、組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を１ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１００ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に到達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．６５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３７℃で３時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００９２】
図５ａに示すように、多様な宿主菌株を対象に本発明の組換えタンパク質の発現を調査した結果、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）菌株で最も高い発現量が確認され、これを組換えタンパク質の発現のための最適な菌株として選択した。
【００９３】
<２−２>組換えタンパク質の発現
前記実施例<２−１>で最適な菌株と確認された大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）に組換え発現ベクターｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、及びｐＨｐ１８それぞれを熱ショック方法で形質転換させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した。その後、前記組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を２５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１ｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に到達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．６５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃で３時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００９４】
図５ｂに示すように、約２１ｋＤａのサイズを有する本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、殆ど封入体の形態で不溶解性分画に含まれており、ＩＰＴＧ無処理培養液（−）に比べてＩＰＴＧ処理培養液（＋）において目的タンパク質の発現が顕著に増加していることを確認した。
【００９５】
実施例３：組換えタンパク質の精製
本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、封入体の形態で不溶解性分画に存在するので、これを精製するために、強力な変性剤として８Ｍ尿素を用いた。
【００９６】
まず、本発明の組換え発現ベクターｐＨｐ１８、ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３それぞれに形質転換されたＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）菌株を前記実施例２でのように１ｌのＬＢ培地に培養した。それぞれの培養液を遠心分離して得た菌体を２０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に気泡が生じないように注意しながら懸濁し、これをマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉp）付きのソニケーターを用いて低温で菌体を破砕した。この時、処理時間は、装置の出力を最大出力の２５％に設定し、３０秒処理後、１０秒放置を５分間繰り返した。十分に溶菌された封入体を４℃で１分当り回転数３，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を回収した。回収された上清をニトリルロ三酢酸アガロース（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｇａｒｏｓｅ）にＮｉを付与したＮｉ−ＮＴＡアガロースレジンにローディングした。この時、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースは、予め溶解緩衝液で数回洗浄して平衡化させた後に用いた。上清を４℃で８時間以上振盪機でゆっくり攪拌しながら、レジンに吸着させた。組換えタンパク質が含まれた封入体が吸着したレジンを４℃で１分当り回転数１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して反応液を除去し、非特異的な吸着物質を除去するためにレジンを洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ６．３）を用いて５回洗浄した。洗浄されたレジンにｐＨ４．０の酸性条件でレジン容積２倍の溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ４．５）をローディングし、振盪機で２時間、又は８時間以上攪拌してタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質の純度を検定するために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行った後、ゲルをクマシーブリリアントブルーR（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）で軽く振盪しながら染色し、目的タンパク質のバンドが明確になるまで脱色液を用いて脱色した。
【００９７】
その結果、図６ａ〜６ｃに示すように、マーカータンパク質の泳動位置に比べ、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤがそれぞれ融合された全ての細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が約２１ｋＤａの部位で単一バンドとして検出され、不溶解性分画から純粋に精製されたことを確認した。
【００９８】
実施例４：タンパク質のリフォールディング及び蛍光染色
前記実施例３でのように不溶解性分画から精製された本発明の組換えタンパク質は、強力な変性剤である８Ｍ尿素により変性されたため、これを活性形態に転換させるために、下記の通りリフォールディング過程を行った。
【００９９】
まず、精製された組換えタンパク質をリフォールディング緩衝液（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．５５Ｍグアニジン［Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ］ＨＣｌ、０．４４Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮＤＳＢ、２ｍＭ酸化型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ］及び０．２ｍＭ還元型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ］）を用いて４℃で２４時間透析して変性剤を除去することにより、組換えタンパク質を再活性、即ちリフォールディングさせた。その後、活性化された組換えタンパク質を細胞培養用培地であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で、透析膜（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｐｌｅａｔｅｄ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いて４℃で８時間攪拌した。この時、３時間ごとに容器内のＤＭＥＭを交換した。
【０１００】
これから得られた活性型の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、以後の細胞透過性の効果をより明確に確認するために、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて蛍光標識した。２〜２０ｍｇの組換えタンパク質について３３３ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＩＴＣ １μｌを用いて、光を避けて常温で1時間振盪しながら結合させた。蛍光で標識された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、４℃で１日間ＤＭＥＭ培地に対し透析し、標識されていないＦＩＴＣを除去し、これから回収された組換えタンパク質は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質定量法で、その濃度を分析した。その結果、それぞれの組換えタンパク質の濃度は、約１μｇ／μｌと測定された。
【０１０１】
実施例５：細胞透過性の実験
<５−１>フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性を検証するため、１０μＭ濃度の各タンパク質でマウスのマクロファージに由来するＲＡＷ ２６４．７細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を処理し、３７℃で１時間培養した。この時、ＲＡＷ ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。培養が終結した後、タンパク質で処理されたＲＡＷ ２６４．７細胞の細胞膜に露出されている遊離ＦＩＴＣを除去するためにトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ）で処理し、低温のＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のセルクエストプロソフトウェア（Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ）プログラムを用いてフローサイトメトリーを行った。
【０１０２】
その結果、図７ａ〜７ｃに示すように、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）の場合、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１の細胞透過性が、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８より明確に示された。ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＣＰ−ｐ１８の場合には、ＭＴＤが融合されていない対照群に比べ、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ２、及び両末端にＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２が互いに類似の水準で高い細胞透過性を示した。また、ＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＣＰ−ｐ１８の場合には、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８及びＣ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ３が、両末端にＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８Ｍ３より一層高い水準で細胞透過性を示した。図７ａ〜７ｃにおいて、灰色の曲面は細胞単独の対照群、黒色の曲線はＦＩＴＣ単独対照群、青色の曲線はＭＴＤが融合されていないＨｐ１８、緑色の曲線はＭＴＤ（ＭＴＤ1、ＭＴＤ２又はＭＴＤ３）がＮ末端に融合されたＨＭｐ１８、赤色の曲線は前記ＭＴＤがＣ末端に融合されたＨｐ１８Ｍ、オレンジ色の曲線は前記ＭＴＤが両末端に融合されたＨＭｐ１８Ｍを示す。
【０１０３】
<５−２>共焦点レーザー走査顕微鏡の観察Ｉ
前記実施例<５−１>でフローサイトメトリーにより一次的に細胞透過性が確認された本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質、およびＭＴＤが融合されていないｐ１８対照群タンパク質により、マウスの線維芽細胞に由来するＮＩＨ３Ｔ３細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を１０μＭの濃度で処理し、３７℃で1時間培養した後、共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。用いられたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、培地総量の１０％ＦＢＳと５％ペニシリン／ストレプトマイシン５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養し、組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために１０μｌの封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）をスライド上に点滴した後、１５分後に観察した。前記組換えタンパク質で処理された細胞は、ＭＴＤの細胞内伝達部位の区別が容易になるように核を染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を通じて核への伝達及び細胞透過性を確認し、共焦点レーザー走査顕微鏡は、ノマルスキーフィルタ（ｎｏｍａｒｓｋｉ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて細胞の原形、ＦＩＴＣ蛍光及びＰＩ蛍光を観察した。
【０１０４】
その結果、図８ａ〜８ｃに示すように、フローサイトメトリーの相対的な細胞透過性結果に比例し、明確なＦＩＴＣ蛍光（薄録色）及びＰＩ（赤色）で染色された核内へのタンパク質伝達が観察され、このようにタンパク質の細胞内の透過の有無を直接確認することにより、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性が再度立証された。
【０１０５】
<５−３>共焦点レーザー走査顕微鏡の観察II
前記実施例<５−２>で培養された細胞を対象として細胞透過性が確認された本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が組織状態でも細胞透過性を示すかどうかを確認するために、下記実験を行った。
【０１０６】
このために主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）に対する突然変異で免疫力が欠乏した７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ、中央実験動物、ソウル）を実験動物として用いた。前記マウスの右足にヒト結腸癌細胞株（ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＨＣＴ−１１６細胞（韓国細胞株銀行）を１×１０７の細胞数で注射器（ｏｍｎｉｃａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂ．ＢＲＡＵＮ）を用いて皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して、腫瘍形成を誘導した。一方、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合されたＨｐ１８Ｍ１、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が両末端に融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）がＮ末端に融合されたＨＭ３ｐ１８、及びＭＴＤが融合されていないＨｐ１８を、ＦＩＴＣを用いて蛍光標識した。腫瘍が形成されたマウスに、ＦＩＴＣで標識された前記組換えタンパク質それぞれを３００μｇずつ腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。２時間後、各群のマウスを犠牲にし、これから肝、腎臓、脾臓、肺、心臓、脳及び腫瘍組織を摘出した。摘出された組織をＯＣＴ化合物で包埋して冷凍させた後、マイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて厚さ１４μｍに薄切した。組織切片をスライド上に置いて、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。この時、組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために、１０μｌの封入剤をスライド上に点滴した後、１５分後に観察した。
【０１０７】
その結果、図９に示すように、前記実施例<５−１>で確認されたフローサイトメトリーによる相対的な細胞透過性の測定結果に比例し、全ての組織で明確なＦＩＴＣ蛍光（薄録色）で染色された核内へのタンパク質の伝達が観察された。前記結果から、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、細胞透過性に優れており、目的とするｐ１８タンパク質を効果的に組織内へ伝達できることが分かる。
【０１０８】
実施例６：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能
<６−１>ウエスタンブロッティング
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するために、下記の通りウエスタンブロッティング分析を行った。本実験に用いられた結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６は、韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）から購入した。ＨＣＴ−１１６細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートに１つのウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種して３７℃で１日間成長させた後、細胞周期を同一にするため、再度１日間血清のない条件で培養した。培地を除去した後、ＨＣＴ−１１６細胞を低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１組換えタンパク質とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８組換えタンパク質をそれぞれ１０μＭ及び２０μＭ濃度で処理した。これを、ｐ２１の誘導のために４時間、ｐ５３、ＡＴＭ、ＭＥＫ、ＥＲＫ及びＲｂのリン酸化のために1時間、５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで反応させた。組換えタンパク質で処理された細胞を２００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％トリトン−Ｘ、１０％グリセロール）を用いて氷で３０分間粉砕して集め、得られた細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１分当り回転数１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。これから上清を除去し、ブラッドフォードタンパク質定量法で溶解物溶液に入っているタンパク質を定量し、溶解物は使用するまで−８０℃で保管した。
【０１０９】
ウエスタンブロッティング分析のために、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（２１ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、５３ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１、３５０ ｋＤａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１、４５ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４２／４４ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１、１１０ ｋＤａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。前記で定量された細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い１００Ｖで電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜に７０Ｖで２時間転写させた。転写させた膜は、抗体との非特異的な吸着を防止するため、ＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に溶解させた５％（ｗ／ｖ）粉乳（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｍｉｌｋ）で１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）処理をした後、前記一次抗体のそれぞれを添加し、４℃で１日間反応させた。この後に膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で５回洗浄した後、二次抗体を添加して室温で1時間程度反応させ、ＴＢＳ／T緩衝液で５回洗浄を反復し、化学発光検出用ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）試薬を用いて抗原を検出し分析した。
【０１１０】
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質を対象として実験した結果、図１０に示すように、ｐ１８により細胞周期の停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を生じるｐ２１の発現、ＡＴＭのリン酸化（Ｐ−ＡＴＭ）とｐ５３のリン酸化（Ｐ−ｐ５３）が増加した一方、腫瘍の細胞周期を活性化させるＭＥＫのリン酸化（Ｐ−ＭＥＫ）、ＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）及びＲｂのリン酸化（Ｐ−Ｒｂ）は減少した。特に、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１組換えタンパク質が、培養された癌細胞の細胞周期を阻害し、腫瘍形成を減少させる細胞周期の阻害剤として卓越した機能的な活性を示すことを確認した。
【０１１１】
一方、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＨＭ２ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ２、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２組換えタンパク質及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ３、ＨＭ３ｐ１８Ｍ３組換えタンパク質と、ＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質を対象として、前記と同様にウエスタンブロッティング分析を行った。
【０１１２】
その結果、図１１に示すように、全体的に本発明のｐ１８組換えタンパク質で処理された細胞において、ｐ１８により細胞周期の停止を生じるｐ２１の発現、ＡＴＭのリン酸化（Ｐ−ＡＴＭ）とｐ５３のリン酸化（Ｐ−５３）が増加した一方、腫瘍の細胞周期を活性化させるＭＥＫのリン酸化（Ｐ−ＭＥＫ）、ＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）及びＲｂのリン酸化（Ｐ−Ｒｂ）は減少した。特にｐ１８のＮ及びＣ末端の両方にＭＴＤ２が融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２組換えタンパク質とそのＮ末端にのみＭＴＤ3が融合されたＨＭ３ｐ１８組換えタンパク質が、腫瘍形成を減少させる細胞周期の阻害剤として卓越した機能的な活性を示すことを確認した。
【０１１３】
<６−２>細胞性ＤＮＡ含量の分析
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するため、下記の通り細胞性ＤＮＡ含量分析（ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて前記組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を調査した。
【０１１４】
結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（韓国細胞株銀行）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートにウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種した後、３７℃で１日間培養した。各ウェルに組換えタンパク質としてｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合されたＨＭ１ｐ１８とＨｐ１８Ｍ１、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８をそれぞれ２０μＭ濃度で処理した後、１時間無血清培地で培養した。前記ウェルプレートを低温のＰＢＳで２回洗浄した後、ウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、それぞれ０、２、４及び８時間さらに培養した。それぞれの培養時間の経過後、細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、これを４ｍｌの７０％エタノールに慎重に浸けた。この細胞浮遊液を氷上で４５分間放置した後、−２０℃で１日間保管した。前記細胞培養液をＰＩ（４０μｇ／ｍｌ）とＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、アポトーシスの程度をフローサイトメトリーを用いて定量的に決定した。
【０１１５】
その結果、図１２に示すように、無処理群及びＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質（Ｈｐ１８）処理群に比べ、ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群（ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）において高比率で癌細胞の細胞周期の進行が阻害され、アポトーシスが誘導されることを確認した。特に組換えタンパク質で処理し、８時間培養した場合において、アポトーシスが誘導された程度が最も高く、またＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８が最も優れたアポトーシス誘導効果を示した。
【０１１６】
<６−３>アネキシン−Ｖを用いたアポトーシス誘導効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するため、下記の通りアネキシン−Ｖを用いて組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を調査した。
【０１１７】
結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（韓国細胞株銀行）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートにウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種した後、３７℃で１日間培養した。各ウェルに組換えタンパク質としてＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８をそれぞれ２０μＭ濃度で処理した後、２時間無血清培地で培養した。培養時間の経過後に細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０６の細胞を１ｍｌの１×結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に浮遊させた。その後、１００ｍｌの細胞をＥＰ−チューブに移し、このチューブに５ｍｌのアネキシン−Ｖと５ｍｌのＰＩを添加し、１５分間常温で反応させた。次いで、４００ｍｌの1×結合緩衝液で前記培養液を処理した後、アポトーシス誘導の程度をフローサイトメトリーを用いて定量的に決定した。
【０１１８】
その結果、図１３に示すように、無処理群及びＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質（Ｈｐ１８）処理群に比べ、ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群（ＨＭ３ｐ１８）において高比率でアポトーシスが誘導されたことを確認した。
【０１１９】
実施例７：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−腹腔注射
<７−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するため、下記の通り動物モデルを用いて抗癌効果を検証した。
【０１２０】
本実験では、動物モデルとしてＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ、中央実験動物、ソウル）を用いた。前記マウスの右足にＨＣＴ−１１６細胞（韓国細胞株銀行）を１×１０7の細胞数で注射器（ｏｍｎｉｃａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂ．ＢＲＡＵＮ）を用いて皮下注射した。各群当り６匹ずつ計４群に分けて実験した。ノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が１００ｍｍ３と測定された日から１μｇ／μｌ濃度のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８（群３）及びＨｐ１８Ｍ１（群４）をそれぞれ３００μｇずつ２１日間腹腔注射した。対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、群１）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（群２）をそれぞれ３００μｌずつ２１日間同様に腹腔注射した。２１日間タンパク質処理後、毎日各群のマウスの腫瘍のサイズと体重の変化を測定し、その結果を図１４ａ及び１４ｂで示した。
【０１２１】
図１４ａ及び１４ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質であるＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１でそれぞれ処理されたマウス（群３及び４）の腫瘍サイズは、対照群（群1及び２）に比べてその成長が顕著に抑制された一方、実験期間中、マウスの体重は、対照群と細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群のいずれも有意味な変化を示さなかった。細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群に生成された腫瘍サイズと体重に関する平均値のp値は０．０５以下で、これは結果の有意性を示す。図１５は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を２１日間投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を示した写真で、肉眼でも対照群に比べて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群のマウスにおいて腫瘍サイズが顕著に減少したことが分かる。
【０１２２】
<７−２>投与期間後の抗癌効果
本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１）の投与後、体内の抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<７−１>でのように２１日間のタンパク質投与後に４群からそれぞれ２匹のマウスを選定し、全ての処理を中止した後、７日間腫瘍サイズを観察した。
【０１２３】
その結果、図１６ａ及び１６ｂに示すように、全ての群において腫瘍サイズが増加する様相を呈したが、タンパク質処理期間に腫瘍サイズが相当抑制されたＨＭ１ｐ１８処理群（群３）は、対照群のように腫瘍サイズが急激に増加した一方、Ｈｐ１８Ｍ１処理群（群４）では、腫瘍サイズの増加率が他の群に比べて顕著に低いことを確認した。前記結果から、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質であるＨｐ１８Ｍ１が生体内で安定的にその有効性を維持し、癌の細胞周期阻害剤として持続的に作用していることが分かる。
【０１２４】
実施例８：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−静脈注射
<８−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するために、前記実施例７と同様な方法で、ＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の右足に、ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ−１１６細胞を１×１０７の細胞数で注射器を用いて皮下注射した。５匹を一群化し、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８、３００μｇ）及び対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（３００μｇ）を投与する計３群で実験した。ノギスを用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が７０〜８０ｍｍ３を示すマウスを選択し、１μｇ／μｌの濃度でＨＭ３ｐ１８を３００μｇずつ１４日間静脈注射した。対照群としては、ＭＴＤが結合していないＨｐ１８タンパク質とＲＰＭＩ １６４０培地を同様な方法でマウスに静脈注射した。
【０１２５】
その結果、図１７ａ及び１７ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウス群において、腫瘍サイズの成長が対照群に比べて顕著に抑制された。また、対照群として１４日間処理したマウス群の体重は徐々に減少した一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で１４日間処理したマウス群の体重は、対照群に比べて減少しておらず、腫瘍サイズの成長が抑制されながら体重が増加した。図１８は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を１４日間静脈注射で投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【０１２６】
<８−２>投与期間後の抗癌効果
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）の投与後に体内抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<８−１>でのように１４日間のタンパク質投与後、３群から２匹のマウスをそれぞれ選定し、担体と全てのタンパク質処理を中止し、２週間腫瘍サイズを観察した。
【０１２７】
その結果、図１９に示すように、対照群の群（担体）では、腫瘍のサイズが急激に増加する様相を呈したが、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の処理が中止されたマウス群（ＨＭ３ｐ１８）では、腫瘍サイズの急激な増加なしに処理期間中と類似する水準で維持された。これは、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が生体内に投与され、癌細胞の細胞周期を完全にリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）し、癌細胞がこれ以上細胞分裂できないように正常細胞化することにより、癌の細胞周期の阻害剤として持続的に作用していることを示すものである。
【０１２８】
実施例９：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−腫瘍直接注射
<９−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するために、前記実施例７と同様な方法でＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の右足に、ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ−１１６細胞を１×１０７の細胞数で注射器を用いて皮下注射した。５匹を一群化し、ｋＦＧＦ由来ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、３００μｇ）、ＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、３００μｇ）、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８、３００μｇ）、及び対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（３００μｇ）で処理する計５群で実験した。ノギスを用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が９０〜１００ｍｍ３を示すマウスを選択し、１μｇ／μｌの濃度において３００μｇずつ１４日間マウスの腫瘍に直接注射した。この時、対照群としては、ＭＴＤが結合していないＨｐ１８タンパク質とＲＰＭＩ １６４０培地を同様な方法で腫瘍に直接注射した。
【０１２９】
その結果、図２０ａ及び２０ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウス群の腫瘍サイズは、対照群に比べて成長が抑制された。また、対照群として１４日間処理したマウス群の体重は徐々に減少した一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で１４日間処理したマウス群の体重は、対照群に比べて減少しておらず、腫瘍サイズの成長が抑制されながら体重は増加した。図２１は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を１４日間腫瘍直接注射で投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【０１３０】
<９−２>投与期間後の抗癌効果
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）の投与後に体内抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<９−１>でのように１４日間のタンパク質投与後、各群から２匹のマウスを選定し、担体と全てのタンパク質処理を中止し、２週間腫瘍サイズを観察した。
【０１３１】
その結果、図２２に示すように、対照群（担体）では、腫瘍サイズが増加する様相を呈したが、本発明による組換えタンパク質処理群では腫瘍の成長が明確に阻害されていることを確認した。
【０１３２】
実施例１０：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の組織学的な変化の分析I
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後、腫瘍組織内におけるアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてヘマトキシリン−エオシン染色を行った。
【０１３３】
具体的には、前記実施例８でのように３群（各群当り５匹）のマウスに対し、それぞれ静脈注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつ選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間タンパク質処理後、再度１４日間の無処理観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。それぞれの摘出された腫瘍組織をホルマリンで固定して洗浄した後、包埋センター（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ）で６２℃に溶かしたパラフィンを用いてパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトームを用いて厚さ４μｍに薄切し、スライドに付着させた後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で５分ずつ３回処理してパラフィンを除去した。次いで、１００％、１００％、９５％、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ２分ずつ処理して含水させ、流水で５分間洗浄した後、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。最後に７０％から１００％エタノールで１０秒ずつ処理して脱水させ、キシレンで３分ずつ２回の投影過程を経た後、封入剤であるカナダバルサム（ｃａｎａｄａ ｂａｌｓａｍ）を用いて封入し、光学顕微鏡で観察した。
【０１３４】
その結果、図２３に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に組織学的な変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス様の細胞死に特徴的に示される核凝縮と核分節などの形態学的な変化が観察された。また本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されていることを確認した。
【０１３５】
実施例１１：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の組織学的な変化の分析II
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内におけるアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例９のマウス動物モデルを用いてヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【０１３６】
具体的には、前記実施例９でのように５群（各群当り５匹）のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１０と同様な方法でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【０１３７】
その結果、図２４に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に組織学的な変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス様の細胞死に特徴的に示される核凝縮と核分節などの形態学的な変化が観察された。
【０１３８】
実施例１２：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析I
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内でアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてＴＵＮＥＬ分析を行った。
【０１３９】
具体的には、前記実施例８でのように３群のマウスに対し、静脈注射でそれぞれ細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつを選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間のタンパク質処理後、再度１４日間の無処理観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。前記実施例１０のように、摘出された腫瘍組織から組織切片を作製した後、これをスライドに付着させた。前記スライドをキシレンで５分間３回処理し、パラフィンを除去した。次いで、無水エタノールで５分間２回、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ３分間処理して含水させ、ＰＢＳで５分間保管した。この後、８分間０．１％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液に溶かした０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｉｏｎ（登録商標））Ｘ−１００溶液で細胞を透過させた後、ＰＢＳで２分間２回洗浄した。ＴＵＮＥＬ反応緩衝液（５０μｌ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を前記組織スライド上で処理し、１時間３７℃湿潤インキュベーターで培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
【０１４０】
その結果、図２５に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に赤く染色される変化が観察され、これから本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されることが分かった。
【０１４１】
実施例１３：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析II
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内でアポトーシス誘導効果が誘導されることを免疫組織化学的に確認するために、アポタグペルオキシダーゼインサイチュ・アポトーシス検出キット（ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｓ７１００）を用いて下記実験を行った。
【０１４２】
具体的には、前記実施例８でのように、３群のマウスに対し、静脈注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつを選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間のタンパク質処理後、再度１４日間の無処理の観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。前記実施例１０のように、摘出された腫瘍組織から組織切片を作製した後、これをスライドに付着させた。前記スライドをキシレンで５分間３回処理し、パラフィンを除去した。次いで、１００％、９０％及び７０％アルコールで順次３分間処理して含水させた後、前記スライドを５分間ＰＢＳで培養した。前記スライドを２０μｇ／ｍｌ濃度のプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｓｉｇｍａ）で１５分間処理し、蒸溜水で洗浄した後、３％ Ｈ２Ｏ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ、ｉｎ ＰＢＳ）で５分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の活性を抑制した。前記スライドを平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）緩衝液で１０秒間処理した後、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｘｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＴｄＴ）により３７℃で1時間処理した。反応が終結した後、前記スライドを停止（ｓｔｏｐ）緩衝液で処理し洗浄した。次いで、スライドをＤＡＢ発色試薬で５分間処理し、メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対比（ｃｏｕｎｔｅｒ）染色した。染色後に脱水過程を経た後、スライド上をカバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ）でシールし、光学顕微鏡で観察した。
【０１４３】
その結果、図２６に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に褐色に染色される変化が観察され、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されていることが分かった。
【０１４４】
実施例１４：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析III
前記実施例９でのように、５群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１２と同様な方法でＴＵＮＥＬ分析を行った。
【０１４５】
その結果、図２７に示すように、対照群として担体で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に赤く染色される変化が観察され、これから本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。
【０１４６】
実施例１５：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析IV
前記実施例９でのように、５群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１３と同様な方法でアポタグ分析を行った。
【０１４７】
その結果、図２８に示すように、対照群として担体で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に褐色に染色される変化が観察され、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。
【０１４８】
実施例１６：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のタンパク質発現様相の比較
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が投与された組織におけるタンパク質発現様相の変化を確認するために、下記の通りマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を行った。
【０１４９】
具体的には、前記実施例９と同様な方法で３群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８Ｍ２と、対照群としてＨｐ１８及び担体により１４日間処理した後、この処理を中止して１４日間放置した。計２８日経過後、各群のマウスから腫瘍組織を分離した後、これを液体窒素で急速冷却させた。腫瘍組織から全ＲＮＡをトリゾール試薬（ＴＲＩＺＯＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの指針に従って分離し、これを無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で処理し、残存するゲノムＤＮＡを除去した。
【０１５０】
前記で分離されたＲＮＡに対し、標的ｃＲＮＡプローブの合成及びハイブリダイゼーションをメーカーの指針に従ってローＲＮＡインプット・リニア・アンプリフィケーションキット（Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。簡略に説明すると、それぞれの全ＲＮＡ １μｇとＴ７プロモータープライマーを混合し、６５℃で１０分間反応させた。５×一本鎖緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ及びＭＭＬＶ−ＲＴ（逆転写酵素）を混合してｃＤＮＡマスタミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を製造した後、これを前記反応混合物に添加した。この混合物を４０℃で２時間反応させた後、６５℃で１５分間反応させて逆転写反応及びｄｓＤＮＡ合成を終結させた。メーカーの指針に従って４×転写緩衝液（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＮＴＰミックス、５０％ ＰＥＧ、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ、無機ピロホスファターゼ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、及びシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ、３／５−ＣＴＰ）を用いて転写マスタミックスを製造した。この転写マスタミックスをｄｓＤＮＡ反応混合物に添加し、４０℃で２時間反応させてｄｓＤＮＡの転写を行った。増幅されて標識されたｃＲＮＡをメーカーの指針に従ってｃＲＮＡクリーンアップモジュール（ｃＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で精製した。標識されたｃＲＮＡ標的をＮＤ−１０００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて定量した。標識効率を調査した後、ｃＲＮＡに１０×ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）及び２５×フラグメンテーション緩衝液（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、６０℃で３０分間反応させてｃＲＮＡの断片化を行った。断片化されたｃＲＮＡを２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁した後、全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、４４Ｋ）上にピペットを用いて直接滴加した。ハイブリダイゼーションオーブン（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて前記マイクロアレイを６５℃で１７時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたマイクロアレイをメーカー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の洗浄指針に従って洗浄した。
【０１５１】
ハイブリダイゼーションパターンをＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて読み出し、特徴抽出ソフトウェア（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で定量した。倍率変化した（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ）遺伝子の全てのデータ標準化及び選別は、ジーンスプリングＧＸ（Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。標準化比率の平均は、標準化された信号チャンネル強度を標準化された対照群チャンネル強度で割って計算した。遺伝子の機能的アノテーションは、遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標） Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従ってジーンスプリングＧＸにより行われた。
【０１５２】
前記マイクロアレイの分析結果を図２９及び下記表３〜７に示すが、表３は、アポトーシスに関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表４ａ及び４ｂは、細胞周期の調節に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表５ａ〜５ｃは、細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表６は、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表７は、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）及び血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものである。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】
【表４ａ】
【０１５５】
【表４ｂ】
【０１５６】
【表５ａ】
【０１５７】
【表５ｂ】
【０１５８】
【表５ｃ】
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
前記表３に示すように、アポトーシスに関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群においてタンパク質キナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ；ＰＲＫＣＥ）と細胞死インデューサーオブリテレーター１（ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｒ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｏｒ １；ＤＩＤＯ１）の発現が１．５倍以上、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー８（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ ８；ＴＮＦＲＳＦ１８）の発現が２倍以上上方調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）された一方、ホスフィノシチド−３−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩＫ３Ｒ２）の発現が３倍以上下方調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されていることが分かる。
【０１６２】
前記表４ａ及び４ｂに示すように、細胞周期調節に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において網膜芽細胞腫結合タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ６；ＲＢＢＰ６）の発現が１．８倍以上上方調節されていることが分かる。
【０１６３】
前記表５a〜５cに示すように、細胞成長に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において無翼型のＭＭＴＶ統合部位ファミリー、メンバー１０Ａ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ １０Ａ；ＷＮＴ１０Ａ）の発現が２倍以上、同一ファミリー、メンバー１６Ａ（ＷＮＴ１６Ａ）の発現が２．５倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６４】
前記表６に示すように、細胞増殖に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群においてＣＤ２８の発現が４倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６５】
前記表７に示すように、癌転移及び血管新生に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において転移関連タンパク質１（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＭＴＡ１）の発現が２倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６６】
以上で本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施様態であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されるわけではないことは言うまでもない。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されると言える。
【０１６７】
受託証１
【０１６８】
受託証２
【０１６９】
受託証３
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されて細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の発現ベクター及び前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有するｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）と呼ばれる一定の規則的な過程を経て分裂、増殖する。細胞周期とは、細胞分裂が起こり、再度次の細胞分裂が起こるまでの一連の過程を意味するが、細胞分裂を準備する休止期であるＧ１期を始めとし、染色体ＤＮＡを複製するＳ期を経て、他の休止期で、かつ最後の有糸分裂に備えて活発なタンパク質の合成がなされるＧ２期、及びその後に倍加したそれぞれの染色体が均等に分配されるＭ期、即ち、分裂期につながる秩序ある過程を経るようになる。このような一連の過程を循環、反復して細胞が増殖し完成する。
【０００３】
また、細胞には、細胞周期を促進させる機構と共に「細胞周期のチェックポイント（ｃｈｅｃｋ ｐｏｉｎｔ）」という細胞周期の進行を点検する段階があり、異常が感知されれば細胞周期を停止させ、これを矯正する機構を作動させる。例えば、ＤＮＡが損傷を受けたり、放射線が照射された細胞では、腫瘍形成反応を進行する間、Ｇ１期からＳ期への進行を阻止するＧ１期のチェックポイント、Ｓ期の進行を延ばすＳ期のチェックポイント、細胞周期をＧ２期で停止させ、Ｍ期への進行を阻止するＧ２期のチェックポイントを通じて細胞周期の進行が遮断される（Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）（非特許文献１））。
【０００４】
このような細胞周期の精巧な調節は、様々な調節因子により誘導されるが、その中で最も重要な役割を果たすのが、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ；ＣＤＫ）である。ＣＤＫは、細胞周期の各段階ごとに特異的に発現されるサイクリンという調節タンパク質と結合して機能的な単位を形成するようになるが、これにより細胞周期の各段階ごとに活性化される特異的で多様な組合わせのサイクリン−ＣＤＫ複合体が製造される。もし、Ｇ１チェックポイントで細胞が成長過程に行けると判断されればＳ期に細胞周期が進行されるが、まずサイクリンＤとサイクリン依存性タンパク質キナーゼ２（ＣＤＫ２）又は６（ＣＤＫ６）が活性化され、Ｓ期の進入時にサイクリンＥとＣＤＫ２の複合体が活性化され、サイクリンＡは、Ｇ１後期とＳ期の初期にＣＤＫ２と結合して細胞周期の進行を実行する。
【０００５】
前述のように、細胞周期の進行は、多様なサイクリンとこれに結合するキナーゼにより調節され、ＣＤＫの活性化を抑制するＣＤＫ４インヒビター（ＩＮＫ４）とＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ抑制タンパク質（ＣＤＫ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＩＰ／ＫＩＰ）ファミリーなどのＣＤＫ抑制因子の結合が重要に作用する（Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）（非特許文献２））。また、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ；ＰＩＫＫ）ファミリーのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼであるＡＴＭ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）は、ＤＮＡ損傷や腫瘍形成信号を受けると、細胞周期のチェックポイントを調節することにより、ゲノムの完全性と安全性を維持することが知られているが、ｐ５３、ＭＤＭ２（ｍｕｒｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２）、ＢＲＣＡ１のような下流の基質タンパク質を活性化させて細胞のＤＮＡ損傷反応を抑制することとなる（Ｌｕ、Ｓ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７：８４８−５５（２００６）（非特許文献３））。例えば、二本鎖ＤＮＡの損傷のような著しい遺伝子の損傷信号が細胞内に伝達されれば、ＡＴＭが細胞周期の抑制、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導に関連する標的タンパク質を活性化させて遺伝子の転写を調節し、損傷した遺伝子を復旧することとなる（Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４））。
【０００６】
このようなＡＴＭに関連するｐ１８は、ヒトとマウスを対象とした実験において、腫瘍抑制因子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）として作用することが確認された。ｐ１８の欠損又は機能の消失は、ＤＮＡ損傷や突然変異を引き起こした細胞のアポトーシスを抑制することにより、癌に対する感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増加させるが、これは細胞を悪性形態（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に変化させる（Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ．Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４））。ｐ１８の機能を調査するために、この遺伝子の機能が破壊されたノックアウトマウス（ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ）を対象とした研究において、ｐ１８の機能を完全に消失した場合は、受精後に胚致死が示され、ｐ１８機能が正常より低くなった場合は、成長しながら肝癌、乳癌、肺癌など多種の癌が発病していることが報告されている（Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５）） 。また、ｐ１８は、ＤＮＡ損傷に反応して核中へ伝達され活性化されるが、ｐ１８の発現が増加すれば細胞増殖と死滅を調節する機構を有する他の腫瘍抑制遺伝子であるｐ５３がリン酸化されて活性化され（Ｆｒｅｎｃｈ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２２：９９−１０６（２００１）（非特許文献６）及びＩｄｅ、F．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７２９−３３（２００３）（非特許文献７））、反対にｐ１８が欠乏すれば、ｐ５３の発現が抑制される（Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））。
【０００７】
このようなｐ１８遺伝子は、リンパ腫でヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ：ｌｏｓｓ−ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）が発見された染色体の６Ｐ２４−２５部位に位置しており、この染色体部分における遺伝子の欠損がｐ１８の低い発現の原因になり、癌が発生するという主張も提起されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、Ａ．Ｋ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１５０９−１６（２００３）（非特許文献８））。更に、最近の研究によれば、多様なヒト癌細胞株でも一般的に、高頻度でｐ１８の機能が低下していることが発見されており、これはｐ１８がハプロ不全腫瘍抑制因子（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）であり、ＡＴＭと相互作用を通じたｐ５３の重要な調節子として機構内で進行速度を制限する速度制限因子（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であることを提示するものである（Ｐａｒｋ, Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））。
【０００８】
そこで、本発明者は、ＤＮＡ損傷のような腫瘍形成信号に反応して細胞周期を制御しアポトーシスを誘導するｐ５３の活性のためにｐ１８が直接ＡＴＭに作用するということから（Ｓａｖｉｔｓｋｙ、Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２０２５−３２（１９９５）（非特許文献９））、ＡＴＭとｐ５３を含む細胞周期のチェックポイントの信号伝達の経路内でｐ１８がハプロ不全腫瘍抑制因子として重要な標的タンパク質であることを確信し（Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）（非特許文献１）；Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）（非特許文献２）；Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ.Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：２５７−８（２００５）（非特許文献４）；及びＰａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ １２０：２０９−２１（２００５）（非特許文献５））、これを用いて新規抗癌剤の開発のために鋭意研究をした。
【０００９】
一方、合成化合物または天然物の小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できるが、タンパク質、ペプチド、核酸のような巨大分子（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は細胞内に伝達できない。これらは、分子量５００以上の巨大分子で、生きている細胞の原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、即ち、二重脂質膜構造（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を通過することができないことが広く知られている。これを克服するための方法として、「巨大分子細胞内伝達技術（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＭＩＴＴ）」が開発されたが（Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）（非特許文献１０））、これは疾病治療性巨大分子の生体内伝達を可能にすることによって、既存の医薬品開発技術では不可能であったペプチド、タンパク質、遺伝子自体を用いるバイオ新薬物の開発を可能にする。この技術によると、巨大分子は「疎水性巨大分子伝達ドメイン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）」と他の様々な細胞内運搬体と融合され、組換えタンパク質の形態で合成または発現、精製され、細胞内に伝達された後、特定位置に正確かつ迅速に運搬され、所要の様々な役割を効果的に発揮できる。このように巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成化合物などと融合されて細胞内に入れない多くの不透過性物質の伝達を可能にする。
【００１０】
そこで、本発明者は、腫瘍抑制因子ｐ１８に巨大分子の伝達ドメインを融合させて細胞透過性を付与したｐ１８組換えタンパク質を製造し、この組換えタンパク質がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）だけでなくインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）環境下でも細胞外部から大量の腫瘍抑制因子ｐ１８を細胞内へ効果的に伝達し、ヒトの多様な癌で発生するｐ１８欠損又は機能消失を治療できる抗癌剤として用いられることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋａｓｔａｎ、Ｍ．Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ ４１０：７６６−７（２００１）
【非特許文献２】Ｂａｌｏｍｅｎｏｓ、Ｄ．及びＭａｒｔｉｎｅｚ、Ａ．Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：５５１−５（２０００）
【非特許文献３】Ｌｕ、Ｓ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２７：８４８−５５（２００６）
【非特許文献４】Ａｂｒａｈａｍ、Ｒ.Ｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ.１１：２５７−８（２００５）
【非特許文献５】Ｐａｒｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ１２０：２０９−２１（２００５）
【非特許文献６】Ｆｒｅｎｃｈ、Ｊ．Ｅ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２２：９９−１０６（２００１）
【非特許文献７】Ｉｄｅ、Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：１７２９−３３（２００３）
【非特許文献８】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ、Ａ．Ｋ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１５０９−１６（２００３）
【非特許文献９】Ｓａｖｉｔｓｋｙ、Ｋ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：２０２５−３２（１９９５）
【非特許文献１０】Ｊｏら、Ｎａｔ．ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９２９−３３（２００１）
【発明の概要】
【００１２】
発明が解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、腫瘍抑制因子ｐ１８に細胞透過性を付与し、これを細胞内に高効率で導入することにより、ヒトの多様な癌で発生するｐ１８欠損又は機能消失が治療できる抗癌剤として細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を提供することである。
【００１３】
課題を解決するための手段
前記目的を達成するために、本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合で細胞透過性が付与され、ｐ１８を細胞内に高効率で導入する細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を提供する。
【００１４】
また、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
更に、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及びこの発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００１６】
また、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００１７】
最後に、前記ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有する細胞透過性ｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
発明の効果
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、腫瘍抑制因子であるｐ１８を細胞内に高効率で導入し、ＤＮＡ損傷又は腫瘍形成信号による細胞周期の阻害とアポトーシスを誘導するＡＴＭとｐ５３の活性化に関連する信号伝達機構を再活性化させることにより、ヒトの多様な癌に対する抗癌剤として有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１ａは、本発明によって全長形及び切頭形として考案されたｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の構造を示したものであり、図１ｂは、本発明によって全長形として考案されたＪＯ−１０１及びＪＯ−１０３ＭＴＤがそれぞれ融合されたｐ１８組換えタンパク質の構造を示したものである。
【図２】図２ａは、図１ａで考案された全長形及び切頭形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果であり、図２ｂは、図１ｂで考案された全長形のＪＯ−１０１及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した結果である。
【図３】図３ａは、ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＰＣＲ増幅産物をサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）する過程を示した模式図であり、図３ｂ、図３ｃは、それぞれ図２ａ及び２ｂのＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターにサブクローニングされたことを示したものである。
【図４】図４ａは、本発明の組換え断片をｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにクローニングして組換え発現ベクターを作製する過程を示した模式図であり、図４ｂ、図４ｃは、本発明の組換え発現ベクターにそれぞれの組換え断片がクローニングされたことを示したものである。
【図５】図５ａは、本発明のｐ１８組換えタンパク質の発現を多様な宿主細胞を対象として調査した結果であり、図５ｂは、本発明のｐ１８組換えタンパク質の発現をタンパク質発現誘導剤であるＩＰＴＧの存在（＋）又は非存在（−）下で調査した結果である。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、それぞれ本発明の組換え発現ベクターが形質転換された細菌から発現された全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質を精製した結果である。
【図７】図７ａ〜図７ｃは、それぞれ本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性をフローサイトメトリーで分析した結果である。
【図８】図８ａ〜図８ｃは、それぞれ本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性をマウス線維芽細胞で共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果である。
【図９】図９は、本発明による全長形のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ、及びＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性を多様なマウス組織で共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した結果である。
【図１０】図１０は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１の細胞内機能をウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で分析した結果である。
【図１１】図１１は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ２、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ３及びＨＭ３ｐ１８Ｍ３の細胞内機能をウエスタンブロッティングで分析した結果である。
【図１２】図１２は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８のアポトーシス誘導効果を細胞内ＤＮＡ含量分析を通じて調査した結果である。
【図１３】図１３は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８のアポトーシス誘導効果をインビボのアネキシン−Ｖ（ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）染色を通じて調査した結果である。
【図１４】図１４ａ、図１４ｂは、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腫瘍が形成されたマウスに腹腔注射で２１日間処理した後、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１５】図１５は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腹腔注射で２１日間投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図１６】図１６ａ、図１６ｂは、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１を腫瘍が形成されたマウスに腹腔注射で２１日間処理した後、７日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１７】図１７ａ、図１７ｂは、腫瘍が形成されたマウスを、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８により静脈注射を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図１８】図１８は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに静脈注射で１４日間投与した後、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図１９】図１９は、腫瘍が形成されたマウスを、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８をにより静脈注射を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２０】図２０ａ、図２０ｂは、腫瘍が形成されたマウスを、それぞれ本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８により腫瘍直接注射（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を介して１４日間処理した後、１４日間処理を中止し、毎日腫瘍のサイズと体重の変化を測定した結果である。
【図２１】図２１は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに腫瘍直接注射で１４日間投与した後、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２２】図２２は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍が形成されたマウスに静脈注射で１４日間投与した後、１４日間投与を中止し、腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【図２３】図２３は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織における細胞の組織学的な変化をヘマトキシリンおよびエオシン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ）染色で観察した結果である。
【図２４】図２４は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織における細胞の組織学的な変化をヘマトキシリンおよびエオシン染色で観察した結果である。
【図２５】図２５は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）分析で観察した結果である。
【図２６】図２６は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８を静脈注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をアポタグ（ＡｐｏｐＴａｇ）分析で観察した結果である。
【図２７】図２７は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をＴＵＮＥＬ分析で観察した結果である。
【図２８】図２８は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＨＭ３ｐ１８を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織におけるアポトーシス誘導効果をアポタグ分析で観察した結果である。
【図２９】図２９は、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８Ｍ２を腫瘍直接注射で投与したマウスの腫瘍組織における遺伝子発現の変化をマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）で分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、腫瘍抑制因子ｐ１８と巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）の融合により細胞透過性が付与され、ｐ１８を細胞内に高効率で導入する細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明の特徴は、細胞内への導入が容易でない巨大分子である腫瘍抑制因子ｐ１８に特定の巨大分子伝達ドメイン（以下、「ＭＴＤ」と略称する）を融合させて細胞透過性を付与することにより、ｐ１８を細胞内に高効率で伝達することにある。この時、巨大分子伝達ドメインは、癌転移の抑制因子であるＮｍ２３の片末端にのみ融合されるか、あるいはその両末端の両方に融合されてもよい。
【００２２】
本発明では腫瘍抑制因子であるｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ）、すなわち、細胞内への巨大分子の伝達を可能にする３種のペプチドドメインそれぞれに前記ｐ１８を融合し、細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質を開発した。
【００２３】
本発明において「細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質」とは、巨大分子伝達ドメインと腫瘍抑制因子ｐ１８を含み、これらの遺伝的な融合や化学的な結合で形成された共有結合複合体を意味する。ここで「遺伝的な融合」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝的な発現を通じて形成された線状の共有結合からなる連結を意味する。
【００２４】
ＤＮＡ損傷のような腫瘍形成信号に反応して細胞周期を制御し、アポトーシスを誘導するｐ５３の活性化のために直接ＡＴＭに作用するｐ１８は、配列番号：１の塩基配列及び配列番号：２のアミノ酸配列を有する腫瘍抑制因子であって、ＡＴＭとｐ５３を含む細胞周期のチェックポイントの信号伝達の経路内で重要な標的タンパク質として作用する。
【００２５】
腫瘍抑制因子ｐ１８は、配列番号：２のアミノ酸配列における１位から６０位までのアミノ酸を含むＮ末端ドメイン、６１位から１２０位までのアミノ酸を含むＳ末端ドメイン、及び１２１位から１６８位までのアミノ酸を含むＣ末端ドメインで構成される（図１ａ参照）。
【００２６】
前記腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしては、配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過性を有するポリペプチドを用いてもよい。前記配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する巨大分子伝達ドメインは、細胞膜を貫通してポリペプチド、タンパク質ドメイン、又は全長タンパク質を含む生物学的な活性分子の細胞内への流入を媒介できる細胞透過性ポリペプチドである。本発明による巨大分子伝達ドメインは、Ｎ末端領域、疎水性領域及びＣ末端の分泌タンパク質切断部位（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）の３部分からなるシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）においてヘリックス（ｈｅｌｉｘ）を形成し、細胞膜標的（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）活性を付与する疎水性領域を有するように考案されたものである。このような巨大分子伝達ドメインは、細胞に損傷を加えず、かつ直接細胞膜を透過することにより、標的タンパク質を細胞内に移動させて目的とする機能を発揮させることができる。
【００２７】
本発明により腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい配列番号：４、６、８及び５３〜２４３で表されるアミノ酸配列を有する巨大分子伝達ドメインを下記表１ａ〜１ｌに示す。
【００２８】
【表１ａ】
【００２９】
【表１ｂ】
【００３０】
【表１ｃ】
【００３１】
【表１ｄ】
【００３２】
【表１ｅ】
【００３３】
【表１ｆ】
【００３４】
【表１ｇ】
【００３５】
【表１ｈ】
【００３６】
【表１ｉ】
【００３７】
【表１ｊ】
【００３８】
【表１ｋ】
【００３９】
【表１ｌ】
【００４０】
本発明の好ましい実施態様では、腫瘍抑制因子ｐ１８に融合されてもよい巨大分子伝達ドメインとしてカポジ線維芽細胞成長因子（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４；ｋＦＧＦ４）に由来する配列番号：３の塩基配列及び配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ1」と略称する）、タイレリア・アンヌラータ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ａｎｎｕｌａｔａ）に由来する機能未知タンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）である配列番号：５の塩基配列及び配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ２」と略称する）、及びヒトのＴＭＥＭ９ドメインファミリー、メンバーＢ（ＴＭＥＭ９ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ Ｂ）由来の配列番号：７の塩基配列及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤ（以下、「ＭＴＤ3」と略称する）を用いる。
【００４１】
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、巨大分子伝達ドメインとして前記３種のＭＴＤ（ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ：ＭＴＤ1、ＪＯ−１０１：ＭＴＤ２、ＪＯ−１０３：ＭＴＤ３）のいずれか１つが癌転移の抑制因子ｐ１８の一方又は両末端に融合され、この融合コンストラクトの片末端に配列番号：９の塩基配列を有するＳＶ４０巨大Ｔ抗原（ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）由来の核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ、配列番号：１０のアミノ酸配列）と、容易な精製のために、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ；Ｈｉｓ−Ｔａｇ）親和性ドメインが融合されている構造を有してもよい。
【００４２】
本発明の一実施形態では、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質として３つの全長形（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍｓ）と５つの切頭形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ）を考案する。
【００４３】
本発明において、用語「全長形」は、腫瘍抑制因子ｐ１８のＮ、Ｓ及びＣ末端ドメインの全てを含む形態を意味し、用語「切頭形」はＮ、Ｓ及びＣ末端ドメインのいずれか１つ又は２つのドメインが欠失された形態を意味する。
【００４４】
図１ａを参考とすれば、本発明による全長形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）全長のｐ１８のＮ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８、
２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１、及び
３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８Ｍ１
である。
【００４５】
前記全長形のｐ１８組換えタンパク質において、ＨＭ１ｐ１８は、配列番号：２６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ１は、配列番号：２８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ１ｐ１８Ｍ１は、配列番号：３０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４６】
また、本発明による切頭形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）Ｓ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＮＭ１、
２）Ｎ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＳＭ１、
３）Ｎ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＣＭ１、
４）Ｃ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＮＳＭ１、及び
５）Ｎ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８ＳＣＭ１
である。
【００４７】
前記切頭形のｐ１８組換えタンパク質において、Ｈｐ１８ＮＭ１は、配列番号：３２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＳＭ１は、配列番号：３４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＣＭ１は、配列番号：３６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＮＳＭ１は、配列番号：３８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８ＳＣＭ１は、配列番号：４０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：３９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４８】
本発明の他の実施形態では、巨大分子伝達ドメインとしてＪＯ−１０１ＭＴＤとＪＯ−１０３ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質としてそれぞれ３つの全長形を考案する。
【００４９】
図１ｂを参考とすれば、本発明による全長形のｐ１８組換えタンパク質は、
１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８、
２）そのＣ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ２、
３）その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、
４）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８、
５）そのＣ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ３、及び
６）その両末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８Ｍ３
である。
【００５０】
前記全長形のｐ１８組換えタンパク質において、ＨＭ２ｐ１８は、配列番号：４２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ２は、配列番号：４４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ２ｐ１８Ｍ２は、配列番号：４６のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４５の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ３ｐ１８は、配列番号：４８のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４７の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；Ｈｐ１８Ｍ３は、配列番号：５０のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：４９の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされ；ＨＭ３ｐ１８Ｍ３は、配列番号：５２のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：５１の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５１】
本発明においては、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の対照群としてＭＴＤが融合されず、ヒスチジンタグとＮＬＳのみが融合されたｐ１８組換えタンパク質Ｈｐ１８を製造する。この対照群タンパク質は、配列番号：２４のアミノ酸配列を有し、これは配列番号：２３の塩基配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５２】
また本発明は、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター及びこの組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。
【００５３】
本発明において、「組換え発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において標的タンパク質または標的ＲＮＡを発現できるベクターであり、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結されている必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００５４】
本発明において、用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能を担うように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることをいう。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコードする核酸配列の発現に影響を及ぼし得る。組換え発現ベクターとの作動的連結は、当該技術分野によく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造でき、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結には、当該技術分野に一般に知られた酵素などを用いる。
【００５５】
本発明に使用可能な発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、終結コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、目的に応じて多様に製造されてもよい。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製が可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。
【００５６】
このように製造された本発明の組換え発現ベクターは、例えばｐＨｐ１８Ｍ１であってもよい。前記組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１は、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＭＣＳ）のＮｄｅＩ制限酵素部位に、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質として全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１をコードするヌクレオチドが挿入されたベクターを意味する。
【００５７】
本発明の一実施例では、タンパク質の精製を容易にする目的で、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のＮ末端部位に人為的に６つのヒスチジンタグを含めて発現させるために、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列を有しているｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）に本発明のヌクレオチドをクローニングした。
【００５８】
前記組換え発現ベクターから発現される細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、全長又は切頭形のｐ１８にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤの１つが融合され、そのＮ末端部位にヒスチジンタグとＮＬＳが連結されている。
【００５９】
本発明はまた、前記組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。本発明の形質転換細菌は、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌を本発明の組換え発現ベクター、例えば本発明による全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性組換えタンパク質Ｈｐ１８Ｍ１をコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１を用いることにより、多量の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を発現させることができる。形質転換には、核酸を宿主細胞に導入するいかなる方法も含まれ、当業者に公知となった形質転換技術により行ってもよい。好ましくは、微粒子銃法（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、ＰＥＧ媒介性融合法（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｓｉｏｎ）、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及びリポソーム媒介法（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）などが含まれるが、これに制限されない。
【００６０】
本発明の好ましい実施例では、前記方法で製造された全長のｐ１８のＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１、その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、及びそのＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８それぞれを含む組換え発現ベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた形質転換細菌を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）内の遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ−１１０３１０ＢＰ、ＫＣＴＣ−１１０３１１ＢＰ及びＫＣＴＣ−１１０３１２ＢＰとして寄託した。
【００６１】
本発明はまた、前記形質転換細菌を培養することを含む細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の製造方法を提供する。
【００６２】
前記製造方法は、本発明の形質転換細菌に導入された組換え発現ベクターにおいて本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現されるように形質転換細菌を適切な培地及び条件下で培養することにより行われる。前記形質転換細菌を培養して組換えタンパク質を発現させる方法は、当該分野で公知となっており、例えば、形質転換細菌が成長できる適切な培地に接種して継代培養した後、これを本培養用培地に接種し、適切な条件、例えば、遺伝子発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）の存在下で培養することによって、タンパク質の発現を誘導できる。培養が完了すると、前記培養物から実質的に純粋な組換えタンパク質を回収できる。本発明において用語「実質的に純粋な」とは、本発明の組換えタンパク質及びこれをコードするポリヌクレオチドの配列が宿主細胞由来の他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００６３】
前記形質転換細菌で発現された組換えタンパク質の回収は、当業界で公知の様々な分離及び精製方法を通じて行ってもよく、通常、細胞残屑（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿及びリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行ってもよく、透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行ってもよい。前記クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ぎクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、親和性カラムクロマトグラフィー及び限外ろ過などの技法を単独で用い、または併用してもよい（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｄ Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））。
【００６４】
一方、組換え発現ベクターで形質転換された細菌で発現された組換えタンパク質は、タンパク質分離の際、タンパク質の特性に応じて溶解性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶解性分画（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に区分され得る。発現されたタンパク質のほとんどが溶解性分画である場合には、前述の方法に従って容易にタンパク質を分離及び精製することができる。しかし、発現されたタンパク質の大部分が不溶解性分画、即ち、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形態で存在する場合には、尿素（ｕｒｅａ）、界面活性剤などのタンパク質変性剤が含まれた溶液で最大限タンパク質を溶解させた後、遠心分離して透析、電気泳動及び各種のカラムクロマトグラフィーなどを行うことによって精製することができる。この際、タンパク質変性剤が含まれた溶液によりタンパク質の構造が変形されてその活性を失うことがあるので、不溶解性分画からタンパク質を精製する過程中には脱塩及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要である。即ち、前記脱塩及びリフォールディング段階は、タンパク質変性剤が含まれていない溶液を用いて透析及び希釈を行うか、またはフィルターを用いて遠心分離してもよい。また、前記溶解性分画からタンパク質を精製する過程中にも、精製時に用いる溶液中の塩濃度が高い場合は、このような脱塩及びリフォールディング段階を行ってもよい。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が封入体の形態で不溶解性分画に存在することを確認し、不溶解性分画からこれを精製するために、不溶解性分画をトリトンＸ−１００のような非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液に溶解させた後、超音波で処理し、遠心分離して沈殿物を得る。前記得られた沈殿物を変性剤である尿素が含まれている溶液に溶解させた後、遠心分離して上清を得る。尿素を用いて不溶解性分画から最大限溶解した本発明の組換えタンパク質は、ヒスチジン結合精製キットを用いて精製し、その後精製されたタンパク質は、アミコンフィルターなどを用いた遠心分離により塩分の除去及びタンパク質構造のリフォールディング過程を行うことによって、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００６６】
さらに、本発明は、前記細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有するｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物を提供する。
【００６７】
本発明の細胞透過性を有するｐ１８組換えタンパク質は、腫瘍抑制因子であるｐ１８が欠損するか、機能が消失した場合、ｐ１８を細胞内に高効率で導入し、ＤＮＡ損傷又は腫瘍形成信号による細胞周期の阻害とアポトーシスを誘導するＡＴＭとｐ５３の活性化に関連する信号伝達機構を再活性化させることにより、ヒトの多様な癌を予防及び／又は治療するための抗癌剤として有用に用いられる。
【００６８】
本発明による組換えタンパク質を有効成分として含有する組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、経口投与用担体または非経口投与用担体をさらに含んでもよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含む。経口投与用の場合、本発明による組換えタンパク質は、賦形剤と混合してチュアブル錠、バッカル剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ及びウエハーなどの形態で用いてもよい。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含み、安定化剤及び保存剤をさらに含んでもよい。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンザルコニウムクロリド、メチル−またはプロピル−パラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考にして用いてもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９ｔｈ ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９９５））。
【００６９】
本発明による組成物は、種々の非経口または経口投与の形態に剤形化してもよい。非経口投与用剤形の代表的なものは注射用剤形であり、等張性水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤形は、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて当業界に公知となった技術によって製造してもよい。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化してもよい。また、経口投与用剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び／又はグリシン）と滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム塩及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。前記錠剤は、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリジンのような結合剤を含んでもよく、場合によって、澱粉、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含んでもよい。前記剤形は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造してもよい。
【００７０】
本発明の組成物は、防腐剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤のような補助剤とその他治療的に有用な物質をさらに含んでもよく、通常の方法に従って製剤化してもよい。
【００７１】
また、本発明による組成物の投与経路としては、経口的、または静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内などのように非経口的にヒトと動物に投与してもよい。経口投与は、舌下適用も含む。非経口的投与は、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射、腫瘍直接注射のような注射法及び点滴法を含む。
【００７２】
本発明の組成物において、本発明の組換えタンパク質の合計有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与してもよく、多重投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与してもよい。本発明の組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含量を異にしてもよいが、通常、成人を基準に１回投与時、５〜２０ｍｇの有効投与量で１日に数回繰り返し投与してもよい。しかし、前記組換えタンパク質の濃度は、薬物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重篤度、食餌及び排泄率等の様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量を決定してもよい。従って、このような点を考慮すると、当該分野の通常の知識を有する者であれば、前記組換えタンパク質の抗癌剤としての特定の用途に応じる適切な有効投与量を決定できるであろう。本発明による組成物は、本発明の効果を奏する限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者に自明であろう。
【００７４】
実施例１：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）の製造
<１−１>ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質の製造
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）を用いて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を製造するために、下記の通り３つの全長形と５つの切頭形を考案した（図１ａ）。
【００７５】
まず、全長形のｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にｋＦＧＦ４−由来ＭＴＤが融合されたＭ１ｐ１８；２）そのＣ末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ１；及び３）その両末端にｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＭ１ｐ１８Ｍ１を製造するために、それぞれについて特異的に考案されたプライマー対とヒトｐ１８ ｃＤＮＡを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った（図２ａ）。この時、Ｍ１ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１４の塩基配列を有し；Ｍ１ｐ１８Ｍ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１３及び１４の塩基配列を有する。
【００７６】
また、切頭形のｐ１８組換えタンパク質として、１）Ｓ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＮＭ１；２）Ｎ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＳＭ１；３）Ｎ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＣＭ１；４）Ｃ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＮＳＭ１；及び５）Ｎ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインにｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８ＳＣＭ１を製造するために、前記のようにＰＣＲを行った（図２ａ）。この時、ｐ１８ＮＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１５の塩基配列を有し；ｐ１８ＳＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１６及び１７の塩基配列を有し；ｐ１８ＣＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１４及び１８の塩基配列を有し；ｐ１８ＮＳＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び１７の塩基配列を有し；ｐ１８ＳＣＭ１の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１４及び１６の塩基配列を有する。
【００７７】
ＰＣＲ反応は、鋳型としてヒトｐ１８ｃＤＮＡ１００ng、各０．２ｍＭの最終濃度ｄＮＴＰ混合物、０．６μＭの各プライマー、１０×Ｔａｑ緩衝液５μｌ、及びＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）１μｌを含む溶液を最終体積５０μｌ反応液として行った。ＰＣＲ反応条件は、まず９４℃で３分間熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させた後、９４℃で４５秒、５７℃で４５秒及び７２℃で４５秒の反応を３０回反復し、最終的に７２℃で４分間増幅した。反応が終わった後、１．０％アガロースゲル電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行い、増幅された生成物を確認した。図２ａに示すように、それぞれのＭＴＤが融合された組換え断片が目的とするサイズに増幅されたことを確認した。
【００７８】
アガロースゲルで増幅された組換え断片を回収した後、これらそれぞれを商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ;Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて抽出、精製した。抽出した断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入した後（図３ａ）、前記ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質遺伝子断片が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを大腸菌ＪＭ１０９感応細胞（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に形質転換させた。これを１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれた平板ＬＢ培地上で培養し、形質転換された大腸菌を選別し、これを再度液体ＬＢ培地で培養した後、これからそれぞれのｐ１８組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを多量に得た。
【００７９】
図３ｂは、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００８０】
前記でそれぞれのｐ１８組換えタンパク質遺伝子が挿入されたｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターを、制限酵素ＮｄｅＩを用いて３７℃で1時間切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）し、それぞれの組換え断片を得た。一方、ヒスチジンタグとＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−２８（＋）aベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）も制限酵素ＮｄｅＩを用いて前記と同じ条件で切断した。前記組換え断片と、切断されたｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターとを電気泳動で分離し、商用のキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ;Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて精製した。これらの混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ;Ｔａｋａｒａ、日本）を添加し、１６℃で１２時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した後、ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換させて組換えタンパク質発現ベクターを得た（図４ａ）。
【００８１】
図４ｂは、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターに挿入された組換え断片をＮｄｅＩ制限酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）で分離し、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示し、これからそれぞれの組換え断片が前記ベクターに正しく挿入されたことを確認した。
【００８２】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターをそれぞれｐＨｐ１８、ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ１ｐ１８Ｍ１、ｐＨｐ１８ＮＭ１、ｐＨｐ１８ＳＭ１、ｐＨｐ１８ＣＭ１、ｐＨｐ１８ＮＳＭ１、及びｐＨｐ１８ＳＣＭ１と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＨｐ１８Ｍ１で大腸菌ＤＨ５αを形質転換させて得られた形質転換細菌ＤＨ５α／Ｈｐ１８Ｍ１を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１１３１０ＢＰとして寄託した。
【００８３】
<１−２>ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤを用いたｐ１８組換えタンパク質の製造
ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）を用いて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を製造するために、下記の通りそれぞれのＭＴＤに対し３つの全長形を考案した。
【００８４】
まず、ＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＭ２ｐ１８；２）そのＣ末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ２；及び３）その両末端にＪＯ−１０１ＭＴＤが融合されたＭ２ｐ１８Ｍ２を製造するために、前記実施例<１−１>の通りＰＣＲを行った（図２ｂ）。この時、Ｍ２ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１９及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び２０の塩基配列を有し、Ｍ２ｐ１８Ｍ２の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１９及び２０の塩基配列を有する。
【００８５】
また、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質として、１）全長のｐ１８のＮ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＭ３ｐ１８；２）そのＣ末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたｐ１８Ｍ３；及び３）その両末端にＪＯ−１０３ＭＴＤが融合されたＭ３ｐ１８M3を製造するために、前記実施例<１−１>の通りＰＣＲを行った。この時、Ｍ３ｐ１８の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：２１及び１２の塩基配列を有し；ｐ１８Ｍ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：１１及び２２の塩基配列を有し；Ｍ３ｐ１８Ｍ３の増幅のための正方向及び逆方向プライマーは、それぞれ配列番号：２１及び２２の塩基配列を有する。
【００８６】
これから増幅されたそれぞれの組換え断片を前記実施例<１−１>と同様な方法でｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクターに挿入してサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅ）を確保した後、これを再度ｐＥＴ−２８（＋）aベクターに挿入し、それぞれの組換えタンパク質発現ベクターを得た。ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター及びｐＥＴ−２８（＋）aベクターへのそれぞれの組換え断片の挿入は、図３ｃ及び４ｃで確認した。
【００８７】
このように得られた組換えタンパク質発現ベクターをそれぞれｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３と命名し、これらの中で組換え発現ベクターｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びｐＨＭ３ｐ１８それぞれに大腸菌ＤＨ５αを形質転換させた形質転換細菌ＤＨ５α／ＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＤＨ５α／ＨＭ３ｐ１８を２００８年４月１２日付で韓国生命工学研究院内の遺伝子銀行に寄託番号ＫＣＴＣ−１０３１１ＢＰ及びＫＣＴＣ−１０３１２ＢＰとして寄託した。
【００８８】
前記実施例<１−１>及び<１−２>でそれぞれの組換え断片の増幅のために用いられた正方向及び逆方向プライマー対を下記表２に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
実施例２：組換えタンパク質の発現
<２−１>最適な宿主菌株の選抜
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の発現誘導に最も適する宿主菌株を選抜するために、LacIプロモーターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を対象に下記実験を行った。
【００９１】
まず、前記実施例<１−１>で製造された組換え発現ベクター ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、及びｐＨｐ１８（対照群）それぞれを前記大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）及びＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳそれぞれに熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法で形質転換させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した。その後、組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を１ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１００ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に到達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．６５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、３７℃で３時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００９２】
図５ａに示すように、多様な宿主菌株を対象に本発明の組換えタンパク質の発現を調査した結果、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）菌株で最も高い発現量が確認され、これを組換えタンパク質の発現のための最適な菌株として選択した。
【００９３】
<２−２>組換えタンパク質の発現
前記実施例<２−１>で最適な菌株と確認された大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）に組換え発現ベクターｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、及びｐＨｐ１８それぞれを熱ショック方法で形質転換させた後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した。その後、前記組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を２５ｍｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中培養した後、これを再度１ｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．５に到達するまで培養した。この培養液にタンパク質発現の誘導剤として０．６５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、３７℃で３時間さらに培養した。この培養液を４℃で７，０００×ｇ、２０分間遠心分離して上清液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体を溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波処理を行って細胞を破砕し、これを１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し、溶解性分画と不溶解性分画を得た。この溶解性分画と不溶解性分画をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけてタンパク質発現特性と発現量の程度を分析した。
【００９４】
図５ｂに示すように、約２１ｋＤａのサイズを有する本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、殆ど封入体の形態で不溶解性分画に含まれており、ＩＰＴＧ無処理培養液（−）に比べてＩＰＴＧ処理培養液（＋）において目的タンパク質の発現が顕著に増加していることを確認した。
【００９５】
実施例３：組換えタンパク質の精製
本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、封入体の形態で不溶解性分画に存在するので、これを精製するために、強力な変性剤として８Ｍ尿素を用いた。
【００９６】
まず、本発明の組換え発現ベクターｐＨｐ１８、ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３それぞれに形質転換されたＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）菌株を前記実施例２でのように１ｌのＬＢ培地に培養した。それぞれの培養液を遠心分離して得た菌体を２０ｍｌの溶解緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）に気泡が生じないように注意しながら懸濁し、これをマイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉp）付きのソニケーターを用いて低温で菌体を破砕した。この時、処理時間は、装置の出力を最大出力の２５％に設定し、３０秒処理後、１０秒放置を５分間繰り返した。十分に溶菌された封入体を４℃で１分当り回転数３，０００ｒｐｍで２５分間遠心分離して沈殿物を除去し、上清を回収した。回収された上清をニトリルロ三酢酸アガロース（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｇａｒｏｓｅ）にＮｉを付与したＮｉ−ＮＴＡアガロースレジンにローディングした。この時、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースは、予め溶解緩衝液で数回洗浄して平衡化させた後に用いた。上清を４℃で８時間以上振盪機でゆっくり攪拌しながら、レジンに吸着させた。組換えタンパク質が含まれた封入体が吸着したレジンを４℃で１分当り回転数１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して反応液を除去し、非特異的な吸着物質を除去するためにレジンを洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ６．３）を用いて５回洗浄した。洗浄されたレジンにｐＨ４．０の酸性条件でレジン容積２倍の溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ４．５）をローディングし、振盪機で２時間、又は８時間以上攪拌してタンパク質を溶出した。溶出したタンパク質の純度を検定するために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行った後、ゲルをクマシーブリリアントブルーR（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）で軽く振盪しながら染色し、目的タンパク質のバンドが明確になるまで脱色液を用いて脱色した。
【００９７】
その結果、図６ａ〜６ｃに示すように、マーカータンパク質の泳動位置に比べ、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ、ＪＯ−１０１ＭＴＤ及びＪＯ−１０３ＭＴＤがそれぞれ融合された全ての細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が約２１ｋＤａの部位で単一バンドとして検出され、不溶解性分画から純粋に精製されたことを確認した。
【００９８】
実施例４：タンパク質のリフォールディング及び蛍光染色
前記実施例３でのように不溶解性分画から精製された本発明の組換えタンパク質は、強力な変性剤である８Ｍ尿素により変性されたため、これを活性形態に転換させるために、下記の通りリフォールディング過程を行った。
【００９９】
まず、精製された組換えタンパク質をリフォールディング緩衝液（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．５５Ｍグアニジン［Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ］ＨＣｌ、０．４４Ｍ Ｌ−アルギニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮＤＳＢ、２ｍＭ酸化型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ］及び０．２ｍＭ還元型グルタチオン［ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ］）を用いて４℃で２４時間透析して変性剤を除去することにより、組換えタンパク質を再活性、即ちリフォールディングさせた。その後、活性化された組換えタンパク質を細胞培養用培地であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の中で、透析膜（Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ ｐｌｅａｔｅｄ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いて４℃で８時間攪拌した。この時、３時間ごとに容器内のＤＭＥＭを交換した。
【０１００】
これから得られた活性型の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、以後の細胞透過性の効果をより明確に確認するために、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を用いて蛍光標識した。２〜２０ｍｇの組換えタンパク質について３３３ｍｇ／ｍｌ濃度のＦＩＴＣ １μｌを用いて、光を避けて常温で1時間振盪しながら結合させた。蛍光で標識された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、４℃で１日間ＤＭＥＭ培地に対し透析し、標識されていないＦＩＴＣを除去し、これから回収された組換えタンパク質は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質定量法で、その濃度を分析した。その結果、それぞれの組換えタンパク質の濃度は、約１μｇ／μｌと測定された。
【０１０１】
実施例５：細胞透過性の実験
<５−１>フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性を検証するため、１０μＭ濃度の各タンパク質でマウスのマクロファージに由来するＲＡＷ ２６４．７細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を処理し、３７℃で１時間培養した。この時、ＲＡＷ ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。培養が終結した後、タンパク質で処理されたＲＡＷ ２６４．７細胞の細胞膜に露出されている遊離ＦＩＴＣを除去するためにトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ）で処理し、低温のＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のセルクエストプロソフトウェア（Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ）プログラムを用いてフローサイトメトリーを行った。
【０１０２】
その結果、図７ａ〜７ｃに示すように、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＣＰ−ｐ１８）の場合、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１の細胞透過性が、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８より明確に示された。ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＣＰ−ｐ１８の場合には、ＭＴＤが融合されていない対照群に比べ、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ２、及び両末端にＭＴＤが融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２が互いに類似の水準で高い細胞透過性を示した。また、ＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＣＰ−ｐ１８の場合には、Ｎ末端にＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８及びＣ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ３が、両末端にＭＴＤが融合されたＨＭ３ｐ１８Ｍ３より一層高い水準で細胞透過性を示した。図７ａ〜７ｃにおいて、灰色の曲面は細胞単独の対照群、黒色の曲線はＦＩＴＣ単独対照群、青色の曲線はＭＴＤが融合されていないＨｐ１８、緑色の曲線はＭＴＤ（ＭＴＤ1、ＭＴＤ２又はＭＴＤ３）がＮ末端に融合されたＨＭｐ１８、赤色の曲線は前記ＭＴＤがＣ末端に融合されたＨｐ１８Ｍ、オレンジ色の曲線は前記ＭＴＤが両末端に融合されたＨＭｐ１８Ｍを示す。
【０１０３】
<５−２>共焦点レーザー走査顕微鏡の観察Ｉ
前記実施例<５−１>でフローサイトメトリーにより一次的に細胞透過性が確認された本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質、およびＭＴＤが融合されていないｐ１８対照群タンパク質により、マウスの線維芽細胞に由来するＮＩＨ３Ｔ３細胞（韓国細胞株銀行、ソウル、大韓民国）を１０μＭの濃度で処理し、３７℃で1時間培養した後、共焦点レーザー走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した。用いられたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、培地総量の１０％ＦＢＳと５％ペニシリン／ストレプトマイシン５００ｍｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で培養し、組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために１０μｌの封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）をスライド上に点滴した後、１５分後に観察した。前記組換えタンパク質で処理された細胞は、ＭＴＤの細胞内伝達部位の区別が容易になるように核を染色するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を通じて核への伝達及び細胞透過性を確認し、共焦点レーザー走査顕微鏡は、ノマルスキーフィルタ（ｎｏｍａｒｓｋｉ ｆｉｌｔｅｒ）を用いて細胞の原形、ＦＩＴＣ蛍光及びＰＩ蛍光を観察した。
【０１０４】
その結果、図８ａ〜８ｃに示すように、フローサイトメトリーの相対的な細胞透過性結果に比例し、明確なＦＩＴＣ蛍光（薄録色）及びＰＩ（赤色）で染色された核内へのタンパク質伝達が観察され、このようにタンパク質の細胞内の透過の有無を直接確認することにより、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞透過性が再度立証された。
【０１０５】
<５−３>共焦点レーザー走査顕微鏡の観察II
前記実施例<５−２>で培養された細胞を対象として細胞透過性が確認された本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が組織状態でも細胞透過性を示すかどうかを確認するために、下記実験を行った。
【０１０６】
このために主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）に対する突然変異で免疫力が欠乏した７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ、中央実験動物、ソウル）を実験動物として用いた。前記マウスの右足にヒト結腸癌細胞株（ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＨＣＴ−１１６細胞（韓国細胞株銀行）を１×１０７の細胞数で注射器（ｏｍｎｉｃａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂ．ＢＲＡＵＮ）を用いて皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して、腫瘍形成を誘導した。一方、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合されたＨｐ１８Ｍ１、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が両末端に融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）がＮ末端に融合されたＨＭ３ｐ１８、及びＭＴＤが融合されていないＨｐ１８を、ＦＩＴＣを用いて蛍光標識した。腫瘍が形成されたマウスに、ＦＩＴＣで標識された前記組換えタンパク質それぞれを３００μｇずつ腹腔注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。２時間後、各群のマウスを犠牲にし、これから肝、腎臓、脾臓、肺、心臓、脳及び腫瘍組織を摘出した。摘出された組織をＯＣＴ化合物で包埋して冷凍させた後、マイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて厚さ１４μｍに薄切した。組織切片をスライド上に置いて、共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。この時、組換えタンパク質の蛍光標識を保存するために、１０μｌの封入剤をスライド上に点滴した後、１５分後に観察した。
【０１０７】
その結果、図９に示すように、前記実施例<５−１>で確認されたフローサイトメトリーによる相対的な細胞透過性の測定結果に比例し、全ての組織で明確なＦＩＴＣ蛍光（薄録色）で染色された核内へのタンパク質の伝達が観察された。前記結果から、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質は、細胞透過性に優れており、目的とするｐ１８タンパク質を効果的に組織内へ伝達できることが分かる。
【０１０８】
実施例６：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能
<６−１>ウエスタンブロッティング
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するために、下記の通りウエスタンブロッティング分析を行った。本実験に用いられた結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６は、韓国細胞株銀行（ソウル、大韓民国）から購入した。ＨＣＴ−１１６細胞は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートに１つのウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種して３７℃で１日間成長させた後、細胞周期を同一にするため、再度１日間血清のない条件で培養した。培地を除去した後、ＨＣＴ−１１６細胞を低温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１組換えタンパク質とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８組換えタンパク質をそれぞれ１０μＭ及び２０μＭ濃度で処理した。これを、ｐ２１の誘導のために４時間、ｐ５３、ＡＴＭ、ＭＥＫ、ＥＲＫ及びＲｂのリン酸化のために1時間、５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで反応させた。組換えタンパク質で処理された細胞を２００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１％トリトン−Ｘ、１０％グリセロール）を用いて氷で３０分間粉砕して集め、得られた細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を４℃で１分当り回転数１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。これから上清を除去し、ブラッドフォードタンパク質定量法で溶解物溶液に入っているタンパク質を定量し、溶解物は使用するまで−８０℃で保管した。
【０１０９】
ウエスタンブロッティング分析のために、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（２１ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ５３（Ｓｅｒ１５、５３ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１、３５０ ｋＤａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１、４５ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、４２／４４ ｋＤａ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、及びｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１、１１０ ｋＤａ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体として用い、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を二次抗体として用いた。前記で定量された細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い１００Ｖで電気泳動を行った後、ＰＶＤＦ膜に７０Ｖで２時間転写させた。転写させた膜は、抗体との非特異的な吸着を防止するため、ＴＢＳ／Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）に溶解させた５％（ｗ／ｖ）粉乳（ｐｏｗｄｅｒｅｄ ｍｉｌｋ）で１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）処理をした後、前記一次抗体のそれぞれを添加し、４℃で１日間反応させた。この後に膜をＴＢＳ／Ｔ緩衝液で５回洗浄した後、二次抗体を添加して室温で1時間程度反応させ、ＴＢＳ／T緩衝液で５回洗浄を反復し、化学発光検出用ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ ＵＫ）試薬を用いて抗原を検出し分析した。
【０１１０】
ｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合されたｐ１８組換えタンパク質を対象として実験した結果、図１０に示すように、ｐ１８により細胞周期の停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を生じるｐ２１の発現、ＡＴＭのリン酸化（Ｐ−ＡＴＭ）とｐ５３のリン酸化（Ｐ−ｐ５３）が増加した一方、腫瘍の細胞周期を活性化させるＭＥＫのリン酸化（Ｐ−ＭＥＫ）、ＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）及びＲｂのリン酸化（Ｐ−Ｒｂ）は減少した。特に、Ｃ末端にＭＴＤが融合されたＨｐ１８Ｍ１組換えタンパク質が、培養された癌細胞の細胞周期を阻害し、腫瘍形成を減少させる細胞周期の阻害剤として卓越した機能的な活性を示すことを確認した。
【０１１１】
一方、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＨＭ２ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ２、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２組換えタンパク質及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ３、ＨＭ３ｐ１８Ｍ３組換えタンパク質と、ＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質を対象として、前記と同様にウエスタンブロッティング分析を行った。
【０１１２】
その結果、図１１に示すように、全体的に本発明のｐ１８組換えタンパク質で処理された細胞において、ｐ１８により細胞周期の停止を生じるｐ２１の発現、ＡＴＭのリン酸化（Ｐ−ＡＴＭ）とｐ５３のリン酸化（Ｐ−５３）が増加した一方、腫瘍の細胞周期を活性化させるＭＥＫのリン酸化（Ｐ−ＭＥＫ）、ＥＲＫのリン酸化（Ｐ−ＥＲＫ）及びＲｂのリン酸化（Ｐ−Ｒｂ）は減少した。特にｐ１８のＮ及びＣ末端の両方にＭＴＤ２が融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２組換えタンパク質とそのＮ末端にのみＭＴＤ3が融合されたＨＭ３ｐ１８組換えタンパク質が、腫瘍形成を減少させる細胞周期の阻害剤として卓越した機能的な活性を示すことを確認した。
【０１１３】
<６−２>細胞性ＤＮＡ含量の分析
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するため、下記の通り細胞性ＤＮＡ含量分析（ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通じて前記組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を調査した。
【０１１４】
結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（韓国細胞株銀行）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートにウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種した後、３７℃で１日間培養した。各ウェルに組換えタンパク質としてｋＦＧＦ４由来ＭＴＤ（ＭＴＤ１）が融合されたＨＭ１ｐ１８とＨｐ１８Ｍ１、ＪＯ−１０１ＭＴＤ（ＭＴＤ２）が融合されたＨＭ２ｐ１８Ｍ２及びＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８をそれぞれ２０μＭ濃度で処理した後、１時間無血清培地で培養した。前記ウェルプレートを低温のＰＢＳで２回洗浄した後、ウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、それぞれ０、２、４及び８時間さらに培養した。それぞれの培養時間の経過後、細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに浮遊させた後、これを４ｍｌの７０％エタノールに慎重に浸けた。この細胞浮遊液を氷上で４５分間放置した後、−２０℃で１日間保管した。前記細胞培養液をＰＩ（４０μｇ／ｍｌ）とＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、アポトーシスの程度をフローサイトメトリーを用いて定量的に決定した。
【０１１５】
その結果、図１２に示すように、無処理群及びＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質（Ｈｐ１８）処理群に比べ、ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群（ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）において高比率で癌細胞の細胞周期の進行が阻害され、アポトーシスが誘導されることを確認した。特に組換えタンパク質で処理し、８時間培養した場合において、アポトーシスが誘導された程度が最も高く、またＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質ＨＭ３ｐ１８が最も優れたアポトーシス誘導効果を示した。
【０１１６】
<６−３>アネキシン−Ｖを用いたアポトーシス誘導効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の細胞内機能を確認するため、下記の通りアネキシン−Ｖを用いて組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を調査した。
【０１１７】
結腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６（韓国細胞株銀行）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｌ−グルタミン３００ｍｇ／ｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ８９．３％、熱不活性化ウシ胎児血清９．８％、ストレプトマイシン／ペニシリン０．９％）を用いて５％ ＣＯ２が供給される３７℃のインキュベーターで培養した。６ウェルプレートにウェル当り２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を添加し、これに前記で培養された細胞を接種した後、３７℃で１日間培養した。各ウェルに組換えタンパク質としてＪＯ−１０３ＭＴＤ（ＭＴＤ３）が融合されたＨＭ３ｐ１８とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８をそれぞれ２０μＭ濃度で処理した後、２時間無血清培地で培養した。培養時間の経過後に細胞を低温のＰＢＳで２回洗浄した後、１×１０６の細胞を１ｍｌの１×結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に浮遊させた。その後、１００ｍｌの細胞をＥＰ−チューブに移し、このチューブに５ｍｌのアネキシン−Ｖと５ｍｌのＰＩを添加し、１５分間常温で反応させた。次いで、４００ｍｌの1×結合緩衝液で前記培養液を処理した後、アポトーシス誘導の程度をフローサイトメトリーを用いて定量的に決定した。
【０１１８】
その結果、図１３に示すように、無処理群及びＭＴＤが融合されていない対照群タンパク質（Ｈｐ１８）処理群に比べ、ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群（ＨＭ３ｐ１８）において高比率でアポトーシスが誘導されたことを確認した。
【０１１９】
実施例７：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−腹腔注射
<７−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するため、下記の通り動物モデルを用いて抗癌効果を検証した。
【０１２０】
本実験では、動物モデルとしてＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した７週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ、中央実験動物、ソウル）を用いた。前記マウスの右足にＨＣＴ−１１６細胞（韓国細胞株銀行）を１×１０7の細胞数で注射器（ｏｍｎｉｃａｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂ．ＢＲＡＵＮ）を用いて皮下注射した。各群当り６匹ずつ計４群に分けて実験した。ノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が１００ｍｍ３と測定された日から１μｇ／μｌ濃度のｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ１ｐ１８（群３）及びＨｐ１８Ｍ１（群４）をそれぞれ３００μｇずつ２１日間腹腔注射した。対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、群１）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（群２）をそれぞれ３００μｌずつ２１日間同様に腹腔注射した。２１日間タンパク質処理後、毎日各群のマウスの腫瘍のサイズと体重の変化を測定し、その結果を図１４ａ及び１４ｂで示した。
【０１２１】
図１４ａ及び１４ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質であるＨＭ１ｐ１８及びＨｐ１８Ｍ１でそれぞれ処理されたマウス（群３及び４）の腫瘍サイズは、対照群（群1及び２）に比べてその成長が顕著に抑制された一方、実験期間中、マウスの体重は、対照群と細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群のいずれも有意味な変化を示さなかった。細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群に生成された腫瘍サイズと体重に関する平均値のp値は０．０５以下で、これは結果の有意性を示す。図１５は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を２１日間投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を示した写真で、肉眼でも対照群に比べて細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質処理群のマウスにおいて腫瘍サイズが顕著に減少したことが分かる。
【０１２２】
<７−２>投与期間後の抗癌効果
本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ１ｐ１８、Ｈｐ１８Ｍ１）の投与後、体内の抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<７−１>でのように２１日間のタンパク質投与後に４群からそれぞれ２匹のマウスを選定し、全ての処理を中止した後、７日間腫瘍サイズを観察した。
【０１２３】
その結果、図１６ａ及び１６ｂに示すように、全ての群において腫瘍サイズが増加する様相を呈したが、タンパク質処理期間に腫瘍サイズが相当抑制されたＨＭ１ｐ１８処理群（群３）は、対照群のように腫瘍サイズが急激に増加した一方、Ｈｐ１８Ｍ１処理群（群４）では、腫瘍サイズの増加率が他の群に比べて顕著に低いことを確認した。前記結果から、本発明の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質であるＨｐ１８Ｍ１が生体内で安定的にその有効性を維持し、癌の細胞周期阻害剤として持続的に作用していることが分かる。
【０１２４】
実施例８：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−静脈注射
<８−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するために、前記実施例７と同様な方法で、ＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の右足に、ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ−１１６細胞を１×１０７の細胞数で注射器を用いて皮下注射した。５匹を一群化し、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８、３００μｇ）及び対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（３００μｇ）を投与する計３群で実験した。ノギスを用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が７０〜８０ｍｍ３を示すマウスを選択し、１μｇ／μｌの濃度でＨＭ３ｐ１８を３００μｇずつ１４日間静脈注射した。対照群としては、ＭＴＤが結合していないＨｐ１８タンパク質とＲＰＭＩ １６４０培地を同様な方法でマウスに静脈注射した。
【０１２５】
その結果、図１７ａ及び１７ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウス群において、腫瘍サイズの成長が対照群に比べて顕著に抑制された。また、対照群として１４日間処理したマウス群の体重は徐々に減少した一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で１４日間処理したマウス群の体重は、対照群に比べて減少しておらず、腫瘍サイズの成長が抑制されながら体重が増加した。図１８は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を１４日間静脈注射で投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【０１２６】
<８−２>投与期間後の抗癌効果
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）の投与後に体内抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<８−１>でのように１４日間のタンパク質投与後、３群から２匹のマウスをそれぞれ選定し、担体と全てのタンパク質処理を中止し、２週間腫瘍サイズを観察した。
【０１２７】
その結果、図１９に示すように、対照群の群（担体）では、腫瘍のサイズが急激に増加する様相を呈したが、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の処理が中止されたマウス群（ＨＭ３ｐ１８）では、腫瘍サイズの急激な増加なしに処理期間中と類似する水準で維持された。これは、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が生体内に投与され、癌細胞の細胞周期を完全にリプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）し、癌細胞がこれ以上細胞分裂できないように正常細胞化することにより、癌の細胞周期の阻害剤として持続的に作用していることを示すものである。
【０１２８】
実施例９：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の生体内機能−腫瘍直接注射
<９−１>投与期間中の抗癌効果
細胞透過性が立証されたｐ１８組換えタンパク質の生体内機能を確認するために、前記実施例７と同様な方法でＭＨＣに対する突然変異で免疫力が欠乏した５週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ ｍｉｃｅ）の右足に、ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ−１１６細胞を１×１０７の細胞数で注射器を用いて皮下注射した。５匹を一群化し、ｋＦＧＦ由来ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、３００μｇ）、ＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、３００μｇ）、ＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８、３００μｇ）、及び対照群として担体（ＲＰＭＩ １６４０培地、３００μｌ）とＭＴＤが融合されていないＨｐ１８タンパク質（３００μｇ）で処理する計５群で実験した。ノギスを用いて腫瘍サイズ（幅２×長さ／２）が９０〜１００ｍｍ３を示すマウスを選択し、１μｇ／μｌの濃度において３００μｇずつ１４日間マウスの腫瘍に直接注射した。この時、対照群としては、ＭＴＤが結合していないＨｐ１８タンパク質とＲＰＭＩ １６４０培地を同様な方法で腫瘍に直接注射した。
【０１２９】
その結果、図２０ａ及び２０ｂに示すように、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウス群の腫瘍サイズは、対照群に比べて成長が抑制された。また、対照群として１４日間処理したマウス群の体重は徐々に減少した一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で１４日間処理したマウス群の体重は、対照群に比べて減少しておらず、腫瘍サイズの成長が抑制されながら体重は増加した。図２１は、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を１４日間腫瘍直接注射で投与したマウスにおける腫瘍サイズの変化を対照群と比較して示した写真である。
【０１３０】
<９−２>投与期間後の抗癌効果
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）の投与後に体内抗癌効果の持続性を確認するために、前記実施例<９−１>でのように１４日間のタンパク質投与後、各群から２匹のマウスを選定し、担体と全てのタンパク質処理を中止し、２週間腫瘍サイズを観察した。
【０１３１】
その結果、図２２に示すように、対照群（担体）では、腫瘍サイズが増加する様相を呈したが、本発明による組換えタンパク質処理群では腫瘍の成長が明確に阻害されていることを確認した。
【０１３２】
実施例１０：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の組織学的な変化の分析I
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後、腫瘍組織内におけるアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてヘマトキシリン−エオシン染色を行った。
【０１３３】
具体的には、前記実施例８でのように３群（各群当り５匹）のマウスに対し、それぞれ静脈注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつ選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間タンパク質処理後、再度１４日間の無処理観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。それぞれの摘出された腫瘍組織をホルマリンで固定して洗浄した後、包埋センター（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ）で６２℃に溶かしたパラフィンを用いてパラフィンブロックを作製した。作製されたパラフィンブロックをマイクロトームを用いて厚さ４μｍに薄切し、スライドに付着させた後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で５分ずつ３回処理してパラフィンを除去した。次いで、１００％、１００％、９５％、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ２分ずつ処理して含水させ、流水で５分間洗浄した後、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。最後に７０％から１００％エタノールで１０秒ずつ処理して脱水させ、キシレンで３分ずつ２回の投影過程を経た後、封入剤であるカナダバルサム（ｃａｎａｄａ ｂａｌｓａｍ）を用いて封入し、光学顕微鏡で観察した。
【０１３４】
その結果、図２３に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に組織学的な変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス様の細胞死に特徴的に示される核凝縮と核分節などの形態学的な変化が観察された。また本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されていることを確認した。
【０１３５】
実施例１１：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の組織学的な変化の分析II
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内におけるアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例９のマウス動物モデルを用いてヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【０１３６】
具体的には、前記実施例９でのように５群（各群当り５匹）のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１０と同様な方法でヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【０１３７】
その結果、図２４に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に組織学的な変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス様の細胞死に特徴的に示される核凝縮と核分節などの形態学的な変化が観察された。
【０１３８】
実施例１２：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析I
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内でアポトーシス誘導効果を確認するために、前記実施例８のマウス動物モデルを用いてＴＵＮＥＬ分析を行った。
【０１３９】
具体的には、前記実施例８でのように３群のマウスに対し、静脈注射でそれぞれ細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつを選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間のタンパク質処理後、再度１４日間の無処理観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。前記実施例１０のように、摘出された腫瘍組織から組織切片を作製した後、これをスライドに付着させた。前記スライドをキシレンで５分間３回処理し、パラフィンを除去した。次いで、無水エタノールで５分間２回、９０％、８０％及び７０％エタノールでそれぞれ３分間処理して含水させ、ＰＢＳで５分間保管した。この後、８分間０．１％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液に溶かした０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｉｏｎ（登録商標））Ｘ−１００溶液で細胞を透過させた後、ＰＢＳで２分間２回洗浄した。ＴＵＮＥＬ反応緩衝液（５０μｌ、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）を前記組織スライド上で処理し、１時間３７℃湿潤インキュベーターで培養した後、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した。
【０１４０】
その結果、図２５に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に赤く染色される変化が観察され、これから本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されることが分かった。
【０１４１】
実施例１３：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析II
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後の腫瘍組織内でアポトーシス誘導効果が誘導されることを免疫組織化学的に確認するために、アポタグペルオキシダーゼインサイチュ・アポトーシス検出キット（ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｓ７１００）を用いて下記実験を行った。
【０１４２】
具体的には、前記実施例８でのように、３群のマウスに対し、静脈注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体及びＨｐ１８タンパク質により１４日間処理した後、各群当り３匹ずつを選別して犠牲にし、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。この時、各群の残り２匹のマウスは、１４日間のタンパク質処理後、再度１４日間の無処理の観察期間を経た後、誘導された腫瘍組織を分離、摘出した。前記実施例１０のように、摘出された腫瘍組織から組織切片を作製した後、これをスライドに付着させた。前記スライドをキシレンで５分間３回処理し、パラフィンを除去した。次いで、１００％、９０％及び７０％アルコールで順次３分間処理して含水させた後、前記スライドを５分間ＰＢＳで培養した。前記スライドを２０μｇ／ｍｌ濃度のプロテイナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、Ｓｉｇｍａ）で１５分間処理し、蒸溜水で洗浄した後、３％ Ｈ２Ｏ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ、ｉｎ ＰＢＳ）で５分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の活性を抑制した。前記スライドを平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）緩衝液で１０秒間処理した後、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｘｏｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＴｄＴ）により３７℃で1時間処理した。反応が終結した後、前記スライドを停止（ｓｔｏｐ）緩衝液で処理し洗浄した。次いで、スライドをＤＡＢ発色試薬で５分間処理し、メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で対比（ｃｏｕｎｔｅｒ）染色した。染色後に脱水過程を経た後、スライド上をカバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐ）でシールし、光学顕微鏡で観察した。
【０１４３】
その結果、図２６に示すように、担体と対照群タンパク質（Ｈｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に褐色に染色される変化が観察され、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。また、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質で処理したマウス群では、タンパク質の投与を中止した２週後にも依然として癌細胞内でアポトーシスが誘導されていることが分かった。
【０１４４】
実施例１４：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析III
前記実施例９でのように、５群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１２と同様な方法でＴＵＮＥＬ分析を行った。
【０１４５】
その結果、図２７に示すように、対照群として担体で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に赤く染色される変化が観察され、これから本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。
【０１４６】
実施例１５：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のアポトーシス誘導効果の分析IV
前記実施例９でのように、５群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）と、対照群として担体により１４日間処理した後、各群のマウスから分離、摘出した腫瘍組織を対象とすることを除いては、前記実施例１３と同様な方法でアポタグ分析を行った。
【０１４７】
その結果、図２８に示すように、対照群として担体で処理したマウスの腫瘍組織では、特に変化が観察されない一方、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質（Ｈｐ１８Ｍ１、ＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ＨＭ３ｐ１８）で処理したマウスの腫瘍組織では、アポトーシス時に褐色に染色される変化が観察され、本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質のアポトーシス誘導効果を肉眼で確認することができた。
【０１４８】
実施例１６：細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質の投与後のタンパク質発現様相の比較
細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質が投与された組織におけるタンパク質発現様相の変化を確認するために、下記の通りマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析を行った。
【０１４９】
具体的には、前記実施例９と同様な方法で３群のマウスに対し、腫瘍直接注射で細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質ＨＭ２ｐ１８Ｍ２と、対照群としてＨｐ１８及び担体により１４日間処理した後、この処理を中止して１４日間放置した。計２８日経過後、各群のマウスから腫瘍組織を分離した後、これを液体窒素で急速冷却させた。腫瘍組織から全ＲＮＡをトリゾール試薬（ＴＲＩＺＯＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてメーカーの指針に従って分離し、これを無ＲＮａｓｅ ＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で処理し、残存するゲノムＤＮＡを除去した。
【０１５０】
前記で分離されたＲＮＡに対し、標的ｃＲＮＡプローブの合成及びハイブリダイゼーションをメーカーの指針に従ってローＲＮＡインプット・リニア・アンプリフィケーションキット（Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。簡略に説明すると、それぞれの全ＲＮＡ １μｇとＴ７プロモータープライマーを混合し、６５℃で１０分間反応させた。５×一本鎖緩衝液、０．１Ｍ ＤＴＴ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ及びＭＭＬＶ−ＲＴ（逆転写酵素）を混合してｃＤＮＡマスタミックス（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）を製造した後、これを前記反応混合物に添加した。この混合物を４０℃で２時間反応させた後、６５℃で１５分間反応させて逆転写反応及びｄｓＤＮＡ合成を終結させた。メーカーの指針に従って４×転写緩衝液（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）、０．１Ｍ ＤＴＴ、ＮＴＰミックス、５０％ ＰＥＧ、ＲＮａｓｅ−Ｏｕｔ、無機ピロホスファターゼ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ、及びシアニン（ｃｙａｎｉｎｅ、３／５−ＣＴＰ）を用いて転写マスタミックスを製造した。この転写マスタミックスをｄｓＤＮＡ反応混合物に添加し、４０℃で２時間反応させてｄｓＤＮＡの転写を行った。増幅されて標識されたｃＲＮＡをメーカーの指針に従ってｃＲＮＡクリーンアップモジュール（ｃＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で精製した。標識されたｃＲＮＡ標的をＮＤ−１０００分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて定量した。標識効率を調査した後、ｃＲＮＡに１０×ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）及び２５×フラグメンテーション緩衝液（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、６０℃で３０分間反応させてｃＲＮＡの断片化を行った。断片化されたｃＲＮＡを２×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁した後、全ヒトゲノムオリゴマイクロアレイ（Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、４４Ｋ）上にピペットを用いて直接滴加した。ハイブリダイゼーションオーブン（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて前記マイクロアレイを６５℃で１７時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたマイクロアレイをメーカー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の洗浄指針に従って洗浄した。
【０１５１】
ハイブリダイゼーションパターンをＤＮＡマイクロアレイスキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて読み出し、特徴抽出ソフトウェア（Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で定量した。倍率変化した（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅｄ）遺伝子の全てのデータ標準化及び選別は、ジーンスプリングＧＸ（Ｇｅｎｅ Ｓｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。標準化比率の平均は、標準化された信号チャンネル強度を標準化された対照群チャンネル強度で割って計算した。遺伝子の機能的アノテーションは、遺伝子オントロジーコンソーシアム（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（商標） Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従ってジーンスプリングＧＸにより行われた。
【０１５２】
前記マイクロアレイの分析結果を図２９及び下記表３〜７に示すが、表３は、アポトーシスに関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表４ａ及び４ｂは、細胞周期の調節に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表５ａ〜５ｃは、細胞成長（ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表６は、細胞増殖（ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものであり、表７は、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）及び血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連する遺伝子の発現様相を示したものである。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】
【表４ａ】
【０１５５】
【表４ｂ】
【０１５６】
【表５ａ】
【０１５７】
【表５ｂ】
【０１５８】
【表５ｃ】
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
【表７】
【０１６１】
前記表３に示すように、アポトーシスに関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群においてタンパク質キナーゼＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ；ＰＲＫＣＥ）と細胞死インデューサーオブリテレーター１（ｄｅａｔｈ ｉｎｄｕｃｅｒ−ｏｂｌｉｔｅｒａｔｏｒ １；ＤＩＤＯ１）の発現が１．５倍以上、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー８（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ ８；ＴＮＦＲＳＦ１８）の発現が２倍以上上方調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）された一方、ホスフィノシチド−３−キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩＫ３Ｒ２）の発現が３倍以上下方調節（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されていることが分かる。
【０１６２】
前記表４ａ及び４ｂに示すように、細胞周期調節に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において網膜芽細胞腫結合タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ６；ＲＢＢＰ６）の発現が１．８倍以上上方調節されていることが分かる。
【０１６３】
前記表５a〜５cに示すように、細胞成長に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において無翼型のＭＭＴＶ統合部位ファミリー、メンバー１０Ａ（ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ ＭＭＴＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｆａｍｉｌｙ、ｍｅｍｂｅｒ １０Ａ；ＷＮＴ１０Ａ）の発現が２倍以上、同一ファミリー、メンバー１６Ａ（ＷＮＴ１６Ａ）の発現が２．５倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６４】
前記表６に示すように、細胞増殖に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群においてＣＤ２８の発現が４倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６５】
前記表７に示すように、癌転移及び血管新生に関連する遺伝子の場合、対照群タンパク質に比べて本発明による細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質投与群において転移関連タンパク質１（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １；ＭＴＡ１）の発現が２倍以上下方調節されていることが分かる。
【０１６６】
以上で本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施様態であるだけで、これにより本発明の範囲が制限されるわけではないことは言うまでもない。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲とそれらの等価物により定義されると言える。
【０１６７】
受託証１
【０１６８】
受託証２
【０１６９】
受託証３
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍抑制因子ｐ１８タンパク質の一方又は両末端に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されている、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項２】
前記ヒト腫瘍抑制因子ｐ１８タンパク質が、Ｎ、Ｓ及びＣ末端ドメインからなる配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長形（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍ）であるか、前記配列で少なくとも１つのドメインが欠失された切頭形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項３】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４、６、８及び５３〜２４３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項４】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４）由来ＭＴＤ、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤ、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項５】
前記組換えタンパク質の片末端に核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）及びヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）親和性ドメインが融合されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項６】
下記からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質：
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＳ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；及び
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質。
【請求項７】
配列番号：２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０及び５２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号：２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９及び５１の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ１ｐ１８Ｍ１、ｐＨｐ１８ＮＭ１、ｐＨｐ１８ＳＭ１、ｐＨｐ１８ＣＭ１、ｐＨｐ１８ＮＳＭ１、ｐＨｐ１８ＳＣＭ１、ｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌。
【請求項１３】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／Ｈｐ１８Ｍ１（ＫＣＴＣ−１１０３１０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１４】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ２ｐ１８Ｍ２（ＫＣＴＣ−１１０３１１ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１５】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ３ｐ１８（ＫＣＴＣ−１１０３１２ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１６】
請求項１２に記載の形質転換細菌を培養する段階を含む、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有し、薬学的に許容可能な担体を含む、ｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物。
【請求項１】
ヒト腫瘍抑制因子ｐ１８タンパク質の一方又は両末端に巨大分子伝達ドメイン（ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＭＴＤ）が融合されている、細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項２】
前記ヒト腫瘍抑制因子ｐ１８タンパク質が、Ｎ、Ｓ及びＣ末端ドメインからなる配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長形（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｆｏｒｍ）であるか、前記配列で少なくとも１つのドメインが欠失された切頭形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項３】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４、６、８及び５３〜２４３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項４】
前記巨大分子伝達ドメインが、配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４（ｋａｐｏｓｉ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ４）由来ＭＴＤ、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤ、及び配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項５】
前記組換えタンパク質の片末端に核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）及びヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）親和性ドメインが融合されていることを特徴とする、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項６】
下記からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質：
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＳ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ及びＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ及びＳ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＣ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＣ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＮ及びＳ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列でＮ末端ドメインが欠失されたｐ１８のＳ及びＣ末端ドメインに配列番号：４のアミノ酸配列を有するｋＦＧＦ４由来ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：６のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０１ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＮ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８のＣ末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質；及び
配列番号：２のアミノ酸配列を有する全長のｐ１８の両末端に配列番号：８のアミノ酸配列を有するＪＯ−１０３ＭＴＤが融合された組換えタンパク質。
【請求項７】
配列番号：２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０及び５２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号：２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９及び５１の塩基配列からなる群から選択される塩基配列を有することを特徴とする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
ｐＨＭ１ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ１、ｐＨＭ１ｐ１８Ｍ１、ｐＨｐ１８ＮＭ１、ｐＨｐ１８ＳＭ１、ｐＨｐ１８ＣＭ１、ｐＨｐ１８ＮＳＭ１、ｐＨｐ１８ＳＣＭ１、ｐＨＭ２ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ２ｐ１８Ｍ２、ｐＨＭ３ｐ１８、ｐＨｐ１８Ｍ３、及びｐＨＭ３ｐ１８Ｍ３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌。
【請求項１３】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／Ｈｐ１８Ｍ１（ＫＣＴＣ−１１０３１０ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１４】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ２ｐ１８Ｍ２（ＫＣＴＣ−１１０３１１ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１５】
形質転換細菌が大腸菌ＤＨ５α／ＨＭ３ｐ１８（ＫＣＴＣ−１１０３１２ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載の形質転換細菌。
【請求項１６】
請求項１２に記載の形質転換細菌を培養する段階を含む、請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の細胞透過性ｐ１８組換えタンパク質を有効成分として含有し、薬学的に許容可能な担体を含む、ｐ１８欠損又は機能消失を治療するための抗癌剤用薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【公表番号】特表２０１０−５３７６６６（Ｐ２０１０−５３７６６６Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２３９５３（Ｐ２０１０−５２３９５３）
【出願日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５２２２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３１８３６
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９２１２７６４）プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５２２２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３１８３６
【国際公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【出願人】（５０９２１２７６４）プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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