細菌の増殖を制御する化合物及びその応用
【課題】脱窒に直接影響を及ぼす因子を見出し、それを利用した排水処理装置及び排水処理方法を提供すること。
【解決手段】三価の鉄イオンは脱窒菌の増殖を促進する、脱窒に直接影響を及ぼす因子である。本発明の排水処理装置１００は、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽１０と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段２０と
を備えることを特徴とする。三価の鉄イオンにより活性化された脱窒菌は効率よく硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元する。
【解決手段】三価の鉄イオンは脱窒菌の増殖を促進する、脱窒に直接影響を及ぼす因子である。本発明の排水処理装置１００は、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽１０と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段２０と
を備えることを特徴とする。三価の鉄イオンにより活性化された脱窒菌は効率よく硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の増殖を制御する化合物及びその応用に関する。より詳細には、本発明は、脱窒菌の増殖促進剤並びにそれを利用した排水処理装置及び排水処理方法に関する。さらに、本発明は抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の細菌は、硝酸イオン（ＮＯ３−）や亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を還元して窒素（Ｎ２）や亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）を放出し、ＡＴＰを合成する硝酸呼吸を行う。このような細菌を脱窒菌といい、このような過程を脱窒という。より具体的には、ＮＯ３−→ＮＯ２−→ＮＯ→Ｎ２Ｏ→Ｎ２の経路で硝酸イオンは窒素まで還元され、各段階においてそれぞれ硝酸還元酵素（ＮＡＲ）、亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）、一酸化窒素還元酵素（ＮＯＲ）及び亜酸化窒素還元酵素（ＮＯＳ）が関与している。代表的な脱窒菌として緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。
【０００３】
脱窒菌の脱窒は環境工学分野において重要な意義を有しており、脱窒菌を利用した脱窒方法が開発され排水処理に応用されている（特許文献１等）。脱窒の処理効率の向上を目的として様々な工夫がなされており、脱窒槽に水素ガスを吹き込む方法（特許文献１等）や脱窒槽のｐＨを制御する方法（特許文献２等）が検討されている。
【０００４】
一方、緑膿菌は病原性が低いため健常者に感染することは少ないが、加齢、疾患、薬物投与等により免疫力が低下した人に感染して日和見感染の原因菌となることが多い。緑膿菌は抗菌剤に対して強い抵抗性を有しているため多剤耐性緑膿菌が出現し、緑膿菌感染症の治療は困難となる。そこで、緑膿菌等の日和見病原体に対する様々な抗菌剤が開発されている（特許文献３等）。
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−３１７８８１号公報
【特許文献２】特開２０００−２８８５８３号公報
【特許文献３】特開２００６−２７３７９６号公報
【特許文献４】特開２００３−１２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存の脱窒の処理効率を向上させる方法は、脱窒菌の生育環境を単に最適化するものに過ぎず、脱窒菌の脱窒に直接影響を及ぼすものではなかった。脱窒に直接影響を及ぼすことができれば、脱窒の効率を劇的に向上させることができると考えられる。したがって、本発明は、脱窒に直接影響を及ぼす因子を見出すことを目的とし、それを利用した排水処理装置及び排水処理方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、抗菌剤を使用する限り必ずそれに対する耐性菌は出現するため、根本的な解決には至らない。しかし、脱窒（すなわち硝酸呼吸）に直接影響を及ぼすことができる抗菌剤であれば耐性菌は生じ難いと考えられる。したがって、本発明は、脱窒に直接影響を及ぼす因子を見出すことを目的とし、それを利用した抗菌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を進めた結果、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ−Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ−Ｓｉｇｎａｌ：ＰＱＳとも言う）が脱窒を抑制することを明らかにした。また、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンの脱窒抑制作用はキレート活性によるものであることを明らかにし、他のキレート剤も脱窒を抑制することを明らかにした。さらに、三価の鉄イオンの添加が脱窒を促進することも明らかにした。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、三価の鉄イオンからなることを特徴とする。本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、脱窒菌の脱窒活性を向上させ、脱窒菌を増殖させることが可能である。したがって、脱窒の処理効率を向上させることができ、排水処理方法及び排水処理装置に利用することが可能である。なお、特許文献４には、二価の鉄イオンを増殖促進剤として利用する脱窒方法が開示されている。しかしながら、三価の鉄イオンに関して何も言及されておらず、また二価の鉄イオンを単独で使用した場合の増殖促進効果は微々たるものでしかない（特許文献４の実施例１２）。
【００１０】
本発明の第１の排水処理装置は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段とを備えることを特徴とする。また、本発明の第１の排水処理方法は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする。本発明の排水処理装置及び排水処理方法は、本発明の脱窒菌の増殖促進剤を利用したものであり、効率よく脱窒を行うことが可能である。
【００１１】
本発明の第２の排水処理装置は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段とを備えることを特徴とする。また、本発明の第２の排水処理方法は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、三価の鉄イオンのキレート剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする。三価の鉄イオンのキレート剤（特に、２，２’−ビピリジル）は、脱窒菌の脱窒におけるＮ２産生量を減少させずに、Ｎ２Ｏ産生量を減少させる効果を有する。Ｎ２ＯはＣＯ２の約３００倍の温室効果を有しており、京都議定書において排出規制の対象となっている。地球温暖化防止の観点から、排水処理におけるＮ２Ｏの排出量を減少させることは非常に重要な意義がある。
【００１２】
また、本発明の抗菌剤は、三価の鉄イオンのキレート剤からなることを特徴とする。本発明の抗菌剤は、脱窒菌の脱窒を抑制し、脱窒菌の増殖を阻害することが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、脱窒菌の脱窒活性を向上させ、脱窒菌を増殖させることが可能であり、排水処理装置及び排水処理方法に利用することが可能である。本発明の第１の排水処理装置及び排水処理方法は、本発明の脱窒菌の増殖促進剤を利用することで、効率よく脱窒を行うことが可能である。本発明の第２の排水処理装置及び排水処理方法は、排水処理に伴い排出されるＮ２Ｏの量を低減することが可能である。
【００１４】
また、本発明の抗菌剤は、脱窒菌の脱窒を抑制し、脱窒菌の増殖を阻害することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、三価の鉄イオンからなることを特徴とする。三価の鉄イオンは脱窒菌の脱窒促進剤として機能する。本発明の脱窒菌の増殖促進剤の存在下で脱窒菌を培養すると、脱窒菌の脱窒活性が向上し、脱窒菌が効率よく脱窒を行い増殖する。脱窒菌を複合系で培養すると、脱窒菌自身が産生するＰＱＳによって脱窒菌は脱窒及び増殖が抑制された状態にある。しかし、三価の鉄イオンの存在下で脱窒菌を培養すると、ＰＱＳにより抑制された脱窒及び増殖を回復させ、脱窒菌が本来有している脱窒能及び増殖能を最大限にまで引き出すことが可能となる。適切な増殖促進活性を発揮させるため、脱窒菌の増殖促進剤の添加濃度は５μＭ〜５００μＭであることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭであることがより好ましい。
【００１７】
三価の鉄イオンとして、三価の鉄イオンの塩を用いることができ、例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）等が挙げられる。
【００１８】
図１０は、本発明の第１の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。図１０に示すように、排水処理装置１００は、脱窒菌が収容されている脱窒槽１０と、脱窒槽に三価の鉄イオンを供給する増殖促進剤供給手段２０とを備えている。脱窒槽１０には、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水するラインＬ１と、増殖促進剤供給手段２０から脱窒槽１０内に三価の鉄イオンを供給するラインＬ２と、脱窒反応後の亜酸化窒素及び／又は窒素を含有する処理水を脱窒槽１０の外部に排出するラインＬ３とが接続されている。脱窒槽１０は嫌気的条件に保たれている。
【００１９】
次に上述の構成の排水処理装置１００を用いた排水処理方法について説明する。
【００２０】
まず、ラインＬ１を経て、処理対象排水を脱窒槽１０に導入し、脱窒槽１０内の脱窒菌と混合される。次いで、ラインＬ２を経て増殖促進剤供給手段２０から三価の鉄イオンが脱窒槽１０内に供給され、脱窒槽１０内の脱窒菌と混合される。三価の鉄イオンを供給することで、脱窒槽１０内の脱窒菌は活性化され、ラインＬ１から供給された処理対象排水に含まれる硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンは亜酸化窒素及び／又は窒素へと効率よく還元される。亜酸化窒素及び／又は窒素を含む脱窒反応後の処理水はラインＬ３により脱窒槽１０の外部へと排出される。
【００２１】
図１１は、本発明の第２の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。図１１に示すように、排水処理装置２００は、脱窒菌が収容されている脱窒槽３０と、脱窒槽に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０とを備えている。脱窒槽３０には、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水するラインＬ４と、三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０から脱窒槽３０内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給するラインＬ５と、脱窒反応後の亜酸化窒素及び／又は窒素を含有する処理水を脱窒槽３０の外部に排出するラインＬ６とが接続されている。脱窒槽３０は嫌気的条件に保たれている。
【００２２】
次に上述の構成の排水処理装置２００を用いた排水処理方法について説明する。
【００２３】
まず、ラインＬ４を経て、処理対象排水を脱窒槽３０に導入し、脱窒槽３０内の脱窒菌と混合される。次いで、ラインＬ５を経て三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０から三価の鉄イオンのキレート剤が脱窒槽３０内に供給され、脱窒槽３０内の脱窒菌と混合される。三価の鉄イオンのキレート剤を供給することで、脱窒槽３０内の脱窒菌はＮ２の産生量をほとんど減少させずにＮ２Ｏの産生量を減少させることができる。ラインＬ４から供給された処理対象排水に含まれる硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンは亜酸化窒素及び／又は窒素へ還元されるが、三価の鉄イオンのキレート剤を供給しない場合と比較して窒素へ還元される割合が高くなる。亜酸化窒素及び／又は窒素を含む脱窒反応後の処理水はラインＬ６により脱窒槽３０の外部へと排出される。
【００２４】
次に、本発明の抗菌剤について説明する。本発明の抗菌剤は、三価の鉄イオンのキレート剤からなる。三価の鉄イオンのキレート剤が存在すると、脱窒菌の脱窒反応すなわち硝酸呼吸が抑制され、ＡＴＰの合成の抑制及び脱窒菌の増殖抑制へと繋がる。また、三価の鉄イオンのキレート剤は、脱窒菌以外の細菌の増殖も抑制する。本発明の抗菌剤は、特に感染の初期段階での細菌の増殖の抑制に有効と考えられる。また、本発明の抗菌剤と既存の抗菌剤とを組み合わせることで効果的に細菌の増殖を抑制することができると考えられる。
【００２５】
三価の鉄イオンのキレート剤としては公知の化合物が使用でき、例えば、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン、２，２’−ビピリジル、デフェロキサミン及びその塩、デフェラシロクス、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、１，１０−フェナントロリン、ポルフィリン等が挙げられ、特に２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン、２，２’−ビピリジル、デフェロキサミン及びその塩並びにデフェラシロクスが好ましい。
【００２６】
２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンは、特異性が高いという優れた特性を備えている。すなわち、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンは脱窒菌の脱窒反応を特異的に抑制することができ、その他の場面において三価の鉄イオンのキレート剤として機能し難いため、効果的に細菌の増殖を抑制することができ、かつ副作用が生じる可能性が低い。
【００２７】
デフェロキサミン（Ｎ’−［５−（ａｃｅｔｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｍｉｎｏ）ｐｅｎｔｙｌ］−Ｎ−［５−［３−（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌａｍｉｎｏ］ｐｅｎｔｙｌ］−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔａｎｅｄｉａｍｉｄｅ）は三価の鉄イオンと結合して、安定した水溶性のキレート化合物であるフェリオキサミンを形成する。臨床上、メシル酸デフェロキサミンが鉄過剰症の治療薬として使われている。鉄過剰症に関するメシル酸デフェロキサミンの用法及び用量は、メシル酸デフェロキサミンは１日量５００ｍｇ〜１０００ｍｇを１〜２回に分けて筋肉内注射する、又は１日量８０ｍｇ／ｋｇを限度として１回１０００ｍｇを毎時１５ｍｇ／ｋｇの速度で点滴静注する。抗菌剤としてデフェロキサミン及びその塩を使用する場合、これを参考に用法及び用量を決定することができる。
【００２８】
デフェラシロクス（［４−［（３Ｚ，５Ｅ）−３，５−ｂｉｓ（６−ｏｘｏ−１−ｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，４−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）も鉄過剰症の治療薬として臨床で使われている。小児患者において１日１回２０〜３０ｍｇ／ｋｇの経口投与が臨床上有効な鉄キレート効果を示すことが明らかになっている。抗菌剤としてデフェラシロクスを使用する場合、これを参考に用法及び用量を決定することができる。
【００２９】
本発明の抗菌剤は、その投与形態に合わせ薬学的に許容される添加剤を加えて各種製剤化することができる。添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えばゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアゴム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。
【００３０】
これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤若しくは注射剤等の液体製剤等が挙げられる。これらは、製剤分野における通常の方法に従って調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させる様式であってもよい。また、特に注射剤の場合、必要に応じて生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は懸濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【実施例】
【００３１】
（細菌株、プラスミド及び増殖条件） 軽質転換用の大腸菌株ＪＭ１０９及びＤＨ５αはタカラバイオから購入した。大腸菌Ｓ１７−１はＳｉｍｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６４０−６５９（１９８６）に記載の方法により得た。クローニングベクターｐＨＳＧ３９８（クロラムフェニコール耐性）はタカラバイオから購入した。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃ由来自殺ベクターｐＧ１９ＩＩ（ゲンタマイシン耐性）はＭａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法で得た。ブロードホストレンジベクターであるｐＵＣＰ２４（ゲンタマイシン耐性）はＷｅｓｔら，Ｇｅｎｅ，１４８：８１−８６（１９９４）に記載の方法で得た。ｐＭＥＸ９、ｐＭＥＸｎａｒＫ、ｐＭＥＸｎｉｒＳ、ｐＭＥＸｎｏｒＣ及びｐＭＥＸｎｏｓＲはＴｏｙｏｆｕｋｕら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８９：４９６９−７２（２００７）に記載の方法で得た。
【００３２】
使用したプライマーは下表の通りである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
細菌株は３７℃において、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地又はＬＢ寒天培地で増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）には８０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを、必要に応じて加えた。試験培養を行う前に、緑膿菌は嫌気的に４ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍｌの試験管で増殖させ、開始時の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が０．０１となるように嫌気培地に接種した。嫌気培養のため、ブチルゴムで栓をしたハンゲート試験管又は三角フラスコの空気をアルゴンで置換した。増殖、脱窒活性及び転写活性は、５ｍｌのＬＢＮ培地（１００ｍＭのＫＮＯ３を添加したＬＢ培地）を含む１７ｍｌのハンゲート試験管を使い、３７℃でインキュベーションし、２００ｒｐｍで振盪して測定した。脱窒酵素活性を測定するために使用した細胞は、８０ｍｌのＬＢＮを含む５００ｍｌの三角フラスコ中で３７℃、２００ｒｐｍで培養した。
【００３５】
（緑膿菌変異体の構築） ｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥの欠失カセットを保有するプラスミドｐＧ１９ｐｑｓＡ、ｐＧ１９ｐｑｓＲ及びｐＧ１９ｐｑｓＥをＭａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法と同じ方法で作製した。ＰＡＯ１の染色体を、ｐｑｓＡＦ１／ｐｑｓＡＲ２、ｐｑｓＲＦ１／ｐｑｓＲＲ２及びｐｑｓＥＦ１／ｐｑｓＥＲ２プライマー対で増幅し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理したクローニングベクターｐＨＳＧ３９８のマルチクローニングサイトにライゲートした。ｐｑｓＡＦ２／ｐｑｓＡＲ１、ｐｑｓＲＦ２／ｐｑｓＲＲ１及びｐｑｓＥＦ２／ｐｑｓＥＲ１プライマー対を使ったインバースＰＣＲで、ｐＨＳＧ３９８のｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥの隣接ＤＮＡ断片を増幅した。増幅したｐｑｓＡの隣接断片はＳｐｅＩで消化し、増幅したｐｑｓＲ及びｐｒｓＥの隣接断片はＢｇｌＩＩで消化した。これらの制限酵素部位はプライマーに付加されている。ｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥ欠失ＤＮＡ断片をｐＧ１９ＩＩのマルチクローニングサイトのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＧ１９ｐｑｓＡ、ｐＧ１９ｐｑｓＲ及びｐＧ１９ｐｑｓＥを作製した。大腸菌Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６４０−６５９（１９８６））にコンジュゲートし、Ｍａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法に従って相同組換えを行い、ｐＧ１９ＩＩ由来のプラスミドをＰＡＯ１に導入した。変異株をＰＣＲで分析した。
【００３６】
（細胞画分の調製） ＬＢＮ培地で増殖させた細胞を中対数増殖期（６時間のインキュベーション時間）で回収し、７０００ｇ、４℃で遠心し、１０％グリセロールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で２回洗浄した。細胞を同じ緩衝液に懸濁し、超音波処理した。超音波処理した細胞を２０００ｇ、４℃で１０分間遠心して壊れていない細胞を取り除き、１０４０００ｇ、４℃で６０分間遠心した。上清を細胞可溶画分として回収し、ペレットを同じバッファーで再懸濁して膜画分として回収した。
【００３７】
（酵素活性測定） ＮＡＲ活性は、その産物であるＮＯ２−を比色測定で定量することで測定した（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３：９８１−９８４（１９５７））。ベンジルビオローゲン−ジチオン酸関連ＮＡＲ活性は、メチルビオローゲンの代わりにベンジルビオローゲンを使用して、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１６２６３−１６２６７（１９９６）に記載の方法に従って測定した。１０ｍＭのＮａＮＯ３、０．２ｍＭのベンジルビオローゲン及び適切な濃度の嫌気的に培養した緑膿菌の細胞膜画分を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）４００μｌに、１００μｌのＮａ２Ｓ２Ｏ４を最終濃度が１０ｍＭとなるように加えた。Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を添加する前に反応液の空気をＮ２で置換した。反応液を３０℃で５分間インキュベートし、反応液の色がメチルビオローゲンの酸化の指標である透明となるまで撹拌した。呼吸鎖に関連するＮＡＲ活性は、ＮＡＤＨを電子供与体として測定した（Ｒａｄｃｌｉｆｆｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０５：２７３−２８７（１９７０））。ＮＡＤＨ由来ＮＡＲ活性測定用の５００μｌの反応液は、１０ｍＭのＮａＮＯ３及び嫌気的に培養した緑膿菌の膜画分を含む。反応液の空気をＮ２で置換した。ＮＡＤＨを最終濃度が５ｍＭとなるように３０℃で加えることで反応を開始し、１００℃で１５分間煮沸することで反応を停止した。
【００３８】
ＮＩＲ活性はＮＯ２−の消費量を測定してアッセイした（Ｌａｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１８０：４５９−４７２（１９６９））。２００μＭのＮａＮＯ２、２００μＭのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び嫌気的に培養した緑膿菌の可溶画分を含む４００μｌの反応液に、最終濃度が１ｍＭとなるように１００μｌのＮＡＤＨを加えることで反応を開始した。ＮＡＤＨの添加前に反応液の空気はＮ２で置換し、３０℃で１０分間反応させた。
【００３９】
ＮＯＲ活性はその産物であるＮ２Ｏをガスクロマトグラフィーで測定して、アッセイした。空気をＮ２で置換した４ｍＭのＮＡＤＨ、２ｍＭのＰＭＳ及び嫌気的に培養した緑膿菌の膜画分を含む反応液に、２０ｍＭのＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウムを１００μｌ加えた。３０℃で６分間反応させた。
【００４０】
カテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ特異的な活性は３７５ｎｍの吸光度Ａ３７５を測定してアッセイした（Ｍａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）及びＳａｗａｄａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４８：４３５−４３９（２００４））。
【００４１】
（分析方法） 液体培養における細菌の増殖は、６００ｎｍの吸光度でモニターした。タンパク質量は、ブラッドフォード法で定量した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８−２５４（１９７６））。ＮＯ３−の濃度はブルシン法（Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３：９８１−９８４（１９５７））で測定した。Ｎ２Ｏ及びＮ２の濃度は、熱伝導検出器を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−８ＡＩＴ；島津製作所）で測定した。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。Ｓｈｉｎｃａｒｂｏｎ ＳＴ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｅｖｅ ５ＡカラムをＮ２Ｏ又はＮ２の検出用にそれぞれ使用した。
【００４２】
（ピオシアニンアッセイ） ピオシアニンは、Ｅｓｓａｒらの方法（Ｅｓｓａｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８８４−９００（１９９０））に従って測定した。細胞をＬＢ又はＬＢＮ培地（１６ｍｌのハンゲート試験管に２ｍｌの培地）で、好気的培養ではシリコンゴムで、嫌気的培養ではブチルゴムで栓をし、１２時間インキュベーションした。１ｍｌの培地を２ｍｌの試験管に回収し、遠心した。上清を新しい試験管に移し、７５０μｌのクロロホルムを加えた。試料を撹拌し、遠心し、下層５００μｌを新しい試験管に移した。その試験管に０．２ＮのＨＣｌを１００μｌ加え、上層の５２０ｎｍの吸光度を測定した。Ａ５２０の数値を培地のＯＤ６００で割った。
【００４３】
（試験例１） 前述の通り、脱窒はＮＯ３−をＮ２Ｏ又はＮ２へ還元する工程であり、生理学的には嫌気条件下でエネルギーを獲得するために重要な工程でもある。ＰＱＳが脱窒に与える影響を調べるため、ＰＱＳ及び関連する２−アルキル−４−キノロン類（ＡＨＱｓ）を産生しないΔｐｑｓＡ変異体（ｐｑｓＡ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）をＬＢＳ培地で嫌気的に増殖させ、外来のＰＱＳを最終濃度が５０μＭとなるように加えた。ＰＱＳを加えると、６００ｎｍの濁度が中対数増殖期の５０％以下に低下し、ＰＱＳにより脱窒が抑制されていることが示唆された（図１Ａ参照）。より詳しく調べるため、１２時間インキュベーションしたときのＮＯ３−の減少量並びにＮ２Ｏ及びＮ２の産生量を測定した。ＰＱＳ添加による増殖の抑制に伴い、ＮＯ３−の減少量は５９％低下し（図１Ｂ参照）、Ｎ２Ｏの産生量は５１％低下し（図１Ｃ参照）、Ｎ２の産生量は４８％低下した（図１Ｄ参照）。これらのデータは、ＰＱＳは緑膿菌の脱窒を抑制していることを示している。
【００４４】
（試験例２） 脱窒のどの工程がＰＱＳにより抑制されているのかを調べるため、各工程に関与する脱窒酵素の転写にＰＱＳが及ぼす影響を調べた。ｘｙｌＥ遺伝子をｎａｒＫ１、ｎｉｒＳ、ｎｏｒＣ及びｎｏｓＲ脱窒遺伝子のプロモーター領域に融合したプロモーター融合プラスミドを、それぞれΔｐｑｓＡ変異体にトランスファーした。対照として、ｐＭＥＸ９プラスミドで軽質転換したΔｐｑｓＡ変異体におけるベースのカテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｃ２３Ｏ）活性を、ＰＱＳの添加の有無で調べた。Ｃ２３Ｏ活性は、中対数増殖期（６時間インキュベーション）中で測定した。プロモーター依存性のＣ２３Ｏ活性は、そのＣ２３Ｏ活性をベースのＣ２３Ｏ活性で割って求めた。ＰＱＳを最終濃度が５０μＭとなるように培地に添加したとき、いずれのプロモーター活性にも影響が認められなかった（図２参照）。この結果は、ＰＱＳによる脱窒制御は転写制御によるものではなく、他の転写後の機序によるものであることを示している。
【００４５】
（試験例３） 転写後のレベルで脱窒が制御されているか否かを調べるため、中対数増殖期の脱窒酵素活性を測定した。ＰＱＳの添加あり（最終濃度５０μＭ）又はなしの条件下でΔｐｑｓＡ変異体を培養し、ＮＡＲ、ＮＩＲ及びＮＯＲ脱窒酵素活性を測定した。その結果、ＮＡＲ活性はＰＱＳを添加して培養すると抑制された（ＰＱＳを添加せずに培養したときの活性に比べて６６％；図３Ａ参照）。興味深いことに、ＮＩＲ活性はＰＱＳの添加により１．８倍上昇した（図３Ｂ参照）。ＮＯＲ活性はＰＱＳの添加により６４％まで低下した（図３Ｃ参照）。これらの脱窒酵素の活性の変化は、転写後の制御によるものか、あるいはＰＱＳとの直接の相互作用によるものであろう。ＰＱＳが脱窒酵素活性に直接影響を及ぼすかどうかを調べるため、Δｐｑｓ変異体の酵素アッセイ反応液にＰＱＳを加えて、酵素活性を測定した。図３Ｃに示したように、ＮＯＲ活性はＰＱＳを反応液に加えることで阻害されており、このことはＰＱＳがＮＯＲ活性を直接阻害することを示している。一方、ＮＡＲ及びＮＩＲ活性は、ＰＱＳを反応液に加えても直接影響を受けていない（図３Ａ及びＢ）。脱窒遺伝子の転写がＰＱＳにより制御されていないという結果をあわせると、この結果はＮＡＲ及びＮＩＲの活性はＰＱＳにより転写後調節を受けており、ＮＯＲ活性はＰＱＳにより直接阻害されていることを示している。
【００４６】
（試験例４） 脱窒酵素はエネルギーが産生される呼吸鎖と関係している。ＮＯ３−呼吸の間、ＮＡＤＨから供与された電子は呼吸鎖を伝達し、最終的にＮＯ３−が受け取り、この最後の皇帝はＮＡＲによって媒介されている。ＮＡＲ活性測定（図３Ａ）において、ＮＡＲに直接電子を供与する電子供与体（ベンジルビオローゲン）が使われ、ＮＯ３−呼吸鎖の活性は計算に入っていない。ＮＯ３−呼吸鎖がＰＱＳによって影響を受けるか否かを調べるため、ＮＡＤＨ由来のＮＡＲ活性の測定を行った。ＮＡＤＨを電子供与体として使用した場合、ＮＡＤＨ−ＮＡＲ活性はＰＱＳの培地への添加により抑制され、ＰＱＳを反応液に添加（最終濃度５０μＭ）した場合も直接阻害された（図３Ｄ）。この結果は、ＮＯ３−呼吸がＰＱＳにより直接阻害されていることを示す。ＮＡＤＨ由来ＮＡＲ活性はＰＱＳにより直接阻害される（図３Ｄ）のに対してベンジルビオローゲン由来ＮＡＲ活性は阻害されない（図３Ａ）という結果は、ＮＡＤＨからＮＯ３−までの電子伝達のいずれかをＰＱＳは直接阻害していることを示す。
【００４７】
（試験例５） ＰＱＳは緑膿菌における転写を調節するばかりでなく、鉄をキレートすることも報告されている。そこで、ＰＱＳの鉄へのキレート効果が脱窒酵素に影響を与えていると考えた。この仮説を試すため、ＰＱＳを添加（最終濃度５０μＭ）した培地にＦｅＣｌ３（最終濃度１００μＭ）を補充した。その結果、ＦｅＣｌ３の添加により、ＰＱＳを添加した培養におけるＮＯ３−の減少量及びＮ２Ｏの産生量が完全に回復した（図４Ａ及びＢ）。これは、ＰＱＳの脱窒制御が鉄のキレート化によるものだということを示している。鉄キレート化が脱窒に影響を及ぼすことを確かめるため、鉄キレート剤である２，２’−ビピリジルを培地に加え（最終濃度１２０μＭ）、脱窒活性を測定した。ＮＯ３−減少量及びＮ２Ｏ産生量は、ＰＱＳの場合と同様に抑制され、ＦｅＣｌ３の補充により回復した（図４Ａ及びＢ）。興味深いことに、ＰＱＳを加えた場合のＮ２産生量はＦｅＣｌ３により部分的にしか回復せず、２，２’−ビピリジルはＮ２産生量を減少させなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、ＮＯＳが触媒しているＮ２ＯからＮ２への還元がＰＱＳの鉄キレート化以外の別の機序によって調節されていることを示唆する。
【００４８】
（試験例６） ＰＱＳが制御する遺伝子の多くは、同族の応答制御因子ＰｑｓＲ又は機能が未知だがＰＱＳへの応答を促進すると考えられているＰｑｓＥを必要とする。Ｎ２ＯからＮ２への還元がこの制御経路で調節されているか否かを調べるため、ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ（ｐｑｓＡ及びｐｑｓＲ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ（ｐｑｓＡ及びｐｑｓＥ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）二重変異体を構築した。ＰＱＳ（最終濃度５０μＭ）を変異体に加え、１２時間のインキュベーションで減少したＮＯ３−量及び産生したＮ２Ｏ及びＮ２量を測定した。ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥにおけるＮＯ３−の減少及びＮ２Ｏの産生は、ΔｐｑｓＡのときと同一であった（図５Ａ〜Ｂ）。図５Ｃに示したように、ＰＱＳによるＮ２産生の抑制は、ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥのいずれの二重変異株でも認められず、一方、ＰＱＳはΔｐｑｓＡにおけるＮ２産生を抑制した（図１Ｄ）。この結果は、Ｎ２産生はＰｑｓＥを通じたＰＱＳ及びＰｑｓＲ転写調節因子によって調節されていることを示す。この調節は、ＰＱＳはｎｏｓの転写を調節していないことから（図２）、ｎｏｓ以外のＮ２産生に関与する他の因子の転写調節に関与している可能性がある。ＮＯ３−からＮ２Ｏへの還元は、ＰｑｓＥ又はＰｑｓＲがない場合でもＰＱＳにより抑制されており（図５Ａ及びＢ）、それはΔｐｑｓＡでも認められたとおりであり（図１Ｂ及びＣ）、ＮＯ３−からＮ２Ｏへの還元は、ＰＱＳの鉄キレート化により調節されているという結果（図４Ａ〜Ｃ）を支持する。ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ株で得られた結果が極性効果によるものかを確認するため、各変異体を適切な野生型のコピー（ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ／ｐＵＣＰ−ｐｑｓＲ，ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ／ｐＵＣＰ−ｐｑｓＥ）で補完する相補性実験を行った。驚いたことに、ＮＯ３−減少量並びにＮ２Ｏ及びＮ２産生量は、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥをプラスミドに発現させたとき、ＰＱＳが存在しなくても、強く抑制された。鉄キレート化実験の結果（図４Ａ〜Ｃ）とあわせて考えると、これらのデータは、ＰｑｓＲ及びＰｑｓＥを媒介する経路であってＰＱＳの鉄キレート化特性とは異なる経路によってＰＱＳはＮ２産生を調節していることを示している。
【００４９】
（試験例７） 好気条件において、ＰＱＳは、高濃度で（１５０μＭ以上）で遅滞期を延長させ、またＬＢ培地単独での増殖と比較して定常期の濁度を若干低下させることが報告されている。一方、嫌気条件では、ＰＱＳは増殖を５０％まで低下させており、嫌気条件ではＰＱＳが増殖に及ぼす影響が顕著であることを示している。最近の研究（Ｄｉｇｇｌｅら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１４：８７−９６（２００７））によれば、ＰＱＳの鉄キレート化特性が緑膿菌の好気的増殖に影響を及ぼすことが示されており、鉄キレート化性のシデロフォア（ピオシアニン及びピオケリン）を産生できないｐｖｄＤｐｃｈＥＦ二重変異体において強い影響を及ぼす。この結果は、シデロフォア産生がＰＱＳの増殖抑制に関与していることを示し、脱窒へのＰＱＳの鉄キレート化効果は嫌気条件下でのシデロフォアの産生低下によるものかもしれないと推測された。これを調べるため、ＬＢ好気培地、ＬＢＮ好気培地及びＬＢＮ嫌気培地での培養物のピオシアニン産生を測定した。予想通り、ピオシアニン産生はＬＢＮ嫌気培養では低下した（図６）。興味深いことに、ピオシアニン産生は、ＮＯ３−を添加した好気培養においても低下しており、ピオシアニン産生がＮＯ３−及びＯ２の両方によって調節されていることを示唆している。これらの結果は、シデロフォアの不十分な産生のため、好気条件下及びＮＯ３−存在下の嫌気条件下において、脱窒はＰＱＳにより抑制されることを示唆している。ＮＯ３−非存在下の低下したピオシアニン産生及び鉄キレート化依存性の脱窒調節は、ＮＯ３−等のＮ−オキシド類及び鉄が、ＰＱＳにより増殖が影響を受けるか否かの重要な環境因子であることを示唆している。
【００５０】
（試験例８） 細菌の増殖にＰＱＳが効果を及ぼすかを調べた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｒｒｉｇｅｎａをＬＢ培地で好気的に増殖させた。ＰＱＳ及びＦｅＣｌ３を添加する場合には、それぞれ最終濃度５０μＭ及び１００μＭとなるように加えた。図８から明らかなように、いずれの細菌もＰＱＳの添加により増殖が抑制され、ＦｅＣｌ３の添加によって増殖が回復した。ＰＱＳは細菌の増殖を抑制し、三価の鉄はＰＱＳによる増殖抑制を回復することが明らかとなった。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａをＬＢＮ培地で嫌気的に増殖させた場合も、ＰＱＳの添加により増殖が抑制され、ＦｅＣｌ３の添加によって増殖が回復した。この結果から、ＰＱＳは緑膿菌に限らず多くの脱窒菌の増殖の抑制し、また三価の鉄はＰＱＳによる増殖抑制を回復することが予想される。
【００５１】
（試験例９） 緑膿菌の増殖に及ぼす２，２−ビピリジルの効果を調べた。緑膿菌を２，２−ビピリジル存在下（２００μＭ）又は非存在下にＬＢ培地で好気的に増殖させるかＬＢＮ培地で嫌気的に増殖させた。図９から明らかなように、緑膿菌を好気的に増殖させた場合は２，２−ビピリジルにより増殖が抑制されなかったが、緑膿菌を嫌気的に増殖させた場合は２，２−ビピリジルにより増殖が抑制された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】嫌気増殖及び脱窒に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。ＡはΔｐｑｓＡ変異体を外来のＰＱＳの添加又は非添加の嫌気増殖を表すグラフである。３回の独立した実験を行い、代表的なデータを示す。ＢはＮＯ３−減少量を、ＣはＮ２Ｏ産生量を、ＤはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図２】脱窒遺伝子の転写に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。３回以上の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図３】脱窒酵素活性及びＮＯ３−呼吸鎖に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。ＡはＮＡＲ活性を、ＢはＮＩＲ活性を、ＣはＮＯＲ活性を、ＤはＮＡＤＨ依存性ＮＡＲ活性を表すグラフである。ＰＱＳは、培地又は反応液に最終濃度５０μＭとなるように加えている。１はＰＱＳ非添加のΔｐｑｓＡ変異体の培養物を表し、２はＰＱＳを添加したΔｐｑｓＡ変異体の培養物を表し、３はＰＱＳ非添加のΔｐｑｓＡ変異体の培養物から回収した細胞画分の反応液にＰＱＳを添加したものを表す。３回以上の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図４】脱窒に及ぼす鉄キレート化の効果を表すグラフである。ＡはＮＯ３−減少量を、ＢはＮ２Ｏ産生量を、ＣはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図５】ＰＱＳにより調節されるＮ２産生にＰｑｓＲ及びＰｑｓＥが関与していることを表すグラフである。ＡはＮＯ３−減少量を、ＢはＮ２Ｏ産生量を、ＣはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図６】ピオシアニン産生に及ぼすＮＯ３−及びＯ２の効果を表すグラフである。ＬＢはＬＢ培地で好気的に培養した場合を表し、ＬＢＮはＬＢ培地に１００ｍＭのＮＯ３−を補充した培地（ＬＢＮ培地）で好気的に培養した場合を表し、ＬＢＮ／−Ｏ２はＬＢＮ培地で嫌気的に培養した場合を表す。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。ＮＤは検出できなかったことを表す。
【図７】ＰＱＳによるＮＯ３−呼吸及び脱窒酵素の調節のモデルを表す図である。実線は直接的な調節を表し、破線は間接的な調節を表す。ＤＨはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを表し、ＯＭは外膜を表し、ＰＰは細胞膜周辺腔を表し、ＩＭは内膜を表す。ＮＯ３−呼吸鎖及びＮＯＲ酵素活性は鉄キレート化を通じてＰＱＳにより直接阻害される。ＮＡＲ及びＮＯＳ活性はＰＱＳにより間接的に抑制され、ＮＩＲ活性はＰＱＳにより間接的に上昇する。ＰｑｓＥ及びＰｑｓＲはＮＯＳ活性抑制に関与している。
【図８】各種細菌の増殖に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。
【図９】緑膿菌の増殖に及ぼす２，２’−ビピリジルの効果を表すグラフである。
【図１０】本発明の第１の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。
【図１１】本発明の第２の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５３】
１０及び３０…脱窒槽、２０…増殖促進剤供給手段、４０…三価の鉄イオンのキレート剤供給手段、１００及び２００…排水処理装置、Ｌ１〜Ｌ６…ライン。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の増殖を制御する化合物及びその応用に関する。より詳細には、本発明は、脱窒菌の増殖促進剤並びにそれを利用した排水処理装置及び排水処理方法に関する。さらに、本発明は抗菌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある種の細菌は、硝酸イオン（ＮＯ３−）や亜硝酸イオン（ＮＯ２−）を還元して窒素（Ｎ２）や亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）を放出し、ＡＴＰを合成する硝酸呼吸を行う。このような細菌を脱窒菌といい、このような過程を脱窒という。より具体的には、ＮＯ３−→ＮＯ２−→ＮＯ→Ｎ２Ｏ→Ｎ２の経路で硝酸イオンは窒素まで還元され、各段階においてそれぞれ硝酸還元酵素（ＮＡＲ）、亜硝酸還元酵素（ＮＩＲ）、一酸化窒素還元酵素（ＮＯＲ）及び亜酸化窒素還元酵素（ＮＯＳ）が関与している。代表的な脱窒菌として緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。
【０００３】
脱窒菌の脱窒は環境工学分野において重要な意義を有しており、脱窒菌を利用した脱窒方法が開発され排水処理に応用されている（特許文献１等）。脱窒の処理効率の向上を目的として様々な工夫がなされており、脱窒槽に水素ガスを吹き込む方法（特許文献１等）や脱窒槽のｐＨを制御する方法（特許文献２等）が検討されている。
【０００４】
一方、緑膿菌は病原性が低いため健常者に感染することは少ないが、加齢、疾患、薬物投与等により免疫力が低下した人に感染して日和見感染の原因菌となることが多い。緑膿菌は抗菌剤に対して強い抵抗性を有しているため多剤耐性緑膿菌が出現し、緑膿菌感染症の治療は困難となる。そこで、緑膿菌等の日和見病原体に対する様々な抗菌剤が開発されている（特許文献３等）。
【０００５】
【特許文献１】特開平０５−３１７８８１号公報
【特許文献２】特開２０００−２８８５８３号公報
【特許文献３】特開２００６−２７３７９６号公報
【特許文献４】特開２００３−１２９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存の脱窒の処理効率を向上させる方法は、脱窒菌の生育環境を単に最適化するものに過ぎず、脱窒菌の脱窒に直接影響を及ぼすものではなかった。脱窒に直接影響を及ぼすことができれば、脱窒の効率を劇的に向上させることができると考えられる。したがって、本発明は、脱窒に直接影響を及ぼす因子を見出すことを目的とし、それを利用した排水処理装置及び排水処理方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また、抗菌剤を使用する限り必ずそれに対する耐性菌は出現するため、根本的な解決には至らない。しかし、脱窒（すなわち硝酸呼吸）に直接影響を及ぼすことができる抗菌剤であれば耐性菌は生じ難いと考えられる。したがって、本発明は、脱窒に直接影響を及ぼす因子を見出すことを目的とし、それを利用した抗菌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を進めた結果、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ−Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ−Ｓｉｇｎａｌ：ＰＱＳとも言う）が脱窒を抑制することを明らかにした。また、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンの脱窒抑制作用はキレート活性によるものであることを明らかにし、他のキレート剤も脱窒を抑制することを明らかにした。さらに、三価の鉄イオンの添加が脱窒を促進することも明らかにした。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、三価の鉄イオンからなることを特徴とする。本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、脱窒菌の脱窒活性を向上させ、脱窒菌を増殖させることが可能である。したがって、脱窒の処理効率を向上させることができ、排水処理方法及び排水処理装置に利用することが可能である。なお、特許文献４には、二価の鉄イオンを増殖促進剤として利用する脱窒方法が開示されている。しかしながら、三価の鉄イオンに関して何も言及されておらず、また二価の鉄イオンを単独で使用した場合の増殖促進効果は微々たるものでしかない（特許文献４の実施例１２）。
【００１０】
本発明の第１の排水処理装置は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段とを備えることを特徴とする。また、本発明の第１の排水処理方法は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする。本発明の排水処理装置及び排水処理方法は、本発明の脱窒菌の増殖促進剤を利用したものであり、効率よく脱窒を行うことが可能である。
【００１１】
本発明の第２の排水処理装置は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、前記脱窒槽内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段とを備えることを特徴とする。また、本発明の第２の排水処理方法は、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、三価の鉄イオンのキレート剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする。三価の鉄イオンのキレート剤（特に、２，２’−ビピリジル）は、脱窒菌の脱窒におけるＮ２産生量を減少させずに、Ｎ２Ｏ産生量を減少させる効果を有する。Ｎ２ＯはＣＯ２の約３００倍の温室効果を有しており、京都議定書において排出規制の対象となっている。地球温暖化防止の観点から、排水処理におけるＮ２Ｏの排出量を減少させることは非常に重要な意義がある。
【００１２】
また、本発明の抗菌剤は、三価の鉄イオンのキレート剤からなることを特徴とする。本発明の抗菌剤は、脱窒菌の脱窒を抑制し、脱窒菌の増殖を阻害することが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、脱窒菌の脱窒活性を向上させ、脱窒菌を増殖させることが可能であり、排水処理装置及び排水処理方法に利用することが可能である。本発明の第１の排水処理装置及び排水処理方法は、本発明の脱窒菌の増殖促進剤を利用することで、効率よく脱窒を行うことが可能である。本発明の第２の排水処理装置及び排水処理方法は、排水処理に伴い排出されるＮ２Ｏの量を低減することが可能である。
【００１４】
また、本発明の抗菌剤は、脱窒菌の脱窒を抑制し、脱窒菌の増殖を阻害することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の脱窒菌の増殖促進剤は、三価の鉄イオンからなることを特徴とする。三価の鉄イオンは脱窒菌の脱窒促進剤として機能する。本発明の脱窒菌の増殖促進剤の存在下で脱窒菌を培養すると、脱窒菌の脱窒活性が向上し、脱窒菌が効率よく脱窒を行い増殖する。脱窒菌を複合系で培養すると、脱窒菌自身が産生するＰＱＳによって脱窒菌は脱窒及び増殖が抑制された状態にある。しかし、三価の鉄イオンの存在下で脱窒菌を培養すると、ＰＱＳにより抑制された脱窒及び増殖を回復させ、脱窒菌が本来有している脱窒能及び増殖能を最大限にまで引き出すことが可能となる。適切な増殖促進活性を発揮させるため、脱窒菌の増殖促進剤の添加濃度は５μＭ〜５００μＭであることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭであることがより好ましい。
【００１７】
三価の鉄イオンとして、三価の鉄イオンの塩を用いることができ、例えば、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）等が挙げられる。
【００１８】
図１０は、本発明の第１の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。図１０に示すように、排水処理装置１００は、脱窒菌が収容されている脱窒槽１０と、脱窒槽に三価の鉄イオンを供給する増殖促進剤供給手段２０とを備えている。脱窒槽１０には、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水するラインＬ１と、増殖促進剤供給手段２０から脱窒槽１０内に三価の鉄イオンを供給するラインＬ２と、脱窒反応後の亜酸化窒素及び／又は窒素を含有する処理水を脱窒槽１０の外部に排出するラインＬ３とが接続されている。脱窒槽１０は嫌気的条件に保たれている。
【００１９】
次に上述の構成の排水処理装置１００を用いた排水処理方法について説明する。
【００２０】
まず、ラインＬ１を経て、処理対象排水を脱窒槽１０に導入し、脱窒槽１０内の脱窒菌と混合される。次いで、ラインＬ２を経て増殖促進剤供給手段２０から三価の鉄イオンが脱窒槽１０内に供給され、脱窒槽１０内の脱窒菌と混合される。三価の鉄イオンを供給することで、脱窒槽１０内の脱窒菌は活性化され、ラインＬ１から供給された処理対象排水に含まれる硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンは亜酸化窒素及び／又は窒素へと効率よく還元される。亜酸化窒素及び／又は窒素を含む脱窒反応後の処理水はラインＬ３により脱窒槽１０の外部へと排出される。
【００２１】
図１１は、本発明の第２の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。図１１に示すように、排水処理装置２００は、脱窒菌が収容されている脱窒槽３０と、脱窒槽に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０とを備えている。脱窒槽３０には、硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水するラインＬ４と、三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０から脱窒槽３０内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給するラインＬ５と、脱窒反応後の亜酸化窒素及び／又は窒素を含有する処理水を脱窒槽３０の外部に排出するラインＬ６とが接続されている。脱窒槽３０は嫌気的条件に保たれている。
【００２２】
次に上述の構成の排水処理装置２００を用いた排水処理方法について説明する。
【００２３】
まず、ラインＬ４を経て、処理対象排水を脱窒槽３０に導入し、脱窒槽３０内の脱窒菌と混合される。次いで、ラインＬ５を経て三価の鉄イオンのキレート剤供給手段４０から三価の鉄イオンのキレート剤が脱窒槽３０内に供給され、脱窒槽３０内の脱窒菌と混合される。三価の鉄イオンのキレート剤を供給することで、脱窒槽３０内の脱窒菌はＮ２の産生量をほとんど減少させずにＮ２Ｏの産生量を減少させることができる。ラインＬ４から供給された処理対象排水に含まれる硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンは亜酸化窒素及び／又は窒素へ還元されるが、三価の鉄イオンのキレート剤を供給しない場合と比較して窒素へ還元される割合が高くなる。亜酸化窒素及び／又は窒素を含む脱窒反応後の処理水はラインＬ６により脱窒槽３０の外部へと排出される。
【００２４】
次に、本発明の抗菌剤について説明する。本発明の抗菌剤は、三価の鉄イオンのキレート剤からなる。三価の鉄イオンのキレート剤が存在すると、脱窒菌の脱窒反応すなわち硝酸呼吸が抑制され、ＡＴＰの合成の抑制及び脱窒菌の増殖抑制へと繋がる。また、三価の鉄イオンのキレート剤は、脱窒菌以外の細菌の増殖も抑制する。本発明の抗菌剤は、特に感染の初期段階での細菌の増殖の抑制に有効と考えられる。また、本発明の抗菌剤と既存の抗菌剤とを組み合わせることで効果的に細菌の増殖を抑制することができると考えられる。
【００２５】
三価の鉄イオンのキレート剤としては公知の化合物が使用でき、例えば、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン、２，２’−ビピリジル、デフェロキサミン及びその塩、デフェラシロクス、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、１，１０−フェナントロリン、ポルフィリン等が挙げられ、特に２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロン、２，２’−ビピリジル、デフェロキサミン及びその塩並びにデフェラシロクスが好ましい。
【００２６】
２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンは、特異性が高いという優れた特性を備えている。すなわち、２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンは脱窒菌の脱窒反応を特異的に抑制することができ、その他の場面において三価の鉄イオンのキレート剤として機能し難いため、効果的に細菌の増殖を抑制することができ、かつ副作用が生じる可能性が低い。
【００２７】
デフェロキサミン（Ｎ’−［５−（ａｃｅｔｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｍｉｎｏ）ｐｅｎｔｙｌ］−Ｎ−［５−［３−（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌａｍｉｎｏ］ｐｅｎｔｙｌ］−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔａｎｅｄｉａｍｉｄｅ）は三価の鉄イオンと結合して、安定した水溶性のキレート化合物であるフェリオキサミンを形成する。臨床上、メシル酸デフェロキサミンが鉄過剰症の治療薬として使われている。鉄過剰症に関するメシル酸デフェロキサミンの用法及び用量は、メシル酸デフェロキサミンは１日量５００ｍｇ〜１０００ｍｇを１〜２回に分けて筋肉内注射する、又は１日量８０ｍｇ／ｋｇを限度として１回１０００ｍｇを毎時１５ｍｇ／ｋｇの速度で点滴静注する。抗菌剤としてデフェロキサミン及びその塩を使用する場合、これを参考に用法及び用量を決定することができる。
【００２８】
デフェラシロクス（［４−［（３Ｚ，５Ｅ）−３，５−ｂｉｓ（６−ｏｘｏ−１−ｃｙｃｌｏｈｅｘａ−２，４−ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）も鉄過剰症の治療薬として臨床で使われている。小児患者において１日１回２０〜３０ｍｇ／ｋｇの経口投与が臨床上有効な鉄キレート効果を示すことが明らかになっている。抗菌剤としてデフェラシロクスを使用する場合、これを参考に用法及び用量を決定することができる。
【００２９】
本発明の抗菌剤は、その投与形態に合わせ薬学的に許容される添加剤を加えて各種製剤化することができる。添加剤としては、製剤分野において通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えばゼラチン、乳糖、白糖、酸化チタン、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トウモロコシデンプン、マイクロクリスタリンワックス、白色ワセリン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、植物油、ベンジルアルコール、アラビアゴム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン等が挙げられる。
【００３０】
これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐剤等の固形製剤；シロップ剤、エリキシル剤若しくは注射剤等の液体製剤等が挙げられる。これらは、製剤分野における通常の方法に従って調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁させる様式であってもよい。また、特に注射剤の場合、必要に応じて生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は懸濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【実施例】
【００３１】
（細菌株、プラスミド及び増殖条件） 軽質転換用の大腸菌株ＪＭ１０９及びＤＨ５αはタカラバイオから購入した。大腸菌Ｓ１７−１はＳｉｍｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６４０−６５９（１９８６）に記載の方法により得た。クローニングベクターｐＨＳＧ３９８（クロラムフェニコール耐性）はタカラバイオから購入した。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃ由来自殺ベクターｐＧ１９ＩＩ（ゲンタマイシン耐性）はＭａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法で得た。ブロードホストレンジベクターであるｐＵＣＰ２４（ゲンタマイシン耐性）はＷｅｓｔら，Ｇｅｎｅ，１４８：８１−８６（１９９４）に記載の方法で得た。ｐＭＥＸ９、ｐＭＥＸｎａｒＫ、ｐＭＥＸｎｉｒＳ、ｐＭＥＸｎｏｒＣ及びｐＭＥＸｎｏｓＲはＴｏｙｏｆｕｋｕら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８９：４９６９−７２（２００７）に記載の方法で得た。
【００３２】
使用したプライマーは下表の通りである。
【００３３】
【表１】
【００３４】
細菌株は３７℃において、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地又はＬＢ寒天培地で増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には１０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）には８０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシンを、必要に応じて加えた。試験培養を行う前に、緑膿菌は嫌気的に４ｍｌのＬＢ培地を含む２４ｍｌの試験管で増殖させ、開始時の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）が０．０１となるように嫌気培地に接種した。嫌気培養のため、ブチルゴムで栓をしたハンゲート試験管又は三角フラスコの空気をアルゴンで置換した。増殖、脱窒活性及び転写活性は、５ｍｌのＬＢＮ培地（１００ｍＭのＫＮＯ３を添加したＬＢ培地）を含む１７ｍｌのハンゲート試験管を使い、３７℃でインキュベーションし、２００ｒｐｍで振盪して測定した。脱窒酵素活性を測定するために使用した細胞は、８０ｍｌのＬＢＮを含む５００ｍｌの三角フラスコ中で３７℃、２００ｒｐｍで培養した。
【００３５】
（緑膿菌変異体の構築） ｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥの欠失カセットを保有するプラスミドｐＧ１９ｐｑｓＡ、ｐＧ１９ｐｑｓＲ及びｐＧ１９ｐｑｓＥをＭａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法と同じ方法で作製した。ＰＡＯ１の染色体を、ｐｑｓＡＦ１／ｐｑｓＡＲ２、ｐｑｓＲＦ１／ｐｑｓＲＲ２及びｐｑｓＥＦ１／ｐｑｓＥＲ２プライマー対で増幅し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理したクローニングベクターｐＨＳＧ３９８のマルチクローニングサイトにライゲートした。ｐｑｓＡＦ２／ｐｑｓＡＲ１、ｐｑｓＲＦ２／ｐｑｓＲＲ１及びｐｑｓＥＦ２／ｐｑｓＥＲ１プライマー対を使ったインバースＰＣＲで、ｐＨＳＧ３９８のｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥの隣接ＤＮＡ断片を増幅した。増幅したｐｑｓＡの隣接断片はＳｐｅＩで消化し、増幅したｐｑｓＲ及びｐｒｓＥの隣接断片はＢｇｌＩＩで消化した。これらの制限酵素部位はプライマーに付加されている。ｐｑｓＡ、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥ欠失ＤＮＡ断片をｐＧ１９ＩＩのマルチクローニングサイトのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングし、ｐＧ１９ｐｑｓＡ、ｐＧ１９ｐｑｓＲ及びｐＧ１９ｐｑｓＥを作製した。大腸菌Ｓ１７−１（Ｓｉｍｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６４０−６５９（１９８６））にコンジュゲートし、Ｍａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）に記載の方法に従って相同組換えを行い、ｐＧ１９ＩＩ由来のプラスミドをＰＡＯ１に導入した。変異株をＰＣＲで分析した。
【００３６】
（細胞画分の調製） ＬＢＮ培地で増殖させた細胞を中対数増殖期（６時間のインキュベーション時間）で回収し、７０００ｇ、４℃で遠心し、１０％グリセロールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で２回洗浄した。細胞を同じ緩衝液に懸濁し、超音波処理した。超音波処理した細胞を２０００ｇ、４℃で１０分間遠心して壊れていない細胞を取り除き、１０４０００ｇ、４℃で６０分間遠心した。上清を細胞可溶画分として回収し、ペレットを同じバッファーで再懸濁して膜画分として回収した。
【００３７】
（酵素活性測定） ＮＡＲ活性は、その産物であるＮＯ２−を比色測定で定量することで測定した（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３：９８１−９８４（１９５７））。ベンジルビオローゲン−ジチオン酸関連ＮＡＲ活性は、メチルビオローゲンの代わりにベンジルビオローゲンを使用して、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１６２６３−１６２６７（１９９６）に記載の方法に従って測定した。１０ｍＭのＮａＮＯ３、０．２ｍＭのベンジルビオローゲン及び適切な濃度の嫌気的に培養した緑膿菌の細胞膜画分を含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）４００μｌに、１００μｌのＮａ２Ｓ２Ｏ４を最終濃度が１０ｍＭとなるように加えた。Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を添加する前に反応液の空気をＮ２で置換した。反応液を３０℃で５分間インキュベートし、反応液の色がメチルビオローゲンの酸化の指標である透明となるまで撹拌した。呼吸鎖に関連するＮＡＲ活性は、ＮＡＤＨを電子供与体として測定した（Ｒａｄｃｌｉｆｆｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０５：２７３−２８７（１９７０））。ＮＡＤＨ由来ＮＡＲ活性測定用の５００μｌの反応液は、１０ｍＭのＮａＮＯ３及び嫌気的に培養した緑膿菌の膜画分を含む。反応液の空気をＮ２で置換した。ＮＡＤＨを最終濃度が５ｍＭとなるように３０℃で加えることで反応を開始し、１００℃で１５分間煮沸することで反応を停止した。
【００３８】
ＮＩＲ活性はＮＯ２−の消費量を測定してアッセイした（Ｌａｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１８０：４５９−４７２（１９６９））。２００μＭのＮａＮＯ２、２００μＭのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び嫌気的に培養した緑膿菌の可溶画分を含む４００μｌの反応液に、最終濃度が１ｍＭとなるように１００μｌのＮＡＤＨを加えることで反応を開始した。ＮＡＤＨの添加前に反応液の空気はＮ２で置換し、３０℃で１０分間反応させた。
【００３９】
ＮＯＲ活性はその産物であるＮ２Ｏをガスクロマトグラフィーで測定して、アッセイした。空気をＮ２で置換した４ｍＭのＮＡＤＨ、２ｍＭのＰＭＳ及び嫌気的に培養した緑膿菌の膜画分を含む反応液に、２０ｍＭのＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウムを１００μｌ加えた。３０℃で６分間反応させた。
【００４０】
カテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ特異的な活性は３７５ｎｍの吸光度Ａ３７５を測定してアッセイした（Ｍａｓｅｄａら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：１３２０−１３２８（２００４）及びＳａｗａｄａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４８：４３５−４３９（２００４））。
【００４１】
（分析方法） 液体培養における細菌の増殖は、６００ｎｍの吸光度でモニターした。タンパク質量は、ブラッドフォード法で定量した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８−２５４（１９７６））。ＮＯ３−の濃度はブルシン法（Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３：９８１−９８４（１９５７））で測定した。Ｎ２Ｏ及びＮ２の濃度は、熱伝導検出器を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−８ＡＩＴ；島津製作所）で測定した。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。Ｓｈｉｎｃａｒｂｏｎ ＳＴ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｅｖｅ ５ＡカラムをＮ２Ｏ又はＮ２の検出用にそれぞれ使用した。
【００４２】
（ピオシアニンアッセイ） ピオシアニンは、Ｅｓｓａｒらの方法（Ｅｓｓａｒら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：８８４−９００（１９９０））に従って測定した。細胞をＬＢ又はＬＢＮ培地（１６ｍｌのハンゲート試験管に２ｍｌの培地）で、好気的培養ではシリコンゴムで、嫌気的培養ではブチルゴムで栓をし、１２時間インキュベーションした。１ｍｌの培地を２ｍｌの試験管に回収し、遠心した。上清を新しい試験管に移し、７５０μｌのクロロホルムを加えた。試料を撹拌し、遠心し、下層５００μｌを新しい試験管に移した。その試験管に０．２ＮのＨＣｌを１００μｌ加え、上層の５２０ｎｍの吸光度を測定した。Ａ５２０の数値を培地のＯＤ６００で割った。
【００４３】
（試験例１） 前述の通り、脱窒はＮＯ３−をＮ２Ｏ又はＮ２へ還元する工程であり、生理学的には嫌気条件下でエネルギーを獲得するために重要な工程でもある。ＰＱＳが脱窒に与える影響を調べるため、ＰＱＳ及び関連する２−アルキル−４−キノロン類（ＡＨＱｓ）を産生しないΔｐｑｓＡ変異体（ｐｑｓＡ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）をＬＢＳ培地で嫌気的に増殖させ、外来のＰＱＳを最終濃度が５０μＭとなるように加えた。ＰＱＳを加えると、６００ｎｍの濁度が中対数増殖期の５０％以下に低下し、ＰＱＳにより脱窒が抑制されていることが示唆された（図１Ａ参照）。より詳しく調べるため、１２時間インキュベーションしたときのＮＯ３−の減少量並びにＮ２Ｏ及びＮ２の産生量を測定した。ＰＱＳ添加による増殖の抑制に伴い、ＮＯ３−の減少量は５９％低下し（図１Ｂ参照）、Ｎ２Ｏの産生量は５１％低下し（図１Ｃ参照）、Ｎ２の産生量は４８％低下した（図１Ｄ参照）。これらのデータは、ＰＱＳは緑膿菌の脱窒を抑制していることを示している。
【００４４】
（試験例２） 脱窒のどの工程がＰＱＳにより抑制されているのかを調べるため、各工程に関与する脱窒酵素の転写にＰＱＳが及ぼす影響を調べた。ｘｙｌＥ遺伝子をｎａｒＫ１、ｎｉｒＳ、ｎｏｒＣ及びｎｏｓＲ脱窒遺伝子のプロモーター領域に融合したプロモーター融合プラスミドを、それぞれΔｐｑｓＡ変異体にトランスファーした。対照として、ｐＭＥＸ９プラスミドで軽質転換したΔｐｑｓＡ変異体におけるベースのカテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｃ２３Ｏ）活性を、ＰＱＳの添加の有無で調べた。Ｃ２３Ｏ活性は、中対数増殖期（６時間インキュベーション）中で測定した。プロモーター依存性のＣ２３Ｏ活性は、そのＣ２３Ｏ活性をベースのＣ２３Ｏ活性で割って求めた。ＰＱＳを最終濃度が５０μＭとなるように培地に添加したとき、いずれのプロモーター活性にも影響が認められなかった（図２参照）。この結果は、ＰＱＳによる脱窒制御は転写制御によるものではなく、他の転写後の機序によるものであることを示している。
【００４５】
（試験例３） 転写後のレベルで脱窒が制御されているか否かを調べるため、中対数増殖期の脱窒酵素活性を測定した。ＰＱＳの添加あり（最終濃度５０μＭ）又はなしの条件下でΔｐｑｓＡ変異体を培養し、ＮＡＲ、ＮＩＲ及びＮＯＲ脱窒酵素活性を測定した。その結果、ＮＡＲ活性はＰＱＳを添加して培養すると抑制された（ＰＱＳを添加せずに培養したときの活性に比べて６６％；図３Ａ参照）。興味深いことに、ＮＩＲ活性はＰＱＳの添加により１．８倍上昇した（図３Ｂ参照）。ＮＯＲ活性はＰＱＳの添加により６４％まで低下した（図３Ｃ参照）。これらの脱窒酵素の活性の変化は、転写後の制御によるものか、あるいはＰＱＳとの直接の相互作用によるものであろう。ＰＱＳが脱窒酵素活性に直接影響を及ぼすかどうかを調べるため、Δｐｑｓ変異体の酵素アッセイ反応液にＰＱＳを加えて、酵素活性を測定した。図３Ｃに示したように、ＮＯＲ活性はＰＱＳを反応液に加えることで阻害されており、このことはＰＱＳがＮＯＲ活性を直接阻害することを示している。一方、ＮＡＲ及びＮＩＲ活性は、ＰＱＳを反応液に加えても直接影響を受けていない（図３Ａ及びＢ）。脱窒遺伝子の転写がＰＱＳにより制御されていないという結果をあわせると、この結果はＮＡＲ及びＮＩＲの活性はＰＱＳにより転写後調節を受けており、ＮＯＲ活性はＰＱＳにより直接阻害されていることを示している。
【００４６】
（試験例４） 脱窒酵素はエネルギーが産生される呼吸鎖と関係している。ＮＯ３−呼吸の間、ＮＡＤＨから供与された電子は呼吸鎖を伝達し、最終的にＮＯ３−が受け取り、この最後の皇帝はＮＡＲによって媒介されている。ＮＡＲ活性測定（図３Ａ）において、ＮＡＲに直接電子を供与する電子供与体（ベンジルビオローゲン）が使われ、ＮＯ３−呼吸鎖の活性は計算に入っていない。ＮＯ３−呼吸鎖がＰＱＳによって影響を受けるか否かを調べるため、ＮＡＤＨ由来のＮＡＲ活性の測定を行った。ＮＡＤＨを電子供与体として使用した場合、ＮＡＤＨ−ＮＡＲ活性はＰＱＳの培地への添加により抑制され、ＰＱＳを反応液に添加（最終濃度５０μＭ）した場合も直接阻害された（図３Ｄ）。この結果は、ＮＯ３−呼吸がＰＱＳにより直接阻害されていることを示す。ＮＡＤＨ由来ＮＡＲ活性はＰＱＳにより直接阻害される（図３Ｄ）のに対してベンジルビオローゲン由来ＮＡＲ活性は阻害されない（図３Ａ）という結果は、ＮＡＤＨからＮＯ３−までの電子伝達のいずれかをＰＱＳは直接阻害していることを示す。
【００４７】
（試験例５） ＰＱＳは緑膿菌における転写を調節するばかりでなく、鉄をキレートすることも報告されている。そこで、ＰＱＳの鉄へのキレート効果が脱窒酵素に影響を与えていると考えた。この仮説を試すため、ＰＱＳを添加（最終濃度５０μＭ）した培地にＦｅＣｌ３（最終濃度１００μＭ）を補充した。その結果、ＦｅＣｌ３の添加により、ＰＱＳを添加した培養におけるＮＯ３−の減少量及びＮ２Ｏの産生量が完全に回復した（図４Ａ及びＢ）。これは、ＰＱＳの脱窒制御が鉄のキレート化によるものだということを示している。鉄キレート化が脱窒に影響を及ぼすことを確かめるため、鉄キレート剤である２，２’−ビピリジルを培地に加え（最終濃度１２０μＭ）、脱窒活性を測定した。ＮＯ３−減少量及びＮ２Ｏ産生量は、ＰＱＳの場合と同様に抑制され、ＦｅＣｌ３の補充により回復した（図４Ａ及びＢ）。興味深いことに、ＰＱＳを加えた場合のＮ２産生量はＦｅＣｌ３により部分的にしか回復せず、２，２’−ビピリジルはＮ２産生量を減少させなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、ＮＯＳが触媒しているＮ２ＯからＮ２への還元がＰＱＳの鉄キレート化以外の別の機序によって調節されていることを示唆する。
【００４８】
（試験例６） ＰＱＳが制御する遺伝子の多くは、同族の応答制御因子ＰｑｓＲ又は機能が未知だがＰＱＳへの応答を促進すると考えられているＰｑｓＥを必要とする。Ｎ２ＯからＮ２への還元がこの制御経路で調節されているか否かを調べるため、ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ（ｐｑｓＡ及びｐｑｓＲ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ（ｐｑｓＡ及びｐｑｓＥ遺伝子に欠失があるＰＡＯ１変異体）二重変異体を構築した。ＰＱＳ（最終濃度５０μＭ）を変異体に加え、１２時間のインキュベーションで減少したＮＯ３−量及び産生したＮ２Ｏ及びＮ２量を測定した。ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥにおけるＮＯ３−の減少及びＮ２Ｏの産生は、ΔｐｑｓＡのときと同一であった（図５Ａ〜Ｂ）。図５Ｃに示したように、ＰＱＳによるＮ２産生の抑制は、ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥのいずれの二重変異株でも認められず、一方、ＰＱＳはΔｐｑｓＡにおけるＮ２産生を抑制した（図１Ｄ）。この結果は、Ｎ２産生はＰｑｓＥを通じたＰＱＳ及びＰｑｓＲ転写調節因子によって調節されていることを示す。この調節は、ＰＱＳはｎｏｓの転写を調節していないことから（図２）、ｎｏｓ以外のＮ２産生に関与する他の因子の転写調節に関与している可能性がある。ＮＯ３−からＮ２Ｏへの還元は、ＰｑｓＥ又はＰｑｓＲがない場合でもＰＱＳにより抑制されており（図５Ａ及びＢ）、それはΔｐｑｓＡでも認められたとおりであり（図１Ｂ及びＣ）、ＮＯ３−からＮ２Ｏへの還元は、ＰＱＳの鉄キレート化により調節されているという結果（図４Ａ〜Ｃ）を支持する。ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ及びΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ株で得られた結果が極性効果によるものかを確認するため、各変異体を適切な野生型のコピー（ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＲ／ｐＵＣＰ−ｐｑｓＲ，ΔｐｑｓＡΔｐｑｓＥ／ｐＵＣＰ−ｐｑｓＥ）で補完する相補性実験を行った。驚いたことに、ＮＯ３−減少量並びにＮ２Ｏ及びＮ２産生量は、ｐｑｓＲ及びｐｑｓＥをプラスミドに発現させたとき、ＰＱＳが存在しなくても、強く抑制された。鉄キレート化実験の結果（図４Ａ〜Ｃ）とあわせて考えると、これらのデータは、ＰｑｓＲ及びＰｑｓＥを媒介する経路であってＰＱＳの鉄キレート化特性とは異なる経路によってＰＱＳはＮ２産生を調節していることを示している。
【００４９】
（試験例７） 好気条件において、ＰＱＳは、高濃度で（１５０μＭ以上）で遅滞期を延長させ、またＬＢ培地単独での増殖と比較して定常期の濁度を若干低下させることが報告されている。一方、嫌気条件では、ＰＱＳは増殖を５０％まで低下させており、嫌気条件ではＰＱＳが増殖に及ぼす影響が顕著であることを示している。最近の研究（Ｄｉｇｇｌｅら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１４：８７−９６（２００７））によれば、ＰＱＳの鉄キレート化特性が緑膿菌の好気的増殖に影響を及ぼすことが示されており、鉄キレート化性のシデロフォア（ピオシアニン及びピオケリン）を産生できないｐｖｄＤｐｃｈＥＦ二重変異体において強い影響を及ぼす。この結果は、シデロフォア産生がＰＱＳの増殖抑制に関与していることを示し、脱窒へのＰＱＳの鉄キレート化効果は嫌気条件下でのシデロフォアの産生低下によるものかもしれないと推測された。これを調べるため、ＬＢ好気培地、ＬＢＮ好気培地及びＬＢＮ嫌気培地での培養物のピオシアニン産生を測定した。予想通り、ピオシアニン産生はＬＢＮ嫌気培養では低下した（図６）。興味深いことに、ピオシアニン産生は、ＮＯ３−を添加した好気培養においても低下しており、ピオシアニン産生がＮＯ３−及びＯ２の両方によって調節されていることを示唆している。これらの結果は、シデロフォアの不十分な産生のため、好気条件下及びＮＯ３−存在下の嫌気条件下において、脱窒はＰＱＳにより抑制されることを示唆している。ＮＯ３−非存在下の低下したピオシアニン産生及び鉄キレート化依存性の脱窒調節は、ＮＯ３−等のＮ−オキシド類及び鉄が、ＰＱＳにより増殖が影響を受けるか否かの重要な環境因子であることを示唆している。
【００５０】
（試験例８） 細菌の増殖にＰＱＳが効果を及ぼすかを調べた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｒｒｉｇｅｎａをＬＢ培地で好気的に増殖させた。ＰＱＳ及びＦｅＣｌ３を添加する場合には、それぞれ最終濃度５０μＭ及び１００μＭとなるように加えた。図８から明らかなように、いずれの細菌もＰＱＳの添加により増殖が抑制され、ＦｅＣｌ３の添加によって増殖が回復した。ＰＱＳは細菌の増殖を抑制し、三価の鉄はＰＱＳによる増殖抑制を回復することが明らかとなった。また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａをＬＢＮ培地で嫌気的に増殖させた場合も、ＰＱＳの添加により増殖が抑制され、ＦｅＣｌ３の添加によって増殖が回復した。この結果から、ＰＱＳは緑膿菌に限らず多くの脱窒菌の増殖の抑制し、また三価の鉄はＰＱＳによる増殖抑制を回復することが予想される。
【００５１】
（試験例９） 緑膿菌の増殖に及ぼす２，２−ビピリジルの効果を調べた。緑膿菌を２，２−ビピリジル存在下（２００μＭ）又は非存在下にＬＢ培地で好気的に増殖させるかＬＢＮ培地で嫌気的に増殖させた。図９から明らかなように、緑膿菌を好気的に増殖させた場合は２，２−ビピリジルにより増殖が抑制されなかったが、緑膿菌を嫌気的に増殖させた場合は２，２−ビピリジルにより増殖が抑制された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】嫌気増殖及び脱窒に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。ＡはΔｐｑｓＡ変異体を外来のＰＱＳの添加又は非添加の嫌気増殖を表すグラフである。３回の独立した実験を行い、代表的なデータを示す。ＢはＮＯ３−減少量を、ＣはＮ２Ｏ産生量を、ＤはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図２】脱窒遺伝子の転写に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。３回以上の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図３】脱窒酵素活性及びＮＯ３−呼吸鎖に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。ＡはＮＡＲ活性を、ＢはＮＩＲ活性を、ＣはＮＯＲ活性を、ＤはＮＡＤＨ依存性ＮＡＲ活性を表すグラフである。ＰＱＳは、培地又は反応液に最終濃度５０μＭとなるように加えている。１はＰＱＳ非添加のΔｐｑｓＡ変異体の培養物を表し、２はＰＱＳを添加したΔｐｑｓＡ変異体の培養物を表し、３はＰＱＳ非添加のΔｐｑｓＡ変異体の培養物から回収した細胞画分の反応液にＰＱＳを添加したものを表す。３回以上の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図４】脱窒に及ぼす鉄キレート化の効果を表すグラフである。ＡはＮＯ３−減少量を、ＢはＮ２Ｏ産生量を、ＣはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図５】ＰＱＳにより調節されるＮ２産生にＰｑｓＲ及びＰｑｓＥが関与していることを表すグラフである。ＡはＮＯ３−減少量を、ＢはＮ２Ｏ産生量を、ＣはＮ２産生量を表すグラフである。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。
【図６】ピオシアニン産生に及ぼすＮＯ３−及びＯ２の効果を表すグラフである。ＬＢはＬＢ培地で好気的に培養した場合を表し、ＬＢＮはＬＢ培地に１００ｍＭのＮＯ３−を補充した培地（ＬＢＮ培地）で好気的に培養した場合を表し、ＬＢＮ／−Ｏ２はＬＢＮ培地で嫌気的に培養した場合を表す。３回の独立した実験の平均±標準偏差のデータである。ＮＤは検出できなかったことを表す。
【図７】ＰＱＳによるＮＯ３−呼吸及び脱窒酵素の調節のモデルを表す図である。実線は直接的な調節を表し、破線は間接的な調節を表す。ＤＨはＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを表し、ＯＭは外膜を表し、ＰＰは細胞膜周辺腔を表し、ＩＭは内膜を表す。ＮＯ３−呼吸鎖及びＮＯＲ酵素活性は鉄キレート化を通じてＰＱＳにより直接阻害される。ＮＡＲ及びＮＯＳ活性はＰＱＳにより間接的に抑制され、ＮＩＲ活性はＰＱＳにより間接的に上昇する。ＰｑｓＥ及びＰｑｓＲはＮＯＳ活性抑制に関与している。
【図８】各種細菌の増殖に及ぼすＰＱＳの効果を表すグラフである。
【図９】緑膿菌の増殖に及ぼす２，２’−ビピリジルの効果を表すグラフである。
【図１０】本発明の第１の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。
【図１１】本発明の第２の排水処理装置の実施形態を示す概略図である。
【符号の説明】
【００５３】
１０及び３０…脱窒槽、２０…増殖促進剤供給手段、４０…三価の鉄イオンのキレート剤供給手段、１００及び２００…排水処理装置、Ｌ１〜Ｌ６…ライン。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤。
【請求項２】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、
導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、
前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段と
を備えることを特徴とする排水処理装置。
【請求項３】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、
三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする排水処理方法。
【請求項４】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、
導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、
前記脱窒槽内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段と
を備えることを特徴とする排水処理装置。
【請求項５】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、
三価の鉄イオンのキレート剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする排水処理方法。
【請求項６】
三価の鉄イオンのキレート剤からなる抗菌剤。
【請求項７】
三価の鉄イオンのキレート剤が２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンである、請求項６記載の抗菌剤。
【請求項８】
三価の鉄イオンのキレート剤が２，２’−ビピリジルである、請求項６記載の抗菌剤。
【請求項１】
三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤。
【請求項２】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、
導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、
前記脱窒槽内に三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤を供給する増殖促進剤供給手段と
を備えることを特徴とする排水処理装置。
【請求項３】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、
三価の鉄イオンからなる脱窒菌の増殖促進剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする排水処理方法。
【請求項４】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を脱窒する排水処理装置において、
導入された排水中の硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを脱窒菌により亜酸化窒素及び／又は窒素に還元処理する脱窒槽と、
前記脱窒槽内に三価の鉄イオンのキレート剤を供給する三価の鉄イオンのキレート剤供給手段と
を備えることを特徴とする排水処理装置。
【請求項５】
硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを含有する排水を、脱窒槽内において脱窒菌により前記硝酸イオン及び／又は亜硝酸イオンを亜酸化窒素及び／又は窒素に還元することで処理する排水処理方法において、
三価の鉄イオンのキレート剤の存在下で前記脱窒菌を前記脱窒槽内で増殖させることを特徴とする排水処理方法。
【請求項６】
三価の鉄イオンのキレート剤からなる抗菌剤。
【請求項７】
三価の鉄イオンのキレート剤が２−ヘプチル−３−ヒドロキシ−４−キノロンである、請求項６記載の抗菌剤。
【請求項８】
三価の鉄イオンのキレート剤が２，２’−ビピリジルである、請求項６記載の抗菌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２２０００７（Ｐ２００９−２２０００７Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６６６１６（Ｐ２００８−６６６１６）
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１４日（２００８．３．１４）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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