組換えアポリポプロテイン
【課題】新たな組換えアポリポプロテインの製造方法、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉ、それに対する抗体、該抗体を用いるアポリポプロテインＣ−Ｉの測定法およびそれに用いるキットを提供することにある。
【解決手段】プロモーターとしてＬａｃプロモーター、チオレドキンをコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを大腸菌に導入して、該大腸菌にてチオレドキンとアポリポプロテインＣ−Ｉとの融合蛋白質を発現させ、該融合蛋白質からアポリポプロテインＣ−Ｉを回収することにより高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られ、これを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができる。
【解決手段】プロモーターとしてＬａｃプロモーター、チオレドキンをコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを大腸菌に導入して、該大腸菌にてチオレドキンとアポリポプロテインＣ−Ｉとの融合蛋白質を発現させ、該融合蛋白質からアポリポプロテインＣ−Ｉを回収することにより高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られ、これを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアポリポプロテインに関する。更に詳細には、組換えアポリポプロテインの製造方法、該製造方法に用いる組換えプラスミド発現ベクター、該製造方法により得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉ、該組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体、該抗体を用いるアポリポプロテインのＣ−Ｉの測定方法および該測定方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の数多くの蛋白質は、病気の有無・状態と関係し、臨床的に測定されてきている。その場合、蛋白質を測定する方法としては、その蛋白質に対する抗体を用いて、免疫的測定法によるものが一般的であり、その原理に基ずく臨床検査薬が広く供給されている。
生体蛋白質の一つであるアポリポプロテインＣ−Ｉは、主として肝臓において産生される分子量６．６ｋＤａの蛋白質であり、高脂質症の発症に関与していることが報告されている（非特許文献１）。天然のアポリポプロテインＣ−Ｉおよびそれを用いて作成した抗体は実際に商業的に供給されているにもかかわらず、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するための免疫測定法の試薬は、臨床検査試薬として使用されていない。
アポリポプロテインＣ−Ｉに関しては、近年、ＳＥＬＤＩ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＭＳのような質量分析計やＨＰＬＣ法の分析法の発展に伴い、それと病態との関係も新たに知られてきている。例えば、質量分析計やＨＰＬＣを用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉのレベルが、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性と関係していることが報告されてきている（特許文献１および特許文献２）。
臨床検査薬としては、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためには、免疫学定測定法でそれを測定することが好ましいにも拘らず、これを免疫学的測定法で調べると、質量分析計で測定したものとは結果が異なると指摘されている（特許文献２）。
従って、アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学定測定法で測定するための臨床検査薬の開発が強く望まれている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０１７５２３号パンフレット（特許公表２００７年５０２４０１号公報）
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／０３８４６１号パンフレット（特許公表２００７年５０６０７５号公報）
【非特許文献１】Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1999; 19; 472-484
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような状況下、本発明者らは、アポリポプロテインＣ−Ｉの免疫学的測定法の一つの問題として、市販の抗アポリポプロテインＣ−Ｉ抗体は、非特異反応が大きく、それは、その抗体を作成するために用いた抗原、すなわち、天然のアポプロテインＣ−Ｉに問題があるということを発見した。そこで、遺伝子工学的手法により、アポリポプロテインＣ−Ｉを作成することを試みた。組換えアポリポプロテインＣ−Ｉの製造を検討したが、これまでに知られていない技術であり、成功するには困難を極めた。例えば、本発明者らの検討によるとヒトに近いマウス卵巣細胞を用いては、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを製造することはできなかった。また、大腸菌の菌体内では、アポリポプロテインＣ−Ｉを用いることなくリポプロテインが代謝されているためか、宿主細胞として大腸菌を用いて、通常のＴ７プロモーターやＬａｃプロモーターを用いても組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを発現できなかった。
従って、本発明の課題は、天然から得られるアポリポプロテインＣ−Ｉに比べて純度が高く、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉの製造方法を提供することにある。更には、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに加えて他の組換えアポリポプロテインも製造するための製造方法を提供することにある。また、本発明の課題は、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉ、該組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体、該抗体を用いるアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法および該測定方法に用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記した課題を解決することを目的として鋭意研究した結果、プロモーターとして大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質であるチオレドキシンとアポリポプロテインＣ−Ｉとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉであって、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られ、この製造方法は、他の組換えアポリポプロテインの製造に広く適用できること、また、この組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて作成した抗アポリポプロテインＣ−Ｉ抗体により天然のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により正確に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。
【０００５】
従って、本発明は、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることを特徴とする組換えアポリポプロテインの製造方法に関する。
更に本発明は、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターに関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を用いて免疫測定法で検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを測定することを特徴とするアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含む、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためのキットに関する。
【発明の効果】
【０００６】
プロモーターとして大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインが得られる。この方法により得られる高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができる。従って、本発明で得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を臨床検査薬として用いることにより、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性などを正確に診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、組換えアポリポプロテインは、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることにより製造できる。
ここで用いる大腸菌由来のプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターなどが挙げられ、特にｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、なかでもｌａｃプロモーターが好ましい。
【０００８】
水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質としては、分子量が８０００から６００００の蛋白質が好ましく、例えば、チオレドキシン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合プロテイン（ＭＢＰ）あるいはこれらの変異体などが挙げられる。変異体としては、これらの蛋白質のアミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、元の蛋白質と同様の機能を有する蛋白質が挙げられる。ここで同様の機能とは、アポリポプロテインとともに大腸菌において融合蛋白質として発現できる機能を指す。本発明では、大腸菌由来の水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質が好ましく、特に、チオレドキシンまたはその変異体、なかでも大腸菌由来のチオレドキシンまたはその変異体が好ましい。
これらの水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は各種文献に記載され公知である。
組換えプラスミド発現ベクターにおいては、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、アポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の上流側に位置しているのが好ましい。
【０００９】
アポリポプロテインとしては、アポリポプロテインＡ、Ｃ、Ｅなどが好適であり、更にこれらのサブタイプ、例えば、アポリポプロテインＡ−Ｉ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４などが挙げられる。あるいはこれらの変異体であってもよい。変異体としては、これらのアポリポプロテインのアミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、元の蛋白質と同様の機能を有する蛋白質が挙げられる。ここで同様の機能とは、元のアポリポプロテインと同様の抗原性を有し同様の特異性を有する抗体産生能を指す。
これらのアポリポプロテインのなかでも、特にアポリポプロテインＣ−Ｉが好ましい。これらのアポリポプロテインのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は各種文献に記載され公知である。
【００１０】
本発明においては、組換えプラスミド発現ベクターは、更に、発現した融合蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むのが好ましい。精製ペプチドとしては、好ましくは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧ、ＳＴＲＥＰなどのアフィニティー精製が可能となるペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が連続して６から１０個程度結合したものであり、融合蛋白質に結合させて用いる。このＨｉｓタグはキレート担体と相互作用するため、発現する融合蛋白質の精製が容易に行える。ＦＬＡＧは８個のアミノ酸残基からなるペプチドタグで、融合蛋白質に結合させて発現させ、融合蛋白質を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて精製することができる。ＳＴＲＥＰは、ストレプトアビジンに結合する８個のアミノ酸残基からなるペプチドタグであり、ストレプトアビジンとの可逆的な結合を利用して、融合蛋白質を精製できる。これらの精製ペプチドのなかでも、Ｈｉｓタグが好ましい。これらの精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の間に置かれて、あるいは、いずれかのＤＮＡ配列に連結して用いられる。
【００１１】
本発明においては、組換えプラスミド発現ベクターは、更に、発現した融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させるためのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むのが好ましい。プロテアーゼ開裂ペプチドとしては、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼなどのプロテアーゼによって開裂されるペプチドなどが挙げられる。これらのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の間に位置し、アポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の直ぐ上流に存在するのが好ましい。このようなプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いることにより、発現した融合蛋白質に、例えば、トロンビンなどを作用させることにより、融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させることができる。
【００１２】
上記した各種ＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクターの構築は、例えば、図１に示すようにして行うことができる。すなわち、Ｌａｃプロモーター、大腸菌由来チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、上流側からこの順序で有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｘを調製し、他方、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを調製し、それぞれのプラスミドから、Ｌａｃプロモーター、大腸菌由来チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片と、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む断片を得て、それら断片を連結することによって、目的とする組換えプラスミド発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築することができる。他の各種組換えアポリポプロテインを得るための組換えプラスミド発現ベクターも同様にして構築することができる。
【００１３】
組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させるには、公知の方法を用いて通常の方法により行うことができる。発現した融合蛋白質は、上記した精製ペプチドを利用して精製し、精製した融合蛋白質から、上記したプロテアーゼ開裂ペプチドを利用してアポリポプロテインを遊離させて、目的とする組換えアポリポプロテインを製造することができる。
本発明の製造方法により、高純度の組換えアポリポプロテインが得られ、また、抗原として動物に免疫することにより、対応する天然アポリポプロテインに対して高い特異性を有する抗体産生を誘導する組換えアポリポプロテインが得られる。特に、本発明の製造方法により、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対して高い特異性を有する抗体産生を誘導する組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られる。
【００１４】
本発明の製造方法により得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与することにより、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体が得られる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。
ポリクローナル抗体は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを哺乳動物に免疫して、免疫動物から血清を採取することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物を免疫し、その動物が産生する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させて得られるハイブリドーマによって調製することができる。
【００１５】
ハイブリドーマは、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等のアジュバントを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に免疫し、次いで免疫動物の脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）する細胞とを、ケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコールなどを用いることにより融合し、融合細胞から、アポリポプロテインＣ−Ｉを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地で培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物をあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
【００１６】
本発明の抗体は、天然アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる抗体に比べて、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対する特異性が高いものである。本発明の抗体を用いた免疫測定法によって検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを高感度で且つ特異的に検出することができる。
ここで対象となる検体としては、血液、血清、血漿、骨などの組織等が挙げられる。
免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
例えば、酵素免疫測定法として、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法を例にとって以下に説明する。
ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して抗体を結合させる。次いで、検体を作用させて、アポリポプロテインＣ−Ｉを固相に結合した抗体に結合させ、固相を洗浄し、次いで対応する二次標識抗体、例えば、抗イムノグロブリン標識抗体を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
【００１７】
本発明の測定方法を実施するときは、アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫測定するためのキットであって、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含むキットを用いて行える。このキットにおいては、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことができる。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。また、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム溶液等の酵素反応停止液、例えば、トリス等の緩衝液を含むこともできる。
【００１８】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
組換えプラスミド発現ベクターの構築
Ａ．ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ断片の調製
図１に示す組換えヒトアポリポロテインＣ−Ｉ発現ベクターの構築において原料プラスミドとして用いる、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含むｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを構築した。
（１）ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子の獲得
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。続いて、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、推奨プロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ由来の１本鎖ｃＤＮＡを得た。
（２）ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子のクローニング（ｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩの
構築）
Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＣＩ（ＮＣＢＩ ＮＭ００１６４５）の配列から５‘末端プライマー（配列番号１）及び３’末端プライマー（配列番号２）を設計し、上記（１）で得た１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。これらのプライマーには後の発現ベクター構築のために、５‘末端プライマーについてはＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端プライマーについてはＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付与されている。すなわち、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。次いで得られた反応産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールにしたがってクローニングした。Ｍ１３プライマーＭ４及びＭ１３ プライマーＲＶ（タカラバイオ社）を用いたシークエンス解析を行ったところ、クローニングされたＤＮＡ断片は配列番号３に示す配列であり、ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子であることを確認した。
【００１９】
Ｂ．発現ベクターの構築
図１に示すように、大腸菌由来ｌａｃプロモーター、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｘを調製し、他方、上記Ａで構築したｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを用い、それぞれのプラスミドから、ｌａｃプロモーター、チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片と、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む断片を得て、それら断片を連結することによって、目的とする組換えプラスミド発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。同様にして、Ｔ７ファージ由来のＴ７プロモーターを含むｐＥＴ−Ｔｒｘから組換えプラスミド発現ベクターｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。
【００２０】
（１）Ｔ７プロモーター、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドを含むプラスミド（ｐＥＴ−Ｔｒｘ）の構築
ｐＥＴ２４ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）から、大腸菌由来のチオレドキシン（Ｔｒｘ）をコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグ（６Ｈｉｓ）およびトロンビン開裂ペプチド（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｅｑ．）を含むチオレドキシンリージョンのＤＮＡ断片（３６６番目−６９２番目）を得るために、ＮｃｏＩ制限酵素サイトが付与されたチオレドキシン５’末端プライマー（配列番号４）、精製タグとなる６×ヒスチジン配列が付与された３’末端プライマー（配列番号５）によるＰＣＲを行った。さらに得られる産物の３‘末端にトロンビンプロテアーゼ開裂配列、ＮｄｅＩ制限酵素サイトを付与するために３’末端プライマー（配列番号６）、発現ベクターへのクローニングのためのＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付与された３‘末端プライマー（配列番号７）を設計しＰＣＲによる伸長反応を行った。すなわち、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。以下同様に、得られたＰＣＲ産物の１０００分の１希釈溶液に対して、配列番号４及び配列番号６、次いで配列番号４及び配列番号７のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行った。最終的に得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって末端を処理し、同様に処理された、Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴ２１ｄ（＋）との間でＬｉｇａｔｉｏｎ− Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社）を用いライゲーション反応させ、Ｔ７プロモーター、Ｔｒｘ(配列番号８)、６Ｈｉｓおよびトロンビン開裂ペプチドを含むｐＥＴ−Ｔｒｘを構築した。
【００２１】
（２）ｌａｃプロモーター、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよ
びトロンビン開裂ペプチドを含むプラスミド（ｐＵＣ−Ｔｒｘ）の構築
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトが付与されたチオレドキシン５’末端プライマー（配列番号９）、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトが付与された３’末端プライマー（配列番号１０）を設計し、上記（１）で構築したｐＥＴ−Ｔｒｘを鋳型として、ＰＣＲを行った。すなわち、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。次いで得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって末端を処理し、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドを含む断片を得、後のライゲーション反応に供した。
一方、ｌａｃプロモーターを含むｐＵＣ１９のＮｄｅＩ部位へ配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを挿入した後に、これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって処理し、上記で得られたＰＣＲ産物とライゲーション反応を行い、ｐＵＣ−Ｔｒｘを構築した。
【００２２】
（３）Ｔ７プロモーター制御によるヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとチオレドキシン融合
蛋白質発現ベクター（ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ）の構築
ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子は、上記ＡのｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩプラスミドをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより切り出し、ｐＥＴ−ＴｒｘのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトの間に挿入することでｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩの概略図は図１の右上にａとして示す。
（４）ｌａｃプロモーター制御によるヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとチオレドキシン融
合タンパク質発現ベクター（ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ）の構築
上記（３）と同様、ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子は、前述のｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩプラスミドをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより切り出し、ｐＵＣ−ＴｒｘのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトの間に挿入することでｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩの概略図を図１の右下にｂとして示す。
【００２３】
実施例２
組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの製造
実施例１で構築した組換え発現プラスミドを大腸菌に導入してヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを製造した。
（１）ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドを含有
する形質転換体の調製
実施例１のＢで構築したヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミドであるｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを用いて、大腸菌を常法により形質転換した。ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩにおいては、Ｔ７プロモーターが機能するＢ株のλＤＥ３溶原菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＣ４１（ＤＥ３）を形質転換してｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）及びｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）を調製した。ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩにおいては、λＤＥ３が組み込まれていないＫ１２株ＪＭ１０９またはＢ株ＢＬ２１を形質転換してｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１を調製した。
各々の形質転換体は、ＬＢプレート培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、グルコース１％、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬ）上にて薬剤耐性によってスクリーニングし、生じたシングルコロニーをＴＢ培地（ポリペプトン１．２％、酵母エキス２．４％、グリセロール０．４％、１７ｍＭリン酸二水素カリウム、７２ｍＭリン酸水素二カリウム、グルコース２％、カルベニシリン２００μｇ／ｍＬ）に接種し、各プロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を対数増殖中期（培養液のＯＤ６００＝０．４〜０．６）に添加、発現誘導を行った。培養液の遠心操作で得られる菌体ペレットを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、超音波破砕を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を可溶性画分とした。一方、沈殿部分は８Ｍ尿素、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で再懸濁、可溶化を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を不溶性画分とした。
【００２４】
上記の各々の形質転換体の可溶性画分、不溶性画分についてＮｉ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用いたバッチ法により、精製タグとなる６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合蛋白質の検出を行った。添付のプロトコールに基づいて、Ｎｉ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ レジンからの溶離液をトリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。結果を図２に示す。図２から分かるように、発現ベクターとして大腸菌由来のｌａｃプロモーターを有するｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１から得られる不溶性画分においてのみ、推定分子量２０ＫＤａを示す６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質のバンドがクマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって確認できた。一方、以下に示すベクター及び大腸菌株の組み合わせにおいては、いずれも組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを含む蛋白質のバンドは確認できなかった。すなわち、Ｔ７プロモーターを有するｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）、ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）、チオレドキシンを含まないｐＥＴ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）、ｐＥＴ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）、または、ｌａｃプロモーターを有しチオレドキシンを含まないｐＵＣ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９、ｐＵＣ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１の組み合わせの場合、いずれも組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを含む蛋白質のバンドは確認できなかった。
【００２５】
（２）組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの産生及び精製
上記ＴＢ培地（ポリペプトン１．２％、酵母エキス２．４％、グリセロール０．４％、１７ｍＭリン酸二水素カリウム、７２ｍＭリン酸水素二カリウム、グルコース２％、カルベニシリン２００μｇ／ｍＬ）であらかじめ３７℃で終夜培養したｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１の培養液３０ｍＬをオートクレーブ済みの３ＬのＴＢ培地に接種し、培養器（丸菱バイオエンジ社）により３７℃通気攪拌培養した。６時間培養後、１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を３ｍＬ添加し、さらに４時間３７℃で通気攪拌培養を続けた。培養終了後全培養液を遠心分離によって集菌し、−２０℃に凍結した。凍結した菌体ペレットを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３００ｍＬ中に懸濁し、超音波破砕を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を可溶性画分とした。一方、沈殿部分は８Ｍ尿素、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３００ｍＬ中で再懸濁、可溶化を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を不溶性画分とした。
【００２６】
不溶性画分からの組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの精製において、変性剤である尿素の除去は希釈、透析、脱塩カラム等の方法を用いることも可能であるが、本法では、アフィニティーカラム上での変性剤除去と変性タンパク質のリフォールディングを行った。すなわち、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）制御下、バッファー１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、４Ｍ尿素 ｐＨ７．８）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐＦＦ ５ｍＬアフィニティーカラム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）に上記不溶性画分サンプル５０ｍＬをアプライし、バッファー１で非結合画分を分離し、バッファー１をバッファー２（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）との間で１００％→０％リニアグラジエントを行うことでカラム溶出液の尿素の除去を行った。次にバッファー２により溶出される画分を回収した後、バッファー３（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）との間で０→１００％リニアグラジエントを行うことで、目的タンパク質を溶出させた。各溶出画分をトリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。結果を図３に示した。図３から分かるように、バッファー２及び（３）溶出画分において、推定分子量２０ＫＤａを示す６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質のバンドがクマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって確認できた。この段階で既に８０％以上の純度を示す可溶性の６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合蛋白質が得られた。
【００２７】
続いて得られた精製組換え蛋白質からチオレドキシン及びヒスチジンタグを除去するために、トロンビンプロテアーゼを作用させた。すなわち基質である可溶性の６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質１ｍｇあたり１Ｕのトロンビンプロテアーゼを作用させ室温で終夜インキュベートした。直ちにバッファー２（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）に対して透析を行った後、ＨｉｓＴｒａｐＦＦ ５ｍＬアフィニティーカラム及びＨｉＴｒａｐ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ＦＦ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）にアプライし両者の素通り画分を回収した。さらに脱塩カラムによりバッファーをＰＢＳに置換した後、濃縮することで精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを得た。
得られた精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉは、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析し、クマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって純度９５％以上であることを確認し、市販のヤギ抗ヒトヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ抗体を用いたウェスタンブロッティングを常法にて行い、その抗原性を確認した。これらの結果は図４に示した。また組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの定量として、ＢＳＡを標準物質としたＬｏｗｒｙ法を行い、上記３Ｌ培養１バッチから３ｍｇ程度の組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉが得られた。
【００２８】
実施例３
組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫原としたモノクローナル抗体の作製
免疫原を実施例３で得た精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとした場合とヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉとした場合とで、得られる抗体の性能を比較するために、両者をそれぞれ抗原としたモノクローナル抗体の作製を行った。以下に組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫原としたモノクローナル抗体の作製について記載するが、ヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉについても同種マウスの別個体を用いて同様の操作を行った。
（１）精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉによるマウスの免疫
精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で調製し、等量のフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業社）と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液５０μＬをＢａｌｂ／ｃ６週齢 雌マウス（日本クレアー社）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量の組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉをフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業社）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫として組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で調製し５０μＬをマウス尾静脈注射により投与した。
【００２９】
（２）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後に組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ融合時の融合比率は脾臓細胞数： 骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１＝（２：１）〜（５：１）であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、α−ＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ社）、ＨＡＴ（コスモバイオ社）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト社）に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。
（３）抗原プレート及びＢＳＡプレートの作製
スクリーニング用抗原プレートとしては、ヒト血漿由来の精製天然ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（ｎａｔｉｖｅ ＡｐｏＣ−Ｉ）を抗原として感作した。すなわち、ヒト血漿由来のヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に溶解し、１μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社）を含むＰＢＳで３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び１０％サッカロース（和光純薬工業社）を含むブロッキング溶液を２００μＬ分注して、更に４℃で１晩静置した。
さらに、ＢＳＡとの非特異的反応を調べるために、ＢＳＡプレートの作製も行った。すなわち、９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）に抗原溶液を感作することなく１．５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び１０％サッカロース（和光純薬工業社）を含むブロッキング溶液を２００μＬ分注して、更に４℃で１晩静置した。
【００３０】
（４）コロニーのスクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。実施したスクリーニング方法を以下に述べる。
上記（３）で作製した抗原プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社）を含むＰＢＳで３回洗浄した後に、上記（２）で得られた３種類のハイブリドーマの培養上清１００μＬを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍＬ ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ナカライ社）クエン酸発色溶液を１００μＬ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸（和光純薬工業社）を停止液として更に１００μＬ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
表１に示すように、免疫原を精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（組換えＡｐｏＣ−Ｉ）とした場合は組換えＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体３種類、免疫原をヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉ（天然ＡｐｏＣ−Ｉ）とした場合は天然ＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体３種類を得ることができたが、組換えＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体は、ＢＳＡとの非特異反応が少ないのに比べ、天然ＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体は、非特異的反応が大きいことが判明した。
【表１】
【００３１】
上記で得られた組換えＡｐｏＣ−Ｉ抗体（クローン３）を産生するハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＭＡ−１）は、平成１９年８月１日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号としてＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８８９が付与されている。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
プロモーターとしてＬａｃプロモーターなどの大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、チオレドキンなどの水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインが得られる。この方法により得られる高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができ、従って、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を臨床検査薬として用いることにより、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性などを正確に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築を示す。
【図２】発現ベクターによって発現されたヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質の検出結果を示す。
【図３】発現ベクターによって発現されたヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質の、アフィニティークロマトグラフィーによるリフォールディングと精製結果を示す。
【図４】精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのトリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウエスタンブロッティングの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えアポリポプロテインに関する。更に詳細には、組換えアポリポプロテインの製造方法、該製造方法に用いる組換えプラスミド発現ベクター、該製造方法により得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉ、該組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体、該抗体を用いるアポリポプロテインのＣ−Ｉの測定方法および該測定方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の数多くの蛋白質は、病気の有無・状態と関係し、臨床的に測定されてきている。その場合、蛋白質を測定する方法としては、その蛋白質に対する抗体を用いて、免疫的測定法によるものが一般的であり、その原理に基ずく臨床検査薬が広く供給されている。
生体蛋白質の一つであるアポリポプロテインＣ−Ｉは、主として肝臓において産生される分子量６．６ｋＤａの蛋白質であり、高脂質症の発症に関与していることが報告されている（非特許文献１）。天然のアポリポプロテインＣ−Ｉおよびそれを用いて作成した抗体は実際に商業的に供給されているにもかかわらず、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するための免疫測定法の試薬は、臨床検査試薬として使用されていない。
アポリポプロテインＣ−Ｉに関しては、近年、ＳＥＬＤＩ−ＭＳやＭＡＬＤＩ−ＭＳのような質量分析計やＨＰＬＣ法の分析法の発展に伴い、それと病態との関係も新たに知られてきている。例えば、質量分析計やＨＰＬＣを用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉのレベルが、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性と関係していることが報告されてきている（特許文献１および特許文献２）。
臨床検査薬としては、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためには、免疫学定測定法でそれを測定することが好ましいにも拘らず、これを免疫学的測定法で調べると、質量分析計で測定したものとは結果が異なると指摘されている（特許文献２）。
従って、アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学定測定法で測定するための臨床検査薬の開発が強く望まれている。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００５／０１７５２３号パンフレット（特許公表２００７年５０２４０１号公報）
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００５／０３８４６１号パンフレット（特許公表２００７年５０６０７５号公報）
【非特許文献１】Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 1999; 19; 472-484
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
このような状況下、本発明者らは、アポリポプロテインＣ−Ｉの免疫学的測定法の一つの問題として、市販の抗アポリポプロテインＣ−Ｉ抗体は、非特異反応が大きく、それは、その抗体を作成するために用いた抗原、すなわち、天然のアポプロテインＣ−Ｉに問題があるということを発見した。そこで、遺伝子工学的手法により、アポリポプロテインＣ−Ｉを作成することを試みた。組換えアポリポプロテインＣ−Ｉの製造を検討したが、これまでに知られていない技術であり、成功するには困難を極めた。例えば、本発明者らの検討によるとヒトに近いマウス卵巣細胞を用いては、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを製造することはできなかった。また、大腸菌の菌体内では、アポリポプロテインＣ−Ｉを用いることなくリポプロテインが代謝されているためか、宿主細胞として大腸菌を用いて、通常のＴ７プロモーターやＬａｃプロモーターを用いても組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを発現できなかった。
従って、本発明の課題は、天然から得られるアポリポプロテインＣ−Ｉに比べて純度が高く、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉの製造方法を提供することにある。更には、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに加えて他の組換えアポリポプロテインも製造するための製造方法を提供することにある。また、本発明の課題は、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉ、該組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体、該抗体を用いるアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法および該測定方法に用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記した課題を解決することを目的として鋭意研究した結果、プロモーターとして大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質であるチオレドキシンとアポリポプロテインＣ−Ｉとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉであって、非特異反応の少ない抗アポプロテインＣ−Ｉ抗体が作成可能な組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られ、この製造方法は、他の組換えアポリポプロテインの製造に広く適用できること、また、この組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて作成した抗アポリポプロテインＣ−Ｉ抗体により天然のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により正確に測定できることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。
【０００５】
従って、本発明は、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることを特徴とする組換えアポリポプロテインの製造方法に関する。
更に本発明は、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターに関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を用いて免疫測定法で検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを測定することを特徴とするアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法に関する。
更に本発明は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含む、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためのキットに関する。
【発明の効果】
【０００６】
プロモーターとして大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインが得られる。この方法により得られる高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができる。従って、本発明で得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を臨床検査薬として用いることにより、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性などを正確に診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明においては、組換えアポリポプロテインは、大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることにより製造できる。
ここで用いる大腸菌由来のプロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターなどが挙げられ、特にｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、なかでもｌａｃプロモーターが好ましい。
【０００８】
水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質としては、分子量が８０００から６００００の蛋白質が好ましく、例えば、チオレドキシン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合プロテイン（ＭＢＰ）あるいはこれらの変異体などが挙げられる。変異体としては、これらの蛋白質のアミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、元の蛋白質と同様の機能を有する蛋白質が挙げられる。ここで同様の機能とは、アポリポプロテインとともに大腸菌において融合蛋白質として発現できる機能を指す。本発明では、大腸菌由来の水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質が好ましく、特に、チオレドキシンまたはその変異体、なかでも大腸菌由来のチオレドキシンまたはその変異体が好ましい。
これらの水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は各種文献に記載され公知である。
組換えプラスミド発現ベクターにおいては、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、アポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の上流側に位置しているのが好ましい。
【０００９】
アポリポプロテインとしては、アポリポプロテインＡ、Ｃ、Ｅなどが好適であり、更にこれらのサブタイプ、例えば、アポリポプロテインＡ−Ｉ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４などが挙げられる。あるいはこれらの変異体であってもよい。変異体としては、これらのアポリポプロテインのアミノ酸配列において一つもしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなり、元の蛋白質と同様の機能を有する蛋白質が挙げられる。ここで同様の機能とは、元のアポリポプロテインと同様の抗原性を有し同様の特異性を有する抗体産生能を指す。
これらのアポリポプロテインのなかでも、特にアポリポプロテインＣ−Ｉが好ましい。これらのアポリポプロテインのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は各種文献に記載され公知である。
【００１０】
本発明においては、組換えプラスミド発現ベクターは、更に、発現した融合蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むのが好ましい。精製ペプチドとしては、好ましくは、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧ、ＳＴＲＥＰなどのアフィニティー精製が可能となるペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が連続して６から１０個程度結合したものであり、融合蛋白質に結合させて用いる。このＨｉｓタグはキレート担体と相互作用するため、発現する融合蛋白質の精製が容易に行える。ＦＬＡＧは８個のアミノ酸残基からなるペプチドタグで、融合蛋白質に結合させて発現させ、融合蛋白質を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて精製することができる。ＳＴＲＥＰは、ストレプトアビジンに結合する８個のアミノ酸残基からなるペプチドタグであり、ストレプトアビジンとの可逆的な結合を利用して、融合蛋白質を精製できる。これらの精製ペプチドのなかでも、Ｈｉｓタグが好ましい。これらの精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の間に置かれて、あるいは、いずれかのＤＮＡ配列に連結して用いられる。
【００１１】
本発明においては、組換えプラスミド発現ベクターは、更に、発現した融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させるためのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むのが好ましい。プロテアーゼ開裂ペプチドとしては、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼなどのプロテアーゼによって開裂されるペプチドなどが挙げられる。これらのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の間に位置し、アポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列の直ぐ上流に存在するのが好ましい。このようなプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を用いることにより、発現した融合蛋白質に、例えば、トロンビンなどを作用させることにより、融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させることができる。
【００１２】
上記した各種ＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクターの構築は、例えば、図１に示すようにして行うことができる。すなわち、Ｌａｃプロモーター、大腸菌由来チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、上流側からこの順序で有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｘを調製し、他方、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを調製し、それぞれのプラスミドから、Ｌａｃプロモーター、大腸菌由来チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片と、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む断片を得て、それら断片を連結することによって、目的とする組換えプラスミド発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築することができる。他の各種組換えアポリポプロテインを得るための組換えプラスミド発現ベクターも同様にして構築することができる。
【００１３】
組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させるには、公知の方法を用いて通常の方法により行うことができる。発現した融合蛋白質は、上記した精製ペプチドを利用して精製し、精製した融合蛋白質から、上記したプロテアーゼ開裂ペプチドを利用してアポリポプロテインを遊離させて、目的とする組換えアポリポプロテインを製造することができる。
本発明の製造方法により、高純度の組換えアポリポプロテインが得られ、また、抗原として動物に免疫することにより、対応する天然アポリポプロテインに対して高い特異性を有する抗体産生を誘導する組換えアポリポプロテインが得られる。特に、本発明の製造方法により、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対して高い特異性を有する抗体産生を誘導する組換えアポリポプロテインＣ−Ｉが得られる。
【００１４】
本発明の製造方法により得られる組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与することにより、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体が得られる。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。
ポリクローナル抗体は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを哺乳動物に免疫して、免疫動物から血清を採取することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物を免疫し、その動物が産生する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させて得られるハイブリドーマによって調製することができる。
【００１５】
ハイブリドーマは、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等のアジュバントを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に免疫し、次いで免疫動物の脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）する細胞とを、ケーラーとミルスタインの定法（Nature.256,495.1975）によってポリエチレングリコールなどを用いることにより融合し、融合細胞から、アポリポプロテインＣ−Ｉを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって得ることができる。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地で培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物をあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
【００１６】
本発明の抗体は、天然アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる抗体に比べて、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対する特異性が高いものである。本発明の抗体を用いた免疫測定法によって検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを高感度で且つ特異的に検出することができる。
ここで対象となる検体としては、血液、血清、血漿、骨などの組織等が挙げられる。
免疫測定法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
例えば、酵素免疫測定法として、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法を例にとって以下に説明する。
ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して抗体を結合させる。次いで、検体を作用させて、アポリポプロテインＣ−Ｉを固相に結合した抗体に結合させ、固相を洗浄し、次いで対応する二次標識抗体、例えば、抗イムノグロブリン標識抗体を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
【００１７】
本発明の測定方法を実施するときは、アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫測定するためのキットであって、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含むキットを用いて行える。このキットにおいては、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことができる。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。また、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム溶液等の酵素反応停止液、例えば、トリス等の緩衝液を含むこともできる。
【００１８】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
組換えプラスミド発現ベクターの構築
Ａ．ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ断片の調製
図１に示す組換えヒトアポリポロテインＣ−Ｉ発現ベクターの構築において原料プラスミドとして用いる、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含むｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを構築した。
（１）ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子の獲得
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて全ＲＮＡを抽出した。続いて、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用い、推奨プロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ由来の１本鎖ｃＤＮＡを得た。
（２）ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子のクローニング（ｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩの
構築）
Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＣＩ（ＮＣＢＩ ＮＭ００１６４５）の配列から５‘末端プライマー（配列番号１）及び３’末端プライマー（配列番号２）を設計し、上記（１）で得た１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。これらのプライマーには後の発現ベクター構築のために、５‘末端プライマーについてはＮｄｅＩ制限酵素サイト、３’末端プライマーについてはＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付与されている。すなわち、ＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。次いで得られた反応産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用い、添付のプロトコールにしたがってクローニングした。Ｍ１３プライマーＭ４及びＭ１３ プライマーＲＶ（タカラバイオ社）を用いたシークエンス解析を行ったところ、クローニングされたＤＮＡ断片は配列番号３に示す配列であり、ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子であることを確認した。
【００１９】
Ｂ．発現ベクターの構築
図１に示すように、大腸菌由来ｌａｃプロモーター、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｘを調製し、他方、上記Ａで構築したｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩを用い、それぞれのプラスミドから、ｌａｃプロモーター、チオレドキシン、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む断片と、ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を含む断片を得て、それら断片を連結することによって、目的とする組換えプラスミド発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。同様にして、Ｔ７ファージ由来のＴ７プロモーターを含むｐＥＴ−Ｔｒｘから組換えプラスミド発現ベクターｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。
【００２０】
（１）Ｔ７プロモーター、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドを含むプラスミド（ｐＥＴ−Ｔｒｘ）の構築
ｐＥＴ２４ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）から、大腸菌由来のチオレドキシン（Ｔｒｘ）をコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグ（６Ｈｉｓ）およびトロンビン開裂ペプチド（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｅｑ．）を含むチオレドキシンリージョンのＤＮＡ断片（３６６番目−６９２番目）を得るために、ＮｃｏＩ制限酵素サイトが付与されたチオレドキシン５’末端プライマー（配列番号４）、精製タグとなる６×ヒスチジン配列が付与された３’末端プライマー（配列番号５）によるＰＣＲを行った。さらに得られる産物の３‘末端にトロンビンプロテアーゼ開裂配列、ＮｄｅＩ制限酵素サイトを付与するために３’末端プライマー（配列番号６）、発現ベクターへのクローニングのためのＢａｍＨＩ制限酵素サイトが付与された３‘末端プライマー（配列番号７）を設計しＰＣＲによる伸長反応を行った。すなわち、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。以下同様に、得られたＰＣＲ産物の１０００分の１希釈溶液に対して、配列番号４及び配列番号６、次いで配列番号４及び配列番号７のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行った。最終的に得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩによって末端を処理し、同様に処理された、Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴ２１ｄ（＋）との間でＬｉｇａｔｉｏｎ− Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社）を用いライゲーション反応させ、Ｔ７プロモーター、Ｔｒｘ(配列番号８)、６Ｈｉｓおよびトロンビン開裂ペプチドを含むｐＥＴ−Ｔｒｘを構築した。
【００２１】
（２）ｌａｃプロモーター、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよ
びトロンビン開裂ペプチドを含むプラスミド（ｐＵＣ−Ｔｒｘ）の構築
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトが付与されたチオレドキシン５’末端プライマー（配列番号９）、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトが付与された３’末端プライマー（配列番号１０）を設計し、上記（１）で構築したｐＥＴ−Ｔｒｘを鋳型として、ＰＣＲを行った。すなわち、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡社）１単位、添付の１０×ＰＣＲバッファー５μＬを用い、０．２５μＭ 配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯとなるように反応溶液を調製し、９８℃ １分の熱処理の後、９４℃ ２０秒、６５℃ ９０秒、７２℃ ４０秒のサーマルサイクルを３０回、７４℃ ５分の伸長反応を行った。次いで得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって末端を処理し、チオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、６Ｈｉｓタグおよびトロンビン開裂ペプチドを含む断片を得、後のライゲーション反応に供した。
一方、ｌａｃプロモーターを含むｐＵＣ１９のＮｄｅＩ部位へ配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを挿入した後に、これをＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって処理し、上記で得られたＰＣＲ産物とライゲーション反応を行い、ｐＵＣ−Ｔｒｘを構築した。
【００２２】
（３）Ｔ７プロモーター制御によるヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとチオレドキシン融合
蛋白質発現ベクター（ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ）の構築
ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子は、上記ＡのｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩプラスミドをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより切り出し、ｐＥＴ−ＴｒｘのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトの間に挿入することでｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩの概略図は図１の右上にａとして示す。
（４）ｌａｃプロモーター制御によるヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとチオレドキシン融
合タンパク質発現ベクター（ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ）の構築
上記（３）と同様、ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ遺伝子は、前述のｐＴＯＰＯ−ＡｐｏＣＩプラスミドをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより切り出し、ｐＵＣ−ＴｒｘのＮｄｅＩとＢａｍＨＩ制限酵素サイトの間に挿入することでｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを構築した。ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩの概略図を図１の右下にｂとして示す。
【００２３】
実施例２
組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの製造
実施例１で構築した組換え発現プラスミドを大腸菌に導入してヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを製造した。
（１）ヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドを含有
する形質転換体の調製
実施例１のＢで構築したヒトアポリポプロテインＣ−ＩをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミドであるｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩを用いて、大腸菌を常法により形質転換した。ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩにおいては、Ｔ７プロモーターが機能するＢ株のλＤＥ３溶原菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＣ４１（ＤＥ３）を形質転換してｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）及びｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）を調製した。ｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩにおいては、λＤＥ３が組み込まれていないＫ１２株ＪＭ１０９またはＢ株ＢＬ２１を形質転換してｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１を調製した。
各々の形質転換体は、ＬＢプレート培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、グルコース１％、カルベニシリン１００μｇ／ｍＬ）上にて薬剤耐性によってスクリーニングし、生じたシングルコロニーをＴＢ培地（ポリペプトン１．２％、酵母エキス２．４％、グリセロール０．４％、１７ｍＭリン酸二水素カリウム、７２ｍＭリン酸水素二カリウム、グルコース２％、カルベニシリン２００μｇ／ｍＬ）に接種し、各プロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を対数増殖中期（培養液のＯＤ６００＝０．４〜０．６）に添加、発現誘導を行った。培養液の遠心操作で得られる菌体ペレットを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、超音波破砕を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を可溶性画分とした。一方、沈殿部分は８Ｍ尿素、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で再懸濁、可溶化を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を不溶性画分とした。
【００２４】
上記の各々の形質転換体の可溶性画分、不溶性画分についてＮｉ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を用いたバッチ法により、精製タグとなる６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合蛋白質の検出を行った。添付のプロトコールに基づいて、Ｎｉ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ レジンからの溶離液をトリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。結果を図２に示す。図２から分かるように、発現ベクターとして大腸菌由来のｌａｃプロモーターを有するｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９及びｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１から得られる不溶性画分においてのみ、推定分子量２０ＫＤａを示す６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質のバンドがクマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって確認できた。一方、以下に示すベクター及び大腸菌株の組み合わせにおいては、いずれも組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを含む蛋白質のバンドは確認できなかった。すなわち、Ｔ７プロモーターを有するｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）、ｐＥＴ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）、チオレドキシンを含まないｐＥＴ−ＡｐｏＣＩ／Ｃ４１（ＤＥ３）、ｐＥＴ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１（ＤＥ３）、または、ｌａｃプロモーターを有しチオレドキシンを含まないｐＵＣ−ＡｐｏＣＩ／ＪＭ１０９、ｐＵＣ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１の組み合わせの場合、いずれも組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを含む蛋白質のバンドは確認できなかった。
【００２５】
（２）組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの産生及び精製
上記ＴＢ培地（ポリペプトン１．２％、酵母エキス２．４％、グリセロール０．４％、１７ｍＭリン酸二水素カリウム、７２ｍＭリン酸水素二カリウム、グルコース２％、カルベニシリン２００μｇ／ｍＬ）であらかじめ３７℃で終夜培養したｐＵＣ−Ｔｒｘ−ＡｐｏＣＩ／ＢＬ２１の培養液３０ｍＬをオートクレーブ済みの３ＬのＴＢ培地に接種し、培養器（丸菱バイオエンジ社）により３７℃通気攪拌培養した。６時間培養後、１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を３ｍＬ添加し、さらに４時間３７℃で通気攪拌培養を続けた。培養終了後全培養液を遠心分離によって集菌し、−２０℃に凍結した。凍結した菌体ペレットを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３００ｍＬ中に懸濁し、超音波破砕を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を可溶性画分とした。一方、沈殿部分は８Ｍ尿素、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）３００ｍＬ中で再懸濁、可溶化を行った。この懸濁液の遠心操作によって得られる上清部分を不溶性画分とした。
【００２６】
不溶性画分からの組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの精製において、変性剤である尿素の除去は希釈、透析、脱塩カラム等の方法を用いることも可能であるが、本法では、アフィニティーカラム上での変性剤除去と変性タンパク質のリフォールディングを行った。すなわち、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）制御下、バッファー１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、４Ｍ尿素 ｐＨ７．８）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐＦＦ ５ｍＬアフィニティーカラム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）に上記不溶性画分サンプル５０ｍＬをアプライし、バッファー１で非結合画分を分離し、バッファー１をバッファー２（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）との間で１００％→０％リニアグラジエントを行うことでカラム溶出液の尿素の除去を行った。次にバッファー２により溶出される画分を回収した後、バッファー３（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）との間で０→１００％リニアグラジエントを行うことで、目的タンパク質を溶出させた。各溶出画分をトリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析した。結果を図３に示した。図３から分かるように、バッファー２及び（３）溶出画分において、推定分子量２０ＫＤａを示す６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質のバンドがクマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって確認できた。この段階で既に８０％以上の純度を示す可溶性の６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合蛋白質が得られた。
【００２７】
続いて得られた精製組換え蛋白質からチオレドキシン及びヒスチジンタグを除去するために、トロンビンプロテアーゼを作用させた。すなわち基質である可溶性の６×ヒスチジン配列を含む組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのチオレドキシン融合タンパク質１ｍｇあたり１Ｕのトロンビンプロテアーゼを作用させ室温で終夜インキュベートした。直ちにバッファー２（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）に対して透析を行った後、ＨｉｓＴｒａｐＦＦ ５ｍＬアフィニティーカラム及びＨｉＴｒａｐ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ＦＦ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）にアプライし両者の素通り画分を回収した。さらに脱塩カラムによりバッファーをＰＢＳに置換した後、濃縮することで精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを得た。
得られた精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉは、トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって解析し、クマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって純度９５％以上であることを確認し、市販のヤギ抗ヒトヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ抗体を用いたウェスタンブロッティングを常法にて行い、その抗原性を確認した。これらの結果は図４に示した。また組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉの定量として、ＢＳＡを標準物質としたＬｏｗｒｙ法を行い、上記３Ｌ培養１バッチから３ｍｇ程度の組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉが得られた。
【００２８】
実施例３
組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫原としたモノクローナル抗体の作製
免疫原を実施例３で得た精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉとした場合とヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉとした場合とで、得られる抗体の性能を比較するために、両者をそれぞれ抗原としたモノクローナル抗体の作製を行った。以下に組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫原としたモノクローナル抗体の作製について記載するが、ヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉについても同種マウスの別個体を用いて同様の操作を行った。
（１）精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉによるマウスの免疫
精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で調製し、等量のフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業社）と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液５０μＬをＢａｌｂ／ｃ６週齢 雌マウス（日本クレアー社）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量の組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉをフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業社）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫として組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉを１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で調製し５０μＬをマウス尾静脈注射により投与した。
【００２９】
（２）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後に組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（メルク社）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ融合時の融合比率は脾臓細胞数： 骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１＝（２：１）〜（５：１）であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ（インビトロジェン社）、α−ＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ社）、ＨＡＴ（コスモバイオ社）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト社）に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。
（３）抗原プレート及びＢＳＡプレートの作製
スクリーニング用抗原プレートとしては、ヒト血漿由来の精製天然ヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（ｎａｔｉｖｅ ＡｐｏＣ−Ｉ）を抗原として感作した。すなわち、ヒト血漿由来のヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に溶解し、１μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社）を含むＰＢＳで３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び１０％サッカロース（和光純薬工業社）を含むブロッキング溶液を２００μＬ分注して、更に４℃で１晩静置した。
さらに、ＢＳＡとの非特異的反応を調べるために、ＢＳＡプレートの作製も行った。すなわち、９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）に抗原溶液を感作することなく１．５％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）及び１０％サッカロース（和光純薬工業社）を含むブロッキング溶液を２００μＬ分注して、更に４℃で１晩静置した。
【００３０】
（４）コロニーのスクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。実施したスクリーニング方法を以下に述べる。
上記（３）で作製した抗原プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（和光純薬工業社）を含むＰＢＳで３回洗浄した後に、上記（２）で得られた３種類のハイブリドーマの培養上清１００μＬを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍＬ ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ナカライ社）クエン酸発色溶液を１００μＬ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸（和光純薬工業社）を停止液として更に１００μＬ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
表１に示すように、免疫原を精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉ（組換えＡｐｏＣ−Ｉ）とした場合は組換えＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体３種類、免疫原をヒト血漿由来の精製天然アポリポプロテインＣ−Ｉ（天然ＡｐｏＣ−Ｉ）とした場合は天然ＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体３種類を得ることができたが、組換えＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体は、ＢＳＡとの非特異反応が少ないのに比べ、天然ＡｐｏＣ−Ｉモノクロナーナル抗体は、非特異的反応が大きいことが判明した。
【表１】
【００３１】
上記で得られた組換えＡｐｏＣ−Ｉ抗体（クローン３）を産生するハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍａｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＭＡ−１）は、平成１９年８月１日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受領番号としてＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０８８９が付与されている。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
プロモーターとしてＬａｃプロモーターなどの大腸菌由来のプロモーターを用い、宿主細胞として大腸菌を用いて、チオレドキンなどの水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質として発現させることにより、高純度の組換えアポリポプロテインが得られる。この方法により得られる高純度の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを抗原として用いて、アポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を調製することにより、天然のアポリポプロテインＣ−Ｉに対して特異性の高い抗体を得ることができる。この抗体を用いて、検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫学的測定法により、正確に測定することができ、従って、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を臨床検査薬として用いることにより、卒中、敗血症、腫瘍、心疾患、クローン病発病の可能性などを正確に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築を示す。
【図２】発現ベクターによって発現されたヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質の検出結果を示す。
【図３】発現ベクターによって発現されたヒトアポリポプロテインＣ−１とチオレドキンとの融合蛋白質の、アフィニティークロマトグラフィーによるリフォールディングと精製結果を示す。
【図４】精製組換えヒトアポリポプロテインＣ−Ｉのトリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウエスタンブロッティングの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることを特徴とする組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項２】
アポリポプロテインがアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体である請求項１の組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項３】
水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質がチオレドキシンまたはその変異体である請求項１または２の組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項４】
大腸菌由来のプロモーターがｌａｃプロモーターまたはｔａｃプロモーターである請求項１から３のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項５】
組換えプラスミド発現ベクターが、更に、発現した融合蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１から４のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項６】
組換えプラスミド発現ベクターが、更に、発現した融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させるためのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１から５のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項７】
大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクター。
【請求項８】
組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかの製造方法によって得られる請求項８の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体。
【請求項１０】
請求項８または９の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体。
【請求項１１】
天然アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる抗体に比べて、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対する特異性が高い請求項１０の抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１０または１１の抗体。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかの組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を用いて免疫測定法で検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを測定することを特徴とするアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかの組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含む、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためのキット。
【請求項１】
大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクターを、大腸菌に導入し、導入された大腸菌を培養して、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質とアポリポプロテインとの融合蛋白質を発現させ、その融合蛋白質からアポリポプロテインを得ることを特徴とする組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項２】
アポリポプロテインがアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体である請求項１の組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項３】
水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質がチオレドキシンまたはその変異体である請求項１または２の組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項４】
大腸菌由来のプロモーターがｌａｃプロモーターまたはｔａｃプロモーターである請求項１から３のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項５】
組換えプラスミド発現ベクターが、更に、発現した融合蛋白質を精製するための精製ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１から４のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項６】
組換えプラスミド発現ベクターが、更に、発現した融合蛋白質からアポリポプロテインを遊離させるためのプロテアーゼ開裂ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１から５のいずれかの組換えアポリポプロテインの製造方法。
【請求項７】
大腸菌由来のプロモーター、水溶性であって大腸菌で発現し得る蛋白質をコードするＤＮＡ配列およびアポリポプロテインをコードするＤＮＡ配列を有する組換えプラスミド発現ベクター。
【請求項８】
組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体。
【請求項９】
請求項１から６のいずれかの製造方法によって得られる請求項８の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉまたはその変異体。
【請求項１０】
請求項８または９の組換えアポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる、組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体。
【請求項１１】
天然アポリポプロテインＣ−Ｉを免疫源として哺乳動物に投与して得られる抗体に比べて、天然アポリポプロテインＣ−Ｉに対する特異性が高い請求項１０の抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１０または１１の抗体。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれかの組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を用いて免疫測定法で検体中のアポリポプロテインＣ−Ｉを測定することを特徴とするアポリポプロテインＣ−Ｉの測定方法。
【請求項１４】
請求項１０から１２のいずれかの組換えアポリポプロテインＣ−Ｉに対する抗体を含む、アポリポプロテインＣ−Ｉを測定するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−５０２２７（Ｐ２００９−５０２２７Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２２００１（Ｐ２００７−２２２００１）
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２９日（２００７．８．２９）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
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