組換型スクロースシンターゼを作製する方法、スクロース測定キットの作製におけるその使用、ＡＤＰグルコースを作製する方法、並びに、高濃度のＡＤＰグルコース及びデンプンを蓄積する葉及び貯蔵器官を有するトランスジェニック植物を得る方法
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株においてスクロースシンターゼをコードする遺伝子を発現させることにより、大量の活性型の可溶性組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）を効率的に作製するための方法に関する。発現ベクターの使用により、このようにして作製された組換型ＳＳがその迅速な精製を容易にするヒスチジン末端を有することが可能となる。さらに、本発明は、ＡＤＰＧの作製に適したＳＳのアイソフォームをコードする、ＳＳ遺伝子の変異型の配列にも関する。本発明は、組換型ＳＳの野生型及び変異型を用いた、ＡＤＰＧ及びＵＤＰＧを作製するための効率的な方法にも関する。本発明はさらに、スクロース測定試験装置を作製するためのＳＳの使用にも関する。最後に、本発明は、構成的に又はその貯蔵器官若しくは葉中でＳＳ遺伝子を過剰発現し、ＳＳの高いＡＤＰＧ合成活性の寄与により、（葉と貯蔵組織の双方において）高濃度のスクロース、ＡＤＰＧ、Ｇ６Ｐ、及びデンプンを有するトランスジェニック植物を得る方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の適切な株を使用することによる、可溶性且つ活性型の組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）作製の最適化、スクロース測定用のキットを作製するためのＳＳの使用、ＡＤＰグルコース（ＡＤＰＧ）合成用のＳＳの最適化された型の設計、並びに、ＳＳを過剰発現する植物における細胞質ゾルＡＤＰＧの過剰産生の結果として高レベルのＡＤＰＧ及びアミロース含量が増加したデンプンを蓄積する葉及び貯蔵組織を有するトランスジェニック植物の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは、植物における炭水化物の主要な貯蔵形態である。デンプンは、種子（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンドウマメなど）や塊茎（特にジャガイモ及びヤムイモ）などの器官に大量に蓄積し、また、ヒトの食物の基本的な構成成分である。さらに、デンプンは、製紙工業、化粧品工業、製薬工業、及び食品工業において幅広く使用されており、また、生分解性プラスチック及び環境に優しい塗料の製造に不可欠な成分としても使用されている。デンプンは、共有結合したグルコース分子から構成されているため、この多糖類の合成に関与するプロセスを調査することが、工業生産の様々な領域における最優先事項である。
【０００３】
ＡＤＰＧは、従属栄養的な器官（図１Ａ）及び葉（図２Ａ）の双方において、植物におけるデンプン生合成の共通の前駆体であり、ＡＤＰＧの産生は、酵素ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）又はＡＤＰＧシンターゼ（ＥＣ２．７．７．２７）によって専ら制御されていると一般に考えられている（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）。植物で産生されるデンプンの様々な用途は、デンプン粒の構造、並びに水性懸濁液中でのその粘度を決定する、アミロースとアミロペクチンの比率に主に基づいている。アミロースとアミロペクチンの比率は、特に、植物細胞中のＡＤＰＧの濃度に依存している（Ｃｌａｒｋｅ，Ｂ．Ｒ．、Ｄｅｎｙｅｒ，Ｋ．、Ｊｅｎｎｅｒ，Ｃ．Ｆ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．（１９９９年）、「デンプン合成速度、アデノシン５’−ジホスホグルコース濃度、及び発育中のエンドウマメ胚におけるデンプンのアミロース含有量の関係（Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔｈｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｐｅａ ｅｍｂｒｙｏｓ）」Ｐｌａｎｔａ ２０９、３２４〜３２９頁）。
【０００４】
ＳＳ（ＥＣ２．４．１．１３、ＳＳ）（ＵＤＰ−グルコース：Ｄ−フルクトース−２−グルコシルトランスフェラーゼ）は、スクロース及びＵＤＰからのＵＤＰＧ及びフルクトースの生成を触媒する可逆的酵素である。図１Ａで示すように、ＳＳは、その代謝プロセスが内胚乳や塊茎などの従属栄養組織中でのデンプンの産生を最終的にもたらす、ＵＤＰＧを生成する役割を有すると従来考えられていたが（Ｚｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．、Ｓａｌａｎｏｕｂａｔ，Ｍ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（１９９５年）、「トランスジェニックジャガイモ植物による、シンク強度に対するスクロースシンターゼの非常に重要な役割の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｎｋ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」 Ｐｌａｎｔ Ｊ．７ ９７〜１０７頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（２００３年８月）、「デンプン分野における新しい波（Ｎｅｗ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｆｉｅｌｄ）」Ｌｅｔｔ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４〜３２頁））、この酵素が、対応する糖ヌクレオチドを生成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで他のヌクレオチド２リン酸を使用する潜在的な能力に関する参考文献がある（Ｍｕｒａｔａ，Ｔ．、Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．、Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９６６年）、「成熟中の米粒におけるデンプン合成の酵素機序。スクロースからデンプンへの変換の機序（Ｅｎｚｙｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｒｉｃｅ ｇｒａｉｎｓ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１３、３４〜４４頁；Ｄｅｌｍｅｒ，Ｄ．Ｐ．（１９７２年）「暗所で黄化させたリョクトウ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ）芽生えに由来するスクロースシンターゼの精製及び諸特性（Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｅｔｉｏｌａｔｅｄ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７、３８２２〜３８２８頁）。生理的な関連性には疑問があるが、（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁）、ＳＳが、従属栄養組織においても光合成組織においてもデンプン産生用に使用され得るＡＤＰＧを直接生成できることが示唆されている（図１Ｂ及び２Ｂ）（Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｐｅｒａｔａ，Ｐ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９年）、「植物の従属栄養組織におけるスクロースからデンプンへの変換（Ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１８、４８９〜５２５頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００１年）、「光合成組織におけるデンプン生合成の現在有力なモデルの再評価：スクロースシンターゼによる細胞質ゾルでのＡＤＰグルコース生成及び葉緑体におけるデンプンのサイクル状の代謝回転の出現に関する提案（Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４２、１３１１〜１３２０頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｍｏｒａｎ−Ｚｏｒｚａｎｏ，Ｍ．Ｔ．、Ｖｉａｌｅ，Ａ．Ｍ．、Ａｌｏｎｓｏ−Ｃａｓａｊｕｓ，Ｎ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００４年）、「デンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの大半は、ソース葉の葉緑体の外部に存在している（Ｍｏｓｔ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｃｃｕｒｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１、１３０８０〜１３０８５頁）。（専ら、また状況に応じて生化学的な証拠に基づく）この仮説によれば、ＳＳは、デンプンの生合成に必要なＡＤＰＧ分子の重要なプールの合成を司っている。しかし、この仮説は遺伝子工学又は従来の作物改良技術により実験的に実証されておらず、また、ＡＧＰアーゼが植物における唯一のＡＤＰＧ供給源であることを示す、遺伝子及び分子的な数え切れないほどの試験結果と一致していない（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）。
【０００５】
ＵＤＰＧやＡＤＰＧなどの糖ヌクレオチドは、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）と呼ばれる高価な物質の使用に基づき、それぞれＵＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＵＧＰアーゼ）やＡＧＰアーゼなどの酵素によって触媒されるピロホスホリラーゼ反応により商業的に製造されている。糖ヌクレオチドを作製するためのこの手法の代替手法はＳＳの使用に基づいているが、代替手法の発展は、多数の真核生物タンパク質を発現し効率的にプロセッシングするための大腸菌の制約により大きく妨げられている。この制約に触発されて、一部の研究者は、酵母など真核生物タイプの生物工場を使用することにより組換型ＳＳを作製した（Ｚｅｒｖｏｓｅｎ，Ａ．、Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（１９９８年）、「組換型スクロースシンターゼの応用−ＡＤＰ−グルコースの大量合成（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ５、２５〜２８頁；Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）から得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）。或いは、糖ヌクレオチドを作製するためのＳＳは、植物抽出物からタンパク質を精製する高価なプロセスによって精製しなければならなかった（特許ＤＥ４２２１５９５（１９９３年）、「ヌクレオチドにより活性化された糖又はオリゴ糖の作製に有用な精製されたスクロースシンターゼ酵素（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｕｇａｒｓ ｏｒ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」。植物抽出物から得られるこのＳＳには、ＵＤＰを好み、ＡＤＰに対する親和性が非常に低いという不都合がある（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁））。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からの組換型ＳＳの作製が最近実現された（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ−Ｑ．、Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｒ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｆ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「リョクトウスクロースシンターゼのスクロースに対する見かけの親和性の増大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのリン酸化又はＳｅｒ１１の特異的変異誘発によって引き起こされる（Ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｆ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｒ１１）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１３３７〜１３４１頁；Ｂａｒｒａｔｔ，Ｄ．Ｈ．Ｐ．、Ｂａｒｂｅｒ，Ｌ．、Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．、Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｌ．、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．（２００１年）、「エンドウマメスクロースシンターゼの多数の異なるアイソフォーム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ，ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｐｅａ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７、６５５〜６６４頁；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，Ｂ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｂ．、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｈ．「細菌のスクロースシンターゼ組成物及び使用方法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ）」特許ＷＯ９８０３６３７）。しかし、この原核生物系におけるＳＳの作製には、以下のような問題が伴っていた。即ち、（１）作製されるＳＳの量が非常に少ない（細菌１グラム当たり３０マイクログラム（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）から得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）、（２）得られた活性ＳＳの量が非常に少なく、又はゼロであった（０．０５〜１．５ユニット／ｍｇ（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）；５．６ Ｕ／ｍｇ（Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁））、（３）組換型ＳＳは、クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などタンパク質を精製する従来の方法によって精製されなければならなかった。これらの方法は併用すると費用がかかり、また、均一な状態のタンパク質精製を保証するものではない、（４）細菌を用いた仕組みではタンパク質を正しく折り畳むことができないため、ＳＳの大半は封入体に送られ、又は不活性な凝集体の形で蓄積される（Ｍｉｒｏｕｘ，Ｂ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９６年）「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生：いくつかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする変異宿主（Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｍｕｔａｎｔ ｈｏｓｔｓ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、２８９〜２９８頁）、という諸問題があった。
【０００６】
本発明は、大腸菌の適切な株の使用、並びに、活性型の組換型ＳＳの様々な変異体の大量作製及び迅速且つ容易な精製を可能にする適切なベクターの使用に基づく系の開発を説明する。これらの変異体のうちのいくつかは、植物抽出物から得られる酵素よりＡＤＰに対する親和性がより大きく、スクロース、ＵＤＰ、及びＡＤＰなど安価な物質からＵＤＰＧ及びＡＤＰＧの双方を作製するのに使用することができる。
【０００７】
クロマトグラフィー技術は、植物抽出物、血清、尿、果汁、ブドウ酒、果実、食料品など複雑なサンプルのスクロース含有量を測定するための強力な手法となる（Ｄ’Ａｏｕｓｔ，Ｍ−Ａ．、Ｙｅｌｌｅ，Ｓ，Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．（１９９９年）、「トマトフルーツのスクロースシンターゼのアンチセンス阻害により、結実及び幼果のスクロースアンローディング能力が低減される（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｒｕｉｔ ｓｅｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｕｎｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ｆｒｕｉｔ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１、２４０７〜２４１８頁；Ｔａｎｇ，Ｇ−Ｑ．、Ｓｔｕｒｍ，Ａ．（１９９９年）、「ニンジンのスクロースシンターゼのアンチセンス抑制は、スクロース分配ではなく成長に影響を及ぼす（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ ａｆｆｅｃｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１、４６５〜４７９頁；Ｆｒｉａｓ，Ｊ．、Ｐｒｉｃｅ，Ｋ．Ｒ．、Ｆｅｎｗｉｃｈ，Ｇ．Ｒ．、Ｈｅｄｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｈ．、Ｖｉｄａｌ−Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ｃ．（１９９６年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ７１９，２１３〜２１９頁）。このような技術は、高度に専門的な技術者を必要とし、また、設備に多額の投資を要する。あいにく、酵素インベルターゼの作用によるスクロース分子の加水分解、並びにそれに続くグルコース及び／又はフルクトース分子の分光光度的若しくは蛍光定量的測定に基づく代替方法（Ｓｗｅｅｔｌｏｖｅ，Ｌ．Ｊ．、Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｍ．、ａｐ Ｒｅｅｓ，Ｔ．（１９９６年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼを増大させたトランスジェニックジャガイモの塊茎におけるデンプン代謝（Ｓｔａｒｃｈ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｕｂｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２０、４９３〜４９８頁；Ｓｔｉｔｔ，Ｍ．、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．、Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．、Ｈｅｌｄｔ，Ｈ．Ｗ．（１９８９年）、「植物の葉の特定の細胞及び細胞内コンパートメントにおける代謝レベル（Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｅａｖｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７４、５１８〜５５２頁；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｗ．（１９９７年）、「スクロースを測定するために共役させた酵素アッセイ（Ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ）」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４、１０３〜１０９頁；分析方法（１９９６年）、「果実及び野菜果汁評価の実施要綱（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ ａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｊｕｉｃｅｓ）」欧州経済共同体の欧州果汁協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆ Ｊｕｉｃｅｓ ａｎｄ Ｎｅｃｔａｒｓ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ））は、サンプル中に存在する内因性グルコース及び／又はフルクトースに対応する測定値の控除など技術的性質の限界の影響を受ける。サンプル中に多量のグルコース及び／又はフルクトースが存在すると、信頼がおけ、且つ正確なスクロースの測定を妨げるバックグラウンドノイズが加えられることがある。大多数の場合では、サンプルの真のスクロース含有量に関する信頼のおける申告を発表する前に、徹底的な管理を実施する必要がある（Ｗｏｒｒｅｌｌ，Ａ．Ｃ．、Ｂｒｕｎｅａｕ，Ｊ−Ｍ．、Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，Ｋ．、Ｂｏｅｒｓｉｇ，Ｍ．、Ｖｏｅｌｋｅｒ，Ｔ．Ａ．（１９９１年）、「トウモロコシのスクロースリン酸シンターゼをトマトにおいて発現させると葉の糖分配が変化する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｉｚｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ａｌｔｅｒｓ ｌｅａｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３、１１２１〜１１３０頁）。インベルターゼの使用に基づくスクロース測定キットは、Ｓｉｇｍａ社、Ｂｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ社、及びＭｅｇａｚｙｍｅ社などの会社から入手可能である。或いは、細菌由来のスクロースホスホリラーゼの作用によって遊離されるグルコース−１−リン酸の測定に基づく、スクロースの自動測定法も開発されている（Ｖｉｎｅｔ，Ｂ．、Ｐａｎｚｉｎｉ，Ｂ．、Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．、Ｍａｓｓｉｃｏｔｔｅ，Ｊ．（１９９８年）、「血清及び尿中のスクロースを測定するための自動酵素アッセイ、並びに胃損傷のマーカーとしてのその使用（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｄａｍａｇｅ）」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４、２３６９〜２３７１頁）。本発明は、ＳＳ、及びＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを加水分解する共役酵素の使用に基づく、サンプル中のスクロース測定用の単純且つ信頼がおけ、安価な代替方法の開発を説明する。
【０００８】
ＡＤＰＧの細胞内レベルを決定する因子に関する考察は、主に、合成酵素ＡＧＰアーゼの調節を中心としてきた（Ｐｒｅｉｓｓ（１９８８年）、「デンプンの生合成及びその調節（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ．Ｖｏｌ．１４、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１８２〜２４９頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｐｅｒａｔａ，Ｐ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９年）、「従属栄養組織におけるスクロースからデンプンへの変換（Ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ）」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１８、４８９〜５２５頁）。実際に、ＡＤＰＧの作製、及び工業的利益を有するデンプンを産生する植物の作製に関する特許及び科学論文の多くは、ＡＧＰアーゼの使用を中心としている（Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｓｌａｔｔｅｒｙ，Ｃ．Ｊ．、Ｋａｖａｋｌｉ，Ｈ．、Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（２０００年）「量を増やし質を高めるためのデンプン改変（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔａｒｃｈ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．５、２９１〜２９８頁）。しかし、生化学的な最近の科学調査は、まだ遺伝子／分子的な証拠によって確認されていないものの、図１Ｂ及び２Ｂで示すように、ＳＳが、デンプンの生合成に必要なＡＤＰＧの直接合成に関与している可能性があることを示唆している（Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁）。この仮説は、（ａ）ＳＳは、葉におけるデンプン産生に関係があるとされたことがこれまでなかったこと、（ｂ）ＳＳによって生成されたＡＤＰＧの細胞質ゾル中のプールをプラスチド内に存在するデンプン合成酵素に連結するＡＤＰＧ輸送体の存在が、プラスチドの膜において必要とされること、（ｃ）ＳＳがＡＤＰＧを生成する供給源として関与することは、ＡＧＰアーゼが唯一のＡＤＰＧ供給源であることを示すと考えられる、生化学／遺伝子／分子的な多くの試験結果と直接的に矛盾していること（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）を踏まえて、特に物議をかもしている。おそらくはこれらすべての理由から、今日まで、高レベルのデンプンを製造するために、ＳＳを過剰発現する植物が設計されたことはなかった。しかし、本発明は、ＡＤＰＧ及びデンプンの生成を増大させるためにＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の作製を初めて説明する。逆に言えば、本発明者らは、ＡＧＰアーゼが無いためにデンプンを欠く植物が正常なＡＤＰＧレベルを有していることを示す。これはすべて、図１Ｂ及び２Ｂで示すように、ＳＳが、デンプンの生合成に必要とされるＡＤＰＧの直接的な合成に関与しており、また、植物細胞中で蓄積されるＡＤＰＧの大半の合成を司っていることを示す。
【０００９】
様々な研究は、ＳＳは貯蔵組織におけるＵＤＧＰの合成に関与している（しかし、ＡＤＰＧの合成には関与していない）とする図１Ａに示す手法に基づいているが、ＳＳの活性が低減された結果としてデンプン含有量が低減した植物の作製を説明している（Ｃｈｏｕｒｅｙ，Ｐ．Ｓ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｏ．Ｅ．（１９７６年）、「トウモロコシのしわ型（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）−１変異によって条件づけられる酵素欠陥（Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．１４、１０４１〜１０５５頁；Ｚｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．、Ｓａｌａｎｏｕｂａｔ，Ｍ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（１９９５年）、「トランスジェニックジャガイモ植物による、シンク強度に対するスクロースシンターゼの非常に重要な役割の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｎｋ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」 Ｐｌａｎｔ Ｊ．７、９７〜１０７頁；Ｔａｎｇ，Ｇ−Ｑ．、Ｓｔｕｒｍ，Ａ．（１９９９年）、「ニンジン（Ｄａｎｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．）のスクロースシンターゼのアンチセンス抑制は、スクロース分配ではなく成長に影響を及ぼす（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ（Ｄａｎｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．）ａｆｆｅｃｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１、４６５〜４７９頁）。この点で、図１Ｂ及び２Ｂに示す代謝スキームに従ってＡＤＰＧのレベルが増大した結果としてデンプン含有量の多い植物を作製するためにＳＳの過剰発現を使用し得るという実験的証拠はない。しかし、細胞壁の多糖類を生合成するための前駆体分子（ＵＤＰＧ）を生成するＳＳの能力に基づいて、ＳＳの過剰発現の結果として繊維含有量の多いワタ植物又はセルロース含有量の多い穀粒の作製を説明した研究が公表され、また、特許権を与えられている（Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｈ．Ｊ．、Ｘｉａｍｏｍｕ，Ｎ．、Ｋａｎｗａｒｐａｌ，Ｓ．「茎及び穀粒の質を改善するためのスクロースシンターゼ遺伝子の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｔａｌｋ ａｎｄ ｇｒａｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ）」特許ＷＯ０２０６７６６２；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｆ．、Ｄａｎｎｙ，Ｌ．、Ｙｏｎｇ−Ｌｉｎｇ，Ｒ．「植物組織におけるスクロースシンターゼ遺伝子発現の改変及びその用途（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｆｏｒ）」特許ＷＯ０２４５４８５；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，Ｂ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｂ．、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｈ．「細菌のスクロースシンターゼ組成物及び使用方法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ）」特許ＷＯ９８０３６３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、第１に、大腸菌の適切な株の使用並びにヒスチジン末端を有する組換型ＳＳの獲得を可能にする発現ベクターの使用に基づき、可溶性であり、容易に精製可能であり、且つ、高い比活性を有する組換型ＳＳを大量に作製する方法の開発及び最適化に関する。本発明はさらに、ＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを代謝する酵素と共役させたＳＳ活性を有する酵素製品の使用に基づくスクロース測定用キットを作製するために従う手順にも関する。本発明はさらに、この目的のために特別に設計したＳＳの変異体から始める、ＡＤＰＧやＵＤＰＧなどの糖ヌクレオチド作製の最適化にも関する。最後に、ＳＳの過剰発現後の、スクロース、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高いトランスジェニック植物の設計についての詳細を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＳＳをコードするｃＤＮＡの増幅
野生型スクロースシンターゼＳＳ４のヌクレオチド配列が分かっているので（Ｆｕ，Ｈ．、Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９５年）「シンク及び維管束に関連したスクロースシンターゼ機能は、ジャガイモにおいて様々な遺伝子クラスにコードされている（Ｓｉｎｋ− ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７、１３６９〜１３８５頁）、遺伝子の５’末端及び３’末端に対応する２種の特異的プライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のｃＤＮＡライブラリーから、ＳＳＸと呼ばれる２４１８塩基対のＤＮＡ断片を従来のＰＣＲ技術によって増幅した。このＰＣＲ断片をｐＳＫブルースクリプトプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入して、ｐＳＳ構築物（図３Ａ）を作製し、宿主細菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ中で増幅させた。
【００１２】
大腸菌の特殊株からの活性な組換型ＳＳの作製
ｐＳＳを制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化した。（ＳＳ、ＳＳＸをコードするｃＤＮＡを含む）遊離された断片を、組換えタンパク質と融合されるヒスチジンに富む配列をコードしているヌクレオチド配列をポリリンカー領域に有するｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）（図３Ｂ）の同じ制限酵素部位にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＥＴ−ＳＳと呼ぶ、図３Ｃ）をエレクトロポレーションによって大腸菌の様々な株に挿入した。ｐＥＴ−ＳＳで形質転換した大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、２００３年１０月２９日に、ブルハソート（Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ）４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号ＣＥＣＴ：５８５０で寄託した。これらの細菌をＬＢ培地中、２０℃でインキュベートした。２０℃で増殖させた細胞培養物１００ｍＬに１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、ＳＳＸの過剰発現を誘導した。培養物を誘導した６時間後に、細菌を回収し、４ｍｌの結合緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈｉｓ結合精製キット）中に再懸濁し、次いで、超音波処理し、４０，０００ｇで２０分間遠心分離した。Ｎ末端にヒスチジン残基に富んだアミノ酸配列を有する組換型ＳＳを含む上清を、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のＨｉｓ結合タンパク質精製キットのアフィニティーカラムに通した。キットに付属している取扱い説明書に従って、１モルの代わりに２００ｍＭのイミダゾールを含有する、推奨される溶出緩衝液６ｍｌでＳＳを溶出させた。溶出後、そのタンパク質を直ちに透析にかけて、ＳＳを不可逆的に不活性化する微量のイミダゾールを除去した。
【００１３】
ＡＤＰＧ作製のために最適化したＳＳのアイソフォームの作製
適切なプライマーを用い、ｐＳＳを鋳型として、突然変異させた変異体ＳＳ５を設計して構築物ｐＳＳ５を作製した。これは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＳＳ５を消化した。（ＳＳ５を含む）遊離された断片を、ｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミドの同じ制限酵素部位にクローニングしてｐＥＴ−ＳＳ５を作製し、エレクトロポレーションによってそれを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）中に挿入した。ｐＳＳ５で形質転換した大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを、２００３年１０月２９日に、ブルハソート４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８４９で寄託した。
【００１４】
ＳＳ４を過剰発現するトランスジェニック植物の作製
本発明では、（ａ）構成的に、（ｂ）葉で特異的に、（ｃ）塊茎などの貯蔵器官で特異的に、ＳＳを過剰発現させた。
【００１５】
ＳＳを構成的に過剰発現する植物を作製するために、タバコモザイクウイルスの３５Ｓ構成的プロモーターの作用によって制御される構築物を作製した。ＳＳＸの５’及び３’領域の３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーターをｐＳＳに連続的に挿入することにより、プラスミドｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを作製した。このプラスミドの制限地図を図４Ｂに示す。
【００１６】
アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を介してこの構築物を植物のゲノムに移行できるようにするには、最初に、この構築物をバイナリープラスミド中にクローニングしなければならない。このために、酵素ＮｏｔＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩでｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを連続的に消化し、予め酵素ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩで連続的に消化しておいたバイナリープラスミドｐＢＩＮ２０（図４Ａ）（Ｈｅｎｎｅｇａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｄａｎｎａ，Ｋ．Ｊ．（１９９８年）「ｐＢＩＮ２０：アグロバクテリウムを介した形質転換のために改良したバイナリーベクター（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１６、１２９〜１３１頁）内にクローニングした。このようにして得られたプラスミドをｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳと呼んだ（図４Ｃ）。
【００１７】
光を照射された葉において特異的にＳＳを過剰発現するために、ＰＣＲを使用して、タバコのＲＵＢＩＳＣＯ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）の小サブユニットをコードしている遺伝子の（ＲＢＣＳと呼ばれる）プロモーター領域を増幅した（Ｂａｒｎｅｓ，Ｓ．Ａ．、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｓ．、Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｃ．（１９９４年）「トランスジェニックタバコ中の葉緑体のリン酸輸送体量の変化は、デンプンと糖との同化産物の分配に影響を及ぼす（Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｓｕｇａｒ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６、１１２３〜１１２９頁）。（光合成的に活性な細胞での特異的な発現を与える）このヌクレオチド配列を、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に挿入して、ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍを作製した（図５Ａ）。この構築物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、遊離された断片をｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳの対応する制限酵素部位中にクローニングして、ｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製した（図５Ｂ）。ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＮｏｔＩで連続的にこの構築物を消化した。遊離された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＥｃｏＲＩで連続的に消化したｐＢＩＮ２０中にクローニングした。得られた構築物をｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳと呼んだ（図５Ｃ）。
【００１８】
大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中で増幅させた後、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ及びｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳの双方をＡ．チュメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８：ＧＶ２２６０中に挿入した（Ｄｅｂｌｅａｒｅ，Ｒ．、Ｒｙｔｅｂｉｅｒ，Ｂ．、ｄｅＧｒｅｖｅ，Ｈ．、Ｄｅｂｒｏｅｃｋ，Ｆ．、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．、ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．、Ｌｅｅｍａｎｓ，Ｊ．（１９８５年）「植物へのアグロバクテリウムを介した遺伝子導入の効率的なオクトピンＴｉプラスミド由来ベクター（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｃｔｏｐｉｎｅ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、４７７７〜４７８８頁）。Ａ．チュメファシエンスは、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネなどの種を従来技術によって形質転換するのに使用されている（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．、Ｆｒｙ，Ｊ．Ｅ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．Ｌ．、Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ，Ｄ．、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．、Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．（１９８５年）「植物中に遺伝子を導入するための簡易で一般的な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１２２９〜１２３１頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｈｏｕｌｎｅ，Ｇ．、Ｓｃｈａｎｔｚ，Ｒ．、Ｃｈａｍａｒｒｏ，Ｊ．（２００１年）「アグロバクテリウムを介した形質転換のための、トマト及びコショウ芽生えの外植片の再生促進（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｐｅｐｐｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．６７、１７３〜１８０頁；Ｈｉｅｉ，Ｙ．、Ｏｈｔａ，Ｓ．、Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．、Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ．Ｔ．（１９９４年）「アグロバクテリウムによって媒介されるイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）の効率的な形質転換、及びＴ−ＤＮＡの境界の配列解析（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ）」Ｐｌａｎｔ Ｊ．６、２７１〜２８２頁）。ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳで形質転換させたＡ．チュメファシエンスＣ５８：ＧＶ２２６０の株を、２００３年１０月２９日に、ブルハソート４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８５１で寄託した。
【００１９】
スクロース測定用のアッセイキットの作製
スクロース測定用に設計されたキットのうちの１つを、スクロースから糖ヌクレオチドへの変換、また、それに続く糖ヌクレオチドからグルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変換に基づいてスクロースを分光光度的／蛍光定量的に測定するためのキットに含まれる酵素反応に関する以下のスキームＩに示す。
【化１】
【００２０】
このキットは、当モル量のフルクトース及び対応する糖ヌクレオチドを遊離する、ヌクレオチド２リン酸（例えば、ＵＤＰ又はＡＤＰ）の存在下でのスクロース分子に対するＳＳの作用に基づいている。この反応の結果として生じる糖ヌクレオチドがＵＤＰＧである場合、ＮｕｄｉｘタイプのＵＤＰＧピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．４５）（Ｙａｇｉ，Ｔ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｒ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）「ＵＤＰ−グルコースのピロリン酸結合を切断する哺乳動物のＮｕｄｉｘ加水分解酵素様の酵素のクローニング、発現、及び性質決定（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎｕｄｉｘ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ−ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃｌｅａｖｅｓ ｔｈｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｏｎｄ ｏｆ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０、４０９〜４１５頁）やＵＤＰＧ加水分解酵素（Ｂｕｒｎｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｅａｃｈａｍ，Ｉ．Ｒ．（１９８６年）「ペリプラズムのＵＤＰ−糖加水分解酵素（５’−ヌクレオチダーゼ）をコードしている大腸菌ｕｓｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び転写解析：ｕｓｈＡ遺伝子の制御、並びにコードされているタンパク質産物のシグナル配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｈＡ ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｓｈＡ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４、４３２５〜４３４２頁）などＵＤＰＧの加水分解酵素の作用をこのＵＤＰＧに受けさせる。これらの加水分解酵素の作用によって遊離されたＧ１Ｐをホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）の作用によって変換して、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生じさせる。次に、酵素Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の作用によって、このＧ６ＰをＮＡＤ（Ｐ）＋とカップリング反応させて、蛍光測定法及び３４０ｎｍでの分光測定によって容易に測定可能な６−ホスホグルコン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させることができる。次に、遊離されたＮＡＤ（Ｐ）ＨをＦＭＮ−オキシドレダクターゼ／ルシフェラーゼの作用と共役させて、分光測定で定量化される光を生じさせることができる。
【００２１】
別法として、スキームＩＩに示すように、生成されるＵＤＰＧを、蛍光測定法又は３４０ｎｍでの分光測定によって測定可能な当モル量のＵＤＰ−グルコン酸及びＮＡＤＨをＮＡＤの存在下で生成させるＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２）と共役させることもできる。次に、遊離されたＮＡＤＨをＦＭＮ−オキシドレダクターゼ／ルシフェラーゼの作用と共役させて、分光測定で定量化される光を生じさせることができる。
【化２】
【００２２】
ＳＳによって触媒される反応の生成物がＡＤＰＧである場合、細菌のＡＤＰＧピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．２１）（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｒｕｎａ，Ｂ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｂａｓｔａｒｒｉｃａ−Ｂｅｒａｓａｔｅｇｕｉ，Ａ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｌａｓａ，Ｉ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００１年）「アデノシン２リン酸糖ピロホスファターゼは、大腸菌におけるグリコーゲン生合成を妨げる（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｇａｒ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８，８１２８〜８１３２頁）などのＡＤＰＧ加水分解酵素の作用をこのＡＤＰＧに受けさせる。遊離されたＧ１Ｐをホスホグルコムターゼの作用によって変換して、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生じさせる。次に、酵素Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼの作用によって、このＧ６ＰをＮＡＤ（Ｐ）＋とカップリング反応させて、蛍光測定法及び３４０ｎｍでの分光測定によって容易に測定可能な６−ホスホグルコン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させることができる。
【００２３】
いずれの場合も、ＳＳによって媒介される糖ヌクレオチド生成と共役させた酵素反応のスキームは、アンペロメトリック検出に応用するのに極めて適している。
【実施例】
【００２４】
ジャガイモのＳＳのアイソフォームをコードしているｃＤＮＡを適切な発現ベクター及び活性型の酵素の作製及び蓄積用に最適化させた大腸菌株においてクローニングするための手順を詳細に示す実施例を以下に説明する。他の実施例では、植物サンプル、血清、尿、果汁、加糖した果実飲料、清涼飲料水などのスクロース測定用アッセイキットを作製するための組換型ＳＳの使用について説明する。別の実施例では、ＵＤＰＧやＡＤＰＧなどの糖ヌクレオチドの大量作製用に最適化したＳＳの変異体の使用について説明する。最後に、別の実施例では、ＳＳを過剰発現する植物における高いＡＤＰＧ生成活性の結果として、スクロース、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い植物の作製について説明する。
【００２５】
（実施例１）
容易に精製可能であり、且つ、高い比活性を有する、ヒスチジン末端を有する組換型ＳＳの大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）における発現
ジャガイモのＳＳのアイソフォームをコードするＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列が分かっているので、５’から３’の方向に、配列番号１及び配列番号２の配列を有する２種の特異的プライマーを作製することができた。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの塊茎のｃＤＮＡライブラリーから、ＳＳＸと呼ばれるＤＮＡ断片を従来のＰＣＲ法によって増幅し、これをｐＳＫブルースクリプトプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入して、宿主細菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ中で増幅させた。ＳＳＸのヌクレオチド配列は、配列番号３であり、ＳＳ４（ジェンバンクアクセッション番号Ｕ２４０８７）と少し異なっている。配列番号３から演繹されるアミノ酸配列はＳＳ４と少し異なっており、したがって、ＳＳＸと呼ぶ。ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドにおいて配列番号３を発現させた後に演繹されるアミノ酸配列は、配列番号４であり、この配列は、配列番号３から演繹されるアミノ酸配列のアミノ末端に融合された３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む配列を含んでいる。
【００２６】
１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＳＳＸ生成を誘導した。３７℃でさらに６時間培養した後、ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌が凝集型のタンパク質を蓄積し、そのサイズがＳＳに対応することが観察された。しかし、これらの細菌はＳＳ活性を示さなかった。活性型ＳＳの発現の失敗の原因は、大腸菌が一部の高分子量の真核生物タンパク質を正しくフォールディングする際に抱える問題に帰することができる（Ｍｉｒｏｕｘ，Ｂ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９６年）「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生：いくつかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする変異宿主（Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｍｕｔａｎｔ ｈｏｓｔｓ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、２８９〜２９８頁）。この問題を克服することを目指して、他の細菌株において、２０℃の温度で活性ＳＳを作製できるか可能性を調査した。これらすべてにおいて、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してＳＳＸの生成を誘導した。さらに６時間インキュベートした後、細胞を超音波処理し、遠心分離した。得られた上清のＳＳ活性を分析した。図６で示すように、これらの条件では、可溶性の活性ＳＳの生成という観点からすると、ＢＬＲ（ＤＥ３）株が最も効率的であることが判明した。ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、２００３年１０月２９日に、寄託番号ＣＥＣＴ：５８５０でスペイン微生物株保存機関に寄託した。文献（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）で記載されている組換型ＳＳの非常に低い生産性と比べて、ＣＥＣＴ：５８５０のタンパク質プール全体における組換型ＳＳＸの寄与率は、約２０％である。ヒスチジン末端を有する組換えタンパク質が特異的に保持されるＨｉｓ−Ｂｉｎｄアフィニティーカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に上清を通した。精製されたＳＳを溶出させ透析した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／２ｍＭ ＵＤＰともにインキュベートした。ＵＤＰＧの生成に基づいて決定した比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり８０ユニットであり、文献（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁；Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）で記載されている組換型ＳＳの１ｍｇ当たり０．０５〜５ユニットという活性よりはるかに高く、植物抽出物から精製したＳＳに対応する３ユニット／ｍｇよりも大きかった（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁）。ユニットは、１分当たり１マイクロモルのＵＤＰＧ生成を触媒する酵素の量として定義される。５００ｍＭのスクロースが存在する場合のＵＤＰに対する親和力は、Ｋｍ（ＵＤＰ）＝０．２５ｍＭであったのに対し、１ｍＭのＵＤＰが存在する場合、スクロースに対するＫｍは、３０ｍＭであった。ＵＤＰの存在下でのスクロースに対するこの親和性は、酵母で得られた組換型ＳＳによって示される親和性（Ｋｍ＝９５ｍＭ、Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）より有意に高い。
【００２７】
（実施例２）
大腸菌から得た組換型ＳＳの使用に基づくＵＤＰＧ及びＡＤＰＧの大量作製
１Ｍ スクロース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／１００ｍＭ ＵＤＰ、並びにＢＬＲ（ＤＥ３）におけるｐＥＴ−ＳＳの発現及びそれに続く精製後に得たジャガイモの組換型ＳＳの３０ユニットを含有する溶液１００ミリリットルを３７℃で１２時間インキュベートして、高純度のＵＤＰＧ３グラムを効率的且つ経済的に作製した。この溶液を１００℃で９０秒間加熱して反応を終了させ、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を分取スケールＨＰＬＣクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）に添加し、文献で記載されているようにしてＵＤＰＧを精製した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２０００年）「アデノシン２リン酸グルコースピロホスファターゼ：グリコーゲン生合成を妨げる色素体ホスホジエステラーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ａ ｐｌａｓｔｉｄｉａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｈａｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７、８７０５〜８７１０頁）。
【００２８】
ＡＤＰＧの作製には、植物組織から抽出されたＳＳについて記述されているよりずっと高い親和性をＡＤＰに対して有するＳＳの変異型の作製を必要とした（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁）
【００２９】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＳＳＸを点突然変異誘発し、下記の［配列番号５、配列番号６］、［配列番号７、配列番号８］、及び［配列番号９、配列番号１０］の配列を有するプライマー対を連続して使用することによって、ＳＳ５と呼ばれるアイソフォームを得た。ＳＳ５と呼ばれる得られたヌクレオチド配列は、配列番号１１である。（データベース中にある）ＳＳ４（Ｓｕｓｙ４）と比べたＳＳ５（Ｓｕｓｙ５）のアミノ酸配列の変化を表Ｉで網がけにして示す。ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドで配列番号１１を発現させた後に演繹されるアミノ酸配列は配列番号１２であり、この配列は、配列番号１１から演繹されるアミノ酸配列のアミノ末端と融合した３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む配列を含んでいる。
【００３０】
表Ｉは、ＳＳ５のアミノ末端部分に融合した３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む前記配列を含んでいる。
【表１】
【００３１】
ｐＥＴ−ＳＳ５の発現後に得られた組換型ＳＳ５は、ＵＤＰ及びＡＤＰの存在下で、それぞれタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニット及び６５ユニットのＶｍａｘ値を示した。５００ｍＭスクロースの存在下でのＵＤＰ及びＡＤＰに対する親和性は非常に類似していたが（ＡＤＰ及びＵＤＰのいずれに対してもＫｍ＝０．２ｍＭ）、飽和濃度のＵＤＰ及びＡＤＰの存在下でのスクロースに対するＫｍは、それぞれ３０ｍＭ及び１００ｍＭであった。これらの動態パラメータは、ジャガイモ塊茎及び他の植物種の他の器官から抽出されたＳＳについて記載されている値と大きく異なっており、それらの文献によると、酵素のＶｍａｘは、ＡＤＰが存在する場合よりＵＤＰが存在する場合に１０倍高い値となる（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁）。ｐＳＳ５で形質転換させた大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを、スペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８４９で寄託した。
【００３２】
１Ｍ スクロース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／１００ｍＭ ＡＤＰ、並びにＢＬＲ（ＤＥ３）におけるｐＥＴ−ＳＳ５の発現及びそれに続くＨｉｓ結合カラムでの精製後に得たジャガイモの組換型ＳＳの３０ユニットを含有する溶液１００ミリリットルを３７℃で１２時間インキュベートして、高純度のＡＤＰＧ３グラムを効率的且つ経済的に作製した。この溶液を１００℃で９０秒間加熱して反応を終了させ、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ＡＤＰＧを精製するために、上清を分取スケールＨＰＬＣクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）に添加した。
【００３３】
（実施例３）
スクロース測定用酵素キットの作製
スクロースを測定するために、以下の成分及び最終量／濃度を用いて次の反応混液を調製した。
１．糖ヌクレオチドの加水分解酵素の使用に基づくキット
ａ．２ユニットのＳＳ（組換型又は非組換型）
ｂ．２ｍＭのＡＤＰ又はＵＤＰ（それぞれ、ＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを作製するかどうかに応じて）
ｃ．２ユニットのＡＤＰＧピロホスファターゼ又は２ユニットのＵＤＰＧピロホスファターゼ（それぞれ、ＡＤＰ又はＵＤＰの反応混液に含めるかどうかに応じて）
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ
ｈ．予めろ過した試験サンプル
２．ＵＤＰＧデヒドロゲナーゼの使用に基づくキット
ａ．２ユニットのＳＳ（組換型又は非組換型）
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットのＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ
ｄ．０．５ｍＭのＮＡＤ
ｅ．反応緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ
ｆ．予めろ過した試験サンプル
【００３４】
試験サンプル中に存在するスクロース量の測定は、スキームＩ及びＩＩで示される共役反応によって生成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光定量的測定又は分光光度的測定（３４０ｎｍ）に基づいている。
【００３５】
発育の程度が様々なオオムギ種子のスクロース含有量を測定するために（図７）、３７℃で３分間、ＥＬＩＳＡプレートの３００マイクロリットルウェル中で反応を行った。試験サンプルの体積は２０マイクロリットルであり、試薬ａ〜ｇ（キット＃１）及びａ〜ｅ（キット＃２）を組み合わせて得られる反応混液の体積は２８０マイクロリットルであった。ブランクは、ＳＳ以外の反応混液のすべての成分を含んだ。ＭｕｌｔｉＳｋａｎ分光光度計を用いて測定を実施した。タイプ「１」のキットとタイプ「２」のキットのいずれで得られた値も、序論で記述したクロマトグラフィー技術を用いて測定した値と同程度であることが判明した（Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁）。
【００３６】
（実施例４）
ＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の作製
図８〜１０は、構成的（３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ）及び特異的（ＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ）にＳＳを過剰発現するジャガイモ植物の葉で得られた双方の結果を示す。
【００３７】
図８で示すように、これらの植物のいずれかの葉におけるＳＳ活性は、野生型植物（ＷＴ）の同一器官での活性より２〜１０倍高い。これらの葉は、以下の特徴を有した。
１．ＡＤＰＧを生成するＳＳの活性（図８）とデンプン（図９）及びＡＤＰＧ（図１０）レベルとの明確な相関。この特徴は、葉だけでなく、塊茎や種子などの貯蔵組織でも観察された（以下参照）。
２．野生型植物の葉と比べてデンプン含有量が多い（図９）。例えば、２０℃、明期８時間／暗期１６時間の光周期の条件で発育させた「野生型」ジャガイモ植物の葉のデンプン含有量は新鮮重１グラム当たり５マイクロモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の葉では、新鮮重１グラム当たり８マイクロモルである。野生型植物とトランスジェニック植物の差は、明期が長いときに拡大され、その結果、ＳＳを過剰発現する植物の葉は野生型植物の葉の４倍のデンプンを含有する。
３．非形質転換植物の同一の組織又は器官に比べてＡＤＰＧ含有量が多い（図１０）。２０℃、明期８時間／暗期１６時間の光周期の条件で発育させた野生型ジャガイモ植物の葉の平均含有量は新鮮重１グラム当たり０．３５ナノモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現する植物の葉は、新鮮重１グラム当たり２．５ナノモルの含有量を有し得る。
４．ＡＤＰＧもデンプンも、明期中に一時的蓄積を示す（図１１）。どちらの物質の蓄積速度もＳＳ活性との間に正の相関があり、このことは、デンプン生合成の「従来の」モデル（図２Ａ）によって示されている内容とは異なり、また、図２Ｂに示す「代替の」モデルの仮説を確認するものであり、ＳＳがＡＤＰＧの生成、及びスクロース代謝とデンプン代謝の連結において基本的な役割を果たしていることを示唆している。
５．グルコースやフルクトースなどの可溶性糖は通常レベルである。しかし、トランスジェニックの葉におけるグルコース−６−Ｐ及びスクロースのレベルは、野生型ジャガイモの葉で観察されるそれらのレベルより高い（表２）。
【００３８】
表２：対照植物（ＷＴ）及び３５Ｓ−ＳｕＳｙ−ＮＯＳ由来の葉における代謝産物のレベル（新鮮重１ｇ当たりのｎモルで示す）。ＷＴで観察される値と有意に異なる値を太字で示す。
【表２】
６．ＳＳを過剰発現する植物の外部形態は、非形質転換植物と比較した場合、異常ではない。
【００３９】
図１２〜１４は、ＳＳを構成的に過剰発現するジャガイモ塊茎で得られた結果を示す（３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ）。これらの結果は、特異的な塊茎プロモーター（パタティナ（ｐａｔａｔｉｎａ）遺伝子のプロモーター）の制御下でＳＳを過剰発現する塊茎で観察される結果とほぼ同一である。
【００４０】
図１２で示すように、これらの植物のいずれかの塊茎におけるＳＳ活性は、野生型植物の同一器官での活性より？倍高い。これらの塊茎は、以下の特徴を有した。
１．ＡＤＰＧを生成するＳＳの活性（図１２）とデンプン（図１３）及びＡＤＰＧ（図１４）レベルとの明確な相関。
２．非形質転換植物の塊茎と比べてデンプン含有量が多い（図１３）。例えば、「野生型」植物の塊茎のデンプン含有量は新鮮重１グラム当たり約３００マイクロモル（新鮮重１グラム当たり５４ｍｇのデンプンに相当）であるのに対し、ＳＳを過剰発現する塊茎では、新鮮重１グラム当たり４５０〜６００マイクロモルである。
３．野生型植物の塊茎と比べてＡＤＰＧ含有量が多い（図１４）。野生型塊茎の平均含有量は新鮮重１グラム当たり５ナノモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現する塊茎は、新鮮重１グラム当たり７〜９ナノモルの含有量を有し得る。
【００４１】
イネの種子、トマト、及びタバコの葉、並びにトマトで得られた結果は、図８〜１４で示す結果と質的に同様である。すべての事例で、デンプン含有量の増加及びアミロース／アミロペクチン比の上昇がみとめられた。
【００４２】
ＳＳの過剰発現によりＡＤＰＧ及びデンプンの含有量が多い植物が得られることは、（図１Ａ及び２Ａに例示した）デンプン生合成の現在の概念によっては全く予想されず、おそらくは、ＳＳを過剰発現する植物の設計が、デンプン産生を増大させる戦略としてなぜこれまで採用されなかったかを説明する結果である。この研究に基づいて得られた結果は、ＡＧＰアーゼではなくＳＳが、植物中で蓄積するＡＤＰＧの基本的供給源であることを示唆している。いまだ通用しているモデルによれば、ＡＧＰアーゼはＡＤＰＧの唯一の供給源である。しかし、意外にも、ＡＧＰアーゼ欠損植物のＡＤＰＧレベルはこれまで調査されていなかった。本発明者らの発明の有意性を調査するために、本発明者らは、ＡＧＰアーゼ活性を低減させたシロイヌナズナ及びジャガイモ植物におけるＡＤＰＧ及びデンプンのレベルを初めて分析した。図１５Ａで示すように、ＡＧＰアーゼ欠損ＴＬ２５シロイヌナズナ植物のデンプンレベル（Ｌｉｎ，Ｔ．Ｐ．、Ｃａｓｐａｒ，Ｔ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．Ｒ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．（１９８８年）「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ活性を欠くシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のデンプンを含まない変異体の単離及び性質決定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔａｒｃｈｌｅｓｓ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｌａｃｋｉｎｇ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８、１１３１〜１１３５頁）は、ＷＴ植物で観察されるレベルより低い。しかし、ＡＤＰＧのレベルは正常である（図１５Ｂ）。一方、ＡＧＰ６２及びＡＧＰ８５ジャガイモ植物のデンプンレベル（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁）は、野生型植物の葉で観察されるデンプンレベルに比べて低減されている（図１６Ａ）。しかし、ＡＤＰＧのレベルは全く正常である（図１６Ｂ）。総合すると、これらの観察結果は、（ａ）ＡＧＰアーゼではなくＳＳが、植物におけるＡＤＰＧの主要供給源であることを示し、（ｂ）ＳＳの過剰発現によりデンプン含有量の多い植物が得られることを実証し、本発明者らの発明の有意性を強調している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】従属栄養的な器官におけるデンプン生合成の機序を表す図である。（Ａ）ＳＳはＵＤＰＧの生成に関与し、そのＵＤＰＧが、ＵＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＵＧＰアーゼ）、細胞質ゾルホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、色素体ホスホグルコムターゼ、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）、及びデンプン合成酵素の一連の作用後に、最終的にデンプンに変換されるとする「従来の」機序を表す図である。（Ｂ）ＳＳは、細胞質ゾルにおけるＡＤＰＧの直接的な生成に関与しているとする「代替の」機序を表す図である。その後、ＡＤＰＧは、輸送体の作用によりアミロプラストへと輸送される。アミロプラストの内部に入った後、デンプン合成酵素はデンプンを生成するためにそのＡＤＰＧを利用する。
【図２】葉におけるデンプン生合成の機序を表す図である。（Ａ）デンプン生合成のプロセス全体が葉緑体の内部で起こるとする「従来の」機序を表す図である。この見解によれば、デンプン代謝とスクロースは連結していない。さらに、ＳＳは、糖新生のプロセスに関与していない。（Ｂ）ＳＳは、細胞質ゾルにおけるＡＤＰＧの直接的な合成に関与しているとする、デンプン生合成の「代替の」機序を表す図である。その後、ＡＤＰＧは、色素体の内部へと輸送され、そこで、デンプン合成酵素はデンプン合成反応用の基質としてそのＡＤＰＧを利用する。
【図３Ａ】ｐＥＴ−２８ａ（＋）及びｐＳＳからｐＥＴ−ＳＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図３Ｂ】ｐＥＴ−２８ａ（＋）及びｐＳＳからｐＥＴ−ＳＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ａ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ｂ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ｃ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ａ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ｂ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ｃ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図６】大腸菌の様々な株におけるｐＥＴ−ＳＳの発現を表す。（Ａ）ｐＥＴ又はｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌抽出物のＳＳ活性（細菌タンパク質１ミリグラム当たりのミリユニット（ｍＵ））を表す。この反応は、スクロースを分解し、ＡＤＰＧを生成する方向に起こった。反応混液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ポリエチレングリコール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＫＣ１、及び２ｍＭ ＡＤＰを含有した。反応は３７℃で１０分間行った。（Ｂ）ｐＥＴ及びｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた様々な大腸菌株から得たタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。組換型ＳＳＸの位置をアスターリスクで示している。
【図７】ＳＳ、ＡＤＰＧ（ＵＤＰＧ）ピロホスファターゼ、ＰＧＭ、及びＧ６ＰＤＨの共役反応に基づくキットによる、オオムギ内胚乳の様々な発育段階におけるスクロースの測定を表すグラフである。これらの結果は、ＳＳ及びＵＤＰＧデヒドロゲナーゼの共役反応に基づくキットの使用、並びにＣａｒｂｏ−ＰａｃＰＡ１カラムに連結したＤＸ−５００ Ｄｉｏｎｅｘシステムでのアンペロメトリック検出を伴う高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用によって並行して得られた結果と同一であった。横軸：開花後の日数縦軸：スクロース含有量／内容（μｍｏｌ／ｇＦＷ）
【図８】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のＳＳ活性を表すグラフである。新鮮重１グラム当たりのミリユニット（ｍＵ）で活性を表す。このユニットは、１分当たり１マイクロモルのＡＤＰＧを生成するのに必要とされるＳＳの量として定義される
【図９】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のデンプン含有量を表すグラフである。
【図１０】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のＡＤＰＧ含有量を表すグラフである。
【図１１】ＷＴ植物（●）、３５Ｓ−ＳＳＮＯＳ（■）、及びＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ（▲）の葉における、明期８時間、暗期１６時間の光周期での（Ａ）デンプン及び（Ｂ）ＡＤＰＧの一時的蓄積を表すグラフである。
【図１２】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、再生させた対照（ＲＧ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物（４、５、６、１２系統）の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）ＳＳ活性を表すグラフである。新鮮重１グラム当たりのミリユニット（ｍＵ）で活性を表す。このユニットは、１分当たり１マイクロモルのＡＤＰＧを生成するのに必要とされるＳＳの量として定義される。
【図１３】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、再生させた対照（ＲＧ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物（４、５、６、１２系統）の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）デンプン含有量を表すグラフである。
【図１４】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）ＡＤＰＧ含有量を表すグラフである。
【図１５】ＡＧＰアーゼ欠損シロイヌナズナＴＬ２５の葉のデンプン含有量（Ａ）及びＡＤＰＧ含有量（Ｂ）を表す。
【図１６】ＡＧＰアーゼ欠損ジャガイモＡＧＰ６２及びＡＧＰ８５の葉のデンプン含有量（Ａ）及び（Ｂ）ＡＤＰＧ含有量を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の適切な株を使用することによる、可溶性且つ活性型の組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）作製の最適化、スクロース測定用のキットを作製するためのＳＳの使用、ＡＤＰグルコース（ＡＤＰＧ）合成用のＳＳの最適化された型の設計、並びに、ＳＳを過剰発現する植物における細胞質ゾルＡＤＰＧの過剰産生の結果として高レベルのＡＤＰＧ及びアミロース含量が増加したデンプンを蓄積する葉及び貯蔵組織を有するトランスジェニック植物の作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは、植物における炭水化物の主要な貯蔵形態である。デンプンは、種子（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、エンドウマメなど）や塊茎（特にジャガイモ及びヤムイモ）などの器官に大量に蓄積し、また、ヒトの食物の基本的な構成成分である。さらに、デンプンは、製紙工業、化粧品工業、製薬工業、及び食品工業において幅広く使用されており、また、生分解性プラスチック及び環境に優しい塗料の製造に不可欠な成分としても使用されている。デンプンは、共有結合したグルコース分子から構成されているため、この多糖類の合成に関与するプロセスを調査することが、工業生産の様々な領域における最優先事項である。
【０００３】
ＡＤＰＧは、従属栄養的な器官（図１Ａ）及び葉（図２Ａ）の双方において、植物におけるデンプン生合成の共通の前駆体であり、ＡＤＰＧの産生は、酵素ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）又はＡＤＰＧシンターゼ（ＥＣ２．７．７．２７）によって専ら制御されていると一般に考えられている（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）。植物で産生されるデンプンの様々な用途は、デンプン粒の構造、並びに水性懸濁液中でのその粘度を決定する、アミロースとアミロペクチンの比率に主に基づいている。アミロースとアミロペクチンの比率は、特に、植物細胞中のＡＤＰＧの濃度に依存している（Ｃｌａｒｋｅ，Ｂ．Ｒ．、Ｄｅｎｙｅｒ，Ｋ．、Ｊｅｎｎｅｒ，Ｃ．Ｆ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．（１９９９年）、「デンプン合成速度、アデノシン５’−ジホスホグルコース濃度、及び発育中のエンドウマメ胚におけるデンプンのアミロース含有量の関係（Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔｈｅ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｐｅａ ｅｍｂｒｙｏｓ）」Ｐｌａｎｔａ ２０９、３２４〜３２９頁）。
【０００４】
ＳＳ（ＥＣ２．４．１．１３、ＳＳ）（ＵＤＰ−グルコース：Ｄ−フルクトース−２−グルコシルトランスフェラーゼ）は、スクロース及びＵＤＰからのＵＤＰＧ及びフルクトースの生成を触媒する可逆的酵素である。図１Ａで示すように、ＳＳは、その代謝プロセスが内胚乳や塊茎などの従属栄養組織中でのデンプンの産生を最終的にもたらす、ＵＤＰＧを生成する役割を有すると従来考えられていたが（Ｚｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．、Ｓａｌａｎｏｕｂａｔ，Ｍ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（１９９５年）、「トランスジェニックジャガイモ植物による、シンク強度に対するスクロースシンターゼの非常に重要な役割の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｎｋ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」 Ｐｌａｎｔ Ｊ．７ ９７〜１０７頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（２００３年８月）、「デンプン分野における新しい波（Ｎｅｗ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｆｉｅｌｄ）」Ｌｅｔｔ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４〜３２頁））、この酵素が、対応する糖ヌクレオチドを生成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで他のヌクレオチド２リン酸を使用する潜在的な能力に関する参考文献がある（Ｍｕｒａｔａ，Ｔ．、Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．、Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ，Ｔ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９６６年）、「成熟中の米粒におけるデンプン合成の酵素機序。スクロースからデンプンへの変換の機序（Ｅｎｚｙｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｒｉｃｅ ｇｒａｉｎｓ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１３、３４〜４４頁；Ｄｅｌｍｅｒ，Ｄ．Ｐ．（１９７２年）「暗所で黄化させたリョクトウ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ）芽生えに由来するスクロースシンターゼの精製及び諸特性（Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｅｔｉｏｌａｔｅｄ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７、３８２２〜３８２８頁）。生理的な関連性には疑問があるが、（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁）、ＳＳが、従属栄養組織においても光合成組織においてもデンプン産生用に使用され得るＡＤＰＧを直接生成できることが示唆されている（図１Ｂ及び２Ｂ）（Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｐｅｒａｔａ，Ｐ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９年）、「植物の従属栄養組織におけるスクロースからデンプンへの変換（Ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１８、４８９〜５２５頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００１年）、「光合成組織におけるデンプン生合成の現在有力なモデルの再評価：スクロースシンターゼによる細胞質ゾルでのＡＤＰグルコース生成及び葉緑体におけるデンプンのサイクル状の代謝回転の出現に関する提案（Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｐｒｅｖａｉｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｎｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４２、１３１１〜１３２０頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁；Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｍｏｒａｎ−Ｚｏｒｚａｎｏ，Ｍ．Ｔ．、Ｖｉａｌｅ，Ａ．Ｍ．、Ａｌｏｎｓｏ−Ｃａｓａｊｕｓ，Ｎ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００４年）、「デンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの大半は、ソース葉の葉緑体の外部に存在している（Ｍｏｓｔ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｃｃｕｒｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１、１３０８０〜１３０８５頁）。（専ら、また状況に応じて生化学的な証拠に基づく）この仮説によれば、ＳＳは、デンプンの生合成に必要なＡＤＰＧ分子の重要なプールの合成を司っている。しかし、この仮説は遺伝子工学又は従来の作物改良技術により実験的に実証されておらず、また、ＡＧＰアーゼが植物における唯一のＡＤＰＧ供給源であることを示す、遺伝子及び分子的な数え切れないほどの試験結果と一致していない（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）。
【０００５】
ＵＤＰＧやＡＤＰＧなどの糖ヌクレオチドは、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）と呼ばれる高価な物質の使用に基づき、それぞれＵＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＵＧＰアーゼ）やＡＧＰアーゼなどの酵素によって触媒されるピロホスホリラーゼ反応により商業的に製造されている。糖ヌクレオチドを作製するためのこの手法の代替手法はＳＳの使用に基づいているが、代替手法の発展は、多数の真核生物タンパク質を発現し効率的にプロセッシングするための大腸菌の制約により大きく妨げられている。この制約に触発されて、一部の研究者は、酵母など真核生物タイプの生物工場を使用することにより組換型ＳＳを作製した（Ｚｅｒｖｏｓｅｎ，Ａ．、Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（１９９８年）、「組換型スクロースシンターゼの応用−ＡＤＰ−グルコースの大量合成（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ５、２５〜２８頁；Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）から得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）。或いは、糖ヌクレオチドを作製するためのＳＳは、植物抽出物からタンパク質を精製する高価なプロセスによって精製しなければならなかった（特許ＤＥ４２２１５９５（１９９３年）、「ヌクレオチドにより活性化された糖又はオリゴ糖の作製に有用な精製されたスクロースシンターゼ酵素（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｕｇａｒｓ ｏｒ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」。植物抽出物から得られるこのＳＳには、ＵＤＰを好み、ＡＤＰに対する親和性が非常に低いという不都合がある（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁））。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物からの組換型ＳＳの作製が最近実現された（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ−Ｑ．、Ｃｈｏｌｌｅｔ，Ｒ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｆ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「リョクトウスクロースシンターゼのスクロースに対する見かけの親和性の増大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのリン酸化又はＳｅｒ１１の特異的変異誘発によって引き起こされる（Ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｐｐａｒｅｎｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｓｕｃｒｏｓｅ ｏｆ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｒ１１）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１３３７〜１３４１頁；Ｂａｒｒａｔｔ，Ｄ．Ｈ．Ｐ．、Ｂａｒｂｅｒ，Ｌ．、Ｋｒｕｇｅｒ，Ｎ．Ｊ．、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．、Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｌ．、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．（２００１年）、「エンドウマメスクロースシンターゼの多数の異なるアイソフォーム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ，ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｐｅａ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２７、６５５〜６６４頁；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，Ｂ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｂ．、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｈ．「細菌のスクロースシンターゼ組成物及び使用方法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ）」特許ＷＯ９８０３６３７）。しかし、この原核生物系におけるＳＳの作製には、以下のような問題が伴っていた。即ち、（１）作製されるＳＳの量が非常に少ない（細菌１グラム当たり３０マイクログラム（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナ（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）から得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）、（２）得られた活性ＳＳの量が非常に少なく、又はゼロであった（０．０５〜１．５ユニット／ｍｇ（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）；５．６ Ｕ／ｍｇ（Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁））、（３）組換型ＳＳは、クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などタンパク質を精製する従来の方法によって精製されなければならなかった。これらの方法は併用すると費用がかかり、また、均一な状態のタンパク質精製を保証するものではない、（４）細菌を用いた仕組みではタンパク質を正しく折り畳むことができないため、ＳＳの大半は封入体に送られ、又は不活性な凝集体の形で蓄積される（Ｍｉｒｏｕｘ，Ｂ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９６年）「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生：いくつかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする変異宿主（Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｍｕｔａｎｔ ｈｏｓｔｓ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、２８９〜２９８頁）、という諸問題があった。
【０００６】
本発明は、大腸菌の適切な株の使用、並びに、活性型の組換型ＳＳの様々な変異体の大量作製及び迅速且つ容易な精製を可能にする適切なベクターの使用に基づく系の開発を説明する。これらの変異体のうちのいくつかは、植物抽出物から得られる酵素よりＡＤＰに対する親和性がより大きく、スクロース、ＵＤＰ、及びＡＤＰなど安価な物質からＵＤＰＧ及びＡＤＰＧの双方を作製するのに使用することができる。
【０００７】
クロマトグラフィー技術は、植物抽出物、血清、尿、果汁、ブドウ酒、果実、食料品など複雑なサンプルのスクロース含有量を測定するための強力な手法となる（Ｄ’Ａｏｕｓｔ，Ｍ−Ａ．、Ｙｅｌｌｅ，Ｓ，Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．（１９９９年）、「トマトフルーツのスクロースシンターゼのアンチセンス阻害により、結実及び幼果のスクロースアンローディング能力が低減される（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｒｕｉｔ ｓｅｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｕｎｌｏａｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｙｏｕｎｇ ｆｒｕｉｔ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１、２４０７〜２４１８頁；Ｔａｎｇ，Ｇ−Ｑ．、Ｓｔｕｒｍ，Ａ．（１９９９年）、「ニンジンのスクロースシンターゼのアンチセンス抑制は、スクロース分配ではなく成長に影響を及ぼす（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ ａｆｆｅｃｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１、４６５〜４７９頁；Ｆｒｉａｓ，Ｊ．、Ｐｒｉｃｅ，Ｋ．Ｒ．、Ｆｅｎｗｉｃｈ，Ｇ．Ｒ．、Ｈｅｄｌｅｙ，Ｃ．Ｌ．、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｈ．、Ｖｉｄａｌ−Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ｃ．（１９９６年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ７１９，２１３〜２１９頁）。このような技術は、高度に専門的な技術者を必要とし、また、設備に多額の投資を要する。あいにく、酵素インベルターゼの作用によるスクロース分子の加水分解、並びにそれに続くグルコース及び／又はフルクトース分子の分光光度的若しくは蛍光定量的測定に基づく代替方法（Ｓｗｅｅｔｌｏｖｅ，Ｌ．Ｊ．、Ｂｕｒｒｅｌｌ，Ｍ．Ｍ．、ａｐ Ｒｅｅｓ，Ｔ．（１９９６年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼを増大させたトランスジェニックジャガイモの塊茎におけるデンプン代謝（Ｓｔａｒｃｈ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｕｂｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２０、４９３〜４９８頁；Ｓｔｉｔｔ，Ｍ．、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．、Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．、Ｈｅｌｄｔ，Ｈ．Ｗ．（１９８９年）、「植物の葉の特定の細胞及び細胞内コンパートメントにおける代謝レベル（Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｌｅａｖｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７４、５１８〜５５２頁；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｗ．（１９９７年）、「スクロースを測定するために共役させた酵素アッセイ（Ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ）」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４、１０３〜１０９頁；分析方法（１９９６年）、「果実及び野菜果汁評価の実施要綱（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ ａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｊｕｉｃｅｓ）」欧州経済共同体の欧州果汁協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆ Ｊｕｉｃｅｓ ａｎｄ Ｎｅｃｔａｒｓ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ））は、サンプル中に存在する内因性グルコース及び／又はフルクトースに対応する測定値の控除など技術的性質の限界の影響を受ける。サンプル中に多量のグルコース及び／又はフルクトースが存在すると、信頼がおけ、且つ正確なスクロースの測定を妨げるバックグラウンドノイズが加えられることがある。大多数の場合では、サンプルの真のスクロース含有量に関する信頼のおける申告を発表する前に、徹底的な管理を実施する必要がある（Ｗｏｒｒｅｌｌ，Ａ．Ｃ．、Ｂｒｕｎｅａｕ，Ｊ−Ｍ．、Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，Ｋ．、Ｂｏｅｒｓｉｇ，Ｍ．、Ｖｏｅｌｋｅｒ，Ｔ．Ａ．（１９９１年）、「トウモロコシのスクロースリン酸シンターゼをトマトにおいて発現させると葉の糖分配が変化する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｉｚｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ａｌｔｅｒｓ ｌｅａｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３、１１２１〜１１３０頁）。インベルターゼの使用に基づくスクロース測定キットは、Ｓｉｇｍａ社、Ｂｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ社、及びＭｅｇａｚｙｍｅ社などの会社から入手可能である。或いは、細菌由来のスクロースホスホリラーゼの作用によって遊離されるグルコース−１−リン酸の測定に基づく、スクロースの自動測定法も開発されている（Ｖｉｎｅｔ，Ｂ．、Ｐａｎｚｉｎｉ，Ｂ．、Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．、Ｍａｓｓｉｃｏｔｔｅ，Ｊ．（１９９８年）、「血清及び尿中のスクロースを測定するための自動酵素アッセイ、並びに胃損傷のマーカーとしてのその使用（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｄａｍａｇｅ）」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４、２３６９〜２３７１頁）。本発明は、ＳＳ、及びＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを加水分解する共役酵素の使用に基づく、サンプル中のスクロース測定用の単純且つ信頼がおけ、安価な代替方法の開発を説明する。
【０００８】
ＡＤＰＧの細胞内レベルを決定する因子に関する考察は、主に、合成酵素ＡＧＰアーゼの調節を中心としてきた（Ｐｒｅｉｓｓ（１９８８年）、「デンプンの生合成及びその調節（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ．Ｖｏｌ．１４、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１８２〜２４９頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｐｅｒａｔａ，Ｐ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．（１９９９年）、「従属栄養組織におけるスクロースからデンプンへの変換（Ｓｕｃｒｏｓｅ−ｓｔａｒｃｈ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ）」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１８、４８９〜５２５頁）。実際に、ＡＤＰＧの作製、及び工業的利益を有するデンプンを産生する植物の作製に関する特許及び科学論文の多くは、ＡＧＰアーゼの使用を中心としている（Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｓｌａｔｔｅｒｙ，Ｃ．Ｊ．、Ｋａｖａｋｌｉ，Ｈ．、Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（２０００年）「量を増やし質を高めるためのデンプン改変（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔａｒｃｈ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．５、２９１〜２９８頁）。しかし、生化学的な最近の科学調査は、まだ遺伝子／分子的な証拠によって確認されていないものの、図１Ｂ及び２Ｂで示すように、ＳＳが、デンプンの生合成に必要なＡＤＰＧの直接合成に関与している可能性があることを示唆している（Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁）。この仮説は、（ａ）ＳＳは、葉におけるデンプン産生に関係があるとされたことがこれまでなかったこと、（ｂ）ＳＳによって生成されたＡＤＰＧの細胞質ゾル中のプールをプラスチド内に存在するデンプン合成酵素に連結するＡＤＰＧ輸送体の存在が、プラスチドの膜において必要とされること、（ｃ）ＳＳがＡＤＰＧを生成する供給源として関与することは、ＡＧＰアーゼが唯一のＡＤＰＧ供給源であることを示すと考えられる、生化学／遺伝子／分子的な多くの試験結果と直接的に矛盾していること（Ｏｋｉｔａ，Ｔ．Ｗ．（１９９２年）、「デンプン合成の代替経路はあるか。（Ｉｓ ｔｈｅｒｅ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ？）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００、５６０〜５６頁；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁；Ｓｔａｒｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｂａｒｒｙ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．、Ｋｉｓｈｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．（１９９２年）、「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼによる、植物組織中のデンプン量の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｙ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８、２８７〜２８２頁；Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｅ．Ｈ．、Ｈａｕｓｌｅｒ，Ｒ．Ｅ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（２００５年）、「代謝経路に関するパラダイムを葉の中の一時的なデンプンに変える時間はない（Ｎｏ ｔｉｍｅ ｔｏ ｓｈｉｆｔ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．印刷中）を踏まえて、特に物議をかもしている。おそらくはこれらすべての理由から、今日まで、高レベルのデンプンを製造するために、ＳＳを過剰発現する植物が設計されたことはなかった。しかし、本発明は、ＡＤＰＧ及びデンプンの生成を増大させるためにＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の作製を初めて説明する。逆に言えば、本発明者らは、ＡＧＰアーゼが無いためにデンプンを欠く植物が正常なＡＤＰＧレベルを有していることを示す。これはすべて、図１Ｂ及び２Ｂで示すように、ＳＳが、デンプンの生合成に必要とされるＡＤＰＧの直接的な合成に関与しており、また、植物細胞中で蓄積されるＡＤＰＧの大半の合成を司っていることを示す。
【０００９】
様々な研究は、ＳＳは貯蔵組織におけるＵＤＧＰの合成に関与している（しかし、ＡＤＰＧの合成には関与していない）とする図１Ａに示す手法に基づいているが、ＳＳの活性が低減された結果としてデンプン含有量が低減した植物の作製を説明している（Ｃｈｏｕｒｅｙ，Ｐ．Ｓ．、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｏ．Ｅ．（１９７６年）、「トウモロコシのしわ型（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）−１変異によって条件づけられる酵素欠陥（Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｈｒｕｎｋｅｎ−１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．１４、１０４１〜１０５５頁；Ｚｒｅｎｎｅｒ，Ｒ．、Ｓａｌａｎｏｕｂａｔ，Ｍ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．（１９９５年）、「トランスジェニックジャガイモ植物による、シンク強度に対するスクロースシンターゼの非常に重要な役割の証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｏｒ ｓｉｎｋ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」 Ｐｌａｎｔ Ｊ．７、９７〜１０７頁；Ｔａｎｇ，Ｇ−Ｑ．、Ｓｔｕｒｍ，Ａ．（１９９９年）、「ニンジン（Ｄａｎｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．）のスクロースシンターゼのアンチセンス抑制は、スクロース分配ではなく成長に影響を及ぼす（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ（Ｄａｎｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．）ａｆｆｅｃｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１、４６５〜４７９頁）。この点で、図１Ｂ及び２Ｂに示す代謝スキームに従ってＡＤＰＧのレベルが増大した結果としてデンプン含有量の多い植物を作製するためにＳＳの過剰発現を使用し得るという実験的証拠はない。しかし、細胞壁の多糖類を生合成するための前駆体分子（ＵＤＰＧ）を生成するＳＳの能力に基づいて、ＳＳの過剰発現の結果として繊維含有量の多いワタ植物又はセルロース含有量の多い穀粒の作製を説明した研究が公表され、また、特許権を与えられている（Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｈ．Ｊ．、Ｘｉａｍｏｍｕ，Ｎ．、Ｋａｎｗａｒｐａｌ，Ｓ．「茎及び穀粒の質を改善するためのスクロースシンターゼ遺伝子の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｔａｌｋ ａｎｄ ｇｒａｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ）」特許ＷＯ０２０６７６６２；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｆ．、Ｄａｎｎｙ，Ｌ．、Ｙｏｎｇ−Ｌｉｎｇ，Ｒ．「植物組織におけるスクロースシンターゼ遺伝子発現の改変及びその用途（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｆｏｒ）」特許ＷＯ０２４５４８５；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，Ｂ．、Ｗｉｌｌｉａｍ，Ｂ．、Ｒｏｂｅｒｔ，Ｈ．「細菌のスクロースシンターゼ組成物及び使用方法（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ）」特許ＷＯ９８０３６３７）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、第１に、大腸菌の適切な株の使用並びにヒスチジン末端を有する組換型ＳＳの獲得を可能にする発現ベクターの使用に基づき、可溶性であり、容易に精製可能であり、且つ、高い比活性を有する組換型ＳＳを大量に作製する方法の開発及び最適化に関する。本発明はさらに、ＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを代謝する酵素と共役させたＳＳ活性を有する酵素製品の使用に基づくスクロース測定用キットを作製するために従う手順にも関する。本発明はさらに、この目的のために特別に設計したＳＳの変異体から始める、ＡＤＰＧやＵＤＰＧなどの糖ヌクレオチド作製の最適化にも関する。最後に、ＳＳの過剰発現後の、スクロース、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高いトランスジェニック植物の設計についての詳細を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＳＳをコードするｃＤＮＡの増幅
野生型スクロースシンターゼＳＳ４のヌクレオチド配列が分かっているので（Ｆｕ，Ｈ．、Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．（１９９５年）「シンク及び維管束に関連したスクロースシンターゼ機能は、ジャガイモにおいて様々な遺伝子クラスにコードされている（Ｓｉｎｋ− ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅ ｃｌａｓｓｅｓ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７、１３６９〜１３８５頁）、遺伝子の５’末端及び３’末端に対応する２種の特異的プライマーを作製した。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のｃＤＮＡライブラリーから、ＳＳＸと呼ばれる２４１８塩基対のＤＮＡ断片を従来のＰＣＲ技術によって増幅した。このＰＣＲ断片をｐＳＫブルースクリプトプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入して、ｐＳＳ構築物（図３Ａ）を作製し、宿主細菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ中で増幅させた。
【００１２】
大腸菌の特殊株からの活性な組換型ＳＳの作製
ｐＳＳを制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化した。（ＳＳ、ＳＳＸをコードするｃＤＮＡを含む）遊離された断片を、組換えタンパク質と融合されるヒスチジンに富む配列をコードしているヌクレオチド配列をポリリンカー領域に有するｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）（図３Ｂ）の同じ制限酵素部位にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＥＴ−ＳＳと呼ぶ、図３Ｃ）をエレクトロポレーションによって大腸菌の様々な株に挿入した。ｐＥＴ−ＳＳで形質転換した大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、２００３年１０月２９日に、ブルハソート（Ｂｕｒｊａｓｓｏｔ）４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号ＣＥＣＴ：５８５０で寄託した。これらの細菌をＬＢ培地中、２０℃でインキュベートした。２０℃で増殖させた細胞培養物１００ｍＬに１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、ＳＳＸの過剰発現を誘導した。培養物を誘導した６時間後に、細菌を回収し、４ｍｌの結合緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｈｉｓ結合精製キット）中に再懸濁し、次いで、超音波処理し、４０，０００ｇで２０分間遠心分離した。Ｎ末端にヒスチジン残基に富んだアミノ酸配列を有する組換型ＳＳを含む上清を、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のＨｉｓ結合タンパク質精製キットのアフィニティーカラムに通した。キットに付属している取扱い説明書に従って、１モルの代わりに２００ｍＭのイミダゾールを含有する、推奨される溶出緩衝液６ｍｌでＳＳを溶出させた。溶出後、そのタンパク質を直ちに透析にかけて、ＳＳを不可逆的に不活性化する微量のイミダゾールを除去した。
【００１３】
ＡＤＰＧ作製のために最適化したＳＳのアイソフォームの作製
適切なプライマーを用い、ｐＳＳを鋳型として、突然変異させた変異体ＳＳ５を設計して構築物ｐＳＳ５を作製した。これは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＳＳ５を消化した。（ＳＳ５を含む）遊離された断片を、ｐＥＴ−２８ａ（＋）発現プラスミドの同じ制限酵素部位にクローニングしてｐＥＴ−ＳＳ５を作製し、エレクトロポレーションによってそれを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）中に挿入した。ｐＳＳ５で形質転換した大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを、２００３年１０月２９日に、ブルハソート４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８４９で寄託した。
【００１４】
ＳＳ４を過剰発現するトランスジェニック植物の作製
本発明では、（ａ）構成的に、（ｂ）葉で特異的に、（ｃ）塊茎などの貯蔵器官で特異的に、ＳＳを過剰発現させた。
【００１５】
ＳＳを構成的に過剰発現する植物を作製するために、タバコモザイクウイルスの３５Ｓ構成的プロモーターの作用によって制御される構築物を作製した。ＳＳＸの５’及び３’領域の３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーターをｐＳＳに連続的に挿入することにより、プラスミドｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを作製した。このプラスミドの制限地図を図４Ｂに示す。
【００１６】
アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を介してこの構築物を植物のゲノムに移行できるようにするには、最初に、この構築物をバイナリープラスミド中にクローニングしなければならない。このために、酵素ＮｏｔＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩでｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを連続的に消化し、予め酵素ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩで連続的に消化しておいたバイナリープラスミドｐＢＩＮ２０（図４Ａ）（Ｈｅｎｎｅｇａｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｄａｎｎａ，Ｋ．Ｊ．（１９９８年）「ｐＢＩＮ２０：アグロバクテリウムを介した形質転換のために改良したバイナリーベクター（Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１６、１２９〜１３１頁）内にクローニングした。このようにして得られたプラスミドをｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳと呼んだ（図４Ｃ）。
【００１７】
光を照射された葉において特異的にＳＳを過剰発現するために、ＰＣＲを使用して、タバコのＲＵＢＩＳＣＯ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）の小サブユニットをコードしている遺伝子の（ＲＢＣＳと呼ばれる）プロモーター領域を増幅した（Ｂａｒｎｅｓ，Ｓ．Ａ．、Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｓ．、Ｇｒａｙ，Ｊ．Ｃ．（１９９４年）「トランスジェニックタバコ中の葉緑体のリン酸輸送体量の変化は、デンプンと糖との同化産物の分配に影響を及ぼす（Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｓｕｇａｒ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６、１１２３〜１１２９頁）。（光合成的に活性な細胞での特異的な発現を与える）このヌクレオチド配列を、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に挿入して、ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍを作製した（図５Ａ）。この構築物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、遊離された断片をｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳの対応する制限酵素部位中にクローニングして、ｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製した（図５Ｂ）。ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＮｏｔＩで連続的にこの構築物を消化した。遊離された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＥｃｏＲＩで連続的に消化したｐＢＩＮ２０中にクローニングした。得られた構築物をｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳと呼んだ（図５Ｃ）。
【００１８】
大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中で増幅させた後、ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ及びｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳの双方をＡ．チュメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８：ＧＶ２２６０中に挿入した（Ｄｅｂｌｅａｒｅ，Ｒ．、Ｒｙｔｅｂｉｅｒ，Ｂ．、ｄｅＧｒｅｖｅ，Ｈ．、Ｄｅｂｒｏｅｃｋ，Ｆ．、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．、ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．、Ｌｅｅｍａｎｓ，Ｊ．（１９８５年）「植物へのアグロバクテリウムを介した遺伝子導入の効率的なオクトピンＴｉプラスミド由来ベクター（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｃｔｏｐｉｎｅ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、４７７７〜４７８８頁）。Ａ．チュメファシエンスは、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネなどの種を従来技術によって形質転換するのに使用されている（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．、Ｆｒｙ，Ｊ．Ｅ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｎ．Ｌ．、Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ，Ｄ．、Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｇ．、Ｆｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．（１９８５年）「植物中に遺伝子を導入するための簡易で一般的な方法（Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７、１２２９〜１２３１頁；Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．、Ｈｏｕｌｎｅ，Ｇ．、Ｓｃｈａｎｔｚ，Ｒ．、Ｃｈａｍａｒｒｏ，Ｊ．（２００１年）「アグロバクテリウムを介した形質転換のための、トマト及びコショウ芽生えの外植片の再生促進（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｐｅｐｐｅｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．６７、１７３〜１８０頁；Ｈｉｅｉ，Ｙ．、Ｏｈｔａ，Ｓ．、Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．、Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ．Ｔ．（１９９４年）「アグロバクテリウムによって媒介されるイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）の効率的な形質転換、及びＴ−ＤＮＡの境界の配列解析（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ＤＮＡ）」Ｐｌａｎｔ Ｊ．６、２７１〜２８２頁）。ｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳで形質転換させたＡ．チュメファシエンスＣ５８：ＧＶ２２６０の株を、２００３年１０月２９日に、ブルハソート４６１００（バレンシア、スペイン）、ブルハソートキャンパスのバレンシア大学研究所に所在するスペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８５１で寄託した。
【００１９】
スクロース測定用のアッセイキットの作製
スクロース測定用に設計されたキットのうちの１つを、スクロースから糖ヌクレオチドへの変換、また、それに続く糖ヌクレオチドからグルコース−１−リン酸、グルコース−６−リン酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変換に基づいてスクロースを分光光度的／蛍光定量的に測定するためのキットに含まれる酵素反応に関する以下のスキームＩに示す。
【化１】
【００２０】
このキットは、当モル量のフルクトース及び対応する糖ヌクレオチドを遊離する、ヌクレオチド２リン酸（例えば、ＵＤＰ又はＡＤＰ）の存在下でのスクロース分子に対するＳＳの作用に基づいている。この反応の結果として生じる糖ヌクレオチドがＵＤＰＧである場合、ＮｕｄｉｘタイプのＵＤＰＧピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．４５）（Ｙａｇｉ，Ｔ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｒ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）「ＵＤＰ−グルコースのピロリン酸結合を切断する哺乳動物のＮｕｄｉｘ加水分解酵素様の酵素のクローニング、発現、及び性質決定（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｎｕｄｉｘ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ−ｌｉｋｅ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈａｔ ｃｌｅａｖｅｓ ｔｈｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｏｎｄ ｏｆ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７０、４０９〜４１５頁）やＵＤＰＧ加水分解酵素（Ｂｕｒｎｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｅａｃｈａｍ，Ｉ．Ｒ．（１９８６年）「ペリプラズムのＵＤＰ−糖加水分解酵素（５’−ヌクレオチダーゼ）をコードしている大腸菌ｕｓｈＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び転写解析：ｕｓｈＡ遺伝子の制御、並びにコードされているタンパク質産物のシグナル配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｈＡ ｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（５’−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ）：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｓｈＡ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４、４３２５〜４３４２頁）などＵＤＰＧの加水分解酵素の作用をこのＵＤＰＧに受けさせる。これらの加水分解酵素の作用によって遊離されたＧ１Ｐをホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）の作用によって変換して、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生じさせる。次に、酵素Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の作用によって、このＧ６ＰをＮＡＤ（Ｐ）＋とカップリング反応させて、蛍光測定法及び３４０ｎｍでの分光測定によって容易に測定可能な６−ホスホグルコン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させることができる。次に、遊離されたＮＡＤ（Ｐ）ＨをＦＭＮ−オキシドレダクターゼ／ルシフェラーゼの作用と共役させて、分光測定で定量化される光を生じさせることができる。
【００２１】
別法として、スキームＩＩに示すように、生成されるＵＤＰＧを、蛍光測定法又は３４０ｎｍでの分光測定によって測定可能な当モル量のＵＤＰ−グルコン酸及びＮＡＤＨをＮＡＤの存在下で生成させるＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２２）と共役させることもできる。次に、遊離されたＮＡＤＨをＦＭＮ−オキシドレダクターゼ／ルシフェラーゼの作用と共役させて、分光測定で定量化される光を生じさせることができる。
【化２】
【００２２】
ＳＳによって触媒される反応の生成物がＡＤＰＧである場合、細菌のＡＤＰＧピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．２１）（Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｒｕｎａ，Ｂ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｂａｓｔａｒｒｉｃａ−Ｂｅｒａｓａｔｅｇｕｉ，Ａ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｌａｓａ，Ｉ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００１年）「アデノシン２リン酸糖ピロホスファターゼは、大腸菌におけるグリコーゲン生合成を妨げる（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｇａｒ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８，８１２８〜８１３２頁）などのＡＤＰＧ加水分解酵素の作用をこのＡＤＰＧに受けさせる。遊離されたＧ１Ｐをホスホグルコムターゼの作用によって変換して、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生じさせる。次に、酵素Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼの作用によって、このＧ６ＰをＮＡＤ（Ｐ）＋とカップリング反応させて、蛍光測定法及び３４０ｎｍでの分光測定によって容易に測定可能な６−ホスホグルコン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させることができる。
【００２３】
いずれの場合も、ＳＳによって媒介される糖ヌクレオチド生成と共役させた酵素反応のスキームは、アンペロメトリック検出に応用するのに極めて適している。
【実施例】
【００２４】
ジャガイモのＳＳのアイソフォームをコードしているｃＤＮＡを適切な発現ベクター及び活性型の酵素の作製及び蓄積用に最適化させた大腸菌株においてクローニングするための手順を詳細に示す実施例を以下に説明する。他の実施例では、植物サンプル、血清、尿、果汁、加糖した果実飲料、清涼飲料水などのスクロース測定用アッセイキットを作製するための組換型ＳＳの使用について説明する。別の実施例では、ＵＤＰＧやＡＤＰＧなどの糖ヌクレオチドの大量作製用に最適化したＳＳの変異体の使用について説明する。最後に、別の実施例では、ＳＳを過剰発現する植物における高いＡＤＰＧ生成活性の結果として、スクロース、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い植物の作製について説明する。
【００２５】
（実施例１）
容易に精製可能であり、且つ、高い比活性を有する、ヒスチジン末端を有する組換型ＳＳの大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）における発現
ジャガイモのＳＳのアイソフォームをコードするＳＳ４遺伝子のヌクレオチド配列が分かっているので、５’から３’の方向に、配列番号１及び配列番号２の配列を有する２種の特異的プライマーを作製することができた。これらのプライマーを用いて、ジャガイモの塊茎のｃＤＮＡライブラリーから、ＳＳＸと呼ばれるＤＮＡ断片を従来のＰＣＲ法によって増幅し、これをｐＳＫブルースクリプトプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入して、宿主細菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅ中で増幅させた。ＳＳＸのヌクレオチド配列は、配列番号３であり、ＳＳ４（ジェンバンクアクセッション番号Ｕ２４０８７）と少し異なっている。配列番号３から演繹されるアミノ酸配列はＳＳ４と少し異なっており、したがって、ＳＳＸと呼ぶ。ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドにおいて配列番号３を発現させた後に演繹されるアミノ酸配列は、配列番号４であり、この配列は、配列番号３から演繹されるアミノ酸配列のアミノ末端に融合された３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む配列を含んでいる。
【００２６】
１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＳＳＸ生成を誘導した。３７℃でさらに６時間培養した後、ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌が凝集型のタンパク質を蓄積し、そのサイズがＳＳに対応することが観察された。しかし、これらの細菌はＳＳ活性を示さなかった。活性型ＳＳの発現の失敗の原因は、大腸菌が一部の高分子量の真核生物タンパク質を正しくフォールディングする際に抱える問題に帰することができる（Ｍｉｒｏｕｘ，Ｂ．、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９６年）「大腸菌におけるタンパク質の過剰産生：いくつかの膜タンパク質及び球状タンパク質の高レベルの合成を可能にする変異宿主（Ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｍｕｔａｎｔ ｈｏｓｔｓ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｇｌｏｂｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０、２８９〜２９８頁）。この問題を克服することを目指して、他の細菌株において、２０℃の温度で活性ＳＳを作製できるか可能性を調査した。これらすべてにおいて、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してＳＳＸの生成を誘導した。さらに６時間インキュベートした後、細胞を超音波処理し、遠心分離した。得られた上清のＳＳ活性を分析した。図６で示すように、これらの条件では、可溶性の活性ＳＳの生成という観点からすると、ＢＬＲ（ＤＥ３）株が最も効率的であることが判明した。ｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた大腸菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、２００３年１０月２９日に、寄託番号ＣＥＣＴ：５８５０でスペイン微生物株保存機関に寄託した。文献（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁）で記載されている組換型ＳＳの非常に低い生産性と比べて、ＣＥＣＴ：５８５０のタンパク質プール全体における組換型ＳＳＸの寄与率は、約２０％である。ヒスチジン末端を有する組換えタンパク質が特異的に保持されるＨｉｓ−Ｂｉｎｄアフィニティーカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に上清を通した。精製されたＳＳを溶出させ透析した後、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／２ｍＭ ＵＤＰともにインキュベートした。ＵＤＰＧの生成に基づいて決定した比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり８０ユニットであり、文献（Ｎａｋａｉ，Ｔ．、Ｔｏｎｏｕｃｈｉ，Ｎ．、Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｈ．、Ｓａｋａｉ，Ｆ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（１９９７年）、「大腸菌における、リョクトウ芽生え由来のスクロースシンターゼの発現及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１、１５００〜１５０３頁；Ｌｉ，Ｃ．Ｒ．、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｂ．、Ｈｅｗ，Ｃ．Ｓ．（２００３年）、「熱帯の着生ラン、オンシジウムゴルディアナから得たスクロースシンターゼ遺伝子のクローニング、性質決定、及び発現解析（Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｅｐｉｐｈｙｔｉｃ ｏｒｃｈｉｄ Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｇｏｌｄｉａｎａ）」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １１８、３５２〜３６０頁；Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）で記載されている組換型ＳＳの１ｍｇ当たり０．０５〜５ユニットという活性よりはるかに高く、植物抽出物から精製したＳＳに対応する３ユニット／ｍｇよりも大きかった（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁）。ユニットは、１分当たり１マイクロモルのＵＤＰＧ生成を触媒する酵素の量として定義される。５００ｍＭのスクロースが存在する場合のＵＤＰに対する親和力は、Ｋｍ（ＵＤＰ）＝０．２５ｍＭであったのに対し、１ｍＭのＵＤＰが存在する場合、スクロースに対するＫｍは、３０ｍＭであった。ＵＤＰの存在下でのスクロースに対するこの親和性は、酵母で得られた組換型ＳＳによって示される親和性（Ｋｍ＝９５ｍＭ、Ｒｏｍｅｒ，Ｕ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｈ．、Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｎ．、Ｎｅｔｔｅｌｓｔｒｏｔｈ，Ｎ．、Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｗ．Ｂ．、Ｅｌｌｉｎｇ，Ｌ．（２００４年）、「糖質工学のための、ジャガイモから得た組換型スクロースシンターゼＩの発現、精製、及び性質決定（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．ｆｏｒ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０７、１３５〜１４９頁）より有意に高い。
【００２７】
（実施例２）
大腸菌から得た組換型ＳＳの使用に基づくＵＤＰＧ及びＡＤＰＧの大量作製
１Ｍ スクロース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／１００ｍＭ ＵＤＰ、並びにＢＬＲ（ＤＥ３）におけるｐＥＴ−ＳＳの発現及びそれに続く精製後に得たジャガイモの組換型ＳＳの３０ユニットを含有する溶液１００ミリリットルを３７℃で１２時間インキュベートして、高純度のＵＤＰＧ３グラムを効率的且つ経済的に作製した。この溶液を１００℃で９０秒間加熱して反応を終了させ、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を分取スケールＨＰＬＣクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）に添加し、文献で記載されているようにしてＵＤＰＧを精製した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｚａｎｄｕｅｔａ−Ｃｒｉａｄｏ，Ａ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２０００年）「アデノシン２リン酸グルコースピロホスファターゼ：グリコーゲン生合成を妨げる色素体ホスホジエステラーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ａ ｐｌａｓｔｉｄｉａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｈａｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７、８７０５〜８７１０頁）。
【００２８】
ＡＤＰＧの作製には、植物組織から抽出されたＳＳについて記述されているよりずっと高い親和性をＡＤＰに対して有するＳＳの変異型の作製を必要とした（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁）
【００２９】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＳＳＸを点突然変異誘発し、下記の［配列番号５、配列番号６］、［配列番号７、配列番号８］、及び［配列番号９、配列番号１０］の配列を有するプライマー対を連続して使用することによって、ＳＳ５と呼ばれるアイソフォームを得た。ＳＳ５と呼ばれる得られたヌクレオチド配列は、配列番号１１である。（データベース中にある）ＳＳ４（Ｓｕｓｙ４）と比べたＳＳ５（Ｓｕｓｙ５）のアミノ酸配列の変化を表Ｉで網がけにして示す。ｐＥＴ−２８ａ（＋）プラスミドで配列番号１１を発現させた後に演繹されるアミノ酸配列は配列番号１２であり、この配列は、配列番号１１から演繹されるアミノ酸配列のアミノ末端と融合した３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む配列を含んでいる。
【００３０】
表Ｉは、ＳＳ５のアミノ末端部分に融合した３８アミノ酸からなるヒスチジンに富む前記配列を含んでいる。
【表１】
【００３１】
ｐＥＴ−ＳＳ５の発現後に得られた組換型ＳＳ５は、ＵＤＰ及びＡＤＰの存在下で、それぞれタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニット及び６５ユニットのＶｍａｘ値を示した。５００ｍＭスクロースの存在下でのＵＤＰ及びＡＤＰに対する親和性は非常に類似していたが（ＡＤＰ及びＵＤＰのいずれに対してもＫｍ＝０．２ｍＭ）、飽和濃度のＵＤＰ及びＡＤＰの存在下でのスクロースに対するＫｍは、それぞれ３０ｍＭ及び１００ｍＭであった。これらの動態パラメータは、ジャガイモ塊茎及び他の植物種の他の器官から抽出されたＳＳについて記載されている値と大きく異なっており、それらの文献によると、酵素のＶｍａｘは、ＡＤＰが存在する場合よりＵＤＰが存在する場合に１０倍高い値となる（Ｐｒｅｓｓｅｙ Ｒ（１９６９年）、「ジャガイモのスクロースシンターゼ：精製、諸特性、及び成熟に伴う活性の変化（Ｐｏｔａｔｏ ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、７５９〜７６４頁；Ｍｏｒｅｌｌ，Ｍ．、Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｌ．（１９８５年）、「ダイズ根粒のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｎｏｄｕｌｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７８、１４９〜１５４頁；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｑｕｏｃｋ，Ｂ．、Ｋｒｉｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．、Ｈｕｂｅｒ，Ｓ．Ｃ．、Ｌｅｃｈａｒｎｙ，Ａ．（１９９０年）、「発育中のトウモロコシの葉のスクロースシンターゼ（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍａｉｚｅ ｌｅａｖｅｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４、５１６〜５２３頁）。ｐＳＳ５で形質転換させた大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを、スペイン微生物株保存機関に寄託番号ＣＥＣＴ：５８４９で寄託した。
【００３２】
１Ｍ スクロース、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ／１００ｍＭ ＡＤＰ、並びにＢＬＲ（ＤＥ３）におけるｐＥＴ−ＳＳ５の発現及びそれに続くＨｉｓ結合カラムでの精製後に得たジャガイモの組換型ＳＳの３０ユニットを含有する溶液１００ミリリットルを３７℃で１２時間インキュベートして、高純度のＡＤＰＧ３グラムを効率的且つ経済的に作製した。この溶液を１００℃で９０秒間加熱して反応を終了させ、次いで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ＡＤＰＧを精製するために、上清を分取スケールＨＰＬＣクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）に添加した。
【００３３】
（実施例３）
スクロース測定用酵素キットの作製
スクロースを測定するために、以下の成分及び最終量／濃度を用いて次の反応混液を調製した。
１．糖ヌクレオチドの加水分解酵素の使用に基づくキット
ａ．２ユニットのＳＳ（組換型又は非組換型）
ｂ．２ｍＭのＡＤＰ又はＵＤＰ（それぞれ、ＡＤＰＧ又はＵＤＰＧを作製するかどうかに応じて）
ｃ．２ユニットのＡＤＰＧピロホスファターゼ又は２ユニットのＵＤＰＧピロホスファターゼ（それぞれ、ＡＤＰ又はＵＤＰの反応混液に含めるかどうかに応じて）
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ
ｈ．予めろ過した試験サンプル
２．ＵＤＰＧデヒドロゲナーゼの使用に基づくキット
ａ．２ユニットのＳＳ（組換型又は非組換型）
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットのＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ
ｄ．０．５ｍＭのＮＡＤ
ｅ．反応緩衝液：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣｌ
ｆ．予めろ過した試験サンプル
【００３４】
試験サンプル中に存在するスクロース量の測定は、スキームＩ及びＩＩで示される共役反応によって生成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光定量的測定又は分光光度的測定（３４０ｎｍ）に基づいている。
【００３５】
発育の程度が様々なオオムギ種子のスクロース含有量を測定するために（図７）、３７℃で３分間、ＥＬＩＳＡプレートの３００マイクロリットルウェル中で反応を行った。試験サンプルの体積は２０マイクロリットルであり、試薬ａ〜ｇ（キット＃１）及びａ〜ｅ（キット＃２）を組み合わせて得られる反応混液の体積は２８０マイクロリットルであった。ブランクは、ＳＳ以外の反応混液のすべての成分を含んだ。ＭｕｌｔｉＳｋａｎ分光光度計を用いて測定を実施した。タイプ「１」のキットとタイプ「２」のキットのいずれで得られた値も、序論で記述したクロマトグラフィー技術を用いて測定した値と同程度であることが判明した（Ｂａｒｏｊａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅ．、Ｍｕｎｏｚ，Ｆ．Ｊ．、Ｓａｉｋｕｓａ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．、Ａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｐｏｚｕｅｔａ−Ｒｏｍｅｒｏ，Ｊ．（２００３年）、「スクロースシンターゼは、植物の従属栄養組織におけるデンプン生合成に関係しているＡＤＰグルコースの新規な生成を触媒する（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｓ ｔｈｅ ｄｅ ｎｏｖｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４、５００〜５０９頁）。
【００３６】
（実施例４）
ＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の作製
図８〜１０は、構成的（３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ）及び特異的（ＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ）にＳＳを過剰発現するジャガイモ植物の葉で得られた双方の結果を示す。
【００３７】
図８で示すように、これらの植物のいずれかの葉におけるＳＳ活性は、野生型植物（ＷＴ）の同一器官での活性より２〜１０倍高い。これらの葉は、以下の特徴を有した。
１．ＡＤＰＧを生成するＳＳの活性（図８）とデンプン（図９）及びＡＤＰＧ（図１０）レベルとの明確な相関。この特徴は、葉だけでなく、塊茎や種子などの貯蔵組織でも観察された（以下参照）。
２．野生型植物の葉と比べてデンプン含有量が多い（図９）。例えば、２０℃、明期８時間／暗期１６時間の光周期の条件で発育させた「野生型」ジャガイモ植物の葉のデンプン含有量は新鮮重１グラム当たり５マイクロモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現するトランスジェニック植物の葉では、新鮮重１グラム当たり８マイクロモルである。野生型植物とトランスジェニック植物の差は、明期が長いときに拡大され、その結果、ＳＳを過剰発現する植物の葉は野生型植物の葉の４倍のデンプンを含有する。
３．非形質転換植物の同一の組織又は器官に比べてＡＤＰＧ含有量が多い（図１０）。２０℃、明期８時間／暗期１６時間の光周期の条件で発育させた野生型ジャガイモ植物の葉の平均含有量は新鮮重１グラム当たり０．３５ナノモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現する植物の葉は、新鮮重１グラム当たり２．５ナノモルの含有量を有し得る。
４．ＡＤＰＧもデンプンも、明期中に一時的蓄積を示す（図１１）。どちらの物質の蓄積速度もＳＳ活性との間に正の相関があり、このことは、デンプン生合成の「従来の」モデル（図２Ａ）によって示されている内容とは異なり、また、図２Ｂに示す「代替の」モデルの仮説を確認するものであり、ＳＳがＡＤＰＧの生成、及びスクロース代謝とデンプン代謝の連結において基本的な役割を果たしていることを示唆している。
５．グルコースやフルクトースなどの可溶性糖は通常レベルである。しかし、トランスジェニックの葉におけるグルコース−６−Ｐ及びスクロースのレベルは、野生型ジャガイモの葉で観察されるそれらのレベルより高い（表２）。
【００３８】
表２：対照植物（ＷＴ）及び３５Ｓ−ＳｕＳｙ−ＮＯＳ由来の葉における代謝産物のレベル（新鮮重１ｇ当たりのｎモルで示す）。ＷＴで観察される値と有意に異なる値を太字で示す。
【表２】
６．ＳＳを過剰発現する植物の外部形態は、非形質転換植物と比較した場合、異常ではない。
【００３９】
図１２〜１４は、ＳＳを構成的に過剰発現するジャガイモ塊茎で得られた結果を示す（３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ）。これらの結果は、特異的な塊茎プロモーター（パタティナ（ｐａｔａｔｉｎａ）遺伝子のプロモーター）の制御下でＳＳを過剰発現する塊茎で観察される結果とほぼ同一である。
【００４０】
図１２で示すように、これらの植物のいずれかの塊茎におけるＳＳ活性は、野生型植物の同一器官での活性より？倍高い。これらの塊茎は、以下の特徴を有した。
１．ＡＤＰＧを生成するＳＳの活性（図１２）とデンプン（図１３）及びＡＤＰＧ（図１４）レベルとの明確な相関。
２．非形質転換植物の塊茎と比べてデンプン含有量が多い（図１３）。例えば、「野生型」植物の塊茎のデンプン含有量は新鮮重１グラム当たり約３００マイクロモル（新鮮重１グラム当たり５４ｍｇのデンプンに相当）であるのに対し、ＳＳを過剰発現する塊茎では、新鮮重１グラム当たり４５０〜６００マイクロモルである。
３．野生型植物の塊茎と比べてＡＤＰＧ含有量が多い（図１４）。野生型塊茎の平均含有量は新鮮重１グラム当たり５ナノモルであるのに対し、ＳＳを過剰発現する塊茎は、新鮮重１グラム当たり７〜９ナノモルの含有量を有し得る。
【００４１】
イネの種子、トマト、及びタバコの葉、並びにトマトで得られた結果は、図８〜１４で示す結果と質的に同様である。すべての事例で、デンプン含有量の増加及びアミロース／アミロペクチン比の上昇がみとめられた。
【００４２】
ＳＳの過剰発現によりＡＤＰＧ及びデンプンの含有量が多い植物が得られることは、（図１Ａ及び２Ａに例示した）デンプン生合成の現在の概念によっては全く予想されず、おそらくは、ＳＳを過剰発現する植物の設計が、デンプン産生を増大させる戦略としてなぜこれまで採用されなかったかを説明する結果である。この研究に基づいて得られた結果は、ＡＧＰアーゼではなくＳＳが、植物中で蓄積するＡＤＰＧの基本的供給源であることを示唆している。いまだ通用しているモデルによれば、ＡＧＰアーゼはＡＤＰＧの唯一の供給源である。しかし、意外にも、ＡＧＰアーゼ欠損植物のＡＤＰＧレベルはこれまで調査されていなかった。本発明者らの発明の有意性を調査するために、本発明者らは、ＡＧＰアーゼ活性を低減させたシロイヌナズナ及びジャガイモ植物におけるＡＤＰＧ及びデンプンのレベルを初めて分析した。図１５Ａで示すように、ＡＧＰアーゼ欠損ＴＬ２５シロイヌナズナ植物のデンプンレベル（Ｌｉｎ，Ｔ．Ｐ．、Ｃａｓｐａｒ，Ｔ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｃ．Ｒ．、Ｐｒｅｉｓｓ，Ｊ．（１９８８年）「ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ活性を欠くシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のデンプンを含まない変異体の単離及び性質決定（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔａｒｃｈｌｅｓｓ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｌａｃｋｉｎｇ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８、１１３１〜１１３５頁）は、ＷＴ植物で観察されるレベルより低い。しかし、ＡＤＰＧのレベルは正常である（図１５Ｂ）。一方、ＡＧＰ６２及びＡＧＰ８５ジャガイモ植物のデンプンレベル（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｒｏｂｅｒ，Ｂ．、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ，Ｕ．、Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９９２年）、「トランスジェニックジャガイモにおけるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼの阻害は、糖を貯蔵した塊茎を生じ、塊茎の形成及び塊茎の貯蔵タンパク質遺伝子の発現に影響を及ぼす（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＡＤＰｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｓｕｇａｒ−ｓｔｏｒｉｎｇ ｔｕｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｕｂｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｅｒ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．１１、１２２９〜１２３８頁）は、野生型植物の葉で観察されるデンプンレベルに比べて低減されている（図１６Ａ）。しかし、ＡＤＰＧのレベルは全く正常である（図１６Ｂ）。総合すると、これらの観察結果は、（ａ）ＡＧＰアーゼではなくＳＳが、植物におけるＡＤＰＧの主要供給源であることを示し、（ｂ）ＳＳの過剰発現によりデンプン含有量の多い植物が得られることを実証し、本発明者らの発明の有意性を強調している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】従属栄養的な器官におけるデンプン生合成の機序を表す図である。（Ａ）ＳＳはＵＤＰＧの生成に関与し、そのＵＤＰＧが、ＵＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＵＧＰアーゼ）、細胞質ゾルホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）、色素体ホスホグルコムターゼ、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）、及びデンプン合成酵素の一連の作用後に、最終的にデンプンに変換されるとする「従来の」機序を表す図である。（Ｂ）ＳＳは、細胞質ゾルにおけるＡＤＰＧの直接的な生成に関与しているとする「代替の」機序を表す図である。その後、ＡＤＰＧは、輸送体の作用によりアミロプラストへと輸送される。アミロプラストの内部に入った後、デンプン合成酵素はデンプンを生成するためにそのＡＤＰＧを利用する。
【図２】葉におけるデンプン生合成の機序を表す図である。（Ａ）デンプン生合成のプロセス全体が葉緑体の内部で起こるとする「従来の」機序を表す図である。この見解によれば、デンプン代謝とスクロースは連結していない。さらに、ＳＳは、糖新生のプロセスに関与していない。（Ｂ）ＳＳは、細胞質ゾルにおけるＡＤＰＧの直接的な合成に関与しているとする、デンプン生合成の「代替の」機序を表す図である。その後、ＡＤＰＧは、色素体の内部へと輸送され、そこで、デンプン合成酵素はデンプン合成反応用の基質としてそのＡＤＰＧを利用する。
【図３Ａ】ｐＥＴ−２８ａ（＋）及びｐＳＳからｐＥＴ−ＳＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図３Ｂ】ｐＥＴ−２８ａ（＋）及びｐＳＳからｐＥＴ−ＳＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ａ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ｂ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図４Ｃ】ｐＢＩＮ２０及びｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳからｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ａ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ｂ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図５Ｃ】ｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍ、ｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ、及びｐＢＩＮ２０からｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ発現プラスミドを構築する際のステップを表す図である。
【図６】大腸菌の様々な株におけるｐＥＴ−ＳＳの発現を表す。（Ａ）ｐＥＴ又はｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた細菌抽出物のＳＳ活性（細菌タンパク質１ミリグラム当たりのミリユニット（ｍＵ））を表す。この反応は、スクロースを分解し、ＡＤＰＧを生成する方向に起こった。反応混液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％ポリエチレングリコール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ ＫＣ１、及び２ｍＭ ＡＤＰを含有した。反応は３７℃で１０分間行った。（Ｂ）ｐＥＴ及びｐＥＴ−ＳＳで形質転換させた様々な大腸菌株から得たタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。組換型ＳＳＸの位置をアスターリスクで示している。
【図７】ＳＳ、ＡＤＰＧ（ＵＤＰＧ）ピロホスファターゼ、ＰＧＭ、及びＧ６ＰＤＨの共役反応に基づくキットによる、オオムギ内胚乳の様々な発育段階におけるスクロースの測定を表すグラフである。これらの結果は、ＳＳ及びＵＤＰＧデヒドロゲナーゼの共役反応に基づくキットの使用、並びにＣａｒｂｏ−ＰａｃＰＡ１カラムに連結したＤＸ−５００ Ｄｉｏｎｅｘシステムでのアンペロメトリック検出を伴う高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用によって並行して得られた結果と同一であった。横軸：開花後の日数縦軸：スクロース含有量／内容（μｍｏｌ／ｇＦＷ）
【図８】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のＳＳ活性を表すグラフである。新鮮重１グラム当たりのミリユニット（ｍＵ）で活性を表す。このユニットは、１分当たり１マイクロモルのＡＤＰＧを生成するのに必要とされるＳＳの量として定義される
【図９】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のデンプン含有量を表すグラフである。
【図１０】野生型（ＷＴ）ジャガイモ植物、並びに３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）又はＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の葉のＡＤＰＧ含有量を表すグラフである。
【図１１】ＷＴ植物（●）、３５Ｓ−ＳＳＮＯＳ（■）、及びＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳ（▲）の葉における、明期８時間、暗期１６時間の光周期での（Ａ）デンプン及び（Ｂ）ＡＤＰＧの一時的蓄積を表すグラフである。
【図１２】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、再生させた対照（ＲＧ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物（４、５、６、１２系統）の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）ＳＳ活性を表すグラフである。新鮮重１グラム当たりのミリユニット（ｍＵ）で活性を表す。このユニットは、１分当たり１マイクロモルのＡＤＰＧを生成するのに必要とされるＳＳの量として定義される。
【図１３】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、再生させた対照（ＲＧ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物（４、５、６、１２系統）の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）デンプン含有量を表すグラフである。
【図１４】野生型ジャガイモ植物（ＷＴ）、及び（アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＣＥＣＴ：５８５１の作用による）３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳ構築物のゲノム中への組み込み後にＳＳＸを過剰発現するジャガイモ植物の塊茎の（新鮮重ＦＷに対する）ＡＤＰＧ含有量を表すグラフである。
【図１５】ＡＧＰアーゼ欠損シロイヌナズナＴＬ２５の葉のデンプン含有量（Ａ）及びＡＤＰＧ含有量（Ｂ）を表す。
【図１６】ＡＧＰアーゼ欠損ジャガイモＡＧＰ６２及びＡＧＰ８５の葉のデンプン含有量（Ａ）及び（Ｂ）ＡＤＰＧ含有量を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高レベルの可溶性且つ活性型の組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）酵素を効率的に作製する方法であって、
ａ）ジャガイモＳＳ４のＳＳのアイソフォームをコードする遺伝子のヌクレオチド配列から配列番号１及び配列番号２によって示される２種のプライマーを得、それらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のｃＤＮＡライブラリーに基づき、配列番号３によって示される２４１８塩基対のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅するステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ｃＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、演繹されるアミノ酸配列が配列番号４によって示されるＳＳＸをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳに融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳＸを単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップｂ）で使用される第１の発現ベクターが、配列番号３に挿入されると図３Ａの構築物ｐＳＳを生じるプラスミドｐＳＫであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項３】
ｐＳＫプラスミドを増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１ Ｂｌｕｅであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、図３Ｂで示されるプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、図３Ｃで示されるｐＥＴ−ＳＳプラスミドを生じることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項７】
可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８５０であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項８】
ＳＳＸを合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項９】
ＳＳＸの精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いた、ヒスチジン残基に富むアミノ酸配列に対するアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１０】
活性型の精製されたＳＳＸ酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１１】
組換型のジャガイモＳＳ５アイソフォームの作製方法であって、
ａ）構築物ｐＳＳを鋳型として使用し、［配列番号５、配列番号６］、［配列番号７、配列番号８］、及び［配列番号９、配列番号１０］の配列を有するプライマー対を連続して使用した後に特異的突然変異誘発を起こすことによって、配列番号１１によって示される２４１８塩基対のＤＮＡ断片を得るステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、アミノ酸配列が配列番号１２によって示されるＳＳ５をコードするＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳ５に融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳ５を単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ステップｂ）が構築物ｐＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１３】
ｐＳＳ５を増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅであることを特徴とする、請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、プラスミドｐＥＴ−ＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１７】
可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８４９であることを特徴とする、請求項１１から１６までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１８】
ＳＳ５を合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１９】
ＳＳ５の精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２０】
活性型の精製されたＳＳ５酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、任意の微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、請求項１１から１９までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２１】
配列番号４によって示される演繹された配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１から１０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２２】
スクロース及びＵＤＰが存在する場合の比活性がタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニットであり、Ｋｍ（ＵＤＰ）＝０．２５ｍＭ及びＫｍ（スクロース）＝３０ｍＭの動態パラメータを有することを特徴とする、請求項２１に記載の可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２３】
配列番号１２によって示される演繹されたアミノ酸配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１１から２０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、請求項２１及び２２に記載の可溶性且つ活性な組換型酵素製品のＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２４】
ＵＤＰ及びＡＤＰが存在する場合の比活性がそれぞれタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニット及び６０ユニットであり、ＵＤＰ及びＡＤＰに対する動態パラメータがＫｍ（ＵＤＰ）＝Ｋｍ（ＡＤＰ）＝０．３ｍＭであることを特徴とする、請求項２３に記載の組換型ＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２５】
適切な条件下でＵＤＰ及びＳＳＸをインキュベートし、次いで、生成されたＵＤＰＧを単離及び精製することを特徴とする、ＵＤＰＧ作製における請求項２１及び２２に記載の酵素製品の使用。
【請求項２６】
請求項２５に記載の使用であって、
ａ）以下の溶液、即ち、
スクロース １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｍＭ
ポリエチレングリコール ２０％
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １５ｍＭ
ＵＤＰ １００ｍＭ
ＳＳＸ ３０Ｕ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｂ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｃ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｄ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＵＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項２７】
適切な条件下でＡＤＰ及びＳＳ５をインキュベートし、次いで、生成されたＡＤＰＧを単離及び精製することを特徴とする、ＡＤＰＧ作製における請求項２３及び２４に記載の酵素製品の使用。
【請求項２８】
請求項２７に記載の使用であって、
ｅ）以下の溶液、即ち、
スクロース １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｍＭ
ポリエチレングリコール ２０％
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １５ｍＭ
ＡＤＰ １００ｍＭ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｆ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｇ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｈ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＡＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項２９】
スクロースの分光光度的／蛍光定量的／アンペロメトリックな測定用のアッセイキットを製造する際の、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を有する酵素製品の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＡＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＡＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＵＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３２】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットのＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ
ｄ．０．５ｍＭのＮＡＤ
ｅ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｆ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３３】
アッセイキットに含まれるＳＳが、任意選択で、ＳＳ４、ＳＳ５、若しくはＳＳＸ、又はそれらの組合せであることを特徴とする、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
ＳＳを発現するトランスジェニック植物の作製における、ＳＳをコードするＤＮＡの使用であって、前記ＤＮＡを含み発現する遺伝子構築物を適切なベクター中に挿入し、前記遺伝子構築物を植物のゲノムに導入することを特徴とする使用。
【請求項３５】
使用されるｃＤＮＡがＳＳＸをコードしていることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項３５に記載の使用であって、以下のステップ、即ち、
ａ）ＳＳＸ遺伝子又はＳＳをコードする他の任意の変種のそれぞれ５’及び３’領域の３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーターをｐＳＳプラスミドに連続的に挿入することにより、図４Ｂに示す制限地図を有するプラスミドｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｂ）酵素ＮｏｔＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩでｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを連続的に消化するステップと、
ｃ）予めＥｃｏＲＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩで連続的に消化しておいたバイナリープラスミドｐＢＩＮ２０内に、作製した断片をクローニングして、図４Ｃに示すプラスミドｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを得るステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮ３５Ａ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８：ＧＶ２２６０に挿入して、形質転換株ＣＥＣＴ ５８５１を得るステップと、
ｆ）形質転換株ＣＥＣＴ ５８５１で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３７】
請求項３５に記載の使用であって、以下のステップ、即ち、
ａ）図５Ａで示す制限地図を有するプラスミドｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍを作製するために、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットをコードしている遺伝子のプロモーターをｐＧＥＭＴプラスミドに連続的に挿入するステップと、
ｂ）遊離された断片をｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳの対応する制限部位に挿入するために酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩでｐＧＥＭＰ−ＲＢＣＳを消化して、図５Ｂで示す制限地図を有するｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＮｏｔＩで連続的にｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを消化し、遊離された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＥｃｏＲＩで連続的に消化したｐＢＩＮ２０中にクローニングして、図５Ｃで示す制限地図を有するｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンスＣ５８：ＧＶ２２６０に挿入し、その形質転換株で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３８】
ＳＳ酵素活性の過剰発現を特徴とする、請求項３３から３７までに記載の使用の方法によって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記過剰発現が、非トランスジェニック野生型植物の同じ組織中で認められる酵素活性の２〜１０倍程度高いＳＳ酵素活性レベルを呈することを特徴とする、請求項３７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
好ましくは、タバコ、ジャガイモ、トマト、又はイネ植物から選択されることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
さらに、同一の条件下で栽培された対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察される含有量より、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量がより多いことを特徴とする、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
対応する野生型植物の葉で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い葉を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い根、塊茎、及び／又は種子を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１】
高レベルの可溶性且つ活性型の組換型スクロースシンターゼ（ＳＳ）酵素を効率的に作製する方法であって、
ａ）ジャガイモＳＳ４のＳＳのアイソフォームをコードする遺伝子のヌクレオチド配列から配列番号１及び配列番号２によって示される２種のプライマーを得、それらのプライマーを用いて、ジャガイモの葉のｃＤＮＡライブラリーに基づき、配列番号３によって示される２４１８塩基対のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅するステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ｃＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、演繹されるアミノ酸配列が配列番号４によって示されるＳＳＸをコードするｃＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳに融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳＸを単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップｂ）で使用される第１の発現ベクターが、配列番号３に挿入されると図３Ａの構築物ｐＳＳを生じるプラスミドｐＳＫであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項３】
ｐＳＫプラスミドを増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１ Ｂｌｕｅであることを特徴とする、前記請求項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、図３Ｂで示されるプラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、図３Ｃで示されるｐＥＴ−ＳＳプラスミドを生じることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項７】
可溶性且つ活性型のＳＳＸを合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８５０であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項８】
ＳＳＸを合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項９】
ＳＳＸの精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いた、ヒスチジン残基に富むアミノ酸配列に対するアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１０】
活性型の精製されたＳＳＸ酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組換型ＳＳの作製方法。
【請求項１１】
組換型のジャガイモＳＳ５アイソフォームの作製方法であって、
ａ）構築物ｐＳＳを鋳型として使用し、［配列番号５、配列番号６］、［配列番号７、配列番号８］、及び［配列番号９、配列番号１０］の配列を有するプライマー対を連続して使用した後に特異的突然変異誘発を起こすことによって、配列番号１１によって示される２４１８塩基対のＤＮＡ断片を得るステップと、
ｂ）第１のベクター中に前記ＤＮＡ断片を挿入するステップと、
ｃ）前記第１のベクターを、増幅場所とする第１の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｄ）増幅された構築物を少なくとも２種の制限酵素で消化するステップと、
ｅ）先に消化した後に、アミノ酸配列が配列番号１２によって示されるＳＳ５をコードするＤＮＡ断片を得るステップと、
ｆ）ヒスチジンに富む配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと同じ制限部位に前記断片をクローニングし、前記ヒスチジンに富む末端をＳＳ５に融合し、第２の発現ベクターを作製するステップと、
ｇ）この第２のベクターを、発現場所とする第２の宿主微生物中に挿入するステップと、
ｈ）前記形質転換された微生物を、可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件でインキュベートするステップと、
ｉ）活性型のＳＳ５を単離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
ステップｂ）が構築物ｐＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１３】
ｐＳＳ５を増幅させるためにステップｃ）で使用される第１の宿主微生物が大腸菌ＸＬ１ Ｂｌｕｅであることを特徴とする、請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１４】
ステップｄ）で使用される制限酵素がＮｃｏＩ及びＮｏｔＩであることを特徴とする、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１５】
ステップｆ）において、ステップｄ）後に遊離されるＤＮＡ断片がクローニングされる制限部位が、プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）と同じであり、プラスミドｐＥＴ−ＳＳ５を生じることを特徴とする、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１６】
ステップｇ）で使用される第２の宿主微生物が大腸菌のＢＬＲ（ＤＥ３）株であることを特徴とする、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１７】
可溶性且つ活性型のＳＳ５を合成するのに適した培養条件においてステップｈ）でインキュベートされる、ステップｇ）で形質転換された株がＣＥＣＴ５８４９であることを特徴とする、請求項１１から１６までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１８】
ＳＳ５を合成するのに適した培養条件が、細菌培養物を２０℃の温度下に置くステップを含むことを特徴とする、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項１９】
ＳＳ５の精製が、好ましくは、イミダゾールを好ましくは２００ｍＭの濃度で含む溶出緩衝液を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって実施されることを特徴とする、請求項１１から１８までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２０】
活性型の精製されたＳＳ５酵素を維持するために、アフィニティクロマトグラフィーから溶出された前記精製酵素を直ちに透析にかけて、任意の微量のイミダゾールを除去することを特徴とする、請求項１１から１９までのいずれか一項に記載の組換型ＳＳ５の作製方法。
【請求項２１】
配列番号４によって示される演繹された配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１から１０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２２】
スクロース及びＵＤＰが存在する場合の比活性がタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニットであり、Ｋｍ（ＵＤＰ）＝０．２５ｍＭ及びＫｍ（スクロース）＝３０ｍＭの動態パラメータを有することを特徴とする、請求項２１に記載の可溶性且つ活性な組換型ＳＳＸ酵素製品。
【請求項２３】
配列番号１２によって示される演繹されたアミノ酸配列を有し、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を示すことを特徴とする、請求項１１から２０までに記載の方法で請求されるようにして得ることができる、請求項２１及び２２に記載の可溶性且つ活性な組換型酵素製品のＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２４】
ＵＤＰ及びＡＤＰが存在する場合の比活性がそれぞれタンパク質１ｍｇ当たり８０ユニット及び６０ユニットであり、ＵＤＰ及びＡＤＰに対する動態パラメータがＫｍ（ＵＤＰ）＝Ｋｍ（ＡＤＰ）＝０．３ｍＭであることを特徴とする、請求項２３に記載の組換型ＳＳ５アイソフォーム。
【請求項２５】
適切な条件下でＵＤＰ及びＳＳＸをインキュベートし、次いで、生成されたＵＤＰＧを単離及び精製することを特徴とする、ＵＤＰＧ作製における請求項２１及び２２に記載の酵素製品の使用。
【請求項２６】
請求項２５に記載の使用であって、
ａ）以下の溶液、即ち、
スクロース １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｍＭ
ポリエチレングリコール ２０％
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １５ｍＭ
ＵＤＰ １００ｍＭ
ＳＳＸ ３０Ｕ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｂ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｃ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｄ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＵＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項２７】
適切な条件下でＡＤＰ及びＳＳ５をインキュベートし、次いで、生成されたＡＤＰＧを単離及び精製することを特徴とする、ＡＤＰＧ作製における請求項２３及び２４に記載の酵素製品の使用。
【請求項２８】
請求項２７に記載の使用であって、
ｅ）以下の溶液、即ち、
スクロース １Ｍ
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ １ｍＭ
ポリエチレングリコール ２０％
ＭｇＣｌ２ １ｍＭ
ＫＣｌ １５ｍＭ
ＡＤＰ １００ｍＭ
の１００ｍｌを３７℃で１２時間インキュベートするステップと、
ｆ）好ましくは１００℃で９０秒間加熱することによって反応を停止するステップと、
ｇ）１００００ｇで１０分間遠心分離するステップと、
ｈ）上清をＨＰＬＣによるクロマトグラフィーにかけ、従来の方法によってＡＤＰＧを溶離及び精製するステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項２９】
スクロースの分光光度的／蛍光定量的／アンペロメトリックな測定用のアッセイキットを製造する際の、スクロースシンターゼ（ＳＳ）活性を有する酵素製品の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＡＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＡＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットの植物、動物、又は微生物由来ＵＤＰＧピロホスファターゼ
ｄ．２ユニットのＰＧＭ
ｅ．２ユニットのＧ６ＰＤＨ
ｆ．０．５ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）
ｇ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｈ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３２】
請求項２９に記載の使用であって、以下のインキュベーション媒体、即ち、
ａ．２ユニットのＳＳ
ｂ．２ｍＭのＵＤＰ
ｃ．２ユニットのＵＤＰＧデヒドロゲナーゼ
ｄ．０．５ｍＭのＮＡＤ
ｅ．反応緩衝液１００ｍｌ：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０／１ｍＭ ＥＤＴＡ／２０％ポリエチレングリコール／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１５ｍＭ ＫＣ１
ｆ．予めろ過した試験サンプル
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３３】
アッセイキットに含まれるＳＳが、任意選択で、ＳＳ４、ＳＳ５、若しくはＳＳＸ、又はそれらの組合せであることを特徴とする、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
ＳＳを発現するトランスジェニック植物の作製における、ＳＳをコードするＤＮＡの使用であって、前記ＤＮＡを含み発現する遺伝子構築物を適切なベクター中に挿入し、前記遺伝子構築物を植物のゲノムに導入することを特徴とする使用。
【請求項３５】
使用されるｃＤＮＡがＳＳＸをコードしていることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項３５に記載の使用であって、以下のステップ、即ち、
ａ）ＳＳＸ遺伝子又はＳＳをコードする他の任意の変種のそれぞれ５’及び３’領域の３５Ｓプロモーター及びＮＯＳターミネーターをｐＳＳプラスミドに連続的に挿入することにより、図４Ｂに示す制限地図を有するプラスミドｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｂ）酵素ＮｏｔＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩでｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを連続的に消化するステップと、
ｃ）予めＥｃｏＲＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＨｉｎｄＩＩＩで連続的に消化しておいたバイナリープラスミドｐＢＩＮ２０内に、作製した断片をクローニングして、図４Ｃに示すプラスミドｐＢＩＮ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳを得るステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮ３５Ａ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８：ＧＶ２２６０に挿入して、形質転換株ＣＥＣＴ ５８５１を得るステップと、
ｆ）形質転換株ＣＥＣＴ ５８５１で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３７】
請求項３５に記載の使用であって、以下のステップ、即ち、
ａ）図５Ａで示す制限地図を有するプラスミドｐＧＥＭＴ−ＲＢＣＳｐｒｏｍを作製するために、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットをコードしている遺伝子のプロモーターをｐＧＥＭＴプラスミドに連続的に挿入するステップと、
ｂ）遊離された断片をｐ３５Ｓ−ＳＳ−ＮＯＳの対応する制限部位に挿入するために酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩでｐＧＥＭＰ−ＲＢＣＳを消化して、図５Ｂで示す制限地図を有するｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＮｏｔＩで連続的にｐＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを消化し、遊離された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＥｃｏＲＩで連続的に消化したｐＢＩＮ２０中にクローニングして、図５Ｃで示す制限地図を有するｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを作製するステップと、
ｄ）大腸菌（ＸＬ１ Ｂｌｕｅ）中でｐＢＩＮＲＢＣＳ−ＳＳ−ＮＯＳを増幅させるステップと、
ｅ）上記のステップで増幅された遺伝子構築物をアグロバクテリウムチュメファシエンスＣ５８：ＧＶ２２６０に挿入し、その形質転換株で植物をトランスフェクションするステップと
を含むことを特徴とする使用。
【請求項３８】
ＳＳ酵素活性の過剰発現を特徴とする、請求項３３から３７までに記載の使用の方法によって得ることができるトランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記過剰発現が、非トランスジェニック野生型植物の同じ組織中で認められる酵素活性の２〜１０倍程度高いＳＳ酵素活性レベルを呈することを特徴とする、請求項３７に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
好ましくは、タバコ、ジャガイモ、トマト、又はイネ植物から選択されることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
さらに、同一の条件下で栽培された対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察される含有量より、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量がより多いことを特徴とする、請求項３８から４０までのいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４２】
対応する野生型植物の葉で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い葉を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４３】
対応する野生型植物の同じ組織又は器官で観察されるより、スクロース、Ｇ６Ｐ、ＡＤＰＧ、及びデンプンの含有量が多く、アミロース／アミロペクチン比が高い根、塊茎、及び／又は種子を有する、請求項４０に記載のトランスジェニック植物。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１】
【図６】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５２０２２８（Ｐ２００７−５２０２２８Ａ）
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５１８６５（Ｐ２００６−５５１８６５）
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００５／０７００１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６４９
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２６７４６６）ユニベルシダド パブリカ デ ナバラ (1)
【出願人】（５０５３３７７７７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００５／０７００１０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７５６４９
【国際公開日】平成１７年８月１８日（２００５．８．１８）
【出願人】（５０６２６７４６６）ユニベルシダド パブリカ デ ナバラ (1)
【出願人】（５０５３３７７７７）
【Ｆターム（参考）】
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