経皮液体
【課題】癌または腫瘍、炎症性障害、特に乳癌の治療または予防に有用であり、市販の抗エストロゲン剤である乳癌治療用タモキシフェンまたはアナストロゾールなどのホルモン性薬剤に見られるような副作用がなく、有効性の高い薬剤を提供する。
【解決手段】α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類の１種以上を含有する経皮液体であり、前記液体は、公知の医薬と併用してまたは単独で使用できる。
【解決手段】α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類の１種以上を含有する経皮液体であり、前記液体は、公知の医薬と併用してまたは単独で使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮液体に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界中で毎年およそ１００万人の女性を襲い、現在の治療でも多くの患者を実際に助けているが、３５万人を超える人が本疾患で死亡している。米国では、２００４年に２１５，９９０人の女性が乳癌と診断され、４０，１１０名が本疾患で死亡した。マレーシアでは、女性では乳癌が最も多い癌である。２００２年、マレーシアでは、ナショナルキャンサーレジストリ（国立癌登録）において乳癌の新規症例は４，３３７名と記録されており、女性の癌全ての３０．４％を占めている。
【０００３】
乳癌発生率の国際的変動と移住者における発生率変化から、乳癌のリスクが環境要因、特に食事に影響を受け、従って、予防可能であることが示唆されている。
【０００４】
乳癌のリスク要因として確立されているものには、乳癌の家族歴、早期初潮、初産の晩年化、閉経の晩年化、および良性胸部疾患の病歴が含まれる。本疾患に対する遺伝的素因を除いて、残りのリスク要因は、エストロゲンに対する女性の生涯暴露を指摘している。エストロゲンは本疾患の原因ではないが、乳癌の進行と進展に関与している。抗エストロゲン剤類が、従って、乳癌進行の制御における治療法として用いられている。
【０００５】
α−Ｔの血漿または脂肪組織濃度によりビタミンＥに対する暴露を評価した観察研究では、α−Ｔが乳癌に対するなんらかの防御を提供するという考えに対して一貫して裏づけを付与できなかった。対照的に、ヒト乳癌細胞における研究では、α―、γ−、δ−Ｔ３が強力な抗増殖性およびプロアポトーシス効果を有しており、それらが乳癌リスクを低下すると期待されるであろうと示唆しているが、一方、α−Ｔは、全く効果を有していなかった。Ｇａｌｌｉおよび共同研究者らは、最近、α−Ｔと比較してγ−Ｔが前立腺癌細胞増殖にはるかに強い阻害効果を示すことを実証した。しかし、彼は、Ｔ３ホモローグ類でさらに試験し、γ−Ｔ３がγ―Ｔよりも高い抗増殖効果を有していることを見出した。したがって、食事性ビタミンＥと関連した適度の乳癌防御が食事中の他のＴおよびＴ３の効果によるのかもしれないと推定できるようである。
【０００６】
科学的研究が、食事中にありうる機能的特性、抗酸化剤または他のものを関連づけるために行われ、それらは、癌のような疾患を防御する際に効率的でありうる。ひとつのそのような抗酸化剤は、ビタミンＥである。これまでの８種の食事成分類であるα−、β−、γ−、δ−トコフェロール類（Ｔ）およびα−、β−、γ−、δ−トコトリエノール類（Ｔ３）は全て、ビタミンＥの形態であると考えられた。α―Ｔは、ビタミンＥの最も生物学的に重要な形態であると考えられる。最近の指針では、α−ＴをビタミンＥと同等とみなしており、他のトコフェロール類およびトコトリエノール類を度外視している。トコフェロール類およびトコトリエノール類は、穀物、種子および木の実の油分画に存在している。ほとんどの食物源において、トコフェロール類は、トコトリエノール類よりも多い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、トコトリエノールまたはその誘導体またはその混合物の有効量を含む経皮液体を哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のために提供する。
【０００８】
さらに、トコトリエノールまたはその誘導体またはその混合物の有効量を含む経皮液体を哺乳類における炎症性障害の予防または治療のために提供する。
【０００９】
本発明は、いくつかの新しい特徴と下記で詳細に記載しかつ付属の図面に示した部分類の組み合わせから構成され、その詳細におけるさまざまな変更が本発明の範囲から逸脱することなく、すなわち本発明の利点をいずれも犠牲にすることなく行われることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の理解を助けるため、付属の図面において、上記記載とともに、本発明、その構成および作用ならびにその利点の多くが、容易に理解され納得されるであろう。
【００１１】
本発明は、経皮液体に関する。この明細書は、以下で、本発明の最良の形態に従い本発明を記載するであろう。しかし、本発明の最良の形態に前記記載を限定することは単に本発明の説明を容易にするためであり、当業者は、付属の請求の範囲から逸脱することなく、さまざまな修飾および等価物を工夫できることが分かるであろう。
【００１２】
本発明において、胸部脂肪組織にδ−トコトリエノールを運搬するための革新的経路を検討した。さらに、乳癌リスクを低下させるトコトリエノールの能力は胸部へのそれらの運搬により決定されるようであるので、胸部脂肪組織におけるこれらの食事性成分類の濃度を決定し、経皮取り込みと関連づけた。
【００１３】
脂肪酸類の食事摂取の定量的組成の生物学的マーカー類全ての中で、脂肪組織脂肪酸組成は特に有益で、理由は、それが長期ベースで脂肪酸類の定量的食事摂取を反映し、それによって、測定した生化学的パラメータに及ぼす本疾患に由来する潜在的バイアスを避けうるからである。さらに、トコフェロールおよびトコトリエノール類の乳癌リスクを低下させる能力は、それらの胸部への運搬により決定されるようであるので、胸部脂肪組織中におけるこれらの食事性成分類の濃度を決定し、これらの濃度を食事摂取と関連づけることは重要であろう。
【００１４】
下記に、乳癌治療用タモキシフェンまたはアナストロゾールのような市販の抗エストロゲン剤と比較し、トコトリエノール類の利点を述べる。トコトリエノール類は非ホルモン性の天然産物であり、過量による副作用は全く知られていない。タモキシフェンは、多くの副作用を有している。タモキシフェンまたはアナストロゾールと異なり、トコトリエノール類は、乳癌細胞株類のエストロゲンレセプター状況に関係なく、有効である。最大５年にわたり服用できるタモキシフェンと異なり、トコトリエノール類は、時間的制限が全く公知となっていない。トコトリエノール誘発アポトーシスは、デスレセプターアポトーシスシグナル伝達に無関係である。しかし、タモキシフェンまたはアナストロゾールのような薬剤類は、やがてデスレセプターからの応答消滅により無効となる。
【００１５】
δ−トコトリエノールは乳癌増殖の最も有効な阻害剤であり、また、タモキシフェンとともに最大の相乗的効率を有している（乳癌治療の目標標準）。トコトリエノールの経口投与は、血中への取り込み不良という結果となる。本文で、胸部にトコトリエノール類を運搬する代替方法を提供する。
【００１６】
マウス研究
ＢＡＬＢ／ｃマウスを２群に分けた。対照群は、担体であるエタノールのみを投与され、実験群には、δ−トコトリエノール１ｍｇを毎日、４週間投与した。背部に適用し、皮下吸収を調べた。腹部および胸部脂肪組織は、第１週に最大吸収（１０００倍）を示し、その後、皮下組織が続いた。血中、脾臓および肝臓におけるトコトリエノールレベルの有意な変化に、第４週までには到達した。
【００１７】
さらに、アルミニウムをアジュバントとした卵白アルブミン（５０μｇ）をマウスに皮下免疫した。インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を、ＯＶＡの抗原特異的刺激により測定した。δ−トコトリエノールを投与されたマウスでＩＦＮ−γの有意な上昇があった。さまざまな白血球マーカー抗体類を用いた単色フローサイトメトリ分析により、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＢ−リンパ球が対照に比較して、δ―トコトリエノール群で有意に増加した。
【００１８】
この代替運搬は、Ｔｈ１応答を介して有効な免疫系を明らかにすると同時に、特異的部位に対しての強力な化合物類運搬という期待できる結果を明らかにした。
【００１９】
用量
本発明の方法類に従い用いるように、トコトリエノール組成物類は、ヒト対象に必要に応じ毎日、１日当たり約１乃至３回投与の頻度で約１ｍｇ乃至１０００ｍｇを単回または複数回、経皮的に投与する。さらに好適には、１日当たり約２乃至３回の頻度で約１００ｍｇ乃至８００ｍｇの範囲で成人対象に製剤を付与する。最も好適には、約６００ｍｇの用量を１日当たり約２乃至３回の頻度で、成人対象に付与する。
【００２０】
動物類
週齢３〜４週の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｕｎｉｔ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＭＲ）、Ｋｕａｌａ Ｌｕｍｐｕｒ、Ｍａｌａｙｓｉａから入手した。実験動物の世話と取り扱いは、実験動物の倫理的取り扱いのためのＩＭＲガイドラインに適合していた。対照動物類は、エタノール単独のみで処理し、一方、実験群には、毎日、δ―トコトリエノール１ｍｇを運搬するために２０ｍｇ／ｍｌ濃度を０．５ｍｌ適用した。マウスは、また、アルミニウムをアジュバントとした（比１：１）卵白アルブミン（５０ｍｇ）により第１１日に皮下免疫した。
【００２１】
胸部脂肪組織におけるトコトリエノール類およびトコフェロール類の分析
トコフェロール類およびトコトリエノール類は、ＨＰＬＣにより分析した。用いたシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ、ＨＰＬＣであり、それには、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光分光分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｌａｓｓ ＶＰデータ取得ソフトウェア、およびシリカカラム（ＹＭＣ Ａ−０１２／１５０×６ｍｍ内径、５μｍ）を取り付けた。溶出溶媒はヘキサン／イソプロピルアルコール（９９．５／０．５ ｖ／ｖ）であり、流量は２．０ｍｌ／ｍｉｎであった。検出器は、励起波長２９５ｎｍであり、発光波長３２５ｎｍであった。脂肪組織５００ｍｇを、ヘキサン：エタノールおよび０．９％塩化ナトリウムの４：１：１混合物で、１００００ｒｐｍで５分間、均質にした。このホモジネートを次に２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。生成した上清をろ過し、ロータリエバポレータを用いて蒸発させた。既知量の脂質サンプルを、溶出溶媒を用いて１０ｍｌの容量フラスコ中で溶解させ、前記溶液１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。α、γ、およびδ−トコトリエノール類混合物の標準溶液もまた、同様に注入した。ビタミンＥの主要構成成分類の定量は、前記成分類のピーク領域を標準のそれと比較することによって、実施した。
【００２２】
Ｔ−リンパ球培養
実験マウスを、エーテルを用いて屠殺した。脾臓は、無菌的にＲＰＭＩ完全培地中に取り、単細胞懸濁液は、脾臓カプセルから脾臓細胞をすきだすことによって作製した。培養前に、細胞を０．４％トリパンブルーステイン（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）により染色し、細胞生存数を、血球計により計数した。脾臓細胞懸濁液を希釈し、５×１０６細胞／ｍｌ溶液を得て、コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を最終濃度２５μｇ／ｍｌで添加した。この懸濁液２００μｌを９６ウェルの平底組織培養プレートに接種し（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）、湿潤化させた３７℃のＣＯ２インキュベータ中に７２時間、放置した。各インキュベーション期間の最終時点でプレートをインキュベータから取り除き、−７０℃に保存した。プレートを、ＥＬＩＳＡ実行前に融解させた。
【００２３】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
−３０℃で凍結した組織培養プレートを融解させた。さまざまなウェルからのサンプルを、適切にラベルを付した清浄なエッペンドルフ試験管に移した。前記試験管を、４℃において１０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を、適切にラベルした新しいエッペンドルフ試験管に移した。ペレットを捨てた。上清をＥＬＩＳＡにより分析し、コンカナバリンＡによりインビトロ刺激後に産生したＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の量を定量した。ＥＬＩＳＡは、製造業者の指示に従い、マウスＩＦＮ−γおよびＩＬ−４用ＥＬＩＳＡキット類（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて行った。
【００２４】
抗体染色
フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン標識抗体類を、別々の試験管中で染色緩衝液５０μｌに対して抗体２０μｌを添加することによって、希釈した。マウス全血１００μｌを各試験管に添加し、静かに混合した。次に、サンプルを室温暗所で１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、ＲＢＣ溶解緩衝液２ｍｌを各試験管に添加し、静かに混合した。サンプルを次に４００ｇで室温下、５分間遠心分離した。洗浄段階は染色緩衝液２ｍｌを添加し行い、サンプルはまた、室温で５分間、４００ｇで遠心分離した。上清を取り除き、各試験管に染色緩衝液２００μｌを添加し、次に４％ホルマリンを２００μｌ、添加した。サンプルは、フローサイトメータを用いて分析した。
【００２５】
３，（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）
細胞の生存能力は、ＭＴＴアッセイにより測定した。このアッセイにおいて、ＭＴＴは、生細胞中で活性のデヒドロゲナーゼ類により、青色ホルマザン生成物に変換する。脾臓細胞は、培地総量２００μｌ中において９６ウェルプレートにコンカナバリンＡまたはＯＶＡを接種した。ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌを２５μｌ）を、各ウェルに添加した。４時間後、５０％ジメチルホルムアミド／５０％水溶液、ｐＨ４．０中に溶解させた２０％ＳＤＳから構成される抽出緩衝液１００μｌを添加した。形成された青色を５９０ｎｍで測定した。
【００２６】
脂肪組織中におけるδ―トコトリエノール組成物
図１は、異なる組織から得られた脂質抽出物中で測定したδ−Ｔ３を示している。胸部および腹部脂肪および皮下脂肪組織は、第１週から開始し第２週において最適濃度に達した経皮適用後に有意な増加を示す。第３週には、濃度低下があった。血液、肝臓および脾臓レベルの変化は、第４週にのみ見られた。
【００２７】
ＭＴＴ
図２はＭＴＴ結果を示している。ＭＴＴアッセイでは、細胞増殖または細胞死が、着色産物ホルマザンへの前記テトラゾリウム塩の変換または無変換により示唆されるという原理を用いており、ホルマザンの濃度は、分光分析により測定できる。図２からわかるように、対照および実験脾臓細胞類両者ともに、コンカナバリンＡまたはＯＶＡの添加により正常に増殖した（ＯＤ読み取り値に変化なし）。
【００２８】
δ―トコトリエノールはワクチン接種によりインターフェロン−γの産生を刺激する
ＯＶＡで免疫したマウスにおける免疫細胞活性に及ぼすδ―Ｔ３の効果を評価するため、マウス全てを検査し、異なる処置後のＩＦＮ−γおよびＩＬ―４のレベルを比較した。図３に示したように、σ−Ｔ３を投与されＯＶＡで免疫したマウスの脾臓細胞中のＩＦＮ−γ濃度は、対照マウスよりも有意に高かった。
【００２９】
抗体反応
図４はナチュラルキラー細胞の増加を示し、δ−トコトリエノールを投与されたマウスでＢ−リンパ球が観察され、一方、図５は、Ｖ３におけるＢＡＬＢ／ｃマウスのＴＮＦ−アルファレベルを示している。
【００３０】
トコトリエノールの吸収については、ほとんどわかっていない。α−トコフェロールを身体が好むことは、確立されている。さらに、ラットにおいて食事性α−Ｔがα−Ｔ３を低下させるがγ−Ｔ３は低下させないことが明らかとなっている。トコトリエノール類が脂肪組織およびその皮膚に優先的に分布していることに注目するのはおもしろい。これらの組織におけるα−Ｔ３の濃度は、ラットにα―Ｔ３またはα―Ｔをそれぞれ５０ｍｇ与えた時に、α―Ｔよりも有意に高くなることが観察された。このことは、おそらく、トコトリエノール類がリンパ系を介してこれらの組織に分布されるという証拠を付与するか、または、前記観察がα−ＴＴＰアフィニティメカニズムによって説明できないということに鑑み、分布のための未知のα−ＴＴＰ独立経路があるのかもしれないという証拠を提供する。
【００３１】
ヒト研究
研究群はクアラルンプール病院から由来し、マレーシア、健康省、倫理委員会により承認を受けていた。検討した女性７５名中、４０名が乳癌であり、３５名が、良性の胸部病理所見を有していた。両群の女性とも胸部腫瘤を示していた。両群とも手術前に良性か悪性かについて病理を証明するために造影および生検を受けており、胸部からの脂肪組織は、手術時に得られた。提出された組織は、実際の病理ではないが周辺脂肪組織由来であった。標本を最初に病理学的に評価した後、脂肪組織０．２〜１．０ｇを生理食塩水で洗浄し、液体窒素ですぐに凍結し、分析するまでバイアル中で−７０℃に保存した。
【００３２】
脂肪組織調製物および脂肪酸分析
総脂質を、クロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）で脂肪組織から抽出した。抽出物を塩化ナトリウムで洗浄し、混合物を２相に分離させた。クロロホルム層は試験管に移し、窒素下で乾燥するまで蒸発させた。脂質抽出物を、クロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）２００μｌに溶解させ、直接カラム操作に用いた。
【００３３】
トリアシルグリセロールは、下記のようにしてシリカ試験管（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｆｒａｎｃｅ）による吸着クロマトグラフィにより精製した：カラムをクロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）２ｍｌで前処置した。次に、脂質サンプルをカラムに適用し、同一系溶媒１００μｌで処置した試験管を前記カラムに添加した。トリアシルグリセロール類は、クロロホルム２０ｍｌで溶出した。クロロホルム分画を、テフロン（登録商標）シールを有するねじ込み式栓を有する試験管に集めた。得られた分画を、乾燥するまで蒸発させた。２Ｎナトリウムメトキサイド３００μｌと三フッ化臭素５００μｌを添加し、脂肪酸類をそれらのメチルエステル類に変換した。混合物を室温で１５分間、混合振とうした。脂肪酸メチルエステル類は２回、ヘキサン中に抽出した。
【００３４】
脂肪酸メチルエステル類（ＦＡＭＥ）組成物は、毛細管ガスクロマトグラフィにより決定した。このシステムは、冷オンカラムインジェクターとフレームイオン化検出器を付属させたＧＣ８００シリーズクロマトグラフ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）から構成されていた。長さ６０ｍで内径０．２２ｍｍの溶融シリカカラム（Ｖａｒｉａｎ，ＵＳＡ）を用いた。ヘリウムを、流量１．５ｍｌ／ｍｉｎでキャリアーガスとして用いた。検出器温度は、２８０℃であった。冷オンカラムインジェクター（６０℃）から１μｌを注入した。オーブンの温度は、１５℃／分の速度で６０〜１７０℃に上昇させ、２０分間一定のままとし、５℃の速度で１７０〜１９０℃に上昇させ、１０分間一定のままとし、１℃／分の速度で１９０〜２１５℃に上昇させ１０分間一定のままとするようにプログラムした。ＦＡＭＥの同定は、それらの相対的保持時間をそれらの純粋な標準混合物と比較することによって、得られた。各脂肪酸の相対量は、基準値におけるピークを積算し、結果を全脂肪酸類の総領域で割ることによって定量した。全ての積算は、同一の実験室作業者が行った。総領域の１％未満を説明するピークが全て検出され、定量された。
【００３５】
胸部脂肪組織におけるトコトリエノール類とトコフェロール類の分析
トコフェロール類とトコトリエノール類は、ＨＰＬＣによって分析した。用いたシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ、ＨＰＬＣであり、それには、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光分光分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｌａｓｓ ＶＰデータ取得ソフトウェア、およびシリカカラム（ＹＭＣ Ａ−０１２／１５０×６ｍｍ内径、５μｍ）を取り付けた。溶出溶媒はヘキサン／イソプロピルアルコール（９９．５／０．５ ｖ／ｖ）であり、流量は２．０ｍｌ／ｍｉｎであった。検出器は、励起波長２９５ｎｍであり、発光波長３２５ｎｍであった。脂肪組織５００ｍｇを、ヘキサン：エタノールおよび０．９％塩化ナトリウムの４：１：１混合物で、１００００ｒｐｍで５分間、均質にした。このホモジネートを次に２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。生成した上清をろ過し、ロータリエバポレータを用いて蒸発させた。既知量の脂質サンプルを、溶出溶媒を用いて１０ｍｌの容量フラスコ中で溶解させ、前記溶液１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。α、γ、およびδ−トコトリエノール類混合物の標準溶液もまた、同様に注入した。ビタミンＥの主要構成成分類の定量は、前記成分類のピーク領域を標準のそれと比較することによって、実施した。
【００３６】
統計
それぞれの脂肪酸類の平均および標準偏差を計算し、各族における脂肪酸類の総計を求めた。統計解析は、ＳＰＳＳプログラムを用いて行った。両側スチューデントｔ検定を用いて、脂肪組織における脂肪酸組成（ＦＡＣ）とビタミンＥレベルに関して、乳癌女性と乳癌のない女性の間で差平均を比較した。結果は、ｐ＜０．０５において有意とみなした。
【００３７】
胸部脂肪組織における脂肪酸組成
下記の表１は、良性および悪性腫瘤における胸部脂肪の脂肪酸組成を示している。胸部脂肪組織における主要脂肪酸類は、オレイン酸（１８：１ ｎ−９ｃ）、パルミチン酸（１６：０）、リノレン酸（１８：２ ｎ−６）およびステアリン酸（１８：０）であった。これらの脂肪酸類は、クロマトグラフィ曲線下総面積の約９０％を占めていた。良性および悪性腫瘤由来の胸部脂肪組織ＦＡＣに有意な差はなかった。
【００３８】
【表１】
【００３９】
胸部脂肪組織におけるビタミンＥ組成
下記の表２は、悪性胸部腫瘤を有する患者４０例および良性胸部腫瘤を有する患者３５例から得られた胸部脂肪組織の脂質抽出物中で測定したＴおよびＴ３を示している。ＴおよびＴ３の含量は、μｇ／ｇ脂肪組織で表した。悪性腫瘤において、胸部脂肪組織におけるα−Ｔの平均含量は、１２６．２μｇ／ｇ脂肪組織であり、一方、良性腫瘤においては１４７．０μｇ／ｇであった。特にα−Ｔについて患者間で大きな変動が見られた。これは、多くの食品においてトコフェロール類が主要であるので、食事摂取パターンに差があることによるのかもしれなかった。しかし、脂肪組織におけるα−Ｔの平均は、良性対象と悪性癌患者で有意に異なることはなかった（ｐ＝０．４３５）。平均γ−Ｔ（７．５１対６．１８）およびδ−Ｔ（１．２６対０．６５）レベルもまた、良性に比較して悪性患者で低下していた。γ−Ｔについては有意ではなかったが（ｐ＝０．３６３）、δ−Ｔのレベル低下は、有意であった（ｐ＝０．０３３）。
【００４０】
【表２】
【００４１】
乳癌患者において、胸部脂肪組織におけるα−、γ―およびδ−Ｔ３の平均含量は、１３．７３μｇ／ｇ脂肪組織であった。良性腫瘤を有する患者においては、２０．０μｇ／ｇ脂肪組織であった。平均Ｔ３値は、良性腫瘤を有する対象に比べて乳癌患者では、有意に（ｐ＝０．００６）小さかった。良性に比較して悪性組織でα−Ｔ３（ｐ＝０．００６）、γ−Ｔ３（ｐ＝０．０４７）およびδ―Ｔ３（ｐ＝０．０１８）の低下が見られた。αおよびγ―Ｔ３が大きくなるにつれトコトリエノール類の分布はまた、パーム油におけるトコトリエノール類の組成を非常によく反映している。
【００４２】
脂肪組織濃度を用いた乳癌患者における長期ビタミンＥ栄養状況の評価は、血漿レベル測定に勝る決定的利点を有している。トコフェロールおよびトコトリエノール類の血漿レベルは、食事摂取を調節するとヒトで非常に急激に変化し、数日中に新しい安定状態レベルに達する。脂肪組織におけるα−Ｔの含量を、ビタミンＥの食事摂取と関連づけてヒトで評価し、α―Ｔ含量がビタミンＥの長期食事摂取を反映していることが示された。
【００４３】
注意して脂肪組織を採取したいくつかの研究で、脂肪組織トコフェロール類と乳癌リスクの関連を調べた。全体的にみて、乳癌リスクとビタミンＥの関連についての研究では、ビタミンＥへの食事による暴露増加ではわずかしか乳癌リスクを低下させない可能性が示唆されている。しかし、全てではないにしてもほとんどがα−Ｔの形状にあるサプリメントによるビタミンＥがなんらかの防御を付与する証拠は全くない。さらに、細胞培養データは、タモキシフェン併用α―Ｔが１０００倍以上ＭＣＦ−７細胞中におけるタモキシフェンに対するＩＣ５０を増加させることを明らかにし、さらに研究する中で、α−ＴがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼすタモキシフェンの強力な増殖阻害効果を完璧にブロックした。対照的に、α−、γ−およびδ―Ｔ３およびパーム油のトコトリエノール高含量部分が、エストラジオールおよびタモキシフェンの不在および存在下の両者で、ＭＣＦ−７（１２）およびＺＲ−７５−１細胞の増殖を阻害した。細胞増殖に及ぼすこの阻害効果は、γおよびδ―Ｔ３でより顕著となった。作用メカニズムは公知となっておらず、これまでのデータでは、この作用が、エストロゲン作用に対する拮抗作用またはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞における増殖阻害インシュリン様成長因子結合タンパク質類への変化によるのではないことが示唆された。トコトリエノール類は、また、数種の腫瘍細胞株に対してプロアポトーシス効果を有していると報告されている。しかし、ＭｃＩｎｔｙｒｅおよび共同研究者らは、また、高度に悪性の細胞類が、前新生物細胞に比較してトコトリエノール類の抗増殖およびアポトーシス効果に対してより感受性が高いことを明らかにしている。
【００４４】
前記の脂肪酸組成データは、マレーシアにおけるパーム油摂取をよく反映している。このことは、それがこの国で最も安くかつ非常に簡単に入手できる油でありかつマレーシア人のほとんどの食事においてそれが主な脂肪であると報告されているので、驚くにあたらない。（３１）ほとんどの植物性油は主にα−またはγ―Ｔを付与する一方、パーム油は、それが比較的高濃度のＴ３を含むという点で独特である。パーム油におけるさまざまなＴおよびＴ３分画の分布は下記のようである：α―Ｔ ３２％、α―Ｔ３ ２５％、γ―Ｔ３ ２９％およびδ―Ｔ３ １４％。米国では、１日当たり２，０００乃至３，０００ｋｃａｌのバランスの取れた食事を分析し、ビタミンＥの１日平均摂取量が７乃至１１ｍｇであると示唆されている。ビタミンＥ摂取に関するマレーシアのデータは、現在のところ限られている。しかし、１日の食事当たり２，０００乃至３，０００ｋｃａｌについて、１日当たりトコトリエノール類１０乃至１５ｍｇの間を消費しているであろうと考えられる。
【００４５】
本研究の最も重要な知見は、悪性胸部腫瘤を有する女性に比較して良性腫瘤の脂肪組織中で６５％ほど多い高トコトリエノール（α―Ｔ３、γ―Ｔ３およびδ―Ｔ３）濃度であった。α―Ｔおよびγ―Ｔ含量に全く差がなかった。しかし、δ−Ｔは、悪性対良性脂肪組織において有意な低下を示した。良性腫瘤を有する患者に比較して悪性腫瘤を有する患者におけるトコトリエノール類の欠如は、フリーラジカル類を消失させ過酸化反応を制御する抗酸化剤としてのその役割によるのであろう。
【００４６】
哺乳類の癌または炎症性障害の治療または予防のために毎日投与されるトコトリエノール組成物の量は、５μｇ乃至１０００ｍｇである。
【００４７】
トコトリエノール類は、強力な抗酸化剤、抗癌剤およびコレステロール低下作用を有している。抗酸化剤、抗癌剤およびコレステロール低下剤としてのトコトリエノール活性がトコフェロール類よりも強力であることがいくつかの研究で確認されている。トコトリエノール類は、α−Ｔよりもより強力な抗酸化作用を有していると考えられている。トコトリエノールの不飽和側鎖は、飽和脂肪層を有する脂肪、脳および肝臓のような組織へのはるかに優れた効率的浸透を可能とする。トコフェロール類およびトコトリエノール類の抗酸化性、フリーラジカルスキャベンジング効果を調べた実験研究は、トコトリエノール類が細胞膜の脂肪層におけるその優れた分布の故により優れているようであることを明らかにした。
【００４８】
酸化ストレスはまた、乳癌でも指摘されており、遺伝子発現を変化させることによってまたは酸化的ＤＮＡ損傷を促進することによって乳癌に影響を及ぼすのかもしれない。胸部脂肪組織における過酸化物レベルは測定されていないが、これまでの文献では、対照患者に比べて乳癌患者の胸部脂肪組織で共役ジエン類および過酸化物類が高いことが明らかにされている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】異なる組織から得られた脂質抽出物中で測定したδ―Ｔ３を示している。
【図２】３，（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）結果を示している。
【図３】δ―Ｔ３を投与されたマウス脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの濃度を示している。
【図４】δ−トコトリエノール類投与を受けたマウスにおけるナチュラルキラー細胞およびＢリンパ球の増加を示している。
【図５】Ｖ３におけるＢＡＬＢ／ｃマウス中ＴＮＦ−アルファレベルを示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮液体に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、世界中で毎年およそ１００万人の女性を襲い、現在の治療でも多くの患者を実際に助けているが、３５万人を超える人が本疾患で死亡している。米国では、２００４年に２１５，９９０人の女性が乳癌と診断され、４０，１１０名が本疾患で死亡した。マレーシアでは、女性では乳癌が最も多い癌である。２００２年、マレーシアでは、ナショナルキャンサーレジストリ（国立癌登録）において乳癌の新規症例は４，３３７名と記録されており、女性の癌全ての３０．４％を占めている。
【０００３】
乳癌発生率の国際的変動と移住者における発生率変化から、乳癌のリスクが環境要因、特に食事に影響を受け、従って、予防可能であることが示唆されている。
【０００４】
乳癌のリスク要因として確立されているものには、乳癌の家族歴、早期初潮、初産の晩年化、閉経の晩年化、および良性胸部疾患の病歴が含まれる。本疾患に対する遺伝的素因を除いて、残りのリスク要因は、エストロゲンに対する女性の生涯暴露を指摘している。エストロゲンは本疾患の原因ではないが、乳癌の進行と進展に関与している。抗エストロゲン剤類が、従って、乳癌進行の制御における治療法として用いられている。
【０００５】
α−Ｔの血漿または脂肪組織濃度によりビタミンＥに対する暴露を評価した観察研究では、α−Ｔが乳癌に対するなんらかの防御を提供するという考えに対して一貫して裏づけを付与できなかった。対照的に、ヒト乳癌細胞における研究では、α―、γ−、δ−Ｔ３が強力な抗増殖性およびプロアポトーシス効果を有しており、それらが乳癌リスクを低下すると期待されるであろうと示唆しているが、一方、α−Ｔは、全く効果を有していなかった。Ｇａｌｌｉおよび共同研究者らは、最近、α−Ｔと比較してγ−Ｔが前立腺癌細胞増殖にはるかに強い阻害効果を示すことを実証した。しかし、彼は、Ｔ３ホモローグ類でさらに試験し、γ−Ｔ３がγ―Ｔよりも高い抗増殖効果を有していることを見出した。したがって、食事性ビタミンＥと関連した適度の乳癌防御が食事中の他のＴおよびＴ３の効果によるのかもしれないと推定できるようである。
【０００６】
科学的研究が、食事中にありうる機能的特性、抗酸化剤または他のものを関連づけるために行われ、それらは、癌のような疾患を防御する際に効率的でありうる。ひとつのそのような抗酸化剤は、ビタミンＥである。これまでの８種の食事成分類であるα−、β−、γ−、δ−トコフェロール類（Ｔ）およびα−、β−、γ−、δ−トコトリエノール類（Ｔ３）は全て、ビタミンＥの形態であると考えられた。α―Ｔは、ビタミンＥの最も生物学的に重要な形態であると考えられる。最近の指針では、α−ＴをビタミンＥと同等とみなしており、他のトコフェロール類およびトコトリエノール類を度外視している。トコフェロール類およびトコトリエノール類は、穀物、種子および木の実の油分画に存在している。ほとんどの食物源において、トコフェロール類は、トコトリエノール類よりも多い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、トコトリエノールまたはその誘導体またはその混合物の有効量を含む経皮液体を哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のために提供する。
【０００８】
さらに、トコトリエノールまたはその誘導体またはその混合物の有効量を含む経皮液体を哺乳類における炎症性障害の予防または治療のために提供する。
【０００９】
本発明は、いくつかの新しい特徴と下記で詳細に記載しかつ付属の図面に示した部分類の組み合わせから構成され、その詳細におけるさまざまな変更が本発明の範囲から逸脱することなく、すなわち本発明の利点をいずれも犠牲にすることなく行われることを理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の理解を助けるため、付属の図面において、上記記載とともに、本発明、その構成および作用ならびにその利点の多くが、容易に理解され納得されるであろう。
【００１１】
本発明は、経皮液体に関する。この明細書は、以下で、本発明の最良の形態に従い本発明を記載するであろう。しかし、本発明の最良の形態に前記記載を限定することは単に本発明の説明を容易にするためであり、当業者は、付属の請求の範囲から逸脱することなく、さまざまな修飾および等価物を工夫できることが分かるであろう。
【００１２】
本発明において、胸部脂肪組織にδ−トコトリエノールを運搬するための革新的経路を検討した。さらに、乳癌リスクを低下させるトコトリエノールの能力は胸部へのそれらの運搬により決定されるようであるので、胸部脂肪組織におけるこれらの食事性成分類の濃度を決定し、経皮取り込みと関連づけた。
【００１３】
脂肪酸類の食事摂取の定量的組成の生物学的マーカー類全ての中で、脂肪組織脂肪酸組成は特に有益で、理由は、それが長期ベースで脂肪酸類の定量的食事摂取を反映し、それによって、測定した生化学的パラメータに及ぼす本疾患に由来する潜在的バイアスを避けうるからである。さらに、トコフェロールおよびトコトリエノール類の乳癌リスクを低下させる能力は、それらの胸部への運搬により決定されるようであるので、胸部脂肪組織中におけるこれらの食事性成分類の濃度を決定し、これらの濃度を食事摂取と関連づけることは重要であろう。
【００１４】
下記に、乳癌治療用タモキシフェンまたはアナストロゾールのような市販の抗エストロゲン剤と比較し、トコトリエノール類の利点を述べる。トコトリエノール類は非ホルモン性の天然産物であり、過量による副作用は全く知られていない。タモキシフェンは、多くの副作用を有している。タモキシフェンまたはアナストロゾールと異なり、トコトリエノール類は、乳癌細胞株類のエストロゲンレセプター状況に関係なく、有効である。最大５年にわたり服用できるタモキシフェンと異なり、トコトリエノール類は、時間的制限が全く公知となっていない。トコトリエノール誘発アポトーシスは、デスレセプターアポトーシスシグナル伝達に無関係である。しかし、タモキシフェンまたはアナストロゾールのような薬剤類は、やがてデスレセプターからの応答消滅により無効となる。
【００１５】
δ−トコトリエノールは乳癌増殖の最も有効な阻害剤であり、また、タモキシフェンとともに最大の相乗的効率を有している（乳癌治療の目標標準）。トコトリエノールの経口投与は、血中への取り込み不良という結果となる。本文で、胸部にトコトリエノール類を運搬する代替方法を提供する。
【００１６】
マウス研究
ＢＡＬＢ／ｃマウスを２群に分けた。対照群は、担体であるエタノールのみを投与され、実験群には、δ−トコトリエノール１ｍｇを毎日、４週間投与した。背部に適用し、皮下吸収を調べた。腹部および胸部脂肪組織は、第１週に最大吸収（１０００倍）を示し、その後、皮下組織が続いた。血中、脾臓および肝臓におけるトコトリエノールレベルの有意な変化に、第４週までには到達した。
【００１７】
さらに、アルミニウムをアジュバントとした卵白アルブミン（５０μｇ）をマウスに皮下免疫した。インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を、ＯＶＡの抗原特異的刺激により測定した。δ−トコトリエノールを投与されたマウスでＩＦＮ−γの有意な上昇があった。さまざまな白血球マーカー抗体類を用いた単色フローサイトメトリ分析により、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＢ−リンパ球が対照に比較して、δ―トコトリエノール群で有意に増加した。
【００１８】
この代替運搬は、Ｔｈ１応答を介して有効な免疫系を明らかにすると同時に、特異的部位に対しての強力な化合物類運搬という期待できる結果を明らかにした。
【００１９】
用量
本発明の方法類に従い用いるように、トコトリエノール組成物類は、ヒト対象に必要に応じ毎日、１日当たり約１乃至３回投与の頻度で約１ｍｇ乃至１０００ｍｇを単回または複数回、経皮的に投与する。さらに好適には、１日当たり約２乃至３回の頻度で約１００ｍｇ乃至８００ｍｇの範囲で成人対象に製剤を付与する。最も好適には、約６００ｍｇの用量を１日当たり約２乃至３回の頻度で、成人対象に付与する。
【００２０】
動物類
週齢３〜４週の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｕｎｉｔ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＭＲ）、Ｋｕａｌａ Ｌｕｍｐｕｒ、Ｍａｌａｙｓｉａから入手した。実験動物の世話と取り扱いは、実験動物の倫理的取り扱いのためのＩＭＲガイドラインに適合していた。対照動物類は、エタノール単独のみで処理し、一方、実験群には、毎日、δ―トコトリエノール１ｍｇを運搬するために２０ｍｇ／ｍｌ濃度を０．５ｍｌ適用した。マウスは、また、アルミニウムをアジュバントとした（比１：１）卵白アルブミン（５０ｍｇ）により第１１日に皮下免疫した。
【００２１】
胸部脂肪組織におけるトコトリエノール類およびトコフェロール類の分析
トコフェロール類およびトコトリエノール類は、ＨＰＬＣにより分析した。用いたシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ、ＨＰＬＣであり、それには、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光分光分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｌａｓｓ ＶＰデータ取得ソフトウェア、およびシリカカラム（ＹＭＣ Ａ−０１２／１５０×６ｍｍ内径、５μｍ）を取り付けた。溶出溶媒はヘキサン／イソプロピルアルコール（９９．５／０．５ ｖ／ｖ）であり、流量は２．０ｍｌ／ｍｉｎであった。検出器は、励起波長２９５ｎｍであり、発光波長３２５ｎｍであった。脂肪組織５００ｍｇを、ヘキサン：エタノールおよび０．９％塩化ナトリウムの４：１：１混合物で、１００００ｒｐｍで５分間、均質にした。このホモジネートを次に２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。生成した上清をろ過し、ロータリエバポレータを用いて蒸発させた。既知量の脂質サンプルを、溶出溶媒を用いて１０ｍｌの容量フラスコ中で溶解させ、前記溶液１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。α、γ、およびδ−トコトリエノール類混合物の標準溶液もまた、同様に注入した。ビタミンＥの主要構成成分類の定量は、前記成分類のピーク領域を標準のそれと比較することによって、実施した。
【００２２】
Ｔ−リンパ球培養
実験マウスを、エーテルを用いて屠殺した。脾臓は、無菌的にＲＰＭＩ完全培地中に取り、単細胞懸濁液は、脾臓カプセルから脾臓細胞をすきだすことによって作製した。培養前に、細胞を０．４％トリパンブルーステイン（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）により染色し、細胞生存数を、血球計により計数した。脾臓細胞懸濁液を希釈し、５×１０６細胞／ｍｌ溶液を得て、コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）を最終濃度２５μｇ／ｍｌで添加した。この懸濁液２００μｌを９６ウェルの平底組織培養プレートに接種し（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＵＳＡ）、湿潤化させた３７℃のＣＯ２インキュベータ中に７２時間、放置した。各インキュベーション期間の最終時点でプレートをインキュベータから取り除き、−７０℃に保存した。プレートを、ＥＬＩＳＡ実行前に融解させた。
【００２３】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
−３０℃で凍結した組織培養プレートを融解させた。さまざまなウェルからのサンプルを、適切にラベルを付した清浄なエッペンドルフ試験管に移した。前記試験管を、４℃において１０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を、適切にラベルした新しいエッペンドルフ試験管に移した。ペレットを捨てた。上清をＥＬＩＳＡにより分析し、コンカナバリンＡによりインビトロ刺激後に産生したＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の量を定量した。ＥＬＩＳＡは、製造業者の指示に従い、マウスＩＦＮ−γおよびＩＬ−４用ＥＬＩＳＡキット類（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて行った。
【００２４】
抗体染色
フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン標識抗体類を、別々の試験管中で染色緩衝液５０μｌに対して抗体２０μｌを添加することによって、希釈した。マウス全血１００μｌを各試験管に添加し、静かに混合した。次に、サンプルを室温暗所で１時間、インキュベーションした。インキュベーション後、ＲＢＣ溶解緩衝液２ｍｌを各試験管に添加し、静かに混合した。サンプルを次に４００ｇで室温下、５分間遠心分離した。洗浄段階は染色緩衝液２ｍｌを添加し行い、サンプルはまた、室温で５分間、４００ｇで遠心分離した。上清を取り除き、各試験管に染色緩衝液２００μｌを添加し、次に４％ホルマリンを２００μｌ、添加した。サンプルは、フローサイトメータを用いて分析した。
【００２５】
３，（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）
細胞の生存能力は、ＭＴＴアッセイにより測定した。このアッセイにおいて、ＭＴＴは、生細胞中で活性のデヒドロゲナーゼ類により、青色ホルマザン生成物に変換する。脾臓細胞は、培地総量２００μｌ中において９６ウェルプレートにコンカナバリンＡまたはＯＶＡを接種した。ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌを２５μｌ）を、各ウェルに添加した。４時間後、５０％ジメチルホルムアミド／５０％水溶液、ｐＨ４．０中に溶解させた２０％ＳＤＳから構成される抽出緩衝液１００μｌを添加した。形成された青色を５９０ｎｍで測定した。
【００２６】
脂肪組織中におけるδ―トコトリエノール組成物
図１は、異なる組織から得られた脂質抽出物中で測定したδ−Ｔ３を示している。胸部および腹部脂肪および皮下脂肪組織は、第１週から開始し第２週において最適濃度に達した経皮適用後に有意な増加を示す。第３週には、濃度低下があった。血液、肝臓および脾臓レベルの変化は、第４週にのみ見られた。
【００２７】
ＭＴＴ
図２はＭＴＴ結果を示している。ＭＴＴアッセイでは、細胞増殖または細胞死が、着色産物ホルマザンへの前記テトラゾリウム塩の変換または無変換により示唆されるという原理を用いており、ホルマザンの濃度は、分光分析により測定できる。図２からわかるように、対照および実験脾臓細胞類両者ともに、コンカナバリンＡまたはＯＶＡの添加により正常に増殖した（ＯＤ読み取り値に変化なし）。
【００２８】
δ―トコトリエノールはワクチン接種によりインターフェロン−γの産生を刺激する
ＯＶＡで免疫したマウスにおける免疫細胞活性に及ぼすδ―Ｔ３の効果を評価するため、マウス全てを検査し、異なる処置後のＩＦＮ−γおよびＩＬ―４のレベルを比較した。図３に示したように、σ−Ｔ３を投与されＯＶＡで免疫したマウスの脾臓細胞中のＩＦＮ−γ濃度は、対照マウスよりも有意に高かった。
【００２９】
抗体反応
図４はナチュラルキラー細胞の増加を示し、δ−トコトリエノールを投与されたマウスでＢ−リンパ球が観察され、一方、図５は、Ｖ３におけるＢＡＬＢ／ｃマウスのＴＮＦ−アルファレベルを示している。
【００３０】
トコトリエノールの吸収については、ほとんどわかっていない。α−トコフェロールを身体が好むことは、確立されている。さらに、ラットにおいて食事性α−Ｔがα−Ｔ３を低下させるがγ−Ｔ３は低下させないことが明らかとなっている。トコトリエノール類が脂肪組織およびその皮膚に優先的に分布していることに注目するのはおもしろい。これらの組織におけるα−Ｔ３の濃度は、ラットにα―Ｔ３またはα―Ｔをそれぞれ５０ｍｇ与えた時に、α―Ｔよりも有意に高くなることが観察された。このことは、おそらく、トコトリエノール類がリンパ系を介してこれらの組織に分布されるという証拠を付与するか、または、前記観察がα−ＴＴＰアフィニティメカニズムによって説明できないということに鑑み、分布のための未知のα−ＴＴＰ独立経路があるのかもしれないという証拠を提供する。
【００３１】
ヒト研究
研究群はクアラルンプール病院から由来し、マレーシア、健康省、倫理委員会により承認を受けていた。検討した女性７５名中、４０名が乳癌であり、３５名が、良性の胸部病理所見を有していた。両群の女性とも胸部腫瘤を示していた。両群とも手術前に良性か悪性かについて病理を証明するために造影および生検を受けており、胸部からの脂肪組織は、手術時に得られた。提出された組織は、実際の病理ではないが周辺脂肪組織由来であった。標本を最初に病理学的に評価した後、脂肪組織０．２〜１．０ｇを生理食塩水で洗浄し、液体窒素ですぐに凍結し、分析するまでバイアル中で−７０℃に保存した。
【００３２】
脂肪組織調製物および脂肪酸分析
総脂質を、クロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）で脂肪組織から抽出した。抽出物を塩化ナトリウムで洗浄し、混合物を２相に分離させた。クロロホルム層は試験管に移し、窒素下で乾燥するまで蒸発させた。脂質抽出物を、クロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）２００μｌに溶解させ、直接カラム操作に用いた。
【００３３】
トリアシルグリセロールは、下記のようにしてシリカ試験管（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｆｒａｎｃｅ）による吸着クロマトグラフィにより精製した：カラムをクロロホルム−メタノール２：１（ｖ：ｖ）２ｍｌで前処置した。次に、脂質サンプルをカラムに適用し、同一系溶媒１００μｌで処置した試験管を前記カラムに添加した。トリアシルグリセロール類は、クロロホルム２０ｍｌで溶出した。クロロホルム分画を、テフロン（登録商標）シールを有するねじ込み式栓を有する試験管に集めた。得られた分画を、乾燥するまで蒸発させた。２Ｎナトリウムメトキサイド３００μｌと三フッ化臭素５００μｌを添加し、脂肪酸類をそれらのメチルエステル類に変換した。混合物を室温で１５分間、混合振とうした。脂肪酸メチルエステル類は２回、ヘキサン中に抽出した。
【００３４】
脂肪酸メチルエステル類（ＦＡＭＥ）組成物は、毛細管ガスクロマトグラフィにより決定した。このシステムは、冷オンカラムインジェクターとフレームイオン化検出器を付属させたＧＣ８００シリーズクロマトグラフ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）から構成されていた。長さ６０ｍで内径０．２２ｍｍの溶融シリカカラム（Ｖａｒｉａｎ，ＵＳＡ）を用いた。ヘリウムを、流量１．５ｍｌ／ｍｉｎでキャリアーガスとして用いた。検出器温度は、２８０℃であった。冷オンカラムインジェクター（６０℃）から１μｌを注入した。オーブンの温度は、１５℃／分の速度で６０〜１７０℃に上昇させ、２０分間一定のままとし、５℃の速度で１７０〜１９０℃に上昇させ、１０分間一定のままとし、１℃／分の速度で１９０〜２１５℃に上昇させ１０分間一定のままとするようにプログラムした。ＦＡＭＥの同定は、それらの相対的保持時間をそれらの純粋な標準混合物と比較することによって、得られた。各脂肪酸の相対量は、基準値におけるピークを積算し、結果を全脂肪酸類の総領域で割ることによって定量した。全ての積算は、同一の実験室作業者が行った。総領域の１％未満を説明するピークが全て検出され、定量された。
【００３５】
胸部脂肪組織におけるトコトリエノール類とトコフェロール類の分析
トコフェロール類とトコトリエノール類は、ＨＰＬＣによって分析した。用いたシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＴ、ＨＰＬＣであり、それには、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｍｏｄｅｌ ＲＦ−１０ＡＸＬ蛍光分光分析計、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｌａｓｓ ＶＰデータ取得ソフトウェア、およびシリカカラム（ＹＭＣ Ａ−０１２／１５０×６ｍｍ内径、５μｍ）を取り付けた。溶出溶媒はヘキサン／イソプロピルアルコール（９９．５／０．５ ｖ／ｖ）であり、流量は２．０ｍｌ／ｍｉｎであった。検出器は、励起波長２９５ｎｍであり、発光波長３２５ｎｍであった。脂肪組織５００ｍｇを、ヘキサン：エタノールおよび０．９％塩化ナトリウムの４：１：１混合物で、１００００ｒｐｍで５分間、均質にした。このホモジネートを次に２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。生成した上清をろ過し、ロータリエバポレータを用いて蒸発させた。既知量の脂質サンプルを、溶出溶媒を用いて１０ｍｌの容量フラスコ中で溶解させ、前記溶液１０μｌをＨＰＬＣシステムに注入した。α、γ、およびδ−トコトリエノール類混合物の標準溶液もまた、同様に注入した。ビタミンＥの主要構成成分類の定量は、前記成分類のピーク領域を標準のそれと比較することによって、実施した。
【００３６】
統計
それぞれの脂肪酸類の平均および標準偏差を計算し、各族における脂肪酸類の総計を求めた。統計解析は、ＳＰＳＳプログラムを用いて行った。両側スチューデントｔ検定を用いて、脂肪組織における脂肪酸組成（ＦＡＣ）とビタミンＥレベルに関して、乳癌女性と乳癌のない女性の間で差平均を比較した。結果は、ｐ＜０．０５において有意とみなした。
【００３７】
胸部脂肪組織における脂肪酸組成
下記の表１は、良性および悪性腫瘤における胸部脂肪の脂肪酸組成を示している。胸部脂肪組織における主要脂肪酸類は、オレイン酸（１８：１ ｎ−９ｃ）、パルミチン酸（１６：０）、リノレン酸（１８：２ ｎ−６）およびステアリン酸（１８：０）であった。これらの脂肪酸類は、クロマトグラフィ曲線下総面積の約９０％を占めていた。良性および悪性腫瘤由来の胸部脂肪組織ＦＡＣに有意な差はなかった。
【００３８】
【表１】
【００３９】
胸部脂肪組織におけるビタミンＥ組成
下記の表２は、悪性胸部腫瘤を有する患者４０例および良性胸部腫瘤を有する患者３５例から得られた胸部脂肪組織の脂質抽出物中で測定したＴおよびＴ３を示している。ＴおよびＴ３の含量は、μｇ／ｇ脂肪組織で表した。悪性腫瘤において、胸部脂肪組織におけるα−Ｔの平均含量は、１２６．２μｇ／ｇ脂肪組織であり、一方、良性腫瘤においては１４７．０μｇ／ｇであった。特にα−Ｔについて患者間で大きな変動が見られた。これは、多くの食品においてトコフェロール類が主要であるので、食事摂取パターンに差があることによるのかもしれなかった。しかし、脂肪組織におけるα−Ｔの平均は、良性対象と悪性癌患者で有意に異なることはなかった（ｐ＝０．４３５）。平均γ−Ｔ（７．５１対６．１８）およびδ−Ｔ（１．２６対０．６５）レベルもまた、良性に比較して悪性患者で低下していた。γ−Ｔについては有意ではなかったが（ｐ＝０．３６３）、δ−Ｔのレベル低下は、有意であった（ｐ＝０．０３３）。
【００４０】
【表２】
【００４１】
乳癌患者において、胸部脂肪組織におけるα−、γ―およびδ−Ｔ３の平均含量は、１３．７３μｇ／ｇ脂肪組織であった。良性腫瘤を有する患者においては、２０．０μｇ／ｇ脂肪組織であった。平均Ｔ３値は、良性腫瘤を有する対象に比べて乳癌患者では、有意に（ｐ＝０．００６）小さかった。良性に比較して悪性組織でα−Ｔ３（ｐ＝０．００６）、γ−Ｔ３（ｐ＝０．０４７）およびδ―Ｔ３（ｐ＝０．０１８）の低下が見られた。αおよびγ―Ｔ３が大きくなるにつれトコトリエノール類の分布はまた、パーム油におけるトコトリエノール類の組成を非常によく反映している。
【００４２】
脂肪組織濃度を用いた乳癌患者における長期ビタミンＥ栄養状況の評価は、血漿レベル測定に勝る決定的利点を有している。トコフェロールおよびトコトリエノール類の血漿レベルは、食事摂取を調節するとヒトで非常に急激に変化し、数日中に新しい安定状態レベルに達する。脂肪組織におけるα−Ｔの含量を、ビタミンＥの食事摂取と関連づけてヒトで評価し、α―Ｔ含量がビタミンＥの長期食事摂取を反映していることが示された。
【００４３】
注意して脂肪組織を採取したいくつかの研究で、脂肪組織トコフェロール類と乳癌リスクの関連を調べた。全体的にみて、乳癌リスクとビタミンＥの関連についての研究では、ビタミンＥへの食事による暴露増加ではわずかしか乳癌リスクを低下させない可能性が示唆されている。しかし、全てではないにしてもほとんどがα−Ｔの形状にあるサプリメントによるビタミンＥがなんらかの防御を付与する証拠は全くない。さらに、細胞培養データは、タモキシフェン併用α―Ｔが１０００倍以上ＭＣＦ−７細胞中におけるタモキシフェンに対するＩＣ５０を増加させることを明らかにし、さらに研究する中で、α−ＴがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に及ぼすタモキシフェンの強力な増殖阻害効果を完璧にブロックした。対照的に、α−、γ−およびδ―Ｔ３およびパーム油のトコトリエノール高含量部分が、エストラジオールおよびタモキシフェンの不在および存在下の両者で、ＭＣＦ−７（１２）およびＺＲ−７５−１細胞の増殖を阻害した。細胞増殖に及ぼすこの阻害効果は、γおよびδ―Ｔ３でより顕著となった。作用メカニズムは公知となっておらず、これまでのデータでは、この作用が、エストロゲン作用に対する拮抗作用またはＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞における増殖阻害インシュリン様成長因子結合タンパク質類への変化によるのではないことが示唆された。トコトリエノール類は、また、数種の腫瘍細胞株に対してプロアポトーシス効果を有していると報告されている。しかし、ＭｃＩｎｔｙｒｅおよび共同研究者らは、また、高度に悪性の細胞類が、前新生物細胞に比較してトコトリエノール類の抗増殖およびアポトーシス効果に対してより感受性が高いことを明らかにしている。
【００４４】
前記の脂肪酸組成データは、マレーシアにおけるパーム油摂取をよく反映している。このことは、それがこの国で最も安くかつ非常に簡単に入手できる油でありかつマレーシア人のほとんどの食事においてそれが主な脂肪であると報告されているので、驚くにあたらない。（３１）ほとんどの植物性油は主にα−またはγ―Ｔを付与する一方、パーム油は、それが比較的高濃度のＴ３を含むという点で独特である。パーム油におけるさまざまなＴおよびＴ３分画の分布は下記のようである：α―Ｔ ３２％、α―Ｔ３ ２５％、γ―Ｔ３ ２９％およびδ―Ｔ３ １４％。米国では、１日当たり２，０００乃至３，０００ｋｃａｌのバランスの取れた食事を分析し、ビタミンＥの１日平均摂取量が７乃至１１ｍｇであると示唆されている。ビタミンＥ摂取に関するマレーシアのデータは、現在のところ限られている。しかし、１日の食事当たり２，０００乃至３，０００ｋｃａｌについて、１日当たりトコトリエノール類１０乃至１５ｍｇの間を消費しているであろうと考えられる。
【００４５】
本研究の最も重要な知見は、悪性胸部腫瘤を有する女性に比較して良性腫瘤の脂肪組織中で６５％ほど多い高トコトリエノール（α―Ｔ３、γ―Ｔ３およびδ―Ｔ３）濃度であった。α―Ｔおよびγ―Ｔ含量に全く差がなかった。しかし、δ−Ｔは、悪性対良性脂肪組織において有意な低下を示した。良性腫瘤を有する患者に比較して悪性腫瘤を有する患者におけるトコトリエノール類の欠如は、フリーラジカル類を消失させ過酸化反応を制御する抗酸化剤としてのその役割によるのであろう。
【００４６】
哺乳類の癌または炎症性障害の治療または予防のために毎日投与されるトコトリエノール組成物の量は、５μｇ乃至１０００ｍｇである。
【００４７】
トコトリエノール類は、強力な抗酸化剤、抗癌剤およびコレステロール低下作用を有している。抗酸化剤、抗癌剤およびコレステロール低下剤としてのトコトリエノール活性がトコフェロール類よりも強力であることがいくつかの研究で確認されている。トコトリエノール類は、α−Ｔよりもより強力な抗酸化作用を有していると考えられている。トコトリエノールの不飽和側鎖は、飽和脂肪層を有する脂肪、脳および肝臓のような組織へのはるかに優れた効率的浸透を可能とする。トコフェロール類およびトコトリエノール類の抗酸化性、フリーラジカルスキャベンジング効果を調べた実験研究は、トコトリエノール類が細胞膜の脂肪層におけるその優れた分布の故により優れているようであることを明らかにした。
【００４８】
酸化ストレスはまた、乳癌でも指摘されており、遺伝子発現を変化させることによってまたは酸化的ＤＮＡ損傷を促進することによって乳癌に影響を及ぼすのかもしれない。胸部脂肪組織における過酸化物レベルは測定されていないが、これまでの文献では、対照患者に比べて乳癌患者の胸部脂肪組織で共役ジエン類および過酸化物類が高いことが明らかにされている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】異なる組織から得られた脂質抽出物中で測定したδ―Ｔ３を示している。
【図２】３，（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）結果を示している。
【図３】δ―Ｔ３を投与されたマウス脾臓細胞におけるＩＦＮ−γの濃度を示している。
【図４】δ−トコトリエノール類投与を受けたマウスにおけるナチュラルキラー細胞およびＢリンパ球の増加を示している。
【図５】Ｖ３におけるＢＡＬＢ／ｃマウス中ＴＮＦ−アルファレベルを示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のための有効量のトコトリエノール、その誘導体またはその混合物を含有する経皮液体。
【請求項２】
前記癌が乳癌である請求項１記載の経皮液体。
【請求項３】
α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類またはこれらの１種以上の組み合わせを含む請求項１または２記載の経皮液体。
【請求項４】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が５μｇ乃至１０００ｍｇである請求項１、２または３に記載の経皮液体。
【請求項５】
前記トコトリエノール組成物を公知の医薬と併用して用いるかまたは単独で用いる請求項１、２または３記載の経皮液体。
【請求項６】
哺乳類における癌または腫瘍、好適には乳癌の予防または治療のための医薬の製造における請求項１乃至５に記載の経皮液体有効量の用途。
【請求項７】
前記液体が局所的に適用される請求項６記載の用途。
【請求項８】
哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のための方法であって、前記哺乳類に対して請求項１乃至５記載の液体を有効量、経皮投与することを特徴とする方法。
【請求項９】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための有効量のトコトリエノール、またはその誘導体、またはその混合物を含有する経皮液体。
【請求項１０】
α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類またはこれらの１種以上の組み合わせを含む請求項９記載の経皮液体。
【請求項１１】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が５μｇ乃至１０００ｍｇである請求項９または１０に記載の経皮液体。
【請求項１２】
前記トコトリエノール組成物を公知の医薬と併用して用いるかまたは単独で用いる請求項９、１０または１１記載の経皮液体。
【請求項１３】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための医薬の製造における請求項９乃至１２に記載の経皮液体有効量の用途。
【請求項１４】
前記液体が局所的に適用される請求項１３記載の用途。
【請求項１５】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための方法であって、前記哺乳類に対して請求項９乃至１２記載の液体を有効量、経皮投与することを特徴とする方法。
【請求項１】
哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のための有効量のトコトリエノール、その誘導体またはその混合物を含有する経皮液体。
【請求項２】
前記癌が乳癌である請求項１記載の経皮液体。
【請求項３】
α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類またはこれらの１種以上の組み合わせを含む請求項１または２記載の経皮液体。
【請求項４】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が５μｇ乃至１０００ｍｇである請求項１、２または３に記載の経皮液体。
【請求項５】
前記トコトリエノール組成物を公知の医薬と併用して用いるかまたは単独で用いる請求項１、２または３記載の経皮液体。
【請求項６】
哺乳類における癌または腫瘍、好適には乳癌の予防または治療のための医薬の製造における請求項１乃至５に記載の経皮液体有効量の用途。
【請求項７】
前記液体が局所的に適用される請求項６記載の用途。
【請求項８】
哺乳類における癌および／または腫瘍の予防または治療のための方法であって、前記哺乳類に対して請求項１乃至５記載の液体を有効量、経皮投与することを特徴とする方法。
【請求項９】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための有効量のトコトリエノール、またはその誘導体、またはその混合物を含有する経皮液体。
【請求項１０】
α−トコトリエノール、および／またはβ−トコトリエノール、および／またはγ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノール、好適にはδ―トコトリエノール、またはこれらの誘導体類またはこれらの１種以上の組み合わせを含む請求項９記載の経皮液体。
【請求項１１】
毎日投与される前記トコトリエノール組成物の量が５μｇ乃至１０００ｍｇである請求項９または１０に記載の経皮液体。
【請求項１２】
前記トコトリエノール組成物を公知の医薬と併用して用いるかまたは単独で用いる請求項９、１０または１１記載の経皮液体。
【請求項１３】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための医薬の製造における請求項９乃至１２に記載の経皮液体有効量の用途。
【請求項１４】
前記液体が局所的に適用される請求項１３記載の用途。
【請求項１５】
哺乳類における炎症性障害の予防または治療のための方法であって、前記哺乳類に対して請求項９乃至１２記載の液体を有効量、経皮投与することを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１９５７１７（Ｐ２００８−１９５７１７Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−３０８８９（Ｐ２００８−３０８８９）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【出願人】（５００５１１６４８）マレーシアン・パーム・オイル・ボード (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０８８９（Ｐ２００８−３０８８９）
【出願日】平成２０年２月１２日（２００８．２．１２）
【出願人】（５００５１１６４８）マレーシアン・パーム・オイル・ボード (12)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]