結節性硬化症複合体関連障害の検出法および処置法
【課題】結節性硬化症複合体関連障害の検出法および処置法が提供すること、および、
結節性硬化症複合体関連障害を処置するための因子の同定法を提供することを、本発明の課題とする。
【解決手段】１つの局面において、本発明は、１つ以上のＴＳＣ調節核酸配列を発現し得る１つ以上の細胞を含む試験細胞集団を提供することによって、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断し決定する方法を提供する。次いで、１つ以上の配
列（ＴＳＣＸ配列と呼ばれる）の発現のレベルは、参照の細胞集団における対応
する核酸の発現のレベルと比較される。
結節性硬化症複合体関連障害を処置するための因子の同定法を提供することを、本発明の課題とする。
【解決手段】１つの局面において、本発明は、１つ以上のＴＳＣ調節核酸配列を発現し得る１つ以上の細胞を含む試験細胞集団を提供することによって、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断し決定する方法を提供する。次いで、１つ以上の配
列（ＴＳＣＸ配列と呼ばれる）の発現のレベルは、参照の細胞集団における対応
する核酸の発現のレベルと比較される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）関連障害を検出および処置する方法に関
する。
【背景技術】
【０００２】
母斑症、または「神経皮膚障害」は、病気に冒された個体における複数の器官
系を冒す表現型を示す３つのメンデルの常染色体優性遺伝疾患の群である。神経
皮膚障害としては、例えば、神経線維腫症（ＮＦ）、結節硬化症（ＴＳＣ）、お
よびフォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）が挙げられる。これらの疾患は、全
て神経学的症状および皮膚科学的症状の両方を生じる。
【０００３】
結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）は、常染色体優性腫瘍抑制遺伝子症候群であり、こ
れは、複数の器官系における特有の良性腫瘍（過誤腫）の発達および先天異常（
過誤組織）によって特徴づけられる。脳、皮膚、心臓および腎臓が、一般に病気
に冒される。皮膚および腎臓において生じるＴＳＣ病変は、平滑筋細胞、内皮細
胞、脂肪細胞、および巨大神経出現細胞を含む。この複雑な細胞の構築物にもか
かわらず、ＴＳＣにおける腎臓および他の病変は、クローン性および異型接合性
（ＬＯＨ）損失の分析に基づいて、事実上のクローン性を示す。脳において、Ｔ
ＳＣは、心室嚢に並ぶ上衣下結節および癲癇性放出についての病巣として働く皮
質下の過誤腫の両方を生じる。ＴＳＣは、人生の１年目において自然に消失する
胎児／新生児における心臓の横紋筋腫を生じる。ＴＳＣはまた、腎血管造影、肺
の症候群、および他の器官系における症状に関連する。さらに、ＴＳＣはまた、
複数の皮膚科学的特徴（例えば、過少メラニンの斑、顔の血管線維腫、粒起革様
斑、および爪の線維腫）に関連する。
【０００４】
この疾患の分子の性質をより理解することは、ＴＳＣ患者のみでなく、類似の
病理によって冒されている非ＴＳＣ患者においてもＴＳＣ複合体に関連する病理
を処置する新しい治療手段を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下を提供する、
（項目１） 被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断または決定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程、
（ｂ）該試験細胞集団中の１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｃ）該試験細胞集団中の該核酸配列の発現を、結節性硬化症複合体関連障害に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照プロフィール中の核酸配列の発現と比較する工程；ならびに
（ｄ）該試験細胞集団および該参照プロフィール中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程、
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断または決定する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記結節性硬化症複合体関連障害が、過誤腫、過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫、メラニン減少斑、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫からなる群から選択される、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、ここで、該方法が５つ以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目５） 項目１に記載の方法であって、該方法が、２０以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、該方法が、２５以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目７） 被験体中の結節性硬化症複合体関連障害を処置する方法であって、該方法が、ＴＳＣ−１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸の発現または活性を調節する因子を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目８） 結節性硬化症複合体関連障害のための候補治療因子を同定する方法であって、以下；
（ａ）ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団と試験因子を接触させる工程；
（ｃ）該試験細胞集団において１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｄ）該試験細胞集団における遺伝子の発現と、結節性硬化状態が既知である少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
それによって、結節性硬化症複合体関連障害のための治療因子を同定する、方法。
（項目９） 選択された被験体において適切な結節性硬化症複合体関連障害の処置に適する個別化された治療因子を同定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団と該治療因子を接触させる工程；
（ｃ）該試験細胞集団において１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｄ）結節性硬化関連障害の状態が既知の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における核酸配列の発現と、該試験細胞集団における該核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
これによって、該被験体に適切な治療因子を同定する、方法。
（項目１０） 被験体において結節性硬化症複合体関連障害の処置の有効性を評価する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞
集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団において1つ以上の該核酸配列の発現を検出する工程；
（ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現と、結節性硬化症複合体関連障害に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において結節性硬化症複合体関連障害の処理の有効性を評価する、方法。
（項目１１） ＴＳＣ１〜８遺伝子、１０〜１２遺伝子、１５〜２５遺伝子またはそれらの相補鎖からなる群から選択される核酸配列を含有する、単離された核酸。
（項目１２） 項目１１に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１３） 項目１２に記載のベクターを含む、細胞。
（項目１４） 項目１１に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
（項目１５） 項目１１に記載の核酸によってコードされる、ポリペプ
チド。
（項目１６） 項目１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
（項目１７） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される２つ以上の前記核酸配列を検出する、キット。
（項目１８） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸を検出する、アレイ。
（項目１９） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸を含む、複数の核酸。
（発明の要旨）
本発明は、Ｔｓｃ２＋／−ヘテロ接合および野生型同胞マウス由来の細胞にお
いて見出される発現パターンと比較した、Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニ
ックマウス由来の細胞における複数の核酸配列の発現パターンにおける変化の発
見に一部基づく。これらの異なって発現される核酸は、以前には記載されていな
い配列および、以前に示されているが、現在までＴＳＣ調節物として同定されて
いない核酸配列を含む。
【０００６】
種々の局面において、本発明は、結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）関連障害に対する
感受性を診断または検出する方法、およびこれらの障害を処置する方法を含む。
例えば、１つの局面において、本発明は、１つ以上のＴＳＣ調節核酸配列を発現
し得る１つ以上の細胞を含む試験細胞集団を提供することによって、結節硬化複
合症に関連する障害に対する感受性を診断し決定する方法を提供する。次いで、
１つ以上の配列（ＴＳＣＸ配列と呼ばれる）の発現のレベルは、参照の細胞集団
における対応する核酸の発現のレベルと比較される。参照の細胞集団は、その結
節性硬化症複合体関連障害の状態が既知である（すなわち、参照の細胞が、結節硬化
症関連障害を有するか有さないかが既知である）細胞を含む。
【０００７】
本発明の別の局面は、結節性硬化症複合体関連障害を処置するための治療剤を同定
する方法を含む。この方法は、１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を発現し得る細胞を
含む試験細胞集団を被験体から提供する工程、試験細胞集団を治療剤と接触させ
る工程、および参照の細胞集団における核酸配列の発現に対して試験細胞集団に
おける核酸配列の発現を比較する工程を含む。
【０００８】
本発明のさらなる局面は、特定の被験体に適切な個別化された治療剤を選択す
る方法を含む。この方法は、１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を発現し得る細胞を含
む試験細胞集団を被験体から提供する工程、試験細胞集団を治療剤と接触させる
工程、および参照の細胞集団における核酸配列の発現に対して試験細胞集団にお
ける核酸配列の発現を比較する工程を含む。
【０００９】
結節性硬化症複合体で調節された、新規の核酸およびそのコードされるポリペプチ
ドもまた、提供される。
【００１０】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用
語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有
する。本明細書中に記載された方法および材料に類似または同等の方法および材
料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料
は、以下に記載される。本明細書中で述べられた全ての刊行物、特許出願、特許
および他の参考文献は、その全体を参考として援用される。矛盾する場合、定義
を含めて本発明の明細書が統制する。さらに、材料、方法および実施例は、例示
のみで、限定することを意図されない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、Ｔｓｃ２＋／−ヘテロ接合および野生型同胞マウス由来の細胞にお
いて見出される発現パターンと比較した、Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニ
ックマウス由来の細胞における複数の核酸配列の発現パターンにおける変化の発
見に一部基づく。
【００１３】
発現パターンにおける変化は、３つの遺伝子型（ｉ．ｅ．）のマウス由来の１
０〜１１日の胎児から確立された神経幹細胞（ＮＳＣ）およびマウス胎児の線維
芽細胞株（ＭＥＦ）の細胞株のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析（米国特許第５
，８７１，６９７号；Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７；１９８〜８０３、本明細書中でその全体を参考とし
て援用される）によって同定された。
【００１４】
配列分析の概略は、表１に示される。本明細書中で同定された１４２の単一核
酸配列は、本明細書中でＴＳＣ１−１４２核酸もしくはＴＳＣ１−１４２ポリペ
プチド、またはＴＳＣＸ核酸もしくはＴＳＣＸポリペプチドと呼ばれる。ＴＳＣ
１−１４２遺伝子フラグメントの差異発現を、Ｓｈｉｍｋｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１９８〜８０３に記載されるような非標
識オリゴヌクレオチド競合アッセイを用いて確認した。
【００１５】
両方の細胞株において異なって発現される遺伝子を比較することによって、Ｔ
ＳＣ−／−腫瘍形成における共通の機構の理解を確認し得た。その一方で、ＮＳ
Ｃ細胞株において異なって発現される遺伝子を比較することによって、ＴＳＣ腫
瘍の元（すなわち、子孫）である細胞において発現される遺伝子を同定した。Ｔ
ＳＣ表現型に基づいて、ＴＳＣ細胞において上方制御される遺伝子は、癌の進行
、詳細には、腎癌および肺癌において役割を有し得る。
【００１６】
２６の配列（ＴＳＣ：１−２６）は、公共のデータベースにおいて見出される
配列に対する配列同一性が、推定の相同性を示唆する新規マウス遺伝子を表す。
【００１７】
１１６の他の同定された配列は、既に記載されている。いくつかの新規の配列
（すなわち、ＴＳＣ：１−２６）について、クローン化された配列が、クローン
化された細胞に実質的に同一の配列を含む１つ以上のさらなる配列フラグメント
（例えば、ＥＳＴまたはコンティグ）とともに提供される。クローン化されたフ
ラグメントおよびさらなるフラグメントから組立てられる複合配列を含むコンセ
ンサス配列もまた提供される。所定のＴＳＣ配列について、その発現が、本明細
書中に記載される方法において用いられ得る任意の関連する核酸配列を用いて測
定され得る。既に記載された配列についてデータベース登録番号が提供される。
この情報は、当業者が、ＴＳＣ核酸配列の発現を検出および測定するために必要
な情報を推定することを可能にする。
【００１８】
ＴＳＣ調節遺伝子の下位集合は、さらに以下の３つのクラスに細分化され得る
：
Ａ．Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニックマウス由来の細胞において上方
制御される分泌タンパク質および／または膜結合タンパク質。
【００１９】
この分類におけるタンパク質としては、血漿リン脂質移動タンパク質、リシル
ヒドロキシラーゼアイソフォーム２、ＤＶＳ２７関連タンパク質［ＡＢ０２４５
１８］、カテプシンＬ、テネイシン、ＡＤＡＭＴＳ１、メタロプロテイナーゼ−
２の組織インヒビター、インテグリンβ−５、トロンボスポンジン２（ＴＨＢＳ
２）、アスパルチルプロテアーゼ１、Ｃｙｒ６１、テトラスパンＮＥＴ−７、シ
ステインリッチ糖タンパク質ＳＰＡＲＣ、神経のペントラキシンレセプター、Ｉ
ＴＭ２Ｂ−Ｅ２５Ｂタンパク質外皮膜タンパク質２Ｂ、膜貫通糖タンパク質ＮＭ
Ｂ、およびジンクフィンガータンパク質が挙げられる。
【００２０】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための抗体スク
リーニングおよび抗体結合治療のための潜在的な候補である。
【００２１】
Ｂ．Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニックマウス由来の細胞において下方
制御される分泌タンパク質および／または膜結合タンパク質。
【００２２】
この分類におけるタンパク質としては、増殖／分化因子１（ＧＤＦ−１）、細
胞外マトリックス関連タンパク質（Ｓｃ１）、膜２型マトリックスメタロプロテ
イナーゼおよびトロンボスポンジン１マウスが挙げられる。
【００２３】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための潜在的な
候補である。
【００２４】
Ｃ．酵素活性を有するタンパク質
この分類におけるタンパク質としては、増殖因子を誘導する前初期遺伝子３Ｃ
Ｈ１３４／ｅｒｐ、ガラクトキナーゼ１、血清誘導キナーゼ（ＳＮＫ）、ＰＡＦ
アセチルヒドロラーゼアスパルチルプロテアーゼ１、リシルヒドロキシラーゼア
イソフォーム２、ペルオキシソーマルＤ２、およびＤ４−ジエノイル−ＣｏＡレ
ダクターゼ（Ｐｄｃｒ）が挙げられる。
【００２５】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための低分子ス
クリーニングおよび低分子薬剤治療についての潜在的な候補である。
【００２６】
本明細書中で考察されるＴＳＣ調節核酸としては、以下が挙げられる：
【００２７】
【表１】
解説＝
Ｎｅｗ＝デノボの発現
太字＝遺伝子がその仕事において確認された
＋１．０＝差異がない
Ｘ＝毒性がない
Ｑ＝プロセス中
ｐ＝部分的な毒性
Ｏ＝バンドなし
発現が差示的に調節される核酸配列の更なる考察を以後に続ける。
【００２８】
（ＴＳＣ１）
ＴＳＣ１は、新規の２５２０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００２９】
【化１】
（ＴＳＣ２）
ＴＳＣ２は、新規の１８６３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３０】
【化２】
（ＴＳＣ３）
ＴＳＣ３は、新規の７５０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３１】
【化３】
（ＴＳＣ４）
ＴＳＣ４は、新規の２８１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３２】
【化４】
（ＴＳＣ５）
ＴＳＣ５は、新規の１５６８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３３】
【化５】
（ＴＳＣ６）
ＴＳＣ６は、新規の３００ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３４】
【化６】
（ＴＳＣ７）
ＴＳＣ７は、新規の９６５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３５】
【化７】
（ＴＳＣ８）
ＴＳＣ８は、新規の４０８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３６】
【化８】
（ＴＳＣ１０）
ＴＳＣ１０は、新規の３５４ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３７】
【化９】
（ＴＳＣ１１）
ＴＳＣ１１は、新規の９５５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３８】
【化１０】
（ＴＳＣ１２）
ＴＳＣ１２は、新規の１１１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３９】
【化１１】
（ＴＳＣ１５）
ＴＳＣ１５は、新規の５９４ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４０】
【化１２】
（ＴＳＣ１６）
ＴＳＣ１６は、新規の７１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４１】
【化１３】
（ＴＳＣ１７）
ＴＳＣ１７は、新規の３０６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４２】
【化１４】
（ＴＳＣ１８）
ＴＳＣ１８は、新規の６６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４３】
【化１５】
（ＴＳＣ１９）
ＴＳＣ１９は、新規の１６１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４４】
【化１６】
（ＴＳＣ２０）
ＴＳＣ２０は、新規の２２４５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４５】
【化１７】
（ＴＳＣ２１）
ＴＳＣ２１は、新規の１７１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４６】
【化１８】
（ＴＳＣ２２）
ＴＳＣ２２は、新規の４９１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４７】
【化１９】
（ＴＳＣ２３）
ＴＳＣ２３は、新規の６５９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４８】
【化２０】
（ＴＳＣ２４）
ＴＳＣ２４は、新規の３４１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４９】
【化２１】
（ＴＳＣ２５）
ＴＳＣ２５は、新規の５３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００５０】
【化２２】
（一般方法）
ＴＳＣＸ核酸およびコードされたポリペプチドは、上記に提供する情報を用い
て同定され得る。いくつかの実施形態において、ＴＳＣＸ核酸およびＴＳＣＸポ
リペプチドは、それぞれのＴＳＣＸポリペプチドについて開示された種々の配列
（配列番号によって参照される）を含む核酸またはポリペプチドに対応する。
【００５１】
その種々の局面ならびに実施形態において、本発明は、配列ＴＳＣ１〜１４２
の１つ以上を発現し得る少なくとも１つの細胞を含む試験細胞集団を提供するこ
とを含む。「発現し得る」によって、その遺伝子が、その細胞中にインタクトな
形態で存在し、そして発現され得ることが意味される。次いで、ＴＳＣＸ配列の
１つ、いくつか、または全ての発現は、存在する場合、検出され、そして好まし
くは、測定される。既知の配列についてデータベース登録によって提供される配
列情報、または新規に記載された配列についての配列情報を用いて、ＴＳＣＸ配
列の発現は、当業者に周知の技術を使用して、（存在する場合）検出され、そし
て測定され得る。例えば、ＴＳＣＸ配列に対応する配列データベース登録内また
は本明細書中に開示された配列内の配列は、例えば、ノーザンブロットハイブリ
ダイゼーション解析または、特定の核酸配列を特異的に、そして好ましくは、定
量的に増幅する方法において、ＴＳＣＸ ＲＮＡ配列を検出するためのプローブ
を構築するために使用され得る。別の例としては、この配列は、例えば、増幅ベ
ースの検出方法（例えば、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応）において、Ｔ
ＳＣＸ配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築するために使用され得る
。遺伝子発現における変更が遺伝子の増幅または欠失に関連する場合、試験集団
と参照集団との配列の比較は、試験細胞集団および参照細胞集団における試験さ
れたＤＮＡ配列の相対的な量を比較することによってなされ得る。
【００５２】
発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち、本明細書中に記載の遺伝子産物
によってコードされたポリペプチドのレベルを測定することによって、測定され
得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そして、例えば、遺伝子によ
ってコードされるタンパク質に対する抗体に基づく免疫アッセイを含む。
【００５３】
次いで、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ配列の発現レベルは、参照のプロフィ
ール由来の１つ以上の細胞におけるその配列の発現レベルと比較される。細胞の
試験集団およびコントロール集団での配列の発現は、核酸配列の発現を比較する
ための、当該分野で認識される方法のいずれかを用いて比較され得る。例えば、
発現は、米国特許第５，８７１，６９７号およびＳｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７９８−８０３に記載されるように、ＧＥＮＥＣ
ＡＬＬＩＮＧ（登録商標）方法を用いて比較され得る。種々の実施形態において
、ＴＳＣ１〜１４２によって表される配列の２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１５、２０、２５、３５、４０、５０、１００、１５０または全ての発現
は、測定される。所望される場合、これらの配列の発現は、発現が本明細書中に
記載されるパラメーターまたは状態の１つに従って変化されると知られている他
の配列と一緒に測定され得る。
【００５４】
参照プロフィールは、単一の参照集団または複数個の発現パターン由来の発現
パターンである。この参照プロフィールは、本明細書中に記載される状態の１つ
（例えば、結節性硬化症複合体関連障害）が知られている、事前に試験された細胞由
来の発現パターンのデータベースであり得る。結節性硬化症複合体関連障害としては
、例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮膚、心臓または腎臓）での過誤腫また
は過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫、メラニン減少斑（ｈｙｐｏｍｅｌａ
ｎｏｔｉｃ ｍａｃｕｌｅｓ）、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体（ｕ
ｎｇｕｌａ）線維腫が挙げられる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試験細胞は、結節性硬化症複合体関連障害を含むと
知れているか、またはこれを有することが疑われる被検体由来の細胞サンプルに
含まれる。他の実施形態において、その細胞サンプルは、原発性腫瘍（例えば、
腎癌腫）を含むと知られているか、または含むことが疑われる領域由来の被検体
由来である。さらなる実施形態において、その細胞サンプルは、原発性腫瘍の転
移を含むと知られているか、または含むことが疑われる領域由来の被検体由来で
ある。
【００５６】
好ましくは、参照プロフィールにおける細胞は、試験細胞とできるだけ同じ組
織型（例えば、脳組織、皮膚組織、心組織または腎組織）由来である。いくつか
の実施形態において、コントロール細胞は、試験細胞と同じ被検体由来（例えば
、試験細胞の起源の領域に近接する領域由来）である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、試験細胞集団は、複数の参照プロフィールと比
較される。複数の参照プロフィールそれぞれは、既知のパラメーターまたは状態
と異なり得る。従って、試験細胞集団は、結節硬化関連障害を有することが既知
の第１の参照プロフィール、および、結節硬化関連障害を有していないことが既
知の第２の参照集団と比較され得る。
【００５８】
種々の実施形態において、表１に列挙されるような、別個の遺伝子プロフィー
ルで発現される遺伝子をコードする１つ以上の配列の発現は、比較される。これ
らの遺伝子プロフィールとしては、例えば、「ＭＥＦおよびＮＳＣ−／−の保存
された差示的発現」（例えば、ＴＳＣ１〜９）、「ＭＥＦおよびＮＳＣ−／−と
反対の差示的発現」（ＴＳＣ１０〜１８）、「ＮＳＣのみ」（ＴＳＣ１９〜４４
）、および「ＭＥＦのみ」（ＴＳＣ４５〜５７）が挙げられる。いくつかの実施
形態において、２つ以上の遺伝子プロフィールのメンバーの発現が比較される。
【００５９】
参照プロフィールとの試験細胞集団における遺伝子発現プロフィールの比較が
、測定された状態の存在または程度を示すか示さないかは、参照プロフィールと
の比較に依存する。例えば、そのプロフィールが結節硬化関連障害を有する細胞
からなる場合、試験細胞集団および参照プロフィールでの同様の遺伝子発現レベ
ルは、試験細胞集団での結節硬化関連障害の存在を示す。逆に、参照プロフィー
ルが結節硬化関連障害を有しない細胞からなる場合、試験細胞集団と参照プロフ
ィールとの間の同様の遺伝子発現プロフィールは、試験細胞集団において結節硬
化関連障害が存在しないことを示す。
【００６０】
種々の実施形態において、試験細胞集団におけるこのＴＳＣＸ配列は、その発
現レベルが、参照プロフィールにおけるＴＳＣＸ転写物のレベルに対し、２．０
倍、１．５倍、または１．０倍の因数内で変化する場合、その発現レベルにおい
て、抗ロイコプロテアーゼ配列の発現レベルと匹敵するとみなされる。種々の実
施形態において、ＴＳＣ配列の発現レベルが、参照細胞集団での対応する抗ロイ
コプロテアーゼ配列の発現レベルの１．０倍、１．５倍、２．０倍、またはそれ
以上の倍数で参照細胞集団と異なる場合、その試験細胞集団におけるＴＳＣ配列
は、発現レベルが変化したとみなされ得る。
【００６１】
所望される場合、試験細胞集団と参照プロフィールとの間の差示的に発現され
た配列の比較は、発現が、測定されるパラメーターまたは状態に依存しないコン
トロール核酸に関して実施され得る。試験核酸および参照核酸におけるコントロ
ール核酸の発現レベルは、比較される集団におけるシグナルのレベルを規準化す
るために使用され得る。
【００６２】
試験細胞集団は、任意の数の細胞、すなわち１つ以上の細胞であり得、そして
、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供され得る。
【００６３】
他の実施形態において、試験細胞集団は、２つ以上の亜集団に分割され得る。
この亜集団は、できるだけ同一の亜集団を作成するように第１の細胞集団を分割
することにより作成され得る。これは、例えば、インビトロまたはエクスビボで
のスクリーニング方法において適切である。いくつかの実施形態において、種々
の亜集団は、コントロール薬剤および／または試験薬剤、複数の試験薬剤、ある
いは、例えば、一緒に投与される１つまたは複数の試験薬剤の異なる投薬量、ま
たは種々の組み合わせに曝され得る。
【００６４】
被検体は、好ましくは、哺乳動物である。この哺乳動物は、例えば、ヒト、非
ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得る。
【００６５】
（結節性硬化症複合体関連障害の診断）
本発明は、結節性硬化症複合体関連障害（例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮
膚、心臓または腎臓）での過誤腫または過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫
、メラニン減少斑、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫）の感受性
を診断または決定する方法を提供する。結節性硬化症複合体関連障害は、結節硬化複
合症関連障害を有することが疑われる被検体からの細胞の試験集団由来のＴＳＣ
Ｘ核酸をコードする核酸の発現を試験することによって診断される。この細胞集
団は、脳の細胞を含み得るか、または代替的に、目、皮膚、心臓または腎臓の細
胞を含み得る。
【００６６】
ＴＳＣＸ核酸の発現は、試験細胞で測定され、そして参照プロフィールにおけ
るこの配列の発現と比較される。参照プロフィールは、ＴＳＣ障害ポジティブ参
照プロフィールであり得る。「ＴＳＣ障害ポジティブ参照プロフィール」によっ
て、参照プロフィールが、結節性硬化症複合体関連障害を有する組織由来の細胞を含
むことが意味される。あるいは、この参照プロフィールは、ＴＳＣ障害ネガティ
ブ参照プロフィールであり得る。「ＴＳＣネガティブ参照プロフィール」によっ
て、参照プロフィールが、結節性硬化症複合体関連障害を有さない組織由来の細胞を
含むことが意味される。
【００６７】
参照プロフィールが、ＴＳＣ障害ポジティブ参照プロフィールである場合、試
験集団と参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の発現の類似性は、被検体
における結節性硬化症複合体関連障害の存在を示す。逆に、試験集団とＴＳＣ障害ポ
ジティブ参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の試験細胞集団中の発現に
おける差異は、被検体において結節性硬化症複合体関連障害が存在しないことを示す
。
【００６８】
参照プロフィールがＴＳＣ障害ネガティブ参照プロフィールである場合、試験
細胞集団とＴＳＣ障害ネガティブ参照プロフィールとの間の発現パターンでの差
異は、結節性硬化症複合体関連障害の存在を示す。逆に、試験集団とＴＳＣ障害ネガ
ティブ参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の発現の類似性は、被検体に
おいて結節性硬化症複合体関連障害が存在しないことを示す。
【００６９】
（結節性硬化症複合体に関連する障害を処置する方法）
本発明は、被験体における結節性硬化症複合体関連の障害を処置するための方法を
提供し、この方法は、１以上のＴＳＣＸ核酸またはポリペプチドの発現を調節す
る化合物を、それを必要とする被験体に投与することによる。投与は、結節性硬化症
複合体関連の障害の危険性のある（または結節性硬化症複合体関連の障害に対して感
受性の）被験体に対して予防的または治療的であり得る。結節性硬化症複合体関連の
障害は、例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮膚、心臓もしくは腎臓）におけ
る過誤腫または過誤組織、腎癌腫、悪性血管筋脂肪腫、メラニン減少斑、顔面（
ｆａｃｉｌａ）血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫であり得る。
【００７０】
治療方法は、罹患細胞が由来する組織型由来の正常細胞に対して、罹患細胞に
おいて、ＴＳＣＸ核酸の発現もしくは機能を減少または阻害する工程を包含する
。これらの方法において、被験体は、有効量の化合物で処置され、この化合物は
、被験体においてＴＳＣＸ核酸またはポリペプチドの量を減少させる。投与は、
全身的または局所的（例えば、被験体の罹患細胞のごく近傍）であり得る。発現
は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって阻害され得る。例えば
、発現は、被験体に、ＴＳＣＸの発現を阻害または拮抗する核酸を投与すること
によって阻害され得る。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが投与されて、ＴＳＣＸ核酸の発現を破壊し得る。
【００７１】
あるいは、ＴＳＣＸの機能は、ＴＳＣＸ遺伝子産物に結合するか、さもなけれ
ばＴＳＣＸ遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって、阻害さ
れ得る。この化合物は、例えば、ＴＳＣＸ核酸によってコードされるポリペプチ
ドに対する抗体であり得る。
【００７２】
これらの調節方法は、エキソビボまたはインビトロで（例えば、この薬剤と共
に細胞を培養することによって）実行され得るか、あるいはインビボで（例えば
、この薬剤を被験体に投与することによって）実行され得る。このように、本発
明は、ＴＳＣＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性によって特徴
付けられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実
施形態において、この方法は、薬剤（例えば、本明細書中に記載されるスクリー
ニングアッセイによって同定される薬剤）、あるいはＴＳＣＸ核酸またはポリペ
プチドの発現または活性を調節（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギ
ュレート）する薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態にお
いて、この方法は、タンパク質、またはタンパク質もしくは核酸分子の組み合わ
せ、またはＴＳＣＸ核酸の異常な発現もしくは活性を補償する治療剤としての核
酸分子の組み合わせを投与する工程を包含する。
【００７３】
利用され得る治療剤としては、例えば以下が挙げられる：（ｉ）過剰発現配列
のポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ
；（ｉｉ）過剰発現配列に対する抗体；（ｉｉｉ）アンチセンス核酸もしくは「
機能不全」（すなわち、１以上の過剰発現配列もしくは過少発現配列のコード配
列内の異種挿入物に起因する）核酸；あるいは（ｖ）モジュレータ（すなわち、
過剰発現ポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変更するインヒ
ビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。機能不全アンチセンス分子は、相
同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するために利用
される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２
９２ １９８９を参照のこと）。増加または減少したレベルは、患者の組織サン
プルを（例えば、生検組織から）獲得し、そしてインビトロでＲＮＡもしくはペ
プチドのレベル、発現したペプチド（または発現が変更された遺伝子のｍＲＮＡ
）の構造および／または活性についてアッセイすることによって、ペプチドおよ
び／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。当該分野で周
知の方法としては、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の免疫沈降、免
疫細胞化学など）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイ
ゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチ
ュハイブリダイゼーションなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
予防剤の投与は、異常な遺伝子発現に特徴的な症状の出現の前に生じ得、その
結果、疾患または障害は、予防されるか、あるいは進行が遅らされる。検出され
る異常な発現の型に依存して、薬剤は、被験体を処置するために使用され得る。
適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定
され得る。
【００７５】
（結節硬化症関連障害を処置または予防するための、候補治療剤を同定するた
めのスクリーニングアッセイ）
本明細書中に開示される差示的に発現される配列はまた、結節硬化症関連障害
を処置または予防する候補治療剤を同定するために使用され得る。この治療剤は
、ＴＳＣＸ核酸を発現し得る細胞を含む細胞集団を提供することによって同定さ
れ得る。次いで、試験細胞集団における核酸配列の発現は、参照細胞集団（これ
は、試験薬剤に曝露されない細胞集団であるか、またはいくつかの実施形態にお
いては試験薬剤に曝露された細胞集団である）における核酸配列の発現と比較さ
れる。比較は、同時または時間的に別個の時点で測定された試験サンプルおよび
参照サンプルに対して実行され得る。後者の例は、編集された発現情報（例えば
、配列データベース）（これは、種々の薬剤の投与後の、既知の配列の発現レベ
ルについての情報を編集する）の使用である。例えば、試験薬剤の投与後の発現
レベルの変更は、コントロール薬剤の投与後に核酸配列において観察される発現
変化に対して比較され得る。
【００７６】
試験サンプルに曝露されていない参照細胞集団における核酸配列の発現と比較
した、試験細胞集団における核酸配列の発現の減少は、この試験薬剤が、候補治
療剤であることを示す。
【００７７】
この試験薬剤は、以前に記載されていない化合物であり得るか、または以前に
知られているが結節性硬化症複合体障害を処置するための薬剤であることが知られて
いない化合物であり得る。
【００７８】
本発明はまた、このスクリーニング方法に従って同定された化合物を含む。
【００７９】
過少発現遺伝子の発現を刺激するか、または過剰発現遺伝子の発現を抑制する
際に有効な薬剤は、結節性硬化症複合体関連障害を予防する能力について、そしてこ
のような病態生理の処置のために有用な潜在的治療剤として、さらに試験され得
る。このような化合物の臨床的有用性のさらなる評価は、毒性および臨床的有効
性を評価する標準的方法を使用して実行され得る。
【００８０】
（特定の個体について適切な、結節性硬化症複合体関連障害を処置するための治療
剤の選択）
個体の遺伝的構成の差異は、種々の薬物を代謝する相対的な能力における差異
を生じ得る。被験体において代謝されて、治療剤として作用する薬剤は、病態生
理学的状態に特徴的な遺伝子発現パターンからの、非病態生理学的状態に特徴的
な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって、自明であり得る。従っ
て、本明細書中に開示される差示的に発現されたＴＳＣＸ配列は、この薬剤が、
被験体において適切な治療剤であるか否かを決定するために、選択された被験体
由来の試験細胞集団において、推定治療剤または予防剤が試験されることを可能
にする。
【００８１】
特定の被験体に適切な治療剤を同定するために、被験体由来の試験細胞集団を
、治療剤、および１以上のＴＳＣＸ１〜１４１の発現に曝露する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、この薬剤は、薬物を活性形態に代謝する酵素を
含む細胞抽出物と最初に混合される。次いで、この治療剤の活性形態は、試験細
胞集団と混合され得、そして遺伝子発現が測定される。このましくは、この細胞
集団は、薬剤またはこの薬剤の活性形態と、エキソビボで接触される。
【００８３】
次いで、試験細胞集団中の核酸配列の発現を、参照細胞集団中の核酸配列の発
現と比較する。参照細胞集団は、その結節性硬化症複合体状態が既知である、少なく
とも１つの細胞を含む。「結節性硬化症複合体状態」によって、参照細胞集団が、結
節性硬化症複合体の対象物を有することが既知の細胞を含むか否かが意味される。
【００８４】
この試験薬剤は、任意の化合物または組成物であり得る。
【００８５】
（被験体における結節性硬化症複合体関連疾患の処置の有効性評価）
本明細書中で同定された差次的に発現したＴＳＣＸ配列はまた、モニターされ
るべき結節性硬化症複合体関連疾患の一連の処置を可能にする。この方法において、
試験細胞集団は、結節性硬化症複合体関連疾患の治療を受ける被験体から提供される
。所望であれば、試験細胞集団は、処置前、処置の間または処置後の種々の時間
で被験体から採集され得る。次いで、試験細胞における１つ以上のＴＳＣＸ配列
（例えば、ＴＳＣＸ：１−１４２）の発現が測定され、そして病理生理学的状態
が知られている細胞を含む参照細胞集団と比較される。好ましくは、この参照細
胞は、処置に曝されていない。
【００８６】
参照細胞集団が処置に曝された細胞を含まない場合、試験細胞集団と参照細胞
集団におけるＴＳＣＸ配列の間の発現の類似性は、処置の有効性を示す。しかし
、試験集団とこの参照細胞集団におけるＴＳＣＸ間の発現における差異は、処置
が有効で無いことを示す。
【００８７】
「有効な」とは、被験体において、処置が病理生理学における低減を導くこと
を意味する。処置が病理生理学的に適用され得る場合、「有効な」とは、処置が
病理生理学を遅らせるか、あるいは予防することを意味する。
【００８８】
有効性は、特定の病理生理学を処置するための公知の任意の方法と関連して決
定され得る。
【００８９】
（結節性硬化症複合体関連疾患を有する被験体の予後評価）
結節性硬化症複合体関連疾患を有する被験体の予後を、試験細胞集団におけるＴＳ
ＣＸ核酸の発現と、疾患状態のスペクトルにわたって患者に由来する参照プロフ
ィールにおける配列の発現とを比較することによって評価する方法もまた提供さ
れる。試験細胞集団と参照プロフィールのＴＳＣＸ核酸の遺伝子発現を比較する
ことによってか、または被験体由来の試験細胞集団における遺伝子発現のパター
ンを経時的に比較することによって、被験体の予後が評価され得る。
【００９０】
参照プロフィールは、主に非癌性細胞または癌性細胞を含む。主に非癌性細胞
を含む参照プロフィールは、非癌性参照プロフィールである。主に癌性細胞を含
む参照プロフィールは、癌性参照プロフィールである。いくつかの実施形態にお
いて、癌性参照プロフィールは、主に広がった癌性細胞を含む。参照プロフィー
ルが主に非癌性細胞を含む場合、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ核酸の増加した
発現は、予後が好調でないことを示す。逆に、参照プロフィールが主に癌性細胞
を含む場合、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ核酸の減少した発現は、予後がより
好調なことを示す。
【００９１】
（薬学的組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される１つ以上の治療化合物
を含有する、薬学的組成物または治療組成物を含む。薬学的処方物としては、経
口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（筋内、皮下
および静脈内を含む）投与、あるいは吸入または噴霧による投与に適切な処方物
が挙げられ得る。処方物は、適切であれば、別個の投薬量単位において好都合に
表わされ得、そして薬学分野における周知の任意の方法によって調製され得る。
全てのこのような薬学的方法は、液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリア
あるいは必要に応じてその両方を活性化合物と合わせる工程、および必要な場合
、所望の処方物に生成物を成形する工程を包含する。
【００９２】
経口投与に適切な薬学的処方物は、個別の単位（例えば、各々が予め決められ
た量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤；散剤または顆粒剤；ある
いは溶液（懸濁液）またはエマルジョンのような）として好都合に表わされ得る
。この活性成分はまた、ボーラスの舐剤またはペーストとして示され得、そして
純粋な形態（すなわち、キャリアを有さない）あり得る。経口投与のための錠剤
およびカプセルは、好都合な賦形剤（例えば、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤
または湿潤剤を含み得る。錠剤は、必要に応じて１つ以上の処方成分を伴って、
圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、自由流動形態の活性成分（
例えば、必要に応じて結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、滑沢剤、界面活性剤また
は分散剤と混合された粉末または顆粒）を適切な機械で圧縮することによって調
製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化化合
物の混合物を、適切な機械において成形することによって作製され得る。この錠
剤は、当該分野で周知の方法に従ってコートされ得る。経口流体調製物は、例え
ば、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤またはエリキシ
ル剤の形態であり得るか、あるいは使用前に水または適切な他のビヒクルを用い
て構成するための乾燥製剤として示され得る。このような液体調製物は、慣習的
な添加剤（例えば、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）また
は防腐剤）を含み得る。この錠剤は、必要に応じて、その中で、活性成分の遅延
された放出または制御された放出を提供するように処方され得る。
【００９３】
非経口投与のための処方物は、処方物を意図された患者の血液と等張性にする
、水性または非水性の滅菌注射溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝液、抗生物質お
よび溶質を含み得る）；ならびに水性または非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤および
増粘剤を含み得る）を含む。これらの処方物は、単回用量または複数回用量の容
器において示され得（例えば、シールしたアンプルおよびバイアル）、そして使
用の直前に、滅菌液体キャリア（例えば、生理食塩水、注射用水）の添加だけを
必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。あるいは、処方物
は連続注入のために示され得る。即席の注入溶液および懸濁液は、先に記載した
種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００９４】
直腸投与のための処方物は、通常のキャリア（例えば、ココアバターまたはポ
リエチレングリコール）を含む坐剤として示され得る。口（例えば、頬側または
舌下）における局所投与のための処方物は、トローチ剤（ショ糖およびアラビア
ゴムまたはトラガカントゴムような風味付けした基剤中に活性成分を含む）、な
らびに口内錠（ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムのよ
うな基剤中に活性成分を含む）を含む。鼻腔内投与のために、本発明の化合物は
、液体噴霧または分散可能な粉末として、あるいはドロップの形態において使用
され得る。ドロップは、水性または非水性基剤で処方され得、また、１つ以上の
分散剤、可溶化剤または懸濁剤を含む。液体噴霧は、加圧パックから簡便に送達
される。
【００９５】
吸入による投与のために、化合物は、吹入器、噴霧器、加圧パックまたはエア
ロゾル噴霧を送達する他の簡便な手段から簡便に送達される。加圧パックは、適
切なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメ
タン、ジクロロテトラフルオロエタン（ｄｉｃｈｉｏｒｏｔｅｔｒａｆｌｕｏｒ
ｏｅｔｈａｎｅ）、二酸化炭素または適切な他のガス）を含み得る。加圧エアロ
ゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって
決定され得る。
【００９６】
あるいは、吸入および通気法による投与のために、この化合物は、乾燥粉末組
成物の形態をとり得る（例えば、乳糖またはデンプンのような適切な化合物およ
び粉末ベースの粉末混合物）。粉末が吸入または通気法を用いて投与され得る粉
末組成物は、１単位の投与形態（例えば、カプセル剤、カートリッジ、ゼラチン
またはブリスターパック）で与えられ得る。
【００９７】
所望の場合、上記活性成分の徐放を与えるように適用された、上記の処方物が
、用いられ得る。この薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存料
などの他の活性成分も含み得る。
【００９８】
特に上述された成分に加えて、本発明の処方物は、課題の型の処方物（例えば
、経口投与に適する組成物は、フレーバー剤を含み得る）に関連する、当該分野
において慣用的な方法も含み得ることは、理解されるべきである。
【００９９】
好ましい単位用量の処方物は、活性成分の、以下に示すような有効用量または
それらの適切な画分を含む処方物である。
【０１００】
各々の上記の状態に関して、この組成物は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜
約２５０ｍｇ／ｋｇの用量で、経口的または注射を介して投与され得る。ヒト成
体のための用量の範囲は、一般的に、約５ｍｇ〜約１７．５ｇ／１日であり、好
ましくは、約５ｍｇ〜約１０ｇ／１日であり、最も好ましくは、約１００ｍｇ〜
約３ｇ／１日である。離散した単位で提供される表示の錠剤または他の単位の投
与形態は、便利には、そのような投与またはその複数の投与で効果的な量（例え
ば、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ（通常１００ｍｇ〜約５００ｍｇ）を含む単位）を
含み得る。
【０１０１】
薬学的組成物は、好ましくは、経口的または注射（静脈注射もしくは皮下注射
）によって、投与され、そして被験体に投与された正確な量は、主治医の責任で
ある。しかし、用いられる用量は、被験体の年齢および性別、処置される正確な
障害、ならびにその重篤度を含む、多くの因子に依存する。投与の経路はまた、
その状態およびその重篤度に非常に依存し得る。
【０１０２】
（ＴＳＣＸ核酸）
ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５（配列番号１〜２２）からな
る群より選択される核酸配列またはその相補体を含む新規核酸ならびにこれらの
核酸を含むベクターおよび細胞もまた、本発明において提供される。
【０１０３】
従って、本発明の１つの局面は、ＴＳＣＸタンパク質またはそれらの生物学的
に活性な部分をコードする単離されたＴＳＣＸ核酸分子に関する。ＴＳＣＸをコ
ードする核酸（例えば、ＴＳＣＸ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリゼーシ
ョンプローブとしての使用に十分な核酸フラグメントおよびＴＳＣＸ核酸分子の
増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使
用するためのフラグメントもまた含まれ得る。本明細書中に使用される場合、用
語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、Ｒ
ＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて作製されたＤＮ
ＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにその誘導体、フラグメントおよびホモログ
を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ま
しくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１０４】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存し
て少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）と例えば、約６，０００ｎｔほどとの
間の配列をいう。プローブは、同一の核酸配列、類似の核酸配列、または相補的
な核酸配列の検出において用いられる。より長いプローブは、通常、天然の供給
源または組換えの供給源から得られ、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよ
り非常に遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖でも二本鎖でもよく、か
つＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術に
おいて特異性を有するように設計され得る。
【０１０５】
「単離された」核酸分子とは、核酸の天然供給源において存在する他の核酸分
子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子の例としては、ベクター
に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種の宿主細胞に維持される組換えＤＮＡ分子、
部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合成Ｒ
ＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」
核酸分子とは、その核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にはその
核酸に連結している（すなわち、核酸の５’末端または３’末端に配置される）
、遊離の配列である。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＴＳＣ
Ｘ核酸分子は、約５０ｋｂ未満、約２５ｋｂ未満、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満
、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満、または約０
．１ｋｂ未満の核酸配列（この核酸配列は、この核酸が誘導される細胞のゲノム
ＤＮＡにおいて天然には核酸分子に隣接している）を含み得る。さらに、「単離
された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって産生された
場合、他の細胞性物質または培養培地を実質的に含み得ないか、または化学合成
された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を含み得ない。
【０１０６】
本発明の核酸分子（例えば、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５
のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはそれらのヌクレオチド
配列のいずれかの相補体）は、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提
供される配列情報を用いて単離され得る。これらの核酸配列の全てまたは一部を
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＴＳＣＸ核酸配列は、標準的な
ハイブリダイゼーションおよびクローン技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
Ｙ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬ
Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されている）。
【０１０７】
本発明の核酸は、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーと
してｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは、ゲノムＤＮＡを用いて、標準的ＰＣＲ増幅技
術に従い、増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクターへとク
ローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、
ＴＳＣＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術
によって（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）調製され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一連の連結
されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチド残基は、ＰＣＲ反応に
用いられるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド
配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれらの配列
から設計され得、そして特定の細胞または組織中の同一、類似または相補的なＤ
ＮＡまたはＲＮＡの存在を、増幅、確認、または明らかにするために用いられる
。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ｎｔかつ５０ｎｔほどまで（好まし
くは、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ）を有する核酸配列の部分を含む。これらは、化
学的に合成され得、プローブとして、用いられ得る。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、ＴＳＣＸ：：１〜７
、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８〜８５、１１１〜１１３、１２０
、１３０、１３２〜１３４、および１３８に示されるヌクレオチド配列の相補体
である核酸分子を含む。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は
、これらの任意の配列、またはこれらの任意のヌクレオチド配列の一部に示され
るヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。ＴＳＣ：１〜８、１０〜１
２、および１５〜２５に示されるヌクレオチド配列と相補的である核酸分子は、
示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な分子であり、その結果、その分子は
、示されるヌクレオチド配列とほとんどミスマッチしないかまたは全くミスマッ
チせずに水素結合し得、それにより、安定な二本鎖を形成する。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド
単位間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対をい
い、用語「結合」とは、２つのポリペプチドまたは化合物または関連するポリペ
プチドもしくは化合物あるいはそれらの組合せの間の物理的相互作用または化学
的相互作用を意味する。結合としては、イオン結合、非イオン結合、Ｖｏｎ ｄ
ｅｒ Ｗａａｌｓ結合、疎水結合などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的
または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用とは、別のポリペプチドま
たは化合物の効果を介するものであり得るか、またはそれらに起因し得る。直接
的相互作用とは、別のポリペプチドまたは化合物を介して生じることも、それら
の効果に起因しても生じることもないが、他の実施的な化学的中間物質を伴うこ
となく、存在する相互作用をいう。
【０１１１】
さらに、本発明の核酸分子は、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２
５の核酸配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得る
フラグメントか、またはＴＳＣＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメ
ント）のみを含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６
個の（連続する）核酸または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸の配列（各
々、核酸の場合、特定のハイブリダイゼーションを可能とし、またはアミノ酸の
場合、特定のエピトープの認識を可能とするのに十分な長さ）として規定され、
そして全長配列より短いせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択
した核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体と
は、ネイティブの化合物より直接的にかまたは改変もしくは部分的置換のいずれ
かによって形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログとは、その
ネイティブの化合物に類似するが、同一ではない構造を有する、核酸配列または
アミノ酸配列であるが、特定の成分または側鎖に関してそのネイティブの化合物
と異なる。アナログは、合成でも進化的に異なる起源に由来してもよく、そして
野生型に対して類似または反対の代謝活性を有し得る。
【０１１２】
誘導体およびアナログは、下記のように、その誘導体またはアナログが改変さ
れた核酸またはアミノ酸を有する場合、全長でも全長以外でもよい。本発明の核
酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、同一
サイズの核酸配列もしくはアミノ酸配列にわたってか、または整列した配列（こ
の整列は、当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによって行
われる）と比較した場合、少なくとも約４５％、約５０％、約７０％、約８０％
、約９５％、約９８％、または約９９％の同一性（好ましくは、８０〜９９％の
同一性）によって、本発明の核酸分子またはタンパク質に対して実質的に相同で
あるか、あるいはこの配列がコードする核酸配列が、ストリンジェントな条件、
中程度にストリンジェントな条件、または低いストリンジェントな条件下で、前
出されたタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る領域を含
む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵ
ＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ
，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３お
よび以下を参照のこと。例示的なプログラムは、デフォルト設定を用いたギャッ
ププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐ
ａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である（これは、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いる（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１
９８１、２：４８２−４８９（これは、本明細書中に参考として援用される））
。
【０１１３】
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」、あるいはこれらのバリエーシ
ョンとは、上で議論されるようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの
相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同ヌクレオチド配列は、ＴＳＣＸ
ポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソ
フォームは、例えば、ＲＮＡの代替的スプライシングの結果として、同じ生物の
異なる組織中で発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によ
ってコードされ得る。本発明において、相同ヌクレオチド配列は、ヒト以外の種
のＴＳＣＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト以外の種と
しては、哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されず、従って、例えば、マウ
ス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物が挙げられ得る
。相同ヌクレオチド配列としてはまた、本明細書中に示されるヌクレオチド配列
の天然に存在する対立遺伝子改変体および変異体が挙げられるが、これらに限定
されない。しかし、相同ヌクレオチド配列は、ヒトＴＳＣＸタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、ＴＳＣＸポリペプチドおよ
びＴＳＣＸ活性を有するポリペプチド中の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこ
と）をコードするそれらの核酸配列を含む。相同アミノ酸配列は、ヒトＴＳＣＸ
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１１４】
ヒトＴＳＣＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の
細胞型（例えば、他の組織）中のＴＳＣＸホモログおよび他の哺乳動物由来のＴ
ＳＣＸホモログの同定および／またはクローニングに使用するために設計された
プローブおよびプライマーの作製を可能とする。このプローブ／プライマーは、
代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオ
チドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、ＴＳＣＸ配列を含む核酸の少
なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個
、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌ
クレオチド配列、またはＴＳＣＸ配列を含む核酸の連続的アンチセンス鎖ヌクレ
オチド配列、あるいは天然に存在するこれらの配列の変異体とハイブリダイズす
るヌクレオチド配列領域を含む。
【０１１５】
ヒトＴＳＣＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写物または同じタンパ
ク質もしくは相同タンパク質をコードするゲノム配列を検出するために用いられ
得る。種々の実施形態において、このプローブは、それらに付着させた標識基（
例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子で
あり得る）をさらに含む。そのようなプローブは、（例えば、被験体中の細胞サ
ンプル中のＴＳＣＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＴＳＣ
Ｘ ｍＲＮＡレベルを決定することまたはゲノムＴＳＣＸ遺伝子が変異または欠
失しているか否かを決定すること）によって）ＴＳＣＸタンパク質を誤って発現
する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る
。
【０１１６】
「ＴＳＣＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド］とは、本発明のポ
リペプチドの活性と必ずしも同一ではないが、類似する活性を示すポリペプチド
をいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定さ
れるような成熟形態を含む。「ＴＳＣＸの生物学的に活性な部分」をコードする
核酸フラグメントは、ＴＳＣＸの生物学的活性（ＴＳＣＸタンパク質の生物学的
活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードするＴＳＣ：１〜８
、１０〜１２、１５〜２５の部分を単離し、ＴＳＣＸタンパク質のコードされた
部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＴＳＣ
Ｘのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、Ｔ
ＳＣＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、
必要に応じてＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態において、ＴＳＣＸ
の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含
む。
【０１１７】
（ＴＳＣＸ改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示または参照されるＴＳ
ＣＸヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は
、例えば、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５に示されるＴＳＣＸ
核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＴＳＣ
Ｘタンパク質をコードする。
【０１１８】
ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５に示されるラットＴＳＣＸヌ
クレオチド配列に加えて、ＴＳＣＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を
導くＤＮＡ配列の多型が、ある集団内（例えば、ヒト集団）に存在することは、
当業者に理解される。ＴＳＣＸ遺伝子におけるそのような遺伝的多型は、天然の
対立遺伝子のバリエーションに起因してある集団内の個体間で存在し得る。本明
細書中に使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＴＳＣ
Ｘタンパク質（好ましくは、哺乳動物ＴＳＣＸタンパク質）をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。そのような天然の対立遺伝子の
バリエーションは、代表的には、ＴＳＣＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１
〜５％の変動性を生じる。天然の対立遺伝子のバリエーションの結果であり、か
つＴＳＣＸの機能的活性を変化させない、ＴＳＣＸにおける任意および全てのそ
のようなヌクレオチド改変体および生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあ
ると意図される。
【０１１９】
さらに、他の種由来のＴＳＣＸタンパク質をコードし、従って、ＴＳＣ：１〜
８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヒト配列とは異なるヌクレ
オチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発
明のＴＳＣＸ ＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸
分子は、本明細書中に開示されるヒトＴＳＣＸ核酸に対するその相同性に基づい
て、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイ
ゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまた
はその一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＴＳＣＸのＤＮＡは、ヒ
トの膜結合性ＴＳＣＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜
結合性のヒトＴＳＣＸ ＤＮＡは、可溶性のヒトＴＳＣＸに対するその相同性に
基づいて単離され得る。
【０１２０】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌ
クレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下でＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ
：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハ
イブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５
０、１００、２５０、または５００のヌクレオチド長である。別の実施形態では
、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書
中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は
、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同な
ヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載
することを意図する。
【０１２１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＴＳＣＸタンパク質をコードする核
酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定の
ヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよび
クローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、また
は高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、
その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない
条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で
異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズ
する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで
、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは
、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイ
ズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列
は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有さ
れている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩
濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０
Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が短いプローブ、
プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について
少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレ
オチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェント
な条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０１２３】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出
され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約
７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が
、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、
０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであ
る。このハイブリダイゼーションは、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ Ｂ
ＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下でＴＳＣ
：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５の配列にハイブリダイ
ズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在す
る（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮ
Ａ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１２４】
第２の実施形態では、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１
５〜２５、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ
し得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．
５％ ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼ
ーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗
浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で
周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ
ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１２５】
第３の実施形態では、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１
５〜２５、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る
核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定
的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏ
ｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重
量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて
２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．１％ ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低
ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイ
ブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（
編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫ
ｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥ
ＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐ
ｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｈｉｌｏら，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１２６】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＴＳＣＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加え
て、当業者は、ＴＳＣＸ核酸中に変化がもたらされ得るか、またはこのＴＳＣＸ
タンパク質の機能的能力を変化させることなく、ＴＳＣＸポリペプチド配列中に
直接的に変化がもたらされ得ることをさらに理解する。いくつかの実施形態にお
いて、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヌクレ
オチド配列が変化され、それによってコードされるＴＳＣＸタンパク質のアミノ
酸配列中に変化をもたらす。例えば、種々の「非必須」アミノ酸残基にてアミノ
酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２お
よびＴＳＣ：１５〜２５の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は
、生物学的活性を変更することなく、このＴＳＣＸの野生型配列から、変更され
得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる
。例えば、本発明のＴＳＣＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、
特に変更を受け入れ難いと予測される。
【０１２７】
さらに、本発明のＴＳＣＸタンパク質のファミリーメンバーの間で保存される
アミノ酸残基は、変更に対して特に受け入れ難いこともまた予想される。このよ
うに、これらの保存されたドメインは、変異に対して受容可能ではないようであ
る。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＴＳＣＸタンパク質のメンバーの間で
保存されないか、またはある程度のみ保存されるアミノ酸残基）は、活性に必須
であり得ず、従って変異に対して受容可能であるようである。
【０１２８】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、
ＴＳＣＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＴＳＣＸタンパ
ク質は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む
核酸によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列とは、アミノ酸残基が異な
るが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子
は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質
は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む核酸
によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列に
、少なくとも約４５％の相同性の、より好ましくは６０％の、そしてさらにより
好ましくは少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％の、
そして最も好ましくは少なくとも約９９％の相同性のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
相同なＴＳＣＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、ＴＳＣ：１〜
８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む核酸のヌクレオチド配
列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製さ
れ得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタ
ンパク質に導入される。
【０１３０】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）
によって、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含
む核酸中に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非
必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が
類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側
鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらの
ファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば
、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、ア
スパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グ
リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイ
ン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β
分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）およ
び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、ヒスチジン）。従って、ＴＳＣＸ中の推定された非必須アミノ酸残基
は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別
の実施形態では、変異は、ＴＳＣＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例え
ば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって
）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＴＳＣＸの生物学的活性に
ついてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。核酸配列の
変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え
技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、変異ＴＳＣＸタンパク質は、以下についてアッセイされ
得る：（１）他のＴＳＣＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学
的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、
（２）変異ＴＳＣＸタンパク質と、ＴＳＣＸのリガンドとの間の複合体形成；（
３）変異ＴＳＣＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性
な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（４）ＡＴＰを結合
させる能力；あるいは（５）ＴＳＣＸタンパク質抗体を特異的に結合させる能力
。
【０１３２】
他の特定の実施形態において、核酸とはＲＮＡまたはＤＮＡである。そのフラ
グメントまたはその相補的なポリヌクレオチド配列のフラグメントは、約１０ヌ
クレオチド〜約１００ヌクレオチドの間の長さ（例えば、約１０ヌクレオチド〜
約９０ヌクレオチドの間の長さ、もしくは約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオ
チドの間の長さ、約１０塩基〜約５０塩基の間の長さ、約１０塩基〜約４０塩基
の間の長さ、または約１５塩基〜約３０塩基の間の長さ）である。
【０１３３】
（アンチセンス）
本発明の別の局面は、ＴＳＣＸ配列、またはそのフラグメント、アナログもし
くは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは
相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核
酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖
ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）
ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０
、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＴＳＣＸコー
ド鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が
提供される。ＴＳＣＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナ
ログをコードする核酸分子、またはＴＳＣＸ核酸配列を含む核酸に相補的なアン
チセンス核酸がさらに提供される。
【０１３４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＴＳＣＸをコードするヌクレ
オチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コ
ード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の
領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＴＳＣＸをコー
ドするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスで
ある。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳され
ない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非
翻訳領域ともいわれる）。
【０１３５】
本明細書中に開示されるＴＳＣＸをコードするコード鎖配列を考慮すれば、本
発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック型塩基対合、またはフーグステ
ィーン型塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＴＳ
ＣＸ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＴＳ
ＣＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであ
るオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ
ＳＣＸ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約
２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０のヌクレオチドであり得る
。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成ま
たは酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこ
の分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセン
ス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された
種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホ
ロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１３６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシ
メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウ
ラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ
６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，
２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル
シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メ
チルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β
−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５
−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシ
ル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシ
ン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４
−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステ
ル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（
３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、お
よび２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアン
チセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成さ
れ得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさら
に記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１３７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果、それらは、ＴＳＣＸタンパク質をコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または
それらに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば、転写および／
または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定
な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によって、または例えばＤＮＡ二
重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルー
ブにおける特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子
の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、ア
ンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで
全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、
そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチド
または抗体に連結することによってそれらが選択された細胞表面上に発現された
レセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセン
ス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得
る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸
分子が、強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの
制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１３８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡとの特定の二本鎖ハイ
ブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平
行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’
−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜３
３０）を含み得る。
【０１３９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。
リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ
活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補
領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａ
ｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８
５〜５９１に記載される））を使用して、ＴＳＣＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に
切断し、それによってＴＳＣＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＴＳＣＸをコー
ドする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＴＳ
ＣＸのＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、活性部位の
ヌクレオチド配列が、ＴＳＣＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチ
ド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築
され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅ
ｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＴＳＣＸの
ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特定のリボヌクレアーゼ活性を
有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１４０】
あるいは、ＴＳＣＸの遺伝子発現は、ＴＳＣＸ核酸の調節領域（例えば、ＴＳ
ＣＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列
を標的化し、標的細胞中でのＴＳＣＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を
形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（
１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭ
ａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１４１】
種々の実施形態において、ＴＳＣＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨
格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶
性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプ
チド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈ
ｅｍ ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される用語「ペプチド核
酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によっ
て置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持さ
れている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの天然の骨格は、
低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼー
ションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨ
ｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ
９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成
プロトコルを用いて行われ得る。
【０１４２】
ＴＳＣＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例
えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害
することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗原
剤として使用され得る。ＴＳＣＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲク
ランピングによる遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素（例
えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素（Ｈｙ
ｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイ
ゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上
記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、例えば、使用され得る
。
【０１４３】
別の実施形態において、ＴＳＣＸのＰＮＡは、例えばそれらの安定性または細
胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂肪親和性基または他のヘルパー基を
結合することによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポ
ソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変
され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＴＳＣＸの
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異
性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓ
ｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする
。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向
を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕ
ｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６
）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３
３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準
的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、
そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチ
ル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮ
Ａの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカッ
プリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメ
ラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグ
メントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔ
ｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５：１
１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１４４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を
含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため
）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３
４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘
発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：
９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変さ
れ得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチ
ド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発
切断剤など）に結合され得る。
【０１４５】
（ＴＳＣＸポリペプチド）
本発明の１つの局面は、単離されたＴＳＣＸタンパク質、およびその生物学的
に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモロ
グを含む。抗ＴＳＣＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切な
ポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイテ
ィブなＴＳＣＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製
スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態にお
いて、ＴＳＣＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発
現に代わるものとして、ＴＳＣＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペ
プチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０１４６】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な
部分は、ＴＳＣＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質
または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合
に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質
的に含まない」は、ＴＳＣＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、
ＴＳＣＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、この
タンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実
質的に含まない」は、非ＴＳＣＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパ
ク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＴＳ
ＣＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＴＳＣＸタンパク質を約
１０％未満、そして最も好ましくは非ＴＳＣＸタンパク質を約５％未満有する、
ＴＳＣＸタンパク質の調製物を含む。ＴＳＣＸタンパク質またはその生物学的に
活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、
すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ま
しくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０１４７】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が
、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離され
ているＴＳＣＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化
学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＴＳ
ＣＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体ま
たは非ＴＳＣＸポリペプチドを約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体ま
たは非ＴＳＣＸポリペプチドを約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体
または非ＴＳＣＸポリペプチドを約５％未満有する、ＴＳＣＸタンパク質の調製
物を含む。
【０１４８】
ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、十分に相同なアミノ酸配列、
またはＴＳＣＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、全長ＴＳＣＸタンパク質よ
り少ないアミノ酸を含み、そしてＴＳＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を
示す、ＴＳＣＸ１〜２０を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列）に由来
するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は
、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ
を含む。ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、
５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチド長であり得る。
【０１４９】
本発明のＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＴＳＣＸタンパク質
間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。代替の
、ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、上記の同定された少なくとも
２つのドメインを含み得る。未発明のＴＳＣＸタンパク質の別の生物学的に活性
な部分は、上記の同定された少なくとも３つのドメインを含み得る。本発明の
ＴＳＣＸタンパク質のなお別の生物学的に活性な部分は、上記の同定された少な
くとも４つのドメインを含み得る。
【０１５０】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、
組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＴＳＣＸタンパク質の機能
的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質は、これらのＴＳＣＸタン
パク質の１つに実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天
然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、ＴＳ
ＣＸタンパク質の機能的活性を保持する。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、ＴＳＣＸｉｃ剤が投与される、哺乳動物
において発現が調節されるポリペプチド配列に８０％以上であるアミノ酸配列を
含む単離されたポリペプチドを含む。
【０１５３】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性のパーセントを決定するために
、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第１の
アミノ酸配列または核酸配列の配列中に第２のアミノ酸配列または核酸配列との
最適な整列のために導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌク
レオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中
の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド
で占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用
される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一
性」と等価である）。
【０１５４】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（５．
０のＧＡＰ作成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー）を用いて
ＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを用いると、上記で言及される類似の核酸配列のコ
ード領域は、ＴＳＣＸ：：１〜７、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８
〜８５、１１１〜１１３、１２０、１３０、１３２〜１３４および１３８を含む
ＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、
８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１５５】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較する工程、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在す
る位置の数を決定し、一致した位置の数を得る工程、この一致した位置の数を、
比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算する工程、そ
して結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを得る工程。用語「
実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特
徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較し
て、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性
、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の
配列同一性を有する配列を含む。
【０１５６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＴＳＣＸのキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用される場合、ＴＳＣＸの「キメラタンパク質」または「融合
タンパク質」は、非ＴＳＣＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＴＳＣＸポ
リペプチドを含む。「ＴＳＣＸポリペプチド」は、ＴＳＣＸに対応するアミノ酸
配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＴＳＣＸポリペプチド」は、ＴＳＣＸ
タンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＴＳＣＸタンパ
ク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＴＳＣＸの融合タンパク質におい
て、このＴＳＣＸポリペプチドは、ＴＳＣＸタンパク質のすべてまたは一部分に
対応し得る。１つの実施形態において、ＴＳＣＸの融合タンパク質は、ＴＳＣＸ
タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態にお
いて、ＴＳＣＸの融合タンパク質は、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも２つの生
物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態において、ＴＳＣＸの融合タン
パク質は、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む
。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＴＳＣＸポリペ
プチドおよび非ＴＳＣＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されている
ことを示すことが意図される。非ＴＳＣＸポリペプチドは、ＴＳＣＸポリペプチ
ドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１５７】
例えば、１つの実施形態において、ＴＳＣＸ融合タンパク質は、第２のタンパ
ク質の細胞外ドメインと作動可能に連結されたＴＳＣＸドメインを含む。このよ
うな融合タンパク質は、ＴＳＣＸ活性を調節する化合物のためのスクリーニング
アッセイ（このようなアッセイは以下に詳細に記載される）において、さらに利
用され得る。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＴＳＣＸ融合
タンパク質であり、ここではＴＳＣＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク
質は、組換えＴＳＣＸの精製を容易にし得る。
【０１５９】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を
含むＴＳＣＸタンパク質である。例えば、ネイティブのＴＳＣＸシグナル配列が
取り除かれ得、そして別のタンパク質からのシグナル配列と置換され得る。特定
の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＴＳＣＸの発現および／ま
たは分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１６０】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＴＳＣＸ−免疫グロブリ
ン融合タンパク質であり、ここで、１つ以上のドメインを含むＴＳＣＸ配列が、
免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。
本発明のこのＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取
り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＴＳＣＸリガントとＴＳ
ＣＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＴＳＣＸ媒
介シグナル伝達を抑制し得る。このＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を
用い、ＴＳＣＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＴＳ
ＣＸリガンド／ＴＳＣＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処
置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有
用であり得る。さらに、本発明のこのＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質
は、被験体中で抗ＴＳＣＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＴＳ
ＣＸリガンドを精製し、そしてＴＳＣＸリガンドとのＴＳＣＸの相互作用を阻害
する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０１６１】
本発明のＴＳＣＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法
により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラ
グメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（
ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じ
て粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるための
アルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフ
レームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成
機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増
幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニーリングおよび再増幅され
得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカー
プライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例え
ば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されて
いる。ＴＳＣＸをコードする核酸は、この融合部分がＴＳＣＸタンパク質にイン
フレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１６２】
（ＴＳＣＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＴＳＣＸアゴニスト（模倣物）としてか、またはＴＳＣＸアン
タゴニストとしてかのいずれかで機能するＴＳＣＸタンパク質の改変体に関する
。ＴＳＣＸタンパク質の改変体（例えば、ＴＳＣＸタンパク質の離散した点変異
または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＴＳＣＸタンパク質のアゴニ
ストは、天然に存在する形態のＴＳＣＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性
、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＴＳＣＸタンパク質のア
ンタゴニストは、天然に存在する形態のＴＳＣＸタンパク質の１つ以上の活性を
、例えば、ＴＳＣＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または
上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学
的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施
形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有
する改変体を用いた被験体の処置は、ＴＳＣＸタンパク質の天然に存在する形態
を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１６３】
ＴＳＣＸアゴニスト（模倣物）としてか、またはＴＳＣＸアンタゴニストのい
ずれかとしてかのいずれかで機能するＴＳＣＸタンパク質の改変体は、ＴＳＣＸ
タンパク質アゴニスト活性またはＴＳＣＸタンパク質アンタゴニスト活性のため
のＴＳＣＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライ
ブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、
ＴＳＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘
発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＴＳ
ＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物
を、潜在的なＴＳＣＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるい
は、その中にＴＳＣＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのた
めの）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子
配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列
から潜在的なＴＳＣＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々
の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施さ
れ得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の
縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＴＳＣＸ配列の所望のセ
ットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを
合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅ
ｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
１１：４７７を参照のこと。
【０１６４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＴＳＣＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用い
て、ＴＳＣＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のための
ＴＳＣＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード
配列フラグメントのライブラリーは、ＴＳＣＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグ
メントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処
理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／
アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生する
こと、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分
を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に
連結することにより生成され得る。この方法により、ＴＳＣＸタンパク質の種々
のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生
し得る。
【０１６５】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。こ
のような技法を、ＴＳＣＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成さ
れた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子
ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広
く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクタ
ー中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を
形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が
、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下
で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技
法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｓｅｍｂｌ
ｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合
わせて用い、ＴＳＣＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（
１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９
３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
（抗ＴＳＣＸ抗体）
単離されたＴＳＣＸタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて
、ＴＳＣＸに結合する抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。完全長
のＴＳＣＸタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての
使用のためのＴＳＣＸの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＴＳＣＸの抗
原性ペプチドは、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２および１５〜２５に示される核酸
配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列のうちの、少なくとも８アミノ
酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＴＳＣＸと特異的
な免疫複合体を形成するように、ＴＳＣＸのエピトープを含む。好ましくは、こ
の抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なく
とも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸
残基、そして最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペ
プチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＴＳＣ
Ｘの領域、例えば、親水性領域である。抗体産生を標的にする手段として、親水
性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を
伴うかまたは伴わない、Ｋｙｔｅ ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ Ｗｏｏ
ｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、Ｈｏｐ
ｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。この各々が、そ
れらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【０１６６】
ＴＳＣＸポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは
ホモログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生におけ
る免疫原として利用し得る。本明細書で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン
分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特
異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体と
しては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆ
ａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げ
られるが、こららに限定されない。当該分野で公知の種々の手順が、ＴＳＣＸタ
ンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに
対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。
これらのタンパク質のいくつかを以下で論議する。
【０１６７】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）が、ネイティブタンパク質、またはそ
の合成改変体、あるいは前述のものの誘導体での注射により免疫され得る。適切
な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたＴＳＣＸタンパク質また
は化学的に合成されたＴＳＣＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジ
ュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のア
ジュバントとしては、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミネラルゲ
ル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プ
ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニト
ロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎおよび
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、ま
たは類似の免疫刺激剤が挙げられるが、こららに限定されない。所望であれば、
ＴＳＣＸに対する抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そして
さらに、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような、
周知の技術により精製され得る。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗
体組成物」は、ＴＳＣＸの特定のエピトープと免疫反応し得る、１種類の抗原結
合部位のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル
抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＴＳＣＸタンパク質に対し、単一の結
合親和性を示す。特定のＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製には、継続的な
細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このよ
うな技術としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１
９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（
ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８
３ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を
産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣ
ＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、
Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）が挙げられるが
、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において利
用し得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによるか（Ｃｏｔｅら、１９８
３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３
０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイル
スで形質転換することにより（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ
ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ
．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）産生し得る。
【０１６９】
本発明によれば、ＴＳＣＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術
が、適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。
さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のための方法が適合されて（例えば、Ｈ
ｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこ
と）、ＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしく
はホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの
迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術によ
り「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと
。ＴＳＣＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該
分野で公知の技術により産生し得、これには：（ｉ）抗体分子のペプシン消化に
より産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメ
ントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；
（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により産生されるＦａｂフ
ラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられるが、これらに限定
されない。
【０１７０】
さらに、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノ
クローナル抗体のような、組換え抗ＴＳＣＸ抗体（これらは、標準的な組換えＤ
ＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ
抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術に
より産生され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特
許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開
番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願
番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：
１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４
３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；
Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら
（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ
Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１
９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５
３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；Ｖ
ｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびに
Ｂｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３〜４０６
０。
【０１７１】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのた
めの方法は、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ
）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の
実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である
抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＴＳＣＸタンパク質のフラグ
メントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＴＳＣＸタンパク
質内の１つ以上のドメイン（例えば、ＴＳＣＸファミリーのタンパク質、または
それらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログの、上で同定された保
存領域にまたがるドメイン）について特異的である抗体もまた、本明細書中で提
供される。
【０１７２】
抗ＴＳＣＸ抗体は、ＴＳＣＸタンパク質の局在化および／または定量化に関す
る当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサン
プル中のＴＳＣＸタンパク質のレベルを測定する際の使用のために、診断的方法
における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所
定の実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメ
ント、アナログまたはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む
）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として
利用される。
【０１７３】
抗ＴＳＣＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフ
ィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＴＳＣＸを単離するた
めに用いられ得る。抗ＴＳＣＸ抗体は、細胞からの天然のＴＳＣＸの精製、およ
び宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＴＳＣＸの精製を容易にし
得る。さらに、抗ＴＳＣＸ抗体は、（例えば、細胞溶解物または細胞上清におけ
る）ＴＳＣＸタンパク質を検出するために用いられ得、ＴＳＣＸタンパク質の発
現の量およびパターンを評価し得る。抗ＴＳＣＸ抗体は、例えば、所定の処置レ
ジメンの効力を決定するために、臨床試験手順の一部として、組織におけるタン
パク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、を検出可能
物質にその抗体を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にさ
れ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光
物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例
としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ
る；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオ
レセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の
例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラ
ーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質
の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１７４】
（ＴＳＣＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、
発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、
連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プ
ラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る直鎖状また
は環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターで
あり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る
。特定のベクターは、そのベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（
例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物
ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿
主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主
ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連
結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において
「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベ
クターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド
」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクター
であるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす
、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、お
よびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含む
ことを意図する。
【０１７５】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における本発明の核酸の発現に適切
な形態で、本発明の核酸を含む。これは、この組換え発現ベクターが、発現され
るべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づ
いて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター
において、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例え
ば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入され
る場合は、宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で
調節配列に連結されることを意味することを、意図する。用語「調節配列」は、
プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデ
ニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列としては、例え
ば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている
。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発
現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現
を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの
設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなど
のような要因に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは
、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコー
ドされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む
）（例えば、ＴＳＣＸタンパク質、ＴＳＣＸの変異形態、融合タンパク質など）
を産生し得る。
【０１７６】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＴＳＣＸ発現のために設計され得る。例えば、ＴＳＣＸは、Ｅ．ｃｏｌｉのよう
な細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞ま
たは哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；
ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉ
Ｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組
換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラ
ーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１７７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有する、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施される。融合
ベクターは、その中コードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミ
ノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には
、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させ
るため；（２）組換えタンパク質の可溶性を増加させること；および（３）アフ
ィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質
の精製の際を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質
分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、そし
て融合タンパク質の精製に続きその融合部分から組換えタンパク質を分離するこ
とを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配
列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。
代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ標的の
組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３
１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１７８】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒ
ａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ
（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙
げられる。
【０１７９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を損なった宿主
細菌中でそのタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ
、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ
ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のス
トラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優
先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配
列を変更することである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２０：２１１：１〜７、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８〜８５
、１１１〜１１３、１２０、１３０、１３２〜１３４および１３５１８を参照の
こと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によっ
て実行され得る。
【０１８０】
別の実施形態において、ＴＳＣＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐ
ＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９〜２
３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅ
ｌｌ ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）
Ｇｅｎｅ ５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（
ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げ
られる。
【０１８１】
あるいは、ＴＳＣＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞
中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発
現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍ
ｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）
およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９）が挙げられる。
【０１８２】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤ
Ｍ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２Ｐ
Ｃ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げ
られる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばし
ば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およ
びシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方の
ために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９の第１６章および第１７章を
参照のこと。
【０１８３】
別の実施形態において、その組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中
で優先的にその核酸の発現を指示し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを
、その核酸を発現するために使用する）。組織特異的調節エレメントは、当該分
野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、ア
ルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ １：２６８〜２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ
およびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５
）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍ
ｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：７２９〜７３３）および免疫グロブリン
の特定のプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９
〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：
７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメント
プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：５
４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（
例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公
開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた
含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４〜３７９）およびα−フェトプロ
テインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎ
ｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７〜５４６））。
【０１８４】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ
分子は、ＴＳＣＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（
そのＤＮＡ分子の転写によって）可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結
される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示す
る、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配
列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され
得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、もしくは
細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。そのアンチセンス発現
ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態で
あり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、そ
の活性は、そのベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセン
ス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒ
ａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔ
ｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１８５】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象細胞をいうのみでなく、そのよう
な細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが、理解される。特定の改変は、
変異または環境による影響のいずれかに起因して、次の世代にて生じ得るので、
このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本
明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０１８６】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ｔ
ＳＣＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞また
はＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知で
ある。
【０１８７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介
して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される
場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（
例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で認識されている種々の
技術をいうことを意図し、これらとしては、リン酸カルシウム共沈または塩化カ
ルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換または
トランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）および他の実験室マニュ
アルに見出され得る。
【０１８８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来Ｄ
ＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが公知である。これらの組込み体を同定お
よび選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコード
する遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の
選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメ
トトレキサート）に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコ
ードする核酸は、ＴＳＣＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に
導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で
安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば
、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１８９】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細
胞）は、ＴＳＣＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る
。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＴＳＣＸタンパク質
を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、
ＴＳＣＸタンパク質が産生されるように、適切な培地中で本発明の宿主細胞（こ
こに、ＴＳＣＸをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する
工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、その培地または宿
主細胞からＴＳＣＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０１９０】
（ＴＳＣＸ核酸を同定するためのキットおよび核酸コレクション）
別の局面において、本発明は、因子のＴＳＣＸ性（ＴＳＣＸｉｃｉｔｙ）の調
査のために役立つキットを提供する。このキットは、２つ以上のＴＳＣＸ配列を
検出する核酸を含み得る。好ましい実施形態において、このキットは、ＴＳＣＸ
核酸配列のうちの３個、４個、５個、６個、８個、１０個、１２個、１５個、２
０個、２５個、５０個、１００個または全てを検出する試薬を含む。
【０１９１】
本発明はまた、１つ以上のＴＳＣＸ応答性核酸配列を同定し得る、単離された
複数の配列を含む。このキットまたは複数の配列は、例えばＴＳＣＸ核酸配列に
相同な配列、または１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を特異的に同定し得る配列を含
み得る。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１：種々の組織における抗ロイコプロテアーゼの発現分析）
ＮＭＢの定量的分析（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ０４４７０；表１；ＴＳＣ
）を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））
を使用して種々の正常の細胞、細胞株および組織由来、および病理状態由来の細
胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有するマイクロタイタープレー
トを用いて評価した。ＲＴＱ ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。種々のサンプルの
コレクションを、プレート上に集め、そしてパネル１（正常な供給源および癌に
由来する細胞および細胞株を含有する）およびパネル２（正常な供給源および癌
に由来する組織（特に外科サンプルを含有する）と呼ぶ。
【０１９３】
最初に、ＲＮＡサンプルを、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチ
ンおよびＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたはｐｏ
ｌｙＡ＋約１ｎｇ）を、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商
標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ
（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号
Ｎ８０８−０２３４）およびランダムな６量体を用いて、ｃＤＮＡに転換した。
反応を、２０μｌ中で実施し、そして４８℃で３０分間インキュベートした。次
いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコルに従って、β−ａｃｔｉｎ
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３１０８８１Ｅ）およびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ
（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カ
タログ番号４３１０８８４Ｅ）ならびにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタロ
グ番号４３０４４４７）を使用する、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、
別のプレートに移した。反応を、２５μｌ中で以下のパラメーターを用いて実施
した：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間／６０℃で１分間
（４０サイクル）。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを越え
るサイクル）として対数目盛を使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も
低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分は、２のΔＣＴ乗とし
て表される。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そ
して１００を乗算することによって得る。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨについ
て得られた平均のＣＴ値を使用して、ＲＮＡサンプルを正規化した。最も高いＣ
Ｔ値をもたらすＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要とせず、一方、全ての他
のサンプルは、それらのβ−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従って、この
サンプルに対して相対的に希釈した。
【０１９４】
正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに転換し、そしてＯｎｅ Ｓｔｅｐ
ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを製造
業者の説明書に従って使用する、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。
プローブおよびプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓのＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ
ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ用バージョンＩ）
または同様のアルゴリズムに従って、入力として標的配列を使用して、それぞれ
のアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そし
て以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝
２５０ｎＭ、プライマーの融解温度（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの
最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さな
い、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならない、ア
ンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよび
プライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔ
Ｘ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、カップリングしていない色素を除
去するためにＨＰＬＣによって二重精製し、そしてプローブのそれぞれ５’およ
び３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認す
るために質量分析法によって評価した。それらの最終濃度は：順方向および逆方
向プライマーについてはそれぞれ９００ｎＭ、そしてプローブは２００ｎＭであ
った。
【０１９５】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルの
ＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェ
ルにスポットした。ＰＣＲ溶液は、２つのプローブ（標的クローンに特異的なプ
ローブおよび標的プローブと多重化する別の遺伝子特異的プローブ）を含み、こ
れを１×ＴａｑＭａｎＴＭ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ ７７００について）を使用して、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（
ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕを１：１：１：２の比率で）、０．２５Ｕ／ｍｌ Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ
ＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ 逆転写酵素で設定した。
逆転写を、４８℃で３０分間、続いて以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを実施
した：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サ
イクル。
【０１９６】
パネル１の結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ＝小細胞改変株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０１９７】
（パネル２）
パネル２のプレートは、一般的には、２つのコントロールのウェルおよび９４
個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との親密に共同している
外科医によって入手されたヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫
瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「ぴったり沿った境界（ｍａｔｃ
ｈｅｄ ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常な隣接組織と呼び、そして
以下の結果において「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「ぴったり沿った境
界」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤ
ＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階
の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もと
もとの外科の病理報告を含み、この報告は、患者の臨床段階に関する情報を提供
する。これらのぴったり沿った境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣
接している）組織（表４においては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）か
ら採取する。さらに、ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または
突然死の被害者（事故など）について行った検死により種々のヒト組織から得た
。これらの組織は、疾患を有さないことが確認され、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０１９８】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針としての２８Ｓおよび１８
ＳリボソームＲＮＡの染色強度比（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、お
よび分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガ
ロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を制御した。サンプルを、単一の
エキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセッ
トを使用して、逆転写酵素の非存在下でＲＴＱ ＰＣＲ反応を実行することによ
り、ゲノムＤＮＡの混入に対して制御した。
【０１９９】
ＮＭＢのＴａｑＭａｎＴＭ発現プロフィールを、以下に示されるような特定の
遺伝子プローブおよびプライマーセット（Ａｇ ８１７）を使用して生成した：
【０２００】
【化２３】
表２に示されるこの結果は、４１個の正常ヒト組織および５５個のヒト癌細胞
株に関連し、そして黒色腫細胞株におけるＮＭＢの高い発現および乳癌細胞株Ｍ
ＤＡ−Ｎにおける過剰発現を示す。表３に示される結果は、さらなる腫瘍組織に
関連し、その多くの腫瘍組織が、サンプルを入手した執刀外科医により規定され
たように、正常な隣接組織（ＮＡＴ）とぴったりである。このことにより、ＮＭ
Ｂが、正常な腎臓またはＮＡＴのいずれかと比較して９／９の腎腫瘍で過剰発現
されることが明らかにされる。この分析は、ＮＭＢがまた、ＮＡＴと比較された
いくつかの肺癌腫組織、およびＮＡＴと比較された２つの黒色腫転移において過
剰発現されるというＮＭＢの発現を最初に同定したＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ
の結果を確証する。
【０２０１】
ＮＣＩのＣＧＡＰ Ｓａｇｅ分析は、ＮＭＢが、パネル１のＴａｑＭａｎ分析
と一致して、いくつかの神経膠腫（Ｈ３９２、プールしたＧＢＭ、ＧＢＭＨ１１
１０）、および１つの悪性胸部腫瘍（ＳＫＢＲ３）中で発現されることを示す。
「ボディーマップ」と呼ばれるＥＳＴの発現についてのＮＣＩデータは、ＮＭＢ
がシュワン細胞、腺癌腫およびｓ．細胞癌腫において発現されることを明らかに
する。
【０２０２】
ＮＭＢの遺伝子発現プロフィールおよびｐＭＥＬ１７とのＮＭＢの相同性に基
づいて、腎臓細胞癌腫、肺癌腫、黒色腫およびＣＮＳ癌を含むヒト腫瘍の部分集
合（ｓｕｂｓｅｔ）について、モノクローナル抗体を使用するＮＭＢの成功した
標的化は、腫瘍の増殖、マトリクスの浸潤および転移の拡がりに阻害効果を有す
ることが予想される。さらに、ＮＭＢの標的化は、ＴＳＣ疾患に治療的効果を有
する。さらに、ＮＭＢの潜在的な酵素活性を考慮すると、ＮＭＢは、低分子薬物
をスクリーニングするための標的として使用され得る。要約すれば、これらの結
果は、ＴＳＣの処置のための治療的標的としてのＮＭＢの関連性が、ＴＳＣに影
響されるいくつかの組織におけるＮＭＢの発現／過剰発現によって増強されるこ
とを示す。
【０２０３】
【表２】
【０２０４】
【表３】
（実施例２：ＣＹＲ６１の治療的標的化）
ＣＹＲ６１の遺伝子発現プロフィールに基づいて、腎臓細胞癌腫、肺癌腫、黒
色腫およびＣＮＳ癌を含むヒト腫瘍の部分集合について、モノクローナル抗体を
使用するＣＹＲ６１の成功した標的化は腫瘍の増殖、マトリクスの浸潤および転
移の拡がりに阻害効果を有することが予想される。さらに、ＣＹＲ６１の標的化
は、ＴＳＣ疾患に治療的効果を有する。
【０２０５】
（実施例３：ＮＥＴ−７の治療的標的化）
ＮＥＴ−７は、乳癌細胞株によって過剰発現され、そしてＮＥＴ−７は、ＥＲ
陽性細胞株ＭＣＦ７のエストラジオール処置によって調節される。ＮＥＴ−７の
遺伝子発現プロフィールに基づいて、ヒト腫瘍（特に胸部腫瘍）の部分集合につ
いて、モノクローナル抗体を使用するＮＥＴ−７の成功した標的化は、腫瘍の増
殖、マトリクスの浸潤および転移の拡がりに阻害効果を有することが予想される
。さらに、ＮＥＴ−７の標的化は、ＴＳＣ疾患のアドレノメデュリン前駆体（お
よびレセプター活性改変プロテイン１）に治療的効果を有する。
【０２０６】
ＮＥＴ−７は、いくつかの脈管系において、強力かつ持続性の血管拡張作用を
有する。アドレノメデュリンに加えて、別の低血圧性ペプチド、プロアドレノメ
デュリン由来ペプチド（ＰＡＭＰ）がまた、アドレノメデュリン前駆体からプロ
セスされることが見い出された。ＰＡＭＰは、末梢交感神経終末で神経伝達を阻
害するが、アドレノメデュリンは血管平滑筋を直接的に拡張する。アドレノメデ
ュリンは、高血圧、腎不全および鬱血性心不全の病原に関与し得る。レセプター
活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）は、カルシトニンレセプター様レセプター（Ｃ
ＲＬＲ）を細胞表面へ輸送する１回膜貫通タンパク質である。ＲＡＭＰ１に輸送
されたＣＲＬＲは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターで
ある。ＲＡＭＰ１は、ＮＳＣで下方制御される。その活性のため、ＴＳＣ患者に
よるアドレノメデュリン前駆体の過剰発現は、いくつかのＴＳＣを説明し得る。
【０２０７】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、前述の説明は、例示
を意図するものであり、そして添付される特許請求の範囲の範囲によって規定さ
れる本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の局面、利点、
および改変は、上記の特許請求の範囲内にある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）関連障害を検出および処置する方法に関
する。
【背景技術】
【０００２】
母斑症、または「神経皮膚障害」は、病気に冒された個体における複数の器官
系を冒す表現型を示す３つのメンデルの常染色体優性遺伝疾患の群である。神経
皮膚障害としては、例えば、神経線維腫症（ＮＦ）、結節硬化症（ＴＳＣ）、お
よびフォン・ヒッペル−リンダウ（ＶＨＬ）が挙げられる。これらの疾患は、全
て神経学的症状および皮膚科学的症状の両方を生じる。
【０００３】
結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）は、常染色体優性腫瘍抑制遺伝子症候群であり、こ
れは、複数の器官系における特有の良性腫瘍（過誤腫）の発達および先天異常（
過誤組織）によって特徴づけられる。脳、皮膚、心臓および腎臓が、一般に病気
に冒される。皮膚および腎臓において生じるＴＳＣ病変は、平滑筋細胞、内皮細
胞、脂肪細胞、および巨大神経出現細胞を含む。この複雑な細胞の構築物にもか
かわらず、ＴＳＣにおける腎臓および他の病変は、クローン性および異型接合性
（ＬＯＨ）損失の分析に基づいて、事実上のクローン性を示す。脳において、Ｔ
ＳＣは、心室嚢に並ぶ上衣下結節および癲癇性放出についての病巣として働く皮
質下の過誤腫の両方を生じる。ＴＳＣは、人生の１年目において自然に消失する
胎児／新生児における心臓の横紋筋腫を生じる。ＴＳＣはまた、腎血管造影、肺
の症候群、および他の器官系における症状に関連する。さらに、ＴＳＣはまた、
複数の皮膚科学的特徴（例えば、過少メラニンの斑、顔の血管線維腫、粒起革様
斑、および爪の線維腫）に関連する。
【０００４】
この疾患の分子の性質をより理解することは、ＴＳＣ患者のみでなく、類似の
病理によって冒されている非ＴＳＣ患者においてもＴＳＣ複合体に関連する病理
を処置する新しい治療手段を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下を提供する、
（項目１） 被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断または決定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程、
（ｂ）該試験細胞集団中の１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｃ）該試験細胞集団中の該核酸配列の発現を、結節性硬化症複合体関連障害に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照プロフィール中の核酸配列の発現と比較する工程；ならびに
（ｄ）該試験細胞集団および該参照プロフィール中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程、
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受性を診断または決定する、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記被験体がヒトである、方法。
（項目３） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記結節性硬化症複合体関連障害が、過誤腫、過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫、メラニン減少斑、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫からなる群から選択される、方法。
（項目４） 項目１に記載の方法であって、ここで、該方法が５つ以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目５） 項目１に記載の方法であって、該方法が、２０以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目６） 項目１に記載の方法であって、該方法が、２５以上の前記核酸配列の発現を比較する工程を包含する、方法。
（項目７） 被験体中の結節性硬化症複合体関連障害を処置する方法であって、該方法が、ＴＳＣ−１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸の発現または活性を調節する因子を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目８） 結節性硬化症複合体関連障害のための候補治療因子を同定する方法であって、以下；
（ａ）ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団と試験因子を接触させる工程；
（ｃ）該試験細胞集団において１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｄ）該試験細胞集団における遺伝子の発現と、結節性硬化状態が既知である少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
それによって、結節性硬化症複合体関連障害のための治療因子を同定する、方法。
（項目９） 選択された被験体において適切な結節性硬化症複合体関連障害の処置に適する個別化された治療因子を同定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団と該治療因子を接触させる工程；
（ｃ）該試験細胞集団において１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｄ）結節性硬化関連障害の状態が既知の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における核酸配列の発現と、該試験細胞集団における該核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
これによって、該被験体に適切な治療因子を同定する、方法。
（項目１０） 被験体において結節性硬化症複合体関連障害の処置の有効性を評価する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞
集団を提供する工程；
（ｂ）該試験細胞集団において1つ以上の該核酸配列の発現を検出する工程；
（ｃ）該試験細胞集団における該核酸配列の発現と、結節性硬化症複合体関連障害に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照細胞集団における該核酸配列の発現を比較する工程；ならびに
（ｅ）該試験細胞集団および参照細胞集団中に該核酸配列の発現レベルの差異が存在する場合、その差異を同定する工程；
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において結節性硬化症複合体関連障害の処理の有効性を評価する、方法。
（項目１１） ＴＳＣ１〜８遺伝子、１０〜１２遺伝子、１５〜２５遺伝子またはそれらの相補鎖からなる群から選択される核酸配列を含有する、単離された核酸。
（項目１２） 項目１１に記載の核酸を含む、ベクター。
（項目１３） 項目１２に記載のベクターを含む、細胞。
（項目１４） 項目１１に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
（項目１５） 項目１１に記載の核酸によってコードされる、ポリペプ
チド。
（項目１６） 項目１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
（項目１７） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される２つ以上の前記核酸配列を検出する、キット。
（項目１８） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸を検出する、アレイ。
（項目１９） ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２からなる群から選択される１つ以上の核酸を含む、複数の核酸。
（発明の要旨）
本発明は、Ｔｓｃ２＋／−ヘテロ接合および野生型同胞マウス由来の細胞にお
いて見出される発現パターンと比較した、Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニ
ックマウス由来の細胞における複数の核酸配列の発現パターンにおける変化の発
見に一部基づく。これらの異なって発現される核酸は、以前には記載されていな
い配列および、以前に示されているが、現在までＴＳＣ調節物として同定されて
いない核酸配列を含む。
【０００６】
種々の局面において、本発明は、結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）関連障害に対する
感受性を診断または検出する方法、およびこれらの障害を処置する方法を含む。
例えば、１つの局面において、本発明は、１つ以上のＴＳＣ調節核酸配列を発現
し得る１つ以上の細胞を含む試験細胞集団を提供することによって、結節硬化複
合症に関連する障害に対する感受性を診断し決定する方法を提供する。次いで、
１つ以上の配列（ＴＳＣＸ配列と呼ばれる）の発現のレベルは、参照の細胞集団
における対応する核酸の発現のレベルと比較される。参照の細胞集団は、その結
節性硬化症複合体関連障害の状態が既知である（すなわち、参照の細胞が、結節硬化
症関連障害を有するか有さないかが既知である）細胞を含む。
【０００７】
本発明の別の局面は、結節性硬化症複合体関連障害を処置するための治療剤を同定
する方法を含む。この方法は、１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を発現し得る細胞を
含む試験細胞集団を被験体から提供する工程、試験細胞集団を治療剤と接触させ
る工程、および参照の細胞集団における核酸配列の発現に対して試験細胞集団に
おける核酸配列の発現を比較する工程を含む。
【０００８】
本発明のさらなる局面は、特定の被験体に適切な個別化された治療剤を選択す
る方法を含む。この方法は、１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を発現し得る細胞を含
む試験細胞集団を被験体から提供する工程、試験細胞集団を治療剤と接触させる
工程、および参照の細胞集団における核酸配列の発現に対して試験細胞集団にお
ける核酸配列の発現を比較する工程を含む。
【０００９】
結節性硬化症複合体で調節された、新規の核酸およびそのコードされるポリペプチ
ドもまた、提供される。
【００１０】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用
語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有
する。本明細書中に記載された方法および材料に類似または同等の方法および材
料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料
は、以下に記載される。本明細書中で述べられた全ての刊行物、特許出願、特許
および他の参考文献は、その全体を参考として援用される。矛盾する場合、定義
を含めて本発明の明細書が統制する。さらに、材料、方法および実施例は、例示
のみで、限定することを意図されない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、Ｔｓｃ２＋／−ヘテロ接合および野生型同胞マウス由来の細胞にお
いて見出される発現パターンと比較した、Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニ
ックマウス由来の細胞における複数の核酸配列の発現パターンにおける変化の発
見に一部基づく。
【００１３】
発現パターンにおける変化は、３つの遺伝子型（ｉ．ｅ．）のマウス由来の１
０〜１１日の胎児から確立された神経幹細胞（ＮＳＣ）およびマウス胎児の線維
芽細胞株（ＭＥＦ）の細胞株のＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析（米国特許第５
，８７１，６９７号；Ｓｈｉｍｋｅｔｓら、１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７；１９８〜８０３、本明細書中でその全体を参考とし
て援用される）によって同定された。
【００１４】
配列分析の概略は、表１に示される。本明細書中で同定された１４２の単一核
酸配列は、本明細書中でＴＳＣ１−１４２核酸もしくはＴＳＣ１−１４２ポリペ
プチド、またはＴＳＣＸ核酸もしくはＴＳＣＸポリペプチドと呼ばれる。ＴＳＣ
１−１４２遺伝子フラグメントの差異発現を、Ｓｈｉｍｋｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：１９８〜８０３に記載されるような非標
識オリゴヌクレオチド競合アッセイを用いて確認した。
【００１５】
両方の細胞株において異なって発現される遺伝子を比較することによって、Ｔ
ＳＣ−／−腫瘍形成における共通の機構の理解を確認し得た。その一方で、ＮＳ
Ｃ細胞株において異なって発現される遺伝子を比較することによって、ＴＳＣ腫
瘍の元（すなわち、子孫）である細胞において発現される遺伝子を同定した。Ｔ
ＳＣ表現型に基づいて、ＴＳＣ細胞において上方制御される遺伝子は、癌の進行
、詳細には、腎癌および肺癌において役割を有し得る。
【００１６】
２６の配列（ＴＳＣ：１−２６）は、公共のデータベースにおいて見出される
配列に対する配列同一性が、推定の相同性を示唆する新規マウス遺伝子を表す。
【００１７】
１１６の他の同定された配列は、既に記載されている。いくつかの新規の配列
（すなわち、ＴＳＣ：１−２６）について、クローン化された配列が、クローン
化された細胞に実質的に同一の配列を含む１つ以上のさらなる配列フラグメント
（例えば、ＥＳＴまたはコンティグ）とともに提供される。クローン化されたフ
ラグメントおよびさらなるフラグメントから組立てられる複合配列を含むコンセ
ンサス配列もまた提供される。所定のＴＳＣ配列について、その発現が、本明細
書中に記載される方法において用いられ得る任意の関連する核酸配列を用いて測
定され得る。既に記載された配列についてデータベース登録番号が提供される。
この情報は、当業者が、ＴＳＣ核酸配列の発現を検出および測定するために必要
な情報を推定することを可能にする。
【００１８】
ＴＳＣ調節遺伝子の下位集合は、さらに以下の３つのクラスに細分化され得る
：
Ａ．Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニックマウス由来の細胞において上方
制御される分泌タンパク質および／または膜結合タンパク質。
【００１９】
この分類におけるタンパク質としては、血漿リン脂質移動タンパク質、リシル
ヒドロキシラーゼアイソフォーム２、ＤＶＳ２７関連タンパク質［ＡＢ０２４５
１８］、カテプシンＬ、テネイシン、ＡＤＡＭＴＳ１、メタロプロテイナーゼ−
２の組織インヒビター、インテグリンβ−５、トロンボスポンジン２（ＴＨＢＳ
２）、アスパルチルプロテアーゼ１、Ｃｙｒ６１、テトラスパンＮＥＴ−７、シ
ステインリッチ糖タンパク質ＳＰＡＲＣ、神経のペントラキシンレセプター、Ｉ
ＴＭ２Ｂ−Ｅ２５Ｂタンパク質外皮膜タンパク質２Ｂ、膜貫通糖タンパク質ＮＭ
Ｂ、およびジンクフィンガータンパク質が挙げられる。
【００２０】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための抗体スク
リーニングおよび抗体結合治療のための潜在的な候補である。
【００２１】
Ｂ．Ｔｓｃ２ノックアウトトランスジェニックマウス由来の細胞において下方
制御される分泌タンパク質および／または膜結合タンパク質。
【００２２】
この分類におけるタンパク質としては、増殖／分化因子１（ＧＤＦ−１）、細
胞外マトリックス関連タンパク質（Ｓｃ１）、膜２型マトリックスメタロプロテ
イナーゼおよびトロンボスポンジン１マウスが挙げられる。
【００２３】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための潜在的な
候補である。
【００２４】
Ｃ．酵素活性を有するタンパク質
この分類におけるタンパク質としては、増殖因子を誘導する前初期遺伝子３Ｃ
Ｈ１３４／ｅｒｐ、ガラクトキナーゼ１、血清誘導キナーゼ（ＳＮＫ）、ＰＡＦ
アセチルヒドロラーゼアスパルチルプロテアーゼ１、リシルヒドロキシラーゼア
イソフォーム２、ペルオキシソーマルＤ２、およびＤ４−ジエノイル−ＣｏＡレ
ダクターゼ（Ｐｄｃｒ）が挙げられる。
【００２５】
これらのタンパク質は、ＴＳＣおよびＴＳＣ関連疾患の処置のための低分子ス
クリーニングおよび低分子薬剤治療についての潜在的な候補である。
【００２６】
本明細書中で考察されるＴＳＣ調節核酸としては、以下が挙げられる：
【００２７】
【表１】
解説＝
Ｎｅｗ＝デノボの発現
太字＝遺伝子がその仕事において確認された
＋１．０＝差異がない
Ｘ＝毒性がない
Ｑ＝プロセス中
ｐ＝部分的な毒性
Ｏ＝バンドなし
発現が差示的に調節される核酸配列の更なる考察を以後に続ける。
【００２８】
（ＴＳＣ１）
ＴＳＣ１は、新規の２５２０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００２９】
【化１】
（ＴＳＣ２）
ＴＳＣ２は、新規の１８６３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３０】
【化２】
（ＴＳＣ３）
ＴＳＣ３は、新規の７５０ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３１】
【化３】
（ＴＳＣ４）
ＴＳＣ４は、新規の２８１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３２】
【化４】
（ＴＳＣ５）
ＴＳＣ５は、新規の１５６８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３３】
【化５】
（ＴＳＣ６）
ＴＳＣ６は、新規の３００ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３４】
【化６】
（ＴＳＣ７）
ＴＳＣ７は、新規の９６５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３５】
【化７】
（ＴＳＣ８）
ＴＳＣ８は、新規の４０８ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３６】
【化８】
（ＴＳＣ１０）
ＴＳＣ１０は、新規の３５４ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３７】
【化９】
（ＴＳＣ１１）
ＴＳＣ１１は、新規の９５５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３８】
【化１０】
（ＴＳＣ１２）
ＴＳＣ１２は、新規の１１１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００３９】
【化１１】
（ＴＳＣ１５）
ＴＳＣ１５は、新規の５９４ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４０】
【化１２】
（ＴＳＣ１６）
ＴＳＣ１６は、新規の７１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４１】
【化１３】
（ＴＳＣ１７）
ＴＳＣ１７は、新規の３０６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４２】
【化１４】
（ＴＳＣ１８）
ＴＳＣ１８は、新規の６６ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４３】
【化１５】
（ＴＳＣ１９）
ＴＳＣ１９は、新規の１６１３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４４】
【化１６】
（ＴＳＣ２０）
ＴＳＣ２０は、新規の２２４５ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は
、以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４５】
【化１７】
（ＴＳＣ２１）
ＴＳＣ２１は、新規の１７１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４６】
【化１８】
（ＴＳＣ２２）
ＴＳＣ２２は、新規の４９１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４７】
【化１９】
（ＴＳＣ２３）
ＴＳＣ２３は、新規の６５９ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４８】
【化２０】
（ＴＳＣ２４）
ＴＳＣ２４は、新規の３４１ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、
以下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００４９】
【化２１】
（ＴＳＣ２５）
ＴＳＣ２５は、新規の５３ｂｐの遺伝子フラグメントである。この核酸は、以
下の配列を有するクローン化フラグメントにおいて最初に同定された：
【００５０】
【化２２】
（一般方法）
ＴＳＣＸ核酸およびコードされたポリペプチドは、上記に提供する情報を用い
て同定され得る。いくつかの実施形態において、ＴＳＣＸ核酸およびＴＳＣＸポ
リペプチドは、それぞれのＴＳＣＸポリペプチドについて開示された種々の配列
（配列番号によって参照される）を含む核酸またはポリペプチドに対応する。
【００５１】
その種々の局面ならびに実施形態において、本発明は、配列ＴＳＣ１〜１４２
の１つ以上を発現し得る少なくとも１つの細胞を含む試験細胞集団を提供するこ
とを含む。「発現し得る」によって、その遺伝子が、その細胞中にインタクトな
形態で存在し、そして発現され得ることが意味される。次いで、ＴＳＣＸ配列の
１つ、いくつか、または全ての発現は、存在する場合、検出され、そして好まし
くは、測定される。既知の配列についてデータベース登録によって提供される配
列情報、または新規に記載された配列についての配列情報を用いて、ＴＳＣＸ配
列の発現は、当業者に周知の技術を使用して、（存在する場合）検出され、そし
て測定され得る。例えば、ＴＳＣＸ配列に対応する配列データベース登録内また
は本明細書中に開示された配列内の配列は、例えば、ノーザンブロットハイブリ
ダイゼーション解析または、特定の核酸配列を特異的に、そして好ましくは、定
量的に増幅する方法において、ＴＳＣＸ ＲＮＡ配列を検出するためのプローブ
を構築するために使用され得る。別の例としては、この配列は、例えば、増幅ベ
ースの検出方法（例えば、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応）において、Ｔ
ＳＣＸ配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築するために使用され得る
。遺伝子発現における変更が遺伝子の増幅または欠失に関連する場合、試験集団
と参照集団との配列の比較は、試験細胞集団および参照細胞集団における試験さ
れたＤＮＡ配列の相対的な量を比較することによってなされ得る。
【００５２】
発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち、本明細書中に記載の遺伝子産物
によってコードされたポリペプチドのレベルを測定することによって、測定され
得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そして、例えば、遺伝子によ
ってコードされるタンパク質に対する抗体に基づく免疫アッセイを含む。
【００５３】
次いで、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ配列の発現レベルは、参照のプロフィ
ール由来の１つ以上の細胞におけるその配列の発現レベルと比較される。細胞の
試験集団およびコントロール集団での配列の発現は、核酸配列の発現を比較する
ための、当該分野で認識される方法のいずれかを用いて比較され得る。例えば、
発現は、米国特許第５，８７１，６９７号およびＳｈｉｍｋｅｔｓら、Ｎａｔ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７９８−８０３に記載されるように、ＧＥＮＥＣ
ＡＬＬＩＮＧ（登録商標）方法を用いて比較され得る。種々の実施形態において
、ＴＳＣ１〜１４２によって表される配列の２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１５、２０、２５、３５、４０、５０、１００、１５０または全ての発現
は、測定される。所望される場合、これらの配列の発現は、発現が本明細書中に
記載されるパラメーターまたは状態の１つに従って変化されると知られている他
の配列と一緒に測定され得る。
【００５４】
参照プロフィールは、単一の参照集団または複数個の発現パターン由来の発現
パターンである。この参照プロフィールは、本明細書中に記載される状態の１つ
（例えば、結節性硬化症複合体関連障害）が知られている、事前に試験された細胞由
来の発現パターンのデータベースであり得る。結節性硬化症複合体関連障害としては
、例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮膚、心臓または腎臓）での過誤腫また
は過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫、メラニン減少斑（ｈｙｐｏｍｅｌａ
ｎｏｔｉｃ ｍａｃｕｌｅｓ）、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体（ｕ
ｎｇｕｌａ）線維腫が挙げられる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試験細胞は、結節性硬化症複合体関連障害を含むと
知れているか、またはこれを有することが疑われる被検体由来の細胞サンプルに
含まれる。他の実施形態において、その細胞サンプルは、原発性腫瘍（例えば、
腎癌腫）を含むと知られているか、または含むことが疑われる領域由来の被検体
由来である。さらなる実施形態において、その細胞サンプルは、原発性腫瘍の転
移を含むと知られているか、または含むことが疑われる領域由来の被検体由来で
ある。
【００５６】
好ましくは、参照プロフィールにおける細胞は、試験細胞とできるだけ同じ組
織型（例えば、脳組織、皮膚組織、心組織または腎組織）由来である。いくつか
の実施形態において、コントロール細胞は、試験細胞と同じ被検体由来（例えば
、試験細胞の起源の領域に近接する領域由来）である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、試験細胞集団は、複数の参照プロフィールと比
較される。複数の参照プロフィールそれぞれは、既知のパラメーターまたは状態
と異なり得る。従って、試験細胞集団は、結節硬化関連障害を有することが既知
の第１の参照プロフィール、および、結節硬化関連障害を有していないことが既
知の第２の参照集団と比較され得る。
【００５８】
種々の実施形態において、表１に列挙されるような、別個の遺伝子プロフィー
ルで発現される遺伝子をコードする１つ以上の配列の発現は、比較される。これ
らの遺伝子プロフィールとしては、例えば、「ＭＥＦおよびＮＳＣ−／−の保存
された差示的発現」（例えば、ＴＳＣ１〜９）、「ＭＥＦおよびＮＳＣ−／−と
反対の差示的発現」（ＴＳＣ１０〜１８）、「ＮＳＣのみ」（ＴＳＣ１９〜４４
）、および「ＭＥＦのみ」（ＴＳＣ４５〜５７）が挙げられる。いくつかの実施
形態において、２つ以上の遺伝子プロフィールのメンバーの発現が比較される。
【００５９】
参照プロフィールとの試験細胞集団における遺伝子発現プロフィールの比較が
、測定された状態の存在または程度を示すか示さないかは、参照プロフィールと
の比較に依存する。例えば、そのプロフィールが結節硬化関連障害を有する細胞
からなる場合、試験細胞集団および参照プロフィールでの同様の遺伝子発現レベ
ルは、試験細胞集団での結節硬化関連障害の存在を示す。逆に、参照プロフィー
ルが結節硬化関連障害を有しない細胞からなる場合、試験細胞集団と参照プロフ
ィールとの間の同様の遺伝子発現プロフィールは、試験細胞集団において結節硬
化関連障害が存在しないことを示す。
【００６０】
種々の実施形態において、試験細胞集団におけるこのＴＳＣＸ配列は、その発
現レベルが、参照プロフィールにおけるＴＳＣＸ転写物のレベルに対し、２．０
倍、１．５倍、または１．０倍の因数内で変化する場合、その発現レベルにおい
て、抗ロイコプロテアーゼ配列の発現レベルと匹敵するとみなされる。種々の実
施形態において、ＴＳＣ配列の発現レベルが、参照細胞集団での対応する抗ロイ
コプロテアーゼ配列の発現レベルの１．０倍、１．５倍、２．０倍、またはそれ
以上の倍数で参照細胞集団と異なる場合、その試験細胞集団におけるＴＳＣ配列
は、発現レベルが変化したとみなされ得る。
【００６１】
所望される場合、試験細胞集団と参照プロフィールとの間の差示的に発現され
た配列の比較は、発現が、測定されるパラメーターまたは状態に依存しないコン
トロール核酸に関して実施され得る。試験核酸および参照核酸におけるコントロ
ール核酸の発現レベルは、比較される集団におけるシグナルのレベルを規準化す
るために使用され得る。
【００６２】
試験細胞集団は、任意の数の細胞、すなわち１つ以上の細胞であり得、そして
、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供され得る。
【００６３】
他の実施形態において、試験細胞集団は、２つ以上の亜集団に分割され得る。
この亜集団は、できるだけ同一の亜集団を作成するように第１の細胞集団を分割
することにより作成され得る。これは、例えば、インビトロまたはエクスビボで
のスクリーニング方法において適切である。いくつかの実施形態において、種々
の亜集団は、コントロール薬剤および／または試験薬剤、複数の試験薬剤、ある
いは、例えば、一緒に投与される１つまたは複数の試験薬剤の異なる投薬量、ま
たは種々の組み合わせに曝され得る。
【００６４】
被検体は、好ましくは、哺乳動物である。この哺乳動物は、例えば、ヒト、非
ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得る。
【００６５】
（結節性硬化症複合体関連障害の診断）
本発明は、結節性硬化症複合体関連障害（例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮
膚、心臓または腎臓）での過誤腫または過誤組織、腎癌腫、悪性の血管筋脂肪腫
、メラニン減少斑、顔面血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫）の感受性
を診断または決定する方法を提供する。結節性硬化症複合体関連障害は、結節硬化複
合症関連障害を有することが疑われる被検体からの細胞の試験集団由来のＴＳＣ
Ｘ核酸をコードする核酸の発現を試験することによって診断される。この細胞集
団は、脳の細胞を含み得るか、または代替的に、目、皮膚、心臓または腎臓の細
胞を含み得る。
【００６６】
ＴＳＣＸ核酸の発現は、試験細胞で測定され、そして参照プロフィールにおけ
るこの配列の発現と比較される。参照プロフィールは、ＴＳＣ障害ポジティブ参
照プロフィールであり得る。「ＴＳＣ障害ポジティブ参照プロフィール」によっ
て、参照プロフィールが、結節性硬化症複合体関連障害を有する組織由来の細胞を含
むことが意味される。あるいは、この参照プロフィールは、ＴＳＣ障害ネガティ
ブ参照プロフィールであり得る。「ＴＳＣネガティブ参照プロフィール」によっ
て、参照プロフィールが、結節性硬化症複合体関連障害を有さない組織由来の細胞を
含むことが意味される。
【００６７】
参照プロフィールが、ＴＳＣ障害ポジティブ参照プロフィールである場合、試
験集団と参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の発現の類似性は、被検体
における結節性硬化症複合体関連障害の存在を示す。逆に、試験集団とＴＳＣ障害ポ
ジティブ参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の試験細胞集団中の発現に
おける差異は、被検体において結節性硬化症複合体関連障害が存在しないことを示す
。
【００６８】
参照プロフィールがＴＳＣ障害ネガティブ参照プロフィールである場合、試験
細胞集団とＴＳＣ障害ネガティブ参照プロフィールとの間の発現パターンでの差
異は、結節性硬化症複合体関連障害の存在を示す。逆に、試験集団とＴＳＣ障害ネガ
ティブ参照プロフィールとにおけるＴＳＣＸ配列間の発現の類似性は、被検体に
おいて結節性硬化症複合体関連障害が存在しないことを示す。
【００６９】
（結節性硬化症複合体に関連する障害を処置する方法）
本発明は、被験体における結節性硬化症複合体関連の障害を処置するための方法を
提供し、この方法は、１以上のＴＳＣＸ核酸またはポリペプチドの発現を調節す
る化合物を、それを必要とする被験体に投与することによる。投与は、結節性硬化症
複合体関連の障害の危険性のある（または結節性硬化症複合体関連の障害に対して感
受性の）被験体に対して予防的または治療的であり得る。結節性硬化症複合体関連の
障害は、例えば、複数の器官系（例えば、脳、皮膚、心臓もしくは腎臓）におけ
る過誤腫または過誤組織、腎癌腫、悪性血管筋脂肪腫、メラニン減少斑、顔面（
ｆａｃｉｌａ）血管線維腫、粒起革様斑および蹄状体線維腫であり得る。
【００７０】
治療方法は、罹患細胞が由来する組織型由来の正常細胞に対して、罹患細胞に
おいて、ＴＳＣＸ核酸の発現もしくは機能を減少または阻害する工程を包含する
。これらの方法において、被験体は、有効量の化合物で処置され、この化合物は
、被験体においてＴＳＣＸ核酸またはポリペプチドの量を減少させる。投与は、
全身的または局所的（例えば、被験体の罹患細胞のごく近傍）であり得る。発現
は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって阻害され得る。例えば
、発現は、被験体に、ＴＳＣＸの発現を阻害または拮抗する核酸を投与すること
によって阻害され得る。１つの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが投与されて、ＴＳＣＸ核酸の発現を破壊し得る。
【００７１】
あるいは、ＴＳＣＸの機能は、ＴＳＣＸ遺伝子産物に結合するか、さもなけれ
ばＴＳＣＸ遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって、阻害さ
れ得る。この化合物は、例えば、ＴＳＣＸ核酸によってコードされるポリペプチ
ドに対する抗体であり得る。
【００７２】
これらの調節方法は、エキソビボまたはインビトロで（例えば、この薬剤と共
に細胞を培養することによって）実行され得るか、あるいはインビボで（例えば
、この薬剤を被験体に投与することによって）実行され得る。このように、本発
明は、ＴＳＣＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性によって特徴
付けられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実
施形態において、この方法は、薬剤（例えば、本明細書中に記載されるスクリー
ニングアッセイによって同定される薬剤）、あるいはＴＳＣＸ核酸またはポリペ
プチドの発現または活性を調節（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギ
ュレート）する薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態にお
いて、この方法は、タンパク質、またはタンパク質もしくは核酸分子の組み合わ
せ、またはＴＳＣＸ核酸の異常な発現もしくは活性を補償する治療剤としての核
酸分子の組み合わせを投与する工程を包含する。
【００７３】
利用され得る治療剤としては、例えば以下が挙げられる：（ｉ）過剰発現配列
のポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ
；（ｉｉ）過剰発現配列に対する抗体；（ｉｉｉ）アンチセンス核酸もしくは「
機能不全」（すなわち、１以上の過剰発現配列もしくは過少発現配列のコード配
列内の異種挿入物に起因する）核酸；あるいは（ｖ）モジュレータ（すなわち、
過剰発現ポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変更するインヒ
ビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。機能不全アンチセンス分子は、相
同組換えによってポリペプチドの内因性機能を「ノックアウト」するために利用
される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２
９２ １９８９を参照のこと）。増加または減少したレベルは、患者の組織サン
プルを（例えば、生検組織から）獲得し、そしてインビトロでＲＮＡもしくはペ
プチドのレベル、発現したペプチド（または発現が変更された遺伝子のｍＲＮＡ
）の構造および／または活性についてアッセイすることによって、ペプチドおよ
び／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。当該分野で周
知の方法としては、イムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の免疫沈降、免
疫細胞化学など）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイ
ゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチ
ュハイブリダイゼーションなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
予防剤の投与は、異常な遺伝子発現に特徴的な症状の出現の前に生じ得、その
結果、疾患または障害は、予防されるか、あるいは進行が遅らされる。検出され
る異常な発現の型に依存して、薬剤は、被験体を処置するために使用され得る。
適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定
され得る。
【００７５】
（結節硬化症関連障害を処置または予防するための、候補治療剤を同定するた
めのスクリーニングアッセイ）
本明細書中に開示される差示的に発現される配列はまた、結節硬化症関連障害
を処置または予防する候補治療剤を同定するために使用され得る。この治療剤は
、ＴＳＣＸ核酸を発現し得る細胞を含む細胞集団を提供することによって同定さ
れ得る。次いで、試験細胞集団における核酸配列の発現は、参照細胞集団（これ
は、試験薬剤に曝露されない細胞集団であるか、またはいくつかの実施形態にお
いては試験薬剤に曝露された細胞集団である）における核酸配列の発現と比較さ
れる。比較は、同時または時間的に別個の時点で測定された試験サンプルおよび
参照サンプルに対して実行され得る。後者の例は、編集された発現情報（例えば
、配列データベース）（これは、種々の薬剤の投与後の、既知の配列の発現レベ
ルについての情報を編集する）の使用である。例えば、試験薬剤の投与後の発現
レベルの変更は、コントロール薬剤の投与後に核酸配列において観察される発現
変化に対して比較され得る。
【００７６】
試験サンプルに曝露されていない参照細胞集団における核酸配列の発現と比較
した、試験細胞集団における核酸配列の発現の減少は、この試験薬剤が、候補治
療剤であることを示す。
【００７７】
この試験薬剤は、以前に記載されていない化合物であり得るか、または以前に
知られているが結節性硬化症複合体障害を処置するための薬剤であることが知られて
いない化合物であり得る。
【００７８】
本発明はまた、このスクリーニング方法に従って同定された化合物を含む。
【００７９】
過少発現遺伝子の発現を刺激するか、または過剰発現遺伝子の発現を抑制する
際に有効な薬剤は、結節性硬化症複合体関連障害を予防する能力について、そしてこ
のような病態生理の処置のために有用な潜在的治療剤として、さらに試験され得
る。このような化合物の臨床的有用性のさらなる評価は、毒性および臨床的有効
性を評価する標準的方法を使用して実行され得る。
【００８０】
（特定の個体について適切な、結節性硬化症複合体関連障害を処置するための治療
剤の選択）
個体の遺伝的構成の差異は、種々の薬物を代謝する相対的な能力における差異
を生じ得る。被験体において代謝されて、治療剤として作用する薬剤は、病態生
理学的状態に特徴的な遺伝子発現パターンからの、非病態生理学的状態に特徴的
な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって、自明であり得る。従っ
て、本明細書中に開示される差示的に発現されたＴＳＣＸ配列は、この薬剤が、
被験体において適切な治療剤であるか否かを決定するために、選択された被験体
由来の試験細胞集団において、推定治療剤または予防剤が試験されることを可能
にする。
【００８１】
特定の被験体に適切な治療剤を同定するために、被験体由来の試験細胞集団を
、治療剤、および１以上のＴＳＣＸ１〜１４１の発現に曝露する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、この薬剤は、薬物を活性形態に代謝する酵素を
含む細胞抽出物と最初に混合される。次いで、この治療剤の活性形態は、試験細
胞集団と混合され得、そして遺伝子発現が測定される。このましくは、この細胞
集団は、薬剤またはこの薬剤の活性形態と、エキソビボで接触される。
【００８３】
次いで、試験細胞集団中の核酸配列の発現を、参照細胞集団中の核酸配列の発
現と比較する。参照細胞集団は、その結節性硬化症複合体状態が既知である、少なく
とも１つの細胞を含む。「結節性硬化症複合体状態」によって、参照細胞集団が、結
節性硬化症複合体の対象物を有することが既知の細胞を含むか否かが意味される。
【００８４】
この試験薬剤は、任意の化合物または組成物であり得る。
【００８５】
（被験体における結節性硬化症複合体関連疾患の処置の有効性評価）
本明細書中で同定された差次的に発現したＴＳＣＸ配列はまた、モニターされ
るべき結節性硬化症複合体関連疾患の一連の処置を可能にする。この方法において、
試験細胞集団は、結節性硬化症複合体関連疾患の治療を受ける被験体から提供される
。所望であれば、試験細胞集団は、処置前、処置の間または処置後の種々の時間
で被験体から採集され得る。次いで、試験細胞における１つ以上のＴＳＣＸ配列
（例えば、ＴＳＣＸ：１−１４２）の発現が測定され、そして病理生理学的状態
が知られている細胞を含む参照細胞集団と比較される。好ましくは、この参照細
胞は、処置に曝されていない。
【００８６】
参照細胞集団が処置に曝された細胞を含まない場合、試験細胞集団と参照細胞
集団におけるＴＳＣＸ配列の間の発現の類似性は、処置の有効性を示す。しかし
、試験集団とこの参照細胞集団におけるＴＳＣＸ間の発現における差異は、処置
が有効で無いことを示す。
【００８７】
「有効な」とは、被験体において、処置が病理生理学における低減を導くこと
を意味する。処置が病理生理学的に適用され得る場合、「有効な」とは、処置が
病理生理学を遅らせるか、あるいは予防することを意味する。
【００８８】
有効性は、特定の病理生理学を処置するための公知の任意の方法と関連して決
定され得る。
【００８９】
（結節性硬化症複合体関連疾患を有する被験体の予後評価）
結節性硬化症複合体関連疾患を有する被験体の予後を、試験細胞集団におけるＴＳ
ＣＸ核酸の発現と、疾患状態のスペクトルにわたって患者に由来する参照プロフ
ィールにおける配列の発現とを比較することによって評価する方法もまた提供さ
れる。試験細胞集団と参照プロフィールのＴＳＣＸ核酸の遺伝子発現を比較する
ことによってか、または被験体由来の試験細胞集団における遺伝子発現のパター
ンを経時的に比較することによって、被験体の予後が評価され得る。
【００９０】
参照プロフィールは、主に非癌性細胞または癌性細胞を含む。主に非癌性細胞
を含む参照プロフィールは、非癌性参照プロフィールである。主に癌性細胞を含
む参照プロフィールは、癌性参照プロフィールである。いくつかの実施形態にお
いて、癌性参照プロフィールは、主に広がった癌性細胞を含む。参照プロフィー
ルが主に非癌性細胞を含む場合、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ核酸の増加した
発現は、予後が好調でないことを示す。逆に、参照プロフィールが主に癌性細胞
を含む場合、試験細胞集団におけるＴＳＣＸ核酸の減少した発現は、予後がより
好調なことを示す。
【００９１】
（薬学的組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される１つ以上の治療化合物
を含有する、薬学的組成物または治療組成物を含む。薬学的処方物としては、経
口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（筋内、皮下
および静脈内を含む）投与、あるいは吸入または噴霧による投与に適切な処方物
が挙げられ得る。処方物は、適切であれば、別個の投薬量単位において好都合に
表わされ得、そして薬学分野における周知の任意の方法によって調製され得る。
全てのこのような薬学的方法は、液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリア
あるいは必要に応じてその両方を活性化合物と合わせる工程、および必要な場合
、所望の処方物に生成物を成形する工程を包含する。
【００９２】
経口投与に適切な薬学的処方物は、個別の単位（例えば、各々が予め決められ
た量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤または錠剤；散剤または顆粒剤；ある
いは溶液（懸濁液）またはエマルジョンのような）として好都合に表わされ得る
。この活性成分はまた、ボーラスの舐剤またはペーストとして示され得、そして
純粋な形態（すなわち、キャリアを有さない）あり得る。経口投与のための錠剤
およびカプセルは、好都合な賦形剤（例えば、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤
または湿潤剤を含み得る。錠剤は、必要に応じて１つ以上の処方成分を伴って、
圧縮または成形によって作製され得る。圧縮錠剤は、自由流動形態の活性成分（
例えば、必要に応じて結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、滑沢剤、界面活性剤また
は分散剤と混合された粉末または顆粒）を適切な機械で圧縮することによって調
製され得る。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤を用いて湿らせた粉末化化合
物の混合物を、適切な機械において成形することによって作製され得る。この錠
剤は、当該分野で周知の方法に従ってコートされ得る。経口流体調製物は、例え
ば、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤またはエリキシ
ル剤の形態であり得るか、あるいは使用前に水または適切な他のビヒクルを用い
て構成するための乾燥製剤として示され得る。このような液体調製物は、慣習的
な添加剤（例えば、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）また
は防腐剤）を含み得る。この錠剤は、必要に応じて、その中で、活性成分の遅延
された放出または制御された放出を提供するように処方され得る。
【００９３】
非経口投与のための処方物は、処方物を意図された患者の血液と等張性にする
、水性または非水性の滅菌注射溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝液、抗生物質お
よび溶質を含み得る）；ならびに水性または非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤および
増粘剤を含み得る）を含む。これらの処方物は、単回用量または複数回用量の容
器において示され得（例えば、シールしたアンプルおよびバイアル）、そして使
用の直前に、滅菌液体キャリア（例えば、生理食塩水、注射用水）の添加だけを
必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。あるいは、処方物
は連続注入のために示され得る。即席の注入溶液および懸濁液は、先に記載した
種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００９４】
直腸投与のための処方物は、通常のキャリア（例えば、ココアバターまたはポ
リエチレングリコール）を含む坐剤として示され得る。口（例えば、頬側または
舌下）における局所投与のための処方物は、トローチ剤（ショ糖およびアラビア
ゴムまたはトラガカントゴムような風味付けした基剤中に活性成分を含む）、な
らびに口内錠（ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアラビアゴムのよ
うな基剤中に活性成分を含む）を含む。鼻腔内投与のために、本発明の化合物は
、液体噴霧または分散可能な粉末として、あるいはドロップの形態において使用
され得る。ドロップは、水性または非水性基剤で処方され得、また、１つ以上の
分散剤、可溶化剤または懸濁剤を含む。液体噴霧は、加圧パックから簡便に送達
される。
【００９５】
吸入による投与のために、化合物は、吹入器、噴霧器、加圧パックまたはエア
ロゾル噴霧を送達する他の簡便な手段から簡便に送達される。加圧パックは、適
切なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメ
タン、ジクロロテトラフルオロエタン（ｄｉｃｈｉｏｒｏｔｅｔｒａｆｌｕｏｒ
ｏｅｔｈａｎｅ）、二酸化炭素または適切な他のガス）を含み得る。加圧エアロ
ゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって
決定され得る。
【００９６】
あるいは、吸入および通気法による投与のために、この化合物は、乾燥粉末組
成物の形態をとり得る（例えば、乳糖またはデンプンのような適切な化合物およ
び粉末ベースの粉末混合物）。粉末が吸入または通気法を用いて投与され得る粉
末組成物は、１単位の投与形態（例えば、カプセル剤、カートリッジ、ゼラチン
またはブリスターパック）で与えられ得る。
【００９７】
所望の場合、上記活性成分の徐放を与えるように適用された、上記の処方物が
、用いられ得る。この薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存料
などの他の活性成分も含み得る。
【００９８】
特に上述された成分に加えて、本発明の処方物は、課題の型の処方物（例えば
、経口投与に適する組成物は、フレーバー剤を含み得る）に関連する、当該分野
において慣用的な方法も含み得ることは、理解されるべきである。
【００９９】
好ましい単位用量の処方物は、活性成分の、以下に示すような有効用量または
それらの適切な画分を含む処方物である。
【０１００】
各々の上記の状態に関して、この組成物は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜
約２５０ｍｇ／ｋｇの用量で、経口的または注射を介して投与され得る。ヒト成
体のための用量の範囲は、一般的に、約５ｍｇ〜約１７．５ｇ／１日であり、好
ましくは、約５ｍｇ〜約１０ｇ／１日であり、最も好ましくは、約１００ｍｇ〜
約３ｇ／１日である。離散した単位で提供される表示の錠剤または他の単位の投
与形態は、便利には、そのような投与またはその複数の投与で効果的な量（例え
ば、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ（通常１００ｍｇ〜約５００ｍｇ）を含む単位）を
含み得る。
【０１０１】
薬学的組成物は、好ましくは、経口的または注射（静脈注射もしくは皮下注射
）によって、投与され、そして被験体に投与された正確な量は、主治医の責任で
ある。しかし、用いられる用量は、被験体の年齢および性別、処置される正確な
障害、ならびにその重篤度を含む、多くの因子に依存する。投与の経路はまた、
その状態およびその重篤度に非常に依存し得る。
【０１０２】
（ＴＳＣＸ核酸）
ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５（配列番号１〜２２）からな
る群より選択される核酸配列またはその相補体を含む新規核酸ならびにこれらの
核酸を含むベクターおよび細胞もまた、本発明において提供される。
【０１０３】
従って、本発明の１つの局面は、ＴＳＣＸタンパク質またはそれらの生物学的
に活性な部分をコードする単離されたＴＳＣＸ核酸分子に関する。ＴＳＣＸをコ
ードする核酸（例えば、ＴＳＣＸ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリゼーシ
ョンプローブとしての使用に十分な核酸フラグメントおよびＴＳＣＸ核酸分子の
増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして使
用するためのフラグメントもまた含まれ得る。本明細書中に使用される場合、用
語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、Ｒ
ＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて作製されたＤＮ
ＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにその誘導体、フラグメントおよびホモログ
を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ま
しくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１０４】
「プローブ」とは、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、用途に依存し
て少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）と例えば、約６，０００ｎｔほどとの
間の配列をいう。プローブは、同一の核酸配列、類似の核酸配列、または相補的
な核酸配列の検出において用いられる。より長いプローブは、通常、天然の供給
源または組換えの供給源から得られ、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよ
り非常に遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖でも二本鎖でもよく、か
つＰＣＲ、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術に
おいて特異性を有するように設計され得る。
【０１０５】
「単離された」核酸分子とは、核酸の天然供給源において存在する他の核酸分
子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子の例としては、ベクター
に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種の宿主細胞に維持される組換えＤＮＡ分子、
部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合成Ｒ
ＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」
核酸分子とは、その核酸が誘導される生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にはその
核酸に連結している（すなわち、核酸の５’末端または３’末端に配置される）
、遊離の配列である。例えば、種々の実施形態において、この単離されたＴＳＣ
Ｘ核酸分子は、約５０ｋｂ未満、約２５ｋｂ未満、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満
、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満、または約０
．１ｋｂ未満の核酸配列（この核酸配列は、この核酸が誘導される細胞のゲノム
ＤＮＡにおいて天然には核酸分子に隣接している）を含み得る。さらに、「単離
された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって産生された
場合、他の細胞性物質または培養培地を実質的に含み得ないか、または化学合成
された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を含み得ない。
【０１０６】
本発明の核酸分子（例えば、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５
のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはそれらのヌクレオチド
配列のいずれかの相補体）は、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提
供される配列情報を用いて単離され得る。これらの核酸配列の全てまたは一部を
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＴＳＣＸ核酸配列は、標準的な
ハイブリダイゼーションおよびクローン技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡ
ＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
Ｙ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬ
Ｓ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されている）。
【０１０７】
本発明の核酸は、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーと
してｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは、ゲノムＤＮＡを用いて、標準的ＰＣＲ増幅技
術に従い、増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクターへとク
ローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、
ＴＳＣＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術
によって（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）調製され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、一連の連結
されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチド残基は、ＰＣＲ反応に
用いられるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド
配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれらの配列
から設計され得、そして特定の細胞または組織中の同一、類似または相補的なＤ
ＮＡまたはＲＮＡの存在を、増幅、確認、または明らかにするために用いられる
。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ｎｔかつ５０ｎｔほどまで（好まし
くは、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ）を有する核酸配列の部分を含む。これらは、化
学的に合成され得、プローブとして、用いられ得る。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、ＴＳＣＸ：：１〜７
、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８〜８５、１１１〜１１３、１２０
、１３０、１３２〜１３４、および１３８に示されるヌクレオチド配列の相補体
である核酸分子を含む。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は
、これらの任意の配列、またはこれらの任意のヌクレオチド配列の一部に示され
るヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。ＴＳＣ：１〜８、１０〜１
２、および１５〜２５に示されるヌクレオチド配列と相補的である核酸分子は、
示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な分子であり、その結果、その分子は
、示されるヌクレオチド配列とほとんどミスマッチしないかまたは全くミスマッ
チせずに水素結合し得、それにより、安定な二本鎖を形成する。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド
単位間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対をい
い、用語「結合」とは、２つのポリペプチドまたは化合物または関連するポリペ
プチドもしくは化合物あるいはそれらの組合せの間の物理的相互作用または化学
的相互作用を意味する。結合としては、イオン結合、非イオン結合、Ｖｏｎ ｄ
ｅｒ Ｗａａｌｓ結合、疎水結合などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的
または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用とは、別のポリペプチドま
たは化合物の効果を介するものであり得るか、またはそれらに起因し得る。直接
的相互作用とは、別のポリペプチドまたは化合物を介して生じることも、それら
の効果に起因しても生じることもないが、他の実施的な化学的中間物質を伴うこ
となく、存在する相互作用をいう。
【０１１１】
さらに、本発明の核酸分子は、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２
５の核酸配列の一部（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得る
フラグメントか、またはＴＳＣＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメ
ント）のみを含み得る。本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６
個の（連続する）核酸または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸の配列（各
々、核酸の場合、特定のハイブリダイゼーションを可能とし、またはアミノ酸の
場合、特定のエピトープの認識を可能とするのに十分な長さ）として規定され、
そして全長配列より短いせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択
した核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体と
は、ネイティブの化合物より直接的にかまたは改変もしくは部分的置換のいずれ
かによって形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログとは、その
ネイティブの化合物に類似するが、同一ではない構造を有する、核酸配列または
アミノ酸配列であるが、特定の成分または側鎖に関してそのネイティブの化合物
と異なる。アナログは、合成でも進化的に異なる起源に由来してもよく、そして
野生型に対して類似または反対の代謝活性を有し得る。
【０１１２】
誘導体およびアナログは、下記のように、その誘導体またはアナログが改変さ
れた核酸またはアミノ酸を有する場合、全長でも全長以外でもよい。本発明の核
酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、同一
サイズの核酸配列もしくはアミノ酸配列にわたってか、または整列した配列（こ
の整列は、当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによって行
われる）と比較した場合、少なくとも約４５％、約５０％、約７０％、約８０％
、約９５％、約９８％、または約９９％の同一性（好ましくは、８０〜９９％の
同一性）によって、本発明の核酸分子またはタンパク質に対して実質的に相同で
あるか、あるいはこの配列がコードする核酸配列が、ストリンジェントな条件、
中程度にストリンジェントな条件、または低いストリンジェントな条件下で、前
出されたタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズし得る領域を含
む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵ
ＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ
，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３お
よび以下を参照のこと。例示的なプログラムは、デフォルト設定を用いたギャッ
ププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐ
ａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸ（登録商標）、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である（これは、Ｓｍｉｔｈおよび
Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いる（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１
９８１、２：４８２−４８９（これは、本明細書中に参考として援用される））
。
【０１１３】
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」、あるいはこれらのバリエーシ
ョンとは、上で議論されるようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの
相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同ヌクレオチド配列は、ＴＳＣＸ
ポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソ
フォームは、例えば、ＲＮＡの代替的スプライシングの結果として、同じ生物の
異なる組織中で発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によ
ってコードされ得る。本発明において、相同ヌクレオチド配列は、ヒト以外の種
のＴＳＣＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヒト以外の種と
しては、哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されず、従って、例えば、マウ
ス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物が挙げられ得る
。相同ヌクレオチド配列としてはまた、本明細書中に示されるヌクレオチド配列
の天然に存在する対立遺伝子改変体および変異体が挙げられるが、これらに限定
されない。しかし、相同ヌクレオチド配列は、ヒトＴＳＣＸタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、ＴＳＣＸポリペプチドおよ
びＴＳＣＸ活性を有するポリペプチド中の保存的アミノ酸置換（以下を参照のこ
と）をコードするそれらの核酸配列を含む。相同アミノ酸配列は、ヒトＴＳＣＸ
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１１４】
ヒトＴＳＣＸ遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の
細胞型（例えば、他の組織）中のＴＳＣＸホモログおよび他の哺乳動物由来のＴ
ＳＣＸホモログの同定および／またはクローニングに使用するために設計された
プローブおよびプライマーの作製を可能とする。このプローブ／プライマーは、
代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオ
チドは、代表的に、ストリンジェントな条件下で、ＴＳＣＸ配列を含む核酸の少
なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個
、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個の連続するセンス鎖ヌ
クレオチド配列、またはＴＳＣＸ配列を含む核酸の連続的アンチセンス鎖ヌクレ
オチド配列、あるいは天然に存在するこれらの配列の変異体とハイブリダイズす
るヌクレオチド配列領域を含む。
【０１１５】
ヒトＴＳＣＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写物または同じタンパ
ク質もしくは相同タンパク質をコードするゲノム配列を検出するために用いられ
得る。種々の実施形態において、このプローブは、それらに付着させた標識基（
例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子で
あり得る）をさらに含む。そのようなプローブは、（例えば、被験体中の細胞サ
ンプル中のＴＳＣＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＴＳＣ
Ｘ ｍＲＮＡレベルを決定することまたはゲノムＴＳＣＸ遺伝子が変異または欠
失しているか否かを決定すること）によって）ＴＳＣＸタンパク質を誤って発現
する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る
。
【０１１６】
「ＴＳＣＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド］とは、本発明のポ
リペプチドの活性と必ずしも同一ではないが、類似する活性を示すポリペプチド
をいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定さ
れるような成熟形態を含む。「ＴＳＣＸの生物学的に活性な部分」をコードする
核酸フラグメントは、ＴＳＣＸの生物学的活性（ＴＳＣＸタンパク質の生物学的
活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードするＴＳＣ：１〜８
、１０〜１２、１５〜２５の部分を単離し、ＴＳＣＸタンパク質のコードされた
部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＴＳＣ
Ｘのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、Ｔ
ＳＣＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、
必要に応じてＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態において、ＴＳＣＸ
の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１つ以上の領域を含
む。
【０１１７】
（ＴＳＣＸ改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、開示または参照されるＴＳ
ＣＸヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は
、例えば、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５に示されるＴＳＣＸ
核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＴＳＣ
Ｘタンパク質をコードする。
【０１１８】
ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２、および１５〜２５に示されるラットＴＳＣＸヌ
クレオチド配列に加えて、ＴＳＣＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を
導くＤＮＡ配列の多型が、ある集団内（例えば、ヒト集団）に存在することは、
当業者に理解される。ＴＳＣＸ遺伝子におけるそのような遺伝的多型は、天然の
対立遺伝子のバリエーションに起因してある集団内の個体間で存在し得る。本明
細書中に使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＴＳＣ
Ｘタンパク質（好ましくは、哺乳動物ＴＳＣＸタンパク質）をコードするオープ
ンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。そのような天然の対立遺伝子の
バリエーションは、代表的には、ＴＳＣＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１
〜５％の変動性を生じる。天然の対立遺伝子のバリエーションの結果であり、か
つＴＳＣＸの機能的活性を変化させない、ＴＳＣＸにおける任意および全てのそ
のようなヌクレオチド改変体および生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあ
ると意図される。
【０１１９】
さらに、他の種由来のＴＳＣＸタンパク質をコードし、従って、ＴＳＣ：１〜
８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヒト配列とは異なるヌクレ
オチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発
明のＴＳＣＸ ＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸
分子は、本明細書中に開示されるヒトＴＳＣＸ核酸に対するその相同性に基づい
て、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイ
ゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまた
はその一部を用いて単離され得る。例えば、可溶性ヒトＴＳＣＸのＤＮＡは、ヒ
トの膜結合性ＴＳＣＸに対するその相同性に基づいて単離され得る。同様に、膜
結合性のヒトＴＳＣＸ ＤＮＡは、可溶性のヒトＴＳＣＸに対するその相同性に
基づいて単離され得る。
【０１２０】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌ
クレオチド長であり、そしてストリンジェント条件下でＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ
：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハ
イブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５
０、１００、２５０、または５００のヌクレオチド長である。別の実施形態では
、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書
中で用いられる場合、用語「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」は
、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同な
ヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載
することを意図する。
【０１２１】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＴＳＣＸタンパク質をコードする核
酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定の
ヒト配列の全てまたは一部をプローブとし、核酸ハイブリダイゼーションおよび
クローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、また
は高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントハイブリダイゼーション
条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、
その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない
条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で
異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズ
する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで
、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは
、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイ
ズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列
は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有さ
れている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩
濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０
Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が短いプローブ、
プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について
少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレ
オチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェント
な条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０１２３】
ストリンジェント条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出
され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約
７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が
、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、
０．０２％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーションであ
る。このハイブリダイゼーションは、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．０１％ Ｂ
ＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄を行う。ストリンジェント条件下でＴＳＣ
：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５の配列にハイブリダイ
ズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在す
る（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮ
Ａ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０１２４】
第２の実施形態では、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１
５〜２５、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ
し得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーシ
ョン条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．
５％ ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼ
ーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗
浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で
周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ Ｐ
ＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ
ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０１２５】
第３の実施形態では、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１
５〜２５、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る
核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定
的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ Ｆｉｃｏ
ｌｌ、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重
量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて
２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０．１％ ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低
ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイ
ブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（
編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫ
ｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥ
ＳＳＩＯＮ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐ
ｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓｈｉｌｏら，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１２６】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＴＳＣＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加え
て、当業者は、ＴＳＣＸ核酸中に変化がもたらされ得るか、またはこのＴＳＣＸ
タンパク質の機能的能力を変化させることなく、ＴＳＣＸポリペプチド配列中に
直接的に変化がもたらされ得ることをさらに理解する。いくつかの実施形態にお
いて、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５のヌクレ
オチド配列が変化され、それによってコードされるＴＳＣＸタンパク質のアミノ
酸配列中に変化をもたらす。例えば、種々の「非必須」アミノ酸残基にてアミノ
酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２お
よびＴＳＣ：１５〜２５の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は
、生物学的活性を変更することなく、このＴＳＣＸの野生型配列から、変更され
得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる
。例えば、本発明のＴＳＣＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、
特に変更を受け入れ難いと予測される。
【０１２７】
さらに、本発明のＴＳＣＸタンパク質のファミリーメンバーの間で保存される
アミノ酸残基は、変更に対して特に受け入れ難いこともまた予想される。このよ
うに、これらの保存されたドメインは、変異に対して受容可能ではないようであ
る。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＴＳＣＸタンパク質のメンバーの間で
保存されないか、またはある程度のみ保存されるアミノ酸残基）は、活性に必須
であり得ず、従って変異に対して受容可能であるようである。
【０１２８】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、
ＴＳＣＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＴＳＣＸタンパ
ク質は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む
核酸によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列とは、アミノ酸残基が異な
るが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子
は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質
は、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む核酸
によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列に
、少なくとも約４５％の相同性の、より好ましくは６０％の、そしてさらにより
好ましくは少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％の、
そして最も好ましくは少なくとも約９９％の相同性のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
相同なＴＳＣＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、ＴＳＣ：１〜
８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含む核酸のヌクレオチド配
列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製さ
れ得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタ
ンパク質に導入される。
【０１３０】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）
によって、ＴＳＣ：１〜８、ＴＳＣ：１０〜１２およびＴＳＣ：１５〜２５を含
む核酸中に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非
必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が
類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側
鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらの
ファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば
、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、ア
スパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グ
リシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイ
ン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イ
ソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β
分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）およ
び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプ
トファン、ヒスチジン）。従って、ＴＳＣＸ中の推定された非必須アミノ酸残基
は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別
の実施形態では、変異は、ＴＳＣＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例え
ば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって
）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＴＳＣＸの生物学的活性に
ついてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。核酸配列の
変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え
技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１３１】
１つの実施形態では、変異ＴＳＣＸタンパク質は、以下についてアッセイされ
得る：（１）他のＴＳＣＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学
的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、
（２）変異ＴＳＣＸタンパク質と、ＴＳＣＸのリガンドとの間の複合体形成；（
３）変異ＴＳＣＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性
な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（４）ＡＴＰを結合
させる能力；あるいは（５）ＴＳＣＸタンパク質抗体を特異的に結合させる能力
。
【０１３２】
他の特定の実施形態において、核酸とはＲＮＡまたはＤＮＡである。そのフラ
グメントまたはその相補的なポリヌクレオチド配列のフラグメントは、約１０ヌ
クレオチド〜約１００ヌクレオチドの間の長さ（例えば、約１０ヌクレオチド〜
約９０ヌクレオチドの間の長さ、もしくは約１０ヌクレオチド〜約７５ヌクレオ
チドの間の長さ、約１０塩基〜約５０塩基の間の長さ、約１０塩基〜約４０塩基
の間の長さ、または約１５塩基〜約３０塩基の間の長さ）である。
【０１３３】
（アンチセンス）
本発明の別の局面は、ＴＳＣＸ配列、またはそのフラグメント、アナログもし
くは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは
相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核
酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖
ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）
ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、少なくとも約１０、約２５、約５０
、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたは全体のＴＳＣＸコー
ド鎖、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が
提供される。ＴＳＣＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナ
ログをコードする核酸分子、またはＴＳＣＸ核酸配列を含む核酸に相補的なアン
チセンス核酸がさらに提供される。
【０１３４】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＴＳＣＸをコードするヌクレ
オチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コ
ード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の
領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＴＳＣＸをコー
ドするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスで
ある。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳され
ない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非
翻訳領域ともいわれる）。
【０１３５】
本明細書中に開示されるＴＳＣＸをコードするコード鎖配列を考慮すれば、本
発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック型塩基対合、またはフーグステ
ィーン型塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＴＳ
ＣＸ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＴＳ
ＣＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであ
るオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ
ＳＣＸ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約
２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０のヌクレオチドであり得る
。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成ま
たは酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、
アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこ
の分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセン
ス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された
種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホ
ロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１３６】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例
としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセ
チルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシ
メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウ
ラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ
６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，
２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル
シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メ
チルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β
−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５
−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシ
ル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシ
ン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４
−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステ
ル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（
３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、お
よび２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアン
チセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成さ
れ得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさら
に記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１３７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、または
インサイチュで生成され、その結果、それらは、ＴＳＣＸタンパク質をコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または
それらに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば、転写および／
または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定
な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によって、または例えばＤＮＡ二
重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルー
ブにおける特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子
の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、ア
ンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで
全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、
そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチド
または抗体に連結することによってそれらが選択された細胞表面上に発現された
レセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセン
ス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得
る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸
分子が、強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの
制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
【０１３８】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー
核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡとの特定の二本鎖ハイ
ブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平
行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’
−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ
アナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜３
３０）を含み得る。
【０１３９】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。
リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ
活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補
領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａ
ｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８
５〜５９１に記載される））を使用して、ＴＳＣＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に
切断し、それによってＴＳＣＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＴＳＣＸをコー
ドする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＴＳ
ＣＸのＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、活性部位の
ヌクレオチド配列が、ＴＳＣＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチ
ド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築
され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅ
ｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＴＳＣＸの
ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特定のリボヌクレアーゼ活性を
有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１４０】
あるいは、ＴＳＣＸの遺伝子発現は、ＴＳＣＸ核酸の調節領域（例えば、ＴＳ
ＣＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列
を標的化し、標的細胞中でのＴＳＣＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を
形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａ
ｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（
１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭ
ａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７〜１５を参照のこと。
【０１４１】
種々の実施形態において、ＴＳＣＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨
格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶
性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプ
チド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈ
ｅｍ ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される用語「ペプチド核
酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によっ
て置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持さ
れている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの天然の骨格は、
低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼー
ションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨ
ｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ
９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成
プロトコルを用いて行われ得る。
【０１４２】
ＴＳＣＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例
えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害
することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗原
剤として使用され得る。ＴＳＣＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲク
ランピングによる遺伝子における単一塩基対変異の分析において；他の酵素（例
えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素（Ｈｙ
ｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）として；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイ
ゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上
記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、例えば、使用され得る
。
【０１４３】
別の実施形態において、ＴＳＣＸのＰＮＡは、例えばそれらの安定性または細
胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂肪親和性基または他のヘルパー基を
結合することによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポ
ソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変
され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＴＳＣＸの
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異
性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓ
ｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする
。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向
を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕ
ｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６
）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３
３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準
的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、
そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチ
ル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮ
Ａの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカッ
プリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメ
ラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグ
メントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔ
ｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５：１
１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０１４４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を
含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため
）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６
５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を
参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３
４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘
発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：
９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変さ
れ得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチ
ド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発
切断剤など）に結合され得る。
【０１４５】
（ＴＳＣＸポリペプチド）
本発明の１つの局面は、単離されたＴＳＣＸタンパク質、およびその生物学的
に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモロ
グを含む。抗ＴＳＣＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切な
ポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイテ
ィブなＴＳＣＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製
スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態にお
いて、ＴＳＣＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発
現に代わるものとして、ＴＳＣＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペ
プチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０１４６】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な
部分は、ＴＳＣＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質
または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合
に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質
的に含まない」は、ＴＳＣＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、
ＴＳＣＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、この
タンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実
質的に含まない」は、非ＴＳＣＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパ
ク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＴＳ
ＣＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＴＳＣＸタンパク質を約
１０％未満、そして最も好ましくは非ＴＳＣＸタンパク質を約５％未満有する、
ＴＳＣＸタンパク質の調製物を含む。ＴＳＣＸタンパク質またはその生物学的に
活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、
すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ま
しくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０１４７】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が
、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離され
ているＴＳＣＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化
学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＴＳ
ＣＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体ま
たは非ＴＳＣＸポリペプチドを約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体ま
たは非ＴＳＣＸポリペプチドを約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体
または非ＴＳＣＸポリペプチドを約５％未満有する、ＴＳＣＸタンパク質の調製
物を含む。
【０１４８】
ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、十分に相同なアミノ酸配列、
またはＴＳＣＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、全長ＴＳＣＸタンパク質よ
り少ないアミノ酸を含み、そしてＴＳＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を
示す、ＴＳＣＸ１〜２０を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列）に由来
するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は
、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ
を含む。ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、
５０、１００またはそれより多いアミノ酸であるポリペプチド長であり得る。
【０１４９】
本発明のＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＴＳＣＸタンパク質
間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つを含み得る。代替の
、ＴＳＣＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、上記の同定された少なくとも
２つのドメインを含み得る。未発明のＴＳＣＸタンパク質の別の生物学的に活性
な部分は、上記の同定された少なくとも３つのドメインを含み得る。本発明の
ＴＳＣＸタンパク質のなお別の生物学的に活性な部分は、上記の同定された少な
くとも４つのドメインを含み得る。
【０１５０】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、
組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＴＳＣＸタンパク質の機能
的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質は、これらのＴＳＣＸタン
パク質の１つに実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天
然の対立遺伝子改変体または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、ＴＳ
ＣＸタンパク質の機能的活性を保持する。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、ＴＳＣＸｉｃ剤が投与される、哺乳動物
において発現が調節されるポリペプチド配列に８０％以上であるアミノ酸配列を
含む単離されたポリペプチドを含む。
【０１５３】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性のパーセントを決定するために
、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第１の
アミノ酸配列または核酸配列の配列中に第２のアミノ酸配列または核酸配列との
最適な整列のために導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌク
レオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中
の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド
で占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用
される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一
性」と等価である）。
【０１５４】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同
性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプロ
グラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得
る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ
４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（５．
０のＧＡＰ作成ペナルティーおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティー）を用いて
ＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを用いると、上記で言及される類似の核酸配列のコ
ード領域は、ＴＳＣＸ：：１〜７、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８
〜８５、１１１〜１１３、１２０、１３０、１３２〜１３４および１３８を含む
ＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、
８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１５５】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列
が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用
語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域に
わたって最適に整列された２つの配列を比較する工程、両方の配列において同一
の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在す
る位置の数を決定し、一致した位置の数を得る工程、この一致した位置の数を、
比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算する工程、そ
して結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを得る工程。用語「
実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特
徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較し
て、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性
、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の
配列同一性を有する配列を含む。
【０１５６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＴＳＣＸのキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する
。本明細書中で使用される場合、ＴＳＣＸの「キメラタンパク質」または「融合
タンパク質」は、非ＴＳＣＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＴＳＣＸポ
リペプチドを含む。「ＴＳＣＸポリペプチド」は、ＴＳＣＸに対応するアミノ酸
配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＴＳＣＸポリペプチド」は、ＴＳＣＸ
タンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＴＳＣＸタンパ
ク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＴＳＣＸの融合タンパク質におい
て、このＴＳＣＸポリペプチドは、ＴＳＣＸタンパク質のすべてまたは一部分に
対応し得る。１つの実施形態において、ＴＳＣＸの融合タンパク質は、ＴＳＣＸ
タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態にお
いて、ＴＳＣＸの融合タンパク質は、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも２つの生
物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態において、ＴＳＣＸの融合タン
パク質は、ＴＳＣＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む
。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＴＳＣＸポリペ
プチドおよび非ＴＳＣＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されている
ことを示すことが意図される。非ＴＳＣＸポリペプチドは、ＴＳＣＸポリペプチ
ドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１５７】
例えば、１つの実施形態において、ＴＳＣＸ融合タンパク質は、第２のタンパ
ク質の細胞外ドメインと作動可能に連結されたＴＳＣＸドメインを含む。このよ
うな融合タンパク質は、ＴＳＣＸ活性を調節する化合物のためのスクリーニング
アッセイ（このようなアッセイは以下に詳細に記載される）において、さらに利
用され得る。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＴＳＣＸ融合
タンパク質であり、ここではＴＳＣＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク
質は、組換えＴＳＣＸの精製を容易にし得る。
【０１５９】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を
含むＴＳＣＸタンパク質である。例えば、ネイティブのＴＳＣＸシグナル配列が
取り除かれ得、そして別のタンパク質からのシグナル配列と置換され得る。特定
の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＴＳＣＸの発現および／ま
たは分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０１６０】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＴＳＣＸ−免疫グロブリ
ン融合タンパク質であり、ここで、１つ以上のドメインを含むＴＳＣＸ配列が、
免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。
本発明のこのＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取
り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＴＳＣＸリガントとＴＳ
ＣＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＴＳＣＸ媒
介シグナル伝達を抑制し得る。このＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を
用い、ＴＳＣＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティに影響を与え得る。ＴＳ
ＣＸリガンド／ＴＳＣＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処
置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有
用であり得る。さらに、本発明のこのＴＳＣＸ−免疫グロブリン融合タンパク質
は、被験体中で抗ＴＳＣＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＴＳ
ＣＸリガンドを精製し、そしてＴＳＣＸリガンドとのＴＳＣＸの相互作用を阻害
する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０１６１】
本発明のＴＳＣＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法
により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラ
グメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（
ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じ
て粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるための
アルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフ
レームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成
機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増
幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニーリングおよび再増幅され
得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカー
プライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮ
Ｔ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例え
ば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されて
いる。ＴＳＣＸをコードする核酸は、この融合部分がＴＳＣＸタンパク質にイン
フレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０１６２】
（ＴＳＣＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＴＳＣＸアゴニスト（模倣物）としてか、またはＴＳＣＸアン
タゴニストとしてかのいずれかで機能するＴＳＣＸタンパク質の改変体に関する
。ＴＳＣＸタンパク質の改変体（例えば、ＴＳＣＸタンパク質の離散した点変異
または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＴＳＣＸタンパク質のアゴニ
ストは、天然に存在する形態のＴＳＣＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性
、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＴＳＣＸタンパク質のア
ンタゴニストは、天然に存在する形態のＴＳＣＸタンパク質の１つ以上の活性を
、例えば、ＴＳＣＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または
上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学
的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施
形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有
する改変体を用いた被験体の処置は、ＴＳＣＸタンパク質の天然に存在する形態
を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０１６３】
ＴＳＣＸアゴニスト（模倣物）としてか、またはＴＳＣＸアンタゴニストのい
ずれかとしてかのいずれかで機能するＴＳＣＸタンパク質の改変体は、ＴＳＣＸ
タンパク質アゴニスト活性またはＴＳＣＸタンパク質アンタゴニスト活性のため
のＴＳＣＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライ
ブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、
ＴＳＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘
発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＴＳ
ＣＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物
を、潜在的なＴＳＣＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるい
は、その中にＴＳＣＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのた
めの）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子
配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列
から潜在的なＴＳＣＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々
の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施さ
れ得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の
縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＴＳＣＸ配列の所望のセ
ットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを
合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅ
ｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
１１：４７７を参照のこと。
【０１６４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＴＳＣＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用い
て、ＴＳＣＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のための
ＴＳＣＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード
配列フラグメントのライブラリーは、ＴＳＣＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグ
メントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処
理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／
アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生する
こと、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分
を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に
連結することにより生成され得る。この方法により、ＴＳＣＸタンパク質の種々
のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生
し得る。
【０１６５】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産
物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。こ
のような技法を、ＴＳＣＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成さ
れた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子
ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広
く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクタ
ー中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を
形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が
、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下
で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技
法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｓｅｍｂｌ
ｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合
わせて用い、ＴＳＣＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（
１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９
３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
（抗ＴＳＣＸ抗体）
単離されたＴＳＣＸタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて
、ＴＳＣＸに結合する抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。完全長
のＴＳＣＸタンパク質が用いられ得るか、あるいは、本発明は、免疫原としての
使用のためのＴＳＣＸの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＴＳＣＸの抗
原性ペプチドは、ＴＳＣ：１〜８、１０〜１２および１５〜２５に示される核酸
配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列のうちの、少なくとも８アミノ
酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＴＳＣＸと特異的
な免疫複合体を形成するように、ＴＳＣＸのエピトープを含む。好ましくは、こ
の抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なく
とも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸
残基、そして最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペ
プチドに含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＴＳＣ
Ｘの領域、例えば、親水性領域である。抗体産生を標的にする手段として、親水
性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を
伴うかまたは伴わない、Ｋｙｔｅ ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ Ｗｏｏ
ｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、Ｈｏｐ
ｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２、
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。この各々が、そ
れらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【０１６６】
ＴＳＣＸポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは
ホモログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生におけ
る免疫原として利用し得る。本明細書で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン
分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特
異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体と
しては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆ
ａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げ
られるが、こららに限定されない。当該分野で公知の種々の手順が、ＴＳＣＸタ
ンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに
対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。
これらのタンパク質のいくつかを以下で論議する。
【０１６７】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ
、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）が、ネイティブタンパク質、またはそ
の合成改変体、あるいは前述のものの誘導体での注射により免疫され得る。適切
な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたＴＳＣＸタンパク質また
は化学的に合成されたＴＳＣＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジ
ュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のア
ジュバントとしては、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミネラルゲ
ル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プ
ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニト
ロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎおよび
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、ま
たは類似の免疫刺激剤が挙げられるが、こららに限定されない。所望であれば、
ＴＳＣＸに対する抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そして
さらに、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような、
周知の技術により精製され得る。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗
体組成物」は、ＴＳＣＸの特定のエピトープと免疫反応し得る、１種類の抗原結
合部位のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル
抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＴＳＣＸタンパク質に対し、単一の結
合親和性を示す。特定のＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製には、継続的な
細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このよ
うな技術としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１
９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（
ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８
３ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を
産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣ
ＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、
Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）が挙げられるが
、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において利
用し得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによるか（Ｃｏｔｅら、１９８
３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３
０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイル
スで形質転換することにより（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ
ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ
．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）産生し得る。
【０１６９】
本発明によれば、ＴＳＣＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のための技術
が、適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。
さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のための方法が適合されて（例えば、Ｈ
ｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこ
と）、ＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしく
はホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの
迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術によ
り「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと
。ＴＳＣＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該
分野で公知の技術により産生し得、これには：（ｉ）抗体分子のペプシン消化に
より産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメ
ントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；
（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により産生されるＦａｂフ
ラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられるが、これらに限定
されない。
【０１７０】
さらに、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノ
クローナル抗体のような、組換え抗ＴＳＣＸ抗体（これらは、標準的な組換えＤ
ＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ
抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術に
より産生され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番
号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特
許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開
番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願
番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：
１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４
３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；
Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら
（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１
９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ
Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉ
ｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１
９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５
３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；Ｖ
ｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびに
Ｂｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３〜４０６
０。
【０１７１】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのた
めの方法は、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ
）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の
実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である
抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＴＳＣＸタンパク質のフラグ
メントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＴＳＣＸタンパク
質内の１つ以上のドメイン（例えば、ＴＳＣＸファミリーのタンパク質、または
それらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログの、上で同定された保
存領域にまたがるドメイン）について特異的である抗体もまた、本明細書中で提
供される。
【０１７２】
抗ＴＳＣＸ抗体は、ＴＳＣＸタンパク質の局在化および／または定量化に関す
る当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサン
プル中のＴＳＣＸタンパク質のレベルを測定する際の使用のために、診断的方法
における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所
定の実施形態において、ＴＳＣＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメ
ント、アナログまたはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む
）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として
利用される。
【０１７３】
抗ＴＳＣＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフ
ィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＴＳＣＸを単離するた
めに用いられ得る。抗ＴＳＣＸ抗体は、細胞からの天然のＴＳＣＸの精製、およ
び宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＴＳＣＸの精製を容易にし
得る。さらに、抗ＴＳＣＸ抗体は、（例えば、細胞溶解物または細胞上清におけ
る）ＴＳＣＸタンパク質を検出するために用いられ得、ＴＳＣＸタンパク質の発
現の量およびパターンを評価し得る。抗ＴＳＣＸ抗体は、例えば、所定の処置レ
ジメンの効力を決定するために、臨床試験手順の一部として、組織におけるタン
パク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、を検出可能
物質にその抗体を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にさ
れ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光
物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例
としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ
る；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオ
レセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオ
レセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の
例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラ
ーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質
の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１７４】
（ＴＳＣＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＴＳＣＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、
発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、
連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プ
ラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る直鎖状また
は環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターで
あり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る
。特定のベクターは、そのベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（
例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物
ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿
主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主
ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連
結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において
「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベ
クターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド
」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクター
であるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす
、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、お
よびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含む
ことを意図する。
【０１７５】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における本発明の核酸の発現に適切
な形態で、本発明の核酸を含む。これは、この組換え発現ベクターが、発現され
るべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づ
いて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター
において、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例え
ば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入され
る場合は、宿主細胞において）そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で
調節配列に連結されることを意味することを、意図する。用語「調節配列」は、
プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデ
ニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列としては、例え
ば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている
。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発
現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現
を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの
設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなど
のような要因に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは
、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコー
ドされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む
）（例えば、ＴＳＣＸタンパク質、ＴＳＣＸの変異形態、融合タンパク質など）
を産生し得る。
【０１７６】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、
ＴＳＣＸ発現のために設計され得る。例えば、ＴＳＣＸは、Ｅ．ｃｏｌｉのよう
な細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞ま
たは哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；
ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉ
Ｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組
換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラ
ーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１７７】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または
非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性
プロモーターを含むベクターを有する、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施される。融合
ベクターは、その中コードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミ
ノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には
、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させ
るため；（２）組換えタンパク質の可溶性を増加させること；および（３）アフ
ィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質
の精製の際を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質
分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、そし
て融合タンパク質の精製に続きその融合部分から組換えタンパク質を分離するこ
とを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配
列としては、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。
代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ標的の
組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３
１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒ
ｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０１７８】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒ
ａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ
（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙
げられる。
【０１７９】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラ
テジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を損なった宿主
細菌中でそのタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ
、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ
ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のス
トラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優
先的に利用されるコドンであるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配
列を変更することである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２０：２１１：１〜７、１０〜１３、１９〜３４、４５〜５３、５８〜８５
、１１１〜１１３、１２０、１３０、１３２〜１３４および１３５１８を参照の
こと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によっ
て実行され得る。
【０１８０】
別の実施形態において、ＴＳＣＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐ
ＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９〜２
３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅ
ｌｌ ３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）
Ｇｅｎｅ ５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（
ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げ
られる。
【０１８１】
あるいは、ＴＳＣＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞
中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発
現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍ
ｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）
およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９）が挙げられる。
【０１８２】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用し
て、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤ
Ｍ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２Ｐ
Ｃ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げ
られる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばし
ば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用される
プロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およ
びシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方の
ために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣ
ＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９の第１６章および第１７章を
参照のこと。
【０１８３】
別の実施形態において、その組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型中
で優先的にその核酸の発現を指示し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを
、その核酸を発現するために使用する）。組織特異的調節エレメントは、当該分
野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、ア
ルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ １：２６８〜２７７）、リンパ系特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ
およびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５〜２７５
）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍ
ｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：７２９〜７３３）および免疫グロブリン
の特定のプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９
〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：
７４１〜７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメント
プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：５
４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２〜９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（
例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公
開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた
含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ
（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４〜３７９）およびα−フェトプロ
テインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎ
ｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７〜５４６））。
【０１８４】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発
明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ
分子は、ＴＳＣＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（
そのＤＮＡ分子の転写によって）可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結
される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示す
る、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配
列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され
得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、もしくは
細胞型特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。そのアンチセンス発現
ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態で
あり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、そ
の活性は、そのベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセン
ス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒ
ａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔ
ｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０１８５】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関
する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能
に使用される。このような用語は、特定の対象細胞をいうのみでなく、そのよう
な細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが、理解される。特定の改変は、
変異または環境による影響のいずれかに起因して、次の世代にて生じ得るので、
このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本
明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０１８６】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、Ｔ
ＳＣＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞
または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞また
はＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知で
ある。
【０１８７】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介
して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される
場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（
例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で認識されている種々の
技術をいうことを意図し、これらとしては、リン酸カルシウム共沈または塩化カ
ルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換または
トランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥ
ＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）および他の実験室マニュ
アルに見出され得る。
【０１８８】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクタ
ーおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来Ｄ
ＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが公知である。これらの組込み体を同定お
よび選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコード
する遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の
選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメ
トトレキサート）に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコ
ードする核酸は、ＴＳＣＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に
導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で
安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば
、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１８９】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細
胞）は、ＴＳＣＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る
。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＴＳＣＸタンパク質
を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、
ＴＳＣＸタンパク質が産生されるように、適切な培地中で本発明の宿主細胞（こ
こに、ＴＳＣＸをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する
工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、その培地または宿
主細胞からＴＳＣＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０１９０】
（ＴＳＣＸ核酸を同定するためのキットおよび核酸コレクション）
別の局面において、本発明は、因子のＴＳＣＸ性（ＴＳＣＸｉｃｉｔｙ）の調
査のために役立つキットを提供する。このキットは、２つ以上のＴＳＣＸ配列を
検出する核酸を含み得る。好ましい実施形態において、このキットは、ＴＳＣＸ
核酸配列のうちの３個、４個、５個、６個、８個、１０個、１２個、１５個、２
０個、２５個、５０個、１００個または全てを検出する試薬を含む。
【０１９１】
本発明はまた、１つ以上のＴＳＣＸ応答性核酸配列を同定し得る、単離された
複数の配列を含む。このキットまたは複数の配列は、例えばＴＳＣＸ核酸配列に
相同な配列、または１つ以上のＴＳＣＸ核酸配列を特異的に同定し得る配列を含
み得る。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１：種々の組織における抗ロイコプロテアーゼの発現分析）
ＮＭＢの定量的分析（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ０４４７０；表１；ＴＳＣ
）を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））
を使用して種々の正常の細胞、細胞株および組織由来、および病理状態由来の細
胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含有するマイクロタイタープレー
トを用いて評価した。ＲＴＱ ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。種々のサンプルの
コレクションを、プレート上に集め、そしてパネル１（正常な供給源および癌に
由来する細胞および細胞株を含有する）およびパネル２（正常な供給源および癌
に由来する組織（特に外科サンプルを含有する）と呼ぶ。
【０１９３】
最初に、ＲＮＡサンプルを、構成的に発現される遺伝子（例えば、β−アクチ
ンおよびＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたはｐｏ
ｌｙＡ＋約１ｎｇ）を、製造業者のプロトコルに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商
標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ
（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号
Ｎ８０８−０２３４）およびランダムな６量体を用いて、ｃＤＮＡに転換した。
反応を、２０μｌ中で実施し、そして４８℃で３０分間インキュベートした。次
いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコルに従って、β−ａｃｔｉｎ
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３１０８８１Ｅ）およびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ
（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カ
タログ番号４３１０８８４Ｅ）ならびにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタロ
グ番号４３０４４４７）を使用する、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、
別のプレートに移した。反応を、２５μｌ中で以下のパラメーターを用いて実施
した：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間／６０℃で１分間
（４０サイクル）。結果を、ＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルを越え
るサイクル）として対数目盛を使用して記録し、ここで、所定のサンプルと最も
低いＣＴ値を有するサンプルとの間でのＲＮＡ濃度の差分は、２のΔＣＴ乗とし
て表される。次いで、相対的な発現の割合を、このＲＮＡ差分の逆数をとり、そ
して１００を乗算することによって得る。β−アクチンおよびＧＡＰＤＨについ
て得られた平均のＣＴ値を使用して、ＲＮＡサンプルを正規化した。最も高いＣ
Ｔ値をもたらすＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要とせず、一方、全ての他
のサンプルは、それらのβ−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従って、この
サンプルに対して相対的に希釈した。
【０１９４】
正規化したＲＮＡ（５μｌ）をｃＤＮＡに転換し、そしてＯｎｅ Ｓｔｅｐ
ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを製造
業者の説明書に従って使用する、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。
プローブおよびプライマーを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓのＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ
ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ用バージョンＩ）
または同様のアルゴリズムに従って、入力として標的配列を使用して、それぞれ
のアッセイについて設計した。デフォルト設定を反応条件について使用し、そし
て以下のパラメーターを、プライマーの選択の前に設定した：プライマー濃度＝
２５０ｎＭ、プライマーの融解温度（Ｔｍ）範囲＝５８〜６０℃、プライマーの
最適Ｔｍ＝５９℃、最大のプライマー差分＝２℃、プローブは５’にＧを有さな
い、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃高くなければならない、ア
ンプリコンの大きさは７５ｂｐから１００ｂｐである。選択したプローブおよび
プライマー（下記を参照のこと）を、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔ
Ｘ，ＵＳＡ）によって合成した。プローブを、カップリングしていない色素を除
去するためにＨＰＬＣによって二重精製し、そしてプローブのそれぞれ５’およ
び３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを確認す
るために質量分析法によって評価した。それらの最終濃度は：順方向および逆方
向プライマーについてはそれぞれ９００ｎＭ、そしてプローブは２００ｎＭであ
った。
【０１９５】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化したＲＮＡを、９６ウェルの
ＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェ
ルにスポットした。ＰＣＲ溶液は、２つのプローブ（標的クローンに特異的なプ
ローブおよび標的プローブと多重化する別の遺伝子特異的プローブ）を含み、こ
れを１×ＴａｑＭａｎＴＭ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ ７７００について）を使用して、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（
ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕを１：１：１：２の比率で）、０．２５Ｕ／ｍｌ Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌ
ＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌ 逆転写酵素で設定した。
逆転写を、４８℃で３０分間、続いて以下のような増幅／ＰＣＲサイクルを実施
した：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サ
イクル。
【０１９６】
パネル１の結果においては、以下の略号を使用する：
ｃａ．＝癌腫
＊＝転移によって確立された
ｍｅｔ＝転移
ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ＝小細胞改変株
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮細胞
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水
ｇｌｉｏ＝神経膠腫
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０１９７】
（パネル２）
パネル２のプレートは、一般的には、２つのコントロールのウェルおよび９４
個の試験サンプルを含む。これらの試験サンプルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との親密に共同している
外科医によって入手されたヒト組織から単離したＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
組織は、ヒトの悪性腫瘍に由来し、そして示される場合、多くの悪性組織は、腫
瘍にすぐ隣接している非癌性組織から得られる「ぴったり沿った境界（ｍａｔｃ
ｈｅｄ ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらを、正常な隣接組織と呼び、そして
以下の結果において「ＮＡＴ」と記載する。腫瘍組織および「ぴったり沿った境
界」を、２人の別々の病理学者によって評価する（外科の病理学者、およびＮＤ
ＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者によって再度）。この分析は、腫瘍の分化の段階
の全体的な組織病理学的評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、もと
もとの外科の病理報告を含み、この報告は、患者の臨床段階に関する情報を提供
する。これらのぴったり沿った境界を、外科手術領域の周辺（すなわち、すぐ隣
接している）組織（表４においては正常な隣接組織を「ＮＡＴ」と明示する）か
ら採取する。さらに、ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または
突然死の被害者（事故など）について行った検死により種々のヒト組織から得た
。これらの組織は、疾患を有さないことが確認され、そしてこれを、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的な供給源から購入した。
【０１９８】
全てのサンプルに由来するＲＮＡの完全性を、指針としての２８Ｓおよび１８
ＳリボソームＲＮＡの染色強度比（２：１〜２．５：１の２８ｓ：１８ｓ）、お
よび分解産物の指標である低分子量のＲＮＡが存在しないことを使用して、アガ
ロースゲル電気泳動の視覚的な評価によって質を制御した。サンプルを、単一の
エキソンの範囲全体を増幅するように設計したプローブおよびプライマーのセッ
トを使用して、逆転写酵素の非存在下でＲＴＱ ＰＣＲ反応を実行することによ
り、ゲノムＤＮＡの混入に対して制御した。
【０１９９】
ＮＭＢのＴａｑＭａｎＴＭ発現プロフィールを、以下に示されるような特定の
遺伝子プローブおよびプライマーセット（Ａｇ ８１７）を使用して生成した：
【０２００】
【化２３】
表２に示されるこの結果は、４１個の正常ヒト組織および５５個のヒト癌細胞
株に関連し、そして黒色腫細胞株におけるＮＭＢの高い発現および乳癌細胞株Ｍ
ＤＡ−Ｎにおける過剰発現を示す。表３に示される結果は、さらなる腫瘍組織に
関連し、その多くの腫瘍組織が、サンプルを入手した執刀外科医により規定され
たように、正常な隣接組織（ＮＡＴ）とぴったりである。このことにより、ＮＭ
Ｂが、正常な腎臓またはＮＡＴのいずれかと比較して９／９の腎腫瘍で過剰発現
されることが明らかにされる。この分析は、ＮＭＢがまた、ＮＡＴと比較された
いくつかの肺癌腫組織、およびＮＡＴと比較された２つの黒色腫転移において過
剰発現されるというＮＭＢの発現を最初に同定したＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ
の結果を確証する。
【０２０１】
ＮＣＩのＣＧＡＰ Ｓａｇｅ分析は、ＮＭＢが、パネル１のＴａｑＭａｎ分析
と一致して、いくつかの神経膠腫（Ｈ３９２、プールしたＧＢＭ、ＧＢＭＨ１１
１０）、および１つの悪性胸部腫瘍（ＳＫＢＲ３）中で発現されることを示す。
「ボディーマップ」と呼ばれるＥＳＴの発現についてのＮＣＩデータは、ＮＭＢ
がシュワン細胞、腺癌腫およびｓ．細胞癌腫において発現されることを明らかに
する。
【０２０２】
ＮＭＢの遺伝子発現プロフィールおよびｐＭＥＬ１７とのＮＭＢの相同性に基
づいて、腎臓細胞癌腫、肺癌腫、黒色腫およびＣＮＳ癌を含むヒト腫瘍の部分集
合（ｓｕｂｓｅｔ）について、モノクローナル抗体を使用するＮＭＢの成功した
標的化は、腫瘍の増殖、マトリクスの浸潤および転移の拡がりに阻害効果を有す
ることが予想される。さらに、ＮＭＢの標的化は、ＴＳＣ疾患に治療的効果を有
する。さらに、ＮＭＢの潜在的な酵素活性を考慮すると、ＮＭＢは、低分子薬物
をスクリーニングするための標的として使用され得る。要約すれば、これらの結
果は、ＴＳＣの処置のための治療的標的としてのＮＭＢの関連性が、ＴＳＣに影
響されるいくつかの組織におけるＮＭＢの発現／過剰発現によって増強されるこ
とを示す。
【０２０３】
【表２】
【０２０４】
【表３】
（実施例２：ＣＹＲ６１の治療的標的化）
ＣＹＲ６１の遺伝子発現プロフィールに基づいて、腎臓細胞癌腫、肺癌腫、黒
色腫およびＣＮＳ癌を含むヒト腫瘍の部分集合について、モノクローナル抗体を
使用するＣＹＲ６１の成功した標的化は腫瘍の増殖、マトリクスの浸潤および転
移の拡がりに阻害効果を有することが予想される。さらに、ＣＹＲ６１の標的化
は、ＴＳＣ疾患に治療的効果を有する。
【０２０５】
（実施例３：ＮＥＴ−７の治療的標的化）
ＮＥＴ−７は、乳癌細胞株によって過剰発現され、そしてＮＥＴ−７は、ＥＲ
陽性細胞株ＭＣＦ７のエストラジオール処置によって調節される。ＮＥＴ−７の
遺伝子発現プロフィールに基づいて、ヒト腫瘍（特に胸部腫瘍）の部分集合につ
いて、モノクローナル抗体を使用するＮＥＴ−７の成功した標的化は、腫瘍の増
殖、マトリクスの浸潤および転移の拡がりに阻害効果を有することが予想される
。さらに、ＮＥＴ−７の標的化は、ＴＳＣ疾患のアドレノメデュリン前駆体（お
よびレセプター活性改変プロテイン１）に治療的効果を有する。
【０２０６】
ＮＥＴ−７は、いくつかの脈管系において、強力かつ持続性の血管拡張作用を
有する。アドレノメデュリンに加えて、別の低血圧性ペプチド、プロアドレノメ
デュリン由来ペプチド（ＰＡＭＰ）がまた、アドレノメデュリン前駆体からプロ
セスされることが見い出された。ＰＡＭＰは、末梢交感神経終末で神経伝達を阻
害するが、アドレノメデュリンは血管平滑筋を直接的に拡張する。アドレノメデ
ュリンは、高血圧、腎不全および鬱血性心不全の病原に関与し得る。レセプター
活性改変タンパク質（ＲＡＭＰ）は、カルシトニンレセプター様レセプター（Ｃ
ＲＬＲ）を細胞表面へ輸送する１回膜貫通タンパク質である。ＲＡＭＰ１に輸送
されたＣＲＬＲは、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターで
ある。ＲＡＭＰ１は、ＮＳＣで下方制御される。その活性のため、ＴＳＣ患者に
よるアドレノメデュリン前駆体の過剰発現は、いくつかのＴＳＣを説明し得る。
【０２０７】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明に関連して記載されているが、前述の説明は、例示
を意図するものであり、そして添付される特許請求の範囲の範囲によって規定さ
れる本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の局面、利点、
および改変は、上記の特許請求の範囲内にある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感
受性を診断または決定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞
集団を提供する工程、
（ｂ）該試験細胞集団中の１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｃ）該試験細胞集団中の該核酸配列の発現を、結節性硬化症複合体関連障害
に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照プロフィール
中の核酸配列の発現と比較する工程；ならびに
（ｄ）該試験細胞集団および該参照プロフィール中に該核酸配列の発現レベル
の差異が存在する場合、その差異を同定する工程、
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受
性を診断または決定する、方法。
【請求項１】
被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感
受性を診断または決定する方法であって、以下：
（ａ）該被験体から、ＴＳＣ１〜８、１０〜１２、１５〜１４１および１４２
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を発現し得る細胞を含む試験細胞
集団を提供する工程、
（ｂ）該試験細胞集団中の１つ以上の該核酸配列の発現を測定する工程；
（ｃ）該試験細胞集団中の該核酸配列の発現を、結節性硬化症複合体関連障害
に罹患していない被験体由来の少なくとも１つの細胞を含む参照プロフィール
中の核酸配列の発現と比較する工程；ならびに
（ｄ）該試験細胞集団および該参照プロフィール中に該核酸配列の発現レベル
の差異が存在する場合、その差異を同定する工程、
を包含する方法であって、
これによって、該被験体において、結節性硬化症複合体関連障害に対する感受
性を診断または決定する、方法。
【公開番号】特開２００８−１５４５８９（Ｐ２００８−１５４５８９Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９１（Ｐ２００８−９１）
【出願日】平成２０年１月４日（２００８．１．４）
【分割の表示】特願２００２−５４８１９１（Ｐ２００２−５４８１９１）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１０日（２００１．１２．１０）
【出願人】（３０１０６２３６３）キュラジェン コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月４日（２００８．１．４）
【分割の表示】特願２００２−５４８１９１（Ｐ２００２−５４８１９１）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１０日（２００１．１２．１０）
【出願人】（３０１０６２３６３）キュラジェン コーポレイション (18)
【Ｆターム（参考）】
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