線虫から抽出されるセリンプロテアーゼ阻害剤および抗凝固性タンパク質
【課題】抗凝固作用を提供するタンパク質の提供。
【解決手段】抗凝固作用を有し、1または複数のNAPドメインを有し、各NAPドメインが以下の配列:Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10(a)A1は7から8アミノ酸残基のアミノ酸配列であ る;b)A2はアミノ酸配列である;c)A3は3アミノ酸残基のアミノ酸配列である;d)A4はアミノ酸配列である;e)A5は3から4アミノ酸残基のアミノ酸配列である;f)A6はアミノ酸配列である;g)A7は1アミノ酸残基である:h)A8は11から12アミノ酸残基のアミノ酸配列である;i)A9 は5から7アミノ酸残基のアミノ酸配列である;およびj)A10はアミノ酸配列である;上記A2、A4、A6およびA10の各々は、それぞれ独立して選択される数の、独立して選択されるアミノ酸残基を有し、各配列は、各NAPドメインが合計約120未満のアミノ酸残基を有するように選択される)を含む、タンパク質。
【解決手段】抗凝固作用を有し、1または複数のNAPドメインを有し、各NAPドメインが以下の配列:Cys-A1-Cys-A2-Cys-A3-Cys-A4-Cys-A5-Cys-A6-Cys-A7-Cys-A8-Cys-A9-Cys-A10(a)A1は7から8アミノ酸残基のアミノ酸配列であ る;b)A2はアミノ酸配列である;c)A3は3アミノ酸残基のアミノ酸配列である;d)A4はアミノ酸配列である;e)A5は3から4アミノ酸残基のアミノ酸配列である;f)A6はアミノ酸配列である;g)A7は1アミノ酸残基である:h)A8は11から12アミノ酸残基のアミノ酸配列である;i)A9 は5から7アミノ酸残基のアミノ酸配列である;およびj)A10はアミノ酸配列である;上記A2、A4、A6およびA10の各々は、それぞれ独立して選択される数の、独立して選択されるアミノ酸残基を有し、各配列は、各NAPドメインが合計約120未満のアミノ酸残基を有するように選択される)を含む、タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
【数1−1】
【背景技術】
【0002】
【数1−2】
【0003】
【数2】
【0004】
【数3】
【0005】
【数4】
【0006】
【数5】
【0007】
【数6】
【0008】
【数7A−1】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明によって、以下が提供される。
【0010】
【数7−1】
【0011】
【数7−2】
【0012】
【数7−3】
【0013】
【数7−4】
【0014】
【数7−5】
【0015】
【数7−6】
【0016】
【数7−7】
【0017】
【数7−8】
【0018】
【数7−9】
【0019】
【数7−10】
【0020】
【数7−11】
【0021】
【数7−12】
【0022】
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【0023】
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【0024】
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【0060】
【数10】
【0061】
【数11】
【0062】
【数12】
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【数13】
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【数19−2】
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【0180】
【数135】
【図面の簡単な説明】
【0181】
【図1】図1はAcaNAP5 cDNA[配列番号3]のヌクレオチド配列を示す。番号付はcDNAの最初のヌクレオチドから始めている。翻訳の開始は最初のATGコドン(第14位);第2枠内ATGは20位に存在する。
【図2】図2は成熟AcaNAP5[配列番号4]のアミノ酸配列を示す。
【図3】図3はAcaNAP6 cDNA[配列番号5]のヌクレオチド配列を示す。番号付はcDNAの最初のヌクレオチドから始めている。翻訳は最初のATGコドン(第14位)から開始する;第2枠内ATGは20位に存在する。
【図4】図4は成熟AcaNAP6のアミノ酸配列[配列番号6]を示す。AcaNAP5と異なるアミノ酸には下線を付している。かかるアミノ酸の置換に加えて、AcaNAP6はAcaNAP5と比較した場合に2つのアミノ酸の欠失(プロ−プロ)を含む。
【図5】図5はプロ−AcaNAP5のアミノ酸配列[配列番号7]を示す。
【図6】図6はプロ−AcaNAP6のアミノ酸配列[配列番号8]を示す。プロ−AcaNAP5と異なるアミノ酸に下線を付した。かかるアミノ酸の置 換に加えて、プロ−AcaNAP6はプロ−AcaNAP5と比較した場合に2つのアミノ酸の欠失(プロ−プロ−)を含む。
【図7A−1】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4および AduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビ ナントcDNAは欠いている。
【図7A−2】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。 AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末 端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7B】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図7C】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図7D】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP4のリコンビナント cDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列番号11]を示す。図7Dは、 アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデスポリギルスから単離された HpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメイン を有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7E−1】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4および AduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビ ナントcDNAは欠いている。
【図7E−2】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。 AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末 端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7F】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図8A】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下 流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクローニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番 号18]リンカー配列が続いている。
【図8B】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下 流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクローニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番 号18]リンカー配列が続いている。
【図8C】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクロー ニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番号18]リンカー配列が続いている。
【図9】図9はリコンビナントcDNAのヌクレオチド配列、AcaNAPc2c DNA[配列番号19]を示す。cDNAの5’−末端に対応する EcoRI部位を示した(下線部分)。番号付けはこのEcoRI部位から開始している。演繹されたアミノ酸配列もまた示した;翻訳リーディングフレームは遺伝子6融合パートナーにより決定された。AcaNAPc2 cDNAはコーディング領域の5’末端部分を欠いている;AcaNAP5および AcaNAP6とのホモロジーにより最初の7つのアミノ酸残基が分泌シグナルに属することが示唆される。
【図10】図10Aおよび10Bは特定のNAPタンパク質がクエン酸化正常ヒト血漿のプロ−トロンビン時間(PT)(図10A)および活性化部分トロ ンボプラスチン時間(aPTT)(図10B)の測定値に及ぼす影響を調べたものである。黒丸は、Pro−AcaNAP5を;白抜き三角はAcaNAP5を(表2のAcaNAP5a);白抜き丸は天然のAcaNAP5の値を示す。
【図11−1】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−2】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開 示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基(1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有す る。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これらは第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]および AduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ 酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−3】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−4】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2 つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これらは第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からな り、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコー ドするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−5】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−6】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2 (d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の 残基の後に「end」という語を付した。
【図11−7】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−8】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−9】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図12】図12Aおよび12BはPバストリス(P.pastoris)pYAM7SP8発現/分泌ベクター(図12A)の地図およびこのベクター内 に含まれる配列(図12B)を示す[配列番号30]。図12Aに示されるように、このプラスミドは以下の要素が、メタノール誘導性AOX1プロ−モーター(5’AOX非翻訳領域内の濃矢印)およびAOX1転写終結シグナル(3’T)の間に挿入されている:酸ホスファターゼ分泌シグナル(S)をコードする合 成DNAフラグメント、Lys−Argプロ−セシング部位とともにKEX2プロ−テアーゼおよびマルチクローニング部位をコードする合成19−アミノ酸プロ−配列(P)。GS115形質転換において選択マーカーとなるHIS4遺伝子は部位特異的変位誘発によってStu1認識配列(HIS4*)が除去される よう、修飾されている。pBR322配列にはBla遺伝子およびE.coli内で増幅するための起点(Ori)を含有しており、これは一本線として示されている。図12BはpYAM7SP8内に導入される以下の連続的なDNA配列を示している;酸ホスファターゼ(PH01)分泌シグナル配列、プロ−配列お よびマルチクローニング部位(MCS)配列。PH01分泌シグナルのATG開始コドンに下線を付した。
【図13A】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45および AcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13B】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13C】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13D】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13E】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号 31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一 である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13GはリコンビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13Hはリコンビナント cDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタン パク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13F−1】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13F−2】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13G−1】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13Fはリコ ンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13GはリコンビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべて の配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13G−2】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13H】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図14】図14はリコンビナントcDNA分子NamNAPのヌクレオチドおよび演繹アミノ酸配列を示す[配列番号39]。
【図15】図15はAcaNAP5および低分子量ヘパリン(LMWH;エノキサパリン(登録商標))の抗血栓活性活性を、FeCl3人工血栓モデルによって調べた結果を示す。活性のデータは頸動脈における閉塞性血栓生成の発生率(%)によって示す(白丸)。血栓生成は被験剤の皮下投与(s.c.)の150分後から認められた。深部傷出血をFeCl3を加える以外は同様に処理した別のグループの動物において調べた(四角)。首の深部手術傷における血液の消失は、化合物の皮下投与から210分の間の合計として定量した。
【図16】図16は以下の方法により単離された成熟NAP一連のアミノ酸配列を示す:即ちAcaNAP5[配列番号40]、AcaNAP6[配列番号41]、AcaNAP48[配列番号42]、AcaNAP23[配列番号43]、AcaNAP24[配列番号44]、AcaNAP25[配列番号45]、AcaNAP44 [配列番号46]、AcaNAP31、42、46[配列番号47]、AceNAP4d1[配列番号48]、AceNAP4d2[配列番号49]、AceNAP45d1〔配列番号50]、AceNAP47d1[配列番号51]、AduNAP7d1[配列番号52]、AcaNAP45d2[配列番号 53]、AcaNAP47d2[配列番号54]、AduNAP4[配列番号55]、AduNAP7d2[配列番号56]、AceNAP5[配列番号57]、Ace−18一NAP7[配列番号58]、AcaNAPc2[配列番号59]、HpoNAP5[配列番号60]およびNamNAP[配列番号 61]である。各NAPドメインには10個のシステイン残基を含み、これらの基準に配列を一列に並べており、そしてシステインの間のアミノ酸を規定している。A1からA10はシステイン残基の間のアミノ酸配列を示す。
【図17】図17は2つのNAPドメインを有する成熟AceNAP4[配列番号62]のアミノ酸配列を示す。
【図18】図18は2つのNAPドメインを有する成熟AcaNAP45[配列番号63]のアミノ酸配列を示す。
【図19】図19は2つのNAPドメインを有する成熟AcaNAP47[配列番号64]のアミノ酸配列を示す。
【図20】図20は2つのNAPドメインを有する成熟AduNAP7[配列番号65]のアミノ酸配列を示す。
【技術分野】
【0001】
【数1−1】
【背景技術】
【0002】
【数1−2】
【0003】
【数2】
【0004】
【数3】
【0005】
【数4】
【0006】
【数5】
【0007】
【数6】
【0008】
【数7A−1】
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明によって、以下が提供される。
【0010】
【数7−1】
【0011】
【数7−2】
【0012】
【数7−3】
【0013】
【数7−4】
【0014】
【数7−5】
【0015】
【数7−6】
【0016】
【数7−7】
【0017】
【数7−8】
【0018】
【数7−9】
【0019】
【数7−10】
【0020】
【数7−11】
【0021】
【数7−12】
【0022】
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【0023】
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【0030】
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【0031】
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【0041】
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【数7−34】
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【数7−40】
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【数7−41】
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【0056】
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【0057】
【数7A−2】
【0058】
【数8】
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【数9】
【0060】
【数10】
【0061】
【数11】
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【数13】
【0064】
【数19−2】
【0065】
【数20】
【0066】
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【0080】
【数35】
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【0082】
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【数44】
【0090】
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【数80】
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【数127】
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【数128】
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【数129】
【0175】
【数130】
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【数131】
【0177】
【数132】
【0178】
【数133】
【0179】
【数134】
【0180】
【数135】
【図面の簡単な説明】
【0181】
【図1】図1はAcaNAP5 cDNA[配列番号3]のヌクレオチド配列を示す。番号付はcDNAの最初のヌクレオチドから始めている。翻訳の開始は最初のATGコドン(第14位);第2枠内ATGは20位に存在する。
【図2】図2は成熟AcaNAP5[配列番号4]のアミノ酸配列を示す。
【図3】図3はAcaNAP6 cDNA[配列番号5]のヌクレオチド配列を示す。番号付はcDNAの最初のヌクレオチドから始めている。翻訳は最初のATGコドン(第14位)から開始する;第2枠内ATGは20位に存在する。
【図4】図4は成熟AcaNAP6のアミノ酸配列[配列番号6]を示す。AcaNAP5と異なるアミノ酸には下線を付している。かかるアミノ酸の置換に加えて、AcaNAP6はAcaNAP5と比較した場合に2つのアミノ酸の欠失(プロ−プロ)を含む。
【図5】図5はプロ−AcaNAP5のアミノ酸配列[配列番号7]を示す。
【図6】図6はプロ−AcaNAP6のアミノ酸配列[配列番号8]を示す。プロ−AcaNAP5と異なるアミノ酸に下線を付した。かかるアミノ酸の置 換に加えて、プロ−AcaNAP6はプロ−AcaNAP5と比較した場合に2つのアミノ酸の欠失(プロ−プロ−)を含む。
【図7A−1】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4および AduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビ ナントcDNAは欠いている。
【図7A−2】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。 AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末 端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7B】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図7C】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図7D】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP4のリコンビナント cDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列番号11]を示す。図7Dは、 アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデスポリギルスから単離された HpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメイン を有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7E−1】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4および AduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビ ナントcDNAは欠いている。
【図7E−2】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデ ナール(Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単 離されたAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子 [配列番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソ モイデスポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。 AceNAP4およびAduNAP7はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末 端部分をこのリコンビナントcDNAは欠いている。
【図7F】図7Aから図7Fはアンサイロストマ セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、アンサイロストマ デュオデナール (Ancylostom a duodenale)およびヘリグモソモイデス ポリギルス(Heligmosomoides polygyrus)から単離された特定のNAPタンパク質cDNAのヌクレオチド配列および演繹されるアミノ酸配列を示す。図7Aは、アンサイロストマ セイラニカムから単離され たAcaNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号9]を示す。図7Bは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号10]を示す。図7Cは、アンサイロストマ セイラニカムから単離されたAcaNAP6のリコンビナントcDNA分子[配列 番号11]を示す。図7Dは、アンサイロストマ デュオデナールから単離されたAduNAP4のリコンビナントcDNA分子[配列番号12]を示す。図7Eは、アンサイロストマデュオデナールから単離されたAduNAP7のリコンビナントcDNA分子[配列番号13]を示す。図7Fは、ヘリグモソモイデ スポリギルスから単離されたHpoNAP5のリコンビナントcDNA分子[配列番号14]を示す。リコンビナントcDNA分子の5’一末端に対応するEcoRI部位はすべての配列において同一である(下線)。各配列の番号付けはこのEcoRI部位より開始している。AceNAP4およびAduNAP7 はそれぞれ2つのNAPドメインを有するタンパク質をコードする;この図に示した他のすべてのクローンは1個のNAPドメインを有するタンパク質をコードする。AduNAP4cDNAクローンは全長ではない、というのは他のアイソフォームにはある、コード領域の5’−末端部分をこのリコンビナントcDNA は欠いている。
【図8A】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下 流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクローニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番 号18]リンカー配列が続いている。
【図8B】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下 流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクローニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番 号18]リンカー配列が続いている。
【図8C】図8Aから図8CはそれぞれベクターpDONG61(図8A)[配列番号15]、pDONG62(図8B)[配列番号16]、および pDONG63(図8C)[配列番号17]のヌクレオチド配列を示す。図示されているHindIII−BamHIフラグメントはpUC119のHindIII部位とBamHI部位の間に存在している。これらのベクターはcDNAをSfiI−NotIフラグメントとして・糸状ファージ遺伝子6の下流の3つの異なるリーディングフレーム内へとクロー ニングすることができる。すべての関連制限部位を示している。373〜375位にあるAAAのLysをコードするトリプレットが遺伝子6の最後のコドンである。遺伝子6にコードされるタンパク質にはGly−Gly−Gly−Ser−Gly−Gly[配列番号18]リンカー配列が続いている。
【図9】図9はリコンビナントcDNAのヌクレオチド配列、AcaNAPc2c DNA[配列番号19]を示す。cDNAの5’−末端に対応する EcoRI部位を示した(下線部分)。番号付けはこのEcoRI部位から開始している。演繹されたアミノ酸配列もまた示した;翻訳リーディングフレームは遺伝子6融合パートナーにより決定された。AcaNAPc2 cDNAはコーディング領域の5’末端部分を欠いている;AcaNAP5および AcaNAP6とのホモロジーにより最初の7つのアミノ酸残基が分泌シグナルに属することが示唆される。
【図10】図10Aおよび10Bは特定のNAPタンパク質がクエン酸化正常ヒト血漿のプロ−トロンビン時間(PT)(図10A)および活性化部分トロ ンボプラスチン時間(aPTT)(図10B)の測定値に及ぼす影響を調べたものである。黒丸は、Pro−AcaNAP5を;白抜き三角はAcaNAP5を(表2のAcaNAP5a);白抜き丸は天然のAcaNAP5の値を示す。
【図11−1】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−2】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開 示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基(1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有す る。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これらは第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]および AduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ 酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−3】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−4】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2 つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これらは第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からな り、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコー ドするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−5】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−6】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2 (d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の 残基の後に「end」という語を付した。
【図11−7】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−8】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図11−9】図11は様々な線虫から単離されたNAP cDNAによりコードされる一連のアミノ酸配列を示す。AcaNAP5[配列番号20]、 AcaNAP6[配列番号21]およびAcaNAPc2[配列番号128]はアンサイロストマカニナム(Ancylostoma caninum)から単離されたものである。AceNAP5[配列番号22]、AceNAP7[配列番号23]、およびAceNAP4(AceNAP4d1[配列番号24]およ びAceNAP4d2[配列番号25])はアンサイロトマセイラニカムから単離されたものである。AduNAP4[配列番号26]およびAduNAP7(AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2(配列番号28])はアンサイロス トマデュオデナールから単離されたものである。 HpoNAP5[配列番号29]はヘリグモソモイデス ポリギルスから単離されたものである。この図に示されたアミノ酸配列は、図1、3、7Aから7Fおよび9に開示されたものである。成熟AcaNAP5[配列番号4]およびAcaNAP6[配列番号6](図2及び図4参照)は、10個のシステイン残基 (1から10まで番号を付し、太字で記載している)によってその性質の一部が決定されている。この図のすべてのアミノ酸配列には少なくとも1のNAPドメインを含有する。AceNAP4 cDNAは2つの隣接領域、AceNAP4d1[配列番号24]とAceNAP4d2[配列番号25]からなり、これら は第1(d1)および第2(d2)NAPドメインをコードする;同様に、AduNAP cDNAも2つの隣接領域AduNAP7d1[配列番号27]およびAduNAP7d2[配列番号28]からなり、それぞれ第1(d1)および第2(d2)のNAPドメインをコードする。すべてのNAP−ドメインの一連 のアミノ酸配列をシステインによって整理するシステインの列を保持するために特定の部位ヘダッシュ(−−−)を導入しているが・この記号は当該部位にアミノ酸が無いことを示している。cDNAがコードするタンパク質のカルボキシ末端の残基の後に「end」という語を付した。
【図12】図12Aおよび12BはPバストリス(P.pastoris)pYAM7SP8発現/分泌ベクター(図12A)の地図およびこのベクター内 に含まれる配列(図12B)を示す[配列番号30]。図12Aに示されるように、このプラスミドは以下の要素が、メタノール誘導性AOX1プロ−モーター(5’AOX非翻訳領域内の濃矢印)およびAOX1転写終結シグナル(3’T)の間に挿入されている:酸ホスファターゼ分泌シグナル(S)をコードする合 成DNAフラグメント、Lys−Argプロ−セシング部位とともにKEX2プロ−テアーゼおよびマルチクローニング部位をコードする合成19−アミノ酸プロ−配列(P)。GS115形質転換において選択マーカーとなるHIS4遺伝子は部位特異的変位誘発によってStu1認識配列(HIS4*)が除去される よう、修飾されている。pBR322配列にはBla遺伝子およびE.coli内で増幅するための起点(Ori)を含有しており、これは一本線として示されている。図12BはpYAM7SP8内に導入される以下の連続的なDNA配列を示している;酸ホスファターゼ(PH01)分泌シグナル配列、プロ−配列お よびマルチクローニング部位(MCS)配列。PH01分泌シグナルのATG開始コドンに下線を付した。
【図13A】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45および AcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13B】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13C】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13D】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13E】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号 31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一 である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13GはリコンビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13Hはリコンビナント cDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタン パク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13F−1】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13F−2】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13G−1】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13Fはリコ ンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13GはリコンビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべて の配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13G−2】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹ア ミノ酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13Dはリコンビナント cDNA分子AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコン ビナントcDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始め た。AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図13H】図13Aから図13Hはアンサイロストマ カニナムから単離された特定のNAPタンパク質のcDNAのヌクレオチド配列および演繹アミノ 酸配列を示す。図13AはリコンビナントcDNA分子AcaNAP23[配列番号31]を示す。図13BはリコンビナントcDNA分子AcaNAP24[配列番号32]を示す。図13CはリコンビナントcDNA分子AcaNAP25[配列番号33]を示す。図13DはリコンビナントcDNA分子 AcaNAP31、AcaNAP42およびAcaNAP46を示し、これらのすべては同一である[配列番号34]。図13EはリコンビナントcDNA分子AcaNAP44[配列番号35]を示す。図13FはリコンビナントcDNA分子AcaNAP45[配列番号36]を示す。図13Gはリコンビナント cDNA分子AcaNAP47[配列番号37]を示す。図13HはリコンビナントcDNAAcaNAP48[配列番号38]を示す。EcoRI部位はリコンビナントcDNA分子の5’−末端に対応するが、すべての配列において下線をひいて示している。各配列の番号付はこのEcoRI部位から始めた。 AcaNAP45およびAcaNAP47はそれぞれ2つのNAPドメインを含有するタンパク質をコードする;この図における他のすべてのクローンは一個のNAPドメインのみをコードする。
【図14】図14はリコンビナントcDNA分子NamNAPのヌクレオチドおよび演繹アミノ酸配列を示す[配列番号39]。
【図15】図15はAcaNAP5および低分子量ヘパリン(LMWH;エノキサパリン(登録商標))の抗血栓活性活性を、FeCl3人工血栓モデルによって調べた結果を示す。活性のデータは頸動脈における閉塞性血栓生成の発生率(%)によって示す(白丸)。血栓生成は被験剤の皮下投与(s.c.)の150分後から認められた。深部傷出血をFeCl3を加える以外は同様に処理した別のグループの動物において調べた(四角)。首の深部手術傷における血液の消失は、化合物の皮下投与から210分の間の合計として定量した。
【図16】図16は以下の方法により単離された成熟NAP一連のアミノ酸配列を示す:即ちAcaNAP5[配列番号40]、AcaNAP6[配列番号41]、AcaNAP48[配列番号42]、AcaNAP23[配列番号43]、AcaNAP24[配列番号44]、AcaNAP25[配列番号45]、AcaNAP44 [配列番号46]、AcaNAP31、42、46[配列番号47]、AceNAP4d1[配列番号48]、AceNAP4d2[配列番号49]、AceNAP45d1〔配列番号50]、AceNAP47d1[配列番号51]、AduNAP7d1[配列番号52]、AcaNAP45d2[配列番号 53]、AcaNAP47d2[配列番号54]、AduNAP4[配列番号55]、AduNAP7d2[配列番号56]、AceNAP5[配列番号57]、Ace−18一NAP7[配列番号58]、AcaNAPc2[配列番号59]、HpoNAP5[配列番号60]およびNamNAP[配列番号 61]である。各NAPドメインには10個のシステイン残基を含み、これらの基準に配列を一列に並べており、そしてシステインの間のアミノ酸を規定している。A1からA10はシステイン残基の間のアミノ酸配列を示す。
【図17】図17は2つのNAPドメインを有する成熟AceNAP4[配列番号62]のアミノ酸配列を示す。
【図18】図18は2つのNAPドメインを有する成熟AcaNAP45[配列番号63]のアミノ酸配列を示す。
【図19】図19は2つのNAPドメインを有する成熟AcaNAP47[配列番号64]のアミノ酸配列を示す。
【図20】図20は2つのNAPドメインを有する成熟AduNAP7[配列番号65]のアミノ酸配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗凝固作用を有し、1または複数のNAPドメインを有し、各NAPドメインが以下の配列:
Cys−A1−Cys−A2−Cys−A3−Cys−A4−Cys−A5−Cys−A6−Cys−A7−Cys−A8−Cys−A9−Cys−A10(式中、
(a)A1は7から8アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(b)A2はアミノ酸配列である;
(c)A3は3アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(d)A4はアミノ酸配列である;
(e)A5は3から4アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(f)A6はアミノ酸配列である;
(g)A7は1アミノ酸残基である:
(h)A8は11から12アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(i)A9は5から7アミノ酸残基のアミノ酸配列である;および
(j)A10はアミノ酸配列である;
上記A2、A4、A6およびA10の各々は、それぞれ独立して選択される数の、独立して選択されるアミノ酸残基を有し、各配列は、各NAPドメインが合計約120未満のアミノ酸残基を有するように選択される)
を含む、単離されたタンパク質。
【請求項1】
抗凝固作用を有し、1または複数のNAPドメインを有し、各NAPドメインが以下の配列:
Cys−A1−Cys−A2−Cys−A3−Cys−A4−Cys−A5−Cys−A6−Cys−A7−Cys−A8−Cys−A9−Cys−A10(式中、
(a)A1は7から8アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(b)A2はアミノ酸配列である;
(c)A3は3アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(d)A4はアミノ酸配列である;
(e)A5は3から4アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(f)A6はアミノ酸配列である;
(g)A7は1アミノ酸残基である:
(h)A8は11から12アミノ酸残基のアミノ酸配列である;
(i)A9は5から7アミノ酸残基のアミノ酸配列である;および
(j)A10はアミノ酸配列である;
上記A2、A4、A6およびA10の各々は、それぞれ独立して選択される数の、独立して選択されるアミノ酸残基を有し、各配列は、各NAPドメインが合計約120未満のアミノ酸残基を有するように選択される)
を含む、単離されたタンパク質。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A−1】
【図7A−2】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E−1】
【図7E−2】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11−1】
【図11−2】
【図11−3】
【図11−4】
【図11−5】
【図11−6】
【図11−7】
【図11−8】
【図11−9】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F−1】
【図13F−2】
【図13G−1】
【図13G−2】
【図13H】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A−1】
【図7A−2】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E−1】
【図7E−2】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11−1】
【図11−2】
【図11−3】
【図11−4】
【図11−5】
【図11−6】
【図11−7】
【図11−8】
【図11−9】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F−1】
【図13F−2】
【図13G−1】
【図13G−2】
【図13H】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【公開番号】特開2007−145851(P2007−145851A)
【公開日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−356647(P2006−356647)
【出願日】平成18年12月28日(2006.12.28)
【分割の表示】特願2005−304883(P2005−304883)の分割
【原出願日】平成7年10月17日(1995.10.17)
【出願人】(501031471)コーバス インターナショナル, インコーポレイテッド (2)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年12月28日(2006.12.28)
【分割の表示】特願2005−304883(P2005−304883)の分割
【原出願日】平成7年10月17日(1995.10.17)
【出願人】(501031471)コーバス インターナショナル, インコーポレイテッド (2)
【Fターム(参考)】
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