肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質（ＰｓａＡ）に関する結合メンバー
本発明は、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバー、特に少なくとも２つの結合ドメインを有する結合メンバー、診断方法ならびに処置のための上記結合メンバーの使用、に関する。好ましい実施形態において、上記結合メンバーは、抗体（例えば、ヒト抗体、またはそのフラグメント）であり、それはまた、二重特異性抗体であり得る。上記結合メンバーは、連鎖球菌属、特に肺炎連鎖球菌に関する疾患および障害を予防および処置するための薬学的組成物での使用に適する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバー、特に少なくとも２つの結合ドメインを有する結合メンバー、診断方法ならびに処置のための上記結合メンバーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
肺炎連鎖球菌は、生命を脅かす細菌感染の主な原因の１つである。発展途上国において、数百万の５才未満の子供が、毎年肺炎連鎖球菌が原因で死亡すると推定されている（３）。工業化した世界では、肺炎連鎖球菌肺炎の発生率は、１００，０００人あたり５人〜１０人であり、そしてその致死率は５％〜７％である。肺炎連鎖球菌髄膜炎は、１００，０００人あたり１人〜２人に発生し、致死率は３０％〜４０％である（１４）。肺炎連鎖球菌は、菌血の最も多い原因の１つである。肺炎連鎖球菌は、中耳炎を有する子供から単離される最も多い生物体である。６才未満の全ての子供のうちの約７５％は、中耳炎に苦しむ。
【０００３】
肺炎連鎖球菌は、対または短連鎖で増殖するグラム陽性細菌である。その表面は、３つの層（莢膜、細胞壁および形質膜）から構成されている。莢膜は、最も厚い層であり、増殖する肺炎連鎖球菌の内部構造を完全に隠す。オリゴ糖類（多糖類）の反復単位のポリマーが、その莢膜を占めている。異なる血清型が、それらの莢膜の一部としてリビトール、アラビチノール（ａｒａｂｉｔｉｎｏｌ）またはホスホリルコリンを含み、血清型に特異的な化学的構造を生ずる。細胞壁は、ペプチドグリカンからなるが、テイコ酸およびリポテイコ酸からもなる。形質膜は、細胞を取り包みそして種々の分子をその表面へ固定する、二重リン脂質膜である（２）。
【０００４】
現在、肺炎連鎖球菌の莢膜の多様性に基づいて、９０種類の異なる型の肺炎連鎖球菌が認識されている（２６）。この莢膜は、肺炎連鎖球菌感染の病原において重要である。１つの莢膜型に対して生じる抗体は、この型の感染からの防御を提供するが、他の莢膜型の感染に対しては提供しない。現在の２３の結合価の多糖類ワクチンは、最も多い血清型の６０％〜８５％よりも多くからの防御を提供する。
【０００５】
細胞壁は、２つの多糖類（Ｃ−多糖類（Ｃ−ＰＳ）（テイコ酸およびペプチドグリカン）およびＦ−抗原（リポテイコ酸、フォルスマン抗原））を含む（２６）。肺炎連鎖球菌以外の細菌は、Ｃ−ＰＳ（例えば、α−連鎖球菌属）を含む（１２）。Ｆ−抗原は、連鎖球菌性の群Ｃ多糖類と交差反応する（２９）。莢膜多糖類に対するいくつかの抗体は、おそらくＣ−ＰＳと交差反応する。なぜなら、これらは、共有結合しているからである。抗Ｃ−ＰＳ抗体の防御的な役割は、議論の余地がある。なぜなら、いくつかの研究は、マウスにおいてこれらの抗体が防御的であることを見出しているが（６）、他の研究は見出していないからである（２０；２８）。防御の欠如は、Ｃ−ＰＳの莢膜隠匿（ｃａｐｓｕｌａｒ ｃｏｎｃｅａｌｍｅｎｔ）によってもたらされると考えられている。Ｃ−ＰＳに対する抗体は、無莢膜の菌株によって感染される宿主を防御するか、またはその莢膜を落とす減衰する肺炎連鎖球菌に結合し得る。Ｆ−抗原を用いるマウスの免疫は、肺炎連鎖球菌感染に対して防御しない（４）。
【０００６】
肺炎球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）は、３７−ｋＤａの表面タンパク質である。ＰｓａＡに関するモノクローナル抗体は、２４の異なる莢膜を有する肺炎連鎖球菌の溶解物のうちの２４と反応し、そして多くの他の細菌のどれとも反応しなかった（２３）。２３の莢膜血清型を示す８０の菌株由来のｐｓａＡ遺伝子のＲＦＬＰ分析は、それらが高度に保存されることを示した（２４）。ＰｓａＡを用いるマウスの免疫は、３型肺炎連鎖球菌に対する防御を提供した（３２）。ネイティブのＰｓａＡは、標準的な方法によって精製される（２５；３３）。組換えＰｓａＡは、バキュロウイルスベクター系において発現され得る（１０）。抗ｒＰｓａＡ免疫血清は、コントロールマウスと比較して、肺炎連鎖球菌血清型６Ｂに対してマウスに防御を与えた（１０）。少なくとも６つの異なるモノクローナル抗体が報告され（９；２３）、そして診断目的のために提案されたが、肺炎連鎖球菌に関連する疾患の処置は、これらの抗体と共には提案されていない。
【０００７】
ＩｇＡからＰｓａＡは、２才未満の子供（２６１人中１９３人）および成人（１７人中１７人）由来の唾液中に検出可能である（３４）。抗ＰｓａＡ ＩｇＧは、ＥＩＡによって２才未満のほとんどの子供（１１０８人中８７２人）およびほとんどの成人（３２５人中２６２人）に検出可能であった（３５）。セロコンバージョンは、キャリアの状態に関連があった。すなわち、鼻咽頭標本または中耳標本から培養される肺炎連鎖球菌を有したことのある子供は、抗ＰｓａＡ ＩｇＧ陽性になる可能性が高かった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバーに関し、その結合メンバーは、連鎖球菌属、特に肺炎連鎖球菌に関する疾患および障害を予防および処置するための薬学的組成物での使用に適する。
【０００９】
それゆえ、１つの実施形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された結合メンバーに関し、その結合ドメインは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する。好ましくは、上記結合ドメインを含む結合メンバーは、上で規定される解離定数Ｋｄを有する。
【００１０】
その高結合力に起因して、上記結合メンバーは、薬学的組成物での使用に適する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、少なくとも第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含む、単離された結合メンバーに関し、その第一結合ドメインは、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能である。
【００１２】
本発明による結合メンバーは、好ましくは、抗体または抗体のフラグメントである。この抗体は、当業者に公知の任意の適切な方法によって産生され得るが、その結合メンバーの少なくとも一部は、組換え技術を通じて産生されることが好ましい。それゆえ、本発明は、１つの局面において、上述されるような結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子、ならびに、上で規定される核酸分子を含むベクターおよび上で規定される核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、上で規定されるような結合メンバーの少なくとも一部を発現するように操作された細胞株に関し、より好ましくは、上で規定されるような全結合メンバーを発現するように操作された細胞株に関する。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法に関し、その方法は、
その個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを生物学的サンプルに添加する工程、
その生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによってその疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する。
【００１５】
また、上記方法において、本発明は、さらに、上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含むキットに関し、その結合メンバーは、診断方法での使用のために標識される。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含む薬学的組成物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、肺炎連鎖球菌に関連する障害または疾患（例えば、肺炎、髄膜炎および／または敗血症）の処置または予防用の薬学的組成物の生成のための、上で規定されるような結合メンバーの使用に関する。
【００１８】
なおさらなる局面において、本発明は、上で規定されるような結合メンバーの有効量を投与することによって、肺炎連鎖球菌に関連する障害または疾患（例えば、肺炎、髄膜炎および／または敗血症）に苦しむ個体を処置または防御するための方法に関する。
【００１９】
（配列表）
（配列番号および名称）
配列番号１：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号４：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号５：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号６：ＣＤＲ４抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号７：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号８：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号９：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１０：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１１：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１２：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１３：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１４：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１５：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１６：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１７：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号１８：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号１９：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２０：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２１：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２２：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２３：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２４：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２５：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号２６：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号２７：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号２８：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号２９：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号３０：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号３１：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号３２：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号３３：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３４：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３５：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３６：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３７：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３８：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３９：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号４０：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号４１：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４２：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４３：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４４：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４５：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４６：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４７：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４８：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４９：ＰｓａＡ Ａ−改変体ＤＮＡ配列
配列番号５０：ＰｓａＡ Ａ−改変体アミノ酸配列
配列番号５１：ペプチド９１３６
配列番号５２：ペプチド９１３７
配列番号５３：ペプチド９１３８
配列番号５４：ＰｓａＡ １−６５アミノ酸配列
配列番号５５：ＰｓａＡ ＤＮＡ配列
配列番号５６：ＰｓａＡ アミノ酸配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（定義）
親和力：レセプターとそれらのリガンドとの間（例えば、抗体とその抗原との間）の結合する力。
【００２１】
アビディティ：抗体の、その抗原と機能的に結合する力であり、その抗原は、そのエピトープとパラトープとの間の反応の親和力、ならびにその抗体および抗原の結合価の両方に関連する。
【００２２】
アミノ酸残基：そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、好ましくは、「Ｌ」異性体形態である。しかし、所望の機能的特性が上記ポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体形態の残基は、任意のＬ−アミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基をいう。標準ポリペプチドと一致して、アミノ酸残基の略称が、以下の対応表に示される。
【００２３】
（対応表）
（記号）
１文字 ３文字 アミノ酸
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ スレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｚ Ｇｌｘ Ｇｌｕおよび／またはＧｌｎ
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｂ Ａｓｘ Ａｓｎおよび／またはＡｓｐ
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｘ Ｘａａ 不明またはその他
本明細書に式で表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端にかけての従来の方向に、左から右の方向を有することに注意するべきである。さらに、成句「アミノ酸残基」は、対応表に列挙されるアミノ酸ならびに改変されたアミノ酸および異常なアミノ酸を含むように広く規定される。その上、アミノ酸残基配列の開始部分または終止部分におけるダッシュ記号は、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、またはアミノ末端基（例えば、ＮＨ２またはアセチル基）への共有結合もしくはカルボキシ末端基（例えば、ＣＯＯＨ）への共有結合を示すことに注意すべきである。
【００２４】
抗体：種々の文法的な形において、用語、抗体は、本明細書において免疫グロブリン分子、および本発明の組成物の免疫グロブリン分子（すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子）の免疫学的に活性な部分をいうように使用される。典型的な抗体分子は、無傷な免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして当該分野において公知のそれらの部分を含む）である。Ｆａｂの模式図が、図１に示されている。本明細書において使用される場合、用語「抗体」はまた、ヒト抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにそのような抗体の結合フラグメントまたはそのような抗体の改変形の結合フラグメント（例えば、抗体分子由来の少なくとも１つの抗原結合決定基を有する、多重特異性分子、二重特異性分子およびキメラ分子）を含むことが意図される。
【００２５】
抗体クラス：その重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには少なくとも５つの主要なクラスがあり（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、そして、これらのクラスのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ配列に基づいて、２つの明確に区別される型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに割り当てられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
【００２６】
抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびに超可変領域を含む抗体分子のその構造部分である。種々の形の用語、免疫反応は、抗原決定基含有分子と抗原結合部位を含む分子（例えば、全抗体分子またはその部分）との間の特異的結合を意味する。あるいは、抗体結合部位は、抗原結合部位として公知である。
【００２７】
塩基対（ｂｐ）：二重鎖ＤＮＡ分子におけるチミン（Ｔ）とアデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の連携。ＲＮＡにおいては、ウラシル（Ｕ）が、チミンの代わりに用いられる。
【００２８】
結合メンバー：肺炎連鎖球菌タンパク質のエピトープに結合し得る（特に、ＰｓａＡに特異的に結合し得る）ポリペプチド。
【００２９】
結合ドメイン：抗原に特異的に結合する抗原結合部位。結合メンバーは、多重特異的であり得、そして２つの免疫学的に異なる抗原に特異的に結合する２つ以上の結合ドメインを含み得る。
【００３０】
キメラ抗体：可変領域がある動物種に由来し、そして定常領域が別の動物の種に由来する抗体。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒトの定常領域を有する抗体であり得る。
【００３１】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二重鎖構成をとる場合、通常対になるヌクレオチド。
【００３２】
相補性決定領域またはＣＤＲ：抗体認識ドメインおよび抗体結合ドメインを共に形成する、抗体のＶ−ドメイン内の領域。
【００３３】
相補的ヌクレオチド配列：ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子のヌクレオチド配列であって、別の一本鎖のヌクレオチド配列に十分に相補的であり、結果として生じる水素結合により特異的にその一本鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００３４】
保存される：ヌクレオチド配列が予め選択された配列の正確な相補体にランダムでなくハイブリダイズする場合、そのヌクレオチド配列は、予め選択された（参照）配列に関して保存される。
【００３５】
保存的置換：本明細書において使用される場合、用語、保存的置換は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例としては、１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別のものへの置換、または１つの極性残基の別のものへの置換（例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、グルタミンのアスパラギンへの置換、等）が挙げられる。用語、保存的置換はまた、置換されたポリペプチドを有する分子もまた同じ機能を有するという条件で、置換されていない元のアミノ酸の代わりでの置換されたアミノ酸の使用を含む。
【００３６】
定常領域または定常ドメインまたはＣ−ドメイン：定常領域は、そこで保存的置換を含み得る所定のアイソタイプの中にアミノ酸残基配列を含む抗体分子のそれらの構造部分である。例示的な重鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＨ５として当該分野で公知の免疫グロブリン分子のそれらの部分である。例示的な軽鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＬとして当該分野で公知の免疫グロブリンのその部分である。
【００３７】
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）：この用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいい、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインの間で対になるには短すぎるリンカーを使用して、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対にされ、そして２つの抗原結合部位が生み出される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）でより十分に記載されている。
【００３８】
解離定数、Ｋｄ：レセプターとそのリガンド（例えば、抗体とその抗原）との間の結合力（または親和力またはアビディティ）を記載する尺度。Ｋｄが小さいほど、結合は強い。
【００３９】
下流：配列転写または読み上げの方向で、ＤＮＡの非コード鎖に沿った３’から５’方向またはＲＮＡ転写に沿った５’から３’方向に移動するＤＮＡ配列にさらに沿うこと。
【００４０】
二重鎖ＤＮＡ：二重鎖の塩基対に存在する相補的塩基の各々の間を１つ以上の水素結合で結合される実質的に相補的ポリヌクレオチドの２つの鎖を含む、二本鎖核酸分子。塩基対を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド塩基またはデオキシリボヌクレオチド塩基のいずれかであり得るので、成句「二重鎖ＤＮＡ」は、２つのＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（ｄｓＤＮＡ）または１つのＤＮＡ鎖および１つのＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のいずれかをいう。
【００４１】
融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチドおよび２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチドに作動可能に連結する連結配列（ｌｉｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなるポリペプチド。融合ポリペプチドに連結された２つのポリペプチドは、代表的には２つの独立した供給源に由来し、それゆえ融合ポリペプチドは、天然では通常連結されるとは見られない２つの連結ポリペプチドを含む。
【００４２】
Ｆｖ：ＶＨおよびＶＬの両方を含む、二重鎖抗体フラグメント。
【００４３】
遺伝子：ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。
【００４４】
ヒト抗体フレームワーク：ヒト免疫グロブリンに由来する、抗原結合部位を有し、その分子の本質的に残りすべてがヒト免疫グロブリン由来の部分である、分子。
【００４５】
ヒト化抗体フレームワーク：非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有するのに対して、その分子の残りの免疫グロブリン由来の部分のいくらかまたはすべては、ヒト免疫グロブリンに由来する、分子。その抗原結合部位は、１つ以上のヒト定常ドメインに融合する非ヒト免疫グロブリン由来の完全な可変ドメイン、または可変ドメインの適切なヒトフレームワーク領域に移植される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含み得る。ヒト化抗体では、ＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体に由来し得、そして抗体の他の領域は、ヒト由来である。
【００４６】
ハイブリダイゼーション：相補的塩基対の間の水素結合の確立によって二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成する、実質的に相補的なヌクレオチド配列の対形成（核酸の鎖）。ハイブリダイゼーションは、競合的に阻害され得る２つの相補的ポリヌクレオチドの間の特異的な（すなわち、ランダムでない）相互作用である。
【００４７】
免疫グロブリン：血清抗体であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤが挙げられる。
【００４８】
免疫グロブリンアイソタイプ：異なるＨ鎖を有するＩｇに与えられる名称。その名称は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、２、３、４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、２）、ｓＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤである。
【００４９】
免疫学的に異なる：成句、免疫学的に異なるは、２つのポリペプチドを区別する能力をいい、そのポリペプチドの一方に特異的に結合し、そして他方のポリペプチドに特異的に結合しない抗体の能力に関する。
【００５０】
個体：一定の状態（特に、以下に規定される「感染症」）に感受性であることを必要とする、生存する動物またはヒト。被験体は、抗原刺激および増殖因子刺激に反応し得る白血球を有する生物体である。好ましい実施形態において、被験体は、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス）が挙げられる）である。最も好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００５１】
感染症：連鎖球菌属の１種以上（特に肺炎連鎖球菌）によりもたらされる障害。
【００５２】
単離された：天然の環境の構成要素から同定されおよび分離されおよび／または回収され、本明細書によって開示される種々の結合メンバー、ポリペプチドおよびヌクレオチドを記載するために使用される。その天然の環境の汚染要素は、そのポリペプチドの診断上の使用もしくは治療上の使用に通常干渉する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク様溶質または非タンパク様溶質を含み得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、精製される。
【００５３】
標識および表示手段：種々の文法的な形において、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接的にまたは間接的に関与する単一の原子および分子をいう。
【００５４】
モノクローナル抗体：種々の文法的な形において、成句、モノクローナル抗体は、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位のうち１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体は、代表的にそれが免疫反応する任意の抗原に対し単一の結合親和力を示す。モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対し免疫特異性である複数の抗体結合部位を有する抗体分子（例えば、二重特異性モノクローナル抗体）を含み得る。
【００５５】
マルチマーの：１つより多くのポリペプチドを含むポリペプチド分子。マルチマーは、ダイマーで２つのポリペプチドを含み得、そしてマルチマーはトリマーで３つのポリペプチドを含み得る。マルチマーは、ホモマーで２つ以上の同一のポリペプチドを含むか、またはマルチマーはヘテロマーで２つ以上の同一でないポリペプチドを含み得る。
【００５６】
核酸：ヌクレオチドのポリマーであって、単鎖または二重鎖のいずれかである。
【００５７】
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸塩、および窒素含有複素環式塩基からなる、ＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位。その塩基は、グリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、そして塩基と糖とのその組み合わせが、ヌクレオシドである。そのヌクレオシドが、ペントースの３’または５’位に結合されるリン酸基を含む場合、それはヌクレオチドといわれる。作動可能に連結されるヌクレオチドの配列は、本明細書において代表的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」（およびそれらの文法的に相当するもの）といわれ、そして本明細書において、その左から右方向が従来の５’末端から３’末端の方向とする式で示される。
【００５８】
ヌクレオチド類似体：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵと構造的に異なるが、核酸分子中の通常のヌクレオチドと置き換わるのに十分類似するプリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチド。
【００５９】
肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）：肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と同意語として使用される。
【００６０】
ポリクローナル抗体：ポリクローナル抗体は、特定の所定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、それゆえ、ポリクローナル抗体は、その抗原内の異なるエピトープを認識し得る。
【００６１】
ポリヌクレオチド：単鎖ヌクレオチドまたは二重鎖ヌクレオチドのポリマー。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」（およびその文法的に相当するもの）は、全範囲の核酸を包含する。ポリヌクレオチドは、代表的に２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの直鎖からなる核酸分子をいう。その正確な大きさは、多くの因子に依存し、同様にその因子は、当該分野で周知のように使用の最終状態に依存する。本発明のポリヌクレオチドとしては、プライマー、プローブ、ＲＮＡ／ＤＮＡセグメント、オリゴヌクレオチドまたは「オリゴ」（比較的短いポリヌクレオチド）、遺伝子、ベクター、プラスミド等が挙げられる。
【００６２】
ポリペプチド：成句、ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基の間のアミド結合以外の結合を含まないアミノ酸残基を含む分子をいう。
【００６３】
レセプター：レセプターは、別の分子と特異的に（ランダムではなく）結合し得る分子（例えば、タンパク質、糖タンパク質等）である。
【００６４】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：２つのＤＮＡセグメントを作動可能に連結することによって産生されるＤＮＡ分子。従って、組換えＤＮＡ分子は、天然には通常共に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を有さない（すなわち、進化的に異なる）ｒＤＮＡは、「異種」といわれる。
【００６５】
特異性：用語、特異性は、ポリペプチドの所定の抗原と免疫反応する（特異的に結合する）潜在的な抗原結合部位の数をいう。そのポリペプチドは、１つのポリペプチドであっても、ジスルフィド結合によって結合される２つ以上のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、単一特異性で抗原に特異的に結合する１つ以上の抗原結合部位を含み得、またはポリペプチドは二重特異性であり２つの免疫学的に異なる抗原に特異的に結合する２つ以上の抗原結合部位を含み得る。従って、ポリペプチドは、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合する、複数の抗原結合部位を含み得る。
【００６６】
血清型：種々の特徴において互いに異なる多くの菌株からなる連鎖球菌属の種の中の細菌の識別。血清型を規定する通常使用される特徴は、特定の抗原分子である。
【００６７】
単鎖抗体またはｓｃＦｖ：成句、単鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部位を含む単一のポリペプチドをいう。その上、ＦｖフラグメントのＨ鎖およびＬ鎖は、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、直接かまたはペプチドを介してかのいずれかによって連結され得る。例えば、組換え技術によって、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする、合成リンカーが作製され得る（単鎖抗体、ｓＡｂとして公知である；Ｂｉｒｄら １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら １９８８ ＰＮＡＳ ８５：５８７９−５８８３）。そのような単鎖抗体はまた、用語「抗体」の中に包含され、多重特異性結合分子の設計および操作において結合決定基として利用され得る。
【００６８】
上流：ＤＮＡ転写の方向に対して反対方向に、それゆえ非コード鎖の５’から３’へ、またはｍＲＮＡの３’から５’へ進むこと。
【００６９】
結合価：用語、結合価は、ポリペプチド中の潜在的な抗原結合部位（すなわち、結合ドメイン）の数をいう。ポリペプチドは、一価で１つの抗原結合部位を含み得るか、またはポリペプチドは二価で２つの抗原結合部位を含み得る。さらに、ポリペプチドは、四価で４つの抗原結合部位を含み得る。各抗原結合部位は、１つの抗原に特異的に結合する。ポリペプチドが、１つより多くの抗原結合部位を含む場合、各抗原結合部位は、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合し得る。従って、ポリペプチドは、複数の抗原結合部位を含み得、それゆえ多価であり得、ポリペプチドは、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合し得る。
【００７０】
Ｖドメイン：可変ドメインは、抗原結合部位を形成するアミノ酸残基配列を含む抗体分子のその構造部分である。典型的な軽鎖免疫グロブリン可変領域は、ＶＬとして当該分野において公知の免疫グロブリン分子のその部分である。
【００７１】
ＶＬ：軽鎖の可変ドメイン。
【００７２】
ＶＨ：重鎖の可変ドメイン。
【００７３】
ベクター：細胞中で自発的に複製可能であり、ＤＮＡセグメント（例えば、遺伝子またはポリヌクレオチド）の複製を引き起こすようにその結合するセグメントを、作動可能に連結し得る、ｒＤＮＡ分子。１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導き得るベクターは、本明細書において「発現ベクター」といわれる。特に重要なベクターは、逆トランスクリプターゼを使用して産生されるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）のクローニングを可能にする。
【００７４】
（説明）
上に記載されるように、本発明は、結合メンバー、特に肺炎連鎖球菌タンパク質（より具体的には肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質（ＰｓａＡ））を特異的に認識しそれに結合することが可能である抗体またはそのフラグメント、に関する。本発明による結合メンバーは、肺炎連鎖球菌によってもたらされる疾患の処置、ならびに上記細菌を検出する診断方法およびキットに使用されるのに特に有用である。肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質は、好ましくは、図１５（配列番号５０）または配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７５】
従って、本発明による結合メンバーは、好ましくは、免疫学的に活性である（例えば、抗体として、例えば、抗原に結合可能であり、抗原を免疫活性細胞に提示可能である）べきであり、それによって上記抗原の食菌作用を促進する。
【００７６】
特に、その結合メンバーは、抗体（例えば、当該分野において公知の任意の適切な抗体）であり、特に、本明細書に規定されるような抗体（例えば、抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメント）、または単鎖抗体である。抗体分子は、代表的に、ジスルフィド結合によって一緒に共有結合される、４つのポリペプチド、２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖からなる基本単位を有する、Ｙ型分子である。これらの鎖の各々は、別々のドメインに折りたたまれている。重鎖および軽鎖の両方のＣ末端領域は、配列中に保存され、定常領域と呼ばれる（Ｃドメインとしても公知である）。Ｎ末端領域（Ｖドメインとしても公知である）は、配列において可変であり、そして抗体特異性に関与する。抗体は、主にＶドメインに位置する６つの短い相補性決定領域（図１を参照のこと）を通じて、抗原を特異的に認識し、それに結合する。
【００７７】
本発明による抗体は、特に有用である。なぜなら、それらは、ＰｓａＡに対して強い親和力を有するからである。
【００７８】
それゆえ、本発明による結合メンバーは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する、結合ドメインを有する。より好ましくは、１×１０−７Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄ、より好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは５×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは５×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満である。
【００７９】
ＰｓａＡに対する結合メンバーの親和力は、好ましくは、実施例３に記載されるように測定される。
【００８０】
上記結合メンバーは、好ましくは、上に規定されるような単離された結合メンバーであり、より好ましくは、単離された、純粋な結合メンバーである。
【００８１】
（相補性決定領域）
理論に束縛されることなく、高結合力は、以下に示される配列の１つ以上の次のモチーフを有するアミノ酸配列を結合ドメインに組み込むことによってもたらされると考えられている。
【００８２】
より具体的には、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ１領域を含む：
配列番号２：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号１０：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号１８：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号２６：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号３４：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号４２：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
そして／または、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ２領域を含む：
配列番号４：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号１２：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号２０：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号２８：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号３６：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号４４：図１８Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
そして／または、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ３領域を含む：
配列番号６：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号１４：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号２２：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号３０：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号３８：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号４６：図１８Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
より好ましくは、上記結合ドメインの可変部分は、以下から選択される配列、または、そのホモログ（ここで、ホモログは、本明細書の他のところで規定される）を含む：
配列番号８：図１６Ａのアミノ酸配列
配列番号１６：図１６Ｂのアミノ酸配列
配列番号２４：図１７Ａのアミノ酸配列
配列番号３２：図１７Ｂのアミノ酸配列
配列番号４０：図１８Ａのアミノ酸配列
配列番号４８：図１８Ｂのアミノ酸配列。
【００８３】
より好ましくは、上記結合ドメインは、以下の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のセットを含む：
アミノ酸配列セット配列番号２またはそのホモログ、配列番号４またはそのホモログ、および配列番号６またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号１０またはそのホモログ、配列番号１２またはそのホモログ、および配列番号１４またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号１８またはそのホモログ、配列番号２０またはそのホモログ、および配列番号２２またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号２６またはそのホモログ、配列番号２８またはそのホモログ、および配列番号３０またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号３４またはそのホモログ、配列番号３６またはそのホモログ、および配列番号３８またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号４２またはそのホモログ、配列番号４４またはそのホモログ、および配列番号４６またはそのホモログ。
【００８４】
上記のアミノ酸配列セットにおいて、アミノ酸配列は、好ましくは、結合ドメインの中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として配置される（すなわち、他のアミノ酸配列によって別々に間隔を空けられる）。
【００８５】
上述のホモログのいずれか１つの相同性は、好ましくは、上に規定されるようなＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する１つ以上のホモログを含む、結合ドメインを与える。
【００８６】
（同一性および相同性）
用語「同一性」または「相同性」は、配列をアラインメントし、全体の配列に対して最大限の同一性パーセントを達成するために必要な場合にはギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部でないとみなした後に、比較される対応配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合を意味する、と解釈されるものとする。Ｎ末端もしくはＣ末端の伸長も挿入も同一性または相同性を減少させていると解釈されないものとする。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において公知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５）を使用して測定され得る。このソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変に関して一定の相同性を割り当てることによって類似の配列を対応させる。
【００８７】
本明細書において特定される１つ以上の配列のホモログは、規定された配列と比較して、１つ以上のアミノ酸で異なり得るが、同じ機能を実行し得る（すなわち、ホモログは、所定の配列の機能的等価物と考えられ得る）。
【００８８】
上述のように、本明細書において、任意の所定の配列のホモログは、以下のように規定され得る：
ｉ）所定のアミノ酸配列によっても認識される抗原を認識し得るアミノ酸配列を含むホモログ、および／または
ｉｉ）抗原に選択的に結合し得るアミノ酸配列を含むホモログ（ここで、抗原はまた、所定の配列によって選択的に結合される）、および／または
ｉｉｉ）所定の配列（例えば、配列番号８）を含む結合ドメインと実質的に同じかまたはより高いＰｓａＡに対する結合親和力を有するホモログ。
【００８９】
ホモログの例は、１つ以上の保存的アミノ酸置換（所定のアミノ酸の同じグループ内の１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む）、または複数の保存的アミノ酸置換（ここで、各保存的置換は、所定のアミノ酸の異なるグループ内の置換によって生成される）を含む。
【００９０】
従って、ホモログは、互いに独立した保存的置換を含み得、このホモログの少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）が、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）が、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）が、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）が、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸（好ましくは、ＴｙｒおよびＴｒｐならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸）で置換され、そのホモログの少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）が、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸（好ましくは、ＰｈｅおよびＴｒｐならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸）で置換され、そのフラグメントの少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）が、ＬｙｓおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのリジン（Ｌｙｓ）が、ＡｇｒおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアスパラギン（Ａｓｎ）が、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）が、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）が、Ｐｈｒ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換される。
【００９１】
保存的置換は、好ましい所定の配列の任意の位置に導入され得る。しかし、非保存的置換（特に、１つ以上の任意の位置における非保存的置換であるが、これに限定されない）を導入することもまた望まれ得る。
【００９２】
本明細書において、配列の機能的に等価なホモログの形成をもたらす非保存的置換は、例えば、ｉ）極性（例えば、極性側鎖を有する残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ）または荷電したアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＬｙｓ）に置換された非極性側鎖を有する残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）あるいは荷電した残基もしくは極性残基を非極性残基へ置換すること）の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｉ）ポリペプチドの骨格の配向（例えば、別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙの置換または別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙへの置換）へのその効果の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｉｉ）電荷（例えば、負に荷電した残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を正に荷電した残基（例えば、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇ）への置換）（逆もまた同じ）の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｖ）立体的なかさ高さ（例えば、かさ高い残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒ）のより小さな側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）への置換）（逆もまた同じ）の点で実質的に異なる。
【００９３】
１つの実施形態において、アミノ酸の置換は、それらの疎水性値および親水性値、ならびにアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（電荷、大きさ、等を含む）に基づいて、行なわれ得る。種々の前述の特徴を考慮する例示的なアミノ酸置換は、当業者に周知であり、そして、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００９４】
好ましい実施形態において、上記結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列に少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を有するホモログを含む。
【００９５】
より好ましくは、その相同性は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列に少なくとも６５％（例えば少なくとも７０％相同、例えば少なくとも７５％相同、例えば少なくとも８０％相同、例えば少なくとも８５％相同、例えば少なくとも９０％相同、例えば少なくとも９５％相同、例えば少なくとも９８％相同）である。
【００９６】
より好ましい実施形態において、上に述べた割合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列と比較されるように、ホモログの配列の同一性に関連する。
【００９７】
（エピトープ）
本発明による抗体は、好ましくは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜１５０に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在するエピトープを認識し、それに結合する。好ましくは、そのエピトープは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜１００に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在し、より好ましくは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜６５に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在する。
【００９８】
好ましい実施形態において、上記抗体は、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５３に対応する配列を有するフラグメントの群から選択されるフラグメントを認識し、それに結合する。
【００９９】
さらに、本発明による抗体は、エピトープを認識し、それに結合し、ここで、そのエピトープはまた、以下の群から選択される配列を含む可変部分を有する抗体によって認識されることが、好ましい：
配列番号８：図１６Ａのアミノ酸配列
配列番号１６：図１６Ｂのアミノ酸配列
配列番号２４：図１７Ａのアミノ酸配列
配列番号３２：図１７Ｂのアミノ酸配列
配列番号４０：図１８Ａのアミノ酸配列
配列番号４８：図１８Ｂのアミノ酸配列。
【０１００】
（血清型）
上述のように、肺炎連鎖球菌の９０の異なる血清型が、同定されている。本発明による結合メンバーは、２つ以上の異なる肺炎球菌血清型（例えば３つ以上の異なる肺炎球菌血清型、例えば４つ以上の異なる肺炎球菌血清型、例えば５つ以上の異なる肺炎球菌血清型）に由来するＰｓａＡに結合し得ることが好ましい。最も好ましくは、本発明による結合メンバーは、本質的に全血清型に由来する肺炎球菌を認識し、それに結合することが可能である。
【０１０１】
（モノクローナル抗体／ポリクローナル抗体）
本発明の１つの実施形態において、結合メンバーは、抗体であり、ここで、その抗体は、哺乳動物またはモノクローナル抗体の混合物由来のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態において、結合メンバーは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。その抗体は、いかなる種類の抗体であり得るが、好ましくは、ＩｇＧ抗体である。より好ましくは、その抗体は、ＩｇＧ１抗体またはそのフラグメントである。
【０１０２】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、抗体であり、ここで、あらゆる抗体分子は、類似であり、従って、同じエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、一般に、ハイブリドーマ細胞株によって産生される。モノクローナル抗体および抗体合成ハイブリドーマ細胞を作製する方法は、当業者に周知である。抗体産生ハイブリドーマは、例えば、不死化された細胞株を用いる抗体産生Ｂリンパ球の融合によって調製され得る。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、以下の工程によって産生され得る。全手順において、動物は、抗原（例えば、上述のようなポリクローナル抗体調製用のタンパク質（またはそのペプチド））を用いて免疫される。その免疫は、代表的に、免疫原を免疫有効量（すなわち、免疫応答を生じるのに十分な量）で免疫学的に適格な哺乳動物に投与することによって達成される。好ましくは、その哺乳動物は、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラットまたはマウス）である。その哺乳動物は、次いで、その哺乳動物にとって、記載されたような高親和力抗体分子を産生するのに十分な期間、追加免疫スケジュールで維持される。抗体産生細胞の懸濁液は、所望の抗体を分泌する各免疫化された哺乳動物から取り出される。高親和力抗体を産生するのに十分な時間の後、その哺乳動物（例えば、マウス）は、屠殺され、そして抗体産生リンパ球が、１つ以上のリンパ節、脾臓および末梢血から得られる。脾臓細胞が好ましく、そして脾臓細胞は当業者に周知の方法を使用して生理培地中で個々の細胞に機械的に分離され得る。その抗体産生細胞は、マウス骨髄腫株の細胞への融合によって不死化される。マウスリンパ球は、マウスホモログ骨髄腫を用いて、高率の安定的な融合を生じるが、ラット体細胞、ウサギ体細胞およびカエル体細胞もまた、使用され得る。所望の抗体産生動物の脾臓細胞は、一般に融剤（例えば、ポリエチレングリコール）の存在下で、骨髄腫細胞と融合することにより不死化される。融合パートナーとして適切な多くの骨髄腫細胞株のいずれもが、標準的な技術（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能なＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１骨髄腫株、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫株またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）を用いて使用される。
【０１０４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ技術の当業者に周知の他の方法によっても産生され得る。代替的な方法（「コンビナトリアル抗体ディスプレイ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ）」方法といわれる）が、特定の抗原特異性を有する抗体フラグメントを同定および単離するように開発されており、そしてモノクローナル抗体を産生するために利用され得る。
【０１０５】
ポリクローナル抗体は、特定の所定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、それゆえ、ポリクローナル抗体は、その抗原中の異なるエピトープを認識し得る。一般に、ポリクローナル抗体は、予め抗原を用いて免疫された、哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｙ Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８に記載の任意の方法により調製され得る。ポリクローナル抗体は、任意の適切な哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、およびヒツジ）に由来し得る。
【０１０６】
（特異性）
上記結合メンバーは、ＰｓａＡタンパク質に関して単一特異性であり得、ここで、ＰｓａＡタンパク質に関しての特異性とは、その結合メンバーが、ＰｓａＡタンパク質と免疫反応することを意味する。別の実施形態において、その結合メンバーは、ＰｓａＡタンパク質に関して特異的である少なくとも１つの部分を有し、二重特異性または多重特異性である。
【０１０７】
（一価抗体）
単一特異性結合メンバーは、一価（すなわち、ただ１つの結合ドメインを有する）であり得る。
【０１０８】
一価抗体に関して、免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸残基配列は、当該分野でＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４として公知の抗体分子の構造部分を含む。ＣＬとして当該分野で公知のそれらの結合メンバーが好ましい。好ましいＣＬポリペプチドは、ＣκおよびＣλからなる群から選択される。
【０１０９】
さらに、上記定常ドメインが、重鎖定常ドメインまたは軽鎖定常ドメイン（それぞれ、ＣＨまたはＣＬ）のいずれかであり得る限り、種々の一価結合メンバー組成物は、本発明によって意図される。例えば、軽鎖定常ドメインは、別の軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインのいずれかにジスルフィド架橋することが可能である。対照的に、重鎖定常ドメインは、２つの独立したジスルフィド架橋を形成し得、別の重鎖および軽鎖の両方に架橋することが可能であるか、または重鎖のポリマーを形成することが可能である。
【０１１０】
従って、別の実施形態において、本発明は、一価ポリペプチドを含む組成物を意図し、ここで、上記定常鎖ドメインＣは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基を有し、そしてその組成物は、そのジスルフィド架橋によって共有結合する少なくとも２つの一価ポリペプチドを含む。
【０１１１】
好ましい実施形態において、上記定常鎖ドメインＣは、ＣＬまたはＣＨのいずれかであり得る。Ｃが、ＣＬである場合、そのＣＬポリペプチドは、好ましくは、ＣκおよびＣλからなる群から選択される。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明は、Ｃが、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基を有するＣＬである場合を除いて、上記のような一価ポリペプチドを含む結合メンバー組成物を意図し、そうしてその組成物は、そのジスルフィド架橋によって共有結合する２つの一価ポリペプチドを含む。
【０１１３】
（多価）
本発明の別の実施形態において、結合メンバーは、少なくとも２つの結合ドメインを有する多価結合メンバーである。その結合ドメインは、同じリガンドまたは異なるリガンドに対して特異性を有し得る。
【０１１４】
（多重特異性（二重特異性を含む））
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる実体に対し親和力を有しかつその実体に結合し得る、多重特異性結合メンバーに関する。多重特異性結合メンバーは、二重特異性結合メンバーを含み得る。
【０１１５】
１つの実施形態において、上記多重特異性分子は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）であり、その二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合ドメインを保有し、その結合ドメインの少なくとも１つは、抗体起源である。
【０１１６】
本発明の二重特異性分子はまた、単鎖二重特異性分子である（例えば、単鎖二重特異性抗体、１つの単鎖抗体と結合ドメインとを含む単鎖二重特異性分子、または２つの結合ドメインを含む単鎖二重特異性分子）。多重特異性分子はまた、単鎖分子であっても少なくとも２つの単鎖分子を含んでもよい。
【０１１７】
上記多重特異性（二重特異性を含む）抗体は、当業者に公知の任意の適切な様式によって産生され得る。
【０１１８】
二重特異性全抗体を産生するための従来のアプローチは、各々所望の特異性を有する抗体を産生する２つのハイブリドーマ細胞株を融合することであった。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のランダムな会合が理由で、これらのハイブリッドハイブリドーマは、重鎖および軽鎖の１０組までの異なる組合せの混合物を産生し、その組合せの１つだけが二重特異性抗体である。それゆえ、これらの二重特異性抗体は、所望の産生物の収量をかなり減少させる、扱いにくい手順で精製されなければならない。
【０１１９】
代替的なアプローチは、ヒンジにおいてかまたは上記のように遺伝的に導入されるＣ末端のシステインを介してかのいずれかの、システイン残基の化学的架橋結合による２つの抗原特異性のインビトロ連結を含む。そのようなインビトロ構築の改良点は、ヘテロダイマーの形成を促進するペプチドとのＦａｂの組換え融合を使用することによって達成された。しかし、これらの方法の二重特異性産生物の収量は、１００％よりずっと少ない。
【０１２０】
二価または二重特異性抗体フラグメントを産生する、より効率的なアプローチ（インビトロでの化学的構築工程を含まない）が、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）によって記載された。このアプローチは、細菌から分泌されるｓｃＦｖが、しばしばモノマーおよびダイマーの両方として存在するという観察を利用する。この観察は、異なる鎖のＶＨおよびＶＬは、対になり得、従ってダイマーおよびより大きい複合体を形成することを示唆した。そのダイマー抗体フラグメント（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらによって「ダイアボディ」とも名付けられる）は、実際に、インビボで構築された小さい二価抗体フラグメントである。２つの異なる抗体１および抗体２のＶＨおよびＶＬを結合することによって、「交差」鎖であるＶＨ １ＶＬ ２およびＶＨ ２−ＶＬ １を形成するために、ダイマー化プロセスが、両方の抗原結合部位を再構築するために示された。その２つの結合部位の親和力は、開始ｓｃＦｖに等しいか、またはＶＨおよびＶＬと共有結合しているポリペプチドリンカーが除去される場合、１０倍増加し、従って、各々ＶＨと対になっていないＶＬと直接共有結合するＶＨからなる、２つのタンパク質を生成することが示された。二重特異性抗体フラグメントを産生するこの戦略はまた、いくつかの特許出願に記載された。特許出願ＷＯ ９４／０９１３１（ＳＣＯＴＧＥＮ ＬＴＤ；優先日１９９２年１０月１５日）は、結合ドメインが、２つの鎖に存在するかまたはｓｃＦｖに結合しているかのいずれかであるＶＨおよびＶＬ領域の両方に由来する二重特異性結合タンパク質に関し、他方で、他の融合抗体ドメイン（例えば、Ｃ末端定常ドメイン）は、ダイマー構築物を安定化するように使用される。特許出願ＷＯ ９４／１３８０４（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ／ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＵＮＣＩＬ；最先優先日１９９２年１２月４日）は、互いに結合し得、それによってＶドメインが、リンカーを用いてまたはリンカーを用いずに結合され得るＶＨおよびＶＬを含むポリペプチドに関する。
【０１２１】
ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４（また、特許出願ＷＯ ９４／１３８０６；ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ；優先日１９９２年１２月１１日にも記載される）は、Ｅ．ｃｏｌｉの単鎖二重特異性抗体フラグメントのインビボ産生を報告した。二価タンパク質の二重特異性は、異なる特異性を有し、柔軟なポリペプチドリンカーによって遺伝子レベルで一緒に連結される、２つの予め産生された一価ｓｃＦｖ分子に基づいていた。伝統的に、単鎖抗体フラグメントが、言及される場合はいつも、ポリペプチドリンカーの存在下または非存在下で１つの（対応する）軽鎖に連結する１つの重鎖からなる単一分子が、関係する。「ダイアボディ」アプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）および特許出願ＷＯ ９４／０９１３１）を通じてかまたは「二重ｓｃＦｖ」アプローチ（ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４および特許出願ＷＯ ９４／１３８０６）によって二価または二重特異性抗体フラグメントを作製する場合、再びそのＶＨは、（対応する）ＶＬに連結する。
【０１２２】
上述の多重特異性分子は、多くの方法によって作製され得る。例えば、すべての特異性は、同じベクターでコードされ得、そして同じ宿主細胞中に発現されそして組み立てられる。この方法は、その多重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質，Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。二重特異性抗体または多重特異性抗体を調製するための種々の他の方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；および同第５,４８２,８５８号に記載されている。
【０１２３】
本発明による二重特異性結合メンバーまたは多重特異性結合メンバーを使用することによって、本発明は、単一特異性／一価結合メンバーと比較していくつかの利点を提供する。
【０１２４】
二重特異性／多重特異性結合メンバーは、連鎖球菌タンパク質、特にＰｓａＡを特異的に認識し、それに結合し得る第一結合ドメインを有する一方で、他の結合ドメインは、他の目的で使用され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、少なくとも１つの他の結合ドメインは、連鎖球菌タンパク質に結合するために使用される（例えば、第一結合ドメインと比較して、同じ連鎖球菌タンパク質上の別のエピトープに結合する）。それによって、連鎖球菌属種に対する特異性は、増加され得、ならびに結合メンバーのアビディティを増加し得る。
【０１２６】
別の実施形態において、上記少なくとも１つの他の結合ドメインは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に特異的に結合するために使用され得る。少なくとも他の結合ドメインは、治療方法において結合メンバーの効果を増加させるために、免疫活性細胞（例えば、白血球、マクロファージ、リンパ球、好塩基性細胞、および／または好酸性細胞）に結合し得ることが、好ましい。これは、少なくとも１つの他の結合ドメインが、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質、例えば、分化抗原群タンパク質（ＣＤ）の任意のもの（特に、ＣＤ６４および／またはＣＤ８９））から選択されるタンパク質）に特異的に結合し得ることを確立することによって達成され得る。ＣＤ６４特異性を有する二重特異性抗体を産生する方法は、Ｍｅｄａｒｅｘ，ＩｎｃへのＵＳ６，０７１３５１７に記載されている。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」は、白血球またはリンパ球である免疫細胞をいう。特定のエフェクター細胞は、特定のＦｃレセプターを発現し、そして特定の免疫機能を実行する。例えば、ＣＤ８９レセプターを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は、標的細胞の特異的な殺作用および免疫系の他の構成要素へ抗原を提示すること、または抗原を提示する細胞に結合することに関与する。
【０１２８】
（ヒト化抗体フレームワーク）
ヒトの治療に非ヒト抗体を使用することは、いつも望ましいわけではない。なぜなら、非ヒト「外来」エピトープは、処置される個体中に免疫反応を誘発し得るからである。非ヒト抗体に関連する問題を除去または縮小するために、キメラ抗体誘導体（すなわち、ヒト定常領域（Ｆｃ）を用いて非ヒトＦａｂ可変領域結合決定基を結合する「ヒト化」抗体分子）を操作することが望まれる。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の等価な抗原特異性および親和性によって特徴付けされ、そしてヒトに投与される場合、免疫原性が低く、それゆえ処置される個体によってはより耐えられやすくなる。
【０１２９】
従って、１つの実施形態において、上記結合メンバーは、ヒト化抗体フレームワーク（またヒト化抗体とも呼ばれる）を保有する結合ドメインを有する。
【０１３０】
ヒト化抗体は、一般に、ヒト抗体由来の領域および非ヒト抗体（例えば、げっ歯類抗体）由来の領域を含む、キメラ抗体である。ヒト化（新形態化またはＣＤＲ移植とも呼ばれる）は、異種の供給源（通常、げっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を減少し、ヒト免疫グロブリンに対する相同性を増加し、およびヒト免疫系のそれらの活性化を改良するよく確立した技術である。従って、ヒト化抗体は、代表的には、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似の部位由来の残基によって置換される、ヒト抗体である。
【０１３１】
ヒト化抗体は、その抗原および他の都合のよい生物学的特性に対する高い親和力を保持することが、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化産生物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、通常入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列のありえそうな三次元立体配座構造を説明および表示するコンピュータープログラムは、入手可能である。これらの表示の検定は、候補免疫グロブリン配列（すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力を影響する残基の分析）の機能におけるある残基のありえそうな役割の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、レシピエントから選択および組合わされ得そして配列を読み込み得、それゆえ、所望の抗体の特徴（例えば、目標抗原に対する増加した親和性）が最大化されるが、抗原結合を直接的におよび最も実質的に影響するのは、ＣＤＲ残基である。
【０１３２】
ＭＡｂをヒト化する１つの方法は、キメラ抗体の産生に関連し、そのキメラ抗体において、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が、第二の抗体（好ましくは、ヒト抗体）由来の定常ドメインに融合されている。そのようなキメラ化手順を実行するための方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ １２０ ６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＥＰ−Ａ−０ １２５ ０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ＥＰ−Ａ−０ １７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびＥＰ−Ａ−０ １９４ ２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。抗体のヒト化のより複雑な形態は、可変領域ドメインの再設計に関与し、それゆえ、非ヒト抗体結合部位を形成するアミノ酸は、ヒト抗体可変領域のフレームワークへと組み込まれている（Ｊｏｎｅｓら、１９８６）。
【０１３３】
本発明のヒト化抗体は、非ヒト抗体由来のＣＤＲによってヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部を置換し得る任意の方法によって産生され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得る方法を記載し（１９８７年３月２６日に申請されたＵＫ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＧＢ ２１８８６３８Ａ）、その内容は、参考として明白に援用されている。そのヒトＣＤＲは、以下の実施例に記載されるようにオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を使用して非ヒトＣＤＲによって置換され得る。
【０１３４】
１つの例として、本発明のヒト化抗体は、以下の短い説明の中に記載されるように作製され得る。本発明のヒト化抗体は、以下のプロセスによって産生され得る：
（ａ）従来の技術によって、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を用いてオペロンを含む発現ベクターを構築するプロセスであって、その中で、抗体結合特異性を保持するために必要なＣＤＲおよび可変ドメインフレークワーク領域のそのような最小限の部分が、非ヒト免疫グロブリンに由来し、そして、抗体鎖の残存する部分がヒト免疫グロブリンに由来し、それによって本発明のベクターを産生するプロセス；
（ｂ）従来の技術によって、相補的抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を用いてオペロンを含む発現ベクターを構築するプロセスであって、その中で、ドナー抗体結合特異性を保持するために必要なＣＤＲおよび可変ドメインフレークワーク領域のそのような最小限の部分が、非ヒト免疫グロブリンに由来し、そして、抗体鎖の残存する部分がヒト免疫グロブリンに由来し、それによって本発明のベクターを産生するプロセス；
（ｃ）本発明のトランスフェクトされる宿主細胞を産生するために従来の技術によって宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトするプロセス；および
（ｄ）本発明のヒト化抗体を産生するために従来の技術によってそのトランスフェクトされる細胞を培養するプロセス。
【０１３５】
上記宿主細胞は、本発明の２つのベクターと同時トランスフェクトされ得、その第一ベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含み、そして第二ベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含む。その２つのベクターは、異なる選択マーカーを含むが、そうでなければ、抗体重鎖コード配列および抗体軽鎖コード配列から離れており、好ましくは同一であり、可能な限り、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を保証する。あるいは、１つのベクターが使用され得、そのベクターは、軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドの両方をコードする配列を含んでいる。軽鎖および重鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはその両方を含み得る。
【０１３６】
本発明の変化される抗体を発現するために使用される宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であるか、または真核生物細胞であり得る。特に、この目的のためによく規定されたタイプの哺乳動物細胞（例えば、骨髄腫細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）が、使用され得る。
【０１３７】
本発明のベクターが構築され得る一般の方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要とされるトランスフェクション方法およびそのような宿主細胞由来の本発明の抗体を産生するために必要とされる培養方法は、全て従来の技術である。同様に、一度産生される場合、本発明のヒト化抗体は、以下に記載されるような標準的な手順によって精製され得る。
【０１３８】
（ヒト抗体フレームワーク）
より好ましい実施形態において、本発明は、結合メンバーに関連し、ここで、上記結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークによって保有される（すなわち、ここで、この抗体は、ヒト化抗体よりも高度のヒトペプチド配列を有する。
【０１３９】
ヒトタンパク質に対して導かれるヒトｍＡｂ抗体は、マウス免疫系ではなく完全なヒト免疫系を保有するトランスジェニックマウスを使用して、産生され得る。所定の抗原により免疫されるこれらのトランスジェニックマウス由来の脾細胞は、ヒトタンパク質由来のエピトープに対し特異的親和力を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生するために使用される（例えば、Ｗｏｏｄら 国際出願ＷＯ ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇら 国際出願ＷＯ ９２／０３９１８；Ｋａｙら 国際出願９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら １９９４ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら １９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら １９９３ Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら １９９３ ＰＮＡＳ ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら １９９１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３−１３２６参照のこと）。
【０１４０】
そのようなトランスジェニックマウスは、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｎｄａｌｅ、Ｎ．Ｊ．から入手可能である。キメラマウスおよび生殖細胞系変異体マウスの抗体重鎖連結領域（ＩＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じる記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配置の転移は、抗原攻撃の際にヒト抗体の産生を生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリに由来され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９（１９９６））。
【０１４１】
好ましい実施形態において、上記抗体は、実施例１に記載される方法によって産生される。
【０１４２】
（フラグメント）
本発明の１つの実施形態において、上記結合メンバーは、抗体のフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメントまたは可変領域）である。本発明を用いるに有用な抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々１つの抗原結合部位を有する、２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと呼ばれる）および残余の「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化するその能力のためにそう呼ばれる）を産生する。ペプシン処理は、抗原に架橋結合し得る２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメント、および残余の他のフラグメント（ｐＦｃ’と称される）を産生する。さらなるフラグメントとしては、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられ得る。
【０１４３】
抗体フラグメントＦａｂ、抗体フラグメントＦｖおよび抗体フラグメントｓｃＦｖは、これら抗体フラグメントが、ただ１つの抗原結合部位を保有する点で、完全な抗体と異なる。２つの結合部位を有する組換えフラグメントは、いくつかの方法で産生される（例えば、ＦｖのＶＨのＣ末端（Ｃｕｍｂｅｒら、１９９２）もしくはｓｃＦｖのＶＬのＣ末端（ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９２）に導入されるシステイン残基の化学的架橋結合によってか、またはＦａｂ’のヒンジシステイン残基を通して（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２））。
【０１４４】
好ましい抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターに選択的に結合する抗体のいくつかのまたは実質的に全ての能力を保持する。いくつかの好ましいフラグメントは、以下のように規定される：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、酵素パパインを用いる完全な抗体の消化によって産生され、無傷の軽鎖および１つの重鎖の部分を産生し得る。
（２）Ｆａｂ’は、抗体分子のフラグメントであり、そしてペプシンを用いて完全な抗体を処理し、続いて還元することによって得られ、無傷の軽鎖および重鎖の部分を産生し得る。２つのＦａｂ’フラグメントが、１つの抗体分子につき得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端におけるいくつかの残基の添加に関してＦａｂフラグメントと異なる。
（３）（Ｆａｂ’）２は、それに続く還元を伴わず、酵素ペプシンを用いて完全な抗体を処理することによって得られる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである。
（４）Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、固い、非共有結合における１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定するために相互作用するのは、この構成である。集合的に、その６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または、抗原に対し特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）ですら、抗原を認識し、それに結合する能力を有するが、全体の結合部位よりも弱い親和力である。
【０１４５】
本発明の１つの実施形態において、上記抗体は、遺伝子的に融合される単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子的に操作される分子として規定される、単鎖抗体（「ＳＣＡ」）である。そのような単鎖抗体はまた、「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントといわれる。一般に、そのＦｖポリペプチドは、さらにそのｓＦｖに抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。
【０１４６】
本発明による上記抗体フラグメントは、当業者に公知の任意の適切な方法によって産生され得る。いくつかの細菌発現系が、活性抗体フラグメントを産生するために既に開発されている（例えば、種々の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９８８、Ｃａｒｔｅｒら、１９９２）、酵母（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８）および糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１９９３））が記載されている）。これらの代替的系において組換えタンパク質の収量は、比較的高くあり得る（高細胞密度発酵のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌されるＦａｂに関して１〜２ｇ／ｌ、Ｃａｒｔｅｒら、１９９２参照のこと）かまたは低レベル（例えば、発酵槽の酵母のＦａｂに関して約０．１ｍｇ／ｌ（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８）、および融合タンパク質ＣＢＨＩ−Ｆａｂに関しては１５０ｍｇ／ｌおよび発酵槽のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのＦａｂに関しては１ｍｇ／ｌ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１９９３））であり得、そしてそのような産生物は、哺乳動物細胞（ハイブリドーマ、骨髄腫、ＣＨＯ）おける完全な抗体の産生と比較して非常に安い。
【０１４７】
上記フラグメントは、Ｆａｂ’としてかまたはＦｖとして産生され得るが、さらに、ＶＨおよびＶＬは、その組合せがｓｃＦｖとして公知である、柔軟なポリペプチドリンカーによってどちらかの順序で遺伝子的に連結され得ることが示される。
【０１４８】
（単離された核酸分子／ベクター／宿主細胞）
１つの局面において、本発明は、上に規定されるような結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子に関する。１つの実施形態において、その核酸分子は、軽鎖をコードし、別の核酸は、重鎖をコードする。その２つの核酸分子は、分離し得るか、またはそれらは、１つの核酸分子に融合され、必要に応じてリンカー配列によって間隔を空けられ得る。抗体フラグメントとの関係で特に、その核酸分子は、全結合メンバーをコードし得るが、結合メンバーの設計に依存して、これはまた、いくつかのより大きな結合メンバーに関連し得る。一度その核酸分子が、宿主細胞中に配置される場合、その核酸分子は、好ましくは、ＤＮＡ配列（より好ましくは、結合メンバーの発現を促進するその上流末端調節要素を含むＤＮＡ配列）である。
【０１４９】
それゆえ、１つの実施形態において、本発明は、以下の群から選択されるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの相補鎖に関する。
ｉ）図１６ａ、図１６ｂ、図１７ａ、図１７ｂ、図１８ａ、および図１８ｂのヌクレオチド配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）図１６ａ、図１６ｂ、図１７ａ、図１７ｂ、図１８ａ、および図１８ｂの群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む結合メンバーをコードするポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドｉ）によってコードされるポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、そのフラグメントは、
ａ）ｉｉ）の結合メンバーによってもまた認識される抗原を認識し得え、および／または、
ｂ）抗原に選択的に結合し得、ここで、その抗原はまた、ｉｉ）の結合メンバーによって選択的に結合され、および／または、
ｃ）所定の配列（例えば、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８）を含む結合ドメインとして、実質的にＰｓａＡに対する結合親和力と類似か、またはより高いＰｓａＡに対する結合親和力を有する。
ｉｖ）ポリヌクレオチドの相補鎖が、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）のいずれかに規定されるようなポリヌクレオチドと一緒に厳しい条件下でハイブリダイズし、およびｉｉｉ）に規定されるようなポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
ｖ）ｉ）〜ｉｖ）のいずれかに規定されるようなポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に変質するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【０１５０】
本発明は、さらに上に規定されるような核酸分子を含むベクター（１つの核酸につき１つのベクターか、または同じベクターに２つ以上の核酸のいずれか）に関する。そのベクターは、好ましくは、上記核酸分子によってコードされる抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
なお別の局面において、本発明は、上に規定されるような核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【０１５２】
また、本発明は、上に規定されるような結合メンバーを発現するように操作される細胞株に関連し、この細胞株は、例えば、マウスリンパ球および不死化細胞株のハイブリドーマである。その細胞株は、いずれの適切な細胞株であり得るが、細胞株Ｐ３が好ましい。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞株が、好まれる。
【０１５３】
（結合メンバーの精製）
産生後、本発明による上記結合メンバーは、好ましくは、精製される。使用される精製方法は、いくつかの因子（必要とされる精製度、抗体の供給源、抗体の意図される使用、抗体が産生される種、抗体のクラスおよび、その抗体がモノクローナル抗体である場合の、抗体のサブクラス、が挙げられる）に依存する。
【０１５４】
抗体を含むポリペプチドを精製する任意の適切な従来の方法としては、沈殿反応およびカラムクロマトグラフィーが挙げられ、そして精製分野の当業者に周知であり、交差流ろ過法、硫安塩析、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動を含み、そして同様のものが使用され得る。
【０１５５】
抗免疫グロブリン抗体を用いて抗体を精製する方法は、単一精製手順かまたは連続精製手順のいずれかであり得る。単一精製および連続精製の方法は、精製分野の当業者に周知である。単一工程精製手順において、抗体は、単一抗免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。連続精製手順において、抗体は、第一抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合され、特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。第一抗免疫グロブリン抗体由来の溶離液は、次いで第二抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。好ましい実施形態において、抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。
【０１５６】
通常使用される精製方法は、精製される抗体が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇによってかまたは抗免疫グロブリン抗体によって結合される、アフィニティークロマトグラフィーである。当業者に周知のアフィニティークロマトグラフィーの別の方法は、その別個の抗原に対する抗体の特異性結合である。
【０１５７】
多重特異性抗体を（二重特異性抗体を含む）精製するために特に、連続精製手順が、使用され得、ここで、２つ以上の可変ドメインを含む二重特異性抗体は、第一抗原に特異的に結合され、次いで第二抗原に特異的に結合される。
【０１５８】
代替的な実施形態において、２つ以上の可変領域を含む二重特異性抗体は、抗体を第一精製工程において第一抗原にそして第二精製工程において第二抗原に特異的に結合することによる連続精製により精製される。
【０１５９】
抗免疫グロブリン抗体を用いて抗体を精製する方法は、単一精製手順かまたは連続精製手順のいずれかであり得る。単一精製および連続精製の方法は、精製分野の当業者に周知である。単一工程精製手順において、抗体は、単一抗免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。連続精製手順において、抗体は、第一抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合され、特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。第一抗免疫グロブリン由来の溶離液は、次いで第二抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。好ましい実施形態において、抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。より好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧの重鎖定常領域およびκおよびλの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。さらにより好ましい実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、κおよびλの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される。
【０１６０】
（診断方法）
本発明はまた、本明細書において記載される診断方法によるサンプル中の細菌の存在（および好ましくは量）を検出することが望ましい場合、生物学的サンプルの連鎖球菌属（特に肺炎連鎖球菌）の存在をアッセイするための診断システム（好ましくはキット形態における）を記載する。
【０１６１】
上記診断システムは、少なくとも１つのアッセイを実行するに十分な量の、本発明による結合メンバー組成物（好ましくは、分離してパッケージ化される試薬として、より好ましくは使用説明書も）を含む。
【０１６２】
上記生物学的サンプルは、組織、組織抽出物、液状サンプルまたは体液サンプル（例えば、血液、血漿または血清）であり得る。
【０１６３】
パッケージ化されるとは、固体マトリックスまたは固体物質（本発明の結合メンバーを定められた範囲中に保持し得る、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリ炭酸塩）、紙、ホイル等）の使用をいう。従って、例えば、パッケージは、ミリグラムの量の意図される標識結合メンバー調製物を含むために使用されるガラスバイアルであり得るか、またはそれは、ミリグラムの量の意図される標識結合メンバーが、作動可能に添付されている（すなわち、リガンドを結合し得るように連結される）マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１６４】
「使用説明書」は、代表的に、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方法パラメーター（例えば、試薬および混合されるサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の保守期間、温度、緩衝条件等）を記載する明白な表現を含む。
【０１６５】
本発明の診断システムはまた、好ましくは、予め選択されるリガンドと複合体化される結合メンバーを含む結合反応複合体の形成を伝達し得る標識または表示手段を含む。
【０１６６】
任意の標識または表示手段は、発現されたポリペプチドまたは診断方法において使用されるファージ粒子に連結されるかまたは組み込まれ得る。そのような標識は、それ自身が臨床診断化学において周知である。
【０１６７】
標識手段は、抗体または抗原を変性することなくそれらに化学的に結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であり得る。適切な蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル塩化物（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸塩（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニル塩化物（ＲＢ ２００ ＳＣ）等のような蛍光色素である。免疫蛍光分析技術の説明は、参考として本明細書に援用されているＤｅＬｕｃａ、「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）の中に見られる。
【０１６８】
好ましい実施形態において、上記表示グループは、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、等）である。そのような主な表示グループが、酵素（例えば、ＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼ）である場合、さらなる試薬が、レセプター−リガンド複合体（免疫反応物）が形成する事実を視覚可能とするために必要とされる。ＨＲＰのためのそのようなさらなる試薬としては、過酸化水素および酸化染料前駆体（例えば、ジアミノベンジジン）が挙げられる。グルコースオキシダーゼと一緒に有用なさらなる試薬は、２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズサイアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１６９】
放射性元素はまた、有用な標識剤であり、そして本明細書において説明的に使用される。例示的な放射標識剤は、ガンマ線放射を生成する放射性元素である。それ自体がガンマ線を放射する元素（例えば、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒ）は、ガンマ線放射生成放射性元素表示グループの１つのクラスを示す。特に好ましいのは、１２５Ｉである。有用な標識手段の別のグループは、それ自体陽電子を放射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。その陽電子は、動物の体に存在する電子に遭遇する際にガンマ線を精製するように放出される。また有用なものは、β放射体（例えば、１１１Ｉｎまたは３Ｈ）である。
【０１７０】
標識、ポリペプチドおよびタンパク質またはファージの連結（すなわち、各々の標識）は、当該分野で周知である。例えば、タンパク質は、培養培地の構成要素として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝的組み込みによって標識され得る。例えば、Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３−４６（１９８１）を参照のこと。活性化された官能基を通じたタンパク質接合またはタンパク質連結の技術は、特に適用可能である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第８巻補遺 ７：７−２３（１９７８）、Ｒｏｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３：８８９−８９４（１９８４）、および米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこと。
【０１７１】
診断システムはまた、特異性結合剤（好ましくは、分離パッケージとして）を含み得る。「特異性結合剤」は、本発明の結合メンバー種かまたはそのような種を含む複合体に選択的に結合し得る分子の実体であるが、それ自体は本発明の結合メンバーではない。例示的な特異性結合剤は、抗体分子、相補的タンパク質またはそのフラグメント、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ、等である。好ましくは、その特異性結合剤が、結合メンバー種に結合するのは、その種が複合体の一部として存在する場合である。
【０１７２】
好ましい実施形態において、上記特異性結合剤は、標識される。しかし、上記診断システムが、標識されていない特異性結合剤を含む場合、その結合剤は、代表的に増幅手段または増幅試薬として使用される。これらの実施形態において、その標識特異性結合剤が、増幅手段に特異的に結合し得るのは、その増幅手段が、試薬種含有複合体に結合される場合である。
【０１７３】
本発明の診断キットは、液状サンプル中の予め選択されるリガンドの量を検出するための「ＥＬＩＳＡ」型式の中で使用され得る。「ＥＬＩＳＡ」は、サンプル中に存在する抗原の量を検出および数量化するために、固相および酵素−抗原接合または酵素−抗体接合に結合される抗体かまたは抗原を使用する酵素結合イムノソルベント検定法をいい、そして本方法に対し容易に適用可能である。
【０１７４】
従って、いくつかの実施形態において、本発明の結合メンバーは、被験体診断システム中のパッケージを含む固体支持体を形成するために固体マトリックスに添付され得る。
【０１７５】
試薬は、代表的に水溶培地からの吸着によって固体マトリックスに添付されるが、当業者に周知であるタンパク質およびポリペプチドに適用可能である添付の他の様式が、使用され得る。例示的な吸着方法は、本明細書に記載されている。
【０１７６】
有用な固体マトリックスはまた、当該分野において周知である。そのような物質は、水不溶性であり、そしてそのような物質としては、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から登録商標ＳＥＰＨＡＤＥＸの下で入手可能である架橋されたデキストラン；アガロース；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．から入手可能である直径約１μｍから約５ｍｍのポリスチレンビーズのビーズ；ポリビニル塩化物、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、ニトロセルロースに基づく繊維またはナイロンに基づく繊維（例えば、シーツ、ストリップまたはパドル）；あるいは管、プレートまたはマイクロタイタープレートのウェル（例えば、ポリスチレンまたはポリビニル塩化物から生成されたもの）が挙げられる。
【０１７７】
本明細書において記載される任意の診断システムの結合メンバー種、標識特異性結合剤または増幅試薬が、液体分散としてかまたは実質的に乾燥粉末（ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ）として（例えば、凍結冷凍された形態で）溶液中に提供され得る。表示手段が酵素である場合、その酵素の基質はまた、系の分離パッケージ中に提供され得る。固体支持体（例えば、以前に記載されたマイクロタイタープレートおよび１つ以上の緩衝液）はまた、この診断アッセイ系に分離してパッケージ化される元素として含まれ得る。
【０１７８】
（診断方法）
本発明はまた、生物学的サンプルに代表的に存在する連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）の存在（および好ましくは量）を決定するための種々のアッセイ方法を意図する。
【０１７９】
それゆえ、本発明は、個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法に関し、その方法は、
その個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを生物学的サンプルに添加する工程、
その生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによってその疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する。
【０１８０】
上記結合される結合メンバーは、サンプル中の連鎖球菌属の量まで直接的にまたは間接的に検出され得る。
【０１８１】
当業者は、種々の周知の臨床診断化学手順があることを理解しており、その手順の中で、本発明の結合試薬が、結合反応産生物を形成するために使用され得る。その結合反応産生物の量は、サンプル中のリガンドの量に関する。従って、例示的なアッセイ方法が本明細書に記載されるが、その発明は、そのように限定されない。
【０１８２】
競合的または非競合的のいずれかである種々の異質のプロトコルおよび同質のプロトコルが、本発明のアッセイ方法を実行する際に使用され得る。
【０１８３】
結合条件は、レセプターのリガンド結合活性を維持するものである。これらの条件としては、約４℃から約５０℃の温度範囲、約５から約９のｐＨ値の範囲および、蒸留水のおよそのイオン強度から１モルの塩化ナトリウムのイオン強度まで変動するイオン強度が挙げられる。
【０１８４】
検出工程は、免疫学分野で周知のように、複合体または結合試薬（複合体のレセプター構成要素）のいずれかに対して導かれ得る。従って、二次的結合試薬（例えば、レセプターに対して特異的な抗体）が、利用され得る。
【０１８５】
あるいは、上記複合体は、標識レセプター分子を使用したことがあることによって検出可能であり得、それによって複合体を標識する。この場合の検出は、その複合体に存在する標識を検出することを含む。
【０１８６】
さらなる診断方法は、リガンドを架橋するために、本発明の１つの実施形態の結合メンバー組成物の多重結合価を利用し得、それによって、多重リガンドおよびポリペプチドの凝集体を形成し、沈降可能な凝集体を産生する。この実施形態は、免疫沈降の周知の方法と比較可能である。この実施形態は、結合条件下で結合混合物を形成するために、本発明の結合メンバー組成物とサンプルを混合する工程を含み、形成される結合複合体を単離する分離工程が後に続く。代表的に、単離は、混合物から凝集体を除去するために、遠心沈殿法またはろ過により達成される。結合複合体の存在は、検出される予め選択されるリガンドの存在を示す。
【０１８７】
（薬学的組成物）
好ましい局面において、本発明は、本明細書において記載される治療方法を実施するために有用な薬学的組成物を意図する。本発明の薬学的組成物は、活性成分としてそこで溶解または分散した、本明細書に記載される結合メンバーの少なくとも１つの種と一緒に、生理学的に耐性なキャリアを含む。好ましい実施形態において、その薬学的組成物が免疫原性ではないのは、治療目的でヒト個体に投与される場合であり、その目的が、免疫反応を誘導するものではない場合である。
【０１８８】
１つの局面において、本発明は、上に規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含む薬学的組成物に関する。好ましい実施形態において、その薬学的組成物は、その処置の効果を増加させるために、上に規定されるような少なくとも２つの異なる結合メンバーを含む。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に耐性可能な」およびその文法上の異形は、それらが組成物、キャリア、希釈剤および試薬をいうように、可換的に使用され、そしてその物質が、望まれない生理学的効果（例えば、吐き気、めまい感、急性胃ぜん動等）の生成を伴わずヒトへまたはヒトに投与し得ることを示す。
【０１９０】
そこで溶解または分散される活性成分を含む薬理学的組成物の調製は、当該分野においてよく理解されている。代表的に、そのような組成物は、溶液または懸濁液、水溶液または非水溶液のように無菌の注射可能物質として調製されるが、使用前に液体中の液剤または懸濁剤として適切な固体形態もまた調製され得る。その調製はまた、乳化され得る。
【０１９１】
上記活性成分は、薬学的に受容可能でありそして活性成分と一致しそして本明細書において記載される治療方法の使用に適切な量の賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等およびそれらの組み合わせである。さらに、もし所望ならば、その組成物は、活性成分の有効性を促進する微量の二次的物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝液等）を含み得る。
【０１９２】
本発明の薬学的組成物は、そこでその構成要素の薬学的に受容可能な塩を含み得る。薬学的に受容可能な塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、またはそのような有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸等）により形成される、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）、およびそのような有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等）に由来し得る。
【０１９３】
生理学的に耐性なキャリアは、当該分野において周知である。液状キャリアの模範例は、活性成分および水に加えて物質を含まない、または緩衝液（生理的ｐＨ値におけるリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方（例えば、リン酸緩衝化生理水））を含む、無菌の水溶液である。なおさらに、水溶性キャリアは、１つ以上の緩衝液塩、ならびに塩（例えば、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、ブドウ糖、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質）を含み得る。
【０１９４】
液体組成物はまた、水に加えるおよび水を除く液相を含み得る。そのようなさらなる液相の模範例は、グリセリン、植物油（例えば、綿実油）、有機エスター（例えば、オレイン酸エチル）、および水−油乳剤である。
【０１９５】
薬学的組成物は、代表的に１ｇの全薬学的組成物あたり抗体の少なくとも０．１重量％の量の、本発明の結合メンバーを含む。重量％は、全組成物に対する抗体の重量の割合である。従って、例えば、０．１重量％は、１００ｇの全組成物あたり０．１ｇの抗体である。
【０１９６】
本発明はまた、本発明の抗体を含む、医薬または薬学的組成物を調製するための方法に関連し、その医薬は、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症））に関連する疾患または障害の免疫療法のために使用されており、生理学的に受容可能なキャリアと上に規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを混合することを含む。
【０１９７】
さらに、本発明は、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）に関連する疾患または障害（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症）の処理のための薬学的組成物を生成するために、上に規定されるような結合メンバーの使用に関する。
【０１９８】
上記薬学的組成物はまた、さらに抗生物質剤（例えば、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリンおよびアミノ配糖体から選択される抗生物質）を含む、および／または免疫刺激剤（例えば、サイトカイン、インターフェロン、増殖因子（例えば、ＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ））を含む、キットの一部であり得る。そのキットの一部は、同時投与、連続投与または分離投与のために使用され得る。
【０１９９】
さらに、上記薬学的組成物は、連鎖球菌タンパク質ＰｓａＡと組み合わせて（特に、ワクチンとして）、本発明による結合メンバーを含み得る。タンパク質ＰｓａＡと本発明による結合メンバーを組み合わせることによって、その組み合わせ産生物の免疫化特性は、タンパク質ＰｓａＡ単独よりも優良であることが、見い出された。このことは、そのＰｓａＡが、結合メンバーによって免疫系に提示される事実に起因し得る。
【０２００】
（治療方法）
本発明による結合メンバーは、その高い親和力および特異性に起因して治療方法において特に有用である。それゆえ、その結合メンバーは、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）に関連する疾患または障害（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症）に関して免疫療法的に使用され得る。
【０２０１】
本発明の結合メンバーと一緒に本明細書において使用される場合、用語「免疫療法的に」または「免疫療法」は、予防的投与ならびに治療投与の両方を示す。従って、その結合メンバーは、疾患の可能性および／または重症度を減少させるため危険性が高い患者に投与され得、活性感染が既に証明されている患者に投与され得、または感染の危険性のある患者に投与され得る。
【０２０２】
本発明の結合メンバーの投与のための投与量の範囲は、疾患の症状が回復するかまたは感染の可能性が減少する、望ましい効果を生成するに十分な範囲である。一般に、その投与量は、年齢、条件、性別および患者が有する疾患の程度によって変動し、そして当業者によって決定され得る。その投与量は、いずれかの合併症の事象の際に個々の医者によって調節され得る。
【０２０３】
本発明の結合メンバーの治療有効量は、代表的に、生理学的に耐性な組成物に投与される場合、１ｍｌあたり約０．１μｇから約１００μｇ／ｍｌ（好ましくは、約１μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、および通常約５μｇ／ｍｌ）の血漿濃度を達成するに十分であるような抗体の量である。別の言い方をすれば、その投与量は、１日または数日間、１日に１回以上の投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまで（好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで）変動し得る。
【０２０４】
本発明の結合メンバーは、注射によってまたは長期にわたって徐々に注入することによって非経口的に投与され得る。上記感染は、全身的であり得、そしてそれゆえ薬学的組成物の静脈投与によって最も頻繁に処理され得るが、他の組織および送達手段は、組織を標的にすることが、疾患の減少を生じる可能性がある場合に意図される。従って、本発明の抗体は、非経口的に（例えば、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、胸腔内に、経皮内に）投与され得、そしてぜん動手段によって送達され得る。
【０２０５】
本発明の結合メンバーを含む薬学的組成物は、従来的に静脈投与される（例えば、１つの単位投与の注射によるように）。本発明の薬学的組成物に関して使用される場合、用語「単位投与」は、被験体に対する単一の投与量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要とされる希釈剤（すなわち、キャリア、またはビヒクル）と関連する所望の治療効果を産生するように計算される所定の量の活性物質を含む。
【０２０６】
上記治療方法は、さらに上で規定されるようなキットの一部の使用を含み得る。
【実施例】
【０２０７】
本発明は、さらに以下の実施例を通じて説明される；その実施例は、本発明を限定するように構成されない。
【０２０８】
（実施例１）
（抗ＰｓａＡ抗体の産生）
完全にヒト抗体を産生する能力を有するマウスを、使用した。そのマウスは、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃから得られたＨｕＭＡｂ−マウスであった。
【０２０９】
Ｈｉｓ６−ｐｓａＡタンパク質（ここで、ＰｓａＡタンパク質は、図１５に示される配列を有する）を、免疫実験のための抗原として使用した。これらのタンパク質の濃度を、分光光度計によって計算し、そしてこれらの精製度を、銀染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。タンパク質を、適切に、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、およびアジュバントとしてＲＩＢＩを使用して、免疫のために調製した。１２匹から１８匹の雄ＨｕＭＡｂマウスのグループを、全ての免疫実験のために使用した。各マウスを、３週間間隔で２０μｇ〜５０μｇのＨｉｓ６−ｐｓａＡ（ＰｓａＡアミノ酸配列を、図１５に示す）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射および皮下注射によって免疫した。５×１０ｅ８熱不活性化肺炎連鎖球菌Ｒ６細胞ｉ．ｐ．Ｓｅｒａを受け取った何匹かのマウスを、レトロ軌道出血によってマウスから集めた。ｒｐｓａＡへの滴定量をＥＬＩＳＡによって決定した。マウスを、犠牲にする前に静脈内に追加免疫した。
【０２１０】
８つの融合が実行され、そして６５の実行可能な細胞クローンを生じた。これらを、サブクローニングし、そして以下の１ａに記載される方法によって同定された４２の陽性クローンをさらなる研究のために選択した。これらのうち、２６を選択し、そして精製されたモノクローナル抗体であった。乏しい反応性のため、３つを放棄した；従って、２３のクローンを評価した。その２３のクローンの中で、候補ＭＡｂの優先リストを確立した。その最優先の４つを、インビボモデルでさらに評価した。
【０２１１】
（１ａ）肺炎連鎖球菌Ｒ６結合抗体）
ハイブリドーマ上清を、試薬が過多のサンドイッチ型酵素結合イムノソルベントアッセイの中で肺炎連鎖球菌Ｒ６に対して３つの希釈容液で試験した。
（装置：）
ＥＬＩＳＡ読み取り機、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＥＬ ８００
ＥＬＩＳＡ洗浄機、携帯用モデル
インキュベーター３７℃
ピペット
（材料：）
チップ
試薬トレー
プレートカバー
９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）。
（細菌：）
１０ｅ１０／ｍｌの濃度の冷凍ストックからの肺炎連鎖球菌Ｒ６（ＳＳＩ、Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｔ）。３７℃で急速に解凍し、そしてコーティング緩衝液で１：１００に希釈する。
（試薬：）
Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ ９．６
ＰＢＳ、ｐＨ ７．４
Ｔｗｅｅｎ ２０
ウサギ抗ヒトＩｇＡ，Ｇ，Ｍ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２１２
ウサギ抗マウスＩｇ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２６０
ブタ抗ウサギＩｇ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２１７
０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ ５．０
ＯＰＤ １０ｍｇ錠剤、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ番号４２６０
Ｈ２Ｏ２
Ｈ２ＳＯ４
コーティング緩衝液：Ｎａ２ＣＯ３ ０．０５Ｍ、ｐＨ ９．６、生産後２週間で期限切れ、４℃にて保存
希釈緩衝液および洗浄緩衝液：０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ、生産後１週間で期限切れ、４℃にて保存
二次抗体：希釈緩衝液中で１：１５００に希釈し、毎日新しく作製する
基質：１０ｍｌのクエン酸に１ＯＰＤ錠を溶解し、そして１０μｌのＨ２Ｏ２を添加する。毎日新しく作製する
停止試薬：１．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４、生産後１年で期限切れ、室温で保存。
（コントロール：）
ブランク：０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ
陽性コントロール：精製されるＲａ−ａ−ＰｓａＡの親和力
（サンプル：）
希釈緩衝液で１：２、１：５０および１：１２５０に希釈したハイブリドーマ培養上清。
（手順：）
１ウェルあたり１００μＬの細菌（＝１０ｅ７）を、９６マイクロウェルにコーティングし、そしてそのプレートを一晩４℃でインキュベートする。過多の液体を放棄する。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして今後１ヶ月の期間は４℃で保存し得る。１００μＬのブランク、陽性コントロールまたはサンプルを添加し、そしてそのプレートを２時間３７℃でインキュベートする。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。１００μＬの二次抗体を添加し、そしてそのプレートを１時間３７℃でインキュベートする。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。そのプレートを、３００μＬの脱塩水で２回洗浄する。１００μＬの基質を添加し、そしてそのプレートを室温で３０分インキュベートする。１００μＬの停止試薬を添加し、そしてそのプレートを、Ａ４９０ｎｍで読み取る。
【０２１２】
（実施例２）
（モノクローナル抗ＰｓａＡ抗体のインビトロ効果）
実施例１で得られたモノクローナル抗体を、種々の株の肺炎球菌に対してインビトロで試験し、全細菌に対して（ＥＬＩＳＡ）（方法１を参照のこと）、およびウェスタンブロットを使用して（以下の方法２を参照のこと）、抗体を同定した。
【０２１３】
（方法２）
（細菌結合抗体の同定―ウェスタンブロット）
第一の細菌タンパク質を、以下の方法によって、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ Ｇｅｌからポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ移す。
（サンプル：）
電気泳動したＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ Ｇｅｌ
（装置：）
ブロットモジュールを伴うＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅｌｏｃｋＴＭミニ細胞
電源装置
（材料：）
プレカットブロッティングＰＶＤＦ膜（０．４５μｍ）およびろ紙（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＬＣ２００５）
ピペット
チップ
トレー
（試薬：）
ＮｕＰＡＧＥ転移緩衝液（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ ＃ＮＰ０００６）
ミリＱ等級Ｈ２Ｏ
エタノール ９６％。
【０２１４】
（手順：）
（１つのゲルを移す）
ａ） ５００ｍｌの転移緩衝液を、２５ｍｌの２０Ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転移緩衝液および１００ｍｌのエタノール（９６％）を３７５ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏに添加することによって調製した。ブロッティングパッドを、３５０ｍｌの転移緩衝液に浸漬した。ＰＶＤＦ膜を、３０秒間９６％のエタノールに浸漬し、そして緩衝液の中で２分間洗浄し、そして上記ろ紙を、短く転移緩衝液の中に浸漬した。
【０２１５】
予め浸漬したろ紙の一片を、ゲルの上に置き（底板に接着させる）、そして全ての閉じ込められた気泡を、除去した。
【０２１６】
そのプレートを反転し、そうしてそのゲルおよびろ紙が、手袋をはめた手の上でまたは清潔な平面の上で下向きに向き合っていた。その予め浸漬された転移膜をゲルの上に置き、そして閉じ込められた気泡を除去した。
【０２１７】
別の予め浸漬されたろ紙を、上記膜の上に置き、そして全ての閉じ込められた気泡を、除去した。
ｂ） ２つの浸漬されたブロッティングパッドを、ブロットモジュールの陰極（−）コアに置いた。そのゲル／膜集合体を、注意深く取り上げ、そして正しい方向にブロッティングパッドの上に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。２つの浸漬されたブロッティングパッドを、そのｓａｎｄｗｉｃｈの上に置き、そして陽極（+）コアはそのパッドの上にある。
ｃ） 上記ブロットモジュールを、硬く結合し、そしてそれを低緩衝液室（Ｌｏｗｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ）のガイドレールの中に滑らせた。ゲル張力楔状部（Ｇｅｌ Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｗｅｄｇｅ）を、低緩衝液室の中に運び、そしてその楔状部を所定の位置に固定した。
【０２１８】
上記ブロットモジュールを、ゲル／膜集合体を覆うまで、転移緩衝液で満たした。外部緩衝液室（Ｏｕｔｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ）を、６５０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏで満たし、そのふたをその部分の上に置き、そして導線を電源装置に接続した。ＰＶＤＦ膜に向けての転移を、１時間一定の３０Ｖを使用して実行した。予想される開始電流は、１７０ｍＡであった。そして予想される終了電流は１１０ｍＡである。ウェスタンブロットを発展し、そして乾燥した膜を、１週間４℃で閉じたコンテナー／ポーチの中で保管した。
【０２１９】
（２つのゲルを移す）
１． ２つのゲル／膜サンドイッチを調製するために上記工程ａ）を２回繰り返す。
２． 上記ブロットモジュールの陰極コアの上に、２つの予め浸漬したブロッティングパッドを置く。
３． 第一ゲル／膜集合体をブロッティングパッドの上に正確な方向に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。
４． 別の予め浸漬したブロッティングパッドを第一膜集合体の上に添加する。
５． 第二ゲル／膜サンドイッチをブロッティングパッドの上に正確な方向に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。
６． （１つのゲルを移す）から工程ｃ）を進める。
上記同定を、以下に記載されるように行なう：
電気泳動的に転移したタンパク質、細菌溶解物またはリポ多糖類を有するＰＶＤＦ膜。
（試薬：）
ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ遮断液／希釈液Ａ+Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＷＢ７０５０
ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ洗浄液（１６×）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＷＢ７００３
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ液状基質、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ番号Ｂ３６７９
Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＬＣ ６０６０
ウサギ抗ヒト ＩｇＧ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３３６
ウサギ抗マウス Ｉｇ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３１４
ブタ抗ウサギ Ｉｇ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３０６
ミリＱ等級Ｈ２Ｏ
エタノール ９６％
洗浄緩衝液：
１０ｍｌのＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｒｅｅｚｅ洗浄液（１６×）
１５０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
ブロック化溶液：
５ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
３ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
一次抗体溶液：
７ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
１ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
二次抗体溶液：
７ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
１ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
５μｌの二次抗体（最終希釈１：２０００）。
【０２２０】
（手順）
１． 乾燥したＰＶＤＦ膜を、９６％のエタノールで再び湿らせ、そして５分間で２回、各々２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏの中でリンスし、工程４に進む。
２． 新しくブロットされた膜を、ガラスプレートに置き、そしてＭＷマーカーを切断する。ＭＷマーカーを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎの中で１５分間から３０分間染色し、背景がはっきりするまで３０％のエタノールで脱色する。ミリＱ等級Ｈ２Ｏの中で２回洗浄する。
３． その膜を、５分間で２回、各々２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏの中で洗浄する。
４． 膜を、緩やかに振盪させながら、室温で３０分間覆われたプラスチック皿の１０ｍｌのブロック化溶液の中に置く。ブロック化溶液をデカントする。
５． 緩やかに振盪させながら、室温で５分間２０ｍｌのＨ２Ｏでリンスする。デカントする。もう１度繰り返す。膜を、必要な場合、これからチップに切断し得る。
６． 膜を、緩やかに振盪させながら、室温で１時間１０ｍｌの一次抗体溶液でインキュベートする。あるいは、４℃にて一晩インキュベートする。
７． ５分間で４回、各々２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄する。
８． 膜を、室温で３０分間１０ｍｌの二次抗体溶液でインキュベートする。
９． ５分間で４回、各回２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄する。
１０． その膜を、２分間で３回、各回２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏでリンスする。
１１． 紫色のバンドが発達するまで（１分から６０分）、膜を、５ｍｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰ液状基質の中でインキュベートする。
１２． 膜を、２分間で３回、各回２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏでリンスすることによって発達を止める。
１３． その膜を、清潔なろ紙の上で乾燥させる。
【０２２１】
（結果）
図２０に、上記インビトロ試験の結果を列挙する。
【０２２２】
（実施例３）
（抗ＰｓａＡ抗体親和力の測定）
以下の一般的な記載を、全ての親和力測定に実施した。
【０２２３】
（使用した機器およびソフトウェア：）
ａ． ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００、表面プラスモン共鳴機器。
ｂ． ＢｉａＥｖａｌ ｖ３．２、データ分析のためのソフトウェア。
ｃ． Ｂｉａｃｏｒｅからの全ての連続緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ／ＨＢＳ−Ｐ）。
【０２２４】
（ＣＭ５チップのアミンを介してタンパク質Ｇを固定する方法（アミン連結方法））
ａ． そのチップを、少なくとも２回適切な緩衝液で正規化する。
ｂ． タンパク質Ｇの０．５μｇ／ｍＬ希釈溶液を、ｐＨ ２．９の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の中に産生する。
ｃ． Ｂｉａｃｏｒｅハンドブックに述べられる方法にしたがって、５μＬ／分の流動速度で、新しく混合されたＥＤＣ ＆ ＮＨＳを流すことによって、そのＣＭ５チップを７分間活性化させる。
ｄ． この活性化された表面の上に２２分間タンパク質Ｇサンプルを注入する。
ｅ． １Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌを１０分間を注入することによって非活性化させる。
ｆ． この方法は、活性化された表面の上の約１００００ＲＵのタンパク質Ｇに連結する。
ｇ． ブランクの表面に対して、同じ活性化および非活性化手順をタンパク質Ｇの注入なしに続ける。
【０２２５】
（ＣＭ５チップのアミンを介してＰｓａＡを固定する方法（アミン連結方法））
ａ． ＣＭ５チップを、上のように正規化した。
ｂ． ＰｓａＡ希釈溶液を、ｐＨ ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の中で、５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度に、生成する。
ｃ． 新しく混合されたＥＤＣおよびＮＨＳを流すことによって、そのチップを７分間活性化させる。
ｄ． そのチップに捕らえられる量が、所望のレベルに達するまで（本発明者らの場合、３５０ＲＵから８００ＲＵ）、手動注入によって酢酸緩衝液中で生成されたＰｓａＡを注入する。
ｅ． そのチップを、１０分間１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌを注入することによって非活性化させる。
ｆ． そのチップ表面から結合されていない／緩く結合されている分子を除去するために、弱酸または弱塩基を用いてチップを再生成する。
ｇ． そのブランクの表面を、そのタンパク質を注入する工程を除いた、同じ方法によって生成する。
【０２２６】
（ＰｓａＡとの抗ＰｓａＡ抗体の結合のアビディティを決定する方法）
ａ． 抗体のアビディティを測定することに続く一般の方法論は、高流動速度にて抗原表面（上述）の上に少なくとも５つの異なる濃度の抗体を流すことである。その高流動速度は、抗原表面に再結合する抗体を最小限にするために必要である。結合相および解離相は、それぞれ、５分から１０分と３０分から４０分との間で変動し得る。この実験設計は、この抗体のアビディティの測定に結び付くが；本発明者らは、アビディティの推定におけるこの現象の効果を最小限にしようとする。そのデータ分析を、結合／解離の二相性態様を表した領域を注意深く含まなかった後、実行した。その態様は、次いで１：１ラングニュアモデルに一致する。分析のためにデータを選択する方法は、アビディティの推定は、真の親和力により近いことを裏付けする。
ｂ． 抗体濃度：３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬ（結合部位の４０．０２ｎＭ、２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭ、１０．０ｎＭおよび６．６７ｎＭに対応している）。全ての希釈溶液を、連続緩衝液、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ ７．２において生成した。
ｃ． ３０μＬ／分の流動速度。結合相８分、解離相３０分から４０分。
ｄ． その表面の再生成：流動速度１００μＬ／分、緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌを伴う１００ｍＭ ＨＣｌ、時間：１分から２分。
【０２２７】
（実験３ａ）８つの精製される抗ＰｓａＡ ｈｕＭａｂの結合親和力）
（試薬）
【０２２８】
【表１】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０
（結合濃度）：５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量（０２／１２／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ
（固定された量（０２／２０／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：１１４５ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：３５５ＲＵ。
【０２２９】
（実験条件：）
抗体濃度：５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ（６６．７ｎＭ、５３．３６ｎＭ，４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭおよび１３．３４ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：３０μＬ／分
結合時間：８分 解離時間：４０分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：１分。
【０２３０】
（結果：）
【０２３１】
【表２】
（実験３ｂ）３つの精製される抗ＰｓａＡ ＨｕＭａｂの結合親和力）
（試薬：）
【０２３２】
【表３】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：ＣＭ５
（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０ （結合濃度：）５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ。
【０２３３】
（実験条件：）
抗体の濃度：４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．５μｇ／ｍＬ（５３．３６ｎＭ，４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭおよび６．６７ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：２５μＬ／分
結合時間：５分 解離時間：４５分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：１分。
【０２３４】
（結果：）
【０２３５】
【表４】
（実験３ｃ）１４の精製される抗ＰｓａＡ ＨｕＭａｂの結合親和力）
（試薬：）
【０２３６】
【表５】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：ＣＭ５ （チップを調製した日）：０２／１２／０３
（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０ （結合濃度）：５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量（０２／１２／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ。
【０２３７】
（実験条件：）
抗体の濃度：３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬおよび０．５０μｇ／ｍＬ（４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭ、１０．０ｎＭ、６．６７ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：３０μＬ／分
結合時間：８分 解離時間：３０分から４０分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：４５秒から１分。
【０２３８】
（結果：）
【０２３９】
【表６】
（実施例４）
（候補抗体のインビボ試験）
肺炎球菌によってもたらされる感染の処理における抗ＰｓａＡ ｈｕＭａｂの効果を、以下に記載されるように決定した。
【０２４０】
（材料：）
・トランスジェニック（ヒトＣＤ６４）雌マウス（８週齢から１２週齢、重量１９ｇから２０ｇ）
・０．９％食塩水（ＭＵ）
・ＰＢＳ ｐＨ ７．０
・５％血小板
・ろ過されたウシブロス
・モノクローナル抗体：
・抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７
・抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５
・抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９
・抗ＰｓａＡ ４−３Ｄ１０
【０２４１】
【数１】
。
【０２４２】
（方法）
（１日目：）
肺炎球菌株を、４×５％血小板に接種し、そして３５℃にて一晩インキュベートした。
（０日目）
その肺炎球菌株を、ろ過されたブロスの中で１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ＭＵ／Ｆ０７４−０１を参照のこと）まで懸濁し、そして１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ（４．９５ｍｌ ＰＢＳの中に５０μｌ １０８ＣＦＵ／ｍｌ）まで希釈し、そしてさらに抗体を用いて希釈する（スキームを参照のこと）。その細菌／抗体混合物を、振盪し、そして３５℃にて１０分間インキュベートし、次いでそのマウスを０．５ｍｌ ｉ．ｐ．で接種する。
【０２４３】
【表７】
（スキーム）
【０２４４】
【表８】
（血液サンプルの回収）
上記マウスを、ＣＯ２を用いて落ち着かせた。切除を腋において行い、そして血液をガラス管０に収集した。１００μｌをガラス１に移し、そして全面的に混ぜ合わせ、その後、１００μｌを、ガラス棒を用いて血小板の上に拡散した。次いで、ＣＦＵ決定を実行した。その残りの血液を、７分間２０００×Ｇにて遠心分離し、そして血清を別の管に移し、−２０℃にて保管した。
【０２４５】
（腹膜液の回収）
上記マウスを犠牲にし、２ｍｌの無菌の食塩水をその腹の中へ注入し、そして１０秒後、その液体を、無菌のパスツールピペットを用いて回収し、そしてエッペンドルフ管へ移した。ＣＦＵ決定を実行した。その残りの腹膜液を−２０℃にて保管した。
【０２４６】
（結果）
上記結果を、図１９Ａ〜図１９Ｅに示す。
【０２４７】
（実施例５）
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７二重特異性抗体の産生）
各ＨｕＭＡｂ、抗ＣＤ６４（８８．５３）、および抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ペプシン消化によって産生し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過クロマトグラフィーによって同質性に精製した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールを各Ｆ（ａｂ’）２に関して図２に示す。このタイプの分析により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの両方が、９５％以上純粋だった。
【０２４８】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図３に示す。このタイプの分析により、８８．５３ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋だった。
【０２４９】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離した。そのＦａｂ’フラグメントを、Ｆａｂ−ＴＮＢ接合を産生するために、ジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）を用いてインキュベートした。
【０２５０】
５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図４に示す。このタイプの分析により、５−９Ａ７ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋だった。
【０２５１】
５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、そして室温にて一晩１：１のモル比において８８．５３ Ｆａｂ−ＴＮＢと混合した。図５に示されるＨＰＬＣプロフィールは、インキュベーションの１８時間後および精製前の接合混合物のプロフィールを示す。このプロフィールは、二重特異性抗体ならびに接合されていないＦａｂ’分子の混合物を示す。
【０２５２】
上記二重特異性抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって汚染されているＦａｂ’分子から精製し、そしてその精製された分子をＨＰＬＣによって分析した。図６に示されるように、８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体を同質性近くまで精製した。
【０２５３】
コントロールに関して、抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９二重特異性抗体を産生した。各ＨｕＭＡｂ、抗ＣＤ６４（８８．５３）、および抗ＣＤ８９（１４Ａ８）のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ペプシン消化によって産生し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過クロマトグラフィーによって同質性に精製した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールを各Ｆ（ａｂ’）２に関して図７に示す。このタイプの分析により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの両方が、９５％以上純粋だった。
【０２５４】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図８に示す。このタイプの分析により、８８．５３ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋であった。
【０２５５】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離した。そのＦａｂ’フラグメントを、Ｆａｂ−ＴＮＢ接合を産生するために、ジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）１６ａおよび１６ｂを用いてインキュベートした。
【０２５６】
１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図９に示す。このタイプの分析により、１４Ａ８ Ｆａｂ’は、９５％以上純粋だった。
【０２５７】
１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、そして室温にて一晩１：１のモル比において８８．５３ Ｆａｂ−ＴＮＢと混合した。図１０に示されるＨＰＬＣプロフィールは、インキュベーションの１８時間後および精製前の接合混合物のプロフィールを示す。このプロフィールは、二重特異性抗体ならびに接合されていないＦａｂ’分子の混合物を示す。
【０２５８】
上記二重特異性抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって汚染されているＦａｂ’分子から精製し、そしてその精製された分子をＨＰＬＣによって分析した。図１１に示されるように、８８．５３×１４Ａ８二重特異性抗体を同質性近くまで精製した。
【０２５９】
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ二重特異性抗体の結合特異性の特徴付け二重特異性ＥＬＩＳＡ）
１． ＥＬＩＳＡプレートを、組換えＰｓａＡ、５０μｌ／ウェル、５μｇ／ｍｌでコーティングし、そして４℃にて一晩インキュベートした。
２． そのプレートを、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡを用いて遮断した。
３． 二重特異性抗体の滴定をそのプレートに添加した。コントロールは、抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９二重特異性（コントロール二重特異性）および抗ＣＤ６４ Ａｂ、８８．５３、または抗ＰｓａＡ Ａｂ、５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。
４． そのプレートを、次いでヒトＩｇＭのＦｃ部分に連結する可溶性ＣＤ６４からなる融合タンパク質を含む上清を用いてインキュベートした。
５． そのプレートを、最終的に、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体と標識されたアルカリホスファターゼを用いてインキュベートした。陽性ウェルを、アルカリホスファターゼ基質を用いて検出した。
【０２６０】
上記抗ＰｓａＡ×抗ＣＤ６４二重特異性は、このアッセイの中で投与量依存的な結合を示した（図１３を参照のこと）。コントロール二重特異性は、検出されず、なぜなら、それは、ＰｓａＡに結合しないからであり、抗ＣＤ６４ Ｆ（ａｂ’）２は、検出されず、なぜなら、それは、ＣＤ６４に結合するが、ＰｓａＡには結合しないからであり、そして抗ＰｓａＡ Ｆ（ａｂ’）２は、検出されず、なぜなら、それは、ＰｓａＡに結合するが、可溶性ＣＤ６４−ＩｇＭ融合タンパク質には結合しないからである。
【０２６１】
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ二重特異性抗体の結合特異性の特徴付けヒトＣＤ６４−トランスジェニックマウス上のＣＤ６４への結合）
血液を、ＣＤ６４トランスジェニックマウスからまたは非トランスジェニック同腹体から摂取し、そして室温にて３０分間３０μｇ／ｍｌの濃度にて８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体を用いてインキュベートした。
【０２６２】
上記血液を洗浄し、次いで室温にて３０分間ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてインキュベートした。赤血球を溶解し、そして残りの白血球を、フローサイトメトリーによって染色のために分析した。リンパ球、単球、および好中球群に対応する領域を、ゲートしそして別々に分析した。結合アッセイの結果を、図１４に示す（Ａ〜Ｃ）。黒線は、ＣＤ６４トランスジェニックマウス由来の細胞の染色を示し、緑線は、非トランスジェニック同腹体由来の細胞の染色を示す。
【０２６３】
ヒトＣＤ６４を、ＣＤ６４トランスジェニックマウスの単球上に発現し、そして、より少ない程度において、ＣＤ６４トランスジェニックマウスの好中球上に発現する。ヒトにおいてそうであるように、ＣＤ６４は、そのトランスジェニックマウスのリンパ球によって発現されない。図１４のデータは、二重特異性抗体は、ＣＤ６４トランスジェニック単球および好中球に結合するが、非トランスジェニックマウス由来のどの細胞群にも結合しないことを示す。
【０２６４】
要約すると、２つの二重特異性抗体（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡおよび抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９）を産生し、そして同質性まで精製した。８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体は、ＣＤ６４およびＰｓａＡへ同時に結合することが示された。さらに、この二重特異性抗体は、ヒトＣＤ６４トランスジェニックマウスによって発現されるＣＤ６４に結合する。
【０２６５】
（実施例６）
（抗体の配列決定）
実施例３ｂの親和力表に示される抗体を、従来の方法によって配列決定し、そしてこの抗体の可変領域を図に示す。
【０２６６】
９Ａ７（クローン５−９Ａ７） 図１６ａおよび図１６ｂ
１Ｇ９（クローン７−１Ｇ９．１） 図１７ａおよび図１７ｂ
１５Ｅ５（クローン１−１５Ｅ５．２．１） 図１８ａおよび図１８ｂ。
【０２６７】
（実施例７）
（エピトープの局在化の同定）
ＰｓａＡの１５の合成フラグメント（各々は、ＰｓａＡの２５のアミノ酸残基を表し、そして５つのアミノ酸残基を有する隣接フラグメントと重なっている）を、産生した。このフラグメントに結合する抗体を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。本発明による抗体が、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３に対応するＮ末端フラグメントに結合したことを、見い出した。
【０２６８】
（参考文献）
【０２６９】
【表９】
【０２７０】
【表１０】
【０２７１】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】Ｆａｂフラグメントの模式図。
【図２ａ】８８．５３のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図２ｂ】５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図３】８８．５３のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図４】５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図５】８８．５３×５−９Ａ７接合混合物のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図６】精製された８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図７ａ】８８．５３のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図７ｂ】１４Ａ８のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図８】８８．５３のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図９】１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１０】８８．５３×１４Ａ８接合混合物のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１１】精製された８８．５３×１４Ａ８二重特異性抗体のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１２】二重特異性抗体の模式図。
【図１３】８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体の二重特異性結合活性。
【図１４】８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体は、ヒトＣＤ６４トランスジェニックマウスによって発現されたＣＤ６４に結合する。
【図１５】配列番号５０を有するＰｓａＡアミノ酸配列。
【図１６ａ】抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ、ここで、Ｖセグメント：Ｌ１５およびＪセグメント：ＪＫ１。
【図１６ｂ】抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ、ここで、Ｖセグメント：４−３４、Ｄセグメント：不明、およびＪセグメント：ＪＨ４ｂ。
【図１７ａ】抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ、Ｖセグメント：Ｌ６、およびＪセグメント：ＪＫ４。
【図１７ｂ】抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ、Ｖセグメント：３−７、Ｄセグメント：３−１０、Ｊセグメント：ＪＨ６ｂ。
【図１８ａ】抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ、Ｖセグメント：Ｌ６、およびＪセグメント：ＪＫ３。
【図１８ｂ】抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ、Ｖセグメント：３−７、Ｄセグメント：３−１０、およびＪセグメント：ＪＨ６ｂ。
【図１９Ａ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｂ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｃ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｄ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｅ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図２０】インビトロ試験の結果の表。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバー、特に少なくとも２つの結合ドメインを有する結合メンバー、診断方法ならびに処置のための上記結合メンバーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
肺炎連鎖球菌は、生命を脅かす細菌感染の主な原因の１つである。発展途上国において、数百万の５才未満の子供が、毎年肺炎連鎖球菌が原因で死亡すると推定されている（３）。工業化した世界では、肺炎連鎖球菌肺炎の発生率は、１００，０００人あたり５人〜１０人であり、そしてその致死率は５％〜７％である。肺炎連鎖球菌髄膜炎は、１００，０００人あたり１人〜２人に発生し、致死率は３０％〜４０％である（１４）。肺炎連鎖球菌は、菌血の最も多い原因の１つである。肺炎連鎖球菌は、中耳炎を有する子供から単離される最も多い生物体である。６才未満の全ての子供のうちの約７５％は、中耳炎に苦しむ。
【０００３】
肺炎連鎖球菌は、対または短連鎖で増殖するグラム陽性細菌である。その表面は、３つの層（莢膜、細胞壁および形質膜）から構成されている。莢膜は、最も厚い層であり、増殖する肺炎連鎖球菌の内部構造を完全に隠す。オリゴ糖類（多糖類）の反復単位のポリマーが、その莢膜を占めている。異なる血清型が、それらの莢膜の一部としてリビトール、アラビチノール（ａｒａｂｉｔｉｎｏｌ）またはホスホリルコリンを含み、血清型に特異的な化学的構造を生ずる。細胞壁は、ペプチドグリカンからなるが、テイコ酸およびリポテイコ酸からもなる。形質膜は、細胞を取り包みそして種々の分子をその表面へ固定する、二重リン脂質膜である（２）。
【０００４】
現在、肺炎連鎖球菌の莢膜の多様性に基づいて、９０種類の異なる型の肺炎連鎖球菌が認識されている（２６）。この莢膜は、肺炎連鎖球菌感染の病原において重要である。１つの莢膜型に対して生じる抗体は、この型の感染からの防御を提供するが、他の莢膜型の感染に対しては提供しない。現在の２３の結合価の多糖類ワクチンは、最も多い血清型の６０％〜８５％よりも多くからの防御を提供する。
【０００５】
細胞壁は、２つの多糖類（Ｃ−多糖類（Ｃ−ＰＳ）（テイコ酸およびペプチドグリカン）およびＦ−抗原（リポテイコ酸、フォルスマン抗原））を含む（２６）。肺炎連鎖球菌以外の細菌は、Ｃ−ＰＳ（例えば、α−連鎖球菌属）を含む（１２）。Ｆ−抗原は、連鎖球菌性の群Ｃ多糖類と交差反応する（２９）。莢膜多糖類に対するいくつかの抗体は、おそらくＣ−ＰＳと交差反応する。なぜなら、これらは、共有結合しているからである。抗Ｃ−ＰＳ抗体の防御的な役割は、議論の余地がある。なぜなら、いくつかの研究は、マウスにおいてこれらの抗体が防御的であることを見出しているが（６）、他の研究は見出していないからである（２０；２８）。防御の欠如は、Ｃ−ＰＳの莢膜隠匿（ｃａｐｓｕｌａｒ ｃｏｎｃｅａｌｍｅｎｔ）によってもたらされると考えられている。Ｃ−ＰＳに対する抗体は、無莢膜の菌株によって感染される宿主を防御するか、またはその莢膜を落とす減衰する肺炎連鎖球菌に結合し得る。Ｆ−抗原を用いるマウスの免疫は、肺炎連鎖球菌感染に対して防御しない（４）。
【０００６】
肺炎球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）は、３７−ｋＤａの表面タンパク質である。ＰｓａＡに関するモノクローナル抗体は、２４の異なる莢膜を有する肺炎連鎖球菌の溶解物のうちの２４と反応し、そして多くの他の細菌のどれとも反応しなかった（２３）。２３の莢膜血清型を示す８０の菌株由来のｐｓａＡ遺伝子のＲＦＬＰ分析は、それらが高度に保存されることを示した（２４）。ＰｓａＡを用いるマウスの免疫は、３型肺炎連鎖球菌に対する防御を提供した（３２）。ネイティブのＰｓａＡは、標準的な方法によって精製される（２５；３３）。組換えＰｓａＡは、バキュロウイルスベクター系において発現され得る（１０）。抗ｒＰｓａＡ免疫血清は、コントロールマウスと比較して、肺炎連鎖球菌血清型６Ｂに対してマウスに防御を与えた（１０）。少なくとも６つの異なるモノクローナル抗体が報告され（９；２３）、そして診断目的のために提案されたが、肺炎連鎖球菌に関連する疾患の処置は、これらの抗体と共には提案されていない。
【０００７】
ＩｇＡからＰｓａＡは、２才未満の子供（２６１人中１９３人）および成人（１７人中１７人）由来の唾液中に検出可能である（３４）。抗ＰｓａＡ ＩｇＧは、ＥＩＡによって２才未満のほとんどの子供（１１０８人中８７２人）およびほとんどの成人（３２５人中２６２人）に検出可能であった（３５）。セロコンバージョンは、キャリアの状態に関連があった。すなわち、鼻咽頭標本または中耳標本から培養される肺炎連鎖球菌を有したことのある子供は、抗ＰｓａＡ ＩｇＧ陽性になる可能性が高かった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバーに関し、その結合メンバーは、連鎖球菌属、特に肺炎連鎖球菌に関する疾患および障害を予防および処置するための薬学的組成物での使用に適する。
【０００９】
それゆえ、１つの実施形態において、本発明は、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された結合メンバーに関し、その結合ドメインは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する。好ましくは、上記結合ドメインを含む結合メンバーは、上で規定される解離定数Ｋｄを有する。
【００１０】
その高結合力に起因して、上記結合メンバーは、薬学的組成物での使用に適する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、少なくとも第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含む、単離された結合メンバーに関し、その第一結合ドメインは、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能である。
【００１２】
本発明による結合メンバーは、好ましくは、抗体または抗体のフラグメントである。この抗体は、当業者に公知の任意の適切な方法によって産生され得るが、その結合メンバーの少なくとも一部は、組換え技術を通じて産生されることが好ましい。それゆえ、本発明は、１つの局面において、上述されるような結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子、ならびに、上で規定される核酸分子を含むベクターおよび上で規定される核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、上で規定されるような結合メンバーの少なくとも一部を発現するように操作された細胞株に関し、より好ましくは、上で規定されるような全結合メンバーを発現するように操作された細胞株に関する。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法に関し、その方法は、
その個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを生物学的サンプルに添加する工程、
その生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによってその疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する。
【００１５】
また、上記方法において、本発明は、さらに、上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含むキットに関し、その結合メンバーは、診断方法での使用のために標識される。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含む薬学的組成物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、肺炎連鎖球菌に関連する障害または疾患（例えば、肺炎、髄膜炎および／または敗血症）の処置または予防用の薬学的組成物の生成のための、上で規定されるような結合メンバーの使用に関する。
【００１８】
なおさらなる局面において、本発明は、上で規定されるような結合メンバーの有効量を投与することによって、肺炎連鎖球菌に関連する障害または疾患（例えば、肺炎、髄膜炎および／または敗血症）に苦しむ個体を処置または防御するための方法に関する。
【００１９】
（配列表）
（配列番号および名称）
配列番号１：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号４：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号５：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号６：ＣＤＲ４抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号７：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号８：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号９：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１０：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１１：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１２：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１３：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１４：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１５：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号１６：抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号１７：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号１８：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号１９：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２０：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２１：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２２：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２３：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号２４：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号２５：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号２６：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号２７：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号２８：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号２９：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号３０：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号３１：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号３２：抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号３３：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３４：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３５：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３６：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３７：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号３８：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号３９：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ ＤＮＡ配列
配列番号４０：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ アミノ酸配列
配列番号４１：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４２：ＣＤＲ１抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４３：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４４：ＣＤＲ２抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４５：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４６：ＣＤＲ３抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４７：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ ＤＮＡ配列
配列番号４８：抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ アミノ酸配列
配列番号４９：ＰｓａＡ Ａ−改変体ＤＮＡ配列
配列番号５０：ＰｓａＡ Ａ−改変体アミノ酸配列
配列番号５１：ペプチド９１３６
配列番号５２：ペプチド９１３７
配列番号５３：ペプチド９１３８
配列番号５４：ＰｓａＡ １−６５アミノ酸配列
配列番号５５：ＰｓａＡ ＤＮＡ配列
配列番号５６：ＰｓａＡ アミノ酸配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
（定義）
親和力：レセプターとそれらのリガンドとの間（例えば、抗体とその抗原との間）の結合する力。
【００２１】
アビディティ：抗体の、その抗原と機能的に結合する力であり、その抗原は、そのエピトープとパラトープとの間の反応の親和力、ならびにその抗体および抗原の結合価の両方に関連する。
【００２２】
アミノ酸残基：そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学的消化（加水分解）の際に形成されるアミノ酸。本明細書において記載されるアミノ酸残基は、好ましくは、「Ｌ」異性体形態である。しかし、所望の機能的特性が上記ポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体形態の残基は、任意のＬ−アミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基をいう。標準ポリペプチドと一致して、アミノ酸残基の略称が、以下の対応表に示される。
【００２３】
（対応表）
（記号）
１文字 ３文字 アミノ酸
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ スレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｚ Ｇｌｘ Ｇｌｕおよび／またはＧｌｎ
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｂ Ａｓｘ Ａｓｎおよび／またはＡｓｐ
Ｃ Ｃｙｓ システイン
Ｘ Ｘａａ 不明またはその他
本明細書に式で表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端にかけての従来の方向に、左から右の方向を有することに注意するべきである。さらに、成句「アミノ酸残基」は、対応表に列挙されるアミノ酸ならびに改変されたアミノ酸および異常なアミノ酸を含むように広く規定される。その上、アミノ酸残基配列の開始部分または終止部分におけるダッシュ記号は、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、またはアミノ末端基（例えば、ＮＨ２またはアセチル基）への共有結合もしくはカルボキシ末端基（例えば、ＣＯＯＨ）への共有結合を示すことに注意すべきである。
【００２４】
抗体：種々の文法的な形において、用語、抗体は、本明細書において免疫グロブリン分子、および本発明の組成物の免疫グロブリン分子（すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子）の免疫学的に活性な部分をいうように使用される。典型的な抗体分子は、無傷な免疫グロブリン分子、実質的に無傷な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして当該分野において公知のそれらの部分を含む）である。Ｆａｂの模式図が、図１に示されている。本明細書において使用される場合、用語「抗体」はまた、ヒト抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、ならびにそのような抗体の結合フラグメントまたはそのような抗体の改変形の結合フラグメント（例えば、抗体分子由来の少なくとも１つの抗原結合決定基を有する、多重特異性分子、二重特異性分子およびキメラ分子）を含むことが意図される。
【００２５】
抗体クラス：その重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには少なくとも５つの主要なクラスがあり（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、そして、これらのクラスのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２）。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ配列に基づいて、２つの明確に区別される型（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに割り当てられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は、周知である。
【００２６】
抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびに超可変領域を含む抗体分子のその構造部分である。種々の形の用語、免疫反応は、抗原決定基含有分子と抗原結合部位を含む分子（例えば、全抗体分子またはその部分）との間の特異的結合を意味する。あるいは、抗体結合部位は、抗原結合部位として公知である。
【００２７】
塩基対（ｂｐ）：二重鎖ＤＮＡ分子におけるチミン（Ｔ）とアデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）の連携。ＲＮＡにおいては、ウラシル（Ｕ）が、チミンの代わりに用いられる。
【００２８】
結合メンバー：肺炎連鎖球菌タンパク質のエピトープに結合し得る（特に、ＰｓａＡに特異的に結合し得る）ポリペプチド。
【００２９】
結合ドメイン：抗原に特異的に結合する抗原結合部位。結合メンバーは、多重特異的であり得、そして２つの免疫学的に異なる抗原に特異的に結合する２つ以上の結合ドメインを含み得る。
【００３０】
キメラ抗体：可変領域がある動物種に由来し、そして定常領域が別の動物の種に由来する抗体。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒトの定常領域を有する抗体であり得る。
【００３１】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二重鎖構成をとる場合、通常対になるヌクレオチド。
【００３２】
相補性決定領域またはＣＤＲ：抗体認識ドメインおよび抗体結合ドメインを共に形成する、抗体のＶ−ドメイン内の領域。
【００３３】
相補的ヌクレオチド配列：ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子のヌクレオチド配列であって、別の一本鎖のヌクレオチド配列に十分に相補的であり、結果として生じる水素結合により特異的にその一本鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列。
【００３４】
保存される：ヌクレオチド配列が予め選択された配列の正確な相補体にランダムでなくハイブリダイズする場合、そのヌクレオチド配列は、予め選択された（参照）配列に関して保存される。
【００３５】
保存的置換：本明細書において使用される場合、用語、保存的置換は、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例としては、１つの疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）の別のものへの置換、または１つの極性残基の別のものへの置換（例えば、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、グルタミンのアスパラギンへの置換、等）が挙げられる。用語、保存的置換はまた、置換されたポリペプチドを有する分子もまた同じ機能を有するという条件で、置換されていない元のアミノ酸の代わりでの置換されたアミノ酸の使用を含む。
【００３６】
定常領域または定常ドメインまたはＣ−ドメイン：定常領域は、そこで保存的置換を含み得る所定のアイソタイプの中にアミノ酸残基配列を含む抗体分子のそれらの構造部分である。例示的な重鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＨ５として当該分野で公知の免疫グロブリン分子のそれらの部分である。例示的な軽鎖免疫グロブリン定常領域は、ＣＬとして当該分野で公知の免疫グロブリンのその部分である。
【００３７】
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）：この用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントをいい、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインの間で対になるには短すぎるリンカーを使用して、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対にされ、そして２つの抗原結合部位が生み出される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）でより十分に記載されている。
【００３８】
解離定数、Ｋｄ：レセプターとそのリガンド（例えば、抗体とその抗原）との間の結合力（または親和力またはアビディティ）を記載する尺度。Ｋｄが小さいほど、結合は強い。
【００３９】
下流：配列転写または読み上げの方向で、ＤＮＡの非コード鎖に沿った３’から５’方向またはＲＮＡ転写に沿った５’から３’方向に移動するＤＮＡ配列にさらに沿うこと。
【００４０】
二重鎖ＤＮＡ：二重鎖の塩基対に存在する相補的塩基の各々の間を１つ以上の水素結合で結合される実質的に相補的ポリヌクレオチドの２つの鎖を含む、二本鎖核酸分子。塩基対を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド塩基またはデオキシリボヌクレオチド塩基のいずれかであり得るので、成句「二重鎖ＤＮＡ」は、２つのＤＮＡ鎖を含むＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖（ｄｓＤＮＡ）または１つのＤＮＡ鎖および１つのＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のいずれかをいう。
【００４１】
融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチドおよび２つのポリペプチドを１つの連続するポリペプチドに作動可能に連結する連結配列（ｌｉｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなるポリペプチド。融合ポリペプチドに連結された２つのポリペプチドは、代表的には２つの独立した供給源に由来し、それゆえ融合ポリペプチドは、天然では通常連結されるとは見られない２つの連結ポリペプチドを含む。
【００４２】
Ｆｖ：ＶＨおよびＶＬの両方を含む、二重鎖抗体フラグメント。
【００４３】
遺伝子：ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸。遺伝子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。
【００４４】
ヒト抗体フレームワーク：ヒト免疫グロブリンに由来する、抗原結合部位を有し、その分子の本質的に残りすべてがヒト免疫グロブリン由来の部分である、分子。
【００４５】
ヒト化抗体フレームワーク：非ヒト種由来の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有するのに対して、その分子の残りの免疫グロブリン由来の部分のいくらかまたはすべては、ヒト免疫グロブリンに由来する、分子。その抗原結合部位は、１つ以上のヒト定常ドメインに融合する非ヒト免疫グロブリン由来の完全な可変ドメイン、または可変ドメインの適切なヒトフレームワーク領域に移植される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含み得る。ヒト化抗体では、ＣＤＲは、マウスモノクローナル抗体に由来し得、そして抗体の他の領域は、ヒト由来である。
【００４６】
ハイブリダイゼーション：相補的塩基対の間の水素結合の確立によって二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成する、実質的に相補的なヌクレオチド配列の対形成（核酸の鎖）。ハイブリダイゼーションは、競合的に阻害され得る２つの相補的ポリヌクレオチドの間の特異的な（すなわち、ランダムでない）相互作用である。
【００４７】
免疫グロブリン：血清抗体であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤが挙げられる。
【００４８】
免疫グロブリンアイソタイプ：異なるＨ鎖を有するＩｇに与えられる名称。その名称は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、２、３、４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、２）、ｓＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤである。
【００４９】
免疫学的に異なる：成句、免疫学的に異なるは、２つのポリペプチドを区別する能力をいい、そのポリペプチドの一方に特異的に結合し、そして他方のポリペプチドに特異的に結合しない抗体の能力に関する。
【００５０】
個体：一定の状態（特に、以下に規定される「感染症」）に感受性であることを必要とする、生存する動物またはヒト。被験体は、抗原刺激および増殖因子刺激に反応し得る白血球を有する生物体である。好ましい実施形態において、被験体は、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウス）が挙げられる）である。最も好ましい実施形態において、被験体は、ヒトである。
【００５１】
感染症：連鎖球菌属の１種以上（特に肺炎連鎖球菌）によりもたらされる障害。
【００５２】
単離された：天然の環境の構成要素から同定されおよび分離されおよび／または回収され、本明細書によって開示される種々の結合メンバー、ポリペプチドおよびヌクレオチドを記載するために使用される。その天然の環境の汚染要素は、そのポリペプチドの診断上の使用もしくは治療上の使用に通常干渉する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク様溶質または非タンパク様溶質を含み得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、精製される。
【００５３】
標識および表示手段：種々の文法的な形において、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接的にまたは間接的に関与する単一の原子および分子をいう。
【００５４】
モノクローナル抗体：種々の文法的な形において、成句、モノクローナル抗体は、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位のうち１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体は、代表的にそれが免疫反応する任意の抗原に対し単一の結合親和力を示す。モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対し免疫特異性である複数の抗体結合部位を有する抗体分子（例えば、二重特異性モノクローナル抗体）を含み得る。
【００５５】
マルチマーの：１つより多くのポリペプチドを含むポリペプチド分子。マルチマーは、ダイマーで２つのポリペプチドを含み得、そしてマルチマーはトリマーで３つのポリペプチドを含み得る。マルチマーは、ホモマーで２つ以上の同一のポリペプチドを含むか、またはマルチマーはヘテロマーで２つ以上の同一でないポリペプチドを含み得る。
【００５６】
核酸：ヌクレオチドのポリマーであって、単鎖または二重鎖のいずれかである。
【００５７】
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸塩、および窒素含有複素環式塩基からなる、ＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位。その塩基は、グリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、そして塩基と糖とのその組み合わせが、ヌクレオシドである。そのヌクレオシドが、ペントースの３’または５’位に結合されるリン酸基を含む場合、それはヌクレオチドといわれる。作動可能に連結されるヌクレオチドの配列は、本明細書において代表的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」（およびそれらの文法的に相当するもの）といわれ、そして本明細書において、その左から右方向が従来の５’末端から３’末端の方向とする式で示される。
【００５８】
ヌクレオチド類似体：Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵと構造的に異なるが、核酸分子中の通常のヌクレオチドと置き換わるのに十分類似するプリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチド。
【００５９】
肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）：肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と同意語として使用される。
【００６０】
ポリクローナル抗体：ポリクローナル抗体は、特定の所定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、それゆえ、ポリクローナル抗体は、その抗原内の異なるエピトープを認識し得る。
【００６１】
ポリヌクレオチド：単鎖ヌクレオチドまたは二重鎖ヌクレオチドのポリマー。本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチド」（およびその文法的に相当するもの）は、全範囲の核酸を包含する。ポリヌクレオチドは、代表的に２つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの直鎖からなる核酸分子をいう。その正確な大きさは、多くの因子に依存し、同様にその因子は、当該分野で周知のように使用の最終状態に依存する。本発明のポリヌクレオチドとしては、プライマー、プローブ、ＲＮＡ／ＤＮＡセグメント、オリゴヌクレオチドまたは「オリゴ」（比較的短いポリヌクレオチド）、遺伝子、ベクター、プラスミド等が挙げられる。
【００６２】
ポリペプチド：成句、ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基の間のアミド結合以外の結合を含まないアミノ酸残基を含む分子をいう。
【００６３】
レセプター：レセプターは、別の分子と特異的に（ランダムではなく）結合し得る分子（例えば、タンパク質、糖タンパク質等）である。
【００６４】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：２つのＤＮＡセグメントを作動可能に連結することによって産生されるＤＮＡ分子。従って、組換えＤＮＡ分子は、天然には通常共に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を有さない（すなわち、進化的に異なる）ｒＤＮＡは、「異種」といわれる。
【００６５】
特異性：用語、特異性は、ポリペプチドの所定の抗原と免疫反応する（特異的に結合する）潜在的な抗原結合部位の数をいう。そのポリペプチドは、１つのポリペプチドであっても、ジスルフィド結合によって結合される２つ以上のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、単一特異性で抗原に特異的に結合する１つ以上の抗原結合部位を含み得、またはポリペプチドは二重特異性であり２つの免疫学的に異なる抗原に特異的に結合する２つ以上の抗原結合部位を含み得る。従って、ポリペプチドは、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合する、複数の抗原結合部位を含み得る。
【００６６】
血清型：種々の特徴において互いに異なる多くの菌株からなる連鎖球菌属の種の中の細菌の識別。血清型を規定する通常使用される特徴は、特定の抗原分子である。
【００６７】
単鎖抗体またはｓｃＦｖ：成句、単鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部位を含む単一のポリペプチドをいう。その上、ＦｖフラグメントのＨ鎖およびＬ鎖は、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、直接かまたはペプチドを介してかのいずれかによって連結され得る。例えば、組換え技術によって、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする、合成リンカーが作製され得る（単鎖抗体、ｓＡｂとして公知である；Ｂｉｒｄら １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら １９８８ ＰＮＡＳ ８５：５８７９−５８８３）。そのような単鎖抗体はまた、用語「抗体」の中に包含され、多重特異性結合分子の設計および操作において結合決定基として利用され得る。
【００６８】
上流：ＤＮＡ転写の方向に対して反対方向に、それゆえ非コード鎖の５’から３’へ、またはｍＲＮＡの３’から５’へ進むこと。
【００６９】
結合価：用語、結合価は、ポリペプチド中の潜在的な抗原結合部位（すなわち、結合ドメイン）の数をいう。ポリペプチドは、一価で１つの抗原結合部位を含み得るか、またはポリペプチドは二価で２つの抗原結合部位を含み得る。さらに、ポリペプチドは、四価で４つの抗原結合部位を含み得る。各抗原結合部位は、１つの抗原に特異的に結合する。ポリペプチドが、１つより多くの抗原結合部位を含む場合、各抗原結合部位は、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合し得る。従って、ポリペプチドは、複数の抗原結合部位を含み得、それゆえ多価であり得、ポリペプチドは、同じかまたは異なる抗原に特異的に結合し得る。
【００７０】
Ｖドメイン：可変ドメインは、抗原結合部位を形成するアミノ酸残基配列を含む抗体分子のその構造部分である。典型的な軽鎖免疫グロブリン可変領域は、ＶＬとして当該分野において公知の免疫グロブリン分子のその部分である。
【００７１】
ＶＬ：軽鎖の可変ドメイン。
【００７２】
ＶＨ：重鎖の可変ドメイン。
【００７３】
ベクター：細胞中で自発的に複製可能であり、ＤＮＡセグメント（例えば、遺伝子またはポリヌクレオチド）の複製を引き起こすようにその結合するセグメントを、作動可能に連結し得る、ｒＤＮＡ分子。１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を導き得るベクターは、本明細書において「発現ベクター」といわれる。特に重要なベクターは、逆トランスクリプターゼを使用して産生されるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）のクローニングを可能にする。
【００７４】
（説明）
上に記載されるように、本発明は、結合メンバー、特に肺炎連鎖球菌タンパク質（より具体的には肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質（ＰｓａＡ））を特異的に認識しそれに結合することが可能である抗体またはそのフラグメント、に関する。本発明による結合メンバーは、肺炎連鎖球菌によってもたらされる疾患の処置、ならびに上記細菌を検出する診断方法およびキットに使用されるのに特に有用である。肺炎球菌表面付着因子Ａタンパク質は、好ましくは、図１５（配列番号５０）または配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００７５】
従って、本発明による結合メンバーは、好ましくは、免疫学的に活性である（例えば、抗体として、例えば、抗原に結合可能であり、抗原を免疫活性細胞に提示可能である）べきであり、それによって上記抗原の食菌作用を促進する。
【００７６】
特に、その結合メンバーは、抗体（例えば、当該分野において公知の任意の適切な抗体）であり、特に、本明細書に規定されるような抗体（例えば、抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメント）、または単鎖抗体である。抗体分子は、代表的に、ジスルフィド結合によって一緒に共有結合される、４つのポリペプチド、２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖からなる基本単位を有する、Ｙ型分子である。これらの鎖の各々は、別々のドメインに折りたたまれている。重鎖および軽鎖の両方のＣ末端領域は、配列中に保存され、定常領域と呼ばれる（Ｃドメインとしても公知である）。Ｎ末端領域（Ｖドメインとしても公知である）は、配列において可変であり、そして抗体特異性に関与する。抗体は、主にＶドメインに位置する６つの短い相補性決定領域（図１を参照のこと）を通じて、抗原を特異的に認識し、それに結合する。
【００７７】
本発明による抗体は、特に有用である。なぜなら、それらは、ＰｓａＡに対して強い親和力を有するからである。
【００７８】
それゆえ、本発明による結合メンバーは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する、結合ドメインを有する。より好ましくは、１×１０−７Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄ、より好ましくは１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは５×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは５×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満である。
【００７９】
ＰｓａＡに対する結合メンバーの親和力は、好ましくは、実施例３に記載されるように測定される。
【００８０】
上記結合メンバーは、好ましくは、上に規定されるような単離された結合メンバーであり、より好ましくは、単離された、純粋な結合メンバーである。
【００８１】
（相補性決定領域）
理論に束縛されることなく、高結合力は、以下に示される配列の１つ以上の次のモチーフを有するアミノ酸配列を結合ドメインに組み込むことによってもたらされると考えられている。
【００８２】
より具体的には、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ１領域を含む：
配列番号２：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号１０：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号１８：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号２６：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号３４：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
配列番号４２：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ１
そして／または、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ２領域を含む：
配列番号４：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号１２：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号２０：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号２８：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号３６：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ２
配列番号４４：図１８Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ２
そして／または、上記結合ドメインは、好ましくは、以下から選択される配列を含むＣＤＲ３領域を含む：
配列番号６：図１６Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号１４：図１６Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号２２：図１７Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号３０：図１７Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号３８：図１８Ａのアミノ酸配列のＣＤＲ３
配列番号４６：図１８Ｂのアミノ酸配列のＣＤＲ３
より好ましくは、上記結合ドメインの可変部分は、以下から選択される配列、または、そのホモログ（ここで、ホモログは、本明細書の他のところで規定される）を含む：
配列番号８：図１６Ａのアミノ酸配列
配列番号１６：図１６Ｂのアミノ酸配列
配列番号２４：図１７Ａのアミノ酸配列
配列番号３２：図１７Ｂのアミノ酸配列
配列番号４０：図１８Ａのアミノ酸配列
配列番号４８：図１８Ｂのアミノ酸配列。
【００８３】
より好ましくは、上記結合ドメインは、以下の群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列のセットを含む：
アミノ酸配列セット配列番号２またはそのホモログ、配列番号４またはそのホモログ、および配列番号６またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号１０またはそのホモログ、配列番号１２またはそのホモログ、および配列番号１４またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号１８またはそのホモログ、配列番号２０またはそのホモログ、および配列番号２２またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号２６またはそのホモログ、配列番号２８またはそのホモログ、および配列番号３０またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号３４またはそのホモログ、配列番号３６またはそのホモログ、および配列番号３８またはそのホモログ、あるいは
アミノ酸配列セット配列番号４２またはそのホモログ、配列番号４４またはそのホモログ、および配列番号４６またはそのホモログ。
【００８４】
上記のアミノ酸配列セットにおいて、アミノ酸配列は、好ましくは、結合ドメインの中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として配置される（すなわち、他のアミノ酸配列によって別々に間隔を空けられる）。
【００８５】
上述のホモログのいずれか１つの相同性は、好ましくは、上に規定されるようなＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する１つ以上のホモログを含む、結合ドメインを与える。
【００８６】
（同一性および相同性）
用語「同一性」または「相同性」は、配列をアラインメントし、全体の配列に対して最大限の同一性パーセントを達成するために必要な場合にはギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部でないとみなした後に、比較される対応配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合を意味する、と解釈されるものとする。Ｎ末端もしくはＣ末端の伸長も挿入も同一性または相同性を減少させていると解釈されないものとする。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において公知である。配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５）を使用して測定され得る。このソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変に関して一定の相同性を割り当てることによって類似の配列を対応させる。
【００８７】
本明細書において特定される１つ以上の配列のホモログは、規定された配列と比較して、１つ以上のアミノ酸で異なり得るが、同じ機能を実行し得る（すなわち、ホモログは、所定の配列の機能的等価物と考えられ得る）。
【００８８】
上述のように、本明細書において、任意の所定の配列のホモログは、以下のように規定され得る：
ｉ）所定のアミノ酸配列によっても認識される抗原を認識し得るアミノ酸配列を含むホモログ、および／または
ｉｉ）抗原に選択的に結合し得るアミノ酸配列を含むホモログ（ここで、抗原はまた、所定の配列によって選択的に結合される）、および／または
ｉｉｉ）所定の配列（例えば、配列番号８）を含む結合ドメインと実質的に同じかまたはより高いＰｓａＡに対する結合親和力を有するホモログ。
【００８９】
ホモログの例は、１つ以上の保存的アミノ酸置換（所定のアミノ酸の同じグループ内の１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む）、または複数の保存的アミノ酸置換（ここで、各保存的置換は、所定のアミノ酸の異なるグループ内の置換によって生成される）を含む。
【００９０】
従って、ホモログは、互いに独立した保存的置換を含み得、このホモログの少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）が、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）が、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのロイシン（Ｌｅｕ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアスパラギン酸（Ａｓｐ）が、Ｇｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）が、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸（好ましくは、ＴｙｒおよびＴｒｐならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸）で置換され、そのホモログの少なくとも１つのチロシン（Ｔｙｒ）が、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸（好ましくは、ＰｈｅおよびＴｒｐならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸）で置換され、そのフラグメントの少なくとも１つのアルギニン（Ａｒｇ）が、ＬｙｓおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのリジン（Ｌｙｓ）が、ＡｇｒおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのアスパラギン（Ａｓｎ）が、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）が、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）が、Ｐｈｒ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓならびにそれらの独立のホモログからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換され、そのホモログの少なくとも１つのシステイン（Ｃｙｓ）が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群より選択されるアミノ酸で置換される。
【００９１】
保存的置換は、好ましい所定の配列の任意の位置に導入され得る。しかし、非保存的置換（特に、１つ以上の任意の位置における非保存的置換であるが、これに限定されない）を導入することもまた望まれ得る。
【００９２】
本明細書において、配列の機能的に等価なホモログの形成をもたらす非保存的置換は、例えば、ｉ）極性（例えば、極性側鎖を有する残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ）または荷電したアミノ酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、またはＬｙｓ）に置換された非極性側鎖を有する残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）あるいは荷電した残基もしくは極性残基を非極性残基へ置換すること）の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｉ）ポリペプチドの骨格の配向（例えば、別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙの置換または別の残基によるＰｒｏまたはＧｌｙへの置換）へのその効果の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｉｉ）電荷（例えば、負に荷電した残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を正に荷電した残基（例えば、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇ）への置換）（逆もまた同じ）の点で実質的に異なり；ならびに／あるいはｉｖ）立体的なかさ高さ（例えば、かさ高い残基（例えば、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒ）のより小さな側鎖を有する残基（例えば、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）への置換）（逆もまた同じ）の点で実質的に異なる。
【００９３】
１つの実施形態において、アミノ酸の置換は、それらの疎水性値および親水性値、ならびにアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（電荷、大きさ、等を含む）に基づいて、行なわれ得る。種々の前述の特徴を考慮する例示的なアミノ酸置換は、当業者に周知であり、そして、アルギニンおよびリジン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。
【００９４】
好ましい実施形態において、上記結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列に少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列を有するホモログを含む。
【００９５】
より好ましくは、その相同性は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列に少なくとも６５％（例えば少なくとも７０％相同、例えば少なくとも７５％相同、例えば少なくとも８０％相同、例えば少なくとも８５％相同、例えば少なくとも９０％相同、例えば少なくとも９５％相同、例えば少なくとも９８％相同）である。
【００９６】
より好ましい実施形態において、上に述べた割合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択される配列と比較されるように、ホモログの配列の同一性に関連する。
【００９７】
（エピトープ）
本発明による抗体は、好ましくは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜１５０に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在するエピトープを認識し、それに結合する。好ましくは、そのエピトープは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜１００に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在し、より好ましくは、配列番号５０または配列番号５６のＮ末端アミノ酸残基１〜６５に対応するＰｓａＡのＮ末端部分に局在する。
【００９８】
好ましい実施形態において、上記抗体は、配列番号５１、配列番号５２または配列番号５３に対応する配列を有するフラグメントの群から選択されるフラグメントを認識し、それに結合する。
【００９９】
さらに、本発明による抗体は、エピトープを認識し、それに結合し、ここで、そのエピトープはまた、以下の群から選択される配列を含む可変部分を有する抗体によって認識されることが、好ましい：
配列番号８：図１６Ａのアミノ酸配列
配列番号１６：図１６Ｂのアミノ酸配列
配列番号２４：図１７Ａのアミノ酸配列
配列番号３２：図１７Ｂのアミノ酸配列
配列番号４０：図１８Ａのアミノ酸配列
配列番号４８：図１８Ｂのアミノ酸配列。
【０１００】
（血清型）
上述のように、肺炎連鎖球菌の９０の異なる血清型が、同定されている。本発明による結合メンバーは、２つ以上の異なる肺炎球菌血清型（例えば３つ以上の異なる肺炎球菌血清型、例えば４つ以上の異なる肺炎球菌血清型、例えば５つ以上の異なる肺炎球菌血清型）に由来するＰｓａＡに結合し得ることが好ましい。最も好ましくは、本発明による結合メンバーは、本質的に全血清型に由来する肺炎球菌を認識し、それに結合することが可能である。
【０１０１】
（モノクローナル抗体／ポリクローナル抗体）
本発明の１つの実施形態において、結合メンバーは、抗体であり、ここで、その抗体は、哺乳動物またはモノクローナル抗体の混合物由来のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。好ましい実施形態において、結合メンバーは、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。その抗体は、いかなる種類の抗体であり得るが、好ましくは、ＩｇＧ抗体である。より好ましくは、その抗体は、ＩｇＧ１抗体またはそのフラグメントである。
【０１０２】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、抗体であり、ここで、あらゆる抗体分子は、類似であり、従って、同じエピトープを認識する。モノクローナル抗体は、一般に、ハイブリドーマ細胞株によって産生される。モノクローナル抗体および抗体合成ハイブリドーマ細胞を作製する方法は、当業者に周知である。抗体産生ハイブリドーマは、例えば、不死化された細胞株を用いる抗体産生Ｂリンパ球の融合によって調製され得る。
【０１０３】
モノクローナル抗体は、以下の工程によって産生され得る。全手順において、動物は、抗原（例えば、上述のようなポリクローナル抗体調製用のタンパク質（またはそのペプチド））を用いて免疫される。その免疫は、代表的に、免疫原を免疫有効量（すなわち、免疫応答を生じるのに十分な量）で免疫学的に適格な哺乳動物に投与することによって達成される。好ましくは、その哺乳動物は、げっ歯類（例えば、ウサギ、ラットまたはマウス）である。その哺乳動物は、次いで、その哺乳動物にとって、記載されたような高親和力抗体分子を産生するのに十分な期間、追加免疫スケジュールで維持される。抗体産生細胞の懸濁液は、所望の抗体を分泌する各免疫化された哺乳動物から取り出される。高親和力抗体を産生するのに十分な時間の後、その哺乳動物（例えば、マウス）は、屠殺され、そして抗体産生リンパ球が、１つ以上のリンパ節、脾臓および末梢血から得られる。脾臓細胞が好ましく、そして脾臓細胞は当業者に周知の方法を使用して生理培地中で個々の細胞に機械的に分離され得る。その抗体産生細胞は、マウス骨髄腫株の細胞への融合によって不死化される。マウスリンパ球は、マウスホモログ骨髄腫を用いて、高率の安定的な融合を生じるが、ラット体細胞、ウサギ体細胞およびカエル体細胞もまた、使用され得る。所望の抗体産生動物の脾臓細胞は、一般に融剤（例えば、ポリエチレングリコール）の存在下で、骨髄腫細胞と融合することにより不死化される。融合パートナーとして適切な多くの骨髄腫細胞株のいずれもが、標準的な技術（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能なＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１骨髄腫株、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫株またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）を用いて使用される。
【０１０４】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ技術の当業者に周知の他の方法によっても産生され得る。代替的な方法（「コンビナトリアル抗体ディスプレイ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ）」方法といわれる）が、特定の抗原特異性を有する抗体フラグメントを同定および単離するように開発されており、そしてモノクローナル抗体を産生するために利用され得る。
【０１０５】
ポリクローナル抗体は、特定の所定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、それゆえ、ポリクローナル抗体は、その抗原中の異なるエピトープを認識し得る。一般に、ポリクローナル抗体は、予め抗原を用いて免疫された、哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｙ Ｅｄ ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８に記載の任意の方法により調製され得る。ポリクローナル抗体は、任意の適切な哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、およびヒツジ）に由来し得る。
【０１０６】
（特異性）
上記結合メンバーは、ＰｓａＡタンパク質に関して単一特異性であり得、ここで、ＰｓａＡタンパク質に関しての特異性とは、その結合メンバーが、ＰｓａＡタンパク質と免疫反応することを意味する。別の実施形態において、その結合メンバーは、ＰｓａＡタンパク質に関して特異的である少なくとも１つの部分を有し、二重特異性または多重特異性である。
【０１０７】
（一価抗体）
単一特異性結合メンバーは、一価（すなわち、ただ１つの結合ドメインを有する）であり得る。
【０１０８】
一価抗体に関して、免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸残基配列は、当該分野でＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４として公知の抗体分子の構造部分を含む。ＣＬとして当該分野で公知のそれらの結合メンバーが好ましい。好ましいＣＬポリペプチドは、ＣκおよびＣλからなる群から選択される。
【０１０９】
さらに、上記定常ドメインが、重鎖定常ドメインまたは軽鎖定常ドメイン（それぞれ、ＣＨまたはＣＬ）のいずれかであり得る限り、種々の一価結合メンバー組成物は、本発明によって意図される。例えば、軽鎖定常ドメインは、別の軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインのいずれかにジスルフィド架橋することが可能である。対照的に、重鎖定常ドメインは、２つの独立したジスルフィド架橋を形成し得、別の重鎖および軽鎖の両方に架橋することが可能であるか、または重鎖のポリマーを形成することが可能である。
【０１１０】
従って、別の実施形態において、本発明は、一価ポリペプチドを含む組成物を意図し、ここで、上記定常鎖ドメインＣは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基を有し、そしてその組成物は、そのジスルフィド架橋によって共有結合する少なくとも２つの一価ポリペプチドを含む。
【０１１１】
好ましい実施形態において、上記定常鎖ドメインＣは、ＣＬまたはＣＨのいずれかであり得る。Ｃが、ＣＬである場合、そのＣＬポリペプチドは、好ましくは、ＣκおよびＣλからなる群から選択される。
【０１１２】
別の実施形態において、本発明は、Ｃが、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基を有するＣＬである場合を除いて、上記のような一価ポリペプチドを含む結合メンバー組成物を意図し、そうしてその組成物は、そのジスルフィド架橋によって共有結合する２つの一価ポリペプチドを含む。
【０１１３】
（多価）
本発明の別の実施形態において、結合メンバーは、少なくとも２つの結合ドメインを有する多価結合メンバーである。その結合ドメインは、同じリガンドまたは異なるリガンドに対して特異性を有し得る。
【０１１４】
（多重特異性（二重特異性を含む））
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも２つの異なる実体に対し親和力を有しかつその実体に結合し得る、多重特異性結合メンバーに関する。多重特異性結合メンバーは、二重特異性結合メンバーを含み得る。
【０１１５】
１つの実施形態において、上記多重特異性分子は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）であり、その二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる結合ドメインを保有し、その結合ドメインの少なくとも１つは、抗体起源である。
【０１１６】
本発明の二重特異性分子はまた、単鎖二重特異性分子である（例えば、単鎖二重特異性抗体、１つの単鎖抗体と結合ドメインとを含む単鎖二重特異性分子、または２つの結合ドメインを含む単鎖二重特異性分子）。多重特異性分子はまた、単鎖分子であっても少なくとも２つの単鎖分子を含んでもよい。
【０１１７】
上記多重特異性（二重特異性を含む）抗体は、当業者に公知の任意の適切な様式によって産生され得る。
【０１１８】
二重特異性全抗体を産生するための従来のアプローチは、各々所望の特異性を有する抗体を産生する２つのハイブリドーマ細胞株を融合することであった。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のランダムな会合が理由で、これらのハイブリッドハイブリドーマは、重鎖および軽鎖の１０組までの異なる組合せの混合物を産生し、その組合せの１つだけが二重特異性抗体である。それゆえ、これらの二重特異性抗体は、所望の産生物の収量をかなり減少させる、扱いにくい手順で精製されなければならない。
【０１１９】
代替的なアプローチは、ヒンジにおいてかまたは上記のように遺伝的に導入されるＣ末端のシステインを介してかのいずれかの、システイン残基の化学的架橋結合による２つの抗原特異性のインビトロ連結を含む。そのようなインビトロ構築の改良点は、ヘテロダイマーの形成を促進するペプチドとのＦａｂの組換え融合を使用することによって達成された。しかし、これらの方法の二重特異性産生物の収量は、１００％よりずっと少ない。
【０１２０】
二価または二重特異性抗体フラグメントを産生する、より効率的なアプローチ（インビトロでの化学的構築工程を含まない）が、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）によって記載された。このアプローチは、細菌から分泌されるｓｃＦｖが、しばしばモノマーおよびダイマーの両方として存在するという観察を利用する。この観察は、異なる鎖のＶＨおよびＶＬは、対になり得、従ってダイマーおよびより大きい複合体を形成することを示唆した。そのダイマー抗体フラグメント（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらによって「ダイアボディ」とも名付けられる）は、実際に、インビボで構築された小さい二価抗体フラグメントである。２つの異なる抗体１および抗体２のＶＨおよびＶＬを結合することによって、「交差」鎖であるＶＨ １ＶＬ ２およびＶＨ ２−ＶＬ １を形成するために、ダイマー化プロセスが、両方の抗原結合部位を再構築するために示された。その２つの結合部位の親和力は、開始ｓｃＦｖに等しいか、またはＶＨおよびＶＬと共有結合しているポリペプチドリンカーが除去される場合、１０倍増加し、従って、各々ＶＨと対になっていないＶＬと直接共有結合するＶＨからなる、２つのタンパク質を生成することが示された。二重特異性抗体フラグメントを産生するこの戦略はまた、いくつかの特許出願に記載された。特許出願ＷＯ ９４／０９１３１（ＳＣＯＴＧＥＮ ＬＴＤ；優先日１９９２年１０月１５日）は、結合ドメインが、２つの鎖に存在するかまたはｓｃＦｖに結合しているかのいずれかであるＶＨおよびＶＬ領域の両方に由来する二重特異性結合タンパク質に関し、他方で、他の融合抗体ドメイン（例えば、Ｃ末端定常ドメイン）は、ダイマー構築物を安定化するように使用される。特許出願ＷＯ ９４／１３８０４（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ／ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＵＮＣＩＬ；最先優先日１９９２年１２月４日）は、互いに結合し得、それによってＶドメインが、リンカーを用いてまたはリンカーを用いずに結合され得るＶＨおよびＶＬを含むポリペプチドに関する。
【０１２１】
ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４（また、特許出願ＷＯ ９４／１３８０６；ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ；優先日１９９２年１２月１１日にも記載される）は、Ｅ．ｃｏｌｉの単鎖二重特異性抗体フラグメントのインビボ産生を報告した。二価タンパク質の二重特異性は、異なる特異性を有し、柔軟なポリペプチドリンカーによって遺伝子レベルで一緒に連結される、２つの予め産生された一価ｓｃＦｖ分子に基づいていた。伝統的に、単鎖抗体フラグメントが、言及される場合はいつも、ポリペプチドリンカーの存在下または非存在下で１つの（対応する）軽鎖に連結する１つの重鎖からなる単一分子が、関係する。「ダイアボディ」アプローチ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）および特許出願ＷＯ ９４／０９１３１）を通じてかまたは「二重ｓｃＦｖ」アプローチ（ＭａｌｌｅｎｄｅｒおよびＶｏｓｓ、１９９４および特許出願ＷＯ ９４／１３８０６）によって二価または二重特異性抗体フラグメントを作製する場合、再びそのＶＨは、（対応する）ＶＬに連結する。
【０１２２】
上述の多重特異性分子は、多くの方法によって作製され得る。例えば、すべての特異性は、同じベクターでコードされ得、そして同じ宿主細胞中に発現されそして組み立てられる。この方法は、その多重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質，Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。二重特異性抗体または多重特異性抗体を調製するための種々の他の方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；および同第５,４８２,８５８号に記載されている。
【０１２３】
本発明による二重特異性結合メンバーまたは多重特異性結合メンバーを使用することによって、本発明は、単一特異性／一価結合メンバーと比較していくつかの利点を提供する。
【０１２４】
二重特異性／多重特異性結合メンバーは、連鎖球菌タンパク質、特にＰｓａＡを特異的に認識し、それに結合し得る第一結合ドメインを有する一方で、他の結合ドメインは、他の目的で使用され得る。
【０１２５】
１つの実施形態において、少なくとも１つの他の結合ドメインは、連鎖球菌タンパク質に結合するために使用される（例えば、第一結合ドメインと比較して、同じ連鎖球菌タンパク質上の別のエピトープに結合する）。それによって、連鎖球菌属種に対する特異性は、増加され得、ならびに結合メンバーのアビディティを増加し得る。
【０１２６】
別の実施形態において、上記少なくとも１つの他の結合ドメインは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に特異的に結合するために使用され得る。少なくとも他の結合ドメインは、治療方法において結合メンバーの効果を増加させるために、免疫活性細胞（例えば、白血球、マクロファージ、リンパ球、好塩基性細胞、および／または好酸性細胞）に結合し得ることが、好ましい。これは、少なくとも１つの他の結合ドメインが、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質、例えば、分化抗原群タンパク質（ＣＤ）の任意のもの（特に、ＣＤ６４および／またはＣＤ８９））から選択されるタンパク質）に特異的に結合し得ることを確立することによって達成され得る。ＣＤ６４特異性を有する二重特異性抗体を産生する方法は、Ｍｅｄａｒｅｘ，ＩｎｃへのＵＳ６，０７１３５１７に記載されている。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」は、白血球またはリンパ球である免疫細胞をいう。特定のエフェクター細胞は、特定のＦｃレセプターを発現し、そして特定の免疫機能を実行する。例えば、ＣＤ８９レセプターを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は、標的細胞の特異的な殺作用および免疫系の他の構成要素へ抗原を提示すること、または抗原を提示する細胞に結合することに関与する。
【０１２８】
（ヒト化抗体フレームワーク）
ヒトの治療に非ヒト抗体を使用することは、いつも望ましいわけではない。なぜなら、非ヒト「外来」エピトープは、処置される個体中に免疫反応を誘発し得るからである。非ヒト抗体に関連する問題を除去または縮小するために、キメラ抗体誘導体（すなわち、ヒト定常領域（Ｆｃ）を用いて非ヒトＦａｂ可変領域結合決定基を結合する「ヒト化」抗体分子）を操作することが望まれる。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の等価な抗原特異性および親和性によって特徴付けされ、そしてヒトに投与される場合、免疫原性が低く、それゆえ処置される個体によってはより耐えられやすくなる。
【０１２９】
従って、１つの実施形態において、上記結合メンバーは、ヒト化抗体フレームワーク（またヒト化抗体とも呼ばれる）を保有する結合ドメインを有する。
【０１３０】
ヒト化抗体は、一般に、ヒト抗体由来の領域および非ヒト抗体（例えば、げっ歯類抗体）由来の領域を含む、キメラ抗体である。ヒト化（新形態化またはＣＤＲ移植とも呼ばれる）は、異種の供給源（通常、げっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を減少し、ヒト免疫グロブリンに対する相同性を増加し、およびヒト免疫系のそれらの活性化を改良するよく確立した技術である。従って、ヒト化抗体は、代表的には、あるＣＤＲ残基およびおそらくあるフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似の部位由来の残基によって置換される、ヒト抗体である。
【０１３１】
ヒト化抗体は、その抗原および他の都合のよい生物学的特性に対する高い親和力を保持することが、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によると、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および種々の概念的なヒト化産生物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、通常入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列のありえそうな三次元立体配座構造を説明および表示するコンピュータープログラムは、入手可能である。これらの表示の検定は、候補免疫グロブリン配列（すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力を影響する残基の分析）の機能におけるある残基のありえそうな役割の分析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基は、レシピエントから選択および組合わされ得そして配列を読み込み得、それゆえ、所望の抗体の特徴（例えば、目標抗原に対する増加した親和性）が最大化されるが、抗原結合を直接的におよび最も実質的に影響するのは、ＣＤＲ残基である。
【０１３２】
ＭＡｂをヒト化する１つの方法は、キメラ抗体の産生に関連し、そのキメラ抗体において、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が、第二の抗体（好ましくは、ヒト抗体）由来の定常ドメインに融合されている。そのようなキメラ化手順を実行するための方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ １２０ ６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＥＰ−Ａ−０ １２５ ０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ＥＰ−Ａ−０ １７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびＥＰ−Ａ−０ １９４ ２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。抗体のヒト化のより複雑な形態は、可変領域ドメインの再設計に関与し、それゆえ、非ヒト抗体結合部位を形成するアミノ酸は、ヒト抗体可変領域のフレームワークへと組み込まれている（Ｊｏｎｅｓら、１９８６）。
【０１３３】
本発明のヒト化抗体は、非ヒト抗体由来のＣＤＲによってヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部を置換し得る任意の方法によって産生され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用され得る方法を記載し（１９８７年３月２６日に申請されたＵＫ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＧＢ ２１８８６３８Ａ）、その内容は、参考として明白に援用されている。そのヒトＣＤＲは、以下の実施例に記載されるようにオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を使用して非ヒトＣＤＲによって置換され得る。
【０１３４】
１つの例として、本発明のヒト化抗体は、以下の短い説明の中に記載されるように作製され得る。本発明のヒト化抗体は、以下のプロセスによって産生され得る：
（ａ）従来の技術によって、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を用いてオペロンを含む発現ベクターを構築するプロセスであって、その中で、抗体結合特異性を保持するために必要なＣＤＲおよび可変ドメインフレークワーク領域のそのような最小限の部分が、非ヒト免疫グロブリンに由来し、そして、抗体鎖の残存する部分がヒト免疫グロブリンに由来し、それによって本発明のベクターを産生するプロセス；
（ｂ）従来の技術によって、相補的抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を用いてオペロンを含む発現ベクターを構築するプロセスであって、その中で、ドナー抗体結合特異性を保持するために必要なＣＤＲおよび可変ドメインフレークワーク領域のそのような最小限の部分が、非ヒト免疫グロブリンに由来し、そして、抗体鎖の残存する部分がヒト免疫グロブリンに由来し、それによって本発明のベクターを産生するプロセス；
（ｃ）本発明のトランスフェクトされる宿主細胞を産生するために従来の技術によって宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトするプロセス；および
（ｄ）本発明のヒト化抗体を産生するために従来の技術によってそのトランスフェクトされる細胞を培養するプロセス。
【０１３５】
上記宿主細胞は、本発明の２つのベクターと同時トランスフェクトされ得、その第一ベクターは、軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含み、そして第二ベクターは、重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含む。その２つのベクターは、異なる選択マーカーを含むが、そうでなければ、抗体重鎖コード配列および抗体軽鎖コード配列から離れており、好ましくは同一であり、可能な限り、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を保証する。あるいは、１つのベクターが使用され得、そのベクターは、軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドの両方をコードする配列を含んでいる。軽鎖および重鎖のためのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはその両方を含み得る。
【０１３６】
本発明の変化される抗体を発現するために使用される宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であるか、または真核生物細胞であり得る。特に、この目的のためによく規定されたタイプの哺乳動物細胞（例えば、骨髄腫細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）が、使用され得る。
【０１３７】
本発明のベクターが構築され得る一般の方法、本発明の宿主細胞を産生するために必要とされるトランスフェクション方法およびそのような宿主細胞由来の本発明の抗体を産生するために必要とされる培養方法は、全て従来の技術である。同様に、一度産生される場合、本発明のヒト化抗体は、以下に記載されるような標準的な手順によって精製され得る。
【０１３８】
（ヒト抗体フレームワーク）
より好ましい実施形態において、本発明は、結合メンバーに関連し、ここで、上記結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークによって保有される（すなわち、ここで、この抗体は、ヒト化抗体よりも高度のヒトペプチド配列を有する。
【０１３９】
ヒトタンパク質に対して導かれるヒトｍＡｂ抗体は、マウス免疫系ではなく完全なヒト免疫系を保有するトランスジェニックマウスを使用して、産生され得る。所定の抗原により免疫されるこれらのトランスジェニックマウス由来の脾細胞は、ヒトタンパク質由来のエピトープに対し特異的親和力を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生するために使用される（例えば、Ｗｏｏｄら 国際出願ＷＯ ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇら 国際出願ＷＯ ９２／０３９１８；Ｋａｙら 国際出願９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら １９９４ Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら １９９４ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら １９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら １９９３ Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら １９９３ ＰＮＡＳ ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら １９９１ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３−１３２６参照のこと）。
【０１４０】
そのようなトランスジェニックマウスは、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｎｄａｌｅ、Ｎ．Ｊ．から入手可能である。キメラマウスおよび生殖細胞系変異体マウスの抗体重鎖連結領域（ＩＨ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じる記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配置の転移は、抗原攻撃の際にヒト抗体の産生を生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８（１９９２）参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリに由来され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９（１９９６））。
【０１４１】
好ましい実施形態において、上記抗体は、実施例１に記載される方法によって産生される。
【０１４２】
（フラグメント）
本発明の１つの実施形態において、上記結合メンバーは、抗体のフラグメント（好ましくは、抗原結合フラグメントまたは可変領域）である。本発明を用いるに有用な抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々１つの抗原結合部位を有する、２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと呼ばれる）および残余の「Ｆｃ」フラグメント（容易に結晶化するその能力のためにそう呼ばれる）を産生する。ペプシン処理は、抗原に架橋結合し得る２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメント、および残余の他のフラグメント（ｐＦｃ’と称される）を産生する。さらなるフラグメントとしては、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられ得る。
【０１４３】
抗体フラグメントＦａｂ、抗体フラグメントＦｖおよび抗体フラグメントｓｃＦｖは、これら抗体フラグメントが、ただ１つの抗原結合部位を保有する点で、完全な抗体と異なる。２つの結合部位を有する組換えフラグメントは、いくつかの方法で産生される（例えば、ＦｖのＶＨのＣ末端（Ｃｕｍｂｅｒら、１９９２）もしくはｓｃＦｖのＶＬのＣ末端（ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９２）に導入されるシステイン残基の化学的架橋結合によってか、またはＦａｂ’のヒンジシステイン残基を通して（Ｃａｒｔｅｒら、１９９２））。
【０１４４】
好ましい抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターに選択的に結合する抗体のいくつかのまたは実質的に全ての能力を保持する。いくつかの好ましいフラグメントは、以下のように規定される：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、酵素パパインを用いる完全な抗体の消化によって産生され、無傷の軽鎖および１つの重鎖の部分を産生し得る。
（２）Ｆａｂ’は、抗体分子のフラグメントであり、そしてペプシンを用いて完全な抗体を処理し、続いて還元することによって得られ、無傷の軽鎖および重鎖の部分を産生し得る。２つのＦａｂ’フラグメントが、１つの抗体分子につき得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端におけるいくつかの残基の添加に関してＦａｂフラグメントと異なる。
（３）（Ｆａｂ’）２は、それに続く還元を伴わず、酵素ペプシンを用いて完全な抗体を処理することによって得られる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって結合される２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである。
（４）Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体フラグメントである。この領域は、固い、非共有結合における１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定するために相互作用するのは、この構成である。集合的に、その６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかし、１つの可変ドメイン（または、抗原に対し特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）ですら、抗原を認識し、それに結合する能力を有するが、全体の結合部位よりも弱い親和力である。
【０１４５】
本発明の１つの実施形態において、上記抗体は、遺伝子的に融合される単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子的に操作される分子として規定される、単鎖抗体（「ＳＣＡ」）である。そのような単鎖抗体はまた、「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントといわれる。一般に、そのＦｖポリペプチドは、さらにそのｓＦｖに抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含む。
【０１４６】
本発明による上記抗体フラグメントは、当業者に公知の任意の適切な方法によって産生され得る。いくつかの細菌発現系が、活性抗体フラグメントを産生するために既に開発されている（例えば、種々の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｂｅｔｔｅｒら、１９８８、ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９８８、Ｃａｒｔｅｒら、１９９２）、酵母（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８）および糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１９９３））が記載されている）。これらの代替的系において組換えタンパク質の収量は、比較的高くあり得る（高細胞密度発酵のＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌されるＦａｂに関して１〜２ｇ／ｌ、Ｃａｒｔｅｒら、１９９２参照のこと）かまたは低レベル（例えば、発酵槽の酵母のＦａｂに関して約０．１ｍｇ／ｌ（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８）、および融合タンパク質ＣＢＨＩ−Ｆａｂに関しては１５０ｍｇ／ｌおよび発酵槽のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのＦａｂに関しては１ｍｇ／ｌ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１９９３））であり得、そしてそのような産生物は、哺乳動物細胞（ハイブリドーマ、骨髄腫、ＣＨＯ）おける完全な抗体の産生と比較して非常に安い。
【０１４７】
上記フラグメントは、Ｆａｂ’としてかまたはＦｖとして産生され得るが、さらに、ＶＨおよびＶＬは、その組合せがｓｃＦｖとして公知である、柔軟なポリペプチドリンカーによってどちらかの順序で遺伝子的に連結され得ることが示される。
【０１４８】
（単離された核酸分子／ベクター／宿主細胞）
１つの局面において、本発明は、上に規定されるような結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子に関する。１つの実施形態において、その核酸分子は、軽鎖をコードし、別の核酸は、重鎖をコードする。その２つの核酸分子は、分離し得るか、またはそれらは、１つの核酸分子に融合され、必要に応じてリンカー配列によって間隔を空けられ得る。抗体フラグメントとの関係で特に、その核酸分子は、全結合メンバーをコードし得るが、結合メンバーの設計に依存して、これはまた、いくつかのより大きな結合メンバーに関連し得る。一度その核酸分子が、宿主細胞中に配置される場合、その核酸分子は、好ましくは、ＤＮＡ配列（より好ましくは、結合メンバーの発現を促進するその上流末端調節要素を含むＤＮＡ配列）である。
【０１４９】
それゆえ、１つの実施形態において、本発明は、以下の群から選択されるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの相補鎖に関する。
ｉ）図１６ａ、図１６ｂ、図１７ａ、図１７ｂ、図１８ａ、および図１８ｂのヌクレオチド配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）図１６ａ、図１６ｂ、図１７ａ、図１７ｂ、図１８ａ、および図１８ｂの群から選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む結合メンバーをコードするポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ポリヌクレオチドｉ）によってコードされるポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、そのフラグメントは、
ａ）ｉｉ）の結合メンバーによってもまた認識される抗原を認識し得え、および／または、
ｂ）抗原に選択的に結合し得、ここで、その抗原はまた、ｉｉ）の結合メンバーによって選択的に結合され、および／または、
ｃ）所定の配列（例えば、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８）を含む結合ドメインとして、実質的にＰｓａＡに対する結合親和力と類似か、またはより高いＰｓａＡに対する結合親和力を有する。
ｉｖ）ポリヌクレオチドの相補鎖が、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）のいずれかに規定されるようなポリヌクレオチドと一緒に厳しい条件下でハイブリダイズし、およびｉｉｉ）に規定されるようなポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
ｖ）ｉ）〜ｉｖ）のいずれかに規定されるようなポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に変質するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【０１５０】
本発明は、さらに上に規定されるような核酸分子を含むベクター（１つの核酸につき１つのベクターか、または同じベクターに２つ以上の核酸のいずれか）に関する。そのベクターは、好ましくは、上記核酸分子によってコードされる抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
なお別の局面において、本発明は、上に規定されるような核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【０１５２】
また、本発明は、上に規定されるような結合メンバーを発現するように操作される細胞株に関連し、この細胞株は、例えば、マウスリンパ球および不死化細胞株のハイブリドーマである。その細胞株は、いずれの適切な細胞株であり得るが、細胞株Ｐ３が好ましい。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞株が、好まれる。
【０１５３】
（結合メンバーの精製）
産生後、本発明による上記結合メンバーは、好ましくは、精製される。使用される精製方法は、いくつかの因子（必要とされる精製度、抗体の供給源、抗体の意図される使用、抗体が産生される種、抗体のクラスおよび、その抗体がモノクローナル抗体である場合の、抗体のサブクラス、が挙げられる）に依存する。
【０１５４】
抗体を含むポリペプチドを精製する任意の適切な従来の方法としては、沈殿反応およびカラムクロマトグラフィーが挙げられ、そして精製分野の当業者に周知であり、交差流ろ過法、硫安塩析、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動を含み、そして同様のものが使用され得る。
【０１５５】
抗免疫グロブリン抗体を用いて抗体を精製する方法は、単一精製手順かまたは連続精製手順のいずれかであり得る。単一精製および連続精製の方法は、精製分野の当業者に周知である。単一工程精製手順において、抗体は、単一抗免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。連続精製手順において、抗体は、第一抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合され、特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。第一抗免疫グロブリン抗体由来の溶離液は、次いで第二抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。好ましい実施形態において、抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。
【０１５６】
通常使用される精製方法は、精製される抗体が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇによってかまたは抗免疫グロブリン抗体によって結合される、アフィニティークロマトグラフィーである。当業者に周知のアフィニティークロマトグラフィーの別の方法は、その別個の抗原に対する抗体の特異性結合である。
【０１５７】
多重特異性抗体を（二重特異性抗体を含む）精製するために特に、連続精製手順が、使用され得、ここで、２つ以上の可変ドメインを含む二重特異性抗体は、第一抗原に特異的に結合され、次いで第二抗原に特異的に結合される。
【０１５８】
代替的な実施形態において、２つ以上の可変領域を含む二重特異性抗体は、抗体を第一精製工程において第一抗原にそして第二精製工程において第二抗原に特異的に結合することによる連続精製により精製される。
【０１５９】
抗免疫グロブリン抗体を用いて抗体を精製する方法は、単一精製手順かまたは連続精製手順のいずれかであり得る。単一精製および連続精製の方法は、精製分野の当業者に周知である。単一工程精製手順において、抗体は、単一抗免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。連続精製手順において、抗体は、第一抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合され、特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。第一抗免疫グロブリン由来の溶離液は、次いで第二抗免疫グロブリン抗体に特異的に結合される。特異的に結合されない分子は、洗浄工程で除去され、そして特異的に結合される分子は、特異的に溶出される。好ましい実施形態において、抗体は、重鎖定常領域および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。より好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧの重鎖定常領域およびκおよびλの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される第一抗免疫グロブリン抗体および第二抗免疫グロブリン抗体によって連続的に精製される。さらにより好ましい実施形態において、抗免疫グロブリン抗体は、κおよびλの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体からなるグループから選択される。
【０１６０】
（診断方法）
本発明はまた、本明細書において記載される診断方法によるサンプル中の細菌の存在（および好ましくは量）を検出することが望ましい場合、生物学的サンプルの連鎖球菌属（特に肺炎連鎖球菌）の存在をアッセイするための診断システム（好ましくはキット形態における）を記載する。
【０１６１】
上記診断システムは、少なくとも１つのアッセイを実行するに十分な量の、本発明による結合メンバー組成物（好ましくは、分離してパッケージ化される試薬として、より好ましくは使用説明書も）を含む。
【０１６２】
上記生物学的サンプルは、組織、組織抽出物、液状サンプルまたは体液サンプル（例えば、血液、血漿または血清）であり得る。
【０１６３】
パッケージ化されるとは、固体マトリックスまたは固体物質（本発明の結合メンバーを定められた範囲中に保持し得る、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリ炭酸塩）、紙、ホイル等）の使用をいう。従って、例えば、パッケージは、ミリグラムの量の意図される標識結合メンバー調製物を含むために使用されるガラスバイアルであり得るか、またはそれは、ミリグラムの量の意図される標識結合メンバーが、作動可能に添付されている（すなわち、リガンドを結合し得るように連結される）マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１６４】
「使用説明書」は、代表的に、試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方法パラメーター（例えば、試薬および混合されるサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の保守期間、温度、緩衝条件等）を記載する明白な表現を含む。
【０１６５】
本発明の診断システムはまた、好ましくは、予め選択されるリガンドと複合体化される結合メンバーを含む結合反応複合体の形成を伝達し得る標識または表示手段を含む。
【０１６６】
任意の標識または表示手段は、発現されたポリペプチドまたは診断方法において使用されるファージ粒子に連結されるかまたは組み込まれ得る。そのような標識は、それ自身が臨床診断化学において周知である。
【０１６７】
標識手段は、抗体または抗原を変性することなくそれらに化学的に結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であり得る。適切な蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル塩化物（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアン酸塩（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニル塩化物（ＲＢ ２００ ＳＣ）等のような蛍光色素である。免疫蛍光分析技術の説明は、参考として本明細書に援用されているＤｅＬｕｃａ、「Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｓ ａ Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．、ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）の中に見られる。
【０１６８】
好ましい実施形態において、上記表示グループは、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、等）である。そのような主な表示グループが、酵素（例えば、ＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼ）である場合、さらなる試薬が、レセプター−リガンド複合体（免疫反応物）が形成する事実を視覚可能とするために必要とされる。ＨＲＰのためのそのようなさらなる試薬としては、過酸化水素および酸化染料前駆体（例えば、ジアミノベンジジン）が挙げられる。グルコースオキシダーゼと一緒に有用なさらなる試薬は、２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズサイアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１６９】
放射性元素はまた、有用な標識剤であり、そして本明細書において説明的に使用される。例示的な放射標識剤は、ガンマ線放射を生成する放射性元素である。それ自体がガンマ線を放射する元素（例えば、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒ）は、ガンマ線放射生成放射性元素表示グループの１つのクラスを示す。特に好ましいのは、１２５Ｉである。有用な標識手段の別のグループは、それ自体陽電子を放射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。その陽電子は、動物の体に存在する電子に遭遇する際にガンマ線を精製するように放出される。また有用なものは、β放射体（例えば、１１１Ｉｎまたは３Ｈ）である。
【０１７０】
標識、ポリペプチドおよびタンパク質またはファージの連結（すなわち、各々の標識）は、当該分野で周知である。例えば、タンパク質は、培養培地の構成要素として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝的組み込みによって標識され得る。例えば、Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：３−４６（１９８１）を参照のこと。活性化された官能基を通じたタンパク質接合またはタンパク質連結の技術は、特に適用可能である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第８巻補遺 ７：７−２３（１９７８）、Ｒｏｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、３：８８９−８９４（１９８４）、および米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこと。
【０１７１】
診断システムはまた、特異性結合剤（好ましくは、分離パッケージとして）を含み得る。「特異性結合剤」は、本発明の結合メンバー種かまたはそのような種を含む複合体に選択的に結合し得る分子の実体であるが、それ自体は本発明の結合メンバーではない。例示的な特異性結合剤は、抗体分子、相補的タンパク質またはそのフラグメント、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ａ、等である。好ましくは、その特異性結合剤が、結合メンバー種に結合するのは、その種が複合体の一部として存在する場合である。
【０１７２】
好ましい実施形態において、上記特異性結合剤は、標識される。しかし、上記診断システムが、標識されていない特異性結合剤を含む場合、その結合剤は、代表的に増幅手段または増幅試薬として使用される。これらの実施形態において、その標識特異性結合剤が、増幅手段に特異的に結合し得るのは、その増幅手段が、試薬種含有複合体に結合される場合である。
【０１７３】
本発明の診断キットは、液状サンプル中の予め選択されるリガンドの量を検出するための「ＥＬＩＳＡ」型式の中で使用され得る。「ＥＬＩＳＡ」は、サンプル中に存在する抗原の量を検出および数量化するために、固相および酵素−抗原接合または酵素−抗体接合に結合される抗体かまたは抗原を使用する酵素結合イムノソルベント検定法をいい、そして本方法に対し容易に適用可能である。
【０１７４】
従って、いくつかの実施形態において、本発明の結合メンバーは、被験体診断システム中のパッケージを含む固体支持体を形成するために固体マトリックスに添付され得る。
【０１７５】
試薬は、代表的に水溶培地からの吸着によって固体マトリックスに添付されるが、当業者に周知であるタンパク質およびポリペプチドに適用可能である添付の他の様式が、使用され得る。例示的な吸着方法は、本明細書に記載されている。
【０１７６】
有用な固体マトリックスはまた、当該分野において周知である。そのような物質は、水不溶性であり、そしてそのような物質としては、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から登録商標ＳＥＰＨＡＤＥＸの下で入手可能である架橋されたデキストラン；アガロース；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．から入手可能である直径約１μｍから約５ｍｍのポリスチレンビーズのビーズ；ポリビニル塩化物、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、ニトロセルロースに基づく繊維またはナイロンに基づく繊維（例えば、シーツ、ストリップまたはパドル）；あるいは管、プレートまたはマイクロタイタープレートのウェル（例えば、ポリスチレンまたはポリビニル塩化物から生成されたもの）が挙げられる。
【０１７７】
本明細書において記載される任意の診断システムの結合メンバー種、標識特異性結合剤または増幅試薬が、液体分散としてかまたは実質的に乾燥粉末（ｄｒｙ ｐｏｗｅｒ）として（例えば、凍結冷凍された形態で）溶液中に提供され得る。表示手段が酵素である場合、その酵素の基質はまた、系の分離パッケージ中に提供され得る。固体支持体（例えば、以前に記載されたマイクロタイタープレートおよび１つ以上の緩衝液）はまた、この診断アッセイ系に分離してパッケージ化される元素として含まれ得る。
【０１７８】
（診断方法）
本発明はまた、生物学的サンプルに代表的に存在する連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）の存在（および好ましくは量）を決定するための種々のアッセイ方法を意図する。
【０１７９】
それゆえ、本発明は、個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法に関し、その方法は、
その個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
上で規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを生物学的サンプルに添加する工程、
その生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによってその疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する。
【０１８０】
上記結合される結合メンバーは、サンプル中の連鎖球菌属の量まで直接的にまたは間接的に検出され得る。
【０１８１】
当業者は、種々の周知の臨床診断化学手順があることを理解しており、その手順の中で、本発明の結合試薬が、結合反応産生物を形成するために使用され得る。その結合反応産生物の量は、サンプル中のリガンドの量に関する。従って、例示的なアッセイ方法が本明細書に記載されるが、その発明は、そのように限定されない。
【０１８２】
競合的または非競合的のいずれかである種々の異質のプロトコルおよび同質のプロトコルが、本発明のアッセイ方法を実行する際に使用され得る。
【０１８３】
結合条件は、レセプターのリガンド結合活性を維持するものである。これらの条件としては、約４℃から約５０℃の温度範囲、約５から約９のｐＨ値の範囲および、蒸留水のおよそのイオン強度から１モルの塩化ナトリウムのイオン強度まで変動するイオン強度が挙げられる。
【０１８４】
検出工程は、免疫学分野で周知のように、複合体または結合試薬（複合体のレセプター構成要素）のいずれかに対して導かれ得る。従って、二次的結合試薬（例えば、レセプターに対して特異的な抗体）が、利用され得る。
【０１８５】
あるいは、上記複合体は、標識レセプター分子を使用したことがあることによって検出可能であり得、それによって複合体を標識する。この場合の検出は、その複合体に存在する標識を検出することを含む。
【０１８６】
さらなる診断方法は、リガンドを架橋するために、本発明の１つの実施形態の結合メンバー組成物の多重結合価を利用し得、それによって、多重リガンドおよびポリペプチドの凝集体を形成し、沈降可能な凝集体を産生する。この実施形態は、免疫沈降の周知の方法と比較可能である。この実施形態は、結合条件下で結合混合物を形成するために、本発明の結合メンバー組成物とサンプルを混合する工程を含み、形成される結合複合体を単離する分離工程が後に続く。代表的に、単離は、混合物から凝集体を除去するために、遠心沈殿法またはろ過により達成される。結合複合体の存在は、検出される予め選択されるリガンドの存在を示す。
【０１８７】
（薬学的組成物）
好ましい局面において、本発明は、本明細書において記載される治療方法を実施するために有用な薬学的組成物を意図する。本発明の薬学的組成物は、活性成分としてそこで溶解または分散した、本明細書に記載される結合メンバーの少なくとも１つの種と一緒に、生理学的に耐性なキャリアを含む。好ましい実施形態において、その薬学的組成物が免疫原性ではないのは、治療目的でヒト個体に投与される場合であり、その目的が、免疫反応を誘導するものではない場合である。
【０１８８】
１つの局面において、本発明は、上に規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを含む薬学的組成物に関する。好ましい実施形態において、その薬学的組成物は、その処置の効果を増加させるために、上に規定されるような少なくとも２つの異なる結合メンバーを含む。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」、「生理学的に耐性可能な」およびその文法上の異形は、それらが組成物、キャリア、希釈剤および試薬をいうように、可換的に使用され、そしてその物質が、望まれない生理学的効果（例えば、吐き気、めまい感、急性胃ぜん動等）の生成を伴わずヒトへまたはヒトに投与し得ることを示す。
【０１９０】
そこで溶解または分散される活性成分を含む薬理学的組成物の調製は、当該分野においてよく理解されている。代表的に、そのような組成物は、溶液または懸濁液、水溶液または非水溶液のように無菌の注射可能物質として調製されるが、使用前に液体中の液剤または懸濁剤として適切な固体形態もまた調製され得る。その調製はまた、乳化され得る。
【０１９１】
上記活性成分は、薬学的に受容可能でありそして活性成分と一致しそして本明細書において記載される治療方法の使用に適切な量の賦形剤と混合され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等およびそれらの組み合わせである。さらに、もし所望ならば、その組成物は、活性成分の有効性を促進する微量の二次的物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝液等）を含み得る。
【０１９２】
本発明の薬学的組成物は、そこでその構成要素の薬学的に受容可能な塩を含み得る。薬学的に受容可能な塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、またはそのような有機酸（例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸等）により形成される、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）、およびそのような有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等）に由来し得る。
【０１９３】
生理学的に耐性なキャリアは、当該分野において周知である。液状キャリアの模範例は、活性成分および水に加えて物質を含まない、または緩衝液（生理的ｐＨ値におけるリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方（例えば、リン酸緩衝化生理水））を含む、無菌の水溶液である。なおさらに、水溶性キャリアは、１つ以上の緩衝液塩、ならびに塩（例えば、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、ブドウ糖、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質）を含み得る。
【０１９４】
液体組成物はまた、水に加えるおよび水を除く液相を含み得る。そのようなさらなる液相の模範例は、グリセリン、植物油（例えば、綿実油）、有機エスター（例えば、オレイン酸エチル）、および水−油乳剤である。
【０１９５】
薬学的組成物は、代表的に１ｇの全薬学的組成物あたり抗体の少なくとも０．１重量％の量の、本発明の結合メンバーを含む。重量％は、全組成物に対する抗体の重量の割合である。従って、例えば、０．１重量％は、１００ｇの全組成物あたり０．１ｇの抗体である。
【０１９６】
本発明はまた、本発明の抗体を含む、医薬または薬学的組成物を調製するための方法に関連し、その医薬は、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症））に関連する疾患または障害の免疫療法のために使用されており、生理学的に受容可能なキャリアと上に規定されるような少なくとも１つの結合メンバーを混合することを含む。
【０１９７】
さらに、本発明は、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）に関連する疾患または障害（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症）の処理のための薬学的組成物を生成するために、上に規定されるような結合メンバーの使用に関する。
【０１９８】
上記薬学的組成物はまた、さらに抗生物質剤（例えば、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリンおよびアミノ配糖体から選択される抗生物質）を含む、および／または免疫刺激剤（例えば、サイトカイン、インターフェロン、増殖因子（例えば、ＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦ））を含む、キットの一部であり得る。そのキットの一部は、同時投与、連続投与または分離投与のために使用され得る。
【０１９９】
さらに、上記薬学的組成物は、連鎖球菌タンパク質ＰｓａＡと組み合わせて（特に、ワクチンとして）、本発明による結合メンバーを含み得る。タンパク質ＰｓａＡと本発明による結合メンバーを組み合わせることによって、その組み合わせ産生物の免疫化特性は、タンパク質ＰｓａＡ単独よりも優良であることが、見い出された。このことは、そのＰｓａＡが、結合メンバーによって免疫系に提示される事実に起因し得る。
【０２００】
（治療方法）
本発明による結合メンバーは、その高い親和力および特異性に起因して治療方法において特に有用である。それゆえ、その結合メンバーは、連鎖球菌属（特に、肺炎連鎖球菌）に関連する疾患または障害（例えば、肺炎、髄膜炎および敗血症）に関して免疫療法的に使用され得る。
【０２０１】
本発明の結合メンバーと一緒に本明細書において使用される場合、用語「免疫療法的に」または「免疫療法」は、予防的投与ならびに治療投与の両方を示す。従って、その結合メンバーは、疾患の可能性および／または重症度を減少させるため危険性が高い患者に投与され得、活性感染が既に証明されている患者に投与され得、または感染の危険性のある患者に投与され得る。
【０２０２】
本発明の結合メンバーの投与のための投与量の範囲は、疾患の症状が回復するかまたは感染の可能性が減少する、望ましい効果を生成するに十分な範囲である。一般に、その投与量は、年齢、条件、性別および患者が有する疾患の程度によって変動し、そして当業者によって決定され得る。その投与量は、いずれかの合併症の事象の際に個々の医者によって調節され得る。
【０２０３】
本発明の結合メンバーの治療有効量は、代表的に、生理学的に耐性な組成物に投与される場合、１ｍｌあたり約０．１μｇから約１００μｇ／ｍｌ（好ましくは、約１μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、および通常約５μｇ／ｍｌ）の血漿濃度を達成するに十分であるような抗体の量である。別の言い方をすれば、その投与量は、１日または数日間、１日に１回以上の投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇまで（好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで）変動し得る。
【０２０４】
本発明の結合メンバーは、注射によってまたは長期にわたって徐々に注入することによって非経口的に投与され得る。上記感染は、全身的であり得、そしてそれゆえ薬学的組成物の静脈投与によって最も頻繁に処理され得るが、他の組織および送達手段は、組織を標的にすることが、疾患の減少を生じる可能性がある場合に意図される。従って、本発明の抗体は、非経口的に（例えば、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、胸腔内に、経皮内に）投与され得、そしてぜん動手段によって送達され得る。
【０２０５】
本発明の結合メンバーを含む薬学的組成物は、従来的に静脈投与される（例えば、１つの単位投与の注射によるように）。本発明の薬学的組成物に関して使用される場合、用語「単位投与」は、被験体に対する単一の投与量として適切な物理的に個別の単位をいい、各単位は、必要とされる希釈剤（すなわち、キャリア、またはビヒクル）と関連する所望の治療効果を産生するように計算される所定の量の活性物質を含む。
【０２０６】
上記治療方法は、さらに上で規定されるようなキットの一部の使用を含み得る。
【実施例】
【０２０７】
本発明は、さらに以下の実施例を通じて説明される；その実施例は、本発明を限定するように構成されない。
【０２０８】
（実施例１）
（抗ＰｓａＡ抗体の産生）
完全にヒト抗体を産生する能力を有するマウスを、使用した。そのマウスは、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃから得られたＨｕＭＡｂ−マウスであった。
【０２０９】
Ｈｉｓ６−ｐｓａＡタンパク質（ここで、ＰｓａＡタンパク質は、図１５に示される配列を有する）を、免疫実験のための抗原として使用した。これらのタンパク質の濃度を、分光光度計によって計算し、そしてこれらの精製度を、銀染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。タンパク質を、適切に、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、およびアジュバントとしてＲＩＢＩを使用して、免疫のために調製した。１２匹から１８匹の雄ＨｕＭＡｂマウスのグループを、全ての免疫実験のために使用した。各マウスを、３週間間隔で２０μｇ〜５０μｇのＨｉｓ６−ｐｓａＡ（ＰｓａＡアミノ酸配列を、図１５に示す）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射および皮下注射によって免疫した。５×１０ｅ８熱不活性化肺炎連鎖球菌Ｒ６細胞ｉ．ｐ．Ｓｅｒａを受け取った何匹かのマウスを、レトロ軌道出血によってマウスから集めた。ｒｐｓａＡへの滴定量をＥＬＩＳＡによって決定した。マウスを、犠牲にする前に静脈内に追加免疫した。
【０２１０】
８つの融合が実行され、そして６５の実行可能な細胞クローンを生じた。これらを、サブクローニングし、そして以下の１ａに記載される方法によって同定された４２の陽性クローンをさらなる研究のために選択した。これらのうち、２６を選択し、そして精製されたモノクローナル抗体であった。乏しい反応性のため、３つを放棄した；従って、２３のクローンを評価した。その２３のクローンの中で、候補ＭＡｂの優先リストを確立した。その最優先の４つを、インビボモデルでさらに評価した。
【０２１１】
（１ａ）肺炎連鎖球菌Ｒ６結合抗体）
ハイブリドーマ上清を、試薬が過多のサンドイッチ型酵素結合イムノソルベントアッセイの中で肺炎連鎖球菌Ｒ６に対して３つの希釈容液で試験した。
（装置：）
ＥＬＩＳＡ読み取り機、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＥＬ ８００
ＥＬＩＳＡ洗浄機、携帯用モデル
インキュベーター３７℃
ピペット
（材料：）
チップ
試薬トレー
プレートカバー
９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）。
（細菌：）
１０ｅ１０／ｍｌの濃度の冷凍ストックからの肺炎連鎖球菌Ｒ６（ＳＳＩ、Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｔ）。３７℃で急速に解凍し、そしてコーティング緩衝液で１：１００に希釈する。
（試薬：）
Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ ９．６
ＰＢＳ、ｐＨ ７．４
Ｔｗｅｅｎ ２０
ウサギ抗ヒトＩｇＡ，Ｇ，Ｍ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２１２
ウサギ抗マウスＩｇ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２６０
ブタ抗ウサギＩｇ ＨＲＰ接合、ＤＡＫＯ ＃Ｐ２１７
０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ ５．０
ＯＰＤ １０ｍｇ錠剤、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ番号４２６０
Ｈ２Ｏ２
Ｈ２ＳＯ４
コーティング緩衝液：Ｎａ２ＣＯ３ ０．０５Ｍ、ｐＨ ９．６、生産後２週間で期限切れ、４℃にて保存
希釈緩衝液および洗浄緩衝液：０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ、生産後１週間で期限切れ、４℃にて保存
二次抗体：希釈緩衝液中で１：１５００に希釈し、毎日新しく作製する
基質：１０ｍｌのクエン酸に１ＯＰＤ錠を溶解し、そして１０μｌのＨ２Ｏ２を添加する。毎日新しく作製する
停止試薬：１．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４、生産後１年で期限切れ、室温で保存。
（コントロール：）
ブランク：０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ
陽性コントロール：精製されるＲａ−ａ−ＰｓａＡの親和力
（サンプル：）
希釈緩衝液で１：２、１：５０および１：１２５０に希釈したハイブリドーマ培養上清。
（手順：）
１ウェルあたり１００μＬの細菌（＝１０ｅ７）を、９６マイクロウェルにコーティングし、そしてそのプレートを一晩４℃でインキュベートする。過多の液体を放棄する。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして今後１ヶ月の期間は４℃で保存し得る。１００μＬのブランク、陽性コントロールまたはサンプルを添加し、そしてそのプレートを２時間３７℃でインキュベートする。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。１００μＬの二次抗体を添加し、そしてそのプレートを１時間３７℃でインキュベートする。そのプレートを、３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄する。そのプレートを、３００μＬの脱塩水で２回洗浄する。１００μＬの基質を添加し、そしてそのプレートを室温で３０分インキュベートする。１００μＬの停止試薬を添加し、そしてそのプレートを、Ａ４９０ｎｍで読み取る。
【０２１２】
（実施例２）
（モノクローナル抗ＰｓａＡ抗体のインビトロ効果）
実施例１で得られたモノクローナル抗体を、種々の株の肺炎球菌に対してインビトロで試験し、全細菌に対して（ＥＬＩＳＡ）（方法１を参照のこと）、およびウェスタンブロットを使用して（以下の方法２を参照のこと）、抗体を同定した。
【０２１３】
（方法２）
（細菌結合抗体の同定―ウェスタンブロット）
第一の細菌タンパク質を、以下の方法によって、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ Ｇｅｌからポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ移す。
（サンプル：）
電気泳動したＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓ Ｇｅｌ
（装置：）
ブロットモジュールを伴うＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅｌｏｃｋＴＭミニ細胞
電源装置
（材料：）
プレカットブロッティングＰＶＤＦ膜（０．４５μｍ）およびろ紙（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＬＣ２００５）
ピペット
チップ
トレー
（試薬：）
ＮｕＰＡＧＥ転移緩衝液（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ ＃ＮＰ０００６）
ミリＱ等級Ｈ２Ｏ
エタノール ９６％。
【０２１４】
（手順：）
（１つのゲルを移す）
ａ） ５００ｍｌの転移緩衝液を、２５ｍｌの２０Ｘ ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）転移緩衝液および１００ｍｌのエタノール（９６％）を３７５ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏに添加することによって調製した。ブロッティングパッドを、３５０ｍｌの転移緩衝液に浸漬した。ＰＶＤＦ膜を、３０秒間９６％のエタノールに浸漬し、そして緩衝液の中で２分間洗浄し、そして上記ろ紙を、短く転移緩衝液の中に浸漬した。
【０２１５】
予め浸漬したろ紙の一片を、ゲルの上に置き（底板に接着させる）、そして全ての閉じ込められた気泡を、除去した。
【０２１６】
そのプレートを反転し、そうしてそのゲルおよびろ紙が、手袋をはめた手の上でまたは清潔な平面の上で下向きに向き合っていた。その予め浸漬された転移膜をゲルの上に置き、そして閉じ込められた気泡を除去した。
【０２１７】
別の予め浸漬されたろ紙を、上記膜の上に置き、そして全ての閉じ込められた気泡を、除去した。
ｂ） ２つの浸漬されたブロッティングパッドを、ブロットモジュールの陰極（−）コアに置いた。そのゲル／膜集合体を、注意深く取り上げ、そして正しい方向にブロッティングパッドの上に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。２つの浸漬されたブロッティングパッドを、そのｓａｎｄｗｉｃｈの上に置き、そして陽極（+）コアはそのパッドの上にある。
ｃ） 上記ブロットモジュールを、硬く結合し、そしてそれを低緩衝液室（Ｌｏｗｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ）のガイドレールの中に滑らせた。ゲル張力楔状部（Ｇｅｌ Ｔｅｎｓｉｏｎ Ｗｅｄｇｅ）を、低緩衝液室の中に運び、そしてその楔状部を所定の位置に固定した。
【０２１８】
上記ブロットモジュールを、ゲル／膜集合体を覆うまで、転移緩衝液で満たした。外部緩衝液室（Ｏｕｔｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒ）を、６５０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏで満たし、そのふたをその部分の上に置き、そして導線を電源装置に接続した。ＰＶＤＦ膜に向けての転移を、１時間一定の３０Ｖを使用して実行した。予想される開始電流は、１７０ｍＡであった。そして予想される終了電流は１１０ｍＡである。ウェスタンブロットを発展し、そして乾燥した膜を、１週間４℃で閉じたコンテナー／ポーチの中で保管した。
【０２１９】
（２つのゲルを移す）
１． ２つのゲル／膜サンドイッチを調製するために上記工程ａ）を２回繰り返す。
２． 上記ブロットモジュールの陰極コアの上に、２つの予め浸漬したブロッティングパッドを置く。
３． 第一ゲル／膜集合体をブロッティングパッドの上に正確な方向に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。
４． 別の予め浸漬したブロッティングパッドを第一膜集合体の上に添加する。
５． 第二ゲル／膜サンドイッチをブロッティングパッドの上に正確な方向に置き、そうしてそのゲルは、陰極コアに最も近い。
６． （１つのゲルを移す）から工程ｃ）を進める。
上記同定を、以下に記載されるように行なう：
電気泳動的に転移したタンパク質、細菌溶解物またはリポ多糖類を有するＰＶＤＦ膜。
（試薬：）
ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ遮断液／希釈液Ａ+Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＷＢ７０５０
ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ洗浄液（１６×）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＷＢ７００３
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ液状基質、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ番号Ｂ３６７９
Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 番号ＬＣ ６０６０
ウサギ抗ヒト ＩｇＧ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３３６
ウサギ抗マウス Ｉｇ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３１４
ブタ抗ウサギ Ｉｇ ＡＰ、ＤＡＫＯ Ｄ０３０６
ミリＱ等級Ｈ２Ｏ
エタノール ９６％
洗浄緩衝液：
１０ｍｌのＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｒｅｅｚｅ洗浄液（１６×）
１５０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
ブロック化溶液：
５ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
３ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
一次抗体溶液：
７ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
１ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
二次抗体溶液：
７ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏ
２ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ａ）
１ｍｌの遮断液／希釈液（Ｐａｒｔ Ｂ）
５μｌの二次抗体（最終希釈１：２０００）。
【０２２０】
（手順）
１． 乾燥したＰＶＤＦ膜を、９６％のエタノールで再び湿らせ、そして５分間で２回、各々２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏの中でリンスし、工程４に進む。
２． 新しくブロットされた膜を、ガラスプレートに置き、そしてＭＷマーカーを切断する。ＭＷマーカーを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ ＳａｆｅＳｔａｉｎの中で１５分間から３０分間染色し、背景がはっきりするまで３０％のエタノールで脱色する。ミリＱ等級Ｈ２Ｏの中で２回洗浄する。
３． その膜を、５分間で２回、各々２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏの中で洗浄する。
４． 膜を、緩やかに振盪させながら、室温で３０分間覆われたプラスチック皿の１０ｍｌのブロック化溶液の中に置く。ブロック化溶液をデカントする。
５． 緩やかに振盪させながら、室温で５分間２０ｍｌのＨ２Ｏでリンスする。デカントする。もう１度繰り返す。膜を、必要な場合、これからチップに切断し得る。
６． 膜を、緩やかに振盪させながら、室温で１時間１０ｍｌの一次抗体溶液でインキュベートする。あるいは、４℃にて一晩インキュベートする。
７． ５分間で４回、各々２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄する。
８． 膜を、室温で３０分間１０ｍｌの二次抗体溶液でインキュベートする。
９． ５分間で４回、各回２０ｍｌの洗浄緩衝液で洗浄する。
１０． その膜を、２分間で３回、各回２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏでリンスする。
１１． 紫色のバンドが発達するまで（１分から６０分）、膜を、５ｍｌのＮＢＴ／ＢＣＩＰ液状基質の中でインキュベートする。
１２． 膜を、２分間で３回、各回２０ｍｌのミリＱ等級Ｈ２Ｏでリンスすることによって発達を止める。
１３． その膜を、清潔なろ紙の上で乾燥させる。
【０２２１】
（結果）
図２０に、上記インビトロ試験の結果を列挙する。
【０２２２】
（実施例３）
（抗ＰｓａＡ抗体親和力の測定）
以下の一般的な記載を、全ての親和力測定に実施した。
【０２２３】
（使用した機器およびソフトウェア：）
ａ． ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００、表面プラスモン共鳴機器。
ｂ． ＢｉａＥｖａｌ ｖ３．２、データ分析のためのソフトウェア。
ｃ． Ｂｉａｃｏｒｅからの全ての連続緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ／ＨＢＳ−Ｐ）。
【０２２４】
（ＣＭ５チップのアミンを介してタンパク質Ｇを固定する方法（アミン連結方法））
ａ． そのチップを、少なくとも２回適切な緩衝液で正規化する。
ｂ． タンパク質Ｇの０．５μｇ／ｍＬ希釈溶液を、ｐＨ ２．９の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の中に産生する。
ｃ． Ｂｉａｃｏｒｅハンドブックに述べられる方法にしたがって、５μＬ／分の流動速度で、新しく混合されたＥＤＣ ＆ ＮＨＳを流すことによって、そのＣＭ５チップを７分間活性化させる。
ｄ． この活性化された表面の上に２２分間タンパク質Ｇサンプルを注入する。
ｅ． １Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌを１０分間を注入することによって非活性化させる。
ｆ． この方法は、活性化された表面の上の約１００００ＲＵのタンパク質Ｇに連結する。
ｇ． ブランクの表面に対して、同じ活性化および非活性化手順をタンパク質Ｇの注入なしに続ける。
【０２２５】
（ＣＭ５チップのアミンを介してＰｓａＡを固定する方法（アミン連結方法））
ａ． ＣＭ５チップを、上のように正規化した。
ｂ． ＰｓａＡ希釈溶液を、ｐＨ ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液の中で、５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度に、生成する。
ｃ． 新しく混合されたＥＤＣおよびＮＨＳを流すことによって、そのチップを７分間活性化させる。
ｄ． そのチップに捕らえられる量が、所望のレベルに達するまで（本発明者らの場合、３５０ＲＵから８００ＲＵ）、手動注入によって酢酸緩衝液中で生成されたＰｓａＡを注入する。
ｅ． そのチップを、１０分間１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌを注入することによって非活性化させる。
ｆ． そのチップ表面から結合されていない／緩く結合されている分子を除去するために、弱酸または弱塩基を用いてチップを再生成する。
ｇ． そのブランクの表面を、そのタンパク質を注入する工程を除いた、同じ方法によって生成する。
【０２２６】
（ＰｓａＡとの抗ＰｓａＡ抗体の結合のアビディティを決定する方法）
ａ． 抗体のアビディティを測定することに続く一般の方法論は、高流動速度にて抗原表面（上述）の上に少なくとも５つの異なる濃度の抗体を流すことである。その高流動速度は、抗原表面に再結合する抗体を最小限にするために必要である。結合相および解離相は、それぞれ、５分から１０分と３０分から４０分との間で変動し得る。この実験設計は、この抗体のアビディティの測定に結び付くが；本発明者らは、アビディティの推定におけるこの現象の効果を最小限にしようとする。そのデータ分析を、結合／解離の二相性態様を表した領域を注意深く含まなかった後、実行した。その態様は、次いで１：１ラングニュアモデルに一致する。分析のためにデータを選択する方法は、アビディティの推定は、真の親和力により近いことを裏付けする。
ｂ． 抗体濃度：３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬ（結合部位の４０．０２ｎＭ、２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭ、１０．０ｎＭおよび６．６７ｎＭに対応している）。全ての希釈溶液を、連続緩衝液、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ ７．２において生成した。
ｃ． ３０μＬ／分の流動速度。結合相８分、解離相３０分から４０分。
ｄ． その表面の再生成：流動速度１００μＬ／分、緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌを伴う１００ｍＭ ＨＣｌ、時間：１分から２分。
【０２２７】
（実験３ａ）８つの精製される抗ＰｓａＡ ｈｕＭａｂの結合親和力）
（試薬）
【０２２８】
【表１】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０
（結合濃度）：５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量（０２／１２／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ
（固定された量（０２／２０／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：１１４５ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：３５５ＲＵ。
【０２２９】
（実験条件：）
抗体濃度：５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ（６６．７ｎＭ、５３．３６ｎＭ，４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭおよび１３．３４ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：３０μＬ／分
結合時間：８分 解離時間：４０分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：１分。
【０２３０】
（結果：）
【０２３１】
【表２】
（実験３ｂ）３つの精製される抗ＰｓａＡ ＨｕＭａｂの結合親和力）
（試薬：）
【０２３２】
【表３】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：ＣＭ５
（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０ （結合濃度：）５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ。
【０２３３】
（実験条件：）
抗体の濃度：４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび０．５μｇ／ｍＬ（５３．３６ｎＭ，４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭおよび６．６７ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：２５μＬ／分
結合時間：５分 解離時間：４５分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：１分。
【０２３４】
（結果：）
【０２３５】
【表４】
（実験３ｃ）１４の精製される抗ＰｓａＡ ＨｕＭａｂの結合親和力）
（試薬：）
【０２３６】
【表５】
（使用した機器）：Ｂｉａｃｏｒｅ：３０００
（使用したチップ）：ＣＭ５ （チップを調製した日）：０２／１２／０３
（結合緩衝液）：１０ｍＭ酢酸、ｐＨ ４．０ （結合濃度）：５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬ
（固定された量（０２／１２／０３）：）
Ｆｃ１＆３＝ブランク Ｆｃ２＝ＰｓａＡ：３５３ＲＵ Ｆｃ４：ＰｓａＡ：８２４ＲＵ。
【０２３７】
（実験条件：）
抗体の濃度：３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬおよび０．５０μｇ／ｍＬ（４０．０２ｎＭ，２６．６８ｎＭ、１３．３４ｎＭ、１０．０ｎＭ、６．６７ｎＭ）
連続緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ 流動速度：３０μＬ／分
結合時間：８分 解離時間：３０分から４０分
再生成緩衝液：１００ｍＭ ＨＣｌおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ
流動速度：１００μＬ／分 再生成時間：４５秒から１分。
【０２３８】
（結果：）
【０２３９】
【表６】
（実施例４）
（候補抗体のインビボ試験）
肺炎球菌によってもたらされる感染の処理における抗ＰｓａＡ ｈｕＭａｂの効果を、以下に記載されるように決定した。
【０２４０】
（材料：）
・トランスジェニック（ヒトＣＤ６４）雌マウス（８週齢から１２週齢、重量１９ｇから２０ｇ）
・０．９％食塩水（ＭＵ）
・ＰＢＳ ｐＨ ７．０
・５％血小板
・ろ過されたウシブロス
・モノクローナル抗体：
・抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７
・抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５
・抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９
・抗ＰｓａＡ ４−３Ｄ１０
【０２４１】
【数１】
。
【０２４２】
（方法）
（１日目：）
肺炎球菌株を、４×５％血小板に接種し、そして３５℃にて一晩インキュベートした。
（０日目）
その肺炎球菌株を、ろ過されたブロスの中で１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ＭＵ／Ｆ０７４−０１を参照のこと）まで懸濁し、そして１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ（４．９５ｍｌ ＰＢＳの中に５０μｌ １０８ＣＦＵ／ｍｌ）まで希釈し、そしてさらに抗体を用いて希釈する（スキームを参照のこと）。その細菌／抗体混合物を、振盪し、そして３５℃にて１０分間インキュベートし、次いでそのマウスを０．５ｍｌ ｉ．ｐ．で接種する。
【０２４３】
【表７】
（スキーム）
【０２４４】
【表８】
（血液サンプルの回収）
上記マウスを、ＣＯ２を用いて落ち着かせた。切除を腋において行い、そして血液をガラス管０に収集した。１００μｌをガラス１に移し、そして全面的に混ぜ合わせ、その後、１００μｌを、ガラス棒を用いて血小板の上に拡散した。次いで、ＣＦＵ決定を実行した。その残りの血液を、７分間２０００×Ｇにて遠心分離し、そして血清を別の管に移し、−２０℃にて保管した。
【０２４５】
（腹膜液の回収）
上記マウスを犠牲にし、２ｍｌの無菌の食塩水をその腹の中へ注入し、そして１０秒後、その液体を、無菌のパスツールピペットを用いて回収し、そしてエッペンドルフ管へ移した。ＣＦＵ決定を実行した。その残りの腹膜液を−２０℃にて保管した。
【０２４６】
（結果）
上記結果を、図１９Ａ〜図１９Ｅに示す。
【０２４７】
（実施例５）
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７二重特異性抗体の産生）
各ＨｕＭＡｂ、抗ＣＤ６４（８８．５３）、および抗ＰｓａＡ ５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ペプシン消化によって産生し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過クロマトグラフィーによって同質性に精製した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールを各Ｆ（ａｂ’）２に関して図２に示す。このタイプの分析により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの両方が、９５％以上純粋だった。
【０２４８】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図３に示す。このタイプの分析により、８８．５３ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋だった。
【０２４９】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離した。そのＦａｂ’フラグメントを、Ｆａｂ−ＴＮＢ接合を産生するために、ジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）を用いてインキュベートした。
【０２５０】
５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図４に示す。このタイプの分析により、５−９Ａ７ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋だった。
【０２５１】
５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、そして室温にて一晩１：１のモル比において８８．５３ Ｆａｂ−ＴＮＢと混合した。図５に示されるＨＰＬＣプロフィールは、インキュベーションの１８時間後および精製前の接合混合物のプロフィールを示す。このプロフィールは、二重特異性抗体ならびに接合されていないＦａｂ’分子の混合物を示す。
【０２５２】
上記二重特異性抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって汚染されているＦａｂ’分子から精製し、そしてその精製された分子をＨＰＬＣによって分析した。図６に示されるように、８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体を同質性近くまで精製した。
【０２５３】
コントロールに関して、抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９二重特異性抗体を産生した。各ＨｕＭＡｂ、抗ＣＤ６４（８８．５３）、および抗ＣＤ８９（１４Ａ８）のＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ペプシン消化によって産生し、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過クロマトグラフィーによって同質性に精製した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールを各Ｆ（ａｂ’）２に関して図７に示す。このタイプの分析により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの両方が、９５％以上純粋だった。
【０２５４】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図８に示す。このタイプの分析により、８８．５３ Ｆａｂ’は、９０％以上純粋であった。
【０２５５】
８８．５３のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離した。そのＦａｂ’フラグメントを、Ｆａｂ−ＴＮＢ接合を産生するために、ジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）１６ａおよび１６ｂを用いてインキュベートした。
【０２５６】
１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントを、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を用いたＦ（ａｂ’）２フラグメントの中間重鎖のジスルフィド結合の弱い還元によって産生した。その正確な還元状態は、接合前の小規模実験において決定した。サイズ排除ＨＰＬＣを実行し、そしてプロフィールをＦａｂ’に関して図９に示す。このタイプの分析により、１４Ａ８ Ｆａｂ’は、９５％以上純粋だった。
【０２５７】
１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントを、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、そして室温にて一晩１：１のモル比において８８．５３ Ｆａｂ−ＴＮＢと混合した。図１０に示されるＨＰＬＣプロフィールは、インキュベーションの１８時間後および精製前の接合混合物のプロフィールを示す。このプロフィールは、二重特異性抗体ならびに接合されていないＦａｂ’分子の混合物を示す。
【０２５８】
上記二重特異性抗体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって汚染されているＦａｂ’分子から精製し、そしてその精製された分子をＨＰＬＣによって分析した。図１１に示されるように、８８．５３×１４Ａ８二重特異性抗体を同質性近くまで精製した。
【０２５９】
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ二重特異性抗体の結合特異性の特徴付け二重特異性ＥＬＩＳＡ）
１． ＥＬＩＳＡプレートを、組換えＰｓａＡ、５０μｌ／ウェル、５μｇ／ｍｌでコーティングし、そして４℃にて一晩インキュベートした。
２． そのプレートを、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡを用いて遮断した。
３． 二重特異性抗体の滴定をそのプレートに添加した。コントロールは、抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９二重特異性（コントロール二重特異性）および抗ＣＤ６４ Ａｂ、８８．５３、または抗ＰｓａＡ Ａｂ、５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。
４． そのプレートを、次いでヒトＩｇＭのＦｃ部分に連結する可溶性ＣＤ６４からなる融合タンパク質を含む上清を用いてインキュベートした。
５． そのプレートを、最終的に、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体と標識されたアルカリホスファターゼを用いてインキュベートした。陽性ウェルを、アルカリホスファターゼ基質を用いて検出した。
【０２６０】
上記抗ＰｓａＡ×抗ＣＤ６４二重特異性は、このアッセイの中で投与量依存的な結合を示した（図１３を参照のこと）。コントロール二重特異性は、検出されず、なぜなら、それは、ＰｓａＡに結合しないからであり、抗ＣＤ６４ Ｆ（ａｂ’）２は、検出されず、なぜなら、それは、ＣＤ６４に結合するが、ＰｓａＡには結合しないからであり、そして抗ＰｓａＡ Ｆ（ａｂ’）２は、検出されず、なぜなら、それは、ＰｓａＡに結合するが、可溶性ＣＤ６４−ＩｇＭ融合タンパク質には結合しないからである。
【０２６１】
（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡ二重特異性抗体の結合特異性の特徴付けヒトＣＤ６４−トランスジェニックマウス上のＣＤ６４への結合）
血液を、ＣＤ６４トランスジェニックマウスからまたは非トランスジェニック同腹体から摂取し、そして室温にて３０分間３０μｇ／ｍｌの濃度にて８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体を用いてインキュベートした。
【０２６２】
上記血液を洗浄し、次いで室温にて３０分間ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてインキュベートした。赤血球を溶解し、そして残りの白血球を、フローサイトメトリーによって染色のために分析した。リンパ球、単球、および好中球群に対応する領域を、ゲートしそして別々に分析した。結合アッセイの結果を、図１４に示す（Ａ〜Ｃ）。黒線は、ＣＤ６４トランスジェニックマウス由来の細胞の染色を示し、緑線は、非トランスジェニック同腹体由来の細胞の染色を示す。
【０２６３】
ヒトＣＤ６４を、ＣＤ６４トランスジェニックマウスの単球上に発現し、そして、より少ない程度において、ＣＤ６４トランスジェニックマウスの好中球上に発現する。ヒトにおいてそうであるように、ＣＤ６４は、そのトランスジェニックマウスのリンパ球によって発現されない。図１４のデータは、二重特異性抗体は、ＣＤ６４トランスジェニック単球および好中球に結合するが、非トランスジェニックマウス由来のどの細胞群にも結合しないことを示す。
【０２６４】
要約すると、２つの二重特異性抗体（抗ＣＤ６４×抗ＰｓａＡおよび抗ＣＤ６４×抗ＣＤ８９）を産生し、そして同質性まで精製した。８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体は、ＣＤ６４およびＰｓａＡへ同時に結合することが示された。さらに、この二重特異性抗体は、ヒトＣＤ６４トランスジェニックマウスによって発現されるＣＤ６４に結合する。
【０２６５】
（実施例６）
（抗体の配列決定）
実施例３ｂの親和力表に示される抗体を、従来の方法によって配列決定し、そしてこの抗体の可変領域を図に示す。
【０２６６】
９Ａ７（クローン５−９Ａ７） 図１６ａおよび図１６ｂ
１Ｇ９（クローン７−１Ｇ９．１） 図１７ａおよび図１７ｂ
１５Ｅ５（クローン１−１５Ｅ５．２．１） 図１８ａおよび図１８ｂ。
【０２６７】
（実施例７）
（エピトープの局在化の同定）
ＰｓａＡの１５の合成フラグメント（各々は、ＰｓａＡの２５のアミノ酸残基を表し、そして５つのアミノ酸残基を有する隣接フラグメントと重なっている）を、産生した。このフラグメントに結合する抗体を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。本発明による抗体が、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３に対応するＮ末端フラグメントに結合したことを、見い出した。
【０２６８】
（参考文献）
【０２６９】
【表９】
【０２７０】
【表１０】
【０２７１】
【表１１】
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】Ｆａｂフラグメントの模式図。
【図２ａ】８８．５３のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図２ｂ】５−９Ａ７のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図３】８８．５３のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図４】５−９Ａ７のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図５】８８．５３×５−９Ａ７接合混合物のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図６】精製された８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図７ａ】８８．５３のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図７ｂ】１４Ａ８のＦ（ａｂ’）２フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図８】８８．５３のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図９】１４Ａ８のＦａｂ’フラグメントのサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１０】８８．５３×１４Ａ８接合混合物のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１１】精製された８８．５３×１４Ａ８二重特異性抗体のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール。
【図１２】二重特異性抗体の模式図。
【図１３】８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体の二重特異性結合活性。
【図１４】８８．５３×５−９Ａ７二重特異性抗体は、ヒトＣＤ６４トランスジェニックマウスによって発現されたＣＤ６４に結合する。
【図１５】配列番号５０を有するＰｓａＡアミノ酸配列。
【図１６ａ】抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＫ、ここで、Ｖセグメント：Ｌ１５およびＪセグメント：ＪＫ１。
【図１６ｂ】抗ＰｓａＡ ７−１Ｇ９ ＶＨ、ここで、Ｖセグメント：４−３４、Ｄセグメント：不明、およびＪセグメント：ＪＨ４ｂ。
【図１７ａ】抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＫ、Ｖセグメント：Ｌ６、およびＪセグメント：ＪＫ４。
【図１７ｂ】抗ＰｓａＡ １−１５Ｅ５ ＶＨ、Ｖセグメント：３−７、Ｄセグメント：３−１０、Ｊセグメント：ＪＨ６ｂ。
【図１８ａ】抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＫ、Ｖセグメント：Ｌ６、およびＪセグメント：ＪＫ３。
【図１８ｂ】抗ＰｓａＡ ９Ａ７ ＶＨ、Ｖセグメント：３−７、Ｄセグメント：３−１０、およびＪセグメント：ＪＨ６ｂ。
【図１９Ａ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｂ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｃ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｄ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図１９Ｅ】肺炎球菌感染に対する抗ＰｓａＡ抗体の効果を示す４つのグラフ。
【図２０】インビトロ試験の結果の表。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された結合メンバーであって、該結合ドメインは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する、単離された結合メンバー。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該単離された結合メンバーは、純粋な単離された結合メンバーである、単離された結合メンバー。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメントもしくは抗体の単鎖から選択される、結合メンバー。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された結合メンバーであって、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の混合物から選択される、単離された結合メンバー。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して単一特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項６】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して特異的である少なくとも一部分を有し、二重特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して特異的である少なくとも一部分を有し、多重特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項８】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークによって保有される、単離された結合メンバー。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ヒト化抗体フレームワークによって保有される、単離された結合メンバー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、ＰｓａＡのＮ末端部分のエピトープを認識する、単離された結合メンバー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、ＰｓａＡのＮ末端の１００個のアミノ酸残基のエピトープを認識する、単離された結合メンバー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から、またはそのホモログから選択されるアミノ酸配列を含む、単離された結合メンバー。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から、またはそのホモログから選択される少なくとも２個のアミノ酸配列を含む、単離された結合メンバー。
【請求項１４】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、少なくとも配列番号４、および配列番号６、またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１５】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６、またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１６】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号８またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、２つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来のＰｓａＡに結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の単離された結合メンバーであって、前記ホモログは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から選択される配列の１つ以上に少なくとも６０％ホモログ（例えば少なくとも６５％ホモログ、例えば少なくとも７０％ホモログ、例えば少なくとも７５％ホモログ、例えば少なくとも８０％ホモログ、例えば少なくとも８５％ホモログ、例えば少なくとも９０％ホモログ、例えば少なくとも９５％ホモログ、例えば少なくとも９８％ホモログ）である、単離された結合メンバー。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡのエピトープに結合することが可能であり、該エピトープは、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の結合メンバーによって認識される、単離された結合メンバー。
【請求項２０】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記解離定数が、５×１０−９Ｍ未満（例えば、１×１０−９Ｍ未満）である、単離された結合メンバー。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ＶＬドメインに位置している、単離された結合メンバー。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ＶＨドメインに位置している、単離された結合メンバー。
【請求項２３】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、該結合メンバーの相補性決定領域（ＣＤＲ）として配置される、単離された結合メンバー。
【請求項２４】
請求項２に記載の単離された結合メンバーであって、前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖから選択される、単離された結合メンバー。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の結合メンバーであって、少なくとも第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含み、該第一結合ドメインが、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能であり、そして該第二結合ドメインが、該第一結合ドメインと異なる、単離された結合メンバー。
【請求項２６】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質（例えば、ＣＤ６４またはＣＤ８９から選択されるタンパク質））に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２７】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞（例えば、白血球、マクロファージ、リンパ球、好中球細胞、好塩基球細胞、および好酸性球細胞から選択される細胞））に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２８】
請求項２６に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、肺炎球菌タンパク質に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２９】
請求項２８に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、前記第一結合ドメインと異なるＰｓａＡエピトープに特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項３０】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーが、２つの結合ドメインを含む、単離された結合メンバー。
【請求項３１】
請求項３０に記載の単離された結合メンバーであって、２つの前記結合メンバーが、スペーサー領域を通じて連結される、単離された結合メンバー。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の結合メンバーの少なくとも一部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターであって、前記核酸分子によってコードされる抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３２に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーを発現するよう操作された、細胞株。
【請求項３７】
個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法であって、
該個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを該生物学的サンプルに添加する工程、
該生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによって該疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含むキットであって、前記抗体が標識される、キット。
【請求項３９】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の薬学的組成物であって、少なくとも２つの異なる結合メンバーを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
薬学的組成物の生成のための、請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーの、使用。
【請求項４２】
肺炎球菌感染の処置用の薬学的組成物の生成のための、請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーの、使用。
【請求項１】
肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能な少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された結合メンバーであって、該結合ドメインは、１×１０−６Ｍ未満であるＰｓａＡに対する解離定数Ｋｄを有する、単離された結合メンバー。
【請求項２】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該単離された結合メンバーは、純粋な単離された結合メンバーである、単離された結合メンバー。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメントもしくは抗体の単鎖から選択される、結合メンバー。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された結合メンバーであって、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の混合物から選択される、単離された結合メンバー。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して単一特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項６】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して特異的である少なくとも一部分を有し、二重特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡプロテインに関して特異的である少なくとも一部分を有し、多重特異性である、単離された結合メンバー。
【請求項８】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークによって保有される、単離された結合メンバー。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ヒト化抗体フレームワークによって保有される、単離された結合メンバー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、ＰｓａＡのＮ末端部分のエピトープを認識する、単離された結合メンバー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、ＰｓａＡのＮ末端の１００個のアミノ酸残基のエピトープを認識する、単離された結合メンバー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から、またはそのホモログから選択されるアミノ酸配列を含む、単離された結合メンバー。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から、またはそのホモログから選択される少なくとも２個のアミノ酸配列を含む、単離された結合メンバー。
【請求項１４】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、少なくとも配列番号４、および配列番号６、またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１５】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号２、配列番号４、および配列番号６、またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１６】
請求項１２に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインは、配列番号８またはそのホモログを含む、単離された結合メンバー。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、２つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来のＰｓａＡに結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の単離された結合メンバーであって、前記ホモログは、配列番号２から、配列番号４から、配列番号６から、および配列番号８から選択される配列の１つ以上に少なくとも６０％ホモログ（例えば少なくとも６５％ホモログ、例えば少なくとも７０％ホモログ、例えば少なくとも７５％ホモログ、例えば少なくとも８０％ホモログ、例えば少なくとも８５％ホモログ、例えば少なくとも９０％ホモログ、例えば少なくとも９５％ホモログ、例えば少なくとも９８％ホモログ）である、単離された結合メンバー。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーは、ＰｓａＡのエピトープに結合することが可能であり、該エピトープは、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の結合メンバーによって認識される、単離された結合メンバー。
【請求項２０】
請求項１に記載の単離された結合メンバーであって、前記解離定数が、５×１０−９Ｍ未満（例えば、１×１０−９Ｍ未満）である、単離された結合メンバー。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ＶＬドメインに位置している、単離された結合メンバー。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、ＶＨドメインに位置している、単離された結合メンバー。
【請求項２３】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の単離された結合メンバーであって、前記結合ドメインが、該結合メンバーの相補性決定領域（ＣＤＲ）として配置される、単離された結合メンバー。
【請求項２４】
請求項２に記載の単離された結合メンバーであって、前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖから選択される、単離された結合メンバー。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の結合メンバーであって、少なくとも第一結合ドメインおよび第二結合ドメインを含み、該第一結合ドメインが、肺炎連鎖球菌表面付着因子Ａ（ＰｓａＡ）タンパク質に特異的に結合することが可能であり、そして該第二結合ドメインが、該第一結合ドメインと異なる、単離された結合メンバー。
【請求項２６】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質（例えば、ＣＤ６４またはＣＤ８９から選択されるタンパク質））に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２７】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞（例えば、白血球、マクロファージ、リンパ球、好中球細胞、好塩基球細胞、および好酸性球細胞から選択される細胞））に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２８】
請求項２６に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、肺炎球菌タンパク質に特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項２９】
請求項２８に記載の単離された結合メンバーであって、前記第二結合ドメインが、前記第一結合ドメインと異なるＰｓａＡエピトープに特異的に結合することが可能である、単離された結合メンバー。
【請求項３０】
請求項２５に記載の単離された結合メンバーであって、該結合メンバーが、２つの結合ドメインを含む、単離された結合メンバー。
【請求項３１】
請求項３０に記載の単離された結合メンバーであって、２つの前記結合メンバーが、スペーサー領域を通じて連結される、単離された結合メンバー。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の結合メンバーの少なくとも一部分をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターであって、前記核酸分子によってコードされる抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項３５】
請求項３２に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーを発現するよう操作された、細胞株。
【請求項３７】
個体において肺炎球菌に関連する疾患または障害を検出または診断する方法であって、
該個体に由来する生物学的サンプルを提供する工程、
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを該生物学的サンプルに添加する工程、
該生物学的サンプルに結合された結合メンバーを検出し、それによって該疾患または障害を検出または診断する工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含むキットであって、前記抗体が標識される、キット。
【請求項３９】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含む、薬学的組成物。
【請求項４０】
請求項３９に記載の薬学的組成物であって、少なくとも２つの異なる結合メンバーを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
薬学的組成物の生成のための、請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーの、使用。
【請求項４２】
肺炎球菌感染の処置用の薬学的組成物の生成のための、請求項１〜３１のいずれかに記載の結合メンバーの、使用。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図２０】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１８ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図２０】
【公表番号】特表２００７−５２７７０３（Ｐ２００７−５２７７０３Ａ）
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７９７１（Ｐ２００６−５１７９７１）
【出願日】平成１６年７月８日（２００４．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００４／０００４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１７４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００６８３２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月８日（２００４．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００４／０００４９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１７４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０６００６８３２）
【Ｆターム（参考）】
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