脂肪族アルデヒド分解微生物
【課題】本発明の目的は、食品や飲料中の香味阻害物質である脂肪族アルデヒドを、飲食品や化粧料用途等として安全な手段で低減する方法を提供することである。
【解決手段】脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンを分解しない細菌株を選別し、菌体や固定化菌体の形、あるいは細胞抽出液、固定化酵素、もしくはこれらの細菌から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品の形で添加するか、またはそのまま摂取することによって、食品や唾液等に含まれる脂肪族アルデヒドを除去することができる。
【解決手段】脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンを分解しない細菌株を選別し、菌体や固定化菌体の形、あるいは細胞抽出液、固定化酵素、もしくはこれらの細菌から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品の形で添加するか、またはそのまま摂取することによって、食品や唾液等に含まれる脂肪族アルデヒドを除去することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪族アルデヒド分解能を有する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルデヒドは様々な物質の香気成分として天然に広く存在する。バニリン等の芳香族アルデヒドは、食品を含む多くの工業製品に香料として添加され、利用されている。また、ビタミンＢ６化合物の一種であるピリドキサールは、アミノ酸の代謝や神経伝達に用いられる有用な芳香族アルデヒドである。
【０００３】
一方、脂肪族アルデヒドは、不快臭の原因となる物質が多く含まれる。例えば、ｎ−ヘキサナールは大豆特有の青豆臭の原因物質の一つであり、ノネナールは加齢臭の原因物質である。
【０００４】
脂肪族アルデヒドであるアセトアルデヒドは、低濃度ではフルーツ様の香気を有し、果実及びフルーツジュース、野菜、乳製品、パン等の食品に天然に含まれている。また、茶及びソフトドリンク、ビール、ワイン、蒸留酒等の飲料にも天然に含まれている。しかし、アセトアルデヒドは、場合によっては食品の香味阻害の原因ともなる。たとえば、食品として用いられる加工大豆粉末素材等においては、アセトアルデヒドは、脂肪族アルデヒドであるヘキサナールと並んで青臭み、生臭さの原因とされている（特許文献１）。
【０００５】
アセトアルデヒドはまた、ビールや日本酒等の醸造酒、ビール風アルコール飲料、焼酎等の蒸留酒においては青臭さや異臭、変質臭の原因であり、香味阻害物質（オフフレーバー）と呼ばれている。アセトアルデヒドによる異臭等の改善を目的として、発酵条件の検討、タンニン酸など他の物質の添加、または原材料の選択などによって、最終生産物中のアセトアルデヒド量を低減したという報告がある（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
【０００６】
また、酒類におけるアセトアルデヒドは、二日酔いの成分としても知られている。飲酒によって体内に取り込まれたアルコール（エタノール）は、アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトアルデヒドに酸化され、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸となり、最終的には二酸化炭素と水に分解されて体外へと放出される。日本人も含め、黄色人種の半分は活性の低いアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを持つため、飲酒により体内に一過的に蓄積したアセトアルデヒドのため、頭痛や吐き気などの二日酔いの症状を示す人の割合が欧米人と比べて高い。過剰なアセトアルデヒドは、血中に分泌されるとともに呼気によって放出され、唾液中にも蓄積して口臭の原因ともなる。
【０００７】
唾液や食品中のアセトアルデヒドを事後的に除去する手段としては、Ｌ−システイン（含硫アミノ酸）や大麦青汁などの利用が考えられている（非特許文献１）。これは、Ｌ−システインや青汁中のフラボノイドがアセトアルデヒドに付加し、これを不活性化するという事実に基づいて考案された方法である。しかし、Ｌ−システインや青汁中のフラボノイドとアセトアルデヒドの複合体形成反応は可逆反応であり、アセトアルデヒドが再生する可能性がある。また、Ｌ−システインや青汁自体が特異な味とにおいを有する物質であり、食品や飲料中の香味に与える影響が大きく、実用面での利用は難しい。また、動物や植物などから単離されたアルデヒド分解酵素を添加して、アルデヒドを分解する方法が考えられる。しかし、これらの酵素は一般に基質特異性が低いため、有害な脂肪族アルデヒドと有用な芳香族アルデヒドを共に分解してしまうという欠点をもつ。さらに、既知の多くのアルデヒド分解酵素は補酵素であるＮＡＤの存在を必要とするが、コスト面からはＮＡＤ非要求性のアルデヒド分解酵素が好ましい。
【０００８】
アルデヒド分解酵素として、主にアルデヒドオキシダーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが存在する。アルデヒドオキシダーゼは酸素を用いてアルデヒドの酸化を触媒し、カルボン酸と過酸化水素を生成する。アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋などを補酵素としてアルデヒドの酸化を触媒する。例えば、大豆根粒菌であるBradyrhizobium japonicumがｎ−ヘキサナールを分解できるｎ−ヘキサナールデヒドロゲナーゼを生産することが報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
また、酢酸菌を利用して、酒類の不快臭の低減方法、穀類の脱臭方法、および食品の不快臭の低減方法が報告されている（特許文献６、特許文献７、特許文献８。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１２９８７７号公報
【特許文献２】特開２００８−１１３５８７号公報
【特許文献３】特許３９４３１２２号公報
【特許文献４】特許３６４０９４６号公報
【特許文献５】特開２０００−６０５３１号公報
【特許文献６】特公平８−２２２２０号公報
【特許文献７】特許３０２５４０９号公報
【特許文献８】特開昭６２−２９４０４６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Salaspuro, V., et al., Int. J. Cancer(2002) 97, 361-364
【非特許文献２】大豆たん白質研究 vol.11. p.67-70, (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、食品や飲料中の香味阻害物質や加齢臭の原因物質である脂肪族アルデヒドを、安全な手段で低減する方法を提供することである。その方法の一つとして、食品微生物や腸内細菌のように人間の体内に天然に存在している菌、または環境中に存在する人間に無害な菌を用いて、微生物発酵により脂肪族アルデヒドを分解除去する方法が考えられるが、これについては、ｉ）食品や飲料の好ましい香気成分であるバニリンなどの他のアルデヒド等には作用しないこと、ｉｉ）コスト面からの理由により酸化型補酵素（ＮＡＤ等）の添加を必要としないこと、を満たすことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、多数の微生物のなかから利用目的に叶った性質をもつ酵素の生産菌を幅広く探索した。その結果、３８４株のアセトアルデヒド分解菌のコロニーを分離し、その中からアセトアルデヒド分解菌を２０３株取得した。バニリンを分解する菌体はその２０３株中６４株確認された。酸性条件下（ｐＨ３．５）でアルデヒド分解活性を示した菌体は２０３株中５０株であった。それらの結果から、酸性条件下でアセトアルデヒドを完全に分解するがバニリンを分解しなかった１６株を選別した。これら１６株について１６ＳｒＲＮＡ配列解析、グラム染色を行い、微生物種を同定した。また、選別した１６株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を解析し、ＢＬＡＳＴを用いて微生物種の推定を行った。また、ＡＬ−５、ＡＬ−７、ＡＬ−１１株から抽出した粗酵素液は、ＮＡＤ非存在下でもアルデヒドオキシダーゼ活性を示すことを明らかにした。さらに、これらの細菌が、実際に唾液や食品中のアセトアルデヒドを分解する能力を有することを見いだし、さらにはｎ−ヘキサナールおよびノネナール等の他の脂肪族アルデヒドをも分解する能力を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。
また本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、ｐＨ３．０以上４．０以下の条件下で脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。このような微生物は、たとえば酸性環境である胃内や酸性の飲食品中においてもアセトアルデヒド分解活性を示すという利点を有する。
【００１５】
また本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有するがバニリンに対しては分解能を有しない微生物であり、ここで脂肪族アルデヒド分解能がＮＡＤ非要求性のものである微生物である。更に、前記微生物であって、ＮＡＤ非要求性の脂肪族アルデヒド分解能がアセトアルデヒドオキシダーゼによるものである微生物である。
【００１６】
本発明はまた、脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンは分解しないPseudomonas sp. FERM ABP-10988、Pantoea sp. FERM ABP-10989、Pantoea sp. FERM ABP-10990株、またはそれらの変異株である。
【００１７】
本発明はさらに、上記本発明の微生物を含む組成物、または上記本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む組成物である。特に、前記組成物は、飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である。
【００１８】
本発明はまた、上記本発明の微生物を含む口中衛生剤、または上記本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む口中衛生剤である。
本発明はさらに、上記本発明の微生物を添加することを特徴とする、食品または飲料中の脂肪族アルデヒド低減方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、脂肪族アルデヒドは分解するが、バニリンは分解しない微生物、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＡＬ−５株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８）、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＡＬ−７株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９）、Ｐａｎｔｏｅａ 属菌ＡＬ−１１株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０）を提供する。かかる微生物を用いて、好ましい香気成分に影響を与えることなく、食品中の異臭の原因となる脂肪族アルデヒドを低減することができる。特に、本発明により、口臭の原因となる唾液中のアセトアルデヒドを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＡＬ−５株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（全長）を示す。
【図２】図２は、ＡＬ−７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（部分）を示す。
【図３】図３は、ＡＬ−１１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（部分）を示す。
【図４】図４は、１６Ｓ ｒＤＮＡを用いたＡｌ−５株の分子系統解析結果を示す。枝の分子付近の数字はブートストラップ値、左下の線はスケールバーを示す。
【図５】図５は、ＡＬ−５株の粗酵素を用いたＮＡＤ＋の有無による活性変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
脂肪族アルデヒド分解微生物
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有するが、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。
【００２２】
それらの要件を満たす菌株は、新たにスクリーニングすることによっても得ることができる。微生物のスクリーニングの一例を示せば、１）公園、森林、田畑などから得られた土壌サンプルを生理食塩水に懸濁し、その上清をアセトアルデヒドを含む選択培地に塗布し、２）生育したコロニーを分離し、アセトアルデヒド分解活性およびバニリン分解活性を評価し、３）アセトアルデヒドを分解するが、バニリンを分解しない細菌株を選別することで得ることができる。この中から、酸性条件下でも活性を示す株や、アセトアルデヒド分解反応にＮＡＤを必要としない株をさらに選別して、本発明の微生物を得てもよい。
【００２３】
代表的な菌株として、平成２０年７月２８日付で、特許生物寄託センターに寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＡＬ−５株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８）、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＡＬ−７株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９）、Ｐａｎｔｏｅａ 属菌ＡＬ−１１株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０）が挙げられる。微生物種の推定および菌学的特性の解析は、たとえば本明細書の実施例２−６の方法によって行うことができる。ＡＬ−５株、ＡＬ−７株、またはＡＬ−１１株の種の同定および菌学的特性解析結果は、本明細書の表１、２、および４−８、および図１−４に示されている。
【００２４】
本発明の微生物は、アセトアルデヒドのみならず、他の脂肪族アルデヒド、例えばヘキサナールおよびノネナールをも分解する能力を有する。本発明の微生物は、それら不快臭の原因となる脂肪族アルデヒドを分解することができることから、特に食品分野で有用である。 更に本発明の微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンは分解しない微生物であれば、野生株、変異株のいずれであってもよい。
【００２５】
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、あるいは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００２６】
「バニリンに対しては分解能を有しない」とは、バニリンを全く分解しないか、または弱い分解活性を有するが脂肪族アルデヒド分解に比べて極めて分解活性が弱いことをいう。例えば、脂肪族アルデヒド分解能に比べてバニリンの分解能が１／１０程度、このましくは１／５０程度である。
【００２７】
本発明の微生物の培養に用いる培地としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって脂肪族アルデヒドを分解できる微生物が、生育できる培地であれば特に制限なく用いることができる。たとえば［ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌ；ｐＨ７．０］に調製した培地を用いることができるが、これに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には本発明の微生物が資化しうる炭素源、たとえばグルコース等、および本発明の微生物が資化しうる窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、たとえばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、各酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、たとえば０．１％〜１０％程度である、窒素源の濃度は、種類により異なるが、たとえば０．０１％〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、たとえば０．００１％〜１％程度である。好ましくは、脂肪族アルデヒドを分解できない微生物の混入を除く目的で、培地中に脂肪族アルデヒド、例えばアセトアルデヒドを添加する。脂肪族アルデヒドの濃度は適宜決定できるが、０．１％が好ましい。
【００２８】
本発明の微生物の菌体は、培養液に懸濁した状態で用いてもよいし、遠心分離等の通常の方法によって培養液から回収または濃縮したものを用いてもよい。回収または濃縮した菌体は、適当な担体に固定化し、固定化菌体として用いることができる。回収または濃縮した菌体は、凍結乾燥等の通常の方法によって粉末状として用いてもよく、その粉末と各種賦形剤とを混合し、散剤、錠剤、カプセル剤等の剤形として用いてもよい。
【００２９】
本発明の微生物からの細胞抽出液の調製法は、たとえば、超音波破砕、界面活性剤処理等の通常の方法から、当業者が適宜選択することができる。
また、本発明の微生物から、当業者は通常の知識を用いて酵素抽出画分または脂肪族アルデヒド分解酵素標品を調製することもできる。これらはそのまま用いてもよいし、適当な担体に固定化し、固定化酵素として用いてもよい。
【００３０】
本発明微生物を含む組成物
本発明は、本発明の微生物を含む組成物、または本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む組成物に関する。特に、前記組成物は、飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である。
【００３１】
本発明の組成物は、本発明微生物の生菌体、死菌体、固定化菌体、細胞抽出液、またはこれらの微生物から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品が添加される。より好ましくは、脂肪族アルデヒド分解の際に副成する可能性のある過酸化水素を即座に分解するため、カタラーゼも併せて添加されることが望ましい。また、飲食品、化粧料、洗濯処理剤または消臭剤など、それぞれの組成物に応じて、適宜添加剤、保存料、色素などが添加される。
【００３２】
本発明の飲食品は、本発明の微生物を摂取することによって、体内に存在または発生した脂肪族アルデヒドを除去することができる。本発明の効果を有する限りにおいて、甘味料、酸味料、香料、酸化防止剤等を適宜加えても良い。具体的な製品形態としては、トローチ、ガム、キャンデー、錠剤、散剤、ドリンク剤等である。添加物の添加法や、食品または飲料等への加工法は、製品の性質等を考慮しつつ、当業者が適宜選択し、実施することができる。
【００３３】
本発明の化粧料は、体臭や加齢臭などの不快臭を抑制する目的で使用される。製品形態としては、例えば石鹸、乳液、ローション、クリーム、シャンプー、コンディショナー、ヘアスプレーである。本発明の消臭剤も、同様に体臭や加齢臭などの不快臭を抑制する目的で使用される。製品形態としては、例えばスプレー、液体状または固形状である。
【００３４】
本発明の洗濯処理剤は、体臭や加齢臭などの不快臭を除去する目的で使用される。製品形態としては、例えば洗濯用洗剤、洗濯用石鹸、洗濯仕上げ剤、柔軟剤である。
本発明微生物を含む口中衛生剤
本発明は、本発明の微生物を含む口中衛生剤、または本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む口中衛生剤である。
【００３５】
本発明の口中衛生剤は、本発明微生物の生菌体、死菌体、固定化菌体、細胞抽出液、またはこれらの微生物から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品が添加される。好ましくは、脂肪族アルデヒド分解の際に副生する可能性のある過酸化水素を即座に分解するため、カタラーゼも併せて添加される。その他、適宜添加剤等が添加される。本発明の口中衛生剤は、口中に存在または発生した脂肪族アルデヒドを除去することができる。
【００３６】
本発明の口中衛生剤には、限定的でない例として、口中清涼剤、口臭予防剤、口臭低減剤、または洗口液などが含まれ、具体的な製品形態は、タブレット状、スプレー状、液体、ペースト状等である。
【００３７】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
脂肪族アルデヒド分解性・バニリン非分解性細菌の選別
公園や森林、田畑などから、それぞれ１．０ｇ程度１５３サンプルを採取し、４℃で保存した。土壌サンプル０．１ｇを生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、その上清１００μｌをアセトアルデヒドを含む寒天培地［アセトアルデヒド、１ｇ／ｌ；ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌ；ｐＨ７．０；寒天、１５ｇ／ｌ］に塗布した。３０℃で静止培養後、生育したアセトアルデヒド耐性コロニー（３８４株）を新しいプレートにひとつずつ区分けして植菌し、再度３０℃で静止培養した後、４℃で保管した。
【００３９】
アセトアルデヒド分解活性は以下のように評価した。アセトアルデヒド標準反応溶液［アセトアルデヒド、２ｍＭ；ＮＡＤ＋、２ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ；最終液量、５００μｌ］に単離したコロニーを懸濁し、室温で２４時間放置した。反応後、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより上清を得た。上清５０μｌと２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００μｌ、０．１％3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone（ＭＢＴＨ）溶液４０μｌを混合し、溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。次に０．６％硫酸アンモニウム鉄（III）／酢酸酸性水溶液［硫酸アンモニウム鉄（III）・１２水和物、６ｇ／ｌ；酢酸、５０ｍｌ／ｌ］１９０μｌを加え、さらに２０分間室温で反応させた。アルデヒドが残存する場合、溶液は青く呈色される。反応後水で１ｍｌに希釈し、溶液２００μｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、SpectraMax 340PC (Molecular Devices）により６２０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度を減少させた株をアセトアルデヒド分解菌とした。アセトアルデヒド分解菌のバニリン分解活性の評価方法は、反応溶液をバニリン反応溶液［バニリン、４ｍＭ；ＮＡＤ＋、４ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ］に変更した点とＭＢＴＨ溶液の濃度を０．５％にした点、比色後に水で希釈しない点以外はアセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。アセトアルデヒド分解菌のエタノール分解活性も評価した。評価方法は反応溶液をエタノール反応溶液［エタノール、１００μｌ／ｍｌ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ］に変更した点以外アセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。ただし今回は溶液中にアルデヒドが存在した場合にエタノールが分解されたものとした。
【００４０】
アルデヒド分解に対するｐＨの影響を調べるため、酸性条件下（ｐＨ３．５）でのアセトアルデヒド分解活性を評価した。評価方法は反応溶液をアセトアルデヒド酸性反応溶液［アセトアルデヒド、２ｍＭ；ＮＡＤ＋、２ｍＭ；酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、１０ｍＭ］に変更した点以外は上述のアセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。
【００４１】
以上の操作を経て、土壌サンプルから３８４株のアセトアルデヒド分解菌のコロニーを分離し、そのなかからアセトアルデヒド分解菌を２０３株取得した。バニリンを分解する菌体は２０３株中６４株確認された。酸性条件下（ｐＨ３．５）でアルデヒド分解活性を示した菌体は２０３株中５０株であった。上に記載した反応条件でアセトアルデヒドを完全に分解するがバニリンを分解せず、さらに酸性条件下でも活性を示した１６株を選別した。
【実施例２】
【００４２】
選別菌株の１６ＳｒＤＮＡ部分配列解析
真正細菌用のユニバーサルプライマー５２０Ｆと１４００Ｒを用いて、選別菌株について１６ＳｒＤＮＡの一部をコロニーＰＣＲにより増幅した［反応溶液組成：テンプレート、１０μｌ；ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ、１×；ｄＮＴＰｓ、０．２ｍＭ；５２０Ｆ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＣＧ−３’；Ｍ：ＡｏｒＣ）、１．０μＭ；１４００Ｒ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ−３’；、Ｒ：ＡｏｒＧ）、１．０μＭ；ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、０．５Ｕ；最終液量、２０μｌ；反応条件：９６℃、１分；（９６℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、１分）×３０サイクル］。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、目的ＰＣＲ産物（約９００ｂｐ）をGenElute Agarose Spin Columns（ＳＩＧＭＡ）を用いてゲル回収し、精製した。精製ＰＣＲ産物をTOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒにＴＡクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０(One Shot TOP10 Chemically Competent Cells、Invitrogen)を形質転換した。形質転換体はＬＢ寒天培地 ［トリプトン、１０ｇ／ｌ；酵母エキス、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ；寒天、１５ｇ／ｌ；アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ；5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ−Ｇａｌ）、８０μｇ／ｍｌ］に塗布し、３７℃で１６時間培養した。生育したコロニーから青／白スクリーニングによりインサートが挿入されたプラスミドを持つコロニーを選別し、２×ＹＴ培地［トリプトン、１６ｇ／ｌ；酵母エキス、１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ；アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ］で再び１４時間培養した。培養後プラスミドを回収し、シークエンス反応を行い、CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter)によって塩基配列を解析した。 解析後、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて得られた塩基配列から微生物種の推定を行った（表１）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＡＬ−５、ＡＬ−７、およびＡＬ−１１の１６ＳｒＤＮＡ配列を、図１、２、および３に示す。
【実施例３】
【００４５】
グラム染色による選別菌株の同定
実施例２で行った１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析による分類の確認のためグラム染色をフェイバーＧ（ニッスイ）を用いて行った。スライドガラスに菌体を塗布し、自然に乾燥させた。乾燥後、火炎固定により菌体を固定した。０．２％ビクトリアブルー溶液で１分間染色した後、流水を塗布面に直接かけないようにスライドガラスの裏側から穏やかに水洗し、２％ピクリン酸エタノール溶液を用いて脱色した。再び穏やかに水洗した後、０．２５％サフラニン溶液を用いて１分間染色した。穏やかに水洗し、水分を除いて乾燥させた後、１０００倍で顕微鏡観察した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（グラム陽性）と大腸菌（グラム陰性）を同時染色し、対照とした。結果を表２に記載した。ＡＬ−１２は１６ＳｒＤＮＡ解析によりグラム陽性菌のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属と推定されたが、今回行ったグラム染色の結果は陰性であった。グラム染色は培養条件などにより結果が変化することがある。
【００４６】
【表２】
【実施例４】
【００４７】
粗酵素画分のアセトアルデヒド分解活性の評価
実施例１で選別および同定した菌株から粗酵素画分を分画し、それらのアセトアルデヒド分解活性を詳細に調べた。
【００４８】
ＡＬ−２、ＡＬ−４、ＡＬ−５、ＡＬ−８、ＡＬ−１１から細胞抽出液をそれぞれ調製し、それらを陰イオン交換クロマトグラフィーに供して得た分画物についてアルデヒドオキシダーゼ（ＡＬＯＤ）活性を調べた。さらに、活性のメインピークを示した画分をそれぞれ集めて粗酵素液とし、各々のＡＬＯＤ活性のｐＨ依存性およびＮＡＤ依存性を調べた。その結果、ＡＬ−５、ＡＬ−８から調製した粗酵素液はｐＨ４−８の間で安定したＡＬＯＤ活性を示すことがわかった。また、ＡＬ−２、ＡＬ−４、ＡＬ−５、ＡＬ−８、ＡＬ−１１から調製した粗酵素液は、いずれもＮＡＤ非存在下で活性を示すことがわかった。
【実施例５】
【００４９】
１６ＳｒＤＮＡ全長配列によるＡＬ−５株の分子系統解析
ＡＬ−５株の全長１６ＳｒＤＮＡによる分子系統解析を行い、微生物種を推定した。解析に用いた菌体は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、好気的条件下３０℃で２４時間培養した。ＤＮＡ抽出はＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ ＲＡＤ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、プロトコールに従って行った。抽出したＤＮＡを鋳型とし、表３に示したプライマーを使用し、PrimeSTAR HS DNA Polymerase （タカラバイオ、滋賀）でＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
【表３】
【００５１】
次に、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems、CA、USA)を用いてシークエンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System (Applied Biosystems、CA、USA)で塩基配列の解析を行った。解析ソフトはAuto Assembler(Applied Biosystems、CA、USA)、アポロン（テクノスルガ、静岡）、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１を用いた。そして、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（テクノスルガ、静岡）と国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）を用いて得られた塩基配列との相同性検索を行った。
【００５２】
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、ＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の１６ＳｒＤＮＡに対して高い相同性を示し、相同率９９．３％でＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＬＭＧ１２２４株の１６ＳｒＤＮＡに対して最も高い相同性を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索においてもＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の１６ＳｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＬＭＧ１２２４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．３％、Ｐ．ｏｔｉｔｉｄｉｓ ＭＣＣ１０３３０株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９８．７％の相同性を示した。これらのことから、ＡＬ−５はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに帰属する可能性が高いと考えられる。そこで、今回の分子系統解析では、比較的近縁と考えられるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する種の基準株由来の１６ＳｒＤＮＡを取得し、分子系統樹を作製した。
【００５３】
分子系統解析の結果、ＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡはＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの１６ＳｒＤＮＡと系統枝を形成した（図４）。ＡＬ−５の系統枝（分枝）の信頼性を示すブートストラップ値は８８％と比較的高いことから、ＡＬ−５は既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する種の中ではＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓに最も近縁と考えられる。しかし、両者の１６ＳｒＤＮＡは完全には一致しておらず、ＡＬ−５とＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの系統枝からは両者が別種である可能性も否定できない。よって、今回の分子系統解析の結果からＡＬ−５をＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓに近縁なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．と推定した。
【実施例６】
【００５４】
ＡＬ−５株の形態観察および生理・生化学的性状試験
ＡＬ−５株の形態観察および生理・生化学的性状試験も行なった。形態観察および生理・生化学的性状試験に用いた菌体は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体はフェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬、東京）を用いてグラム染色を行い、光化学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４（オリンパス、東京）により形態観察を行った。また、ＢＡＲＲＯＷらの方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産出、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）についても試験した。さらに、ＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた試験を行った。また、追加試験としてＫｉｎｇ’ｓＢ寒天培地での蛍光色素産出、でんぷんの加水分解、カゼインの加水分解、リパーゼ（Ｔｗｅｅｎ８０）活性、レシチナーゼ活性について試験した。
【００５５】
菌体脂肪酸組成分析に用いた菌体は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ＋Ｇｒａｎｕｌａｒ Ａｇａｒ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用し、２８℃で２４時間培養した。得られた菌体からの脂肪酸抽出と測定は、Sherlock Microbial Identification System(Version 5．0) (MIDI、DEIUSA)の菌体脂肪酸組成分析操作マニュアル（Ｖｅｒｓｉｏｎ６）に従い行った。得られた脂肪酸組成はＭＩＳ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＬｉｂｒａｒｉｅｓのＴＳＢＡ４０のデータベースと照合した。
【００５６】
脂肪酸分析の結果、主要脂肪酸としてＣ１８：１ω７ｃ（２９．８７％）、Ｃ１６：０ （１９．３６％）、Ｓｕｍ Ｉｎ Ｆｅａｔｕｒｅ ３（Ｃ１５：０ ｉｓｏ ２ＯＨ＋Ｃ１６：１ω７ｃ）（１８．２２％）が認められた（表４）。ＭＩＤＩデータベースとの照合の結果、類似した脂肪酸組成を保持する菌種としてＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（類似度０．１６８）、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （類似度０．０９５）が検索された（表５）。しかし、類似度は低く、ＭＩＤＩの類似度（Ｓ．Ｉ．：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）の判定基準に従うと、ＭＩＤＩデータベースには該当する菌種のデータはないと考えられる（Ｓ．Ｉ．はまったく同一の組成を持つ場合は１．０００が与えられ、目安として０．５００以上あれば類似していると判断する）。
【００５７】
ＡＬ−５は運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表６）。ＡＰＩ試験において、ＡＬ−５はアルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、エクスリンを加水分解せず、ゼラチンを加水分解した（表７）。また、ＡＬ−５はＫｉｎｇ’ｓＢ寒天培地で蛍光色素を産出し、カゼインを加水分解せず、レシチナーゼ活性を示さず、リパーゼ（Ｔｗｅｅｎ８０）活性を示し、カゼインを加水分解した（表７）。
【００５８】
これらの性状は、蛍光色素を産出することを除くとＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの一般性状とほぼ類似する。しかし、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の中で蛍光色素非産出種として知られており、加えてＡＬ−５のグルコースを資化する点もＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの性状と異なる。また、今回の試験から得られた生理性状とＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓやＰ．ｐｕｔｉｄａなど蛍光色素を産出する種と比較したが、一致する種は見当たらなかった。よって、今回の生理・生化学的性状試験からはＡＬ−５をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの新種と判断し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．と推定した。
【００５９】
【表４】
【００６０】
【表５】
【００６１】
【表６】
【００６２】
【表７】
【００６３】
ＡＬ−５株、ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株は、平成２０年７月２８日付で特許生物寄託センターにそれぞれＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０として受領された。
【実施例７】
【００６４】
ＡＬ−５株由来アルデヒド分解酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
ＡＬ−５粗酵素液の調製
ＡＬ−５株は５０ｍｌの１％エタノール含有ＬＢ培地［トリプトン、１０ｇ／ｌ；酵母エキス、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ，１０ｇ／ｌ］で、３０℃、２４時間１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、６０００×ｇで１５分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）２０ｍｌに再懸濁し、再び６０００×ｇで１５分間遠心し、上清を取り除いた。菌体は回収した量の２倍量の１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、超音波により破砕した。破砕後、２００００×ｇで遠心し、得られた上清を１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。そして透析により、菌体由来の低分子を取り除いた状態のものを粗酵素液とした。
アルデヒド酸化還元酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
酵素反応は酵素反応溶液（２ｍＭアセトアルデヒド；（＋２ｍＭ ＮＡＤ＋）；５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）；粗酵素溶液；最終液量２５０μｌ）で，３０℃２４時間反応させた。反応後、上清５０ｍｌと２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００ｍｌ、０．１％3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone (MBTH)溶液４０ｍｌを混合し、溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。次に０．６％硫酸アンモニウム鉄（III）／酢酸酸性水溶液［硫酸アンモニウム鉄（III）・１２水和物，６ｇ／ｌ；酢酸、５０ｍｌ／ｌ］１９０ｍｌを加え、さらに２０分間室温で反応させた。アルデヒドが残存する場合、溶液は青く呈色される。反応後水で１ｍｌに希釈し、溶液２００ｍｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＮＡＤ＋非存在下で示した活性をＮＡＤ＋非依存性活性とし、ＮＡＤ＋存在下で示した活性からＮＡＤ＋非依存性活性を引いた値をＮＡＤ＋依存性活性とした。
アルデヒド酸化還元酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
ＡＬ−５の粗酵素液は、ＮＡＤ＋非存在下であってもアルデヒド酸化活性を示した。ＮＡＤ＋の添加により，ＮＡＤ＋非存在下よりも高い活性を示した（図５）。この結果からＡＬ−５の粗酵素液中にはＮＡＤ＋非依存性活性を持つ酵素（アセトアルデヒドオキシダーゼ）とＮＡＤ＋依存性活性を持つ酵素（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）の両方が存在すると考えられる（図５）。
【実施例８】
【００６５】
ＡＬ−５株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
アセトアルデヒド、１ｍｌ／ｌ；ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌを含有する培地（ｐＨ７．０、５リットル）にてＡＬ−５株を３０℃で２日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、１５分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（６、０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、上清にアセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例９】
【００６６】
ＡＬ−５株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同様にして培養することにより得られたＡＬ−５株の菌体（菌体湿重量、３．６ｇ）を、氷冷した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１０、０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。菌体抽出液にカタラーゼ（米国シグマ社、１０ｍｇ）を加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、アセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１０】
【００６７】
ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同組成の培地にてＡＬ−７株またはＡＬ−１１株を３０℃で２日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１５分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、各々約０．２ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株のいずれの場合においても上清にアセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１１】
【００６８】
ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例９と同様にして得られたＡＬ−１１株の菌体（菌体湿重量、５．４ｇ）を、氷冷した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。菌体抽出液にカタラーゼ（米国シグマ社、１０ｍｇ）を加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、アセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１２】
【００６９】
ＡＬ−５株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
アセトアルデヒド；１ｍｌ／ｌ、ペプトン；５ｇ／ｌ、酵母エキス；２ｇ／ｌ、ＮａＣｌ；８．５ｇ／ｌを含有する培地（ｐＨ７．０、２００ｍｌ）にてＡＬ−５株を３０℃で３日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。反応後、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより上清を得た。上清４５０μｌを内部標準として１００ｐｐｍのイソブタノールを５０μｌ加えたガラスバイアルに入れ、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法によりアセトアルデヒド濃度を測定した。機器はＴｅｋｍａｒ７０００型ヘッドスペースオートサンプラーと、ＩＮＮＯＷＡＸ１９０９１Ｎ−２３３キャピラリーカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム０．２５μｍ）を装着したＶａｒｉａｎ ＣＰ−３８００型ガスクロマトグラフを使用した。その結果，実施例８記載の方法で測定した場合同様、上記測定方法によっても上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１３】
【００７０】
ＡＬ−５株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同様にして培養することにより得られたＡＬ−５株の菌体（菌体湿重量、７．３ｇ）を、氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１５ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１０分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例９同様、上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１４】
【００７１】
ＡＬ−１１株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同組成の培地にてＡＬ−１１株を３０℃で３日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、各々約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例１０同様、ＡＬ−１１株のいずれの場合においても上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１５】
【００７２】
ＡＬ−１１株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例１４と同様にして得られたＡＬ−１１株の菌体（菌体湿重量、２．０ｇ）を、氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１０分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例１１同様、上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１６】
【００７３】
ＡＬ−５菌体抽出液によるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナール分解活性評価
実施例１３と同様にして得られた粗酵素液をｎ−ヘキサナールまたは２−ノネナールを２ｐｐｍとなるように添加した反応液（０．６ｍｌ）に粗酵素液０．０３ｍｌを懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液中に含まれるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、ｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールは検出されなかった。
【実施例１７】
【００７４】
ＡＬ−１１菌体抽出液によるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナール分解活性評価
実施例１５と同様にして得られた粗酵素液をｎ−ヘキサナールまたは２−ノネナールを２ｐｐｍとなるように添加した反応液（０．６ｍｌ）に粗酵素液０．０３ｍｌを懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液中に含まれるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、ｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールは検出されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪族アルデヒド分解能を有する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルデヒドは様々な物質の香気成分として天然に広く存在する。バニリン等の芳香族アルデヒドは、食品を含む多くの工業製品に香料として添加され、利用されている。また、ビタミンＢ６化合物の一種であるピリドキサールは、アミノ酸の代謝や神経伝達に用いられる有用な芳香族アルデヒドである。
【０００３】
一方、脂肪族アルデヒドは、不快臭の原因となる物質が多く含まれる。例えば、ｎ−ヘキサナールは大豆特有の青豆臭の原因物質の一つであり、ノネナールは加齢臭の原因物質である。
【０００４】
脂肪族アルデヒドであるアセトアルデヒドは、低濃度ではフルーツ様の香気を有し、果実及びフルーツジュース、野菜、乳製品、パン等の食品に天然に含まれている。また、茶及びソフトドリンク、ビール、ワイン、蒸留酒等の飲料にも天然に含まれている。しかし、アセトアルデヒドは、場合によっては食品の香味阻害の原因ともなる。たとえば、食品として用いられる加工大豆粉末素材等においては、アセトアルデヒドは、脂肪族アルデヒドであるヘキサナールと並んで青臭み、生臭さの原因とされている（特許文献１）。
【０００５】
アセトアルデヒドはまた、ビールや日本酒等の醸造酒、ビール風アルコール飲料、焼酎等の蒸留酒においては青臭さや異臭、変質臭の原因であり、香味阻害物質（オフフレーバー）と呼ばれている。アセトアルデヒドによる異臭等の改善を目的として、発酵条件の検討、タンニン酸など他の物質の添加、または原材料の選択などによって、最終生産物中のアセトアルデヒド量を低減したという報告がある（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
【０００６】
また、酒類におけるアセトアルデヒドは、二日酔いの成分としても知られている。飲酒によって体内に取り込まれたアルコール（エタノール）は、アルコールデヒドロゲナーゼによってアセトアルデヒドに酸化され、アルデヒドデヒドロゲナーゼによって酢酸となり、最終的には二酸化炭素と水に分解されて体外へと放出される。日本人も含め、黄色人種の半分は活性の低いアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを持つため、飲酒により体内に一過的に蓄積したアセトアルデヒドのため、頭痛や吐き気などの二日酔いの症状を示す人の割合が欧米人と比べて高い。過剰なアセトアルデヒドは、血中に分泌されるとともに呼気によって放出され、唾液中にも蓄積して口臭の原因ともなる。
【０００７】
唾液や食品中のアセトアルデヒドを事後的に除去する手段としては、Ｌ−システイン（含硫アミノ酸）や大麦青汁などの利用が考えられている（非特許文献１）。これは、Ｌ−システインや青汁中のフラボノイドがアセトアルデヒドに付加し、これを不活性化するという事実に基づいて考案された方法である。しかし、Ｌ−システインや青汁中のフラボノイドとアセトアルデヒドの複合体形成反応は可逆反応であり、アセトアルデヒドが再生する可能性がある。また、Ｌ−システインや青汁自体が特異な味とにおいを有する物質であり、食品や飲料中の香味に与える影響が大きく、実用面での利用は難しい。また、動物や植物などから単離されたアルデヒド分解酵素を添加して、アルデヒドを分解する方法が考えられる。しかし、これらの酵素は一般に基質特異性が低いため、有害な脂肪族アルデヒドと有用な芳香族アルデヒドを共に分解してしまうという欠点をもつ。さらに、既知の多くのアルデヒド分解酵素は補酵素であるＮＡＤの存在を必要とするが、コスト面からはＮＡＤ非要求性のアルデヒド分解酵素が好ましい。
【０００８】
アルデヒド分解酵素として、主にアルデヒドオキシダーゼとアルデヒドデヒドロゲナーゼが存在する。アルデヒドオキシダーゼは酸素を用いてアルデヒドの酸化を触媒し、カルボン酸と過酸化水素を生成する。アルデヒドデヒドロゲナーゼはＮＡＤ＋やＮＡＤＰ＋などを補酵素としてアルデヒドの酸化を触媒する。例えば、大豆根粒菌であるBradyrhizobium japonicumがｎ−ヘキサナールを分解できるｎ−ヘキサナールデヒドロゲナーゼを生産することが報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
また、酢酸菌を利用して、酒類の不快臭の低減方法、穀類の脱臭方法、および食品の不快臭の低減方法が報告されている（特許文献６、特許文献７、特許文献８。）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１２９８７７号公報
【特許文献２】特開２００８−１１３５８７号公報
【特許文献３】特許３９４３１２２号公報
【特許文献４】特許３６４０９４６号公報
【特許文献５】特開２０００−６０５３１号公報
【特許文献６】特公平８−２２２２０号公報
【特許文献７】特許３０２５４０９号公報
【特許文献８】特開昭６２−２９４０４６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Salaspuro, V., et al., Int. J. Cancer(2002) 97, 361-364
【非特許文献２】大豆たん白質研究 vol.11. p.67-70, (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、食品や飲料中の香味阻害物質や加齢臭の原因物質である脂肪族アルデヒドを、安全な手段で低減する方法を提供することである。その方法の一つとして、食品微生物や腸内細菌のように人間の体内に天然に存在している菌、または環境中に存在する人間に無害な菌を用いて、微生物発酵により脂肪族アルデヒドを分解除去する方法が考えられるが、これについては、ｉ）食品や飲料の好ましい香気成分であるバニリンなどの他のアルデヒド等には作用しないこと、ｉｉ）コスト面からの理由により酸化型補酵素（ＮＡＤ等）の添加を必要としないこと、を満たすことが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、多数の微生物のなかから利用目的に叶った性質をもつ酵素の生産菌を幅広く探索した。その結果、３８４株のアセトアルデヒド分解菌のコロニーを分離し、その中からアセトアルデヒド分解菌を２０３株取得した。バニリンを分解する菌体はその２０３株中６４株確認された。酸性条件下（ｐＨ３．５）でアルデヒド分解活性を示した菌体は２０３株中５０株であった。それらの結果から、酸性条件下でアセトアルデヒドを完全に分解するがバニリンを分解しなかった１６株を選別した。これら１６株について１６ＳｒＲＮＡ配列解析、グラム染色を行い、微生物種を同定した。また、選別した１６株の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を解析し、ＢＬＡＳＴを用いて微生物種の推定を行った。また、ＡＬ−５、ＡＬ−７、ＡＬ−１１株から抽出した粗酵素液は、ＮＡＤ非存在下でもアルデヒドオキシダーゼ活性を示すことを明らかにした。さらに、これらの細菌が、実際に唾液や食品中のアセトアルデヒドを分解する能力を有することを見いだし、さらにはｎ−ヘキサナールおよびノネナール等の他の脂肪族アルデヒドをも分解する能力を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。
また本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、ｐＨ３．０以上４．０以下の条件下で脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。このような微生物は、たとえば酸性環境である胃内や酸性の飲食品中においてもアセトアルデヒド分解活性を示すという利点を有する。
【００１５】
また本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有するがバニリンに対しては分解能を有しない微生物であり、ここで脂肪族アルデヒド分解能がＮＡＤ非要求性のものである微生物である。更に、前記微生物であって、ＮＡＤ非要求性の脂肪族アルデヒド分解能がアセトアルデヒドオキシダーゼによるものである微生物である。
【００１６】
本発明はまた、脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンは分解しないPseudomonas sp. FERM ABP-10988、Pantoea sp. FERM ABP-10989、Pantoea sp. FERM ABP-10990株、またはそれらの変異株である。
【００１７】
本発明はさらに、上記本発明の微生物を含む組成物、または上記本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む組成物である。特に、前記組成物は、飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である。
【００１８】
本発明はまた、上記本発明の微生物を含む口中衛生剤、または上記本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む口中衛生剤である。
本発明はさらに、上記本発明の微生物を添加することを特徴とする、食品または飲料中の脂肪族アルデヒド低減方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、脂肪族アルデヒドは分解するが、バニリンは分解しない微生物、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＡＬ−５株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８）、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＡＬ−７株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９）、Ｐａｎｔｏｅａ 属菌ＡＬ−１１株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０）を提供する。かかる微生物を用いて、好ましい香気成分に影響を与えることなく、食品中の異臭の原因となる脂肪族アルデヒドを低減することができる。特に、本発明により、口臭の原因となる唾液中のアセトアルデヒドを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＡＬ−５株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（全長）を示す。
【図２】図２は、ＡＬ−７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（部分）を示す。
【図３】図３は、ＡＬ−１１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（部分）を示す。
【図４】図４は、１６Ｓ ｒＤＮＡを用いたＡｌ−５株の分子系統解析結果を示す。枝の分子付近の数字はブートストラップ値、左下の線はスケールバーを示す。
【図５】図５は、ＡＬ−５株の粗酵素を用いたＮＡＤ＋の有無による活性変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
脂肪族アルデヒド分解微生物
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有するが、バニリンに対しては分解能を有しない微生物である。
【００２２】
それらの要件を満たす菌株は、新たにスクリーニングすることによっても得ることができる。微生物のスクリーニングの一例を示せば、１）公園、森林、田畑などから得られた土壌サンプルを生理食塩水に懸濁し、その上清をアセトアルデヒドを含む選択培地に塗布し、２）生育したコロニーを分離し、アセトアルデヒド分解活性およびバニリン分解活性を評価し、３）アセトアルデヒドを分解するが、バニリンを分解しない細菌株を選別することで得ることができる。この中から、酸性条件下でも活性を示す株や、アセトアルデヒド分解反応にＮＡＤを必要としない株をさらに選別して、本発明の微生物を得てもよい。
【００２３】
代表的な菌株として、平成２０年７月２８日付で、特許生物寄託センターに寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＡＬ−５株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８）、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＡＬ−７株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９）、Ｐａｎｔｏｅａ 属菌ＡＬ−１１株（寄託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０）が挙げられる。微生物種の推定および菌学的特性の解析は、たとえば本明細書の実施例２−６の方法によって行うことができる。ＡＬ−５株、ＡＬ−７株、またはＡＬ−１１株の種の同定および菌学的特性解析結果は、本明細書の表１、２、および４−８、および図１−４に示されている。
【００２４】
本発明の微生物は、アセトアルデヒドのみならず、他の脂肪族アルデヒド、例えばヘキサナールおよびノネナールをも分解する能力を有する。本発明の微生物は、それら不快臭の原因となる脂肪族アルデヒドを分解することができることから、特に食品分野で有用である。 更に本発明の微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒドを分解するが、バニリンは分解しない微生物であれば、野生株、変異株のいずれであってもよい。
【００２５】
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、あるいは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００２６】
「バニリンに対しては分解能を有しない」とは、バニリンを全く分解しないか、または弱い分解活性を有するが脂肪族アルデヒド分解に比べて極めて分解活性が弱いことをいう。例えば、脂肪族アルデヒド分解能に比べてバニリンの分解能が１／１０程度、このましくは１／５０程度である。
【００２７】
本発明の微生物の培養に用いる培地としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって脂肪族アルデヒドを分解できる微生物が、生育できる培地であれば特に制限なく用いることができる。たとえば［ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌ；ｐＨ７．０］に調製した培地を用いることができるが、これに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には本発明の微生物が資化しうる炭素源、たとえばグルコース等、および本発明の微生物が資化しうる窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、たとえばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、各酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、たとえば０．１％〜１０％程度である、窒素源の濃度は、種類により異なるが、たとえば０．０１％〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、たとえば０．００１％〜１％程度である。好ましくは、脂肪族アルデヒドを分解できない微生物の混入を除く目的で、培地中に脂肪族アルデヒド、例えばアセトアルデヒドを添加する。脂肪族アルデヒドの濃度は適宜決定できるが、０．１％が好ましい。
【００２８】
本発明の微生物の菌体は、培養液に懸濁した状態で用いてもよいし、遠心分離等の通常の方法によって培養液から回収または濃縮したものを用いてもよい。回収または濃縮した菌体は、適当な担体に固定化し、固定化菌体として用いることができる。回収または濃縮した菌体は、凍結乾燥等の通常の方法によって粉末状として用いてもよく、その粉末と各種賦形剤とを混合し、散剤、錠剤、カプセル剤等の剤形として用いてもよい。
【００２９】
本発明の微生物からの細胞抽出液の調製法は、たとえば、超音波破砕、界面活性剤処理等の通常の方法から、当業者が適宜選択することができる。
また、本発明の微生物から、当業者は通常の知識を用いて酵素抽出画分または脂肪族アルデヒド分解酵素標品を調製することもできる。これらはそのまま用いてもよいし、適当な担体に固定化し、固定化酵素として用いてもよい。
【００３０】
本発明微生物を含む組成物
本発明は、本発明の微生物を含む組成物、または本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む組成物に関する。特に、前記組成物は、飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である。
【００３１】
本発明の組成物は、本発明微生物の生菌体、死菌体、固定化菌体、細胞抽出液、またはこれらの微生物から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品が添加される。より好ましくは、脂肪族アルデヒド分解の際に副成する可能性のある過酸化水素を即座に分解するため、カタラーゼも併せて添加されることが望ましい。また、飲食品、化粧料、洗濯処理剤または消臭剤など、それぞれの組成物に応じて、適宜添加剤、保存料、色素などが添加される。
【００３２】
本発明の飲食品は、本発明の微生物を摂取することによって、体内に存在または発生した脂肪族アルデヒドを除去することができる。本発明の効果を有する限りにおいて、甘味料、酸味料、香料、酸化防止剤等を適宜加えても良い。具体的な製品形態としては、トローチ、ガム、キャンデー、錠剤、散剤、ドリンク剤等である。添加物の添加法や、食品または飲料等への加工法は、製品の性質等を考慮しつつ、当業者が適宜選択し、実施することができる。
【００３３】
本発明の化粧料は、体臭や加齢臭などの不快臭を抑制する目的で使用される。製品形態としては、例えば石鹸、乳液、ローション、クリーム、シャンプー、コンディショナー、ヘアスプレーである。本発明の消臭剤も、同様に体臭や加齢臭などの不快臭を抑制する目的で使用される。製品形態としては、例えばスプレー、液体状または固形状である。
【００３４】
本発明の洗濯処理剤は、体臭や加齢臭などの不快臭を除去する目的で使用される。製品形態としては、例えば洗濯用洗剤、洗濯用石鹸、洗濯仕上げ剤、柔軟剤である。
本発明微生物を含む口中衛生剤
本発明は、本発明の微生物を含む口中衛生剤、または本発明の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む口中衛生剤である。
【００３５】
本発明の口中衛生剤は、本発明微生物の生菌体、死菌体、固定化菌体、細胞抽出液、またはこれらの微生物から精製された脂肪族アルデヒド分解酵素標品が添加される。好ましくは、脂肪族アルデヒド分解の際に副生する可能性のある過酸化水素を即座に分解するため、カタラーゼも併せて添加される。その他、適宜添加剤等が添加される。本発明の口中衛生剤は、口中に存在または発生した脂肪族アルデヒドを除去することができる。
【００３６】
本発明の口中衛生剤には、限定的でない例として、口中清涼剤、口臭予防剤、口臭低減剤、または洗口液などが含まれ、具体的な製品形態は、タブレット状、スプレー状、液体、ペースト状等である。
【００３７】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
脂肪族アルデヒド分解性・バニリン非分解性細菌の選別
公園や森林、田畑などから、それぞれ１．０ｇ程度１５３サンプルを採取し、４℃で保存した。土壌サンプル０．１ｇを生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、その上清１００μｌをアセトアルデヒドを含む寒天培地［アセトアルデヒド、１ｇ／ｌ；ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌ；ｐＨ７．０；寒天、１５ｇ／ｌ］に塗布した。３０℃で静止培養後、生育したアセトアルデヒド耐性コロニー（３８４株）を新しいプレートにひとつずつ区分けして植菌し、再度３０℃で静止培養した後、４℃で保管した。
【００３９】
アセトアルデヒド分解活性は以下のように評価した。アセトアルデヒド標準反応溶液［アセトアルデヒド、２ｍＭ；ＮＡＤ＋、２ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ；最終液量、５００μｌ］に単離したコロニーを懸濁し、室温で２４時間放置した。反応後、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより上清を得た。上清５０μｌと２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００μｌ、０．１％3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone（ＭＢＴＨ）溶液４０μｌを混合し、溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。次に０．６％硫酸アンモニウム鉄（III）／酢酸酸性水溶液［硫酸アンモニウム鉄（III）・１２水和物、６ｇ／ｌ；酢酸、５０ｍｌ／ｌ］１９０μｌを加え、さらに２０分間室温で反応させた。アルデヒドが残存する場合、溶液は青く呈色される。反応後水で１ｍｌに希釈し、溶液２００μｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、SpectraMax 340PC (Molecular Devices）により６２０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度を減少させた株をアセトアルデヒド分解菌とした。アセトアルデヒド分解菌のバニリン分解活性の評価方法は、反応溶液をバニリン反応溶液［バニリン、４ｍＭ；ＮＡＤ＋、４ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ］に変更した点とＭＢＴＨ溶液の濃度を０．５％にした点、比色後に水で希釈しない点以外はアセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。アセトアルデヒド分解菌のエタノール分解活性も評価した。評価方法は反応溶液をエタノール反応溶液［エタノール、１００μｌ／ｍｌ；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ］に変更した点以外アセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。ただし今回は溶液中にアルデヒドが存在した場合にエタノールが分解されたものとした。
【００４０】
アルデヒド分解に対するｐＨの影響を調べるため、酸性条件下（ｐＨ３．５）でのアセトアルデヒド分解活性を評価した。評価方法は反応溶液をアセトアルデヒド酸性反応溶液［アセトアルデヒド、２ｍＭ；ＮＡＤ＋、２ｍＭ；酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）、１０ｍＭ］に変更した点以外は上述のアセトアルデヒド分解活性評価方法と同様である。
【００４１】
以上の操作を経て、土壌サンプルから３８４株のアセトアルデヒド分解菌のコロニーを分離し、そのなかからアセトアルデヒド分解菌を２０３株取得した。バニリンを分解する菌体は２０３株中６４株確認された。酸性条件下（ｐＨ３．５）でアルデヒド分解活性を示した菌体は２０３株中５０株であった。上に記載した反応条件でアセトアルデヒドを完全に分解するがバニリンを分解せず、さらに酸性条件下でも活性を示した１６株を選別した。
【実施例２】
【００４２】
選別菌株の１６ＳｒＤＮＡ部分配列解析
真正細菌用のユニバーサルプライマー５２０Ｆと１４００Ｒを用いて、選別菌株について１６ＳｒＤＮＡの一部をコロニーＰＣＲにより増幅した［反応溶液組成：テンプレート、１０μｌ；ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ、１×；ｄＮＴＰｓ、０．２ｍＭ；５２０Ｆ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＣＧ−３’；Ｍ：ＡｏｒＣ）、１．０μＭ；１４００Ｒ ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ−３’；、Ｒ：ＡｏｒＧ）、１．０μＭ；ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、０．５Ｕ；最終液量、２０μｌ；反応条件：９６℃、１分；（９６℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、１分）×３０サイクル］。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、目的ＰＣＲ産物（約９００ｂｐ）をGenElute Agarose Spin Columns（ＳＩＧＭＡ）を用いてゲル回収し、精製した。精製ＰＣＲ産物をTOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒにＴＡクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０(One Shot TOP10 Chemically Competent Cells、Invitrogen)を形質転換した。形質転換体はＬＢ寒天培地 ［トリプトン、１０ｇ／ｌ；酵母エキス、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ；寒天、１５ｇ／ｌ；アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ；5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ−Ｇａｌ）、８０μｇ／ｍｌ］に塗布し、３７℃で１６時間培養した。生育したコロニーから青／白スクリーニングによりインサートが挿入されたプラスミドを持つコロニーを選別し、２×ＹＴ培地［トリプトン、１６ｇ／ｌ；酵母エキス、１０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ；アンピシリン、５０μｇ／ｍｌ］で再び１４時間培養した。培養後プラスミドを回収し、シークエンス反応を行い、CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter)によって塩基配列を解析した。 解析後、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いて得られた塩基配列から微生物種の推定を行った（表１）。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＡＬ−５、ＡＬ−７、およびＡＬ−１１の１６ＳｒＤＮＡ配列を、図１、２、および３に示す。
【実施例３】
【００４５】
グラム染色による選別菌株の同定
実施例２で行った１６Ｓ ｒＤＮＡ配列解析による分類の確認のためグラム染色をフェイバーＧ（ニッスイ）を用いて行った。スライドガラスに菌体を塗布し、自然に乾燥させた。乾燥後、火炎固定により菌体を固定した。０．２％ビクトリアブルー溶液で１分間染色した後、流水を塗布面に直接かけないようにスライドガラスの裏側から穏やかに水洗し、２％ピクリン酸エタノール溶液を用いて脱色した。再び穏やかに水洗した後、０．２５％サフラニン溶液を用いて１分間染色した。穏やかに水洗し、水分を除いて乾燥させた後、１０００倍で顕微鏡観察した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（グラム陽性）と大腸菌（グラム陰性）を同時染色し、対照とした。結果を表２に記載した。ＡＬ−１２は１６ＳｒＤＮＡ解析によりグラム陽性菌のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属と推定されたが、今回行ったグラム染色の結果は陰性であった。グラム染色は培養条件などにより結果が変化することがある。
【００４６】
【表２】
【実施例４】
【００４７】
粗酵素画分のアセトアルデヒド分解活性の評価
実施例１で選別および同定した菌株から粗酵素画分を分画し、それらのアセトアルデヒド分解活性を詳細に調べた。
【００４８】
ＡＬ−２、ＡＬ−４、ＡＬ−５、ＡＬ−８、ＡＬ−１１から細胞抽出液をそれぞれ調製し、それらを陰イオン交換クロマトグラフィーに供して得た分画物についてアルデヒドオキシダーゼ（ＡＬＯＤ）活性を調べた。さらに、活性のメインピークを示した画分をそれぞれ集めて粗酵素液とし、各々のＡＬＯＤ活性のｐＨ依存性およびＮＡＤ依存性を調べた。その結果、ＡＬ−５、ＡＬ−８から調製した粗酵素液はｐＨ４−８の間で安定したＡＬＯＤ活性を示すことがわかった。また、ＡＬ−２、ＡＬ−４、ＡＬ−５、ＡＬ−８、ＡＬ−１１から調製した粗酵素液は、いずれもＮＡＤ非存在下で活性を示すことがわかった。
【実施例５】
【００４９】
１６ＳｒＤＮＡ全長配列によるＡＬ−５株の分子系統解析
ＡＬ−５株の全長１６ＳｒＤＮＡによる分子系統解析を行い、微生物種を推定した。解析に用いた菌体は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、好気的条件下３０℃で２４時間培養した。ＤＮＡ抽出はＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ ＲＡＤ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、プロトコールに従って行った。抽出したＤＮＡを鋳型とし、表３に示したプライマーを使用し、PrimeSTAR HS DNA Polymerase （タカラバイオ、滋賀）でＰＣＲ反応を行った。
【００５０】
【表３】
【００５１】
次に、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems、CA、USA)を用いてシークエンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer System (Applied Biosystems、CA、USA)で塩基配列の解析を行った。解析ソフトはAuto Assembler(Applied Biosystems、CA、USA)、アポロン（テクノスルガ、静岡）、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１を用いた。そして、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（テクノスルガ、静岡）と国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）を用いて得られた塩基配列との相同性検索を行った。
【００５２】
ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、ＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の１６ＳｒＤＮＡに対して高い相同性を示し、相同率９９．３％でＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＬＭＧ１２２４株の１６ＳｒＤＮＡに対して最も高い相同性を示した。ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬに対する相同性検索においてもＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来の１６ＳｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、基準株ではＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＬＭＧ１２２４株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９９．３％、Ｐ．ｏｔｉｔｉｄｉｓ ＭＣＣ１０３３０株の１６ＳｒＤＮＡに対し相同率９８．７％の相同性を示した。これらのことから、ＡＬ−５はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに帰属する可能性が高いと考えられる。そこで、今回の分子系統解析では、比較的近縁と考えられるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する種の基準株由来の１６ＳｒＤＮＡを取得し、分子系統樹を作製した。
【００５３】
分子系統解析の結果、ＡＬ−５の１６ＳｒＤＮＡはＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの１６ＳｒＤＮＡと系統枝を形成した（図４）。ＡＬ−５の系統枝（分枝）の信頼性を示すブートストラップ値は８８％と比較的高いことから、ＡＬ−５は既知のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓに属する種の中ではＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓに最も近縁と考えられる。しかし、両者の１６ＳｒＤＮＡは完全には一致しておらず、ＡＬ−５とＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの系統枝からは両者が別種である可能性も否定できない。よって、今回の分子系統解析の結果からＡＬ−５をＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓに近縁なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．と推定した。
【実施例６】
【００５４】
ＡＬ−５株の形態観察および生理・生化学的性状試験
ＡＬ−５株の形態観察および生理・生化学的性状試験も行なった。形態観察および生理・生化学的性状試験に用いた菌体は、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ培地（Ｏｘｏｉｄ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用し、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体はフェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬、東京）を用いてグラム染色を行い、光化学顕微鏡ＢＸ５０Ｆ４（オリンパス、東京）により形態観察を行った。また、ＢＡＲＲＯＷらの方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産出、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）についても試験した。さらに、ＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いた試験を行った。また、追加試験としてＫｉｎｇ’ｓＢ寒天培地での蛍光色素産出、でんぷんの加水分解、カゼインの加水分解、リパーゼ（Ｔｗｅｅｎ８０）活性、レシチナーゼ活性について試験した。
【００５５】
菌体脂肪酸組成分析に用いた菌体は、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ＋Ｇｒａｎｕｌａｒ Ａｇａｒ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用し、２８℃で２４時間培養した。得られた菌体からの脂肪酸抽出と測定は、Sherlock Microbial Identification System(Version 5．0) (MIDI、DEIUSA)の菌体脂肪酸組成分析操作マニュアル（Ｖｅｒｓｉｏｎ６）に従い行った。得られた脂肪酸組成はＭＩＳ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＬｉｂｒａｒｉｅｓのＴＳＢＡ４０のデータベースと照合した。
【００５６】
脂肪酸分析の結果、主要脂肪酸としてＣ１８：１ω７ｃ（２９．８７％）、Ｃ１６：０ （１９．３６％）、Ｓｕｍ Ｉｎ Ｆｅａｔｕｒｅ ３（Ｃ１５：０ ｉｓｏ ２ＯＨ＋Ｃ１６：１ω７ｃ）（１８．２２％）が認められた（表４）。ＭＩＤＩデータベースとの照合の結果、類似した脂肪酸組成を保持する菌種としてＰ．ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（類似度０．１６８）、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （類似度０．０９５）が検索された（表５）。しかし、類似度は低く、ＭＩＤＩの類似度（Ｓ．Ｉ．：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）の判定基準に従うと、ＭＩＤＩデータベースには該当する菌種のデータはないと考えられる（Ｓ．Ｉ．はまったく同一の組成を持つ場合は１．０００が与えられ、目安として０．５００以上あれば類似していると判断する）。
【００５７】
ＡＬ−５は運動性を有するグラム陰性桿菌で、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表６）。ＡＰＩ試験において、ＡＬ−５はアルギニンジヒドロラーゼ活性を示し、エクスリンを加水分解せず、ゼラチンを加水分解した（表７）。また、ＡＬ−５はＫｉｎｇ’ｓＢ寒天培地で蛍光色素を産出し、カゼインを加水分解せず、レシチナーゼ活性を示さず、リパーゼ（Ｔｗｅｅｎ８０）活性を示し、カゼインを加水分解した（表７）。
【００５８】
これらの性状は、蛍光色素を産出することを除くとＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの一般性状とほぼ類似する。しかし、Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の中で蛍光色素非産出種として知られており、加えてＡＬ−５のグルコースを資化する点もＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓの性状と異なる。また、今回の試験から得られた生理性状とＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓやＰ．ｐｕｔｉｄａなど蛍光色素を産出する種と比較したが、一致する種は見当たらなかった。よって、今回の生理・生化学的性状試験からはＡＬ−５をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの新種と判断し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．と推定した。
【００５９】
【表４】
【００６０】
【表５】
【００６１】
【表６】
【００６２】
【表７】
【００６３】
ＡＬ−５株、ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株は、平成２０年７月２８日付で特許生物寄託センターにそれぞれＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８８、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９８９、Ｐａｎｔｏｅａ属菌ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０９９０として受領された。
【実施例７】
【００６４】
ＡＬ−５株由来アルデヒド分解酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
ＡＬ−５粗酵素液の調製
ＡＬ−５株は５０ｍｌの１％エタノール含有ＬＢ培地［トリプトン、１０ｇ／ｌ；酵母エキス、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ，１０ｇ／ｌ］で、３０℃、２４時間１８０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、６０００×ｇで１５分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）（ｐＨ７．０）２０ｍｌに再懸濁し、再び６０００×ｇで１５分間遠心し、上清を取り除いた。菌体は回収した量の２倍量の１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に再懸濁し、超音波により破砕した。破砕後、２００００×ｇで遠心し、得られた上清を１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。そして透析により、菌体由来の低分子を取り除いた状態のものを粗酵素液とした。
アルデヒド酸化還元酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
酵素反応は酵素反応溶液（２ｍＭアセトアルデヒド；（＋２ｍＭ ＮＡＤ＋）；５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）；粗酵素溶液；最終液量２５０μｌ）で，３０℃２４時間反応させた。反応後、上清５０ｍｌと２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００ｍｌ、０．１％3-methyl-2-benzothiazolone hydrazone (MBTH)溶液４０ｍｌを混合し、溶液を５０℃で３０分間インキュベートした。次に０．６％硫酸アンモニウム鉄（III）／酢酸酸性水溶液［硫酸アンモニウム鉄（III）・１２水和物，６ｇ／ｌ；酢酸、５０ｍｌ／ｌ］１９０ｍｌを加え、さらに２０分間室温で反応させた。アルデヒドが残存する場合、溶液は青く呈色される。反応後水で１ｍｌに希釈し、溶液２００ｍｌを９６穴マイクロタイタープレートに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により６２０ｎｍの吸光度を測定した。ＮＡＤ＋非存在下で示した活性をＮＡＤ＋非依存性活性とし、ＮＡＤ＋存在下で示した活性からＮＡＤ＋非依存性活性を引いた値をＮＡＤ＋依存性活性とした。
アルデヒド酸化還元酵素活性に対するＮＡＤ＋の影響
ＡＬ−５の粗酵素液は、ＮＡＤ＋非存在下であってもアルデヒド酸化活性を示した。ＮＡＤ＋の添加により，ＮＡＤ＋非存在下よりも高い活性を示した（図５）。この結果からＡＬ−５の粗酵素液中にはＮＡＤ＋非依存性活性を持つ酵素（アセトアルデヒドオキシダーゼ）とＮＡＤ＋依存性活性を持つ酵素（アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ）の両方が存在すると考えられる（図５）。
【実施例８】
【００６５】
ＡＬ−５株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
アセトアルデヒド、１ｍｌ／ｌ；ペプトン、５ｇ／ｌ；酵母エキス、２ｇ／ｌ：ＮａＣｌ、８．５ｇ／ｌを含有する培地（ｐＨ７．０、５リットル）にてＡＬ−５株を３０℃で２日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（６、０００ｒｐｍ、１５分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（６、０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、上清にアセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例９】
【００６６】
ＡＬ−５株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同様にして培養することにより得られたＡＬ−５株の菌体（菌体湿重量、３．６ｇ）を、氷冷した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１０、０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。菌体抽出液にカタラーゼ（米国シグマ社、１０ｍｇ）を加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、アセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１０】
【００６７】
ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同組成の培地にてＡＬ−７株またはＡＬ−１１株を３０℃で２日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１５分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、各々約０．２ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株のいずれの場合においても上清にアセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１１】
【００６８】
ＡＬ−７株およびＡＬ−１１株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例９と同様にして得られたＡＬ−１１株の菌体（菌体湿重量、５．４ｇ）を、氷冷した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。菌体抽出液にカタラーゼ（米国シグマ社、１０ｍｇ）を加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１で述べた方法によって測定したところ、アセトアルデヒドを検出することはできなかった。
【実施例１２】
【００６９】
ＡＬ−５株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
アセトアルデヒド；１ｍｌ／ｌ、ペプトン；５ｇ／ｌ、酵母エキス；２ｇ／ｌ、ＮａＣｌ；８．５ｇ／ｌを含有する培地（ｐＨ７．０、２００ｍｌ）にてＡＬ−５株を３０℃で３日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。反応後、１５，０００×ｇで１０分間遠心することにより上清を得た。上清４５０μｌを内部標準として１００ｐｐｍのイソブタノールを５０μｌ加えたガラスバイアルに入れ、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法によりアセトアルデヒド濃度を測定した。機器はＴｅｋｍａｒ７０００型ヘッドスペースオートサンプラーと、ＩＮＮＯＷＡＸ１９０９１Ｎ−２３３キャピラリーカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム０．２５μｍ）を装着したＶａｒｉａｎ ＣＰ−３８００型ガスクロマトグラフを使用した。その結果，実施例８記載の方法で測定した場合同様、上記測定方法によっても上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１３】
【００７０】
ＡＬ−５株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同様にして培養することにより得られたＡＬ−５株の菌体（菌体湿重量、７．３ｇ）を、氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１５ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１０分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例９同様、上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１４】
【００７１】
ＡＬ−１１株による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例７と同組成の培地にてＡＬ−１１株を３０℃で３日間しんとう培養した。菌体を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分間）にて回収し、生理的食塩水にて洗浄した。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に菌体（湿重量、各々約０．１ｇ）を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この反応液から遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分間）により菌体を除去し、上清に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例１０同様、ＡＬ−１１株のいずれの場合においても上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１５】
【００７２】
ＡＬ−１１株菌体抽出液による唾液中アセトアルデヒド分解活性評価
実施例１４と同様にして得られたＡＬ−１１株の菌体（菌体湿重量、２．０ｇ）を、氷冷した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、４ｍｌ）に懸濁し、超音波処理（２０ｋＨｚ、のべ１０分間）により破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）にかけ、上清を菌体抽出液として回収した。０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で十分に透析し、粗酵素液とした。アセトアルデヒドを２ｍＭとなるように添加した唾液（０．５ｍｌ）に粗酵素液０．１ｍｌを懸濁し、３７℃で５時間インキュベートした。この唾液中に含まれるアセトアルデヒドの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、実施例１１同様、上清にアセトアルデヒドは検出されなかった。
【実施例１６】
【００７３】
ＡＬ−５菌体抽出液によるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナール分解活性評価
実施例１３と同様にして得られた粗酵素液をｎ−ヘキサナールまたは２−ノネナールを２ｐｐｍとなるように添加した反応液（０．６ｍｌ）に粗酵素液０．０３ｍｌを懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液中に含まれるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、ｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールは検出されなかった。
【実施例１７】
【００７４】
ＡＬ−１１菌体抽出液によるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナール分解活性評価
実施例１５と同様にして得られた粗酵素液をｎ−ヘキサナールまたは２−ノネナールを２ｐｐｍとなるように添加した反応液（０．６ｍｌ）に粗酵素液０．０３ｍｌを懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液中に含まれるｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールの濃度を実施例１２で述べた方法によって測定したところ、ｎ−ヘキサナールおよび２−ノネナールは検出されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物。
【請求項２】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、ヘキサナールおよび／またはノネナールである、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒドである、請求項１記載の微生物。
【請求項４】
ｐＨ３．０以上４．０以下の条件下で脂肪族アルデヒド分解能を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の微生物。
【請求項５】
脂肪族アルデヒド分解能がＮＡＤ非要求性のものである、請求項１〜４のいずれか一項記載の微生物。
【請求項６】
ＮＡＤ非要求性の脂肪族アルデヒド分解能が、アセトアルデヒドオキシダーゼによるものである、請求項５記載の微生物。
【請求項７】
微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．FERM ABP-10988株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項８】
微生物がＰａｎｔｏｅａ ｓｐ．FERM ABP-10989株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項９】
微生物がＰａｎｔｏｅａ ｓｐ．FERM ABP-10990株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を含む組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む組成物。
【請求項１２】
組成物が飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である、請求項１０または１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を含む口中衛生剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む口中衛生剤。
【請求項１５】
飲食品に、請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を添加することを特徴とする、食品または飲料中の脂肪族アルデヒド濃度の低減方法。
【請求項１６】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、ヘキサナールおよび／またはノネナールである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒドである、請求項１５記載の方法。
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌またはＰａｎｔｏｅａ属菌であって、脂肪族アルデヒド分解能を有し、バニリンに対しては分解能を有しない微生物。
【請求項２】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、ヘキサナールおよび／またはノネナールである、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒドである、請求項１記載の微生物。
【請求項４】
ｐＨ３．０以上４．０以下の条件下で脂肪族アルデヒド分解能を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の微生物。
【請求項５】
脂肪族アルデヒド分解能がＮＡＤ非要求性のものである、請求項１〜４のいずれか一項記載の微生物。
【請求項６】
ＮＡＤ非要求性の脂肪族アルデヒド分解能が、アセトアルデヒドオキシダーゼによるものである、請求項５記載の微生物。
【請求項７】
微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．FERM ABP-10988株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項８】
微生物がＰａｎｔｏｅａ ｓｐ．FERM ABP-10989株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項９】
微生物がＰａｎｔｏｅａ ｓｐ．FERM ABP-10990株またはその変異株である、請求項１〜６のいずれか一項記載の微生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を含む組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含む組成物。
【請求項１２】
組成物が飲食品、化粧料、洗濯処理剤、または消臭剤である、請求項１０または１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を含む口中衛生剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物から調製される菌体破砕液、粗酵素液、または精製酵素を含む口中衛生剤。
【請求項１５】
飲食品に、請求項１〜９のいずれか一項記載の微生物を添加することを特徴とする、食品または飲料中の脂肪族アルデヒド濃度の低減方法。
【請求項１６】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒド、ヘキサナールおよび／またはノネナールである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
脂肪族アルデヒドが、アセトアルデヒドである、請求項１５記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−５７４８２（Ｐ２０１０−５７４８２Ａ）
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８１０６２（Ｐ２００９−１８１０６２）
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月３日（２００９．８．３）
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【出願人】（３０９００７９１１）サントリーホールディングス株式会社 (307)
【Ｆターム（参考）】
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