脂質代謝調整剤
【課題】肝臓の脂肪酸合成系酵素群の発現を抑制し、活性を低下させ、トリアシルグリセロールおよびコレステロール量を減少させる脂質代謝調整剤を提供する。本発明は、肥満、脂肪肝の予防または改善に有用な脂質代謝調整剤として、医薬品、食品産業のほか、動物飼料産業、などに広く利用される。
【解決手段】炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤。脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである脂質代謝調整剤。高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である脂質代謝調整剤。
【解決手段】炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤。脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである脂質代謝調整剤。高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である脂質代謝調整剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含む脂質代謝調整剤に関する。詳しくは、肝臓の脂肪酸合成系酵素群の発現を抑制し、活性を低下させ、トリアシルグリセロールおよびコレステロール量を減少させる脂質代謝調整剤に関する。本発明は、肥満、脂肪肝の予防または改善に有用な脂質代謝調整剤として、医薬品、食品産業のほか、動物飼料産業、などに広く利用されるものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓の働きは、栄養過多または運動不足によるエネルギー消費の低下時に、グルコースから脂肪酸を合成し、トリアシルグリセロールの形で中性脂肪として蓄積する。肥満は、このような脂肪が過剰蓄積する病態であり、この状態になると糖尿病，高脂血症，循環器疾患，関節炎、脂肪肝などいわゆる成人病が合併して多く見られることになる。したがって、脂肪合成能を阻害し脂肪蓄積を軽減することによってこれら病態の治療および予防が可能であると考えられる。
脂肪酸合成阻害剤としては、ＦＡ−４２４８（特許文献１）、１−フェニルピロリドン誘導体（特許文献２）、リグナン類化合物（特許文献３）等が知られている。しかし、これらの化合物は微生物の代謝物であり、投与方法によっては副作用が問題となり、長期的な使用には適していなかった。
【０００３】
高級脂肪族アルコールは、天然界においては、高級脂肪酸とエステル結合した化合物として存在している。高級脂肪族アルコールは、抗ストレス（特許文献４）、高コレステロール症の改善（特許文献５）が報告され天然由来の副作用のない安全な機能素材として注目されつつある。
高級脂肪族アルコールの抗高コレステロール症効果において、その作用機序としてコレステロール合成経路の律速反応であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の発現抑制が推察されているが（非特許文献１）、脂肪酸合成を抑制することは見出されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−１９８６８７号公報
【特許文献２】ＷＯ９４／０６６７公報
【特許文献３】特開平３−２７３１９号公報
【特許文献４】特開２００４−２９２３５５号公報
【特許文献５】特開平０６−１９２０７２号公報
【非特許文献１】Medical Hypotheses (2002) 59(3), 268-279
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、前記の問題点に鑑み鋭意検討した結果、高級脂肪族アルコールが、肝臓中の脂肪酸合成経路における酵素群の発現を低下し、酵素の活性を抑制することを見いだし、更には、肝臓中のトリアシルグリセロールおよびコレステロール量を低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち本発明は、次の（１）〜（３）である。
（１）炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤である。
（２）脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである前記（１）の脂質代謝調整剤である。
（３）高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である前記（１）または（２）の脂質代謝調整剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有する脂質調整剤によれば、肝臓中の脂肪酸合成経路における酵素群の発現を低下し、酵素の活性を抑制することができる。そして、肝臓中のトリアシルグリセロールおよびコレステロール量を低下することができるので、肥満の抑制、または肥満から引き起こされる糖尿病，高脂血症，循環器疾患，関節炎、脂肪肝などいわゆる成人病などの予防または改善に有効である脂質代謝調整剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の高級脂肪族アルコールは、天然ワックスより分離精製される。天然ワックスとしては、炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを構成成分とする天然ワックスであれば特に限定されないが、動物、植物、微生物由来のワックスが挙げられ、好ましくは高含量の長鎖アルコールを構成成分として有するワックスが挙げられる。例えば、植物起源のワックスとしては、米糠ワックス（ライスワックス）、さとうきびワックス、カルナウバワックス、カンデリラワックス、ホホバ油、木ろうなどが挙げられる。また、動物起源のワックスとしては、ビーズワックス（蜜蝋）、マッコウ鯨油、羊毛脂などが挙げられる。これらから選ばれた少なくとも1種を用いることができ、高級脂肪族アルコール（Ｃ２０〜３６）を多く含む、米糠ワックス（ライスワックス）、さとうきびワックス、カンデリラワックス、木ろう、カルナウバワックス、蜜蝋などが好ましい。また、米糠ワックス、さとうきびワックスは、米や米油、砂糖の生産の副産物として大量に発生するため、安価で入手しやすいため、特に好ましい。したがって、本発明で得られる高級脂肪族アルコールとしては、前記のワックスを分解して得られるもので、通常炭素数２０〜３６の１価および２価の飽和アルコールが挙げられる。具体的には、例えば、エイコサノール（Ｃ２０、炭素数を示す。以降、同じ）、ドコサノール（Ｃ２２）、テトラコサノール（Ｃ２４）、ヘキサコサノール（Ｃ２６）、オクタコサノール（Ｃ２８）、ノナコサノール（Ｃ２９）、ミリシルアルコール（Ｃ３０）、メリシルアルコール（Ｃ３１）、ラクセリルアルコール（Ｃ３２）、セロメリシルアルコール（Ｃ３３）、テトラトリアコンタノール（Ｃ３４）、ヘプタトリアコンタノール（Ｃ３５）、ヘキサトリアコンタノール（Ｃ３６）、エイコサン１，２−ジオール、ドコサン１，２−ジオール、テトラコサン１，２−ジオール、ドコサン１，３−ジオール、トリコサン１，３−ジオール、テトラコサン１，３−ジオールなどが挙げられる。
これらは、製精し純品として使用できるし、また、これを混合して使用することができる。天然由来の高級アルコール混合物は、そのままで本発明に使用できるので、実施に適している。
代表的な天然由来の組成を表１にまとめる。
【０００９】
【表１】
この中でも米糠から得られる高級アルコール混合物は、原料の入手が容易かつ安価なので、本発明の使用に適している。
【００１０】
かかる高級脂肪族アルコールは、天然ワックスの加水分解反応等により得ることができる。反応方法は、アルカリ触媒等を用いた化学反応法、リパーゼ等の油脂加水分解酵素を用いた生化学反応法のいずれでもよい。分解生成物である高級脂肪族アルコールの一般的な精製方法は、ヘキサン、アセトン、エタノール等の有機溶剤、または中鎖トリグリセライド（ＭＣＴ油）等の食品素材を用いて抽出する方法が挙げられるが、本発明にかかる高級脂肪族アルコールの抽出はいずれでもよい。また、高級脂肪族アルコール分子内の水酸基に、一度、エチル基、メチル基等を修飾し、蒸留により分離した後、修飾基を除去する方法もあるが、本発明にかかる高級脂肪族アルコールは、いずれの方法で得られたものでもよい。
【００１１】
本発明の脂質代謝調整剤は、かかる高級脂肪族アルコールを有効成分とするものである。本発明の脂肪代謝調整剤は、医薬品又は飲食物とすることが好ましい。医薬品としては経口投与剤が好ましい。経口投与剤とする場合には、その形態に特に制限はなく、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これらの医薬品は、高級脂肪族アルコールの他に、必要に応じて医薬品の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。
【００１２】
飲食物としては、例えば特定の機能を発揮して健康増進を図る健康食品が挙げられる。具体的には、高級脂肪族アルコールを配合した調理油、錠剤、顆粒剤、ドレッシング類、マヨネーズ類、合成クリーム類、チョコレートやポテトチップス等の菓子類等が挙げられる。かかる飲食物は、上記高級脂肪族アルコールの他に、飲食物の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。
本発明の脂質代謝調整剤の、高級脂肪族アルコールの含有量は、０．００１〜１００質量％であることが好ましい。医薬品として用いる場合は、３０〜９０質量％が好ましい。飲食物として用いる場合は、０．００１〜８０質量％が好ましい。
投与量は、高級脂肪族アルコールの効果を有効に発現させるために、成人１人当たり、高級脂肪族アルコールとして、１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは５ｍｇ〜１ｇを１日１〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００１３】
本発明の脂質代謝調整剤において、高級脂肪族アルコールは平均粒径が１〜１５０μｍの粉末状であることが好ましい。平均粒径が１５０μｍを超えると経口による吸収効率が悪くなる。
【００１４】
本発明に係る脂肪酸合成系酵素とは、生体内の脂肪酸量を調整するものであり、グルコースから脂肪酸の合成する経路及びトリグリセリド合成の初期反応を指す。すなわち、本発明に係る脂肪酸合成系酵素とは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）である。
【００１５】
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡからＮＡＤＰＨを補酵素として脂肪酸を合成する酵素である。
【００１６】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）は、ペント−スリン酸回路の酵素であり、グルコース−６−リン酸とＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨと６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。この反応で生成したＮＡＤＰＨは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の補酵素として供給される。
【００１７】
ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）は、クエン酸をＡＴＰとＣｏＡにより開裂して、アセチルＣｏＡ、オキサロ酢酸、ＡＤＰと正リン酸を生成する反応を触媒する酵素である。この反応により得られたアセチルＣｏＡは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に係る反応に供給される。
【００１８】
リンゴ酸酵素（ＭＥ）は、L-リンゴ酸をＮＡＤまたはＮＡＤＰ存在下で脱炭酸し、ピルビン酸を生成する反応を触媒する。この反応は、トリカルボン酸輸送系に係る酵素である。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）で触媒される反応は、サイトソルで行われる。トリカルボン酸輸送系は、ミトコンドリアからサイトソルへアセチルＣｏＡを輸送し、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に係る反応にアセチルＣｏＡを供給する。
【００１９】
ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、ＡＤＰとホスホエノールピルビン酸から、ＡＴＰとピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素で、グルコースの解糖系に関する酵素である。この反応から得られたピルビン酸は、トリカルボン酸輸送系に取り込まれる。
【００２０】
グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）は、グリセロール３リン酸とアシルＣｏＡからリゾホスファチジン酸を生成する反応を触媒する酵素である。脂肪酸合成系酵素群により生成された脂肪酸は、アシルＣｏＡシンテターゼによりアシルＣｏＡとなり、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）に触媒される反応に取り込まれる。この反応は、トリグリセロール合成の初期反応であり、脂肪酸量の消費に関する。
【実施例】
【００２１】
以下、比較例、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
（動物実験１）
比較例１
雄の４週齢ＳＤラット（体重１３２〜１５６ｇ）を用いて、１週間の予備飼育後、１群７匹にて下記の試験食を投与し、３週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。
コントロール食群：カゼイン（和光純薬（株）製）２０質量％、パーム油（日本油脂（株）製）１０質量％、コーンスターチ１５質量％、セルロース２質量％、ビタミンミックス（日本農産（株）製「ＡＩＮ−７６ＴＭビタミン混合組成」）１質量％、ミネラルミックス（日本農産（株）製「ＡＩＮ−７６ＴＭミネラル混合組成」）３．５質量％、ＤＬ−メチオニン（和光純薬（株）製）０．３質量％、コリン酒石酸水素塩（和光純薬（株）製）０．２質量％、スクロース（大日本明治製糖（株）製「グラニュー糖」）４８質量％。
【００２３】
実施例１〜３
高級脂肪族アルコール添加食群は、高級脂肪族アルコールの添加量を、コントロール食のスクロース量から差し引き下記の試験食を調整した。
雄の４週齢ＳＤラット（体重１３２〜１５６ｇ）を用いて、１週間の予備飼育後、１群７匹にて下記の試験食を投与し、３週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。
（１）実施例１（０．５％添加食群）：高級脂肪族アルコール（日本油脂（株）製「オクタコサノール１２−Ｏ」）０．５質量％、スクロース（同上）４７．５質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
（２）実施例２（１．０％添加食群）：高級脂肪族アルコール（同上）１．０質量％、スクロース（同上）４７．０質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
（３）実施例３（２．０％添加食群）：高級脂肪族アルコール（同上）２．０質量％、スクロース（同上）４６．０質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
【００２４】
なお、添加した高級脂肪族アルコールの組成は、テトラコサノール（Ｃ２４）７．４質量％、ヘキサコサノール（Ｃ２６）８．４質量％、オクタコサノール（Ｃ２８）１４．８質量％、ミリシルアルコール（Ｃ３０）２３．５質量％、ラクセリルアルコール（Ｃ３２）１４．９質量％、テトラトリアコンタノール（Ｃ３４）８．６質量％、ヘプタトリアコンタノール（Ｃ３５）２．４質量％、残りはその他の高級脂肪族アルコール類である。高級脂肪族アルコール組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。前処理として、トリメチルシリル化し、ガスクロマトグラフィー条件は下記の通り行った。
「ガスクロマトグラフィー条件」
カラム：ＤＢ−１（Ｌｅｎｇｔｈ：３０ｍ、ＩＤ：０．３２ｍｍ、Ｆｉｌｍ：０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社製）
昇温条件：１５０℃→（１０℃／分）→３２０℃→（２０分）→３２０℃
カラム流量：２．７ｍＬ／分
検出器：ＦＩＤ、検出器温度：３２０℃、注入口温度：３２０℃
キャリアーガス：ヘリウム
【００２５】
高級脂肪族アルコールの形状は微粉末であり、１００メッシュの篩を通過させ、平均粒径は７１．３μｍ（（株）島津製作所製、レーザー回折式粒度分布分析装置：ＳＡＬＡ−２１００）のものを使用した。
【００２６】
表２に、実施例、比較例における、飼育の結果を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実験食投与時の摂食量は、比較例１（コントロール食群）；４５７±１８（ｇ／３週間、±標準誤差）、実施例１（０．５％添加食群）；４３０±９、実施例２（１．０％添加食群）；４４１±９、実施例３（２．０％添加食群）；４４１±２０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。飼育開始時と終了時の体重増加量は、比較例１（コントロール食群）；１９０±７（ｇ増加／３週間、±標準誤差）、実施例１（０．５％添加食群）；１７９±５、実施例２（１．０％添加食群）；１８３±８、実施例３（２．０％添加食群）；１７９±９であり、各群間で有意な差異は認められなかった。
表１から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤を長期にわたり投与しても、体重、摂食量、肝臓重量等に特に異常は見られず、本発明の脂質代謝調整剤は安全性が高いことが確認された。
【００２９】
次に、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤の脂肪酸合成系酵素の発現、活性について検討した。
（ｍＲＮＡの発現量）
肝臓の約１．５ｇをＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート，２５ｍＭクエン酸ナトリウム，０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム，０．１Ｍメルカプトエタノール）１５ｍＬに入れ、ポリトロン式ホモジナイザーにより組織を破砕し、ＡＧＰＣ法により、ＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡサンプルの精製度はＯＤ比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）１．６〜１．８であった。抽出は、実施例２（１．０％投与群）および比較例１（コントロール食群）について行った。各群において、ラット個体のＲＮＡ濃度が等量となるように混合し、ＤＮＡチップ（アジレント社製「ラット用２０，５００遺伝子」）による発現量の解析を行った。結果を表３にまとめた。
【００３０】
（脂肪酸合成系酵素の活性）
肝臓の約１．３ｇを切り取り、約１０ｍＬの０．２５Ｍスクロース，３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）緩衝液に入れ、速やかにホモジナイズした。ホモジナイズした抽出液を８，０００×ｇで遠心し、更に上清を２００，０００×ｇで超遠心した。超遠心の上清を用いて、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の活性を測定した。超遠心の沈殿物を用いて、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）の活性を測定した。ローリー法により、上清及び沈殿物の総蛋白質重量をそれぞれ測定し、酵素活性値を総蛋白質重量当りで表した。
【００３１】
（１）脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）測定法；アッセイは、恒温セル室付きの分光光度計を用いて行った。アッセイ溶液は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０），０．２ｍＭＥＤＴＡ，０．３ｍＭＮＡＤＰＨ，０．０５ｍＭアセチルＣｏＡ，０．２ｍＭマロニルＣｏＡ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った（総容量１ｍＬ、反応温度３０℃）。測定波長は３４０ｎｍで行い、ＮＡＤＰＨの酸化反応を測定した（測定時間１５０秒間）。具体的な測定操作は、マロニルＣｏＡ以外のアッセイ溶液を調製し、ブランクを測定後、反応開始剤としてマロニルＣｏＡを投入し、素早く撹拌して、測定を開始した。ブランクを差し引いた反応曲線から、活性を算出した。
【００３２】
（２）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．１６ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），３０ｍＭＭｇＣｌ２，３．３ｍＭグルコース６―リン酸，１．２ｍＭＮＡＤＰ，０．５ｕｎｉｔホスホグルコン酸デヒドラターゼ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＰの還元反応を測定した（反応時間１８０秒間）。反応開始剤は、グルコース６−リン酸溶液とした。
【００３３】
（３）ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭ２−メルカプトエタノール，２０ｍＭクエン酸カリウム，０．２ｍＭＣｏＡ，１０ｍＭＡＴＰ，０．２ｍＭＮＡＤＨ，０．２ｕｎｉｔリンゴ酸デヒドロゲナーゼ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化反応を測定した（反応時間１５０秒間）。反応開始剤は、ＣｏＡ溶液とした。
【００３４】
（４）リンゴ酸酵素（ＭＥ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、６４ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．４），４ｍＭＭｇＣｌ２，１．２ｍＭＮＡＤＰ，１．２ｍＭリンゴ酸，１．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＰの還元反応を測定した（反応時間１８０秒間）。反応開始剤は、リンゴ酸溶液とした。
【００３５】
（５）ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭＭｇＣｌ２，０．２Ｍ塩化カリウム，０．２ｍＭＮＡＤＨ，０．８ｍＭＡＤＰ，３ｍＭホスホエノイルピルビン酸，６ｕｎｉｔ乳酸デヒドロゲナーゼ，１．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化反応を測定した（反応時間１２０秒間）。反応開始剤は、ホスホエノイルピルビン酸溶液とした。
【００３６】
（６）グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）測定法；超遠心で得られた沈殿物を２ｍＬの０．２５Ｍスクロース，３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）緩衝液に分散し、酵素液として測定に用いた。測定は、放射性試薬[Ｕ−１４Ｃ]グリセロール３リン酸を基質として添加し、反応生成物をカウントした。アッセイ溶液は、７５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬアルブミン、７５μＭパルミトイルＣｏＡ、３００μＭ[Ｕ−１４Ｃ]グリセロール３リン酸（５０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）、８ｍＭフッ化カリウム、酵素液（総蛋白量約１００μｇ）で行った。反応条件は、３７℃、３０分間とした。反応終了後、クロロホルム：メタノール（１：２）で反応生成物を抽出した。
【００３７】
これらの酵素活性の結果を表４にまとめた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
表３の結果から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、脂肪酸合成系酵素の発現が抑制されることがわかる。
表４の結果から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、脂肪酸合成系酵素群の活性が低下することがわかる。
【００４１】
次に、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤による、肝臓中のトリアシルグリセロール量、コレステロール量における効果を検討した。本発明に係る酵素群の活性が低下すると、肝臓中のトリアシルグリセロールの蓄積が抑制される。これに従い、末梢組織へのトリアシルグリセロールの輸送を低下し、脂肪蓄積予防となる。
【００４２】
また、本発明に係る酵素群のＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼは、脂肪酸合成の中間生成物であるアセチルＣｏＡの合成に関する酵素である。アセチルＣｏＡは脂肪酸合成経路やコレステロール合成経路など種々の脂質代謝経路へと派生している。本発明の酵素群の活性低下により、肝臓中のコレステロール量の蓄積も抑制される。
【００４３】
ホルチ法により肝臓脂質を抽出し、トリアシルグリセロール、コレステロールを測定した。脂質抽出（ホルチ法）、トリアシルグリセロール測定、コレステロール測定は下記の通り行った。
【００４４】
（１）ホルチ法；冷凍した肝臓０．５ｇを８ｍＬのメタノールに入れ、ポリトロン型ホモジナイザーですりつぶし、５０ｍＬ容メスフラスコに移した。７ｍＬのメタノールと３０ｍＬのクロロホルムを数回に分けてホモジナイザー、容器を洗浄し、全て抽出液と混合した。抽出液を４０℃で３０分間加温した。室温へ戻した後、クロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ（体積／体積比）。以降、同様に表示する。）溶液で５０ｍＬに定容した。抽出液を濾過（アドバンテック社製「濾紙Ｎｏ．２」）し、ろ液を定量した。ろ液の約２０％（Ｖ／Ｖ）の精製水を加え、静かに撹拌後、一晩静置して、２層に分離した。上層の水層部を捨て、下層のクロロホルム層にメタノールを加えて４０ｍＬとした。これを抽出液として、トリアシルグリセロール測定、コレステロール測定に用いた。
【００４５】
（２）トリアシルグリセロール測定法；２ｍＬの抽出液を１０ｍＬ容スピンチューブに入れ、窒素下で乾燥した。５ｍＬのクロロホルム、０．４ｇのＳｉｌｉｃ Ａｃｉｄ １００Ｍｅｓｈ（和光純薬（株）製）を加え、強く撹拌した。３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層１ｍＬを別の試験管に移した。ここで、トリアシルグリセロールの標準液として、トリオレイン（和光純薬（株）製）１２５μｇ／ｍＬ・クロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ）溶液を用意し、以下、同様の操作を行い、検量線を作成した。抽出液、標準液それぞれを窒素下で乾燥した。２ｍＬのイソプロパーノール／精製水（９：１、Ｖ／Ｖ）、０．６ｍＬの水酸化カリウム（５ｇ／１００ｍＬイソプロパーノール／精製水（４０：６０））溶液を加え、６５℃で２０分間加温後、室温に戻した。１ｍＬの３ｍＭＮａＩＯ４溶液（溶媒；イソプロパノール／１Ｎ酢酸（２０：８０、Ｖ／Ｖ））を加え、強く撹拌した。０．５ｍＬのアセチルアセトン溶液（０．７５ｍＬのアセチルアセトン、２．５ｍＬのイソプロパノール、１００ｍＬの２Ｍ酢酸アンモニウムの混合溶液）を加え、強く撹拌し、５０℃で３０分間加温した。室温に戻して、４０５ｎｍの吸光度を測定し、検量線よりトリアシルグリセロール含量を算出した。結果を表５に示した。
【００４６】
（３）コレステロール測定法；１．２ｍＬの抽出液を試験管にとり、窒素下で乾燥した。１ｍＬのエタノール、０．２ｍＬの４Ｎ水酸化カリウムを加え、強く撹拌後、６５℃で２０分間加温した。１ｍＬの精製水を添加後、約３ｍＬのヘキサンで３回抽出した。ヘキサン層を別のチューブに移し、３回分を混合した。ここで、サンプルとは別にコレステロール標準液（和光純薬（株）製、５０μｇ／２ｍＬクロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ））を用意し、以下、同様の操作を行い、検量線を作成した。サンプル溶液、標準液をそれぞれ窒素下で乾燥し、０．１２５ｍＬのブタノールを加えて強く撹拌した。２４０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ１）。再度、試験管へ戻し、２５μＬのコレステロール酸化酵素溶液（東洋紡（株）製、０．５ｕｎｉｔ／２５μＬ；０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７），０．５ｍＬ／ＬＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加え撹拌し、３７℃で１時間インキュベートした。室温に戻した後、２４０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ２）。ΔＯＤ（ＯＤ２−ＯＤ１）の値を用いて、検量線を作成し、抽出液中のコレステロール含量を算出した。結果は、表５に示した。
【００４７】
【表５】
【００４８】
表５より、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、肝臓中のトリアシルグリセロール量およびコレステロール量が減少することがわかる。これらの結果から、本発明の脂質代謝調整剤により脂質代謝の調整が可能であることがわかった。
【００４９】
（動物実験２）
比較例２
肥満モデルラットである「Ｚｕｃｋｅｒラット（雄性、７週齢）」（「Ｃｒｊ：（ＺＵＣ）−ｆａ／ｆａ」、日本チャールスリバー（株））を用いて、１群７頭とし（平均体重２９７．６ｇ）、１週間の予備飼育後、ＡＩＮ−７６標準飼料（日本農産工業（株）製）を投与して８週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。飼育環境は、温度２５℃、湿度５５％、１２時間の明暗サイクルで飼育した。
【００５０】
ＡＩＮ−７６標準飼料の組成は、カゼイン：２０％、ＤＬ−メチオニン：０．３％、コーンスターチ：１５％、コーン油：５％、スクロース：５０％、セルロース：５％、ＡＩＮ−７６ミネラルミックス（日本農産工業（株）製）：３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミンミックス（日本農産工業（株）製）：１％、重酒石酸コリン：０．２％である。
【００５１】
実施例４〜６
高級脂肪族アルコール添加食群については、試験食をＡＩＮ−７６：９９質量％、高級脂肪族アルコール混合物１％とし、それ以外の条件は比較例２と同条件とした。
（１）実施例４
米糠由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「ニッサンオクタコサノール１２−Ｏ（日本油脂（株）製）」を使用した。平均粒径を動物実験１と同様に求めた結果、７１μｍであった。
（２）実施例５
サトウキビ由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「サトウキビ由来ポリコサノール（フィトファーマ（株）製）」を使用した。平均粒径は８３μｍであった。
（３）実施例６
蜜蝋由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「脱臭精製蜜蝋高酸（（株）セラリカ野田製）」をケン化分解し、ＭＣＴ油により抽出後、晶析、エタノール洗浄により精製したものを使用した。平均粒径は７６μｍであった。
【００５２】
実施例４〜６に用いた高級脂肪族アルコールの脂肪鎖組成は、動物実験１と同様にガスクロマトグラフィーにより求めた。これらの結果は、表６にまとめた。
【００５３】
【表６】
【００５４】
実験食投与時の摂食量は、比較例２；１７２２±５５（ｇ／８週間、±標準誤差）、実施例４；１７１４±３９、実施例５；１７３５±３７、実施例６；１７３４±３０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。
飼育開始時と終了時の体重増加量は、比較例２；２７７±１５（ｇ増加／８週間、±標準誤差）、実施例４；２７４±１３、実施例５；２８６±１４、実施例６；２８３±１０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。ＩＩ型糖尿病モデルラットの特徴とする肥満は認められるが、高級脂肪族アルコールの摂取による変化はなく、副作用はない。
【００５５】
次に、動物実験１と同様にして、肝臓中の脂肪酸合成系酵素群の活性測定を行った。結果を表７にまとめた。
【００５６】
【表７】
【００５７】
次に、動物実験１と同様にして、肝臓中のトリアシルグリセロール含量及びコレステロール含量を測定した。結果を表８にまとめた。
【００５８】
【表８】
【００５９】
表６、表７、表８より、肥満モデルラットにおいても肝臓中の脂肪酸合成系酵素群の活性が抑制され、トリアシルグリセロール含量及びコレステロール含量が低下することが確認された。また、脂肪組成の異なるサトウキビ由来、米糠由来、蜜蝋由来の高級脂肪族アルコール組成の異なる素材を用いても、同様の効果を得られることから、特定の高級脂肪族アルコール組成によらないことがわかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含む脂質代謝調整剤に関する。詳しくは、肝臓の脂肪酸合成系酵素群の発現を抑制し、活性を低下させ、トリアシルグリセロールおよびコレステロール量を減少させる脂質代謝調整剤に関する。本発明は、肥満、脂肪肝の予防または改善に有用な脂質代謝調整剤として、医薬品、食品産業のほか、動物飼料産業、などに広く利用されるものである。
【背景技術】
【０００２】
肝臓の働きは、栄養過多または運動不足によるエネルギー消費の低下時に、グルコースから脂肪酸を合成し、トリアシルグリセロールの形で中性脂肪として蓄積する。肥満は、このような脂肪が過剰蓄積する病態であり、この状態になると糖尿病，高脂血症，循環器疾患，関節炎、脂肪肝などいわゆる成人病が合併して多く見られることになる。したがって、脂肪合成能を阻害し脂肪蓄積を軽減することによってこれら病態の治療および予防が可能であると考えられる。
脂肪酸合成阻害剤としては、ＦＡ−４２４８（特許文献１）、１−フェニルピロリドン誘導体（特許文献２）、リグナン類化合物（特許文献３）等が知られている。しかし、これらの化合物は微生物の代謝物であり、投与方法によっては副作用が問題となり、長期的な使用には適していなかった。
【０００３】
高級脂肪族アルコールは、天然界においては、高級脂肪酸とエステル結合した化合物として存在している。高級脂肪族アルコールは、抗ストレス（特許文献４）、高コレステロール症の改善（特許文献５）が報告され天然由来の副作用のない安全な機能素材として注目されつつある。
高級脂肪族アルコールの抗高コレステロール症効果において、その作用機序としてコレステロール合成経路の律速反応であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の発現抑制が推察されているが（非特許文献１）、脂肪酸合成を抑制することは見出されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−１９８６８７号公報
【特許文献２】ＷＯ９４／０６６７公報
【特許文献３】特開平３−２７３１９号公報
【特許文献４】特開２００４−２９２３５５号公報
【特許文献５】特開平０６−１９２０７２号公報
【非特許文献１】Medical Hypotheses (2002) 59(3), 268-279
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、前記の問題点に鑑み鋭意検討した結果、高級脂肪族アルコールが、肝臓中の脂肪酸合成経路における酵素群の発現を低下し、酵素の活性を抑制することを見いだし、更には、肝臓中のトリアシルグリセロールおよびコレステロール量を低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち本発明は、次の（１）〜（３）である。
（１）炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤である。
（２）脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである前記（１）の脂質代謝調整剤である。
（３）高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である前記（１）または（２）の脂質代謝調整剤である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有する脂質調整剤によれば、肝臓中の脂肪酸合成経路における酵素群の発現を低下し、酵素の活性を抑制することができる。そして、肝臓中のトリアシルグリセロールおよびコレステロール量を低下することができるので、肥満の抑制、または肥満から引き起こされる糖尿病，高脂血症，循環器疾患，関節炎、脂肪肝などいわゆる成人病などの予防または改善に有効である脂質代謝調整剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の高級脂肪族アルコールは、天然ワックスより分離精製される。天然ワックスとしては、炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを構成成分とする天然ワックスであれば特に限定されないが、動物、植物、微生物由来のワックスが挙げられ、好ましくは高含量の長鎖アルコールを構成成分として有するワックスが挙げられる。例えば、植物起源のワックスとしては、米糠ワックス（ライスワックス）、さとうきびワックス、カルナウバワックス、カンデリラワックス、ホホバ油、木ろうなどが挙げられる。また、動物起源のワックスとしては、ビーズワックス（蜜蝋）、マッコウ鯨油、羊毛脂などが挙げられる。これらから選ばれた少なくとも1種を用いることができ、高級脂肪族アルコール（Ｃ２０〜３６）を多く含む、米糠ワックス（ライスワックス）、さとうきびワックス、カンデリラワックス、木ろう、カルナウバワックス、蜜蝋などが好ましい。また、米糠ワックス、さとうきびワックスは、米や米油、砂糖の生産の副産物として大量に発生するため、安価で入手しやすいため、特に好ましい。したがって、本発明で得られる高級脂肪族アルコールとしては、前記のワックスを分解して得られるもので、通常炭素数２０〜３６の１価および２価の飽和アルコールが挙げられる。具体的には、例えば、エイコサノール（Ｃ２０、炭素数を示す。以降、同じ）、ドコサノール（Ｃ２２）、テトラコサノール（Ｃ２４）、ヘキサコサノール（Ｃ２６）、オクタコサノール（Ｃ２８）、ノナコサノール（Ｃ２９）、ミリシルアルコール（Ｃ３０）、メリシルアルコール（Ｃ３１）、ラクセリルアルコール（Ｃ３２）、セロメリシルアルコール（Ｃ３３）、テトラトリアコンタノール（Ｃ３４）、ヘプタトリアコンタノール（Ｃ３５）、ヘキサトリアコンタノール（Ｃ３６）、エイコサン１，２−ジオール、ドコサン１，２−ジオール、テトラコサン１，２−ジオール、ドコサン１，３−ジオール、トリコサン１，３−ジオール、テトラコサン１，３−ジオールなどが挙げられる。
これらは、製精し純品として使用できるし、また、これを混合して使用することができる。天然由来の高級アルコール混合物は、そのままで本発明に使用できるので、実施に適している。
代表的な天然由来の組成を表１にまとめる。
【０００９】
【表１】
この中でも米糠から得られる高級アルコール混合物は、原料の入手が容易かつ安価なので、本発明の使用に適している。
【００１０】
かかる高級脂肪族アルコールは、天然ワックスの加水分解反応等により得ることができる。反応方法は、アルカリ触媒等を用いた化学反応法、リパーゼ等の油脂加水分解酵素を用いた生化学反応法のいずれでもよい。分解生成物である高級脂肪族アルコールの一般的な精製方法は、ヘキサン、アセトン、エタノール等の有機溶剤、または中鎖トリグリセライド（ＭＣＴ油）等の食品素材を用いて抽出する方法が挙げられるが、本発明にかかる高級脂肪族アルコールの抽出はいずれでもよい。また、高級脂肪族アルコール分子内の水酸基に、一度、エチル基、メチル基等を修飾し、蒸留により分離した後、修飾基を除去する方法もあるが、本発明にかかる高級脂肪族アルコールは、いずれの方法で得られたものでもよい。
【００１１】
本発明の脂質代謝調整剤は、かかる高級脂肪族アルコールを有効成分とするものである。本発明の脂肪代謝調整剤は、医薬品又は飲食物とすることが好ましい。医薬品としては経口投与剤が好ましい。経口投与剤とする場合には、その形態に特に制限はなく、例えば散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等が挙げられる。これらの医薬品は、高級脂肪族アルコールの他に、必要に応じて医薬品の形態に応じて一般に用いられる、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール類、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料等を添加し、常法に従って製造することができる。
【００１２】
飲食物としては、例えば特定の機能を発揮して健康増進を図る健康食品が挙げられる。具体的には、高級脂肪族アルコールを配合した調理油、錠剤、顆粒剤、ドレッシング類、マヨネーズ類、合成クリーム類、チョコレートやポテトチップス等の菓子類等が挙げられる。かかる飲食物は、上記高級脂肪族アルコールの他に、飲食物の種類に応じて一般に用いられる食品原料を添加し、常法に従って製造することができる。
本発明の脂質代謝調整剤の、高級脂肪族アルコールの含有量は、０．００１〜１００質量％であることが好ましい。医薬品として用いる場合は、３０〜９０質量％が好ましい。飲食物として用いる場合は、０．００１〜８０質量％が好ましい。
投与量は、高級脂肪族アルコールの効果を有効に発現させるために、成人１人当たり、高級脂肪族アルコールとして、１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは５ｍｇ〜１ｇを１日１〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００１３】
本発明の脂質代謝調整剤において、高級脂肪族アルコールは平均粒径が１〜１５０μｍの粉末状であることが好ましい。平均粒径が１５０μｍを超えると経口による吸収効率が悪くなる。
【００１４】
本発明に係る脂肪酸合成系酵素とは、生体内の脂肪酸量を調整するものであり、グルコースから脂肪酸の合成する経路及びトリグリセリド合成の初期反応を指す。すなわち、本発明に係る脂肪酸合成系酵素とは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）である。
【００１５】
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡからＮＡＤＰＨを補酵素として脂肪酸を合成する酵素である。
【００１６】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）は、ペント−スリン酸回路の酵素であり、グルコース−６−リン酸とＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨと６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。この反応で生成したＮＡＤＰＨは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）の補酵素として供給される。
【００１７】
ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）は、クエン酸をＡＴＰとＣｏＡにより開裂して、アセチルＣｏＡ、オキサロ酢酸、ＡＤＰと正リン酸を生成する反応を触媒する酵素である。この反応により得られたアセチルＣｏＡは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に係る反応に供給される。
【００１８】
リンゴ酸酵素（ＭＥ）は、L-リンゴ酸をＮＡＤまたはＮＡＤＰ存在下で脱炭酸し、ピルビン酸を生成する反応を触媒する。この反応は、トリカルボン酸輸送系に係る酵素である。脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）で触媒される反応は、サイトソルで行われる。トリカルボン酸輸送系は、ミトコンドリアからサイトソルへアセチルＣｏＡを輸送し、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に係る反応にアセチルＣｏＡを供給する。
【００１９】
ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）は、ＡＤＰとホスホエノールピルビン酸から、ＡＴＰとピルビン酸を生成する反応を触媒する酵素で、グルコースの解糖系に関する酵素である。この反応から得られたピルビン酸は、トリカルボン酸輸送系に取り込まれる。
【００２０】
グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）は、グリセロール３リン酸とアシルＣｏＡからリゾホスファチジン酸を生成する反応を触媒する酵素である。脂肪酸合成系酵素群により生成された脂肪酸は、アシルＣｏＡシンテターゼによりアシルＣｏＡとなり、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）に触媒される反応に取り込まれる。この反応は、トリグリセロール合成の初期反応であり、脂肪酸量の消費に関する。
【実施例】
【００２１】
以下、比較例、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
（動物実験１）
比較例１
雄の４週齢ＳＤラット（体重１３２〜１５６ｇ）を用いて、１週間の予備飼育後、１群７匹にて下記の試験食を投与し、３週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。
コントロール食群：カゼイン（和光純薬（株）製）２０質量％、パーム油（日本油脂（株）製）１０質量％、コーンスターチ１５質量％、セルロース２質量％、ビタミンミックス（日本農産（株）製「ＡＩＮ−７６ＴＭビタミン混合組成」）１質量％、ミネラルミックス（日本農産（株）製「ＡＩＮ−７６ＴＭミネラル混合組成」）３．５質量％、ＤＬ−メチオニン（和光純薬（株）製）０．３質量％、コリン酒石酸水素塩（和光純薬（株）製）０．２質量％、スクロース（大日本明治製糖（株）製「グラニュー糖」）４８質量％。
【００２３】
実施例１〜３
高級脂肪族アルコール添加食群は、高級脂肪族アルコールの添加量を、コントロール食のスクロース量から差し引き下記の試験食を調整した。
雄の４週齢ＳＤラット（体重１３２〜１５６ｇ）を用いて、１週間の予備飼育後、１群７匹にて下記の試験食を投与し、３週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。
（１）実施例１（０．５％添加食群）：高級脂肪族アルコール（日本油脂（株）製「オクタコサノール１２−Ｏ」）０．５質量％、スクロース（同上）４７．５質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
（２）実施例２（１．０％添加食群）：高級脂肪族アルコール（同上）１．０質量％、スクロース（同上）４７．０質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
（３）実施例３（２．０％添加食群）：高級脂肪族アルコール（同上）２．０質量％、スクロース（同上）４６．０質量％、その他の成分はコントロール食群に同じとした。
【００２４】
なお、添加した高級脂肪族アルコールの組成は、テトラコサノール（Ｃ２４）７．４質量％、ヘキサコサノール（Ｃ２６）８．４質量％、オクタコサノール（Ｃ２８）１４．８質量％、ミリシルアルコール（Ｃ３０）２３．５質量％、ラクセリルアルコール（Ｃ３２）１４．９質量％、テトラトリアコンタノール（Ｃ３４）８．６質量％、ヘプタトリアコンタノール（Ｃ３５）２．４質量％、残りはその他の高級脂肪族アルコール類である。高級脂肪族アルコール組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて測定した。前処理として、トリメチルシリル化し、ガスクロマトグラフィー条件は下記の通り行った。
「ガスクロマトグラフィー条件」
カラム：ＤＢ−１（Ｌｅｎｇｔｈ：３０ｍ、ＩＤ：０．３２ｍｍ、Ｆｉｌｍ：０．２５μｍ、Ｊ＆Ｗサイエンティフィック社製）
昇温条件：１５０℃→（１０℃／分）→３２０℃→（２０分）→３２０℃
カラム流量：２．７ｍＬ／分
検出器：ＦＩＤ、検出器温度：３２０℃、注入口温度：３２０℃
キャリアーガス：ヘリウム
【００２５】
高級脂肪族アルコールの形状は微粉末であり、１００メッシュの篩を通過させ、平均粒径は７１．３μｍ（（株）島津製作所製、レーザー回折式粒度分布分析装置：ＳＡＬＡ−２１００）のものを使用した。
【００２６】
表２に、実施例、比較例における、飼育の結果を示す。
【００２７】
【表２】
【００２８】
実験食投与時の摂食量は、比較例１（コントロール食群）；４５７±１８（ｇ／３週間、±標準誤差）、実施例１（０．５％添加食群）；４３０±９、実施例２（１．０％添加食群）；４４１±９、実施例３（２．０％添加食群）；４４１±２０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。飼育開始時と終了時の体重増加量は、比較例１（コントロール食群）；１９０±７（ｇ増加／３週間、±標準誤差）、実施例１（０．５％添加食群）；１７９±５、実施例２（１．０％添加食群）；１８３±８、実施例３（２．０％添加食群）；１７９±９であり、各群間で有意な差異は認められなかった。
表１から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤を長期にわたり投与しても、体重、摂食量、肝臓重量等に特に異常は見られず、本発明の脂質代謝調整剤は安全性が高いことが確認された。
【００２９】
次に、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤の脂肪酸合成系酵素の発現、活性について検討した。
（ｍＲＮＡの発現量）
肝臓の約１．５ｇをＧＴＣ溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート，２５ｍＭクエン酸ナトリウム，０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム，０．１Ｍメルカプトエタノール）１５ｍＬに入れ、ポリトロン式ホモジナイザーにより組織を破砕し、ＡＧＰＣ法により、ＲＮＡを抽出した。各ＲＮＡサンプルの精製度はＯＤ比（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ）１．６〜１．８であった。抽出は、実施例２（１．０％投与群）および比較例１（コントロール食群）について行った。各群において、ラット個体のＲＮＡ濃度が等量となるように混合し、ＤＮＡチップ（アジレント社製「ラット用２０，５００遺伝子」）による発現量の解析を行った。結果を表３にまとめた。
【００３０】
（脂肪酸合成系酵素の活性）
肝臓の約１．３ｇを切り取り、約１０ｍＬの０．２５Ｍスクロース，３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）緩衝液に入れ、速やかにホモジナイズした。ホモジナイズした抽出液を８，０００×ｇで遠心し、更に上清を２００，０００×ｇで超遠心した。超遠心の上清を用いて、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）、リンゴ酸酵素（ＭＥ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の活性を測定した。超遠心の沈殿物を用いて、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）の活性を測定した。ローリー法により、上清及び沈殿物の総蛋白質重量をそれぞれ測定し、酵素活性値を総蛋白質重量当りで表した。
【００３１】
（１）脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）測定法；アッセイは、恒温セル室付きの分光光度計を用いて行った。アッセイ溶液は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０），０．２ｍＭＥＤＴＡ，０．３ｍＭＮＡＤＰＨ，０．０５ｍＭアセチルＣｏＡ，０．２ｍＭマロニルＣｏＡ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った（総容量１ｍＬ、反応温度３０℃）。測定波長は３４０ｎｍで行い、ＮＡＤＰＨの酸化反応を測定した（測定時間１５０秒間）。具体的な測定操作は、マロニルＣｏＡ以外のアッセイ溶液を調製し、ブランクを測定後、反応開始剤としてマロニルＣｏＡを投入し、素早く撹拌して、測定を開始した。ブランクを差し引いた反応曲線から、活性を算出した。
【００３２】
（２）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．１６ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），３０ｍＭＭｇＣｌ２，３．３ｍＭグルコース６―リン酸，１．２ｍＭＮＡＤＰ，０．５ｕｎｉｔホスホグルコン酸デヒドラターゼ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＰの還元反応を測定した（反応時間１８０秒間）。反応開始剤は、グルコース６−リン酸溶液とした。
【００３３】
（３）ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ（ＡＣＬ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），１０ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭ２−メルカプトエタノール，２０ｍＭクエン酸カリウム，０．２ｍＭＣｏＡ，１０ｍＭＡＴＰ，０．２ｍＭＮＡＤＨ，０．２ｕｎｉｔリンゴ酸デヒドロゲナーゼ，２．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化反応を測定した（反応時間１５０秒間）。反応開始剤は、ＣｏＡ溶液とした。
【００３４】
（４）リンゴ酸酵素（ＭＥ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、６４ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．４），４ｍＭＭｇＣｌ２，１．２ｍＭＮＡＤＰ，１．２ｍＭリンゴ酸，１．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＰの還元反応を測定した（反応時間１８０秒間）。反応開始剤は、リンゴ酸溶液とした。
【００３５】
（５）ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）測定法；ＦＡＳ活性測定と同様の操作を行った。アッセイ溶液は、０．２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０），２０ｍＭＭｇＣｌ２，０．２Ｍ塩化カリウム，０．２ｍＭＮＡＤＨ，０．８ｍＭＡＤＰ，３ｍＭホスホエノイルピルビン酸，６ｕｎｉｔ乳酸デヒドロゲナーゼ，１．０質量％酵素測定サンプルで行った。測定波長は３４０ｎｍで、ＮＡＤＨの酸化反応を測定した（反応時間１２０秒間）。反応開始剤は、ホスホエノイルピルビン酸溶液とした。
【００３６】
（６）グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（Ｇ３ＰＡＴ）測定法；超遠心で得られた沈殿物を２ｍＬの０．２５Ｍスクロース，３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）緩衝液に分散し、酵素液として測定に用いた。測定は、放射性試薬[Ｕ−１４Ｃ]グリセロール３リン酸を基質として添加し、反応生成物をカウントした。アッセイ溶液は、７５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬアルブミン、７５μＭパルミトイルＣｏＡ、３００μＭ[Ｕ−１４Ｃ]グリセロール３リン酸（５０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ）、８ｍＭフッ化カリウム、酵素液（総蛋白量約１００μｇ）で行った。反応条件は、３７℃、３０分間とした。反応終了後、クロロホルム：メタノール（１：２）で反応生成物を抽出した。
【００３７】
これらの酵素活性の結果を表４にまとめた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
表３の結果から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、脂肪酸合成系酵素の発現が抑制されることがわかる。
表４の結果から、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、脂肪酸合成系酵素群の活性が低下することがわかる。
【００４１】
次に、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤による、肝臓中のトリアシルグリセロール量、コレステロール量における効果を検討した。本発明に係る酵素群の活性が低下すると、肝臓中のトリアシルグリセロールの蓄積が抑制される。これに従い、末梢組織へのトリアシルグリセロールの輸送を低下し、脂肪蓄積予防となる。
【００４２】
また、本発明に係る酵素群のＡＴＰ−クエン酸リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼは、脂肪酸合成の中間生成物であるアセチルＣｏＡの合成に関する酵素である。アセチルＣｏＡは脂肪酸合成経路やコレステロール合成経路など種々の脂質代謝経路へと派生している。本発明の酵素群の活性低下により、肝臓中のコレステロール量の蓄積も抑制される。
【００４３】
ホルチ法により肝臓脂質を抽出し、トリアシルグリセロール、コレステロールを測定した。脂質抽出（ホルチ法）、トリアシルグリセロール測定、コレステロール測定は下記の通り行った。
【００４４】
（１）ホルチ法；冷凍した肝臓０．５ｇを８ｍＬのメタノールに入れ、ポリトロン型ホモジナイザーですりつぶし、５０ｍＬ容メスフラスコに移した。７ｍＬのメタノールと３０ｍＬのクロロホルムを数回に分けてホモジナイザー、容器を洗浄し、全て抽出液と混合した。抽出液を４０℃で３０分間加温した。室温へ戻した後、クロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ（体積／体積比）。以降、同様に表示する。）溶液で５０ｍＬに定容した。抽出液を濾過（アドバンテック社製「濾紙Ｎｏ．２」）し、ろ液を定量した。ろ液の約２０％（Ｖ／Ｖ）の精製水を加え、静かに撹拌後、一晩静置して、２層に分離した。上層の水層部を捨て、下層のクロロホルム層にメタノールを加えて４０ｍＬとした。これを抽出液として、トリアシルグリセロール測定、コレステロール測定に用いた。
【００４５】
（２）トリアシルグリセロール測定法；２ｍＬの抽出液を１０ｍＬ容スピンチューブに入れ、窒素下で乾燥した。５ｍＬのクロロホルム、０．４ｇのＳｉｌｉｃ Ａｃｉｄ １００Ｍｅｓｈ（和光純薬（株）製）を加え、強く撹拌した。３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上層１ｍＬを別の試験管に移した。ここで、トリアシルグリセロールの標準液として、トリオレイン（和光純薬（株）製）１２５μｇ／ｍＬ・クロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ）溶液を用意し、以下、同様の操作を行い、検量線を作成した。抽出液、標準液それぞれを窒素下で乾燥した。２ｍＬのイソプロパーノール／精製水（９：１、Ｖ／Ｖ）、０．６ｍＬの水酸化カリウム（５ｇ／１００ｍＬイソプロパーノール／精製水（４０：６０））溶液を加え、６５℃で２０分間加温後、室温に戻した。１ｍＬの３ｍＭＮａＩＯ４溶液（溶媒；イソプロパノール／１Ｎ酢酸（２０：８０、Ｖ／Ｖ））を加え、強く撹拌した。０．５ｍＬのアセチルアセトン溶液（０．７５ｍＬのアセチルアセトン、２．５ｍＬのイソプロパノール、１００ｍＬの２Ｍ酢酸アンモニウムの混合溶液）を加え、強く撹拌し、５０℃で３０分間加温した。室温に戻して、４０５ｎｍの吸光度を測定し、検量線よりトリアシルグリセロール含量を算出した。結果を表５に示した。
【００４６】
（３）コレステロール測定法；１．２ｍＬの抽出液を試験管にとり、窒素下で乾燥した。１ｍＬのエタノール、０．２ｍＬの４Ｎ水酸化カリウムを加え、強く撹拌後、６５℃で２０分間加温した。１ｍＬの精製水を添加後、約３ｍＬのヘキサンで３回抽出した。ヘキサン層を別のチューブに移し、３回分を混合した。ここで、サンプルとは別にコレステロール標準液（和光純薬（株）製、５０μｇ／２ｍＬクロロホルム／メタノール（２：１、Ｖ／Ｖ））を用意し、以下、同様の操作を行い、検量線を作成した。サンプル溶液、標準液をそれぞれ窒素下で乾燥し、０．１２５ｍＬのブタノールを加えて強く撹拌した。２４０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ１）。再度、試験管へ戻し、２５μＬのコレステロール酸化酵素溶液（東洋紡（株）製、０．５ｕｎｉｔ／２５μＬ；０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．７），０．５ｍＬ／ＬＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加え撹拌し、３７℃で１時間インキュベートした。室温に戻した後、２４０ｎｍの吸光度を測定した（ＯＤ２）。ΔＯＤ（ＯＤ２−ＯＤ１）の値を用いて、検量線を作成し、抽出液中のコレステロール含量を算出した。結果は、表５に示した。
【００４７】
【表５】
【００４８】
表５より、本発明の高級脂肪族アルコールを主成分とする脂質代謝調整剤により、肝臓中のトリアシルグリセロール量およびコレステロール量が減少することがわかる。これらの結果から、本発明の脂質代謝調整剤により脂質代謝の調整が可能であることがわかった。
【００４９】
（動物実験２）
比較例２
肥満モデルラットである「Ｚｕｃｋｅｒラット（雄性、７週齢）」（「Ｃｒｊ：（ＺＵＣ）−ｆａ／ｆａ」、日本チャールスリバー（株））を用いて、１群７頭とし（平均体重２９７．６ｇ）、１週間の予備飼育後、ＡＩＮ−７６標準飼料（日本農産工業（株）製）を投与して８週間飼育した。飼育中、試験食、水は自由摂食とした。飼育環境は、温度２５℃、湿度５５％、１２時間の明暗サイクルで飼育した。
【００５０】
ＡＩＮ−７６標準飼料の組成は、カゼイン：２０％、ＤＬ−メチオニン：０．３％、コーンスターチ：１５％、コーン油：５％、スクロース：５０％、セルロース：５％、ＡＩＮ−７６ミネラルミックス（日本農産工業（株）製）：３．５％、ＡＩＮ−７６ビタミンミックス（日本農産工業（株）製）：１％、重酒石酸コリン：０．２％である。
【００５１】
実施例４〜６
高級脂肪族アルコール添加食群については、試験食をＡＩＮ−７６：９９質量％、高級脂肪族アルコール混合物１％とし、それ以外の条件は比較例２と同条件とした。
（１）実施例４
米糠由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「ニッサンオクタコサノール１２−Ｏ（日本油脂（株）製）」を使用した。平均粒径を動物実験１と同様に求めた結果、７１μｍであった。
（２）実施例５
サトウキビ由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「サトウキビ由来ポリコサノール（フィトファーマ（株）製）」を使用した。平均粒径は８３μｍであった。
（３）実施例６
蜜蝋由来の高級脂肪族アルコール混合物は、「脱臭精製蜜蝋高酸（（株）セラリカ野田製）」をケン化分解し、ＭＣＴ油により抽出後、晶析、エタノール洗浄により精製したものを使用した。平均粒径は７６μｍであった。
【００５２】
実施例４〜６に用いた高級脂肪族アルコールの脂肪鎖組成は、動物実験１と同様にガスクロマトグラフィーにより求めた。これらの結果は、表６にまとめた。
【００５３】
【表６】
【００５４】
実験食投与時の摂食量は、比較例２；１７２２±５５（ｇ／８週間、±標準誤差）、実施例４；１７１４±３９、実施例５；１７３５±３７、実施例６；１７３４±３０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。
飼育開始時と終了時の体重増加量は、比較例２；２７７±１５（ｇ増加／８週間、±標準誤差）、実施例４；２７４±１３、実施例５；２８６±１４、実施例６；２８３±１０であり、各群間で有意な差異は認められなかった。ＩＩ型糖尿病モデルラットの特徴とする肥満は認められるが、高級脂肪族アルコールの摂取による変化はなく、副作用はない。
【００５５】
次に、動物実験１と同様にして、肝臓中の脂肪酸合成系酵素群の活性測定を行った。結果を表７にまとめた。
【００５６】
【表７】
【００５７】
次に、動物実験１と同様にして、肝臓中のトリアシルグリセロール含量及びコレステロール含量を測定した。結果を表８にまとめた。
【００５８】
【表８】
【００５９】
表６、表７、表８より、肥満モデルラットにおいても肝臓中の脂肪酸合成系酵素群の活性が抑制され、トリアシルグリセロール含量及びコレステロール含量が低下することが確認された。また、脂肪組成の異なるサトウキビ由来、米糠由来、蜜蝋由来の高級脂肪族アルコール組成の異なる素材を用いても、同様の効果を得られることから、特定の高級脂肪族アルコール組成によらないことがわかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤。
【請求項２】
脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである請求項１に記載の脂質代謝調整剤。
【請求項３】
高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である請求項１または２に記載の脂質代謝調整剤。
【請求項１】
炭素数２０〜３６の高級脂肪族アルコールを有効成分として含有し、脂肪酸合成系酵素の発現を低下させることを特徴とする脂質代謝調整剤。
【請求項２】
脂肪酸合成系酵素が、脂肪酸シンターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−クエン酸−リアーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸キナーゼ、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼである請求項１に記載の脂質代謝調整剤。
【請求項３】
高級脂肪族アルコールの平均粒径が１〜１５０μｍであり、粉末状である請求項１または２に記載の脂質代謝調整剤。
【公開番号】特開２００６−２８２６５５（Ｐ２００６−２８２６５５Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４５１６（Ｐ２００６−２４５１６）
【出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【出願人】（０００００４３４１）日本油脂株式会社 (896)
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１日（２００６．２．１）
【出願人】（０００００４３４１）日本油脂株式会社 (896)
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【Ｆターム（参考）】
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