自己免疫障害を治療するためのＴｒｋＢアゴニスト
多発性硬化症等の自己免疫疾患における白血球の中枢神経系への侵入を低下させるためのチロシン受容体キナーゼ（ＴｒｋＢ）アゴニストを提供する。ＴｒｋＢアゴニストは、ＮＴ４およびＢＤＮＦ等の天然に存在するアゴニスト、ならびにアゴニスト抗体等のアゴニストを包含する。
【図１】
【図１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１２月２０日に出願した米国仮特許出願第６０／８７０９１８号の優先権を主張するものであり、その全体は参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、多発性硬化症を含めた、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患の治療に関する。本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるためのチロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）のアゴニストを提供する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症、脱髄および軸索損傷によって特徴付けられる中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性自己免疫疾患である。この疾患は、全世界で１００万人以上の人々を襲い、女性の有病率は、男性の有病率の２倍である。ＭＳの症状は通常、２０歳から４０歳の間に出現する。
【０００４】
ＭＳの特色が研究されているが、この疾患の病因は不明である。そのような特色には、ＣＮＳ組織の損傷、ミクログリアの活性化、炎症促進性サイトカインの産生、Ｔ細胞の遊走およびクローン型増殖の停止、マクロファージのエフェクター機能、産生の変化、ＭＨＣの上方制御、ならびに浸潤性Ｔ細胞によるＣＮＳの直接的な攻撃を包含する。
【０００５】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が、ＭＳの標準的なモデルであるとみなされている。マウス疾患モデルが、ＭＳの病因を研究し、その治療用の薬物を評価するのに使用されている（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。ＥＡＥの臨床的な特色には、非常に多数の浸潤性リンパ球およびマクロファージによるＣＮＳの炎症および脱髄がある。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含めた、ミエリンのいくつかの異なるタンパク質構成成分を用いたマウスの能動免疫は、自己免疫抗体の産生および上行性麻痺の臨床症状を誘発する。この疾患は、マウスの系統、および免疫感作に使用したミエリンタンパク質に依存して、急性または慢性となる場合がある。ＥＡＥは、ＭＳの病因を研究し、その治療用の薬物を評価するのに使用されている（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。
【０００６】
ＭＳは、多くの場合、神経細胞組織中に豊富に存在するポリペプチドであるミエリンに対するＴ細胞の応答によって生じる。脱髄および臨床上の麻痺は、ミエリン抗原に対する特異性を有するＴｈ１表現型のＴ細胞の、ＣＮＳ組織への侵入によって生じる。Ｔｈ１細胞は、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを含めた、炎症性サイトカインを産生する。また、ＣＮＳに対する損傷は、自己免疫抗体の産生および補体の活性化を含めた、その他の免疫学的応答によっても引き起こされる可能性がある。Ｂ細胞が、ＭＳおよびＥＡＥの早期および後期の段階の間に関与し、種々のアイソタイプのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的抗体が疾患の経過全体を通して認められる。脳および脊髄の組織から調製した切片が、白血球の侵入（特に、リンパ球およびマクロファージ）ならびに神経系の下層組織の破壊を示す。
【０００７】
酢酸グラチラマー（ＧＡ、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）は、ＭＳおよびその他の疾患の治療について承認された免疫抑制薬である（Ａｒｎｏｎ，Ｒ．ら、２００３）。また、この薬物は、ＥＡＥモデルにおいても有効である。ＧＡは、Ｔｈ２／３細胞の誘発物質であり、この細胞は、抗炎症性サイトカインを産生し、これらのサイトカインは、血液脳関門を横断して、ＣＮＳ中に蓄積する。これらのサイトカインは、ＣＮＳ組織において種々の効果をもたらし、その他の増殖因子、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＢＤＮＦの局所的な産生に至る（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００３）。長期的なＧＡの投与は、ＮＴ３、ＮＴ４およびＢＤＮＦのより高いレベルの発現を伴った（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ｂ）。
【０００８】
ＮＴ３、ＮＴ４およびＢＤＮＦは、神経細胞の発達、成長過程、シナプス可塑性、保護および生存に関して重要な小型のホモ二量体タンパク質のニューロトロフィン（ＮＴ）ファミリーのメンバーである。ＮＴは、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ３、ＮＴ４（また、ＮＴ４／５とも呼ばれる）、ＮＴ６およびＮＴ７を包含する。ＮＴは、受容体チロシンキナーゼ（また、チロシン受容体キナーゼとも呼ばれる）として知られる受容体ファミリーとの相互作用を通して、標的細胞に影響を及ぼす。これらの受容体は、いくつかの高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）で、高親和性（約１０−１１Ｍ）のチロシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）である受容体および低分子量（６５〜８０ｋＤａ）で、低親和性（約１０−９Ｍ）の受容体（ＬＮＧＦＲ、ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５）として知られる受容体を包含する。特異的な受容体チロシンキナーゼへのＮＴの結合が、受容体の二量体化および内在性チロシンキナーゼドメインの活性化を引き起こす。ＮＧＦは、チロシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）に、ＢＤＮＦおよびＮＴ４は、チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に、ならびにＮＴ３は、チロシン受容体キナーゼＣ（ＴｒｋＣ）に優先的に結合する。全てのＮＴは、ｐ７５に弱く結合する。
【０００９】
ＥＡＥマウスのＣＮＳ組織中のＢＤＮＦおよびＮＴ４の報告（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００３、２００５ｂ）は、多発性硬化症および関連する疾患におけるＮＴおよび／またはそれらの受容体の役割を示唆している。
【００１０】
参照文献
Aharoni,R.et
al.(2005a)J.Neurosci.25:8217-28.
Aharoni,R.et
al.(2005b)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 102:19045-50.
Aharoni,R.et al.(2003)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA
100:14157-62.
Aharoni,R.et
al.(1997)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 94:10821-26.
Arnon,R.et
al.(2003)J.Mol.Recognit.16:412-21.
Davies,A.et al.(1993)Neuron 11565-74.
Karnezis,T.et al(2004)Nat.
Neurosci.7:736-44.
Padlan,E.et al.(1995)FASEB J.133-39.
Steinman and
Zamvil(2006)Ann.Neurol.60:12-21.
【００１１】
追加の参照文献、特に、標準的な手順および方法に関連する参照文献を、本文を通して引用する。本出願中、上記および他所で引用する全ての特許、特許出願、Ｇｅｎｂａｎｋへの登録、参照マニュアルおよび刊行物は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるための方法を提供し、この方法は、ＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物対象に、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量で投与するステップを含み、それによって、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させる。本発明は、哺乳動物において白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用もさらに提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は、自己免疫障害を有する。一実施形態では、自己免疫障害は実験的自己免疫性脳脊髄炎である。別の実施形態では、自己免疫障害は多発性硬化症である。その他の実施形態では、自己免疫疾患は、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患またはパーキンソン病に関係する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである。一実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＮＴ４である。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＮＴ４の天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴ４の断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。別の実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＢＤＮＦである。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＢＤＮＦの天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦの断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。
【００１６】
別の実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗体３８Ｂ８である。別の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生される。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト抗体である。関連する実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１７】
好ましい実施形態では、侵入する白血球は、Ｔ細胞およびマクロファージを含む。特定の実施形態では、侵入する白血球は、ＣＤ３を発現する白血球およびＣＤ６８を発現する白血球を含む。好ましい実施形態では、中枢神経系組織は、脳組織または脊髄組織である。
【００１８】
関連する態様では、本発明は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するための方法を提供し、この方法は、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに十分な量のＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物対象に投与するステップを含み、それによって、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させる。本発明は、哺乳動物において中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用もさらに提供する。
【００１９】
一実施形態では、自己免疫障害は実験的自己免疫性脳脊髄炎である。別の実施形態では、自己免疫障害は多発性硬化症である。その他の実施形態では、自己免疫疾患は、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患またはパーキンソン病に関係する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである。一実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＮＴ４である。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＮＴ４の天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴ４の断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。別の実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＢＤＮＦである。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＢＤＮＦの天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦの断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。
【００２１】
別の実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗体３８Ｂ８である。別の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生される。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト抗体である。関連する実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２２】
好ましい実施形態では、侵入する白血球は、Ｔ細胞およびマクロファージを含む。特定の実施形態では、侵入する白血球は、ＣＤ３を発現する白血球およびＣＤ６８を発現する白血球を含む。好ましい実施形態では、中枢神経系組織は、脳組織または脊髄組織である。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるためのキットオブパーツを提供し、このキットオブパーツは、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量のＴｒｋＢアゴニストおよび使用のための指示を含む。関連する態様では、本発明は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するためのキットオブパーツを提供し、このキットオブパーツは、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量のＴｒｋＢアゴニストおよび使用のための指示を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８、例えば、単離モノクローナル３８Ｂ８抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された単離ＴｒｋＢアゴニスト抗体に関する。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、３８Ｂ８の抗体断片または誘導体である。さらなる実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、３８Ｂ８に由来するＦａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。特定の実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体に由来するＦａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されたアゴニスト抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるアゴニスト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらなる実施形態は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８を産生する細胞または３８Ｂ８に由来する断片を産生する細胞である。さらなる実施形態は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株である。
【００２５】
また、本発明は、本明細書に記載する自己免疫障害のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載する任意のＴｒｋＢアゴニストにも関する。また、本発明は、本明細書に記載するＴｒｋＢアゴニストのいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載するＴｒｋＢアゴニストのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関する。特定の一実施形態は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるアゴニスト抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子である。本発明は、本明細書に記載する核酸分子のいずれかを含むベクターにもさらに関し、ベクターは、核酸分子に動作可能に連結している発現制御配列を場合により含む。
【００２７】
別の実施形態は、本明細書に記載するベクターのいずれかを含むか、本明細書に記載する核酸分子のいずれかを含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、本明細書に記載する抗体または抗原に結合する部分のいずれかを産生するか、前記抗体または前記抗原に結合する部分のいずれかの重鎖または軽鎖を産生する、単離細胞系統も提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原に結合する部分を産生するための方法に関し、この方法は、本明細書に記載する宿主細胞または細胞系統のいずれかを適切な条件下で培養するステップと、前記の抗体または抗原に結合する部分を回収するステップとを含む。
【００２９】
また、本発明は、本明細書に記載する核酸のいずれかを含む、非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物にも関し、非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物は、前記核酸を発現する。
【００３０】
本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原に結合する部分を単離するための方法もさらに提供し、この方法は、抗体を本明細書に記載する非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物から単離するステップを含む。
【００３１】
本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の本発明の説明および実施例から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ＭＯＧによる誘発後の数週間のＥＡＥ動物における相対的な病的状態を示すグラフである。ＭＯＧを、第０日に投与した。（Ａ）動物に、第１０日から、ＮＴ４（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのビヒクル単独のいずれかを毎日投与した。（Ｂ）動物を、対照であるＩｇＧを用いて（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）のいずれかで治療した。
【図１Ｂ】ＭＯＧによる誘発後の数週間のＥＡＥ動物における相対的な病的状態を示すグラフである。ＭＯＧを、第０日に投与した。（Ａ）動物に、第１０日から、ＮＴ４（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのビヒクル単独のいずれかを毎日投与した。（Ｂ）動物を、対照であるＩｇＧを用いて（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）のいずれかで治療した。
【図２】４つの受容体チロシンキナーゼアゴニスト（すなわち、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４および３８Ｂ８）の、４つの受容体チロシンキナーゼ（すなわち、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびｐ７５）に対する相対的な親和性を示す一連のグラフである。ｘ軸は、時間（全て、３００〜４５０秒の範囲）を示す。ｙ軸は、相対的な親和性を示す。最大目盛、上の行（左から右へ）：９０、２０、５０および６０単位；２番目の行：３２、６０、６０、１４０単位；３番目の行：３５、３５、１６および２０単位；下の行：９０、８０、１００および９０単位。これらのデータは、本文および（表２を含めた）実施例４においてさらに説明する。
【図３】ＭＯＧによる誘発９日後にＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物における病的状態を示すグラフである。動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。マウスを、ＥＡＥの臨床徴候について、以下のスコア化システムに従って毎日査定した：０＝正常；１＝尾を引きずる；２＝中等度の後肢の衰弱；３＝中等度に重度の後肢の衰弱（動物は依然として歩行することができるが、困難が伴う）；４＝重度の後肢の衰弱（動物は後肢を動かすことができるが、歩行することはできない）；５＝完全な後肢の麻痺；および６＝死亡。
【図４】ＭＯＧによる誘発１６日後にＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物における病的状態を示すグラフである。動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８またはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを、第１６日および第２３日に投与した。
【図５Ａ】疾患の進行のより遅い時期に治療した動物における病的状態を示すグラフである。（Ａ）動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧのいずれかを、第１８日および第２３日に投与した。（Ｂ）動物に、ＧＡ（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）またはビヒクル単独（対照）のいずれかを、第２２日から毎日投与した。
【図５Ｂ】疾患の進行のより遅い時期に治療した動物における病的状態を示すグラフである。（Ａ）動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧのいずれかを、第１８日および第２３日に投与した。（Ｂ）動物に、ＧＡ（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）またはビヒクル単独（対照）のいずれかを、第２２日から毎日投与した。
【図６Ａ】ＴｒｋＢアゴニストまたはデキサメタゾンのいずれかの投与後の動物における病的状態および体重を示すグラフである。動物に、３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）を投与するか、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）を第３日から第１２日まで毎日投与した。（Ａ）上記に従って、病的状態を測定した。（Ｂ）動物の体重を疾患の進行の経過にわたって測定した。
【図６Ｂ】ＴｒｋＢアゴニストまたはデキサメタゾンのいずれかの投与後の動物における病的状態および体重を示すグラフである。動物に、３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）を投与するか、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）を第３日から第１２日まで毎日投与した。（Ａ）上記に従って、病的状態を測定した。（Ｂ）動物の体重を疾患の進行の経過にわたって測定した。
【図７Ａ】ＴｒｋＢアゴニストの、疾患の病的状態の低下における有効性は、用量依存性であることを示すグラフである。（Ａ）動物に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト３８Ｂ８のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。（Ｂ）動物に、５ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８もしくは１０ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８、またはＰＢＳ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。
【図７Ｂ】ＴｒｋＢアゴニストの、疾患の病的状態の低下における有効性は、用量依存性であることを示すグラフである。（Ａ）動物に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト３８Ｂ８のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。（Ｂ）動物に、５ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８もしくは１０ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８、またはＰＢＳ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。
【図８】ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを使用して、いくつかのＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１、３７Ｄ１２および１９Ｈ８）の増加する量の存在下で生存する神経細胞の相対的な量を示すグラフである。実験の手順および結果を、本文および実施例１（例えば、表１）に記載する。神経細胞生存アッセイにおける各抗体のＥＣ５０値を、表１の第３列に示す。
【図９】未治療（対照）動物およびＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８を用いて治療した動物における、ＭＯＧに特異的な抗体の表示したアイソタイプの相対的なレベルを示す一連のグラフである。各グラフは、ＴｒｋＢアゴニスト（３８Ｂ８）治療動物または未治療（対照）動物における、（４５０μｍにおける吸収を測定することによって決定した）表示した抗体のアイソタイプの量を示す。
【図１０】脾細胞刺激アッセイの結果を示すグラフである。ＭＯＧで誘発した未治療（対照）動物由来の脾臓細胞またはＭＯＧで誘発したＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物由来の脾臓細胞を、ＭＯＧ単独、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８；５０μｌ／ｍｇ）もしくは２つの異なる濃度（１０−８Ｍおよび１０−５Ｍ）のうちの１つにおけるデキサメタゾンと組み合わせたＭＯＧの存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した。
【図１１】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ミエリンについてはＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅを用いて、かつ細胞体についてはクレシルバイオレットを用いて染色した。
【図１２】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ＣＤ３に対して特異的な抗体を用いて染色した。
【図１３】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療ＥＡＥ動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ＣＤ６８に対して特異的な抗体を用いて染色した。
【図１４】対照動物から取り出した脊髄の切片およびＴｒｋＢアゴニスト治療ＥＡＥ動物から取り出した脊髄の切片の組織学的染色の結果を示す図である。切片を、ミエリン染色、すなわちＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅを用いて染色した。染色されていない場所は、脱髄の領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本明細書で使用する場合、「チロシン受容体キナーゼ」および「受容体チロシンキナーゼ」用語は、互換的に使用して、ＴｒｋＢがそのメンバーである、分子のクラスを指す。リガンド（アゴニスト）の受容体チロシンキナーゼへの結合が、リガンド誘発性の受容体の二量体化および細胞内キナーゼドメイン中のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。チロシンのリン酸化に、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路、ＭＡＰＫ経路およびＰＬＣ経路等の多様なシグナル伝達カスケードの活性化が続き、これらの経路は、遺伝子発現を、典型的には細胞型に特異的な様式で調節する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「侵入する白血球」は、自己免疫疾患、好ましくは、ＣＮＳに影響を及ぼす自己免疫疾患の結果として、脳および脊髄の組織を含めた、中枢神経系（ＣＮＳ）組織中に侵入、浸潤または遊走する白血球である。侵入する白血球は、主としてＴ細胞および単核球であるが、その他の白血球も存在する場合がある。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「白血球の侵入を低下させる」とは、脳および脊髄の組織を含めた、白血球のＣＮＳ組織中への遊走（すなわち、侵入または浸潤）を減少させることを指す。白血球の侵入を低下させるとはまた、白血球の侵入によって媒介される細胞傷害性の効果を、特に、ＣＮＳ組織の下層の神経細胞および／またはその他の支持細胞に関して低下させることも指す。白血球の侵入は、Ｔ細胞および単核球による侵入を包含する。白血球の侵入の低下は、ＣＮＳ組織の自己免疫性の攻撃からの保護を包含する。白血球の侵入によって破壊されるＣＮＳ細胞は、ミエリン発現細胞および付近の非ミエリン発現細胞を包含する。細胞の破壊は、アポトーシス、壊死またはそれらの組合せであってよい。白血球の侵入の低下は、疾患の進行の緩慢化、病的状態の発症および重症化の遅延、生存の延長、生活の質の改善、認知、運動または行動の症状の減少または安定化等の臨床的な指標によって特徴付けられる。白血球の侵入の低下はまた、白血球の中枢神経系（ＣＮＳ）組織中への遊走の危険の予防または低下も包含する。白血球の侵入の低下は、部分的であっても、または完全であってもよく、例えば、低下は、本明細書に記載するように、相対的なまたは実際の低下として、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはさらに約９５％であってよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ受容体アゴニスト」または「ＴｒｋＢアゴニスト」は、ＴｒｋＢ受容体の活性化の量を増加させる分子であり、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４によってもたらされる効果に類似する効果をもたらす。ＴｒｋＢの活性化は、通例、受容体誘発性の自己リン酸化によって生じ、これは、細胞内シグナル伝達事象の特徴的なカスケードを開始する。ＴｒｋＢ受容体アゴニストは、この活性化を、例えば、受容体の二量体化またはリン酸化を調節することによって、天然に存在するアゴニストの結合を調節することによって、天然に存在するアゴニストの結合を模倣することによって、ＴｒｋＢ受容体を活性化された（例えば、リン酸化された）状態に（無期限を含めた）より長い期間留めさせることによって、またはその他の形でＴｒｋＢの活性化を調節し、もしくはＴｒｋＢ受容体の活性化に特徴的である細胞内事象のカスケードを開始させることによって増加させる。ＴｒｋＢアゴニストは、これらに限定されないが、既知のＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＢＤＮＦを含めた、天然に存在するアゴニストのポリペプチド、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。ＴｒｋＢアゴニストは、アゴニスト抗体、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。ＴｒｋＢアゴニストの好ましい特性を、本明細書に記載する。本発明のＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢの活性化を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、またはそれ以上増加させることができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「断片」ポリペプチドは、より大きなポリペプチドの部分であり、これは、ＴｒｋＢ受容体を活性化する能力等、そのより大きなポリペプチドの生物学的特性のうちの少なくともいくつかを保持する。好ましい断片は、そのより大きなポリペプチドの生物学的特性をもたらす、そのより大きなポリペプチドのアミノ酸残基および／または構造を含む。ポリペプチド断片は、ペプチドと呼ばれる場合があるが、本明細書では、ポリペプチドとペプチドを区別しない。例示的な断片を、本明細書に記載する。断片は、本明細書に記載するように、誘導体化することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「誘導体」ポリペプチドは、官能基または官能性部分の付加または除去等、１つまたは複数の共有結合性または非共有結合性の修飾を有する。誘導体の例を、本明細書に提供する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、特定のポリペプチド配列の「変異体」を、Ｃｌｕｓｔａｌ ＶまたはＢＬＡＳＴ、例えば、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」ツールのＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）等のアルゴリズムを使用した場合、ポリペプチド配列のうちの１つの特定の長さにわたる特定のポリペプチド配列に対して、少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列と定義する。そのような一対のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのうちの１つの特定の定義した長さにわたり、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％以上の配列同一性を示すことができる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、ポリペプチド配列に適用する場合の「配列同一性」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ、ＭＥＧＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ等の標準化されたアルゴリズムを使用して整列させた、少なくとも２つのポリペプチド配列間における残基の一致のパーセントを指す。ポリペプチド配列のアラインメントの方法は、周知である。いくつかのアラインメントの方法は、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる。本明細書に記載する、そのような保存的置換は、一般に、置換部位において電荷および疎水性を保存し、したがって、当該ポリペプチドの構造（したがって、機能）を保存する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量」またはＴｒｋＢアゴニストに関する類似表現は、ＴｒｋＢ受容体アゴニスト投与前の活性化のベースラインレベルと比較して、（本明細書に記載し、当技術分野で既知である）ＴｒｋＢ受容体の活性化を増加させるのに十分な量を指す。活性化の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、またはそれ以上であってよい。この量は、投与経路、ＴｒｋＢアゴニストの体内半減期、ＴｒｋＢアゴニストの溶解性、生物学的利用率、クリアランス速度およびその他の薬物動態学的特徴、動物または患者の体重および代謝等を考慮に入れる。また、ＴｒｋＢアゴニストも参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「治療を必要とする動物」または類似表現は、ＣＮＳが関与する自己免疫疾患を有するまたはそれを発症する危険を有する動物、好ましくは、ヒトを含めた哺乳動物を意味する。ＣＮＳに影響を及ぼす自己免疫性の疾患（または区別なく、障害）の例は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒトにおける多発性硬化症（ＭＳ）、およびその他の哺乳動物において見出される類似の自己免疫疾患である。また、ＣＮＳの自己免疫性の攻撃は、例えば、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患およびパーキンソン病においても観察される。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「天然に存在するＴｒｋＢアゴニスト」は、天然に存在し、ＴｒｋＢ受容体の活性化物質として機能する分子である。ＴｒｋＢ受容体の既知の天然に存在するアゴニストは、ニューロトロフィンであるＮＴ４およびＢＤＮＦである。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、変異型ＴｒｋＢ対立遺伝子を有する動物において発現したニューロトロフィンポリペプチド等、天然に存在する変異体分子を包含する。
【００４４】
「単離抗体」は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＴｒｋＢに特異的に結合する、単離抗体は、ＴｒｋＢ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＴｒｋＢ分子等のその他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００４５】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の分子組成物である抗体分子調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４６】
一般的技術
本発明は、分子生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の分野において使用される従来の技術を利用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）等の参照文献に記載されている。
【００４７】
ＴｒｋＢアゴニスト
本発明は、多発性硬化症および中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼすその他の自己免疫障害の治療のために、ＴｒｋＢアゴニストを使用する方法を提供する。本発明の１つの特色によれば、ＴｒｋＢアゴニストは、白血球のＣＮＳ組織への侵入を低下させる点およびＣＮＳの下層神経細胞組織の破壊を低下させる点において有効であり、したがって、四肢麻痺等、こうした疾患の臨床所見を緩和する。具体的には、ＴｒｋＢアゴニストは、単核球およびＴ細胞の遊走を低下させる。これらの細胞は、ミエリン抗原を提示する点およびミエリン抗原を産生する細胞に対して細胞傷害性の効果を与える点で活性がある。
【００４８】
ＭＳについて一般に認められている動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスを使用して、本発明を導いた観察がなされた。ＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳと多くの臨床的および病理学的な特色を共有する実験的な疾患状態である。多くのＦＤＡが承認したＭＳの療法は、最初に、マウスおよびラットにおけるＥＡＥモデルに基づいて発見および開発された（ＳｔｅｉｎｍａｎおよびＺａｍｖｉｌ、２００６による総説）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のペプチド３５〜５５を用いた免疫感作後に誘発することができる（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。ＭＯＧを用いた免疫感作は、ミエリンに特異的な自己免疫性反応を誘発し、これは、ＭＳのものに類似する脱髄および病的状態を引き起こす。
【００４９】
ＴｒｋＢアゴニストを使用する動物実験
本発明の裏付けとして実施した実験では、ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与が、ＣＮＳに特異的な自己免疫疾患を有する動物において、病的状態およびＣＮＳ組織の損傷を低下させることが示された（図１Ａおよび１Ｂ）。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４の組換えの形態を、ＭＯＧによる誘発後のＥＡＥ動物に投与した（実施例５）。ＮＴ４を用いて治療した動物は、対照動物と比較して、有意に低下した病的状態を示した。この結果から、ＴｒｋＢアゴニストの投与が、慢性ＥＡＥの進行の緩慢化において有効であることが実証された。さらなる実験からは、より早い時期の間に投与した場合、より遅い時期の間に投与した場合と比較して、症状の発症に関して、ＮＴ４によって与えられる保護は、（より良好ではないにしても）少なくとも同等に良好であり、ＴｒｋＢアゴニストを用いた治療を、治療が有効となるように症状の発症時まで継続する必要がないことが示された（図１Ｂ）。ＴｒｋＢの活性化は、ＥＡＥの誘発の比較的上流の段階を標的にしている可能性がある。
【００５０】
実施例１〜４および６は、ＴｒｋＢの生物学的活性を刺激する、すなわち、ＴｒｋＢを活性化する（例えば、実施例６、ならびに表１および２）能力に基づいて、いくつかがＴｒｋＢアゴニストとして機能したＴｒｋＢ抗体について記載する。抗体３８Ｂ８を含めた、いくつかの抗体は、ＴｒｋＢに対して特異的であり、アッセイしたその他の受容体チロシンキナーゼに対しては顕著な結合を示さなかった。抗体３８Ｂ８は、何らかの交差反応性を示した、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４よりも、ＴｒｋＢ受容体に対して、さらにより選択的であった。これらのリガンド−受容体の相互関係の動態解析を、実施例４および表２に提供する。
【００５１】
動物実験からは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、対照の免疫グロブリンと比較して、ＥＡＥの病的状態に対して有意な保護をもたらすことが示された（図３、実施例７）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＭＯＧによる誘発１６日後とまで遅れて投与した場合でも、臨床症状が発症した後で投与した場合でも有効であった（図４）。酢酸グラチラマー（ＧＡ）との比較から、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構が、ＧＡおよびその他の現行のＭＳ薬物の作用機構とは異なることが示唆された（図５）。その他の結果からは、ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの効果に類似することが実証されている（図６Ａおよび６Ｂ）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体の有益な効果は、用量依存性であった（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００５２】
神経細胞生存アッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で神経細胞に影響を及ぼすことが実証された（実施例８）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体の増加する量を添加した結果、神経細胞の生存が増加した（図８）。神経細胞生存アッセイおよびヒトＫＩＲＡアッセイにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体である３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１および３７Ｄ１２のＥＣ５０値を、実施例１に記載し、その概要を表１に示す。
【００５３】
（ＧＡおよびデキサメタゾンを含めた）ＭＳの治療用の現行の薬物は、免疫調節物質である。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、抗ＭＯＧ抗体の産生を抑制することによって機能するようには見えず、したがって、従来の免疫抑制剤としては機能しないと思われる（図９、実施例９）。さらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の存在は、脾細胞の刺激に対して、免疫抑制剤であるデキサメタゾンが示したような明らかな効果は何ら示さなかった（図１０）。ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物は、抗ＭＯＧ性Ｔ細胞および／または抗ＭＯＧ性Ｂ細胞の正常な応答をもたらす能力を保持する。これらの観察から、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの作用機構は、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構とは異なること、およびＴｒｋＢアゴニストの主要な作用機構は、白血球増殖のレベルにおいてではないことが示唆される。
【００５４】
ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から調製した切片において、組織学的解析により、白血球侵入の低下が示された。数匹のＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、白血球のＣＮＳへの侵入の証拠を全く示さなかった（図１１）。侵入する細胞の同定を、ＣＤ３を発現するＴ細胞およびＣＤ６８を発現するマクロファージについて染色することによって実施した。ＴｒｋＢアゴニスト治療動物由来の脊髄組織は、対照動物と比較した場合、Ｔ細胞および単核球の侵入のかなりの低下を示す（図１２および１３）。重度の脱髄の領域が、対照マウスにおいては明らかであったが、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療したマウスにおいてはそうではなかった（図１４）。ＣＮＳ組織切片の組織化学的染色の結果から、ＴｒｋＢアゴニストによる治療によって、リンパ球および単核球のＣＮＳへの侵入が低下することが実証された。
【００５５】
上記に記載した結果から、ＴｒｋＢアゴニストは、白血球のＣＮＳへの侵入を低下させ、ＭＳについて一般的に認められている動物モデルであるＥＡＥの進行を緩慢化させる点において有効であることが実証されている。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＴｒｋＢアゴニスト抗体の両方は、疾患の進行の緩慢化において有効であった。当該アゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対して最も大きな選択性を示し、これを、さらなる研究に使用した。ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、用量依存性であり、ＴｒｋＢアゴニストの用量の増加に伴って病的状態が低下した。現行のＭＳ薬物とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない。組織化学的な実験により、ＴｒｋＢアゴニストは、Ｔ細胞および単核球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることが示された。
【００５６】
ＣＮＳ自己免疫障害のためのＴｒｋＢアゴニスト
何らかの理論に限定されることなく、ＴｒｋＢアゴニストは、主として、白血球の遊走を調節することによって機能すると考えられている。ＭＳにおいては、細胞性免疫が優勢である可能性があり、このことは、ＴｒｋＢアゴニストを、液性免疫に影響を及ぼす現行の免疫抑制剤より有効な型の薬物となす。さらに、本方法は、現行の免疫抑制剤治療と組み合わせて、追加の治療効果をもたらすことができる。
【００５７】
いくつかの自己免疫疾患または関連する疾患において、本発明のＴｒｋＢアゴニストを使用して、白血球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることができる。ＥＡＥマウスは、ＭＳのモデルであることに加えて、また、視神経炎を研究するためにも使用される。ＴｒｋＢアゴニストは、全てのこれらの疾患、およびとりわけ白血球の侵入によって媒介されるその他の自己免疫障害において、免疫のＣＮＳへの侵入を緩和することが予想される。疾患および障害という用語は、区別なく使用されていることに留意されたい。
【００５８】
本発明の特色は、ＴｒｋＢアゴニストの、自己免疫疾患に罹患している動物への直接的な投与である。本発明の好ましい実施形態を、ポリペプチドの観点から記載するが、本発明は、当該ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与を包含し、このポリヌクレオチドは、体内において、コードするＴｒｋＢアゴニストの発現を導く。直接的なＤＮＡ注入および遺伝子療法の送達の方法は、当技術分野で既知である。ＧＡ等の薬物の投与によって誘発させる場合とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを、動物に直接的に投与する。本発明はまた、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよび／またはアゴニスト抗体と一致する様式でＴｒｋＢに結合し、これを活性化するペプチド模倣分子も包含する。
【００５９】
本明細書に記載する方法により使用するための具体的なＴｒｋＢアゴニストを、以下に、さらに詳細に記載する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、追加のＴｒｋＢアゴニストが明らかとなるであろう。
【００６０】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよびそれらの誘導体
ＴｒｋＢアゴニストは、これらに限定されないが、既知のＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＢＤＮＦを含めた、天然に存在するアゴニストのポリペプチドを包含する。ＮＴ４および／またはＢＤＮＦのポリペプチド配列は、得られるポリペプチドがＴｒｋＢに結合し、アゴニストとして機能するという条件で、対応するＴｒｋＢ受容体と同一の種からであっても、または異なる種からであってもよい。
【００６１】
ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＮＴ４および変異体ＮＴ４（すなわち、ＮＴ−４／５および類似名）を包含する。ＮＴ４ポリペプチドは、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号、第２００３／０２０３３８３号および第２００２／００４５５７６号、ならびにＰＣＴ第ＷＯ２００５／０８２４０号に記載されている。ＮＴ４（すなわち、ＮＴ４／５）ポリペプチドは、いくつかの哺乳動物において同定されている。対象とするアミノ酸置換には、Ｇ７７のＫ、Ｈ、ＱまたはＲへの置換；およびＲ８４のＥ、Ｆ、Ｐ、ＹまたはＷへの置換がある。プロテアーゼ切断部位を除去して、ＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドの半減期を延長させてもよく、またはプロテアーゼ切断部位を付加して、それらの活性を制御してもよい。ＴｒｋＢアゴニストを、ＰＥＧ、ＩｇＧのＦｃ領域、アルブミン、またはＭｙｃ、ＨＡ（赤血球凝集素）、Ｈｉｓ−６やＦＬＡＧ等のペプチドもしくはエピトープ等の半減期延長部分にコンジュゲートまたは融合させることができる。
【００６２】
また、ＢＤＮＦポリペプチドも、いくつかの哺乳動物において同定されている（例えば、米国特許第５１８０８２０号および米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号を参照されたい）。
【００６３】
本発明の天然に存在するおよび変異体のＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドは、それらのキメラ、変異体、断片（ペプチドを包含する）および／または誘導体を包含する。好ましい断片は、天然に存在するポリペプチドのＴｒｋＢ結合部分、またはキメラ、コンセンサスもしくは変異型の同等な結合部分を包含する。断片は、合成ペプチドを包含する。変異体は、保存的および非保存的なアミノ酸の置換を有する、天然に存在するアミノ酸配列の変異体を包含する。
【００６４】
保存的置換には、類似の大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸残基が関与する。例えば、Ａｌａは、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅで置換してよい。Ａｒｇは、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換してよい。Ａｓｎは、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇで置換してよい。Ａｓｐは、Ｇｌｕで置換してよい。Ｃｙｓは、Ｓｅｒで置換してよい。Ｇｌｎは、Ａｓｎで置換してよい。Ｇｌｕは、Ａｓｐで置換してよい。Ｇｌｙは、Ｐｒｏで置換してよい。Ｈｉｓは、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇで置換してよい。Ｉｌｅは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅまたはノルロイシンで置換してよい。Ｌｅｕは、ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＡｌａまたはＰｈｅで置換してよい。Ｌｙｓは、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換してよい。Ｍｅｔは、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅで置換してよい。Ｐｈｅは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＡｌａで置換してよい。Ｐｒｏは、Ｇｌｙで置換してよい。Ｓｅｒは、Ｔｈｒで置換してよい。Ｔｈｒは、Ｓｅｒで置換してよい。Ｔｒｐは、Ｔｙｒで置換してよい。Ｔｙｒは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＴｈｒまたはＳｅｒで置換してよい。Ｖａｌは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａまたはノルロイシンで置換してよい。
【００６５】
機能の実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート状もしくはらせん状の高次構造を維持する、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性を維持する、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対する置換の効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成することができる。天然に存在する残基は、側鎖の共通の特性に基づいてグループに分けられる（これらのうちのいくつかは、複数の機能グループに属する場合がある）：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；ならびに
（６）曲がりを誘発する残基：ＧｌｙおよびＰｒｏ。
【００６６】
非保存的置換では、１つのクラスのメンバーが、別のクラスのメンバーと交換されるか、前段落において保存的であると同定されていない置換が関与する。
【００６７】
変異体は、得られるポリペプチドまたは誘導体がＴｒｋＢに結合し、アゴニストとして機能することを条件として、天然に存在するアミノ酸配列の変異体および遺伝子操作した変異体を含む。ＴｒｋＢの活性化を測定するためのアッセイが、本明細書および引用する参照文献に記載されている。
【００６８】
さらなる変異体は、ＮＴ３およびＮＧＦを含めた、チロシン受容体キナーゼのＴｒｋファミリーのその他の関連するリガンド由来の部分的なアミノ酸配列を有する、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドを含む。変異体は、コンセンサスＴｒｋまたはコンセンサス受容体チロシンキナーゼ結合および／もしくは活性化配列を有するポリペプチドもさらに含む。
【００６９】
その他の誘導体は、共有結合性および非共有結合性に修飾されたペプチドおよびポリペプチド（例えば、アセチル化、ペグ化、ファルネシル化、グリコシル化またはリン酸化されたポリペプチド）を含む。ＮＴ４の具体的なペグ化された形態およびその他の修飾された形態が、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号に記載されている。ポリペプチドは、追加の官能基を包含して、結合および／もしくは活性を調節し、体内での画像診断を可能にし、半減期を調節し、血液脳関門を越えての輸送を調節し、またはポリペプチドが特定の細胞型もしくは組織を標的にするのを援助することができる。ポリペプチドは、アミノ酸置換がポリペプチドのＴｒｋＢへの結合にも、アゴニストの活性にも実質的に影響を及ぼさないならば、アミノ酸置換を含んで、修飾（例えば、ペグ化部位、グリコシル化部位またはその他の部位の付加）を促進することができる。
【００７０】
一般的な修飾は、ペグ化であり、生物学的活性の最小限の損失を伴って全身クリアランスを低下させる。ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）は、当技術分野で既知の方法を使用して、ＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチド（ならびにＴｒｋＢアゴニスト抗体）の種々の官能基に連結させることができる（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００２）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９−４７６；Ｓａｋａｎｅら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１０８５−９１を参照されたい）。ＰＥＧは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、修飾したまたは天然のＮ末端、アミン基およびチオール基に連結させることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の表面アミノ酸残基を、ＰＥＧ分子を用いて修飾する。ＰＥＧ分子は、種々の大きさ（例えば、約２から４０ｋＤａの範囲）であってよい。ＮＴ４、ＢＤＮＦまたはその他のポリペプチドに連結させるＰＥＧ分子は、約２０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００Ｄａのいずれかの分子量を有してよい。ＰＥＧ分子は、一本鎖であっても、または分枝鎖であってもよい。ＰＥＧをＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドに連結させるためには、一方または両方の末端に官能基を有する、ＰＥＧの誘導体を使用することができる。官能基は、ポリペプチド上の利用可能な反応性の基の型に基づいて選ばれる。誘導体をポリペプチドに連結させる方法は、当技術分野で既知である。
【００７１】
ペグ化されたＮＴ４が、生成され、動物においてＮＴ４として機能することが示されている（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号の実施例６および７、ならびにＰＣＴ第ＷＯ２００５／０８２４０１号を参照されたい）。成熟したヒトＮＴ４の５０位のセリン残基をシステインに変化させて、ＮＴ４−Ｓ５０Ｃを生成することができ、次いで、これをペグ化し、ＰＥＧを、５０位のシステインに連結させる。ＰＥＧへのＮ末端に特異的な結合の１つの例が、１位の残基をセリンまたはスレオニンに変異させて、ペグ化を促進する場合である。類似の方法が、ＢＤＮＦおよび本発明において使用するためのその他のポリペプチドに適用される。
【００７２】
ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、その他の分子に、直接的にまたは合成リンカーを介して連結させることができる。好ましいＴｒｋＢアゴニストのポリペプチド、それらの断片または誘導体は、それらの値が報告されている天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、類似またはより良好な結合親和性、選択性および活性化を示す。アゴニストのポリペプチドの小さな部分は、「ペプチド」と呼ぶことができるが、この用語法は、限定的であると解釈されてはならない。
【００７３】
好ましいＴｒｋＢアゴニストは、動態アッセイ、ＥＡＥ動物モデル、ＫＩＲＡアッセイおよび神経細胞生存アッセイを含めた、本明細書に記載するおびただしい数の実験およびアッセイにおいて、ＢＤＮＦおよびＮＴ４と比較して、類似の生物学的特性を示す。
【００７４】
ＴｒｋＢ抗体アゴニストおよびそれらの誘導体
ＴｒｋＢアゴニストは、アゴニスト抗体、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。適切なアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対して選択的であり、天然に存在するＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドに類似するまたはそれより大きな親和性で結合する。しかし、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、抗体の循環半減期が長いことから、結合親和性の重大性は低下する。抗体３８Ｂ８の結合親和性は、４６±１０ｎＭであると決定された（上記および実施例４を参照されたい）。好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体は、実施例４に記載する特定のアッセイ条件を使用する場合、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満またはさらに１０ｐＭ未満のＫｄを有する。
【００７５】
好ましいＴｒｋＢアゴニストはまた、結合アッセイ、ＥＡＥ動物モデル、ＫＩＲＡアッセイおよび神経細胞生存アッセイを含めた、本明細書に記載するおびただしい数の実験およびアッセイにおいて、抗体３８Ｂ８（および天然に存在するアゴニスト）と比較して、類似の生物学的特性を示す。例えば、好ましいＴｒｋＢアゴニストは、（表１を含めた）実施例１に記載する神経細胞生存アッセイにおいて、１１ｐＭ未満のＥＣ５０値を示す。好ましいＴｒｋＢアゴニストは、約１ｐＭから約１０ｐＭまで、約０．１ｐＭから約１ｐＭまで、約０．０１ｐＭから約０．１ｐＭまで、またはさらに０．０１ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する。例示的なＥＣ５０値は、３８Ｂ８の場合、０．２ｐＭであり、３６Ｄ１の場合、５ｐＭである。好ましいＴｒｋＢアゴニストはまた、ＫＩＲＡアッセイを使用する場合、抗体３８Ｂ８と比較して、類似の生物学的特性を示す（表１を含めた、実施例１）。好ましいＴｒｋＢアゴニストは、ＫＩＲＡアッセイにおいて、５０ｎＭ未満、好ましくは、約５ｎＭから５０ｎＭ未満まで、約０．５ｎＭから約５ｎＭまで、またはさらに０．５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。例示的なＥＣ５０値は、提供したアッセイ条件下では、約５ｎＭである。
【００７６】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、コンセンサス抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体またはコンジュゲート抗体を包含する。抗体は、該当する場合、いずれかのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）であってよい。抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体および一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体）を包含する。適切なＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその機能性断片もしくは誘導体は、例えば、モノクローナル抗体アゴニスト３８Ｂ８の場合、本明細書に記載する様式で、ＴｒｋＢに結合し、それを活性化する。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、抗体断片を包含し、これは、抗体に由来したアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。特に重要なのは、ＣＤＲ領域中のアミノ酸配列等の抗原認識に関与するアミノ酸配列である。
【００７７】
モノクローナル抗体およびマウスのハイブリドーマの方法は、当技術分野では周知である。ヒトの治療のための非ヒト抗体の使用は、免疫抑制薬の併用により許容され得る。そのような薬物は、日常的に投与されて、ＭＳならびにその他の自己免疫性および炎症性の疾患の症状を治療し、または低下させる。免疫調節薬は、当技術分野では既知であり、それには、糖質コルチコイド、細胞分裂阻害剤（例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、メトトレキセート、アザチオプリンおよびメルカプトプリン）、細胞傷害性抗体（例えば、Ｔ細胞受容体抗体およびＩＬ−２に特異的な抗体）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、ＲＡＰＡＭＵＮＥ、ＰＲＯＧＲＡＦおよびＦＫ５０６）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質（例えば、循環する受容体）、ミコフェノール酸、および外来の抗体または治療用抗原に対する動物の免疫応答を抑制するのに使用されるその他の生物学的薬剤を包含する。
【００７８】
異なる種、例えば、マウスに由来するモノクローナル抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では周知である。ヒトの治療のためには、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、最小限の数の非ヒトのアミノ酸配列を含み、したがって、ヒトにおいては、最低限に免疫原性、または非免疫原性となる。好ましいヒト化抗体は、ヒトの免疫系によって異物として認識されない。そのような抗体は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗原結合のために必要なアミノ酸残基を含む、免疫グロブリン鎖のその他の部分）であってよく、抗原結合部位以外の大部分のアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンに由来する。また、抗原結合が不利な影響を受けない限り、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内部のアミノ酸残基を、ヒトに特異的な残基で置換することもできる。
【００７９】
ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をもっぱらまたは実質的に含む抗体である。ヒト抗体はまた、少なくとも１つのヒトの重鎖のポリペプチドもしくは少なくとも１つのヒトの軽鎖のポリペプチド、またはそれらの相当の断片を含む抗体も包含し、別の動物由来の重鎖または軽鎖と場合により組み合わせる。そのような１つの例が、マウスの軽鎖のポリペプチドおよびヒトの重鎖のポリペプチドを含む抗体である。
【００８０】
適切なＴｒｋＢアゴニスト抗体、それらの断片または誘導体は、遺伝子導入動物、（Ｂ細胞を含めた）哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、酵母または細菌中で発現または分泌させることができる。例えば、適切なヒト抗体を、完全にヒトまたは実質的にヒトの免疫グロブリンを産生することが可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）を免疫感作することによって生成することができる。抗体はまた、遺伝子シャッフリング、ファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、リボゾームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、タンパク質断片コンプリメンテーションまたはＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって産生させてもよい。ヒト化抗体およびヒト抗体ならびにそれらの誘導体を設計および産生するための方法は、例えば、米国特許第７００５５０４号、第６８００７３８号、第６４０７２１３号、第６０５４２９７号、第６３３１４１５号および第５７５０３７３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許第６８３３２６８号、第６２０７４１８号、第６１１４５９８号および第６０７５１８１号（Ａｂｇｅｎｉｘ）；米国特許第６４９８２８５号（Ａｌｅｘｉｏｎ）；米国特許第７０７４５５７号、第５８８５７９３号、第５８３７２４２号、第５７３３７４３号、第５５６５３３２号（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；米国特許第７１１８８７９号、第６９７９５３８号、第６３２６１５５号、第５９９４１２５号、第５８３７５００号（Ｄｙａｘ）；米国特許第６７５３１３６号、第６６６７１５０号、第６３０００６４号、第５５１４５４８号（ＭｏｒｐｈｏＧｅｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）；ならびに６，４６１，８２４、６，２０４，０２３、５，８２１，１２３、５，５９５，８９８、５，５７６，１８４、４，６９８，４２０（Ｘｏｍａ）；米国特許第７０４１８７０号、第６６８０２０９号、第６５００９３１号、第６１１１１６６号、第６０９６３１１号、第６０７１５１７号、第６０６３１１６号（Ｍｅｄａｒｅｘ）；ならびに米国特許第４８１６３９７号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）に記載されている。ヒト抗体またはヒト化抗体を産生するための方法はまた、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−１４；Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６１５７−６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ）ｐ．７７；ならびにＢｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５にも記載されている。
【００８１】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、共有結合または非共有結合によって修飾（例えば、アセチル化、ペグ化（例えば、実施例５を参照されたい）、ファルネシル化、グリコシル化、リン酸化等）することができ、追加の官能基を包含して、結合を調節し、アゴニスト活性を調節し、体内でのポリペプチドの画像診断を可能にし、ポリペプチドの半減期を調節し、または血液脳関門を越えての輸送を調節することができる。ポリペプチドは、アミノ酸置換がポリペプチド（複数のポリペプチド）のＴｒｋＢへの結合にも、アゴニストの活性にも実質的に影響を及ぼさないならば、アミノ酸置換を含んで、修飾（例えば、追加のペグ化部位、グリコシル化部位またはその他の部位の付加）を促進することができる。ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、その他の分子に、直接的にまたは合成リンカーを介して連結させることができる。
【００８２】
適切な抗体断片または誘導体は、本明細書および引用する参照文献に記載されているように、ＴｒｋＢへの結合およびその活性化を媒介するアミノ酸残基を含む。抗体の特異性は、主として、軽鎖および重鎖のＮ−末端の付近に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）または高頻度可変ループとして知られる、６つの小さなループ状領域中の残基によって決定される。軽鎖中のＣＤＲは、一般に、アミノ酸残基の２４と３４との間（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０〜５６（ＣＤＲ２−Ｌ）および８９〜９７（ＣＤＲ３−Ｌ）にある。重鎖中のＣＤＲは、一般に、アミノ酸残基の３１と３５ｂとの間（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０〜６５（ＣＤＲ２−Ｈ）および９５〜１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）にある。いくつかのＣＤＲの長さは、その他のＣＤＲよりも可変である。ＣＤＲ１−Ｌは、長さが約１０〜１７残基相当変動し、一方、ＣＤＲ３−Ｈは、長さが約４〜２６残基相当変動する。その他のＣＤＲは、かなり標準的な長さを有する。Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら（１９９５）ＦＡＳＥＢ．Ｊ．１３３−３９。本発明において使用するための好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体断片は、ＣＤＲからまたはＣＤＲの内部の重鎖および／もしくは軽鎖のドメイン由来のアミノ酸残基を含む。
【００８３】
本発明と共に使用するための抗体は、上記に記載し、当技術分野で既知である保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する、天然に存在するアミノ酸配列の変異体を包含する。
【００８４】
好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体、それらの断片または誘導体は、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、類似またはより良好な結合親和性、選択性および活性化能を示す。アゴニストのポリペプチドの小さな部分は、「ペプチド」と呼ぶことができるが、この用語法は、限定的であると解釈されてはならない。
【００８５】
ＴｒｋＢアゴニストの製剤
ＴｒｋＢアゴニストは、多発性硬化症等の中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患の治療用の医薬品の製造において使用することができる。このようにして、ＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を使用して、本明細書で定義する（ヒト患者を含めた）哺乳動物における疾患を治療することができる。ＴｒｋＢアゴニストの組成物は、適切な薬学的に許容できる賦形剤をさらに含むことができ、これらの賦形剤は、当技術分野では既知である。一般に、ＴｒｋＢアゴニストの組成物を、（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等の）注射による投与のために製剤化するが、その他の投与形態も使用してよい。ＴｒｋＢアゴニストは、水性、または植物油もしくはその他の類似の油、合成の脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルやポリエチレングリコール等の非水性の溶媒中に、それらを、所望により、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤等の従来の添加剤と共に、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に製剤化することができる。
【００８６】
適切な担体、希釈剤および賦形剤は、当技術分野では周知であり、炭水化物、ろう、水に可溶性および／または膨潤性のポリマー、親水性または疎水性の材料、ゼラチン、油、溶媒、水ならびにその他等の材料を包含する。使用する具体的な担体、希釈剤または賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段および目的によって異なる。一般に、安全な溶媒は、水等の無毒性の水性溶媒および水に可溶性または混和性であるその他の無毒性溶媒である。適切な水性溶媒は、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）等、およびそれらの混合物を包含する。製剤はまた、１つまたは複数の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、矯臭剤、矯味剤およびその他の既知の添加剤を含めて、薬物（すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物）を、洗練された形で提供し、または薬学的な製品（すなわち、医薬品）の製造を支援することができる。製剤のうちのいくつかは、リポソーム等の担体を含めることができる。リポソームの調製物には、これらに限定されないが、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多層ベシクルおよび単層ベシクルがある。非経口および経口の薬物送達のための賦形剤および製剤が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）に記載されている。
【００８７】
投与および投与量
本明細書に例示する投与スケジュールおよび治療用量は、動物の体重、ＴｒｋＢアゴニストの血液中の半減期およびＴｒｋＢアゴニストの親和性等の要因に基づいた。好ましい投与スケジュールおよび用量は、投与と投与の間に、体内に治療量のＴｒｋＢアゴニストを維持する。（天然に存在するＴｒｋＢアゴニストを含めた）ＮＴの有効用量の範囲が、本明細書、Ｄａｖｉｅｓら（１９９３）およびその他の参照文献に例示されている。アゴニスト抗体の有効用量の範囲を、本明細書に例示し（例えば、ＥＡＥ動物の場合、１〜１０ｍｇ／ｋｇ）、類似のアゴニスト抗体の最適用量を決定するための開始点を提供する。
【００８８】
本発明の裏付けとして実施した実験によって実証されたように（例えば、図１Ｂ、３および４を参照されたい）、疾患の経過の早期における「パルス治療」が、動物における病的状態を低下させるのに十分であるようである。治療に効力をもたせるために、ＴｒｋＢアゴニストを継続して投与する必要がない場合がある。
【００８９】
具体的な投与計画、すなわち、用量、時期および反復は、治療しようとするヒトまたは動物の年齢、状態および体重によって異なる。最初の投与計画は、動物実験から外挿することができる。ＴｒｋＢアゴニストの投与の時期／頻度は、適用に際して、特定のＴｒｋＢアゴニストの循環半減期（または神経細胞組織中の半減期）、血液脳関門を通過するアゴニストの量、細胞中のアゴニストの半減期、毒性および副作用に基づかなければならない。
【００９０】
本研究では、ＴｒｋＢアゴニストの投与を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により実施したが；その他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）も有効であることが予想される。頭蓋内もしくは脊髄内への投与（またはＣＮＳのその他の組織への投与）も有効である可能性がある。その他の投与経路は、特定のＴｒｋＢアゴニスト、その被覆、コンジュゲーションまたは特定の生物学的特性に応じて、適切である場合がある（例えば、経口、舌下、骨膜内、粘膜、経皮、関節内、膣、肛門、尿道内、経鼻、経耳、吸入による、送気、カテーテルによる、ボーラスとして、ステントまたはその他の埋込み型の装置の上、塞栓症用の組成物中、静脈内点滴中、パッチまたは溶解性薄膜の上等）。
【００９１】
ＴｒｋＢアゴニストを、好ましくは、適切な末梢経路を介して投与する。それにもかかわらず、数パーセントのアゴニストは、血液脳関門を横切り、中枢神経系細胞に送達され得ることを理解されたい。場合によっては、末梢から投与され、ＣＮＳに接近するＴｒｋＢアゴニストの量は、少量である（１％未満に過ぎない）。
【００９２】
本発明の特色は、ＴｒｋＢアゴニストの自己免疫疾患に罹患している哺乳動物対象への直接的な投与である。「直接的な」は、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの発現を導くことが可能なポリヌクレオチドを、標準的な接種経路によって動物に送達することを意味する。ＴｒｋＢアゴニストは、糖質コルチコイド等の免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤（例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、メトトレキセート、アザチオプリンおよびメルカプトプリン）、細胞傷害性抗体（例えば、Ｔ細胞受容体抗体およびＩＬ−２に特異的な抗体）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質（例えば、循環する受容体）、ミコフェノール酸、および外来の抗体または治療用抗原に対する動物の免疫応答を抑制するのに使用されるその他の生物学的薬剤を含めた、その他の薬学的な物質と組み合わせて動物に送達することができる。
【００９３】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストを上回る利点は、抗体が、循環するタンパク質−リガンドと比較して、比較的長い循環半減期を有する傾向を示す点である。例えば、天然に存在するアゴニストは、毎日投与する必要がある場合があるが、抗体は、週１回の投与を必要とするに過ぎない場合がある。別の利点は、抗体が、より高い結合親和性を有する傾向を示し、当該抗体のそれらの抗原に対する選択性が、細胞の受容体のそれらのタンパク質リガンドに対する選択性よりも高い点である。
【００９４】
ＴｒｋＢアゴニストを用いる治療は、多発性硬化症および関連する障害のための従来の治療と組み合わせることができる。多発性硬化症の治療および管理のための従来の薬物には、これらに限定されないが、ＡＢＣ（すなわち、Ａｖｏｎｅｘ−Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ／Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ−Ｃｏｐａｘｏｎｅ）治療（例えば、インターフェロンベータ１ａ（ＡＶＯＮＥＸ、ＲＥＢＩＦ）、インターフェロンベータ１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ、ＢＥＴＡＦＥＲＯＮ）および酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ））；化学療法剤（例えば、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ、ＮＥＯＳＡＲ）、シクロスポリン（ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ）、メトトレキセートおよびクラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ））；副腎皮質ステロイドおよび副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（例えば、メチルプレドニゾロン（ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ）、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ）、プレドニゾロン（ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ）、デキサメタゾン（ＭＥＤＲＯＬ、ＤＥＣＡＤＲＯＮ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびコルチコトロピン（ＡＣＴＨＡＲ））；疼痛管理（感覚異常）（例えば、カルバマゼピン（ＴＥＧＲＥＴＯＬ、ＥＰＩＴＯＬ、ＡＴＲＥＴＯＬ、ＣＡＲＢＡＴＲＯＬ）、ガバペンチン（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ）、トピラメート（ＴＯＰＡＭＡＸ）、ゾニサミド（ＺＯＮＥＧＲＡＮ）、フェニトイン（ＤＩＬＡＮＴＩＮ）、デシプラミン（ＮＯＲＰＲＡＭＩＮ）、アミトリプチリン（ＥＬＡＶＩＬ）、イミプラミン（ＴＯＦＲＡＮＩＬ、ＩＭＡＶＡＴＥ、ＪＡＮＩＭＩＮＥ）、ドキセピン（ＳＩＮＥＱＵＡＮ、ＡＤＡＰＩＮ、ＴＲＩＡＤＡＰＩＮ、ＺＯＮＡＬＯＮ）、プロトリプチリン（ＶＩＶＡＣＴＩＬ）、カンナビスおよび合成カンナビノイド（ＭＡＲＩＮＯＬ）、ペントキシフィリン（ＴＲＥＮＴＡＬ）、イブプロフェン（ＮＥＵＲＯＦＥＮ）、アスピリン、アセトアミノフェンおよびヒドロキシジン（ＡＴＡＲＡＸ））；ならびにその他の治療（例えば、ナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）、４−アミノピリジン（ＦＡＭＰＲＩＤＩＮＥ）、３，４ ジアミノピリジン、エリプロディル、ＩＶイムノグロビン（ＩＶ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ、ＧＡＭＭＡＲ−ＩＶ、ＧＡＭＩＭＵＮＥ Ｎ、ＩＶＥＥＧＡＭ、ＰＡＮＧＬＯＢＵＬＩＮ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ、ＶＥＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ）、プレガバリンおよびジコノチド）がある。
【００９５】
キットオブパーツ
本発明はまた、本発明の方法を実行するための、キットオブパーツ（キット）も提供する。キットは、適切に単離および滅菌したＴｒｋＢアゴニストならびに本明細書に記載する本発明の方法のいずれかによる使用のための指示を包含する。一般に、これらの指示は、ＴｒｋＢアゴニストの投与方法の説明を含む。キットは、治療を必要とする動物を同定するためおよび治療の有効性をモニターまたは測定するための指示をさらに含むこともできる。指示は、一般に、用量、投与スケジュール（投与頻度）および投与経路に関連する情報を包含する。キット中の指示は、書面で供給しても、またはデータファイルもしくはスプレッドシートの形態として機械／コンピュータが読取り可能にして供給してもよい。
【００９６】
キットはまた、シリンジ、針、カテーテル、吸入器、ポンプ、アルコール消毒綿、ガーゼ、ＣＮＳの生検用の器具、組織学的な抗体および染色等を含めた、ＴｒｋＢアゴニストを投与するための器具を含むこともできる。キットの構成成分は、必要に応じて滅菌する。キットはまた、これらに限定されないが、ＧＡおよびデキサメタゾン等の免疫抑制剤を含めた、追加の医薬物質を提供することもできる。キットは、日付印、不正開封防止包装、および無線ＩＣ（ＲＦＩＤ）タグまたはその他の商品管理機能を含んでよい。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例を、本発明をさらに例証するために提供する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の追加の態様が明らかとなるであろう。
【００９８】
（実施例１）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の生成およびスクリーニング
モノクローナル抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体を生成するための免疫感作
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、８μｇのヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインを、抗原として規則的なスケジュールで５回注射した。ヒス−タグ化ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（残基３１〜４３０）を、２９３細胞中で、ベクターｐＴｒｉＥｘ−２ Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ製、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して発現させた。ＴｒｋＢ細胞外ドメインは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して製造者の指示により精製した（Ｑｉａｇｅｎ製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）。最初の４回の注射については、抗原を、ヒトＴｒｋＢをＲＩＢＩアジュバントシステムおよびミョウバンと混合することによって調製した。全量８μｇの抗原を、首筋、足パッドへの注射およびＩＰによって、約３日毎に１１日にわたって投与した。第１３日に、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。リンパ球を、８６５３細胞と融合させて、ハイブリドーマのクローンを作製した。クローンを増殖させ、次いでヒトおよびラットの両方のＴｒｋＢのＥＬＩＳＡを用いるＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって、抗ＴｒｋＢ陽性として選択した。
【００９９】
ＥＬＩＳＡによる抗ＴｒｋＢ抗体のスクリーニング：
増殖中のハイブリドーマのクローンからの上清を、ヒトおよびラットの両方のＴｒｋＢに結合する能力についてスクリーニングした。アッセイは、０．５μｇ／ｍｌのラットまたはヒトのＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質１００μｌを用いて一晩コートした９６ウエルプレートを用いて実施した。過剰な試薬を、ウエルから、各ステップの間に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いて洗浄した。次いで、プレートを、０．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いてブロッキングした。上清を、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＦｃを添加して、ＴｒｋＢに結合しているマウス抗体に結合させた。次いで、テトラメチルベンジジンを、ＨＲＰの基質として添加して、上清中に存在するマウス抗体の量を検出した。反応を停止し、抗体の相対的な量を、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって定量化した。５０個の抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、陽性を示した。これらの抗体のうち、５個をさらに試験し、これらが、アゴニスト活性を有することを示した。以下の表２を参照されたい。
【０１００】
ＫＩＲＡアッセイ：
このアッセイを使用して、ＥＬＩＳＡにおいて受容体チロシンキナーゼの活性化を誘発する能力について陽性であることが見出された抗体を、ヒトＴｒｋＢについてスクリーニングした。Ｓａｄｉｃｋら（１９９７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３４：３５４−６１。ｇＤタグ化ヒトＴｒｋＢをトランスフェクトした安定な細胞系統を活用して、ハイブリドーマのクローンから精製したマウス抗体を、天然のリガンドであるＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５の場合に見られる活性化に類似する、細胞表面上の受容体を活性化する能力について試験した。天然のリガンドは、ＴｒｋＢ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を誘発した。細胞を、抗体の種々の濃度に暴露した後、溶解させ、ＥＬＩＳＡを実施して、ＴｒｋＢ受容体のリン酸化を検出した。ＥＣ５０（以下の表２および図１０に示す）を、それぞれの推定上のＴｒｋＢアゴニストについて決定し、天然のリガンドであるＮＴ−４／５のＥＣ５０と比較した。
【０１０１】
Ｅ１５の結節神経細胞生存アッセイ：
Ｅ１５胚から得た下神経節の神経細胞を、ＢＤＮＦにより支持し、それによって、神経栄養因子の飽和濃度では、生存は、培養４８時間まで、１００％に近かった。ＢＤＮＦの非存在下では、５％未満の神経細胞が、４８時間まで生存した。したがって、Ｅ１５の結節神経細胞の生存は、抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性を評価するための敏感なアッセイであり、すなわち、アゴニスト抗体は、Ｅ１５の結節神経細胞の生存を促す。
【０１０２】
時期を定めて交尾させ、妊娠させたＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス、雌を、ＣＯ２の吸入により安楽死させた。子宮角を取り出し、胎生期Ｅ１５の胚を抽出した。下神経節を、解体し、次いで、トリプシン処理し、機械的に解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンを用いてコートした９６ウエルプレート中で、規定された無血清培地中に、１ウエル当たり２００〜３００個の細胞密度で蒔いた。抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性を、ヒトＢＤＮＦを基準にして、用量−応答に関して、三つ組みで評価した。培養４８時間後、細胞を、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ液体取扱いワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）上で実施する自動化された免疫細胞化学プロトコールに供した。プロトコールは、固定化（４％ホルムアルデヒド、５％スクロース、ＰＢＳ）、透過処理（ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、非特異的結合部位のブロッキング（５％正常ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）、ならびに神経細胞を検出するための一次抗体および二次抗体を用いた逐次的なインキュベーションを包含した。確立された神経細胞の表現型マーカーであるタンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）に対するウサギポリクローナル抗体を、一次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）を、二次試薬として、核染色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）と共に使用して、培養物中に存在する全ての細胞核を標識した。画像収集および画像解析を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１／ＧｅｎＩＩ Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）上で実施した。画像を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２のための２つの波長において自動的に収集し、核染色を基準点として使用した。これは、核染色は、このＩｍａｇｅｒの、画像に基づいた自動焦点系に対して、全てのウエル中に存在するからである。適切な対象および１ウエル当たりの撮像部位数を選択して、各ウエルの全表面を網羅した。画像解析を自動化して、培養４８時間後に、各ウエル中に存在する神経細胞の数を、抗ＰＧＰ９．５抗体を用いる、神経細胞に特異的な染色に基づいて計数した。画像の注意深い閾値化および形態学の適用および蛍光強度に基づいた選択性フィルターによって、１ウエル当たりの神経細胞の正確な数値を得た。ＥＣ５０（以下の表１および図８に示す）を、それぞれの推定上のＴｒｋＢアゴニスト抗体について決定し、天然のリガンドのＥＣ５０と比較した。
【０１０３】
以下の表は、５つの同定した抗ＴｒｋＢ抗体、ならびにマウス神経細胞の生存に対するそれらの活性およびヒトＴｒｋＢに対するリン酸化活性を示す。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体のマウスへの頭蓋内注射：
退役させたＣ５７Ｂ６繁殖用マウス、雄（８〜１２月齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ施設）から得、温度／湿度を制御した環境中、１２時間の明／暗サイクルで、飼料および水に自由に接近させて、注射まで少なくとも５日間順応させた。各マウスを、イソフルランを用いて麻酔し、頭蓋骨上の体毛のセクションを刈り込んだ。マウスを、定位固定用外科機器（Ｋｏｐｆモデル９００）上に固定し、麻酔し、中位に設定した電気加熱用パッドを用いて暖かく保った。Ｂｅｔａｄｉｎｅを、頭蓋骨のせん毛した部分上に擦り込んで、当該領域を滅菌した。頭蓋上、耳の直後から開始して目に向けて、長さ約１ｃｍと小さく、正中長軸方向に切開した。頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨表面の直径約１ｃｍの円形部分を、綿棒を用いて浄化して、いずれの結合組織も除去した。表面は、３０％過酸化水素中に浸漬した綿棒を用いて浄化して、十字縫合を露出させた。ドリルの先端部をプローブとして使用して頭蓋骨の深さを測定して、ドリルで穴を開ける前に頭蓋が水平であることを確実にするために、頭蓋を水平方向および垂直方向に加減した。０．５ｍｍ外側に比較して０．５ｍｍ内側から、および０．５ｍｍ後側に比較して０．５ｍｍ前側からの深さの偏位（十字縫合において、ゼロとする）を、±０．０５ｍｍ以内の差に最小化した。マウスの脳の図譜（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．およびＰａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９７）によれば、外側視床下部内への単回注射の座標は、以下のごとくである：十字縫合から１．３０ｍｍ後側；正中線から−０．５ｍｍ；深さ、（十字縫合において）頭蓋骨表面から５．７０ｍｍ。小さな穴を、頭蓋骨を通して、脳との接触を回避しながらドリルで開けた。ドリルを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（モデル８４８５１）に取り付けた斜めになった２６ゲージ針で置き換え、これを、同一の座標に戻した。２μｌの化合物を、外側視床下部内に、２分にわたって徐々に注射した。針を、注射後３０秒間この位置に維持し、次いで、１ｍｍ上昇させた。さらなる３０秒後に、針を、さらに１ｍｍ上昇させた。３０秒後には、針を、完全に取り出した。次いで、切開を、閉鎖して、２〜９ｍｍの創傷クリップ（Ａｕｔｏｃｌｉｐ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）を用いて一緒に保持した。注射は、第０日に実施した。体重および試料の摂取を第１５日まで毎日モニターした。
【０１０６】
表１（上記）に示すように、抗体３８Ｂ８および抗体３６Ｄ１の特定の用量における頭蓋内注射は、マウスにおいて、体重および飼料の摂取を顕著に減少させた。特定の用量で投与した対照のＩｇＧ抗体および２３Ｂ８は、飼料の摂取に対しても、体重に対しても、いずれも顕著に影響を及ぼすことはなかった。抗体３８Ｂ８を産生するマウスハイブリドーマ株は、２００７年１１月２１日、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州、２０１１０−２２０９に寄託され、これには、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６が割り当てられた。
【０１０７】
（実施例２）
ＴｒｋＢアゴニストの同定
ＴｒｋＢアゴニスト（抗体等）は、以下の方法のうちの１つまたは複数を含めた、当技術分野で認識されている方法を使用して同定することができる。例えば、米国特許第５７６６８６３号および第５８９１６５０号に記載されているキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを使用することができる。このＥＬＩＳＡ型のアッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ、例えば、Ｔｒｋ受容体）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することにより、キナーゼ活性化の定性的または定量的な測定に適しており、選択したｒＰＴＫの有望なアゴニストまたはアンタゴニストの同定および特徴付けにも適している。アッセイの第１段階では、キナーゼ受容体、本件では、ＴｒｋＢ受容体のキナーゼドメインのリン酸化が関与し、当該受容体は、真核細胞の細胞膜中に存在する。受容体は、内因性の受容体もしくは当該受容体をコードする核酸であっても、または受容体構築物を細胞中に形質転換してもよい。典型的には、第１の固相（例えば、第１アッセイのプレートのウエル）を、そのような細胞の実質的に均一な集団（通常、哺乳動物細胞系統）を用いてコートし、それによって、当該細胞を固相に接着させる。しばしば、細胞は、接着性であり、したがって、第１の固相に自然に接着する。「受容体構築物」を使用する場合、これは通常、キナーゼ受容体とｆｌａｇポリペプチドとの融合体を含む。ｆｌａｇポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において、捕捉剤、しばしば、捕捉抗体によって認識される。次いで、候補アゴニスト等の分析対象を、接着細胞を有するウエルに添加し、それによって、チロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＢ受容体）を、分析対象に暴露（または接触）させる。このアッセイにより、対象とするチロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＢ）に対するアゴニストリガンドの同定が可能となる。分析対象に対する暴露に続いて、接着している細胞を、（その中に可溶化用界面活性剤を有する）溶解用緩衝液を使用して可溶化させ、穏やかに撹拌し、それによって、細胞可溶化液を放出させ、これは、細胞可溶化液の濃縮または清澄化の必要性なしで、アッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接供することができる。
【０１０８】
次いで、こうして調製した細胞可溶化液は、アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供する準備ができている。ＥＬＩＳＡ段階の第１のステップとして、第２の固相（通常、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートのウエル）を、チロシンキナーゼ受容体に、または受容体構築物の場合、ｆｌａｇポリペプチドに特異的に結合する捕捉剤（しばしば、捕捉抗体）を用いてコートする。第２の固相のコーティングを実施し、それによって、捕捉剤を第２の固相に接着させる。捕捉剤は、一般的には、モノクローナル抗体であるが、また、本明細書の実施例に記載するように、ポリクローナル抗体またはその他の薬剤も使用してよい。次いで、得られた細胞可溶化液を、接着している捕捉剤に暴露または接触させ、それによって、受容体または受容体構築物を、第２の固相に接着させる（または第２の固相中に捕捉する）。次いで、洗浄ステップを実施し、それにより、未結合の細胞可溶化液を除去して、捕捉した受容体または受容体構築物を残す。次いで、接着しているまたは捕捉した受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗リン酸化チロシン抗体に暴露または接触させる。好ましい実施形態では、抗リン酸化チロシン抗体を、非放射性の発色試薬の色の変化を触媒する酵素に（直接的または間接的に）コンジュゲートさせる。したがって、受容体のリン酸化を、それに続く試薬の色の変化によって測定することができる。酵素を、抗リン酸化チロシン抗体に直接結合させてもよく、またはコンジュゲートする分子（例えば、ビオチン）を、抗リン酸化チロシン抗体にコンジュゲートさせてもよく、それに続いて、酵素を、コンジュゲートする分子を介して、抗リン酸化チロシン抗体に結合させることができる。最後に、抗リン酸化チロシン抗体の、捕捉した受容体または受容体構築物に対する結合を、例えば、発色試薬の色の変化によって測定する。
【０１０９】
最初の同定に続いて、候補（例えば、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体）のアゴニスト活性を、標的とする生物学的活性を試験することが知られているバイオアッセイによりさらに確認および精密化することができる。例えば、ＴｒｋＢをアゴナイズする候補の能力を、完全長のＴｒｋＢをトランスフェクトしたＰＣ１２細胞を使用する、ＰＣ１２神経突起伸長アッセイにおいて試験することができる（Ｊｉａｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．８：３６５−７０、１９９６）。このアッセイは、神経突起の伸長過程を、適切なリガンドによる刺激に対して応答するラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）によって測定する。これらの細胞は、内因性のＴｒｋＡを発現し、したがって、ＮＧＦに対して応答性である。しかし、これらの細胞は、内因性のＴｒｋＢを発現せず、したがって、ＴｒｋＢアゴニストに対する応答を惹起するために、ＴｒｋＢ発現構築物をトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を候補と共にインキュベートした後、神経突起の伸長を測定し、例えば、当該細胞の直径の２倍超の神経突起を有する細胞を計数する。トランスフェクトしたＰＣ１２細胞において神経突起の伸長を刺激する候補（抗ＴｒｋＢ抗体等）は、ＴｒｋＢアゴニスト活性を示す。
【０１１０】
ＴｒｋＢの活性化はまた、胚の発達の特異的な段階における種々の特異的な神経細胞を使用することによっても決定することができる。適切に選択した神経細胞の生存は、ＴｒｋＢの活性化に依存し得、したがって、これらの神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生存を追跡することによって、ＴｒｋＢの活性化を決定することが可能である。適切な神経細胞の一次培養物へ候補を添加すると、当該候補が、ＴｒｋＢを活性化する場合には、これらの神経細胞を少なくとも数日の期間にわたって生存させる。これによって、候補（抗ＴｒｋＢ抗体等）の、ＴｒｋＢを活性化する能力の決定が可能になる。この型のアッセイの１つの例では、マウスＥ１５胚由来の下神経節を解体し、解離させ、得られた神経細胞を、組織培養皿中に低い密度で蒔く。次いで、候補の抗体を培地に添加し、プレートを２４〜４８時間インキュベートする。この時間の後、神経細胞の生存を、多様な方法のいずれかによって査定する。アゴニストを投与した試料は、典型的には、対照の抗体を投与した試料を上回る生存率の増加を示し、これによって、アゴニストの存在の決定が可能となる。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎら（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８（３）：９８９−１００１を参照されたい。
【０１１１】
ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢを自然にまたはＴｒｋＢをコードするＤＮＡをトランスフェクトした後にのいずれかの場合発現する多様な細胞型における下流のシグナル伝達を活性化する能力によって同定することができる。このＴｒｋＢは、ヒトまたはその他の哺乳動物（げっ歯類もしくは霊長類等）のＴｒｋＢであってよい。下流のシグナル伝達カスケードは、タンパク質に関しては、タンパク質の発現レベルもしくはタンパク質のリン酸化レベル、または細胞に関しては、代謝状態もしくは増殖状態の変化（本明細書に記載するように、神経細胞の生存および／もしくは神経節の伸長を包含する）等、ＴｒｋＢ発現細胞の多様な生化学的または生理学的なパラメータの変化によって検出することができる。関連する生化学的または生理学的なパラメータを検出する方法は、当技術分野では既知である。
【０１１２】
（実施例３）
抗体の結合親和性の決定
ＴｒｋＢに対する抗体の結合親和性の決定は、抗体の単機能性のＦａｂ断片の結合親和性を測定することによって実施することができる。単機能性のＦａｂ断片を得るためには、抗体（例えば、ＩｇＧ）を、パパインを用いて切断するか、組換えにより発現させるかすることができる。抗体の抗ＴｒｋＢのＦａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ製、Ｐｉｓｃａｗａｙ、ニュージャージ州）によって決定することができる。ＣＭ５チップを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、供給者の指示に従って活性化することができる。ヒトＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質（「ｈＴｒｋＢ」）（またはラットＴｒｋＢ等のいずれかのその他のＴｒｋＢ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に希釈して、活性化したチップの上に、０．０００５ｍｇ／ｍｌの濃度で注入することができる。個々のチップの経路にわたり可変のフロー時間を使用して、２つの範囲の抗原密度を達成することができる：詳細な動態研究のための２００〜４００反応単位（ＲＵ）、およびスクリーニングアッセイのための５００〜１０００ＲＵ。チップを、エタノールアミンを用いてブロッキングすることができる。再生研究から、Ｐｉｅｒｃｅ製溶出用緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）と４Ｍ ＮａＣｌとの混合物（２：１）が、結合したＦａｂを有効に除去し、一方、ｈＴｒｋＢ活性を、チップ上に２００回超の注入にわたり維持することが示されている。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２９）を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイのための実行用緩衝液として使用する。精製したＦａｂ試料の段階希釈液（０．１〜１０×推定ＫＤ）を、１００μｌ／分で１分間注入し、最長２時間にわたり解離させる。Ｆａｂタンパク質の濃度を、（アミノ酸解析によって決定した）既知の濃度のＦａｂを標準として使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定する。（一般に、２５°Ｃにおいて測定する）動態学的な結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、データを、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ、Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ、Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６：９９−１１０）にフィットさせることによって同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）の値を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。
【０１１３】
（実施例４）
Ｂｉａｃｏｒｅにより測定したリガンド／受容体の相互作用の動態解析
一般的な方法：
相互作用解析を、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ製、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して、２５℃において実施した。（受容体を固定化するのに使用する）ＨＢＳ−ＥＰ実行用緩衝液は、Ｂｉａｃｏｒｅから、アミンのカップリング試薬（ＮＨＳ、ＥＤＣ、酢酸塩、ｐＨ４．５およびエタノールアミン）と共に購入した。Ｆｃ融合組換えヒト受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびＰ７５）、ならびに自然のリガンド（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５およびＮＴ３）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入するまたは社内で調製するのいずれかであった。
【０１１４】
受容体の固定化：
受容体（１チップ当たり３つ）を、ＣＭ５センサーチップ上に、低いレベル（典型的には、５００ＲＵまたは４ｆｍｏｌ／ｍｍ２）で固定化し、（１チップ当たり）１つのフローセルは、改変せずに残して、参照表面として供した。標準的なアミンのカップリングのプロトコールを、ＨＢＳ−ＥＰ実行用緩衝液中、５μｌ／分で使用し、このプロトコールには、３つのステップが関与した。手短にいうと、このプロトコールには、３つのステップが関与した。最初に、フローセルを、５０ｍＭ ＮＨＳ中に新たに調製した２００ｍＭ ＥＤＣの混合物を７分間注入して活性化した；このステップは、チップのカルボン酸基を反応性のエステルに変換した。次に、受容体を、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中で約１０μｇ／ｍＬに希釈し、所望のレベルを達成するまでチップにカップリングさせた。最後に、過剰の反応性エステルを、１Ｍのナトリウムエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を７分間注入してブロッキングした。
【０１１５】
リガンド解析：
リガンド（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５およびＮＴ３）を、実行用緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）中で５倍ずつ段階希釈して、０．０８〜２５０ｎＭに及ぶ濃度を得た。抗体２００．３８Ｂ８（３８Ｂ８）のＦａｂ断片を、０．７から４８０ｎＭまで３倍ずつ希釈した。試料を、１００μｌ／分で３０秒間注入し、最長１０分にわたり解離させた。各結合サイクル後には、受容体表面を、弱酸性のカクテル（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ４．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて再生させた。注入を２回繰り返すことによって、当該アッセイには再現性があることを確認した。動態学的速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を、結合のデータを物質輸送モデルに包括的にフィットさせることによって決定し、結合親和性を、それらの比、すなわち、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算した。
【０１１６】
結果：
パネル中の大部分のリガンド／受容体の相互作用は、迅速な、拡散に制限されるｏｎ速度によって特徴付けられ、これらの速度は、Ｂｉａｃｏｒｅの分解能（ｋｏｎ、約１×１０７ １／Ｍ・秒）を超えるものであった。顕著な例外は、ＰｒｏＮＧＦであり、これは、典型的には、緩慢なｏｎ速度を示した。ｏｆｆ速度は、より可変であり、例えば、ＰｒｏＮＧＦまたは成熟ＮＧＦのＴｒｋＡとの相互作用は、非常に緩慢なｏｆｆ速度（Ｔ１／２＞１時間）を有し、一方、ＮＴ３／ＴｒｋＡの相互作用は、数秒以内に減衰した（Ｔ１／２＝９秒）。３８Ｂ８−Ｆａｂ／ＴｒｋＢの相互作用は、二相性のｏｆｆ速度を有し、この場合、最初の相の減衰のみがモデルに適合した。二量体リガンドが、隣接する受容体分子間で、分子相互にｃｉｓ架橋することができないように、受容体の間に（平均的して）十分に広い間隔をあけるために、受容体を、チップ上に低いレベルでコートした。立体的な制約の故に、二量体リガンドが、Ｆｃ融合受容体分子の２つの腕の間で分子内架橋し得る可能性は低い。リガンドに、それらの２つの利用可能な結合部位のうちの１つのみを介して結合するのを強いる条件を促すことによって、親和力の課題が最少化され、我々のデータを単純な１：１の結合モデルにフィットさせることが妥当に感じられる。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
（実施例５）
ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与により、動物における病的状態が低下する
本発明の裏付けとして実施した実験では、ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与が、ＣＮＳに特異的な自己免疫疾患を有する動物において、病的状態およびＣＮＳ組織の損傷を低下させることが示された（図１Ａおよび１Ｂ）。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４の組換えの形態を、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号の記載に従って産生し、ＭＯＧによる誘発後のＣ５７ＢＬ／６マウス、雌に投与した（第０日）。
【０１１９】
動物に、ＮＴ４を、ＭＯＧによる誘発後第１０日から毎日投与した（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）（図１Ａ）。対照動物には、ビヒクルを投与した（ｎ＝８）。動物を、病的状態について、以下のようにスコア化した：０＝正常；１＝尾を引きずる；２＝中等度の後肢の衰弱；３＝中等度に重度の後肢の衰弱（動物は依然として歩行することができるが、困難が伴う）；４＝重度の後肢の衰弱（動物は後肢を動かすことができるが、歩行することはできない）；５＝完全な後肢の麻痺；および６＝死亡。ＮＴ４を用いて治療した動物は、対照動物と比較して、有意に低下した病的状態を示した。この結果から、ＴｒｋＢアゴニストが、慢性ＥＡＥの進行の緩慢化において有効であることが実証された。
【０１２０】
図１Ｂは、ＭＯＧによる誘発後の異なる時期の間に、ＮＴ４を用いて毎日治療した動物の病的状態を示す。動物を、対照であるＩｇＧを用いて（ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（ｎ＝８）のいずれかで治療した。両方の投与スケジュールが、動物の病的状態を低下させる点において有効であった。より早い時期の間に投与した場合（すなわち、早期の「パルス治療」）、より遅い時期の間に投与した場合と比較して、ＮＴ４によって与えられる保護は、（より良好ではないにしても）少なくとも同等に良好である。これらの結果から、ＴｒｋＢアゴニストを用いた治療を、治療が有効となるように、症状の発症時まで継続する必要がないことが示されている。ＴｒｋＢの活性化は、ＥＡＥの誘発の比較的上流の段階を標的にしている可能性がある。
【０１２１】
（実施例６）
高選択性ＴｒｋＢアゴニスト抗体の同定
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の同定を導いた実験および観察は、実施例１〜４に記載されている。それらの抗体のうちの１つ、すなわち、抗体３８Ｂ８のさらなる特徴付けから、当該抗体は、ＴｒｋＢに対しては極めて選択的であり、一方、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣまたはｐ７５に対しては通常の結合性を示すことが明らかになった（図２）。３８Ｂ８のＦａｂ断片の、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびｐ７５に対する相対的な親和性を、天然に存在するアゴニストであるＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ４の相対的な親和性と比較した。図２中の各パネルは、相対的な結合対時間を示すグラフである。抗体３８Ｂ８は、ＴｒｋＢに対して特異的であり、アッセイしたその他の受容体チロシンキナーゼに対しては顕著な結合を示さなかった。３８Ｂ８は、何らかの交差反応性を示した、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４よりも、ＴｒｋＢに対して、さらにより選択的であった。予想されたように、ＮＧＦは、ＴｒｋＢに対する結合性はほとんど示さず、ＴｒｋＡおよびｐ７５ニューロトロフィン受容体に優先的に結合した。３８Ｂ８の結合親和性は、４６±１０ｎＭであると決定された。（Ｋｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫｄのデータを含めた）これらのリガンド−受容体の相互作用の動態解析を、実施例４、詳細には、表２に提供する。
【０１２２】
ＢＤＮＦおよびＮＴ４は、ＴｒｋＢに対して、３８Ｂ８抗体アゴニストよりも高い親和性を有するようである。しかし、結合実験は、天然に存在するリガンドの二量体の形態および３８Ｂ８のＦａｂの単量体の形態を用いて実施された。さらに、抗体は、一般に、増殖因子よりも、はるかに長い循環半減期を有し、このことは、抗体が、それらの標的の受容体に対してより低い結合親和性を有するにもかかわらず、有効であることを可能にする。このＴｒｋＢアゴニスト抗体を、さらなる研究に使用した。
【０１２３】
（実施例７）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、自己免疫疾患における病的状態を低下させる点において有効である
動物実験から、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、対照の免疫グロブリンと比較して、ＥＡＥの病的状態に対して有意な保護をもたらすことが示された（図３）。ＭＯＧによる誘発後、マウスを、５ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体（３８Ｂ８、ｎ＝９）または対照のＩｇＧ（ｎ＝９）のいずれかを用いて治療した。これらを、第９日および第１６日に投与した。ＴｒｋＢアゴニスト抗体はまた、ＭＯＧによる誘発１６日後とまで遅れて投与した場合でも、臨床症状が発症した後で投与した場合でも有効であった（図４）。より遅い投与、例えば、誘発１８日後の場合には、病的状態の低下における有効性が低減した（図５Ａ）。より遅い治療後の臨床症状の差は、２要因の分散分析に基づくと有意ではなかった。
【０１２４】
他の動物において、ＭＯＧによる誘発２２日後の酢酸グラチラマー（ＧＡ、ＣＯＰＡＸＯＮＥ、ＴＹＳＡＢＲＩ）の投与は、病的状態の低下において有効であった（図５Ｂ）。これらの結果から、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構が、ＧＡおよびその他の現行のＭＳ薬物の作用機構とは異なることが示唆される。
【０１２５】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体を、ＭＳの治療用の別の現行の薬物であるデキサメタゾンと比較した。図６Ａは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）の投与後、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）の第３日から第１２日までの毎日投与後のいずれかの場合の動物における病的状態を示すグラフを図示する。これらの結果からは、ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの効果に類似することが実証されている。ＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、対照動物と比較して体重が減少する傾向を示した（図６Ｂ）。
【０１２６】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の有益な効果は、用量依存性であった。図７Ａおよび７Ｂに、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）もしくは５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）の３８Ｂ８投与後の動物の病的状態の差、または５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）および１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）の３８Ｂ８投与後の動物の病的状態の差を示す。これらの結果から、５ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体は、１ｍｇ／ｋｇよりも、病的状態に対するより多くの保護（すなわち、病的状態の低下）をもたらし、一方、１０ｍｇ／ｋｇは、５ｍｇ／ｋｇと比較して、病的状態をさらに低下させることが実証された。保護の増加は、より高い用量においては、それほど顕著ではなく、このことは、ＴｒｋＢアゴニストの追加の投与には、わずかな治療価値しかないことを示唆した。
【０１２７】
（実施例８）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびＮＴは、培養物中の神経細胞を保護する
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける神経細胞生存アッセイを使用して、ＮＴが、神経細胞の生存を促すことが示されている（Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．ら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ １１５６５−７４）。類似のアッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、神経細胞に、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で影響を及ぼすことを実証した（実施例１を参照されたい）。対照の（すなわち、神経栄養因子を欠く）培養物においては、事実上全ての神経細胞が、４８時間以内に死滅する。しかし、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４またはＮＧＦの存在下で培養した神経細胞のうちの６０〜８０％が、４８時間にわたり生存する（同上）。
【０１２８】
本発明の裏付けとして実施した実験では、以前の記載に従って、ＴｒｋＢアゴニスト抗体である３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１、３７Ｄ１２および１９Ｈ８の増加する量（例えば、表１を含めた、実施例１を参照されたい）を、神経細胞の培養物に添加した（図８）。いくばくかの変動はあるものの、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の増加する量を添加すると、神経細胞の生存が、（３８Ｂ８の場合、１０〜１００ｐＭの範囲においては最大７５％超、および１９Ｈ８の場合、０．１〜１０ｐＭの範囲においては最大１００％超）増加した。神経細胞生存アッセイにおける抗体３８Ｂ８のＥＣ５０値は、０．２ｐＭであった。神経細胞生存アッセイにおける３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１および３７Ｄ１２のＥＣ５０値、ならびにヒトＫＩＲＡアッセイにおけるこれらの抗体のＥＣ５０値および動物の体重に対するそれらの効果（認識されている、ＴｒｋＢアゴニストに対する応答）は、実施例１において議論し、その概要を表１に示す。抗体２３Ｂ８は、より高いＥＣ５０値である１１ｐＭを有するが、動物の体重に対して効果を示すことはできなかったことに注目されたい。このことは、１１ｐＭ未満のＥＣ５０値が、ＴｒｋＢアゴニストの生物学的活性のためには必要であることを示唆している。抗体３６Ｄ１は、５ｐＭのＥＣ５０値を有し、動物の体重に対して効果を示した。これらのデータは、ＮＴについて報告されている結果と一致し、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、神経細胞に、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で影響を及ぼすことを実証している。
【０１２９】
（実施例９）
ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない
（ＧＡおよびデキサメタゾンを含めた）ＭＳの治療用の現行の薬物は、免疫調節物質であり、これらは、免疫応答に関して、免疫抑制性およびその他の効果を示す。ＴｒｋＢアゴニストの治療効果もまた、免疫抑制のレベルのものであるか否かを決定するために、動物を、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）またはビヒクル単独（対照）を用いて治療し、異なるアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭ）の、循環するＭＯＧ（ミエリン）に特異的な抗体のレベルを測定した（図９）。ＴｒｋＢアゴニストによる治療後には、ＭＯＧに特異的な抗体のレベルのいくばくかの変動を観察したが、これは、動物の病的状態の顕著な低下を説明するのに十分であるようには見えなかった。特定の機構を本発明に帰することなく、これらの結果からは、ＴｒｋＢアゴニストは、抗ＭＯＧ抗体の産生を抑制することによって機能するのではなく、したがって、従来の免疫抑制剤として機能するとは思われないことが示唆される。
【０１３０】
ＴｒｋＢアゴニストが、Ｔ細胞およびＢ細胞の、ミエリンによって刺激される能力を阻害するか否かを決定するために、脾細胞増殖アッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニストの存在下で、ＭＯＧの、単離した脾細胞を刺激する能力を測定した。比較のために、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの存在下で、ＭＯＧを用いて脾細胞を刺激した。
【０１３１】
ＭＯＧで誘発した未治療（対照）動物（ｎ＝９）由来の脾臓細胞またはＭＯＧで誘発したＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物（ｎ＝８）由来の脾臓細胞を、ＭＯＧ単独（０）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８；５０μｌ／ｍｇ）または２つの異なる濃度（１０−８Ｍおよび１０−５Ｍ）のうちの１つにおけるデキサメタゾンと組み合わせたＭＯＧの存在下のいずれかで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した。図１０を参照すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＯＧで刺激されなかった脾細胞と比較した、脾細胞の刺激の種々の量が、ｙ軸上に示されている。
【０１３２】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の存在は、脾細胞刺激に対して、何ら明らかな効果を有さなかった。このことはまた、免疫抑制剤であるデキサメタゾンのより低い濃度の場合にもあてはまった。デキサメタゾンは、１０−５Ｍのより高い濃度では、ＭＯＧによる刺激を妨げた。
【０１３３】
全体的に、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物から得た脾細胞は、ＭＯＧによる刺激に対して、対照治療動物と一致する様式で応答し、このことは、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物は、抗ＭＯＧ性Ｔ細胞および／または抗ＭＯＧ性Ｂ細胞の正常な応答をもたらす能力を保持することを示している。さらに、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物から得た脾細胞も、対照動物から得た脾細胞も、培地中のＴｒｋＢアゴニストの存在に対して同様に応答する。これらの観察から、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの作用機構は、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構とは異なること、およびＴｒｋＢアゴニストの主要な作用機構は、白血球増殖のレベルにおいてではないことがさらに示唆される。
【０１３４】
（実施例１０）
ＴｒｋＢアゴニストは、炎症性細胞のＣＮＳへの侵入を遮断し、脱髄を低下させる
動物においてＴｒｋＢアゴニストが保護を媒介する機構をよりよく理解するために、組織学的解析を実施した。脊髄の切片を、対照動物およびＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物から調製し、次いで、ミエリンを染色するためにＬｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅを用いて、かつ細胞体を染色するためにクレシルバイオレットを用いて染色した（図１１）。対照動物では、染色は、ミエリンを発現している神経細胞の背景に対して白血球の侵入および細胞破壊の領域を示した。白血球侵入の低下が、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から調製した切片中には観察された。数匹のＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、白血球のＣＮＳへの侵入の証拠を全く示さなかった。
【０１３５】
侵入する細胞の同定を、２つの白血球マーカーであるＴ細胞上に存在するＣＤ３およびマクロファージ上に存在するＣＤ６８に対して特異的な抗体を使用して実施した。図１２は、ＣＤ３抗体を用いた染色の結果を示す。おびただしい数の、染色により明るく強調された領域が、特に、クレシルバイオレットで暗く染色された場所と同一の場所において明らかである。ＴｒｋＢアゴニスト治療マウスから得た脊髄の切片は、顕著に減少した染色を示し、このことから、Ｔ細胞の侵入が、治療動物においてはかなり低下することが示された。脊髄の切片はまた、単核球に伴うＣＤ６８マーカーに特異的な抗体でも染色された（図１３）。対照マウスから調製した切片は、ＴｒｋＢアゴニスト治療マウスからの切片よりも、特に、クレシルバイオレットおよびＣＤ３に特異的な抗体で強力に染色された領域と同一の領域において、より強力に染色された。そのような観察から、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物由来の脊髄組織は、対照動物と比較した場合、Ｔ細胞および単核球の侵入のかなりの低下を示すことが示された。
【０１３６】
脊髄の切片を、Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅで染色して、脱髄を測定した。対照マウスの脳は、リンパ球の激しい侵入を有する場所に対応して、重度の脱髄の領域を示し（すなわち、図１４中、黒の矢印が示す染色されていない場所）、このような領域は、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療したマウスにおいては明らかではなかった。重度の脱髄および／または神経細胞の死滅の領域は、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物からの切片においては観察されなかった。総合すると、ＣＮＳ組織の切片の組織化学的な染色の結果から、ＴｒｋＢアゴニストによる治療によって、リンパ球および単核球のＣＮＳへの侵入が低下することが実証された。
【０１３７】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよび人工的なＴｒｋＢアゴニストの両方が、ＥＡＥの進行を緩慢化させる点において有効である。天然に存在するアゴニストであるＮＴ４およびアゴニスト抗体の両方が、疾患の進行を緩慢化させる点において有効であった。アゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対する最も高い選択性を示し、これを使用して、ＴｒｋＢアゴニストがＥＡＥの進行に影響を及ぼす機構をさらに検討した。ＴｒｋＢアゴニストは、ＥＡＥの症状の発症（通常、これら特定の動物の場合、第１２日または第１３日）の前に投与しても、数日後に投与しても有効であった。ＭＯＧによる誘発１６日後（または症状の発症約４日後）までの投与は、病的状態の低下において有効であった。アゴニストの有益な効果は、用量依存性であり、ＴｒｋＢアゴニストの用量の増加に伴って病的状態が低下する。組織化学的な実験により、ＴｒｋＢアゴニストは、Ｔ細胞および単核球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることが示された。ミエリンの染色からは、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物における神経細胞に対する損傷の低下が示された。
【０１３８】
アッセイにおいて試験したその他の薬物とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない。このことは、ＴｒｋＢアゴニストが、ＭＯＧに特異的な自己免疫抗体の産生には影響を及ぼさないという観察において証明された。さらに、ＭＯＧにより誘発し、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から単離した脾細胞は、ＭＯＧによって刺激される能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで保持した。したがって、ＴｒｋＢアゴニストは、ＧＡおよびデキサメタゾン等のその他の化合物の様式とは異なる様式で機能する。
【０１３９】
本明細書に記載する実施例および実施形態は、説明する目的のものに過ぎず、ならびにそれらに照らした種々の改変形態または変形形態が当業者には示唆され、これらは本出願の精神および範囲のうちに含まれることを理解されたい。本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が、全ての目的のために、各刊行物、特許および特許出願が個々に、具体的かつ個別に参照によって組み込まれていると示されている場合と同程度に、本明細書によって、参照により組み込まれている。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年１２月２０日に出願した米国仮特許出願第６０／８７０９１８号の優先権を主張するものであり、その全体は参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、多発性硬化症を含めた、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患の治療に関する。本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるためのチロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）のアゴニストを提供する。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（ＭＳ）は、炎症、脱髄および軸索損傷によって特徴付けられる中枢神経系（ＣＮＳ）の脱髄性自己免疫疾患である。この疾患は、全世界で１００万人以上の人々を襲い、女性の有病率は、男性の有病率の２倍である。ＭＳの症状は通常、２０歳から４０歳の間に出現する。
【０００４】
ＭＳの特色が研究されているが、この疾患の病因は不明である。そのような特色には、ＣＮＳ組織の損傷、ミクログリアの活性化、炎症促進性サイトカインの産生、Ｔ細胞の遊走およびクローン型増殖の停止、マクロファージのエフェクター機能、産生の変化、ＭＨＣの上方制御、ならびに浸潤性Ｔ細胞によるＣＮＳの直接的な攻撃を包含する。
【０００５】
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）が、ＭＳの標準的なモデルであるとみなされている。マウス疾患モデルが、ＭＳの病因を研究し、その治療用の薬物を評価するのに使用されている（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。ＥＡＥの臨床的な特色には、非常に多数の浸潤性リンパ球およびマクロファージによるＣＮＳの炎症および脱髄がある。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を含めた、ミエリンのいくつかの異なるタンパク質構成成分を用いたマウスの能動免疫は、自己免疫抗体の産生および上行性麻痺の臨床症状を誘発する。この疾患は、マウスの系統、および免疫感作に使用したミエリンタンパク質に依存して、急性または慢性となる場合がある。ＥＡＥは、ＭＳの病因を研究し、その治療用の薬物を評価するのに使用されている（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。
【０００６】
ＭＳは、多くの場合、神経細胞組織中に豊富に存在するポリペプチドであるミエリンに対するＴ細胞の応答によって生じる。脱髄および臨床上の麻痺は、ミエリン抗原に対する特異性を有するＴｈ１表現型のＴ細胞の、ＣＮＳ組織への侵入によって生じる。Ｔｈ１細胞は、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを含めた、炎症性サイトカインを産生する。また、ＣＮＳに対する損傷は、自己免疫抗体の産生および補体の活性化を含めた、その他の免疫学的応答によっても引き起こされる可能性がある。Ｂ細胞が、ＭＳおよびＥＡＥの早期および後期の段階の間に関与し、種々のアイソタイプのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的抗体が疾患の経過全体を通して認められる。脳および脊髄の組織から調製した切片が、白血球の侵入（特に、リンパ球およびマクロファージ）ならびに神経系の下層組織の破壊を示す。
【０００７】
酢酸グラチラマー（ＧＡ、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）は、ＭＳおよびその他の疾患の治療について承認された免疫抑制薬である（Ａｒｎｏｎ，Ｒ．ら、２００３）。また、この薬物は、ＥＡＥモデルにおいても有効である。ＧＡは、Ｔｈ２／３細胞の誘発物質であり、この細胞は、抗炎症性サイトカインを産生し、これらのサイトカインは、血液脳関門を横断して、ＣＮＳ中に蓄積する。これらのサイトカインは、ＣＮＳ組織において種々の効果をもたらし、その他の増殖因子、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βおよびＢＤＮＦの局所的な産生に至る（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００３）。長期的なＧＡの投与は、ＮＴ３、ＮＴ４およびＢＤＮＦのより高いレベルの発現を伴った（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ｂ）。
【０００８】
ＮＴ３、ＮＴ４およびＢＤＮＦは、神経細胞の発達、成長過程、シナプス可塑性、保護および生存に関して重要な小型のホモ二量体タンパク質のニューロトロフィン（ＮＴ）ファミリーのメンバーである。ＮＴは、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ３、ＮＴ４（また、ＮＴ４／５とも呼ばれる）、ＮＴ６およびＮＴ７を包含する。ＮＴは、受容体チロシンキナーゼ（また、チロシン受容体キナーゼとも呼ばれる）として知られる受容体ファミリーとの相互作用を通して、標的細胞に影響を及ぼす。これらの受容体は、いくつかの高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）で、高親和性（約１０−１１Ｍ）のチロシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）である受容体および低分子量（６５〜８０ｋＤａ）で、低親和性（約１０−９Ｍ）の受容体（ＬＮＧＦＲ、ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５）として知られる受容体を包含する。特異的な受容体チロシンキナーゼへのＮＴの結合が、受容体の二量体化および内在性チロシンキナーゼドメインの活性化を引き起こす。ＮＧＦは、チロシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）に、ＢＤＮＦおよびＮＴ４は、チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に、ならびにＮＴ３は、チロシン受容体キナーゼＣ（ＴｒｋＣ）に優先的に結合する。全てのＮＴは、ｐ７５に弱く結合する。
【０００９】
ＥＡＥマウスのＣＮＳ組織中のＢＤＮＦおよびＮＴ４の報告（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００３、２００５ｂ）は、多発性硬化症および関連する疾患におけるＮＴおよび／またはそれらの受容体の役割を示唆している。
【００１０】
参照文献
Aharoni,R.et
al.(2005a)J.Neurosci.25:8217-28.
Aharoni,R.et
al.(2005b)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 102:19045-50.
Aharoni,R.et al.(2003)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA
100:14157-62.
Aharoni,R.et
al.(1997)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 94:10821-26.
Arnon,R.et
al.(2003)J.Mol.Recognit.16:412-21.
Davies,A.et al.(1993)Neuron 11565-74.
Karnezis,T.et al(2004)Nat.
Neurosci.7:736-44.
Padlan,E.et al.(1995)FASEB J.133-39.
Steinman and
Zamvil(2006)Ann.Neurol.60:12-21.
【００１１】
追加の参照文献、特に、標準的な手順および方法に関連する参照文献を、本文を通して引用する。本出願中、上記および他所で引用する全ての特許、特許出願、Ｇｅｎｂａｎｋへの登録、参照マニュアルおよび刊行物は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるための方法を提供し、この方法は、ＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物対象に、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量で投与するステップを含み、それによって、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させる。本発明は、哺乳動物において白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用もさらに提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は、自己免疫障害を有する。一実施形態では、自己免疫障害は実験的自己免疫性脳脊髄炎である。別の実施形態では、自己免疫障害は多発性硬化症である。その他の実施形態では、自己免疫疾患は、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患またはパーキンソン病に関係する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである。一実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＮＴ４である。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＮＴ４の天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴ４の断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。別の実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＢＤＮＦである。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＢＤＮＦの天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦの断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。
【００１６】
別の実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗体３８Ｂ８である。別の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生される。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト抗体である。関連する実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１７】
好ましい実施形態では、侵入する白血球は、Ｔ細胞およびマクロファージを含む。特定の実施形態では、侵入する白血球は、ＣＤ３を発現する白血球およびＣＤ６８を発現する白血球を含む。好ましい実施形態では、中枢神経系組織は、脳組織または脊髄組織である。
【００１８】
関連する態様では、本発明は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するための方法を提供し、この方法は、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに十分な量のＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を、そのような治療を必要とする哺乳動物対象に投与するステップを含み、それによって、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させる。本発明は、哺乳動物において中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用もさらに提供する。
【００１９】
一実施形態では、自己免疫障害は実験的自己免疫性脳脊髄炎である。別の実施形態では、自己免疫障害は多発性硬化症である。その他の実施形態では、自己免疫疾患は、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患またはパーキンソン病に関係する。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである。一実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＮＴ４である。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＮＴ４の天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴ４の断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。別の実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストはＢＤＮＦである。関連する実施形態では、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、ＢＤＮＦの天然に存在する断片または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＮＦの断片または誘導体は、ＴｒｋＢに結合して、それを活性化する。
【００２１】
別の実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは抗体である。特定の実施形態では、抗体は、抗体３８Ｂ８である。別の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生される。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト抗体である。関連する実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２２】
好ましい実施形態では、侵入する白血球は、Ｔ細胞およびマクロファージを含む。特定の実施形態では、侵入する白血球は、ＣＤ３を発現する白血球およびＣＤ６８を発現する白血球を含む。好ましい実施形態では、中枢神経系組織は、脳組織または脊髄組織である。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、白血球の中枢神経系組織への侵入を低下させるためのキットオブパーツを提供し、このキットオブパーツは、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量のＴｒｋＢアゴニストおよび使用のための指示を含む。関連する態様では、本発明は、中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するためのキットオブパーツを提供し、このキットオブパーツは、ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量のＴｒｋＢアゴニストおよび使用のための指示を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８、例えば、単離モノクローナル３８Ｂ８抗体に関する。別の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された単離ＴｒｋＢアゴニスト抗体に関する。いくつかの実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、３８Ｂ８の抗体断片または誘導体である。さらなる実施形態では、ＴｒｋＢアゴニストは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体の抗体断片または誘導体である。特定の実施形態では、抗体断片は、３８Ｂ８に由来するＦａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。特定の実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された抗体に由来するＦａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体または一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されたアゴニスト抗体の抗原結合領域を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、アゴニスト抗体３８Ｂ８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。関連する実施形態では、抗体断片は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるアゴニスト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらなる実施形態は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８を産生する細胞または３８Ｂ８に由来する断片を産生する細胞である。さらなる実施形態は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株である。
【００２５】
また、本発明は、本明細書に記載する自己免疫障害のいずれかの治療における使用のための、本明細書に記載する任意のＴｒｋＢアゴニストにも関する。また、本発明は、本明細書に記載するＴｒｋＢアゴニストのいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物も提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載するＴｒｋＢアゴニストのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関する。特定の一実施形態は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生されるアゴニスト抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子である。本発明は、本明細書に記載する核酸分子のいずれかを含むベクターにもさらに関し、ベクターは、核酸分子に動作可能に連結している発現制御配列を場合により含む。
【００２７】
別の実施形態は、本明細書に記載するベクターのいずれかを含むか、本明細書に記載する核酸分子のいずれかを含む宿主細胞を提供する。また、本発明は、本明細書に記載する抗体または抗原に結合する部分のいずれかを産生するか、前記抗体または前記抗原に結合する部分のいずれかの重鎖または軽鎖を産生する、単離細胞系統も提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原に結合する部分を産生するための方法に関し、この方法は、本明細書に記載する宿主細胞または細胞系統のいずれかを適切な条件下で培養するステップと、前記の抗体または抗原に結合する部分を回収するステップとを含む。
【００２９】
また、本発明は、本明細書に記載する核酸のいずれかを含む、非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物にも関し、非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物は、前記核酸を発現する。
【００３０】
本発明は、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその抗原に結合する部分を単離するための方法もさらに提供し、この方法は、抗体を本明細書に記載する非ヒトの遺伝子導入動物または遺伝子導入植物から単離するステップを含む。
【００３１】
本発明のこれらおよびその他の態様は、以下の本発明の説明および実施例から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】ＭＯＧによる誘発後の数週間のＥＡＥ動物における相対的な病的状態を示すグラフである。ＭＯＧを、第０日に投与した。（Ａ）動物に、第１０日から、ＮＴ４（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのビヒクル単独のいずれかを毎日投与した。（Ｂ）動物を、対照であるＩｇＧを用いて（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）のいずれかで治療した。
【図１Ｂ】ＭＯＧによる誘発後の数週間のＥＡＥ動物における相対的な病的状態を示すグラフである。ＭＯＧを、第０日に投与した。（Ａ）動物に、第１０日から、ＮＴ４（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのビヒクル単独のいずれかを毎日投与した。（Ｂ）動物を、対照であるＩｇＧを用いて（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）のいずれかで治療した。
【図２】４つの受容体チロシンキナーゼアゴニスト（すなわち、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４および３８Ｂ８）の、４つの受容体チロシンキナーゼ（すなわち、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびｐ７５）に対する相対的な親和性を示す一連のグラフである。ｘ軸は、時間（全て、３００〜４５０秒の範囲）を示す。ｙ軸は、相対的な親和性を示す。最大目盛、上の行（左から右へ）：９０、２０、５０および６０単位；２番目の行：３２、６０、６０、１４０単位；３番目の行：３５、３５、１６および２０単位；下の行：９０、８０、１００および９０単位。これらのデータは、本文および（表２を含めた）実施例４においてさらに説明する。
【図３】ＭＯＧによる誘発９日後にＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物における病的状態を示すグラフである。動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。マウスを、ＥＡＥの臨床徴候について、以下のスコア化システムに従って毎日査定した：０＝正常；１＝尾を引きずる；２＝中等度の後肢の衰弱；３＝中等度に重度の後肢の衰弱（動物は依然として歩行することができるが、困難が伴う）；４＝重度の後肢の衰弱（動物は後肢を動かすことができるが、歩行することはできない）；５＝完全な後肢の麻痺；および６＝死亡。
【図４】ＭＯＧによる誘発１６日後にＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物における病的状態を示すグラフである。動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８またはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを、第１６日および第２３日に投与した。
【図５Ａ】疾患の進行のより遅い時期に治療した動物における病的状態を示すグラフである。（Ａ）動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧのいずれかを、第１８日および第２３日に投与した。（Ｂ）動物に、ＧＡ（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）またはビヒクル単独（対照）のいずれかを、第２２日から毎日投与した。
【図５Ｂ】疾患の進行のより遅い時期に治療した動物における病的状態を示すグラフである。（Ａ）動物に、５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８または非特異性であるＩｇＧのいずれかを、第１８日および第２３日に投与した。（Ｂ）動物に、ＧＡ（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）またはビヒクル単独（対照）のいずれかを、第２２日から毎日投与した。
【図６Ａ】ＴｒｋＢアゴニストまたはデキサメタゾンのいずれかの投与後の動物における病的状態および体重を示すグラフである。動物に、３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）を投与するか、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）を第３日から第１２日まで毎日投与した。（Ａ）上記に従って、病的状態を測定した。（Ｂ）動物の体重を疾患の進行の経過にわたって測定した。
【図６Ｂ】ＴｒｋＢアゴニストまたはデキサメタゾンのいずれかの投与後の動物における病的状態および体重を示すグラフである。動物に、３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）を投与するか、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）を第３日から第１２日まで毎日投与した。（Ａ）上記に従って、病的状態を測定した。（Ｂ）動物の体重を疾患の進行の経過にわたって測定した。
【図７Ａ】ＴｒｋＢアゴニストの、疾患の病的状態の低下における有効性は、用量依存性であることを示すグラフである。（Ａ）動物に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト３８Ｂ８のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。（Ｂ）動物に、５ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８もしくは１０ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８、またはＰＢＳ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。
【図７Ｂ】ＴｒｋＢアゴニストの、疾患の病的状態の低下における有効性は、用量依存性であることを示すグラフである。（Ａ）動物に、１ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＴｒｋＢアゴニスト３８Ｂ８のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。（Ｂ）動物に、５ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８もしくは１０ｍｇ／ｋｇ３８Ｂ８、またはＰＢＳ（対照）のいずれかを、第９日および第１６日に投与した。
【図８】ｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイを使用して、いくつかのＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１、３７Ｄ１２および１９Ｈ８）の増加する量の存在下で生存する神経細胞の相対的な量を示すグラフである。実験の手順および結果を、本文および実施例１（例えば、表１）に記載する。神経細胞生存アッセイにおける各抗体のＥＣ５０値を、表１の第３列に示す。
【図９】未治療（対照）動物およびＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８を用いて治療した動物における、ＭＯＧに特異的な抗体の表示したアイソタイプの相対的なレベルを示す一連のグラフである。各グラフは、ＴｒｋＢアゴニスト（３８Ｂ８）治療動物または未治療（対照）動物における、（４５０μｍにおける吸収を測定することによって決定した）表示した抗体のアイソタイプの量を示す。
【図１０】脾細胞刺激アッセイの結果を示すグラフである。ＭＯＧで誘発した未治療（対照）動物由来の脾臓細胞またはＭＯＧで誘発したＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物由来の脾臓細胞を、ＭＯＧ単独、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８；５０μｌ／ｍｇ）もしくは２つの異なる濃度（１０−８Ｍおよび１０−５Ｍ）のうちの１つにおけるデキサメタゾンと組み合わせたＭＯＧの存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した。
【図１１】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ミエリンについてはＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅを用いて、かつ細胞体についてはクレシルバイオレットを用いて染色した。
【図１２】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ＣＤ３に対して特異的な抗体を用いて染色した。
【図１３】対照動物から取り出した脊髄の切片（Ａ）およびＴｒｋＢアゴニスト治療ＥＡＥ動物から取り出した脊髄の切片（Ｂ）の免疫化学的染色の結果を示す図である。切片は、ＣＤ６８に対して特異的な抗体を用いて染色した。
【図１４】対照動物から取り出した脊髄の切片およびＴｒｋＢアゴニスト治療ＥＡＥ動物から取り出した脊髄の切片の組織学的染色の結果を示す図である。切片を、ミエリン染色、すなわちＬｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅを用いて染色した。染色されていない場所は、脱髄の領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本明細書で使用する場合、「チロシン受容体キナーゼ」および「受容体チロシンキナーゼ」用語は、互換的に使用して、ＴｒｋＢがそのメンバーである、分子のクラスを指す。リガンド（アゴニスト）の受容体チロシンキナーゼへの結合が、リガンド誘発性の受容体の二量体化および細胞内キナーゼドメイン中のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。チロシンのリン酸化に、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路、ＭＡＰＫ経路およびＰＬＣ経路等の多様なシグナル伝達カスケードの活性化が続き、これらの経路は、遺伝子発現を、典型的には細胞型に特異的な様式で調節する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「侵入する白血球」は、自己免疫疾患、好ましくは、ＣＮＳに影響を及ぼす自己免疫疾患の結果として、脳および脊髄の組織を含めた、中枢神経系（ＣＮＳ）組織中に侵入、浸潤または遊走する白血球である。侵入する白血球は、主としてＴ細胞および単核球であるが、その他の白血球も存在する場合がある。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「白血球の侵入を低下させる」とは、脳および脊髄の組織を含めた、白血球のＣＮＳ組織中への遊走（すなわち、侵入または浸潤）を減少させることを指す。白血球の侵入を低下させるとはまた、白血球の侵入によって媒介される細胞傷害性の効果を、特に、ＣＮＳ組織の下層の神経細胞および／またはその他の支持細胞に関して低下させることも指す。白血球の侵入は、Ｔ細胞および単核球による侵入を包含する。白血球の侵入の低下は、ＣＮＳ組織の自己免疫性の攻撃からの保護を包含する。白血球の侵入によって破壊されるＣＮＳ細胞は、ミエリン発現細胞および付近の非ミエリン発現細胞を包含する。細胞の破壊は、アポトーシス、壊死またはそれらの組合せであってよい。白血球の侵入の低下は、疾患の進行の緩慢化、病的状態の発症および重症化の遅延、生存の延長、生活の質の改善、認知、運動または行動の症状の減少または安定化等の臨床的な指標によって特徴付けられる。白血球の侵入の低下はまた、白血球の中枢神経系（ＣＮＳ）組織中への遊走の危険の予防または低下も包含する。白血球の侵入の低下は、部分的であっても、または完全であってもよく、例えば、低下は、本明細書に記載するように、相対的なまたは実際の低下として、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはさらに約９５％であってよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ受容体アゴニスト」または「ＴｒｋＢアゴニスト」は、ＴｒｋＢ受容体の活性化の量を増加させる分子であり、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４によってもたらされる効果に類似する効果をもたらす。ＴｒｋＢの活性化は、通例、受容体誘発性の自己リン酸化によって生じ、これは、細胞内シグナル伝達事象の特徴的なカスケードを開始する。ＴｒｋＢ受容体アゴニストは、この活性化を、例えば、受容体の二量体化またはリン酸化を調節することによって、天然に存在するアゴニストの結合を調節することによって、天然に存在するアゴニストの結合を模倣することによって、ＴｒｋＢ受容体を活性化された（例えば、リン酸化された）状態に（無期限を含めた）より長い期間留めさせることによって、またはその他の形でＴｒｋＢの活性化を調節し、もしくはＴｒｋＢ受容体の活性化に特徴的である細胞内事象のカスケードを開始させることによって増加させる。ＴｒｋＢアゴニストは、これらに限定されないが、既知のＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＢＤＮＦを含めた、天然に存在するアゴニストのポリペプチド、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。ＴｒｋＢアゴニストは、アゴニスト抗体、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。ＴｒｋＢアゴニストの好ましい特性を、本明細書に記載する。本発明のＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢの活性化を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、またはそれ以上増加させることができる。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「断片」ポリペプチドは、より大きなポリペプチドの部分であり、これは、ＴｒｋＢ受容体を活性化する能力等、そのより大きなポリペプチドの生物学的特性のうちの少なくともいくつかを保持する。好ましい断片は、そのより大きなポリペプチドの生物学的特性をもたらす、そのより大きなポリペプチドのアミノ酸残基および／または構造を含む。ポリペプチド断片は、ペプチドと呼ばれる場合があるが、本明細書では、ポリペプチドとペプチドを区別しない。例示的な断片を、本明細書に記載する。断片は、本明細書に記載するように、誘導体化することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「誘導体」ポリペプチドは、官能基または官能性部分の付加または除去等、１つまたは複数の共有結合性または非共有結合性の修飾を有する。誘導体の例を、本明細書に提供する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、特定のポリペプチド配列の「変異体」を、Ｃｌｕｓｔａｌ ＶまたはＢＬＡＳＴ、例えば、デフォルトパラメータに設定した「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」ツールのＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．９（１９９９年５月７日）等のアルゴリズムを使用した場合、ポリペプチド配列のうちの１つの特定の長さにわたる特定のポリペプチド配列に対して、少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチド配列と定義する。そのような一対のポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのうちの１つの特定の定義した長さにわたり、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％以上の配列同一性を示すことができる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、ポリペプチド配列に適用する場合の「配列同一性」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ、ＭＥＧＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴ等の標準化されたアルゴリズムを使用して整列させた、少なくとも２つのポリペプチド配列間における残基の一致のパーセントを指す。ポリペプチド配列のアラインメントの方法は、周知である。いくつかのアラインメントの方法は、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる。本明細書に記載する、そのような保存的置換は、一般に、置換部位において電荷および疎水性を保存し、したがって、当該ポリペプチドの構造（したがって、機能）を保存する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ受容体を活性化するのに有効な量」またはＴｒｋＢアゴニストに関する類似表現は、ＴｒｋＢ受容体アゴニスト投与前の活性化のベースラインレベルと比較して、（本明細書に記載し、当技術分野で既知である）ＴｒｋＢ受容体の活性化を増加させるのに十分な量を指す。活性化の増加は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、またはそれ以上であってよい。この量は、投与経路、ＴｒｋＢアゴニストの体内半減期、ＴｒｋＢアゴニストの溶解性、生物学的利用率、クリアランス速度およびその他の薬物動態学的特徴、動物または患者の体重および代謝等を考慮に入れる。また、ＴｒｋＢアゴニストも参照されたい。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「治療を必要とする動物」または類似表現は、ＣＮＳが関与する自己免疫疾患を有するまたはそれを発症する危険を有する動物、好ましくは、ヒトを含めた哺乳動物を意味する。ＣＮＳに影響を及ぼす自己免疫性の疾患（または区別なく、障害）の例は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒトにおける多発性硬化症（ＭＳ）、およびその他の哺乳動物において見出される類似の自己免疫疾患である。また、ＣＮＳの自己免疫性の攻撃は、例えば、免疫拒絶、視神経症、炎症性腸疾患およびパーキンソン病においても観察される。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「天然に存在するＴｒｋＢアゴニスト」は、天然に存在し、ＴｒｋＢ受容体の活性化物質として機能する分子である。ＴｒｋＢ受容体の既知の天然に存在するアゴニストは、ニューロトロフィンであるＮＴ４およびＢＤＮＦである。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストは、変異型ＴｒｋＢ対立遺伝子を有する動物において発現したニューロトロフィンポリペプチド等、天然に存在する変異体分子を包含する。
【００４４】
「単離抗体」は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＴｒｋＢに特異的に結合する、単離抗体は、ＴｒｋＢ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＴｒｋＢに特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＴｒｋＢ分子等のその他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００４５】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、単一の分子組成物である抗体分子調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００４６】
一般的技術
本発明は、分子生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の分野において使用される従来の技術を利用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）等の参照文献に記載されている。
【００４７】
ＴｒｋＢアゴニスト
本発明は、多発性硬化症および中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼすその他の自己免疫障害の治療のために、ＴｒｋＢアゴニストを使用する方法を提供する。本発明の１つの特色によれば、ＴｒｋＢアゴニストは、白血球のＣＮＳ組織への侵入を低下させる点およびＣＮＳの下層神経細胞組織の破壊を低下させる点において有効であり、したがって、四肢麻痺等、こうした疾患の臨床所見を緩和する。具体的には、ＴｒｋＢアゴニストは、単核球およびＴ細胞の遊走を低下させる。これらの細胞は、ミエリン抗原を提示する点およびミエリン抗原を産生する細胞に対して細胞傷害性の効果を与える点で活性がある。
【００４８】
ＭＳについて一般に認められている動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスを使用して、本発明を導いた観察がなされた。ＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳと多くの臨床的および病理学的な特色を共有する実験的な疾患状態である。多くのＦＤＡが承認したＭＳの療法は、最初に、マウスおよびラットにおけるＥＡＥモデルに基づいて発見および開発された（ＳｔｅｉｎｍａｎおよびＺａｍｖｉｌ、２００６による総説）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のペプチド３５〜５５を用いた免疫感作後に誘発することができる（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．ら、２００５ａ）。ＭＯＧを用いた免疫感作は、ミエリンに特異的な自己免疫性反応を誘発し、これは、ＭＳのものに類似する脱髄および病的状態を引き起こす。
【００４９】
ＴｒｋＢアゴニストを使用する動物実験
本発明の裏付けとして実施した実験では、ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与が、ＣＮＳに特異的な自己免疫疾患を有する動物において、病的状態およびＣＮＳ組織の損傷を低下させることが示された（図１Ａおよび１Ｂ）。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４の組換えの形態を、ＭＯＧによる誘発後のＥＡＥ動物に投与した（実施例５）。ＮＴ４を用いて治療した動物は、対照動物と比較して、有意に低下した病的状態を示した。この結果から、ＴｒｋＢアゴニストの投与が、慢性ＥＡＥの進行の緩慢化において有効であることが実証された。さらなる実験からは、より早い時期の間に投与した場合、より遅い時期の間に投与した場合と比較して、症状の発症に関して、ＮＴ４によって与えられる保護は、（より良好ではないにしても）少なくとも同等に良好であり、ＴｒｋＢアゴニストを用いた治療を、治療が有効となるように症状の発症時まで継続する必要がないことが示された（図１Ｂ）。ＴｒｋＢの活性化は、ＥＡＥの誘発の比較的上流の段階を標的にしている可能性がある。
【００５０】
実施例１〜４および６は、ＴｒｋＢの生物学的活性を刺激する、すなわち、ＴｒｋＢを活性化する（例えば、実施例６、ならびに表１および２）能力に基づいて、いくつかがＴｒｋＢアゴニストとして機能したＴｒｋＢ抗体について記載する。抗体３８Ｂ８を含めた、いくつかの抗体は、ＴｒｋＢに対して特異的であり、アッセイしたその他の受容体チロシンキナーゼに対しては顕著な結合を示さなかった。抗体３８Ｂ８は、何らかの交差反応性を示した、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４よりも、ＴｒｋＢ受容体に対して、さらにより選択的であった。これらのリガンド−受容体の相互関係の動態解析を、実施例４および表２に提供する。
【００５１】
動物実験からは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、対照の免疫グロブリンと比較して、ＥＡＥの病的状態に対して有意な保護をもたらすことが示された（図３、実施例７）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ＭＯＧによる誘発１６日後とまで遅れて投与した場合でも、臨床症状が発症した後で投与した場合でも有効であった（図４）。酢酸グラチラマー（ＧＡ）との比較から、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構が、ＧＡおよびその他の現行のＭＳ薬物の作用機構とは異なることが示唆された（図５）。その他の結果からは、ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの効果に類似することが実証されている（図６Ａおよび６Ｂ）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体の有益な効果は、用量依存性であった（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００５２】
神経細胞生存アッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で神経細胞に影響を及ぼすことが実証された（実施例８）。ＴｒｋＢアゴニスト抗体の増加する量を添加した結果、神経細胞の生存が増加した（図８）。神経細胞生存アッセイおよびヒトＫＩＲＡアッセイにおけるＴｒｋＢアゴニスト抗体である３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１および３７Ｄ１２のＥＣ５０値を、実施例１に記載し、その概要を表１に示す。
【００５３】
（ＧＡおよびデキサメタゾンを含めた）ＭＳの治療用の現行の薬物は、免疫調節物質である。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、抗ＭＯＧ抗体の産生を抑制することによって機能するようには見えず、したがって、従来の免疫抑制剤としては機能しないと思われる（図９、実施例９）。さらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の存在は、脾細胞の刺激に対して、免疫抑制剤であるデキサメタゾンが示したような明らかな効果は何ら示さなかった（図１０）。ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物は、抗ＭＯＧ性Ｔ細胞および／または抗ＭＯＧ性Ｂ細胞の正常な応答をもたらす能力を保持する。これらの観察から、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの作用機構は、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構とは異なること、およびＴｒｋＢアゴニストの主要な作用機構は、白血球増殖のレベルにおいてではないことが示唆される。
【００５４】
ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から調製した切片において、組織学的解析により、白血球侵入の低下が示された。数匹のＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、白血球のＣＮＳへの侵入の証拠を全く示さなかった（図１１）。侵入する細胞の同定を、ＣＤ３を発現するＴ細胞およびＣＤ６８を発現するマクロファージについて染色することによって実施した。ＴｒｋＢアゴニスト治療動物由来の脊髄組織は、対照動物と比較した場合、Ｔ細胞および単核球の侵入のかなりの低下を示す（図１２および１３）。重度の脱髄の領域が、対照マウスにおいては明らかであったが、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療したマウスにおいてはそうではなかった（図１４）。ＣＮＳ組織切片の組織化学的染色の結果から、ＴｒｋＢアゴニストによる治療によって、リンパ球および単核球のＣＮＳへの侵入が低下することが実証された。
【００５５】
上記に記載した結果から、ＴｒｋＢアゴニストは、白血球のＣＮＳへの侵入を低下させ、ＭＳについて一般的に認められている動物モデルであるＥＡＥの進行を緩慢化させる点において有効であることが実証されている。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＴｒｋＢアゴニスト抗体の両方は、疾患の進行の緩慢化において有効であった。当該アゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対して最も大きな選択性を示し、これを、さらなる研究に使用した。ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、用量依存性であり、ＴｒｋＢアゴニストの用量の増加に伴って病的状態が低下した。現行のＭＳ薬物とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない。組織化学的な実験により、ＴｒｋＢアゴニストは、Ｔ細胞および単核球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることが示された。
【００５６】
ＣＮＳ自己免疫障害のためのＴｒｋＢアゴニスト
何らかの理論に限定されることなく、ＴｒｋＢアゴニストは、主として、白血球の遊走を調節することによって機能すると考えられている。ＭＳにおいては、細胞性免疫が優勢である可能性があり、このことは、ＴｒｋＢアゴニストを、液性免疫に影響を及ぼす現行の免疫抑制剤より有効な型の薬物となす。さらに、本方法は、現行の免疫抑制剤治療と組み合わせて、追加の治療効果をもたらすことができる。
【００５７】
いくつかの自己免疫疾患または関連する疾患において、本発明のＴｒｋＢアゴニストを使用して、白血球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることができる。ＥＡＥマウスは、ＭＳのモデルであることに加えて、また、視神経炎を研究するためにも使用される。ＴｒｋＢアゴニストは、全てのこれらの疾患、およびとりわけ白血球の侵入によって媒介されるその他の自己免疫障害において、免疫のＣＮＳへの侵入を緩和することが予想される。疾患および障害という用語は、区別なく使用されていることに留意されたい。
【００５８】
本発明の特色は、ＴｒｋＢアゴニストの、自己免疫疾患に罹患している動物への直接的な投与である。本発明の好ましい実施形態を、ポリペプチドの観点から記載するが、本発明は、当該ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与を包含し、このポリヌクレオチドは、体内において、コードするＴｒｋＢアゴニストの発現を導く。直接的なＤＮＡ注入および遺伝子療法の送達の方法は、当技術分野で既知である。ＧＡ等の薬物の投与によって誘発させる場合とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを、動物に直接的に投与する。本発明はまた、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよび／またはアゴニスト抗体と一致する様式でＴｒｋＢに結合し、これを活性化するペプチド模倣分子も包含する。
【００５９】
本明細書に記載する方法により使用するための具体的なＴｒｋＢアゴニストを、以下に、さらに詳細に記載する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、追加のＴｒｋＢアゴニストが明らかとなるであろう。
【００６０】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよびそれらの誘導体
ＴｒｋＢアゴニストは、これらに限定されないが、既知のＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４およびＢＤＮＦを含めた、天然に存在するアゴニストのポリペプチドを包含する。ＮＴ４および／またはＢＤＮＦのポリペプチド配列は、得られるポリペプチドがＴｒｋＢに結合し、アゴニストとして機能するという条件で、対応するＴｒｋＢ受容体と同一の種からであっても、または異なる種からであってもよい。
【００６１】
ＴｒｋＢアゴニストは、天然に存在するＮＴ４および変異体ＮＴ４（すなわち、ＮＴ−４／５および類似名）を包含する。ＮＴ４ポリペプチドは、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号、第２００３／０２０３３８３号および第２００２／００４５５７６号、ならびにＰＣＴ第ＷＯ２００５／０８２４０号に記載されている。ＮＴ４（すなわち、ＮＴ４／５）ポリペプチドは、いくつかの哺乳動物において同定されている。対象とするアミノ酸置換には、Ｇ７７のＫ、Ｈ、ＱまたはＲへの置換；およびＲ８４のＥ、Ｆ、Ｐ、ＹまたはＷへの置換がある。プロテアーゼ切断部位を除去して、ＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドの半減期を延長させてもよく、またはプロテアーゼ切断部位を付加して、それらの活性を制御してもよい。ＴｒｋＢアゴニストを、ＰＥＧ、ＩｇＧのＦｃ領域、アルブミン、またはＭｙｃ、ＨＡ（赤血球凝集素）、Ｈｉｓ−６やＦＬＡＧ等のペプチドもしくはエピトープ等の半減期延長部分にコンジュゲートまたは融合させることができる。
【００６２】
また、ＢＤＮＦポリペプチドも、いくつかの哺乳動物において同定されている（例えば、米国特許第５１８０８２０号および米国特許出願公開第２００３／０２０３３８３号を参照されたい）。
【００６３】
本発明の天然に存在するおよび変異体のＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドは、それらのキメラ、変異体、断片（ペプチドを包含する）および／または誘導体を包含する。好ましい断片は、天然に存在するポリペプチドのＴｒｋＢ結合部分、またはキメラ、コンセンサスもしくは変異型の同等な結合部分を包含する。断片は、合成ペプチドを包含する。変異体は、保存的および非保存的なアミノ酸の置換を有する、天然に存在するアミノ酸配列の変異体を包含する。
【００６４】
保存的置換には、類似の大きさ、電荷または疎水性のアミノ酸残基が関与する。例えば、Ａｌａは、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅで置換してよい。Ａｒｇは、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換してよい。Ａｓｎは、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇで置換してよい。Ａｓｐは、Ｇｌｕで置換してよい。Ｃｙｓは、Ｓｅｒで置換してよい。Ｇｌｎは、Ａｓｎで置換してよい。Ｇｌｕは、Ａｓｐで置換してよい。Ｇｌｙは、Ｐｒｏで置換してよい。Ｈｉｓは、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｒｇで置換してよい。Ｉｌｅは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅまたはノルロイシンで置換してよい。Ｌｅｕは、ノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＡｌａまたはＰｈｅで置換してよい。Ｌｙｓは、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換してよい。Ｍｅｔは、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＩｌｅで置換してよい。Ｐｈｅは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＡｌａで置換してよい。Ｐｒｏは、Ｇｌｙで置換してよい。Ｓｅｒは、Ｔｈｒで置換してよい。Ｔｈｒは、Ｓｅｒで置換してよい。Ｔｒｐは、Ｔｙｒで置換してよい。Ｔｙｒは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＴｈｒまたはＳｅｒで置換してよい。Ｖａｌは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａまたはノルロイシンで置換してよい。
【００６５】
機能の実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート状もしくはらせん状の高次構造を維持する、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性を維持する、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対する置換の効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成することができる。天然に存在する残基は、側鎖の共通の特性に基づいてグループに分けられる（これらのうちのいくつかは、複数の機能グループに属する場合がある）：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ノルロイシン；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；ならびに
（６）曲がりを誘発する残基：ＧｌｙおよびＰｒｏ。
【００６６】
非保存的置換では、１つのクラスのメンバーが、別のクラスのメンバーと交換されるか、前段落において保存的であると同定されていない置換が関与する。
【００６７】
変異体は、得られるポリペプチドまたは誘導体がＴｒｋＢに結合し、アゴニストとして機能することを条件として、天然に存在するアミノ酸配列の変異体および遺伝子操作した変異体を含む。ＴｒｋＢの活性化を測定するためのアッセイが、本明細書および引用する参照文献に記載されている。
【００６８】
さらなる変異体は、ＮＴ３およびＮＧＦを含めた、チロシン受容体キナーゼのＴｒｋファミリーのその他の関連するリガンド由来の部分的なアミノ酸配列を有する、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドを含む。変異体は、コンセンサスＴｒｋまたはコンセンサス受容体チロシンキナーゼ結合および／もしくは活性化配列を有するポリペプチドもさらに含む。
【００６９】
その他の誘導体は、共有結合性および非共有結合性に修飾されたペプチドおよびポリペプチド（例えば、アセチル化、ペグ化、ファルネシル化、グリコシル化またはリン酸化されたポリペプチド）を含む。ＮＴ４の具体的なペグ化された形態およびその他の修飾された形態が、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号に記載されている。ポリペプチドは、追加の官能基を包含して、結合および／もしくは活性を調節し、体内での画像診断を可能にし、半減期を調節し、血液脳関門を越えての輸送を調節し、またはポリペプチドが特定の細胞型もしくは組織を標的にするのを援助することができる。ポリペプチドは、アミノ酸置換がポリペプチドのＴｒｋＢへの結合にも、アゴニストの活性にも実質的に影響を及ぼさないならば、アミノ酸置換を含んで、修飾（例えば、ペグ化部位、グリコシル化部位またはその他の部位の付加）を促進することができる。
【００７０】
一般的な修飾は、ペグ化であり、生物学的活性の最小限の損失を伴って全身クリアランスを低下させる。ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）は、当技術分野で既知の方法を使用して、ＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチド（ならびにＴｒｋＢアゴニスト抗体）の種々の官能基に連結させることができる（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００２）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９−４７６；Ｓａｋａｎｅら（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：１０８５−９１を参照されたい）。ＰＥＧは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、修飾したまたは天然のＮ末端、アミン基およびチオール基に連結させることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の表面アミノ酸残基を、ＰＥＧ分子を用いて修飾する。ＰＥＧ分子は、種々の大きさ（例えば、約２から４０ｋＤａの範囲）であってよい。ＮＴ４、ＢＤＮＦまたはその他のポリペプチドに連結させるＰＥＧ分子は、約２０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００Ｄａのいずれかの分子量を有してよい。ＰＥＧ分子は、一本鎖であっても、または分枝鎖であってもよい。ＰＥＧをＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドに連結させるためには、一方または両方の末端に官能基を有する、ＰＥＧの誘導体を使用することができる。官能基は、ポリペプチド上の利用可能な反応性の基の型に基づいて選ばれる。誘導体をポリペプチドに連結させる方法は、当技術分野で既知である。
【００７１】
ペグ化されたＮＴ４が、生成され、動物においてＮＴ４として機能することが示されている（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号の実施例６および７、ならびにＰＣＴ第ＷＯ２００５／０８２４０１号を参照されたい）。成熟したヒトＮＴ４の５０位のセリン残基をシステインに変化させて、ＮＴ４−Ｓ５０Ｃを生成することができ、次いで、これをペグ化し、ＰＥＧを、５０位のシステインに連結させる。ＰＥＧへのＮ末端に特異的な結合の１つの例が、１位の残基をセリンまたはスレオニンに変異させて、ペグ化を促進する場合である。類似の方法が、ＢＤＮＦおよび本発明において使用するためのその他のポリペプチドに適用される。
【００７２】
ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、その他の分子に、直接的にまたは合成リンカーを介して連結させることができる。好ましいＴｒｋＢアゴニストのポリペプチド、それらの断片または誘導体は、それらの値が報告されている天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、類似またはより良好な結合親和性、選択性および活性化を示す。アゴニストのポリペプチドの小さな部分は、「ペプチド」と呼ぶことができるが、この用語法は、限定的であると解釈されてはならない。
【００７３】
好ましいＴｒｋＢアゴニストは、動態アッセイ、ＥＡＥ動物モデル、ＫＩＲＡアッセイおよび神経細胞生存アッセイを含めた、本明細書に記載するおびただしい数の実験およびアッセイにおいて、ＢＤＮＦおよびＮＴ４と比較して、類似の生物学的特性を示す。
【００７４】
ＴｒｋＢ抗体アゴニストおよびそれらの誘導体
ＴｒｋＢアゴニストは、アゴニスト抗体、それらの断片、変異体および誘導体を包含する。適切なアゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対して選択的であり、天然に存在するＮＴ４およびＢＤＮＦのポリペプチドに類似するまたはそれより大きな親和性で結合する。しかし、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、抗体の循環半減期が長いことから、結合親和性の重大性は低下する。抗体３８Ｂ８の結合親和性は、４６±１０ｎＭであると決定された（上記および実施例４を参照されたい）。好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体は、実施例４に記載する特定のアッセイ条件を使用する場合、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、１００ｐＭ未満またはさらに１０ｐＭ未満のＫｄを有する。
【００７５】
好ましいＴｒｋＢアゴニストはまた、結合アッセイ、ＥＡＥ動物モデル、ＫＩＲＡアッセイおよび神経細胞生存アッセイを含めた、本明細書に記載するおびただしい数の実験およびアッセイにおいて、抗体３８Ｂ８（および天然に存在するアゴニスト）と比較して、類似の生物学的特性を示す。例えば、好ましいＴｒｋＢアゴニストは、（表１を含めた）実施例１に記載する神経細胞生存アッセイにおいて、１１ｐＭ未満のＥＣ５０値を示す。好ましいＴｒｋＢアゴニストは、約１ｐＭから約１０ｐＭまで、約０．１ｐＭから約１ｐＭまで、約０．０１ｐＭから約０．１ｐＭまで、またはさらに０．０１ｐＭ未満のＥＣ５０値を有する。例示的なＥＣ５０値は、３８Ｂ８の場合、０．２ｐＭであり、３６Ｄ１の場合、５ｐＭである。好ましいＴｒｋＢアゴニストはまた、ＫＩＲＡアッセイを使用する場合、抗体３８Ｂ８と比較して、類似の生物学的特性を示す（表１を含めた、実施例１）。好ましいＴｒｋＢアゴニストは、ＫＩＲＡアッセイにおいて、５０ｎＭ未満、好ましくは、約５ｎＭから５０ｎＭ未満まで、約０．５ｎＭから約５ｎＭまで、またはさらに０．５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。例示的なＥＣ５０値は、提供したアッセイ条件下では、約５ｎＭである。
【００７６】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、コンセンサス抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体またはコンジュゲート抗体を包含する。抗体は、該当する場合、いずれかのアイソタイプ（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）であってよい。抗体は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、Ｆｖ抗体、Ｆｃ抗体および一本鎖（ＳｃＦｖ）抗体）を包含する。適切なＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその機能性断片もしくは誘導体は、例えば、モノクローナル抗体アゴニスト３８Ｂ８の場合、本明細書に記載する様式で、ＴｒｋＢに結合し、それを活性化する。ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、抗体断片を包含し、これは、抗体に由来したアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。特に重要なのは、ＣＤＲ領域中のアミノ酸配列等の抗原認識に関与するアミノ酸配列である。
【００７７】
モノクローナル抗体およびマウスのハイブリドーマの方法は、当技術分野では周知である。ヒトの治療のための非ヒト抗体の使用は、免疫抑制薬の併用により許容され得る。そのような薬物は、日常的に投与されて、ＭＳならびにその他の自己免疫性および炎症性の疾患の症状を治療し、または低下させる。免疫調節薬は、当技術分野では既知であり、それには、糖質コルチコイド、細胞分裂阻害剤（例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、メトトレキセート、アザチオプリンおよびメルカプトプリン）、細胞傷害性抗体（例えば、Ｔ細胞受容体抗体およびＩＬ−２に特異的な抗体）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン、ＲＡＰＡＭＵＮＥ、ＰＲＯＧＲＡＦおよびＦＫ５０６）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質（例えば、循環する受容体）、ミコフェノール酸、および外来の抗体または治療用抗原に対する動物の免疫応答を抑制するのに使用されるその他の生物学的薬剤を包含する。
【００７８】
異なる種、例えば、マウスに由来するモノクローナル抗体をヒト化するための方法は、当技術分野では周知である。ヒトの治療のためには、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、最小限の数の非ヒトのアミノ酸配列を含み、したがって、ヒトにおいては、最低限に免疫原性、または非免疫原性となる。好ましいヒト化抗体は、ヒトの免疫系によって異物として認識されない。そのような抗体は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗原結合のために必要なアミノ酸残基を含む、免疫グロブリン鎖のその他の部分）であってよく、抗原結合部位以外の大部分のアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリンに由来する。また、抗原結合が不利な影響を受けない限り、相補性決定領域（ＣＤＲ）の内部のアミノ酸残基を、ヒトに特異的な残基で置換することもできる。
【００７９】
ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をもっぱらまたは実質的に含む抗体である。ヒト抗体はまた、少なくとも１つのヒトの重鎖のポリペプチドもしくは少なくとも１つのヒトの軽鎖のポリペプチド、またはそれらの相当の断片を含む抗体も包含し、別の動物由来の重鎖または軽鎖と場合により組み合わせる。そのような１つの例が、マウスの軽鎖のポリペプチドおよびヒトの重鎖のポリペプチドを含む抗体である。
【００８０】
適切なＴｒｋＢアゴニスト抗体、それらの断片または誘導体は、遺伝子導入動物、（Ｂ細胞を含めた）哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、酵母または細菌中で発現または分泌させることができる。例えば、適切なヒト抗体を、完全にヒトまたは実質的にヒトの免疫グロブリンを産生することが可能な遺伝子導入動物（例えば、マウス）を免疫感作することによって生成することができる。抗体はまた、遺伝子シャッフリング、ファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、リボゾームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、タンパク質断片コンプリメンテーションまたはＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって産生させてもよい。ヒト化抗体およびヒト抗体ならびにそれらの誘導体を設計および産生するための方法は、例えば、米国特許第７００５５０４号、第６８００７３８号、第６４０７２１３号、第６０５４２９７号、第６３３１４１５号および第５７５０３７３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；米国特許第６８３３２６８号、第６２０７４１８号、第６１１４５９８号および第６０７５１８１号（Ａｂｇｅｎｉｘ）；米国特許第６４９８２８５号（Ａｌｅｘｉｏｎ）；米国特許第７０７４５５７号、第５８８５７９３号、第５８３７２４２号、第５７３３７４３号、第５５６５３３２号（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；米国特許第７１１８８７９号、第６９７９５３８号、第６３２６１５５号、第５９９４１２５号、第５８３７５００号（Ｄｙａｘ）；米国特許第６７５３１３６号、第６６６７１５０号、第６３０００６４号、第５５１４５４８号（ＭｏｒｐｈｏＧｅｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）；ならびに６，４６１，８２４、６，２０４，０２３、５，８２１，１２３、５，５９５，８９８、５，５７６，１８４、４，６９８，４２０（Ｘｏｍａ）；米国特許第７０４１８７０号、第６６８０２０９号、第６５００９３１号、第６１１１１６６号、第６０９６３１１号、第６０７１５１７号、第６０６３１１６号（Ｍｅｄａｒｅｘ）；ならびに米国特許第４８１６３９７号（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）に記載されている。ヒト抗体またはヒト化抗体を産生するための方法はまた、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０９−１４；Ｓｈｅｅｔｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６１５７−６１６２；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ）ｐ．７７；ならびにＢｏｅｒｎｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５にも記載されている。
【００８１】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、共有結合または非共有結合によって修飾（例えば、アセチル化、ペグ化（例えば、実施例５を参照されたい）、ファルネシル化、グリコシル化、リン酸化等）することができ、追加の官能基を包含して、結合を調節し、アゴニスト活性を調節し、体内でのポリペプチドの画像診断を可能にし、ポリペプチドの半減期を調節し、または血液脳関門を越えての輸送を調節することができる。ポリペプチドは、アミノ酸置換がポリペプチド（複数のポリペプチド）のＴｒｋＢへの結合にも、アゴニストの活性にも実質的に影響を及ぼさないならば、アミノ酸置換を含んで、修飾（例えば、追加のペグ化部位、グリコシル化部位またはその他の部位の付加）を促進することができる。ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、その他の分子に、直接的にまたは合成リンカーを介して連結させることができる。
【００８２】
適切な抗体断片または誘導体は、本明細書および引用する参照文献に記載されているように、ＴｒｋＢへの結合およびその活性化を媒介するアミノ酸残基を含む。抗体の特異性は、主として、軽鎖および重鎖のＮ−末端の付近に位置する相補性決定領域（ＣＤＲ）または高頻度可変ループとして知られる、６つの小さなループ状領域中の残基によって決定される。軽鎖中のＣＤＲは、一般に、アミノ酸残基の２４と３４との間（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０〜５６（ＣＤＲ２−Ｌ）および８９〜９７（ＣＤＲ３−Ｌ）にある。重鎖中のＣＤＲは、一般に、アミノ酸残基の３１と３５ｂとの間（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０〜６５（ＣＤＲ２−Ｈ）および９５〜１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）にある。いくつかのＣＤＲの長さは、その他のＣＤＲよりも可変である。ＣＤＲ１−Ｌは、長さが約１０〜１７残基相当変動し、一方、ＣＤＲ３−Ｈは、長さが約４〜２６残基相当変動する。その他のＣＤＲは、かなり標準的な長さを有する。Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら（１９９５）ＦＡＳＥＢ．Ｊ．１３３−３９。本発明において使用するための好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体断片は、ＣＤＲからまたはＣＤＲの内部の重鎖および／もしくは軽鎖のドメイン由来のアミノ酸残基を含む。
【００８３】
本発明と共に使用するための抗体は、上記に記載し、当技術分野で既知である保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する、天然に存在するアミノ酸配列の変異体を包含する。
【００８４】
好ましいＴｒｋＢアゴニスト抗体、それらの断片または誘導体は、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと比較して、類似またはより良好な結合親和性、選択性および活性化能を示す。アゴニストのポリペプチドの小さな部分は、「ペプチド」と呼ぶことができるが、この用語法は、限定的であると解釈されてはならない。
【００８５】
ＴｒｋＢアゴニストの製剤
ＴｒｋＢアゴニストは、多発性硬化症等の中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫疾患の治療用の医薬品の製造において使用することができる。このようにして、ＴｒｋＢアゴニストを含む組成物を使用して、本明細書で定義する（ヒト患者を含めた）哺乳動物における疾患を治療することができる。ＴｒｋＢアゴニストの組成物は、適切な薬学的に許容できる賦形剤をさらに含むことができ、これらの賦形剤は、当技術分野では既知である。一般に、ＴｒｋＢアゴニストの組成物を、（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内等の）注射による投与のために製剤化するが、その他の投与形態も使用してよい。ＴｒｋＢアゴニストは、水性、または植物油もしくはその他の類似の油、合成の脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルやポリエチレングリコール等の非水性の溶媒中に、それらを、所望により、可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤等の従来の添加剤と共に、溶解、懸濁または乳化させることによって、注射のための調製物に製剤化することができる。
【００８６】
適切な担体、希釈剤および賦形剤は、当技術分野では周知であり、炭水化物、ろう、水に可溶性および／または膨潤性のポリマー、親水性または疎水性の材料、ゼラチン、油、溶媒、水ならびにその他等の材料を包含する。使用する具体的な担体、希釈剤または賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段および目的によって異なる。一般に、安全な溶媒は、水等の無毒性の水性溶媒および水に可溶性または混和性であるその他の無毒性溶媒である。適切な水性溶媒は、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）等、およびそれらの混合物を包含する。製剤はまた、１つまたは複数の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、矯臭剤、矯味剤およびその他の既知の添加剤を含めて、薬物（すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物）を、洗練された形で提供し、または薬学的な製品（すなわち、医薬品）の製造を支援することができる。製剤のうちのいくつかは、リポソーム等の担体を含めることができる。リポソームの調製物には、これらに限定されないが、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多層ベシクルおよび単層ベシクルがある。非経口および経口の薬物送達のための賦形剤および製剤が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）に記載されている。
【００８７】
投与および投与量
本明細書に例示する投与スケジュールおよび治療用量は、動物の体重、ＴｒｋＢアゴニストの血液中の半減期およびＴｒｋＢアゴニストの親和性等の要因に基づいた。好ましい投与スケジュールおよび用量は、投与と投与の間に、体内に治療量のＴｒｋＢアゴニストを維持する。（天然に存在するＴｒｋＢアゴニストを含めた）ＮＴの有効用量の範囲が、本明細書、Ｄａｖｉｅｓら（１９９３）およびその他の参照文献に例示されている。アゴニスト抗体の有効用量の範囲を、本明細書に例示し（例えば、ＥＡＥ動物の場合、１〜１０ｍｇ／ｋｇ）、類似のアゴニスト抗体の最適用量を決定するための開始点を提供する。
【００８８】
本発明の裏付けとして実施した実験によって実証されたように（例えば、図１Ｂ、３および４を参照されたい）、疾患の経過の早期における「パルス治療」が、動物における病的状態を低下させるのに十分であるようである。治療に効力をもたせるために、ＴｒｋＢアゴニストを継続して投与する必要がない場合がある。
【００８９】
具体的な投与計画、すなわち、用量、時期および反復は、治療しようとするヒトまたは動物の年齢、状態および体重によって異なる。最初の投与計画は、動物実験から外挿することができる。ＴｒｋＢアゴニストの投与の時期／頻度は、適用に際して、特定のＴｒｋＢアゴニストの循環半減期（または神経細胞組織中の半減期）、血液脳関門を通過するアゴニストの量、細胞中のアゴニストの半減期、毒性および副作用に基づかなければならない。
【００９０】
本研究では、ＴｒｋＢアゴニストの投与を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により実施したが；その他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）も有効であることが予想される。頭蓋内もしくは脊髄内への投与（またはＣＮＳのその他の組織への投与）も有効である可能性がある。その他の投与経路は、特定のＴｒｋＢアゴニスト、その被覆、コンジュゲーションまたは特定の生物学的特性に応じて、適切である場合がある（例えば、経口、舌下、骨膜内、粘膜、経皮、関節内、膣、肛門、尿道内、経鼻、経耳、吸入による、送気、カテーテルによる、ボーラスとして、ステントまたはその他の埋込み型の装置の上、塞栓症用の組成物中、静脈内点滴中、パッチまたは溶解性薄膜の上等）。
【００９１】
ＴｒｋＢアゴニストを、好ましくは、適切な末梢経路を介して投与する。それにもかかわらず、数パーセントのアゴニストは、血液脳関門を横切り、中枢神経系細胞に送達され得ることを理解されたい。場合によっては、末梢から投与され、ＣＮＳに接近するＴｒｋＢアゴニストの量は、少量である（１％未満に過ぎない）。
【００９２】
本発明の特色は、ＴｒｋＢアゴニストの自己免疫疾患に罹患している哺乳動物対象への直接的な投与である。「直接的な」は、ＴｒｋＢアゴニストのポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの発現を導くことが可能なポリヌクレオチドを、標準的な接種経路によって動物に送達することを意味する。ＴｒｋＢアゴニストは、糖質コルチコイド等の免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤（例えば、アルキル化剤、抗代謝剤、メトトレキセート、アザチオプリンおよびメルカプトプリン）、細胞傷害性抗体（例えば、Ｔ細胞受容体抗体およびＩＬ−２に特異的な抗体）、イムノフィリンに作用する薬物（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ラパマイシン）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、オピオイド、ＴＮＦ結合性タンパク質（例えば、循環する受容体）、ミコフェノール酸、および外来の抗体または治療用抗原に対する動物の免疫応答を抑制するのに使用されるその他の生物学的薬剤を含めた、その他の薬学的な物質と組み合わせて動物に送達することができる。
【００９３】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストを上回る利点は、抗体が、循環するタンパク質−リガンドと比較して、比較的長い循環半減期を有する傾向を示す点である。例えば、天然に存在するアゴニストは、毎日投与する必要がある場合があるが、抗体は、週１回の投与を必要とするに過ぎない場合がある。別の利点は、抗体が、より高い結合親和性を有する傾向を示し、当該抗体のそれらの抗原に対する選択性が、細胞の受容体のそれらのタンパク質リガンドに対する選択性よりも高い点である。
【００９４】
ＴｒｋＢアゴニストを用いる治療は、多発性硬化症および関連する障害のための従来の治療と組み合わせることができる。多発性硬化症の治療および管理のための従来の薬物には、これらに限定されないが、ＡＢＣ（すなわち、Ａｖｏｎｅｘ−Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ／Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ−Ｃｏｐａｘｏｎｅ）治療（例えば、インターフェロンベータ１ａ（ＡＶＯＮＥＸ、ＲＥＢＩＦ）、インターフェロンベータ１ｂ（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ、ＢＥＴＡＦＥＲＯＮ）および酢酸グラチラマー（ＣＯＰＡＸＯＮＥ））；化学療法剤（例えば、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、アザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ、ＮＥＯＳＡＲ）、シクロスポリン（ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ）、メトトレキセートおよびクラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ））；副腎皮質ステロイドおよび副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（例えば、メチルプレドニゾロン（ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ、ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ）、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ）、プレドニゾロン（ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ）、デキサメタゾン（ＭＥＤＲＯＬ、ＤＥＣＡＤＲＯＮ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびコルチコトロピン（ＡＣＴＨＡＲ））；疼痛管理（感覚異常）（例えば、カルバマゼピン（ＴＥＧＲＥＴＯＬ、ＥＰＩＴＯＬ、ＡＴＲＥＴＯＬ、ＣＡＲＢＡＴＲＯＬ）、ガバペンチン（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ）、トピラメート（ＴＯＰＡＭＡＸ）、ゾニサミド（ＺＯＮＥＧＲＡＮ）、フェニトイン（ＤＩＬＡＮＴＩＮ）、デシプラミン（ＮＯＲＰＲＡＭＩＮ）、アミトリプチリン（ＥＬＡＶＩＬ）、イミプラミン（ＴＯＦＲＡＮＩＬ、ＩＭＡＶＡＴＥ、ＪＡＮＩＭＩＮＥ）、ドキセピン（ＳＩＮＥＱＵＡＮ、ＡＤＡＰＩＮ、ＴＲＩＡＤＡＰＩＮ、ＺＯＮＡＬＯＮ）、プロトリプチリン（ＶＩＶＡＣＴＩＬ）、カンナビスおよび合成カンナビノイド（ＭＡＲＩＮＯＬ）、ペントキシフィリン（ＴＲＥＮＴＡＬ）、イブプロフェン（ＮＥＵＲＯＦＥＮ）、アスピリン、アセトアミノフェンおよびヒドロキシジン（ＡＴＡＲＡＸ））；ならびにその他の治療（例えば、ナタリズマブ（ＡＮＴＥＧＲＥＮ）、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ）、４−アミノピリジン（ＦＡＭＰＲＩＤＩＮＥ）、３，４ ジアミノピリジン、エリプロディル、ＩＶイムノグロビン（ＩＶ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）（ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ、ＧＡＭＭＡＲ−ＩＶ、ＧＡＭＩＭＵＮＥ Ｎ、ＩＶＥＥＧＡＭ、ＰＡＮＧＬＯＢＵＬＩＮ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮ、ＶＥＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ）、プレガバリンおよびジコノチド）がある。
【００９５】
キットオブパーツ
本発明はまた、本発明の方法を実行するための、キットオブパーツ（キット）も提供する。キットは、適切に単離および滅菌したＴｒｋＢアゴニストならびに本明細書に記載する本発明の方法のいずれかによる使用のための指示を包含する。一般に、これらの指示は、ＴｒｋＢアゴニストの投与方法の説明を含む。キットは、治療を必要とする動物を同定するためおよび治療の有効性をモニターまたは測定するための指示をさらに含むこともできる。指示は、一般に、用量、投与スケジュール（投与頻度）および投与経路に関連する情報を包含する。キット中の指示は、書面で供給しても、またはデータファイルもしくはスプレッドシートの形態として機械／コンピュータが読取り可能にして供給してもよい。
【００９６】
キットはまた、シリンジ、針、カテーテル、吸入器、ポンプ、アルコール消毒綿、ガーゼ、ＣＮＳの生検用の器具、組織学的な抗体および染色等を含めた、ＴｒｋＢアゴニストを投与するための器具を含むこともできる。キットの構成成分は、必要に応じて滅菌する。キットはまた、これらに限定されないが、ＧＡおよびデキサメタゾン等の免疫抑制剤を含めた、追加の医薬物質を提供することもできる。キットは、日付印、不正開封防止包装、および無線ＩＣ（ＲＦＩＤ）タグまたはその他の商品管理機能を含んでよい。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例を、本発明をさらに例証するために提供する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の追加の態様が明らかとなるであろう。
【００９８】
（実施例１）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の生成およびスクリーニング
モノクローナル抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体を生成するための免疫感作
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、８μｇのヒトＴｒｋＢ細胞外ドメインを、抗原として規則的なスケジュールで５回注射した。ヒス−タグ化ヒトＴｒｋＢ細胞外ドメイン（残基３１〜４３０）を、２９３細胞中で、ベクターｐＴｒｉＥｘ−２ Ｈｙｇｒｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ製、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して発現させた。ＴｒｋＢ細胞外ドメインは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して製造者の指示により精製した（Ｑｉａｇｅｎ製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）。最初の４回の注射については、抗原を、ヒトＴｒｋＢをＲＩＢＩアジュバントシステムおよびミョウバンと混合することによって調製した。全量８μｇの抗原を、首筋、足パッドへの注射およびＩＰによって、約３日毎に１１日にわたって投与した。第１３日に、マウスを安楽死させ、脾臓を取り出した。リンパ球を、８６５３細胞と融合させて、ハイブリドーマのクローンを作製した。クローンを増殖させ、次いでヒトおよびラットの両方のＴｒｋＢのＥＬＩＳＡを用いるＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって、抗ＴｒｋＢ陽性として選択した。
【００９９】
ＥＬＩＳＡによる抗ＴｒｋＢ抗体のスクリーニング：
増殖中のハイブリドーマのクローンからの上清を、ヒトおよびラットの両方のＴｒｋＢに結合する能力についてスクリーニングした。アッセイは、０．５μｇ／ｍｌのラットまたはヒトのＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質１００μｌを用いて一晩コートした９６ウエルプレートを用いて実施した。過剰な試薬を、ウエルから、各ステップの間に０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳを用いて洗浄した。次いで、プレートを、０．５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いてブロッキングした。上清を、プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＦｃを添加して、ＴｒｋＢに結合しているマウス抗体に結合させた。次いで、テトラメチルベンジジンを、ＨＲＰの基質として添加して、上清中に存在するマウス抗体の量を検出した。反応を停止し、抗体の相対的な量を、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって定量化した。５０個の抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、陽性を示した。これらの抗体のうち、５個をさらに試験し、これらが、アゴニスト活性を有することを示した。以下の表２を参照されたい。
【０１００】
ＫＩＲＡアッセイ：
このアッセイを使用して、ＥＬＩＳＡにおいて受容体チロシンキナーゼの活性化を誘発する能力について陽性であることが見出された抗体を、ヒトＴｒｋＢについてスクリーニングした。Ｓａｄｉｃｋら（１９９７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３４：３５４−６１。ｇＤタグ化ヒトＴｒｋＢをトランスフェクトした安定な細胞系統を活用して、ハイブリドーマのクローンから精製したマウス抗体を、天然のリガンドであるＢＤＮＦおよびＮＴ−４／５の場合に見られる活性化に類似する、細胞表面上の受容体を活性化する能力について試験した。天然のリガンドは、ＴｒｋＢ受容体のキナーゼドメインの自己リン酸化を誘発した。細胞を、抗体の種々の濃度に暴露した後、溶解させ、ＥＬＩＳＡを実施して、ＴｒｋＢ受容体のリン酸化を検出した。ＥＣ５０（以下の表２および図１０に示す）を、それぞれの推定上のＴｒｋＢアゴニストについて決定し、天然のリガンドであるＮＴ−４／５のＥＣ５０と比較した。
【０１０１】
Ｅ１５の結節神経細胞生存アッセイ：
Ｅ１５胚から得た下神経節の神経細胞を、ＢＤＮＦにより支持し、それによって、神経栄養因子の飽和濃度では、生存は、培養４８時間まで、１００％に近かった。ＢＤＮＦの非存在下では、５％未満の神経細胞が、４８時間まで生存した。したがって、Ｅ１５の結節神経細胞の生存は、抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性を評価するための敏感なアッセイであり、すなわち、アゴニスト抗体は、Ｅ１５の結節神経細胞の生存を促す。
【０１０２】
時期を定めて交尾させ、妊娠させたＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス、雌を、ＣＯ２の吸入により安楽死させた。子宮角を取り出し、胎生期Ｅ１５の胚を抽出した。下神経節を、解体し、次いで、トリプシン処理し、機械的に解離させ、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンを用いてコートした９６ウエルプレート中で、規定された無血清培地中に、１ウエル当たり２００〜３００個の細胞密度で蒔いた。抗ＴｒｋＢ抗体のアゴニスト活性を、ヒトＢＤＮＦを基準にして、用量−応答に関して、三つ組みで評価した。培養４８時間後、細胞を、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ液体取扱いワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製）上で実施する自動化された免疫細胞化学プロトコールに供した。プロトコールは、固定化（４％ホルムアルデヒド、５％スクロース、ＰＢＳ）、透過処理（ＰＢＳ中の０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、非特異的結合部位のブロッキング（５％正常ヤギ血清、０．１％ＢＳＡ、ＰＢＳ）、ならびに神経細胞を検出するための一次抗体および二次抗体を用いた逐次的なインキュベーションを包含した。確立された神経細胞の表現型マーカーであるタンパク質遺伝子産物９．５（ＰＧＰ９．５、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）に対するウサギポリクローナル抗体を、一次抗体として使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）を、二次試薬として、核染色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）と共に使用して、培養物中に存在する全ての細胞核を標識した。画像収集および画像解析を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１／ＧｅｎＩＩ Ｉｍａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）上で実施した。画像を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２のための２つの波長において自動的に収集し、核染色を基準点として使用した。これは、核染色は、このＩｍａｇｅｒの、画像に基づいた自動焦点系に対して、全てのウエル中に存在するからである。適切な対象および１ウエル当たりの撮像部位数を選択して、各ウエルの全表面を網羅した。画像解析を自動化して、培養４８時間後に、各ウエル中に存在する神経細胞の数を、抗ＰＧＰ９．５抗体を用いる、神経細胞に特異的な染色に基づいて計数した。画像の注意深い閾値化および形態学の適用および蛍光強度に基づいた選択性フィルターによって、１ウエル当たりの神経細胞の正確な数値を得た。ＥＣ５０（以下の表１および図８に示す）を、それぞれの推定上のＴｒｋＢアゴニスト抗体について決定し、天然のリガンドのＥＣ５０と比較した。
【０１０３】
以下の表は、５つの同定した抗ＴｒｋＢ抗体、ならびにマウス神経細胞の生存に対するそれらの活性およびヒトＴｒｋＢに対するリン酸化活性を示す。
【０１０４】
【表１】
【０１０５】
抗ＴｒｋＢアゴニスト抗体のマウスへの頭蓋内注射：
退役させたＣ５７Ｂ６繁殖用マウス、雄（８〜１２月齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ施設）から得、温度／湿度を制御した環境中、１２時間の明／暗サイクルで、飼料および水に自由に接近させて、注射まで少なくとも５日間順応させた。各マウスを、イソフルランを用いて麻酔し、頭蓋骨上の体毛のセクションを刈り込んだ。マウスを、定位固定用外科機器（Ｋｏｐｆモデル９００）上に固定し、麻酔し、中位に設定した電気加熱用パッドを用いて暖かく保った。Ｂｅｔａｄｉｎｅを、頭蓋骨のせん毛した部分上に擦り込んで、当該領域を滅菌した。頭蓋上、耳の直後から開始して目に向けて、長さ約１ｃｍと小さく、正中長軸方向に切開した。頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨表面の直径約１ｃｍの円形部分を、綿棒を用いて浄化して、いずれの結合組織も除去した。表面は、３０％過酸化水素中に浸漬した綿棒を用いて浄化して、十字縫合を露出させた。ドリルの先端部をプローブとして使用して頭蓋骨の深さを測定して、ドリルで穴を開ける前に頭蓋が水平であることを確実にするために、頭蓋を水平方向および垂直方向に加減した。０．５ｍｍ外側に比較して０．５ｍｍ内側から、および０．５ｍｍ後側に比較して０．５ｍｍ前側からの深さの偏位（十字縫合において、ゼロとする）を、±０．０５ｍｍ以内の差に最小化した。マウスの脳の図譜（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｋ．Ｂ．Ｊ．およびＰａｘｉｎｏｓ，Ｇ．、Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９７）によれば、外側視床下部内への単回注射の座標は、以下のごとくである：十字縫合から１．３０ｍｍ後側；正中線から−０．５ｍｍ；深さ、（十字縫合において）頭蓋骨表面から５．７０ｍｍ。小さな穴を、頭蓋骨を通して、脳との接触を回避しながらドリルで開けた。ドリルを、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（モデル８４８５１）に取り付けた斜めになった２６ゲージ針で置き換え、これを、同一の座標に戻した。２μｌの化合物を、外側視床下部内に、２分にわたって徐々に注射した。針を、注射後３０秒間この位置に維持し、次いで、１ｍｍ上昇させた。さらなる３０秒後に、針を、さらに１ｍｍ上昇させた。３０秒後には、針を、完全に取り出した。次いで、切開を、閉鎖して、２〜９ｍｍの創傷クリップ（Ａｕｔｏｃｌｉｐ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製）を用いて一緒に保持した。注射は、第０日に実施した。体重および試料の摂取を第１５日まで毎日モニターした。
【０１０６】
表１（上記）に示すように、抗体３８Ｂ８および抗体３６Ｄ１の特定の用量における頭蓋内注射は、マウスにおいて、体重および飼料の摂取を顕著に減少させた。特定の用量で投与した対照のＩｇＧ抗体および２３Ｂ８は、飼料の摂取に対しても、体重に対しても、いずれも顕著に影響を及ぼすことはなかった。抗体３８Ｂ８を産生するマウスハイブリドーマ株は、２００７年１１月２１日、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州、２０１１０−２２０９に寄託され、これには、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６が割り当てられた。
【０１０７】
（実施例２）
ＴｒｋＢアゴニストの同定
ＴｒｋＢアゴニスト（抗体等）は、以下の方法のうちの１つまたは複数を含めた、当技術分野で認識されている方法を使用して同定することができる。例えば、米国特許第５７６６８６３号および第５８９１６５０号に記載されているキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを使用することができる。このＥＬＩＳＡ型のアッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ、例えば、Ｔｒｋ受容体）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することにより、キナーゼ活性化の定性的または定量的な測定に適しており、選択したｒＰＴＫの有望なアゴニストまたはアンタゴニストの同定および特徴付けにも適している。アッセイの第１段階では、キナーゼ受容体、本件では、ＴｒｋＢ受容体のキナーゼドメインのリン酸化が関与し、当該受容体は、真核細胞の細胞膜中に存在する。受容体は、内因性の受容体もしくは当該受容体をコードする核酸であっても、または受容体構築物を細胞中に形質転換してもよい。典型的には、第１の固相（例えば、第１アッセイのプレートのウエル）を、そのような細胞の実質的に均一な集団（通常、哺乳動物細胞系統）を用いてコートし、それによって、当該細胞を固相に接着させる。しばしば、細胞は、接着性であり、したがって、第１の固相に自然に接着する。「受容体構築物」を使用する場合、これは通常、キナーゼ受容体とｆｌａｇポリペプチドとの融合体を含む。ｆｌａｇポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において、捕捉剤、しばしば、捕捉抗体によって認識される。次いで、候補アゴニスト等の分析対象を、接着細胞を有するウエルに添加し、それによって、チロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＢ受容体）を、分析対象に暴露（または接触）させる。このアッセイにより、対象とするチロシンキナーゼ受容体（例えば、ＴｒｋＢ）に対するアゴニストリガンドの同定が可能となる。分析対象に対する暴露に続いて、接着している細胞を、（その中に可溶化用界面活性剤を有する）溶解用緩衝液を使用して可溶化させ、穏やかに撹拌し、それによって、細胞可溶化液を放出させ、これは、細胞可溶化液の濃縮または清澄化の必要性なしで、アッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接供することができる。
【０１０８】
次いで、こうして調製した細胞可溶化液は、アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供する準備ができている。ＥＬＩＳＡ段階の第１のステップとして、第２の固相（通常、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートのウエル）を、チロシンキナーゼ受容体に、または受容体構築物の場合、ｆｌａｇポリペプチドに特異的に結合する捕捉剤（しばしば、捕捉抗体）を用いてコートする。第２の固相のコーティングを実施し、それによって、捕捉剤を第２の固相に接着させる。捕捉剤は、一般的には、モノクローナル抗体であるが、また、本明細書の実施例に記載するように、ポリクローナル抗体またはその他の薬剤も使用してよい。次いで、得られた細胞可溶化液を、接着している捕捉剤に暴露または接触させ、それによって、受容体または受容体構築物を、第２の固相に接着させる（または第２の固相中に捕捉する）。次いで、洗浄ステップを実施し、それにより、未結合の細胞可溶化液を除去して、捕捉した受容体または受容体構築物を残す。次いで、接着しているまたは捕捉した受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗リン酸化チロシン抗体に暴露または接触させる。好ましい実施形態では、抗リン酸化チロシン抗体を、非放射性の発色試薬の色の変化を触媒する酵素に（直接的または間接的に）コンジュゲートさせる。したがって、受容体のリン酸化を、それに続く試薬の色の変化によって測定することができる。酵素を、抗リン酸化チロシン抗体に直接結合させてもよく、またはコンジュゲートする分子（例えば、ビオチン）を、抗リン酸化チロシン抗体にコンジュゲートさせてもよく、それに続いて、酵素を、コンジュゲートする分子を介して、抗リン酸化チロシン抗体に結合させることができる。最後に、抗リン酸化チロシン抗体の、捕捉した受容体または受容体構築物に対する結合を、例えば、発色試薬の色の変化によって測定する。
【０１０９】
最初の同定に続いて、候補（例えば、抗ＴｒｋＢモノクローナル抗体）のアゴニスト活性を、標的とする生物学的活性を試験することが知られているバイオアッセイによりさらに確認および精密化することができる。例えば、ＴｒｋＢをアゴナイズする候補の能力を、完全長のＴｒｋＢをトランスフェクトしたＰＣ１２細胞を使用する、ＰＣ１２神経突起伸長アッセイにおいて試験することができる（Ｊｉａｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．８：３６５−７０、１９９６）。このアッセイは、神経突起の伸長過程を、適切なリガンドによる刺激に対して応答するラット褐色細胞腫細胞（ＰＣ１２）によって測定する。これらの細胞は、内因性のＴｒｋＡを発現し、したがって、ＮＧＦに対して応答性である。しかし、これらの細胞は、内因性のＴｒｋＢを発現せず、したがって、ＴｒｋＢアゴニストに対する応答を惹起するために、ＴｒｋＢ発現構築物をトランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を候補と共にインキュベートした後、神経突起の伸長を測定し、例えば、当該細胞の直径の２倍超の神経突起を有する細胞を計数する。トランスフェクトしたＰＣ１２細胞において神経突起の伸長を刺激する候補（抗ＴｒｋＢ抗体等）は、ＴｒｋＢアゴニスト活性を示す。
【０１１０】
ＴｒｋＢの活性化はまた、胚の発達の特異的な段階における種々の特異的な神経細胞を使用することによっても決定することができる。適切に選択した神経細胞の生存は、ＴｒｋＢの活性化に依存し得、したがって、これらの神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生存を追跡することによって、ＴｒｋＢの活性化を決定することが可能である。適切な神経細胞の一次培養物へ候補を添加すると、当該候補が、ＴｒｋＢを活性化する場合には、これらの神経細胞を少なくとも数日の期間にわたって生存させる。これによって、候補（抗ＴｒｋＢ抗体等）の、ＴｒｋＢを活性化する能力の決定が可能になる。この型のアッセイの１つの例では、マウスＥ１５胚由来の下神経節を解体し、解離させ、得られた神経細胞を、組織培養皿中に低い密度で蒔く。次いで、候補の抗体を培地に添加し、プレートを２４〜４８時間インキュベートする。この時間の後、神経細胞の生存を、多様な方法のいずれかによって査定する。アゴニストを投与した試料は、典型的には、対照の抗体を投与した試料を上回る生存率の増加を示し、これによって、アゴニストの存在の決定が可能となる。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎら（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１８（３）：９８９−１００１を参照されたい。
【０１１１】
ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢを自然にまたはＴｒｋＢをコードするＤＮＡをトランスフェクトした後にのいずれかの場合発現する多様な細胞型における下流のシグナル伝達を活性化する能力によって同定することができる。このＴｒｋＢは、ヒトまたはその他の哺乳動物（げっ歯類もしくは霊長類等）のＴｒｋＢであってよい。下流のシグナル伝達カスケードは、タンパク質に関しては、タンパク質の発現レベルもしくはタンパク質のリン酸化レベル、または細胞に関しては、代謝状態もしくは増殖状態の変化（本明細書に記載するように、神経細胞の生存および／もしくは神経節の伸長を包含する）等、ＴｒｋＢ発現細胞の多様な生化学的または生理学的なパラメータの変化によって検出することができる。関連する生化学的または生理学的なパラメータを検出する方法は、当技術分野では既知である。
【０１１２】
（実施例３）
抗体の結合親和性の決定
ＴｒｋＢに対する抗体の結合親和性の決定は、抗体の単機能性のＦａｂ断片の結合親和性を測定することによって実施することができる。単機能性のＦａｂ断片を得るためには、抗体（例えば、ＩｇＧ）を、パパインを用いて切断するか、組換えにより発現させるかすることができる。抗体の抗ＴｒｋＢのＦａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ製、Ｐｉｓｃａｗａｙ、ニュージャージ州）によって決定することができる。ＣＭ５チップを、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて、供給者の指示に従って活性化することができる。ヒトＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質（「ｈＴｒｋＢ」）（またはラットＴｒｋＢ等のいずれかのその他のＴｒｋＢ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に希釈して、活性化したチップの上に、０．０００５ｍｇ／ｍｌの濃度で注入することができる。個々のチップの経路にわたり可変のフロー時間を使用して、２つの範囲の抗原密度を達成することができる：詳細な動態研究のための２００〜４００反応単位（ＲＵ）、およびスクリーニングアッセイのための５００〜１０００ＲＵ。チップを、エタノールアミンを用いてブロッキングすることができる。再生研究から、Ｐｉｅｒｃｅ製溶出用緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）と４Ｍ ＮａＣｌとの混合物（２：１）が、結合したＦａｂを有効に除去し、一方、ｈＴｒｋＢ活性を、チップ上に２００回超の注入にわたり維持することが示されている。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２９）を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイのための実行用緩衝液として使用する。精製したＦａｂ試料の段階希釈液（０．１〜１０×推定ＫＤ）を、１００μｌ／分で１分間注入し、最長２時間にわたり解離させる。Ｆａｂタンパク質の濃度を、（アミノ酸解析によって決定した）既知の濃度のＦａｂを標準として使用して、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定する。（一般に、２５°Ｃにおいて測定する）動態学的な結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用して、データを、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｒｏｏｓ、Ｈ．Ｆａｇｅｒｓｔａｍ、Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６：９９−１１０）にフィットさせることによって同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）の値を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。
【０１１３】
（実施例４）
Ｂｉａｃｏｒｅにより測定したリガンド／受容体の相互作用の動態解析
一般的な方法：
相互作用解析を、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ製、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して、２５℃において実施した。（受容体を固定化するのに使用する）ＨＢＳ−ＥＰ実行用緩衝液は、Ｂｉａｃｏｒｅから、アミンのカップリング試薬（ＮＨＳ、ＥＤＣ、酢酸塩、ｐＨ４．５およびエタノールアミン）と共に購入した。Ｆｃ融合組換えヒト受容体（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびＰ７５）、ならびに自然のリガンド（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５およびＮＴ３）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入するまたは社内で調製するのいずれかであった。
【０１１４】
受容体の固定化：
受容体（１チップ当たり３つ）を、ＣＭ５センサーチップ上に、低いレベル（典型的には、５００ＲＵまたは４ｆｍｏｌ／ｍｍ２）で固定化し、（１チップ当たり）１つのフローセルは、改変せずに残して、参照表面として供した。標準的なアミンのカップリングのプロトコールを、ＨＢＳ−ＥＰ実行用緩衝液中、５μｌ／分で使用し、このプロトコールには、３つのステップが関与した。手短にいうと、このプロトコールには、３つのステップが関与した。最初に、フローセルを、５０ｍＭ ＮＨＳ中に新たに調製した２００ｍＭ ＥＤＣの混合物を７分間注入して活性化した；このステップは、チップのカルボン酸基を反応性のエステルに変換した。次に、受容体を、ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中で約１０μｇ／ｍＬに希釈し、所望のレベルを達成するまでチップにカップリングさせた。最後に、過剰の反応性エステルを、１Ｍのナトリウムエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を７分間注入してブロッキングした。
【０１１５】
リガンド解析：
リガンド（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５およびＮＴ３）を、実行用緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）中で５倍ずつ段階希釈して、０．０８〜２５０ｎＭに及ぶ濃度を得た。抗体２００．３８Ｂ８（３８Ｂ８）のＦａｂ断片を、０．７から４８０ｎＭまで３倍ずつ希釈した。試料を、１００μｌ／分で３０秒間注入し、最長１０分にわたり解離させた。各結合サイクル後には、受容体表面を、弱酸性のカクテル（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ４．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて再生させた。注入を２回繰り返すことによって、当該アッセイには再現性があることを確認した。動態学的速度定数（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）を、結合のデータを物質輸送モデルに包括的にフィットさせることによって決定し、結合親和性を、それらの比、すなわち、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎから計算した。
【０１１６】
結果：
パネル中の大部分のリガンド／受容体の相互作用は、迅速な、拡散に制限されるｏｎ速度によって特徴付けられ、これらの速度は、Ｂｉａｃｏｒｅの分解能（ｋｏｎ、約１×１０７ １／Ｍ・秒）を超えるものであった。顕著な例外は、ＰｒｏＮＧＦであり、これは、典型的には、緩慢なｏｎ速度を示した。ｏｆｆ速度は、より可変であり、例えば、ＰｒｏＮＧＦまたは成熟ＮＧＦのＴｒｋＡとの相互作用は、非常に緩慢なｏｆｆ速度（Ｔ１／２＞１時間）を有し、一方、ＮＴ３／ＴｒｋＡの相互作用は、数秒以内に減衰した（Ｔ１／２＝９秒）。３８Ｂ８−Ｆａｂ／ＴｒｋＢの相互作用は、二相性のｏｆｆ速度を有し、この場合、最初の相の減衰のみがモデルに適合した。二量体リガンドが、隣接する受容体分子間で、分子相互にｃｉｓ架橋することができないように、受容体の間に（平均的して）十分に広い間隔をあけるために、受容体を、チップ上に低いレベルでコートした。立体的な制約の故に、二量体リガンドが、Ｆｃ融合受容体分子の２つの腕の間で分子内架橋し得る可能性は低い。リガンドに、それらの２つの利用可能な結合部位のうちの１つのみを介して結合するのを強いる条件を促すことによって、親和力の課題が最少化され、我々のデータを単純な１：１の結合モデルにフィットさせることが妥当に感じられる。
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
（実施例５）
ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与により、動物における病的状態が低下する
本発明の裏付けとして実施した実験では、ＴｒｋＢアゴニストの直接的な投与が、ＣＮＳに特異的な自己免疫疾患を有する動物において、病的状態およびＣＮＳ組織の損傷を低下させることが示された（図１Ａおよび１Ｂ）。天然に存在するＴｒｋＢアゴニストであるＮＴ４の組換えの形態を、米国特許出願公開第２００５／０２０９１４８号の記載に従って産生し、ＭＯＧによる誘発後のＣ５７ＢＬ／６マウス、雌に投与した（第０日）。
【０１１９】
動物に、ＮＴ４を、ＭＯＧによる誘発後第１０日から毎日投与した（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）（図１Ａ）。対照動物には、ビヒクルを投与した（ｎ＝８）。動物を、病的状態について、以下のようにスコア化した：０＝正常；１＝尾を引きずる；２＝中等度の後肢の衰弱；３＝中等度に重度の後肢の衰弱（動物は依然として歩行することができるが、困難が伴う）；４＝重度の後肢の衰弱（動物は後肢を動かすことができるが、歩行することはできない）；５＝完全な後肢の麻痺；および６＝死亡。ＮＴ４を用いて治療した動物は、対照動物と比較して、有意に低下した病的状態を示した。この結果から、ＴｒｋＢアゴニストが、慢性ＥＡＥの進行の緩慢化において有効であることが実証された。
【０１２０】
図１Ｂは、ＭＯＧによる誘発後の異なる時期の間に、ＮＴ４を用いて毎日治療した動物の病的状態を示す。動物を、対照であるＩｇＧを用いて（ｎ＝９）、第３日から第９日までＮＴ４を用いて（ｎ＝８）、または第９日から第１５日までＮＴ４を用いて（ｎ＝８）のいずれかで治療した。両方の投与スケジュールが、動物の病的状態を低下させる点において有効であった。より早い時期の間に投与した場合（すなわち、早期の「パルス治療」）、より遅い時期の間に投与した場合と比較して、ＮＴ４によって与えられる保護は、（より良好ではないにしても）少なくとも同等に良好である。これらの結果から、ＴｒｋＢアゴニストを用いた治療を、治療が有効となるように、症状の発症時まで継続する必要がないことが示されている。ＴｒｋＢの活性化は、ＥＡＥの誘発の比較的上流の段階を標的にしている可能性がある。
【０１２１】
（実施例６）
高選択性ＴｒｋＢアゴニスト抗体の同定
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の同定を導いた実験および観察は、実施例１〜４に記載されている。それらの抗体のうちの１つ、すなわち、抗体３８Ｂ８のさらなる特徴付けから、当該抗体は、ＴｒｋＢに対しては極めて選択的であり、一方、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣまたはｐ７５に対しては通常の結合性を示すことが明らかになった（図２）。３８Ｂ８のＦａｂ断片の、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣおよびｐ７５に対する相対的な親和性を、天然に存在するアゴニストであるＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ４の相対的な親和性と比較した。図２中の各パネルは、相対的な結合対時間を示すグラフである。抗体３８Ｂ８は、ＴｒｋＢに対して特異的であり、アッセイしたその他の受容体チロシンキナーゼに対しては顕著な結合を示さなかった。３８Ｂ８は、何らかの交差反応性を示した、天然に存在するアゴニストであるＢＤＮＦおよびＮＴ４よりも、ＴｒｋＢに対して、さらにより選択的であった。予想されたように、ＮＧＦは、ＴｒｋＢに対する結合性はほとんど示さず、ＴｒｋＡおよびｐ７５ニューロトロフィン受容体に優先的に結合した。３８Ｂ８の結合親和性は、４６±１０ｎＭであると決定された。（Ｋｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫｄのデータを含めた）これらのリガンド−受容体の相互作用の動態解析を、実施例４、詳細には、表２に提供する。
【０１２２】
ＢＤＮＦおよびＮＴ４は、ＴｒｋＢに対して、３８Ｂ８抗体アゴニストよりも高い親和性を有するようである。しかし、結合実験は、天然に存在するリガンドの二量体の形態および３８Ｂ８のＦａｂの単量体の形態を用いて実施された。さらに、抗体は、一般に、増殖因子よりも、はるかに長い循環半減期を有し、このことは、抗体が、それらの標的の受容体に対してより低い結合親和性を有するにもかかわらず、有効であることを可能にする。このＴｒｋＢアゴニスト抗体を、さらなる研究に使用した。
【０１２３】
（実施例７）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、自己免疫疾患における病的状態を低下させる点において有効である
動物実験から、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、対照の免疫グロブリンと比較して、ＥＡＥの病的状態に対して有意な保護をもたらすことが示された（図３）。ＭＯＧによる誘発後、マウスを、５ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体（３８Ｂ８、ｎ＝９）または対照のＩｇＧ（ｎ＝９）のいずれかを用いて治療した。これらを、第９日および第１６日に投与した。ＴｒｋＢアゴニスト抗体はまた、ＭＯＧによる誘発１６日後とまで遅れて投与した場合でも、臨床症状が発症した後で投与した場合でも有効であった（図４）。より遅い投与、例えば、誘発１８日後の場合には、病的状態の低下における有効性が低減した（図５Ａ）。より遅い治療後の臨床症状の差は、２要因の分散分析に基づくと有意ではなかった。
【０１２４】
他の動物において、ＭＯＧによる誘発２２日後の酢酸グラチラマー（ＧＡ、ＣＯＰＡＸＯＮＥ、ＴＹＳＡＢＲＩ）の投与は、病的状態の低下において有効であった（図５Ｂ）。これらの結果から、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構が、ＧＡおよびその他の現行のＭＳ薬物の作用機構とは異なることが示唆される。
【０１２５】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体を、ＭＳの治療用の別の現行の薬物であるデキサメタゾンと比較した。図６Ａは、ＴｒｋＢアゴニスト抗体３８Ｂ８（５ｍｇ／ｋｇ、第９日および第１６日に週１回）の投与後、またはデキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）もしくはエタノールビヒクル（対照）の第３日から第１２日までの毎日投与後のいずれかの場合の動物における病的状態を示すグラフを図示する。これらの結果からは、ＴｒｋＢアゴニストの有益な効果は、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの効果に類似することが実証されている。ＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、対照動物と比較して体重が減少する傾向を示した（図６Ｂ）。
【０１２６】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の有益な効果は、用量依存性であった。図７Ａおよび７Ｂに、１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）もしくは５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）の３８Ｂ８投与後の動物の病的状態の差、または５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）および１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）の３８Ｂ８投与後の動物の病的状態の差を示す。これらの結果から、５ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体は、１ｍｇ／ｋｇよりも、病的状態に対するより多くの保護（すなわち、病的状態の低下）をもたらし、一方、１０ｍｇ／ｋｇは、５ｍｇ／ｋｇと比較して、病的状態をさらに低下させることが実証された。保護の増加は、より高い用量においては、それほど顕著ではなく、このことは、ＴｒｋＢアゴニストの追加の投与には、わずかな治療価値しかないことを示唆した。
【０１２７】
（実施例８）
ＴｒｋＢアゴニスト抗体およびＮＴは、培養物中の神経細胞を保護する
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける神経細胞生存アッセイを使用して、ＮＴが、神経細胞の生存を促すことが示されている（Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．ら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ １１５６５−７４）。類似のアッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニスト抗体が、神経細胞に、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で影響を及ぼすことを実証した（実施例１を参照されたい）。対照の（すなわち、神経栄養因子を欠く）培養物においては、事実上全ての神経細胞が、４８時間以内に死滅する。しかし、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４またはＮＧＦの存在下で培養した神経細胞のうちの６０〜８０％が、４８時間にわたり生存する（同上）。
【０１２８】
本発明の裏付けとして実施した実験では、以前の記載に従って、ＴｒｋＢアゴニスト抗体である３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１、３７Ｄ１２および１９Ｈ８の増加する量（例えば、表１を含めた、実施例１を参照されたい）を、神経細胞の培養物に添加した（図８）。いくばくかの変動はあるものの、ＴｒｋＢアゴニスト抗体の増加する量を添加すると、神経細胞の生存が、（３８Ｂ８の場合、１０〜１００ｐＭの範囲においては最大７５％超、および１９Ｈ８の場合、０．１〜１０ｐＭの範囲においては最大１００％超）増加した。神経細胞生存アッセイにおける抗体３８Ｂ８のＥＣ５０値は、０．２ｐＭであった。神経細胞生存アッセイにおける３８Ｂ８、２３Ｂ８、３６Ｄ１および３７Ｄ１２のＥＣ５０値、ならびにヒトＫＩＲＡアッセイにおけるこれらの抗体のＥＣ５０値および動物の体重に対するそれらの効果（認識されている、ＴｒｋＢアゴニストに対する応答）は、実施例１において議論し、その概要を表１に示す。抗体２３Ｂ８は、より高いＥＣ５０値である１１ｐＭを有するが、動物の体重に対して効果を示すことはできなかったことに注目されたい。このことは、１１ｐＭ未満のＥＣ５０値が、ＴｒｋＢアゴニストの生物学的活性のためには必要であることを示唆している。抗体３６Ｄ１は、５ｐＭのＥＣ５０値を有し、動物の体重に対して効果を示した。これらのデータは、ＮＴについて報告されている結果と一致し、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、神経細胞に、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストと一致する様式で影響を及ぼすことを実証している。
【０１２９】
（実施例９）
ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない
（ＧＡおよびデキサメタゾンを含めた）ＭＳの治療用の現行の薬物は、免疫調節物質であり、これらは、免疫応答に関して、免疫抑制性およびその他の効果を示す。ＴｒｋＢアゴニストの治療効果もまた、免疫抑制のレベルのものであるか否かを決定するために、動物を、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）またはビヒクル単独（対照）を用いて治療し、異なるアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭ）の、循環するＭＯＧ（ミエリン）に特異的な抗体のレベルを測定した（図９）。ＴｒｋＢアゴニストによる治療後には、ＭＯＧに特異的な抗体のレベルのいくばくかの変動を観察したが、これは、動物の病的状態の顕著な低下を説明するのに十分であるようには見えなかった。特定の機構を本発明に帰することなく、これらの結果からは、ＴｒｋＢアゴニストは、抗ＭＯＧ抗体の産生を抑制することによって機能するのではなく、したがって、従来の免疫抑制剤として機能するとは思われないことが示唆される。
【０１３０】
ＴｒｋＢアゴニストが、Ｔ細胞およびＢ細胞の、ミエリンによって刺激される能力を阻害するか否かを決定するために、脾細胞増殖アッセイを使用して、ＴｒｋＢアゴニストの存在下で、ＭＯＧの、単離した脾細胞を刺激する能力を測定した。比較のために、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの存在下で、ＭＯＧを用いて脾細胞を刺激した。
【０１３１】
ＭＯＧで誘発した未治療（対照）動物（ｎ＝９）由来の脾臓細胞またはＭＯＧで誘発したＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物（ｎ＝８）由来の脾臓細胞を、ＭＯＧ単独（０）、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８；５０μｌ／ｍｇ）または２つの異なる濃度（１０−８Ｍおよび１０−５Ｍ）のうちの１つにおけるデキサメタゾンと組み合わせたＭＯＧの存在下のいずれかで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて培養した。図１０を参照すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＯＧで刺激されなかった脾細胞と比較した、脾細胞の刺激の種々の量が、ｙ軸上に示されている。
【０１３２】
ＴｒｋＢアゴニスト抗体の存在は、脾細胞刺激に対して、何ら明らかな効果を有さなかった。このことはまた、免疫抑制剤であるデキサメタゾンのより低い濃度の場合にもあてはまった。デキサメタゾンは、１０−５Ｍのより高い濃度では、ＭＯＧによる刺激を妨げた。
【０１３３】
全体的に、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物から得た脾細胞は、ＭＯＧによる刺激に対して、対照治療動物と一致する様式で応答し、このことは、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物は、抗ＭＯＧ性Ｔ細胞および／または抗ＭＯＧ性Ｂ細胞の正常な応答をもたらす能力を保持することを示している。さらに、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物から得た脾細胞も、対照動物から得た脾細胞も、培地中のＴｒｋＢアゴニストの存在に対して同様に応答する。これらの観察から、免疫抑制剤であるデキサメタゾンの作用機構は、ＴｒｋＢアゴニストの作用機構とは異なること、およびＴｒｋＢアゴニストの主要な作用機構は、白血球増殖のレベルにおいてではないことがさらに示唆される。
【０１３４】
（実施例１０）
ＴｒｋＢアゴニストは、炎症性細胞のＣＮＳへの侵入を遮断し、脱髄を低下させる
動物においてＴｒｋＢアゴニストが保護を媒介する機構をよりよく理解するために、組織学的解析を実施した。脊髄の切片を、対照動物およびＴｒｋＢアゴニスト抗体（３８Ｂ８）治療動物から調製し、次いで、ミエリンを染色するためにＬｕｘｏｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅを用いて、かつ細胞体を染色するためにクレシルバイオレットを用いて染色した（図１１）。対照動物では、染色は、ミエリンを発現している神経細胞の背景に対して白血球の侵入および細胞破壊の領域を示した。白血球侵入の低下が、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から調製した切片中には観察された。数匹のＴｒｋＢアゴニスト治療動物は、白血球のＣＮＳへの侵入の証拠を全く示さなかった。
【０１３５】
侵入する細胞の同定を、２つの白血球マーカーであるＴ細胞上に存在するＣＤ３およびマクロファージ上に存在するＣＤ６８に対して特異的な抗体を使用して実施した。図１２は、ＣＤ３抗体を用いた染色の結果を示す。おびただしい数の、染色により明るく強調された領域が、特に、クレシルバイオレットで暗く染色された場所と同一の場所において明らかである。ＴｒｋＢアゴニスト治療マウスから得た脊髄の切片は、顕著に減少した染色を示し、このことから、Ｔ細胞の侵入が、治療動物においてはかなり低下することが示された。脊髄の切片はまた、単核球に伴うＣＤ６８マーカーに特異的な抗体でも染色された（図１３）。対照マウスから調製した切片は、ＴｒｋＢアゴニスト治療マウスからの切片よりも、特に、クレシルバイオレットおよびＣＤ３に特異的な抗体で強力に染色された領域と同一の領域において、より強力に染色された。そのような観察から、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物由来の脊髄組織は、対照動物と比較した場合、Ｔ細胞および単核球の侵入のかなりの低下を示すことが示された。
【０１３６】
脊髄の切片を、Ｌｕｘｏｌ Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅで染色して、脱髄を測定した。対照マウスの脳は、リンパ球の激しい侵入を有する場所に対応して、重度の脱髄の領域を示し（すなわち、図１４中、黒の矢印が示す染色されていない場所）、このような領域は、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療したマウスにおいては明らかではなかった。重度の脱髄および／または神経細胞の死滅の領域は、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物からの切片においては観察されなかった。総合すると、ＣＮＳ組織の切片の組織化学的な染色の結果から、ＴｒｋＢアゴニストによる治療によって、リンパ球および単核球のＣＮＳへの侵入が低下することが実証された。
【０１３７】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストおよび人工的なＴｒｋＢアゴニストの両方が、ＥＡＥの進行を緩慢化させる点において有効である。天然に存在するアゴニストであるＮＴ４およびアゴニスト抗体の両方が、疾患の進行を緩慢化させる点において有効であった。アゴニスト抗体は、ＴｒｋＢに対する最も高い選択性を示し、これを使用して、ＴｒｋＢアゴニストがＥＡＥの進行に影響を及ぼす機構をさらに検討した。ＴｒｋＢアゴニストは、ＥＡＥの症状の発症（通常、これら特定の動物の場合、第１２日または第１３日）の前に投与しても、数日後に投与しても有効であった。ＭＯＧによる誘発１６日後（または症状の発症約４日後）までの投与は、病的状態の低下において有効であった。アゴニストの有益な効果は、用量依存性であり、ＴｒｋＢアゴニストの用量の増加に伴って病的状態が低下する。組織化学的な実験により、ＴｒｋＢアゴニストは、Ｔ細胞および単核球のＣＮＳ組織への侵入を低下させることが示された。ミエリンの染色からは、ＴｒｋＢアゴニスト治療動物における神経細胞に対する損傷の低下が示された。
【０１３８】
アッセイにおいて試験したその他の薬物とは異なり、ＴｒｋＢアゴニストは、主に免疫抑制を介して機能するものではない。このことは、ＴｒｋＢアゴニストが、ＭＯＧに特異的な自己免疫抗体の産生には影響を及ぼさないという観察において証明された。さらに、ＭＯＧにより誘発し、ＴｒｋＢアゴニストを用いて治療した動物から単離した脾細胞は、ＭＯＧによって刺激される能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで保持した。したがって、ＴｒｋＢアゴニストは、ＧＡおよびデキサメタゾン等のその他の化合物の様式とは異なる様式で機能する。
【０１３９】
本明細書に記載する実施例および実施形態は、説明する目的のものに過ぎず、ならびにそれらに照らした種々の改変形態または変形形態が当業者には示唆され、これらは本出願の精神および範囲のうちに含まれることを理解されたい。本明細書に引用する全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの全体が、全ての目的のために、各刊行物、特許および特許出願が個々に、具体的かつ個別に参照によって組み込まれていると示されている場合と同程度に、本明細書によって、参照により組み込まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用。
【請求項２】
自己免疫障害が、実験的自己免疫性脳脊髄炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫障害が、多発性硬化症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＴｒｋＢアゴニストが、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストが、ＮＴ４である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストが、ＢＤＮＦである、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
ＴｒｋＢアゴニストが抗体である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ＴｒｋＢアゴニストが、その抗体断片または誘導体である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された単離モノクローナルＴｒｋＢアゴニスト抗体。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株。
【請求項１】
哺乳動物において中枢神経系に影響を及ぼす自己免疫障害を治療するのに使用する医薬品の製造におけるＴｒｋＢアゴニストの使用。
【請求項２】
自己免疫障害が、実験的自己免疫性脳脊髄炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫障害が、多発性硬化症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＴｒｋＢアゴニストが、天然に存在するＴｒｋＢアゴニストである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストが、ＮＴ４である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
天然に存在するＴｒｋＢアゴニストが、ＢＤＮＦである、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
ＴｒｋＢアゴニストが抗体である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ＴｒｋＢアゴニストが、その抗体断片または誘導体である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株によって産生された単離モノクローナルＴｒｋＢアゴニスト抗体。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８７６６の下に寄託されたハイブリドーマ株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１０−５１３４６１（Ｐ２０１０−５１３４６１Ａ）
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２２６６（Ｐ２００９−５４２２６６）
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８１７９
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０５１２９４１５）ライナット ニューロサイエンス コーポレイション (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４１４５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８１７９
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０５１２９４１５）ライナット ニューロサイエンス コーポレイション (33)
【Ｆターム（参考）】
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