舌上皮由来細胞株ＫＴ−１及びその用途
マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株ＫＴ−１；細胞株ＫＴ−１を含む味覚センサー；及び、細胞株ＫＴ−１の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、味覚センサー、これを利用した味覚センサー等の探索方法に関し、さらに詳細には、マウス舌上皮細胞から樹立された細胞株ＫＴ−１及びその用途に関する。特に、マウス舌上皮細胞より樹立された細胞株ＫＴ−１を味覚センサーとして利用する方法、ならびに細胞株ＫＴ−１を利用して味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
舌上皮細胞を単離・培養する方法は既に報告されている（例えば、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：３６５−３７２（２００２）参照）。しかしながら、舌上皮由来の細胞で味覚レセプターを発現する細胞株や分化状態の異なる細胞集団を含む細胞株については報告されていない。このため、生きた細胞を用いて特定の味応答を再現性良く測定することや、味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築することは非常に困難であった。
【発明の開示】
本発明の第１の目的は、味覚レセプターを発現する細胞及びその形質転換体を提供することである。
本発明の第２の目的は、上記細胞を用いた味覚センサーを提供することである。
本発明の第３の目的は、上記味覚センサーの用途を提供することである。
本発明の第４の目的は、様々な分化段階の細胞を利用して、特定の味細胞への分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質を探索する系を確立することである。
以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための形態
本発明は以下の細胞、味覚センサー、その用途を提供するものである。
１．マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株ＫＴ−１。
２．前記１に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の低血清培地中で長期継代培養して樹立された細胞株ＫＴ−１。
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
３．受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７で寄託されている、前記２に記載の細胞株ＫＴ−１。
４．前記２又は３に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の分化誘導培地中で培養して得られるＫＴ−１細胞。
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
５．味覚レセプターを機能的に発現している、前記４に記載のＫＴ−１細胞。
６．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞を含む味覚センサー。
７．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞を用いて、該味覚レセプターが受容する味物質を識別することを特徴とする細胞株ＫＴ−１の味覚センサーとしての使用。
８．味覚レセプターが甘味レセプター、苦味レセプター、塩味チャネル、又はアミノ酸レセプターである、前記７記載の使用。
９．細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが既知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
１０．前記９記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１の、該味覚レセプターが受容する特定の味を感知する細胞としての使用。
１１．細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが未知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
１２．前記１１記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１を使用して、該未知のリガンドを探索する方法。
１３．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。
１４．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞及び味物質を用いて、該味物質に対する味覚レセプターを探索する方法。
１５．味覚レセプターが塩味チャネルである、前記１４に記載の方法。
本発明の細胞株ＫＴ−１は、マウス舌上皮細胞を単離・培養後、２年半以上継代・維持することにより樹立された細胞である。細胞株ＫＴ−１は、未分化な細胞と味覚レセプターを発現する細胞とが混在するユニークな細胞株であり、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７（寄託日：平成１５年３月２７日）として〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、細胞株ＫＴ−１Ａからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図面である。
図２は、細胞株ＫＴ−１Ａにおける味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す図面である。図中、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図３は、ＫＴ−１Ｃ細胞における味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す図面である。図中、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図４は、成体マウス有郭乳頭におけるインテグリンの発現パターンを示す免疫組織染色像を示す図面である。
図５は、細胞株ＫＴ−１Ｂにおける各インテグリン分子の発現レベルをフローサイトメーターで解析した結果を示す図面である。
図６は、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）で発現する未分化および味蕾特異的に発現する分子について、免疫染色ならびにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面である。
図７は、カルシウムイメージングによるＫＴ−１Ｃ細胞における甘味受容応答の結果を示す図面である。
図８は、ホルモンによる細胞株ＫＴ−１Ｂの塩味チャネルαＥＮａＣ発現の変化を示す図面である。（レーン１：プロゲステロン、レーン２：ヒドロコルチゾン、レーン３：アルドステロン）
図９は、ナトリウムイメージングによるＫＴ−１Ｃ細胞における塩味受容応答の結果を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
１．細胞株ＫＴ−１の樹立方法
１−１．細胞株ＫＴ−１Ａ株の樹立
マウス舌上皮からインテグリンβ１の強発現を指標に細胞を回収し、初代培養後１年間半、以下の培地により維持・継代（１−２週間に一度）した。
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地Ａ
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．５ ％
得られた細胞株をＫＴ−１Ａ株とした。
１−２．細胞株ＫＴ−１Ｂ株の樹立
継代のために細胞株ＫＴ−１Ａが付着しているプラスティックディッシュを３回ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．０５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡを加えて３７℃で５−１０分間反応させた。ディッシュより剥がれてきた細胞を、トリプシン活性を中和してから遠心により回収し、新たな培地で懸濁して、コラーゲンタイプＩＶ（３μｇ／ｍｌ）とマトリジェル（１０μｌ／ｍｌ）でコートしたプラスティックディッシュに播いた。そして、以下のより血清濃度の低い（０．２５％）培地にて、３−４日間に一度の継代を１年半以上行い続けた。
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地Ｂ
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
得られた細胞株をＫＴ−１Ｂ株とした。細胞株ＫＴ−１Ｂ株はＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託されている。
１−３．細胞株ＫＴ−１ＢからＫＴ−１Ｃ細胞への分化誘導
細胞株ＫＴ−１Ｂを以下の分化誘導培地で３〜７日間培養して、細胞株ＫＴ−１Ｂを更に分化させてＫＴ−１Ｃ細胞を得た。
分化誘導培地：ＭＣＤＢ基本培地Ｃ
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
２−１．ＲＴ−ＰＣＲによる細胞株ＫＴ−１Ａにおける味覚関連遺伝子のｍＲＮＡ発現の確認
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１ＡのｃＤＮＡを、細胞株ＫＴ−１Ａからｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により得た。ＲＮＡの抽出にはＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることが簡便である。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２μｇを用いて、逆転写反応を行うには、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いると簡便に行うことができる。
このｃＤＮＡを鋳型として、あらかじめ設計しておいた各味覚レセプター及び味蕾関連分子に特異的なプライマー（各０．２μＭ）（表１）を用い、２．５ユニットのＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５５−５８℃で１分、７２℃で２分 を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。各プライマーの配列は、表１に示した（但し、配列番号３１〜３４のプライマーは、後述する実施例２−２で使用した。）。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
結果を図１に示す。細胞株ＫＴ−１Ａでは、味覚レセプターをコードするＴ１ｒ１、Ｔ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９や塩味の受容に関わるαＥＮａＣ（アミロライド感受性ナトリウムチャンネルαサブユニット）、Ｇタンパク質であるＧαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇγ１３、ならびに、味蕾およびその周囲で特異的に発現するＳＴＧ、サイトケラチン８、Ｐａｔｃｈｅｄ１（図面においてＰｔｃ１又はｐａｔｃｈｅｄ−１と表記することもある）の発現が確認されたが、Ｔ１ｒ２、Ｔ１ｒ３及びｇｕｓｔｄｕｃｉｎは発現していなかった。以上より、細胞株ＫＴ−１Ａは、未分化な細胞から味覚レセプターを発現する細胞まで、様々な分化段階の細胞から構成されていることがわかる。
２−２．細胞株ＫＴ−１Ａ及びＫＴ−１Ｃ細胞における味覚レセプターｍＲＮＡの検出
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ａ及びＫＴ−１Ｃ細胞からＴｒｉｚｏｌ溶液によりそれぞれのＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ ２μｇ用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを４０μｌスケールで合成した。このｃＤＮＡ溶液１μｌを鋳型に各味覚レセプター（Ｔ１ｒ１、Ｔ１ｒ３、Ｔ１ｒ２及びサイトケラチン８）に特異的なプライマー（Ｔ１ｒ１：配列番号３１及び３２、Ｔ１ｒ３：配列番号３３及び３４、Ｔ１ｒ２：配列番号３及び４、サイトケラチン８：配列番号２７及び２８）（各０．２μＭ）を用いて２．５ユニットＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５８−６８℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
図２及び３に、ＲＴ−ＰＣＲ法による細胞株ＫＴ−１Ａ（図２）及びＫＴ−１Ｃ細胞（図３）における味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す。各図において、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図２と図３とを対比すると細胞株ＫＴ−１Ａでは発現していない甘味レセプターＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３がＫＴ−１Ｃ細胞では発現している。すなわち、ＫＴ−１Ｃ細胞にはＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３を発現する細胞が多く含まれている。したがって、細胞株ＫＴ−１ＡとＫＴ−１Ｃ細胞とは、Ｔ１ｒ２及びＴ１ｒ３の発現において区別することができる。
また、前記マーカー分子及びその他のマーカー分子の発現結果を、以下の表２に示す。
表中の記号の意味は以下のとおりである。
＋＋：強く発現している、＋：発現している、−：発現していない。
２−３．有郭乳頭の免疫組織染色
（実験方法）
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの舌を摘出後、有郭乳頭の凍結切片（１０μｍ）を載せたスライドを、４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で固定した後、様々な抗インテグリン抗体と４℃で一晩反応させた後、蛍光標識２次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギもしくは抗マウスＩｇＧならびにＣｙ３標識抗ハムスターもしくはラットＩｇＧ）で染色した。
（実験結果）
図４は、成体マウス有郭乳頭のインテグリン発現パターンを示す免疫組織染色像である。図４に示すように、マウスの有郭乳頭では、インテグリンβ４とインテグリンα６とが上皮基底部に限局して強発現していた。一方、インテグリンβ１は基底部のみならず、味蕾においても強い発現が認められた。
２−４．細胞株ＫＴ−１Ｂのフローサイトメーター解析
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ｂ（２×１０５個）を抗インテグリンモノクローナル抗体（１μｇ）と４℃で３０分間反応させた後、ＦＩＴＣ標識２次抗体で染色し、発現レベルを示す強度をフローサイトメーターにて解析した。
（実験結果）
細胞株ＫＴ−１Ｂにおける各インテグリン分子の発現レベルを図５に示した。有郭乳頭付近の舌上皮基底部（図４）と同様に細胞株ＫＴ−１Ｂでは、α６、β１、β４の発現が認められた。したがって、細胞株ＫＴ−１Ｂは、上記の有郭乳頭と同様のインテグリンの発現パターンを示した。このことから、細胞株ＫＴ−１Ｂには、基底部にある未分化の細胞と味蕾の細胞が混在していることが分かった。
２−５．マウス有郭乳頭及び細胞株ＫＴ−１Ｂの免疫染色
（実験方法）
スライドガラス上で培養した細胞株ＫＴ−１Ｂ、及び、上記の実施例２−３と同様にして４％パラフォルムアルデヒドを含んだＰＢＳ（−）により室温下で１０分間固定したマウス有郭乳頭を、抗ｍｕｓａｓｈｉ抗体や抗サイトケラチン８抗体等と４℃で一晩反応させた後、Ａｌｅｘａ４８８−標識２次抗体で染色した。
（実験結果）
図６に、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）における未分化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。図６Ａ及び図６Ｂはｍｕｓａｓｈｉタンパク質、図６Ｅ及び図６Ｆはサイトケラチン８タンパク質の発現をそれぞれ示す。スケールバーは４０μｍである。図６中、白く染まった細胞が、各分子を発現している細胞を示す。
図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、有郭乳頭の基底部近傍でｍｕｓａｓｈｉタンパク質（神経幹細胞で発現しているマーカー）の発現が認められ、細胞株ＫＴ−１Ｂでも強い発現が認められた。また図６Ｅ及び６Ｆに示されるように、味蕾特異的分子であるサイトケラチン８が細胞株ＫＴ−１Ｂでも発現していた。細胞株ＫＴ−１Ｂの約２０−３０％の細胞でサイトケラチン８の発現が認められた。
２−６．マウス有郭乳頭及び細胞株ＫＴ−１Ｂのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる味覚関連分子の発現の確認
（実験方法）
マウスＰａｔｃｈｅｄ１、ＳＴＧ、Ｔ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９の各ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、これらのプラスミドを鋳型にＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてジゴキシゲニンで標識したＲＮＡプローブを作製した。これらを各プローブが０．５μｇ／ｍｌの濃度になるようにハイブリダイゼーション溶液（５０％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、１０％Ｄｅｎｈａｒｔｓ、１０ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ）に溶解した。スライドガラス上で培養した細胞株ＫＴ−１Ｂ、及び、上記の実施例２−３と同様にして４％パラフォルムアルデヒドを含んだＰＢＳ（−）により室温下で１０分間固定したマウス有郭乳頭を、それぞれ上記のプローブ液を希釈したハイブリダイゼーション液で被覆し、６５℃で一晩ハイブリダイズした。
２×ＳＳＣ（室温で５分）と０．２×ＳＳＣ（６５℃で９０分）で洗浄後、１×チラミドブロッキングバッファー（Ｄｕｐｏｎｔ社製）で２時間ブロッキングした後、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＰＯＤ（ブロッキングバッファーで１００倍希釈、ロッシュ社製）と４℃で一晩反応させた。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）にて５分間３回洗浄した後、ビオチニルチラミド（チラミドリアクションバッファーで５０倍希釈、Ｄｕｐｏｎｔ社製）と３７℃で３０分間反応させた。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）にて５分間３回洗浄した後、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８（ＰＢＳ（−）で２５０倍希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と反応させて蛍光顕微鏡（ライカ社製、ＤＭＲＩＢ）で観察・写真撮影した。
（実験結果）
図６に、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）における未分化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。図６Ｃ及び６Ｄは、未分化細胞マーカーであるＰａｔｃｈｅｄ１の発現を示し、図６Ｇ及び６Ｈは、味蕾特異的遺伝子ＳＴＧの発現を示し、図６Ｉ及び６Ｊは、苦味レセプターＴ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９の発現を示す。図６中、白く染まった細胞が、各分子を発現している細胞を示す。但し、図６Ｄでは、黒く染まった部分が発現細胞を示す。図６より、細胞株ＫＴ−１Ｂを含む細胞集団中には、未分化な細胞、味蕾特異的分子を発現する細胞及び苦味に応答する細胞を含んでいることが分かる。
３．カルシウムイメージングを用いたＫＴ−１Ｃ細胞の甘味応答能の確認
（実験方法）
３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪ガラス）中で細胞株ＫＴ−１Ｂを培養し、５０−７０％コンフルエントになった時点で、実施例１−３に記載の分化誘導処理を３−７日間施して、ＫＴ−１Ｃ細胞を得た。
ＰＢＳ（−）で２回洗浄したＫＴ−１Ｃ細胞を、イメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＮａＣｌ １２４ｍＭ）１ｍｌに５μｌ Ｆｕｒａ−２−ＡＭ（ＤＭＳＯで溶解した１ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と５μｌクレモフォア（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）とを加えたものと一緒に室温で３０分間インキュベートしてＦｕｒａ−２−ＡＭを細胞内へ取り込ませた。その後、イメージングバッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＦｕｒａ−２−ＡＭを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ甘味レセプターＴ１ｒ２／Ｔ１ｒ３のリガンドであることが知られている人工甘味料Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ（Ｆｌｕｋａ社製）を終濃度で５ｍＭになるように加えた。甘味応答能を有する細胞、すなわち甘味レセプターであるＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３が機能的に発現している細胞は、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ（甘味物質）に応答してカルシウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により細胞質へ流入したカルシウムに起因してＦｕｒａ−２が出す蛍光（４９０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をカルシウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
（実験結果）
結果を図７に示す。図７ＡはＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋを入れる前の蛍光強度を示し、図７ＢはＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加０．５分後の蛍光強度を示している。図７Ｂの右側のカラーバーは、青色から赤色に向かって蛍光強度が強いことを示している。
図７Ｂの矢印で示した細胞について図７Ａと７Ｂとを比較すると、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ添加により蛍光強度が緑色から黄色・赤色へと変化した。このことは、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのカルシウム流入が起こり細胞内カルシウム濃度が上昇したことを示している。
図７Ｃは、図７Ｂの矢印で示した細胞についてのカルシウム濃度の経時的変化を示している。図７Ｃにおいて、横軸は測定開始からの時間（分）、縦軸は細胞内カルシウム濃度を示している。また、矢印で示した点はＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋを添加した時点を示している。図７ＣからもＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのカルシウム流入が起こり、結果として細胞内カルシウム濃度が上昇したことが理解される。
以上より、ＫＴ−１Ｃ細胞は、甘味レセプターであるＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３を機能的に発現しており、甘味応答能を有することが理解される。したがって、ＫＴ−１Ｃ細胞を、甘味を感知する味覚センサーとして利用可能であること及び代替甘味料や甘味増強物質を探索するために利用可能であることが示された。
本実施例の甘味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、実施例１−３に記載のＭＣＤＢ基本培地Ｃにて処理して得られるＫＴ−１Ｃ細胞を、上述のＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ添加による細胞内カルシウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
４．細胞株ＫＴ−１Ｂを用いたホルモンによる味覚レセプターの発現制御
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ｂは、ヒドロコルチゾン存在下で培養している間は、塩味の受容に関与するアミロライド感受性ナトリウムチャンネルαサブユニット（αＥＮａＣ）を恒常的に発現している。
そこで、細胞株ＫＴ−１Ｂを、ホルモンであるプロゲステロン（０．１μＭ）、アルドステロン（１μＭ）又はヒドロコルチゾン（０．２μＭ）で６日間処理して、塩味チャネルαＥＮａＣの発現を調べた。
処理した細胞株ＫＴ−１ＢからＴｒｉｚｏｌ溶液によりＲＮＡを抽出し、得られた２μｇ ＲＮＡを用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを４０μｌスケールで合成した。このｃＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として、塩味チャネルαＥＮａＣに特異的なプライマー（各０．２μＭ）（配列番号１３及び１４）を用い、２．５ユニットＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５８℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとして、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
図８に、各ホルモン（レーン１：プロゲステロン、レーン２：ヒドロコルチゾン、レーン３：アルドステロン）で処理した細胞株ＫＴ−１Ｂにおける味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す。
図８に示すように、プロゲステロン処理細胞と比較して、アルドステロン又はヒドロコルチゾンで処理した細胞では、塩味チャネルであるαＥＮａＣの発現量が増加していることが明らかとなった。
５．ナトリウムイメージングを用いたＫＴ−１Ｃ細胞の塩味応答能の確認
（実験方法）
実施例３と同様にして誘導したＫＴ−１Ｃ細胞を、ＰＢＳ（−）で２階洗浄し、次いでＮａイメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ，ＫＣｌ ５ｍＭ，ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ，グルコース１０ｍＭ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ １２４ｍＭ）１ｍｌに１μｌ ＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を加えたものと一緒に室温で３分間インキュベートしてＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄを細胞内へ取り込ませた。その後、Ｎａイメージング用バッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ塩味チャネルのリガンドであることが知られているＮａＣｌを終濃度で５０ｍＭになるように加えた。塩味応答能を有する細胞、すなわち塩味チャネルであるαＥＮａＣが機能的に発現している細胞は、ＮａＣｌ（塩味物質）に応答してナトリウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内ナトリウム濃度が上昇することが知られている。そこで、ＮａＣｌの添加により細胞質へ流入したナトリウムに起因してＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄが出す蛍光（５８０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をナトリウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
（実験結果）
結果を図９に示す。図９ＡはＮａＣｌを入れる前の蛍光強度を示し、図９ＢはＮａＣｌの添加０．５分後の蛍光強度を示している。図９Ｂの右側のカラーバーは、青色から赤色に向かって蛍光強度が強いことを示している。
図９Ａと９Ｂとを比較すると、ＮａＣｌ添加により蛍光強度が青色から黄色・赤色へと変化した。このことは、ＮａＣｌの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのナトリウム流入が起こり細胞内ナトリウム濃度が上昇したことを示している。
図９Ｃは、図９Ｂの矢印で示した細胞についてのナトリウム濃度の経時的変化を示している。図９Ｃにおいて、横軸は測定開始からの時間（分）、縦軸は細胞内ナトリウム濃度を示している。また、下矢印で示した点は５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した時点を、上矢印で示した点は１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した時点を示している。図９ＣからもＮａＣｌの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのナトリウム流入が起こり、結果として細胞内ナトリウム濃度が上昇したことが理解される。また、添加するＮａＣｌ濃度に応じて細胞内ナトリウム濃度も変化することが明らかになった。
以上より、ＫＴ−１Ｃ細胞は、塩味チャネルであるαＥＮａＣを機能的に発現しており、塩味応答能を有することが理解される。したがって、ＫＴ−１Ｃ細胞を塩味を感知する味覚センサーとして利用可能であること及び塩味代替物質や塩味増強物質を探索するために利用可能であることが示された。
本実施例の塩味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、実施例１−３に記載のＭＣＤＢ基本培地Ｃにて処理して得られるＫＴ−１Ｃ細胞を、上述のＮａＣｌ添加による細胞内ナトリウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
６．カルシウムイメージングを用いた細胞株ＫＴ−１Ｂの苦味応答能の確認
（実験方法）
３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪ガラス）中で細胞株ＫＴ−１Ｂを培養し、５０−７０％コンフルエントになった時点で、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したＫＴ−１Ｂ細胞を、イメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＮａＣｌ １２４ｍＭ）１ｍｌに５μｌ Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（ＤＭＳＯで溶解した１ｍＭ、同仁化学社製）と５μｌクレモフォア（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）とを加えたものと一緒に室温で３０分間インキュベートしてＦｌｕｏ−３−ＡＭを細胞内へ取り込ませた。その後、イメージングバッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＦｌｕｏ−３−ＡＭを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ苦味レセプターＴ２ｒ５のリガンドであることが知られているシクロヘキシミドを終濃度で１ｍＭになるように加えた。苦味応答能を有する細胞、すなわち苦味レセプターであるＴ２ｒ５が機能的に発現している細胞は、シクロヘキシミド（苦味物質）に応答してカルシウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、シクロヘキシミドの添加により細胞質へ流入したカルシウムに起因してＦｌｕｏ−３が出す蛍光（４９０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をカルシウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
本実施例の苦味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、上述のシクロヘキシミド添加による細胞内カルシウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
【産業上の利用の可能性】
本発明の細胞株ＫＴ−１を用いると、特定の味応答を再現性良く測定することや、味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築することが可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、味覚センサー、これを利用した味覚センサー等の探索方法に関し、さらに詳細には、マウス舌上皮細胞から樹立された細胞株ＫＴ−１及びその用途に関する。特に、マウス舌上皮細胞より樹立された細胞株ＫＴ−１を味覚センサーとして利用する方法、ならびに細胞株ＫＴ−１を利用して味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
舌上皮細胞を単離・培養する方法は既に報告されている（例えば、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：３６５−３７２（２００２）参照）。しかしながら、舌上皮由来の細胞で味覚レセプターを発現する細胞株や分化状態の異なる細胞集団を含む細胞株については報告されていない。このため、生きた細胞を用いて特定の味応答を再現性良く測定することや、味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築することは非常に困難であった。
【発明の開示】
本発明の第１の目的は、味覚レセプターを発現する細胞及びその形質転換体を提供することである。
本発明の第２の目的は、上記細胞を用いた味覚センサーを提供することである。
本発明の第３の目的は、上記味覚センサーの用途を提供することである。
本発明の第４の目的は、様々な分化段階の細胞を利用して、特定の味細胞への分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質を探索する系を確立することである。
以下、本発明を詳細に説明する。
発明を実施するための形態
本発明は以下の細胞、味覚センサー、その用途を提供するものである。
１．マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株ＫＴ−１。
２．前記１に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の低血清培地中で長期継代培養して樹立された細胞株ＫＴ−１。
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
３．受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７で寄託されている、前記２に記載の細胞株ＫＴ−１。
４．前記２又は３に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の分化誘導培地中で培養して得られるＫＴ−１細胞。
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
５．味覚レセプターを機能的に発現している、前記４に記載のＫＴ−１細胞。
６．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞を含む味覚センサー。
７．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞を用いて、該味覚レセプターが受容する味物質を識別することを特徴とする細胞株ＫＴ−１の味覚センサーとしての使用。
８．味覚レセプターが甘味レセプター、苦味レセプター、塩味チャネル、又はアミノ酸レセプターである、前記７記載の使用。
９．細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが既知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
１０．前記９記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１の、該味覚レセプターが受容する特定の味を感知する細胞としての使用。
１１．細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが未知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
１２．前記１１記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１を使用して、該未知のリガンドを探索する方法。
１３．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。
１４．前記１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は前記４又は５に記載のＫＴ−１細胞及び味物質を用いて、該味物質に対する味覚レセプターを探索する方法。
１５．味覚レセプターが塩味チャネルである、前記１４に記載の方法。
本発明の細胞株ＫＴ−１は、マウス舌上皮細胞を単離・培養後、２年半以上継代・維持することにより樹立された細胞である。細胞株ＫＴ−１は、未分化な細胞と味覚レセプターを発現する細胞とが混在するユニークな細胞株であり、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７（寄託日：平成１５年３月２７日）として〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【図面の簡単な説明】
図１は、細胞株ＫＴ−１Ａからｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、特異プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す図面である。
図２は、細胞株ＫＴ−１Ａにおける味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す図面である。図中、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図３は、ＫＴ−１Ｃ細胞における味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す図面である。図中、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図４は、成体マウス有郭乳頭におけるインテグリンの発現パターンを示す免疫組織染色像を示す図面である。
図５は、細胞株ＫＴ−１Ｂにおける各インテグリン分子の発現レベルをフローサイトメーターで解析した結果を示す図面である。
図６は、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）で発現する未分化および味蕾特異的に発現する分子について、免疫染色ならびにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った結果を示す図面である。
図７は、カルシウムイメージングによるＫＴ−１Ｃ細胞における甘味受容応答の結果を示す図面である。
図８は、ホルモンによる細胞株ＫＴ−１Ｂの塩味チャネルαＥＮａＣ発現の変化を示す図面である。（レーン１：プロゲステロン、レーン２：ヒドロコルチゾン、レーン３：アルドステロン）
図９は、ナトリウムイメージングによるＫＴ−１Ｃ細胞における塩味受容応答の結果を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
１．細胞株ＫＴ−１の樹立方法
１−１．細胞株ＫＴ−１Ａ株の樹立
マウス舌上皮からインテグリンβ１の強発現を指標に細胞を回収し、初代培養後１年間半、以下の培地により維持・継代（１−２週間に一度）した。
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地Ａ
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．５ ％
得られた細胞株をＫＴ−１Ａ株とした。
１−２．細胞株ＫＴ−１Ｂ株の樹立
継代のために細胞株ＫＴ−１Ａが付着しているプラスティックディッシュを３回ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．０５％トリプシン−１ｍＭ ＥＤＴＡを加えて３７℃で５−１０分間反応させた。ディッシュより剥がれてきた細胞を、トリプシン活性を中和してから遠心により回収し、新たな培地で懸濁して、コラーゲンタイプＩＶ（３μｇ／ｍｌ）とマトリジェル（１０μｌ／ｍｌ）でコートしたプラスティックディッシュに播いた。そして、以下のより血清濃度の低い（０．２５％）培地にて、３−４日間に一度の継代を１年半以上行い続けた。
培地：ＭＣＤＢ１５３基本培地Ｂ
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
得られた細胞株をＫＴ−１Ｂ株とした。細胞株ＫＴ−１Ｂ株はＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託されている。
１−３．細胞株ＫＴ−１ＢからＫＴ−１Ｃ細胞への分化誘導
細胞株ＫＴ−１Ｂを以下の分化誘導培地で３〜７日間培養して、細胞株ＫＴ−１Ｂを更に分化させてＫＴ−１Ｃ細胞を得た。
分化誘導培地：ＭＣＤＢ基本培地Ｃ
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
２−１．ＲＴ−ＰＣＲによる細胞株ＫＴ−１Ａにおける味覚関連遺伝子のｍＲＮＡ発現の確認
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１ＡのｃＤＮＡを、細胞株ＫＴ−１Ａからｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、このｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応により得た。ＲＮＡの抽出にはＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることが簡便である。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ ２μｇを用いて、逆転写反応を行うには、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いると簡便に行うことができる。
このｃＤＮＡを鋳型として、あらかじめ設計しておいた各味覚レセプター及び味蕾関連分子に特異的なプライマー（各０．２μＭ）（表１）を用い、２．５ユニットのＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５５−５８℃で１分、７２℃で２分 を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。各プライマーの配列は、表１に示した（但し、配列番号３１〜３４のプライマーは、後述する実施例２−２で使用した。）。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
結果を図１に示す。細胞株ＫＴ−１Ａでは、味覚レセプターをコードするＴ１ｒ１、Ｔ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９や塩味の受容に関わるαＥＮａＣ（アミロライド感受性ナトリウムチャンネルαサブユニット）、Ｇタンパク質であるＧαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇγ１３、ならびに、味蕾およびその周囲で特異的に発現するＳＴＧ、サイトケラチン８、Ｐａｔｃｈｅｄ１（図面においてＰｔｃ１又はｐａｔｃｈｅｄ−１と表記することもある）の発現が確認されたが、Ｔ１ｒ２、Ｔ１ｒ３及びｇｕｓｔｄｕｃｉｎは発現していなかった。以上より、細胞株ＫＴ−１Ａは、未分化な細胞から味覚レセプターを発現する細胞まで、様々な分化段階の細胞から構成されていることがわかる。
２−２．細胞株ＫＴ−１Ａ及びＫＴ−１Ｃ細胞における味覚レセプターｍＲＮＡの検出
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ａ及びＫＴ−１Ｃ細胞からＴｒｉｚｏｌ溶液によりそれぞれのＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ ２μｇ用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを４０μｌスケールで合成した。このｃＤＮＡ溶液１μｌを鋳型に各味覚レセプター（Ｔ１ｒ１、Ｔ１ｒ３、Ｔ１ｒ２及びサイトケラチン８）に特異的なプライマー（Ｔ１ｒ１：配列番号３１及び３２、Ｔ１ｒ３：配列番号３３及び３４、Ｔ１ｒ２：配列番号３及び４、サイトケラチン８：配列番号２７及び２８）（各０．２μＭ）を用いて２．５ユニットＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５８−６８℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
図２及び３に、ＲＴ−ＰＣＲ法による細胞株ＫＴ−１Ａ（図２）及びＫＴ−１Ｃ細胞（図３）における味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す。各図において、レーン１：Ｔ１ｒ１、レーン２：Ｔ１ｒ２、レーン３：Ｔ１ｒ３、レーン４：サイトケラチン８である。
図２と図３とを対比すると細胞株ＫＴ−１Ａでは発現していない甘味レセプターＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３がＫＴ−１Ｃ細胞では発現している。すなわち、ＫＴ−１Ｃ細胞にはＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３を発現する細胞が多く含まれている。したがって、細胞株ＫＴ−１ＡとＫＴ−１Ｃ細胞とは、Ｔ１ｒ２及びＴ１ｒ３の発現において区別することができる。
また、前記マーカー分子及びその他のマーカー分子の発現結果を、以下の表２に示す。
表中の記号の意味は以下のとおりである。
＋＋：強く発現している、＋：発現している、−：発現していない。
２−３．有郭乳頭の免疫組織染色
（実験方法）
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの舌を摘出後、有郭乳頭の凍結切片（１０μｍ）を載せたスライドを、４％パラフォルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で固定した後、様々な抗インテグリン抗体と４℃で一晩反応させた後、蛍光標識２次抗体（Ａｌｅｘａ４８８標識抗ウサギもしくは抗マウスＩｇＧならびにＣｙ３標識抗ハムスターもしくはラットＩｇＧ）で染色した。
（実験結果）
図４は、成体マウス有郭乳頭のインテグリン発現パターンを示す免疫組織染色像である。図４に示すように、マウスの有郭乳頭では、インテグリンβ４とインテグリンα６とが上皮基底部に限局して強発現していた。一方、インテグリンβ１は基底部のみならず、味蕾においても強い発現が認められた。
２−４．細胞株ＫＴ−１Ｂのフローサイトメーター解析
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ｂ（２×１０５個）を抗インテグリンモノクローナル抗体（１μｇ）と４℃で３０分間反応させた後、ＦＩＴＣ標識２次抗体で染色し、発現レベルを示す強度をフローサイトメーターにて解析した。
（実験結果）
細胞株ＫＴ−１Ｂにおける各インテグリン分子の発現レベルを図５に示した。有郭乳頭付近の舌上皮基底部（図４）と同様に細胞株ＫＴ−１Ｂでは、α６、β１、β４の発現が認められた。したがって、細胞株ＫＴ−１Ｂは、上記の有郭乳頭と同様のインテグリンの発現パターンを示した。このことから、細胞株ＫＴ−１Ｂには、基底部にある未分化の細胞と味蕾の細胞が混在していることが分かった。
２−５．マウス有郭乳頭及び細胞株ＫＴ−１Ｂの免疫染色
（実験方法）
スライドガラス上で培養した細胞株ＫＴ−１Ｂ、及び、上記の実施例２−３と同様にして４％パラフォルムアルデヒドを含んだＰＢＳ（−）により室温下で１０分間固定したマウス有郭乳頭を、抗ｍｕｓａｓｈｉ抗体や抗サイトケラチン８抗体等と４℃で一晩反応させた後、Ａｌｅｘａ４８８−標識２次抗体で染色した。
（実験結果）
図６に、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）における未分化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。図６Ａ及び図６Ｂはｍｕｓａｓｈｉタンパク質、図６Ｅ及び図６Ｆはサイトケラチン８タンパク質の発現をそれぞれ示す。スケールバーは４０μｍである。図６中、白く染まった細胞が、各分子を発現している細胞を示す。
図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、有郭乳頭の基底部近傍でｍｕｓａｓｈｉタンパク質（神経幹細胞で発現しているマーカー）の発現が認められ、細胞株ＫＴ−１Ｂでも強い発現が認められた。また図６Ｅ及び６Ｆに示されるように、味蕾特異的分子であるサイトケラチン８が細胞株ＫＴ−１Ｂでも発現していた。細胞株ＫＴ−１Ｂの約２０−３０％の細胞でサイトケラチン８の発現が認められた。
２−６．マウス有郭乳頭及び細胞株ＫＴ−１Ｂのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる味覚関連分子の発現の確認
（実験方法）
マウスＰａｔｃｈｅｄ１、ＳＴＧ、Ｔ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９の各ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、これらのプラスミドを鋳型にＤＩＧ ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてジゴキシゲニンで標識したＲＮＡプローブを作製した。これらを各プローブが０．５μｇ／ｍｌの濃度になるようにハイブリダイゼーション溶液（５０％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、１０％Ｄｅｎｈａｒｔｓ、１０ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡ）に溶解した。スライドガラス上で培養した細胞株ＫＴ−１Ｂ、及び、上記の実施例２−３と同様にして４％パラフォルムアルデヒドを含んだＰＢＳ（−）により室温下で１０分間固定したマウス有郭乳頭を、それぞれ上記のプローブ液を希釈したハイブリダイゼーション液で被覆し、６５℃で一晩ハイブリダイズした。
２×ＳＳＣ（室温で５分）と０．２×ＳＳＣ（６５℃で９０分）で洗浄後、１×チラミドブロッキングバッファー（Ｄｕｐｏｎｔ社製）で２時間ブロッキングした後、Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＰＯＤ（ブロッキングバッファーで１００倍希釈、ロッシュ社製）と４℃で一晩反応させた。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）にて５分間３回洗浄した後、ビオチニルチラミド（チラミドリアクションバッファーで５０倍希釈、Ｄｕｐｏｎｔ社製）と３７℃で３０分間反応させた。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）にて５分間３回洗浄した後、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４８８（ＰＢＳ（−）で２５０倍希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と反応させて蛍光顕微鏡（ライカ社製、ＤＭＲＩＢ）で観察・写真撮影した。
（実験結果）
図６に、細胞株ＫＴ−１Ｂ（上段）およびマウス有郭乳頭（下段）における未分化細胞特異的分子及び味蕾特異的分子の発現を示す。図６Ｃ及び６Ｄは、未分化細胞マーカーであるＰａｔｃｈｅｄ１の発現を示し、図６Ｇ及び６Ｈは、味蕾特異的遺伝子ＳＴＧの発現を示し、図６Ｉ及び６Ｊは、苦味レセプターＴ２ｒ５、Ｔ２ｒ１８、Ｔ２ｒ１９の発現を示す。図６中、白く染まった細胞が、各分子を発現している細胞を示す。但し、図６Ｄでは、黒く染まった部分が発現細胞を示す。図６より、細胞株ＫＴ−１Ｂを含む細胞集団中には、未分化な細胞、味蕾特異的分子を発現する細胞及び苦味に応答する細胞を含んでいることが分かる。
３．カルシウムイメージングを用いたＫＴ−１Ｃ細胞の甘味応答能の確認
（実験方法）
３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪ガラス）中で細胞株ＫＴ−１Ｂを培養し、５０−７０％コンフルエントになった時点で、実施例１−３に記載の分化誘導処理を３−７日間施して、ＫＴ−１Ｃ細胞を得た。
ＰＢＳ（−）で２回洗浄したＫＴ−１Ｃ細胞を、イメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＮａＣｌ １２４ｍＭ）１ｍｌに５μｌ Ｆｕｒａ−２−ＡＭ（ＤＭＳＯで溶解した１ｍＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）と５μｌクレモフォア（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）とを加えたものと一緒に室温で３０分間インキュベートしてＦｕｒａ−２−ＡＭを細胞内へ取り込ませた。その後、イメージングバッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＦｕｒａ−２−ＡＭを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ甘味レセプターＴ１ｒ２／Ｔ１ｒ３のリガンドであることが知られている人工甘味料Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ（Ｆｌｕｋａ社製）を終濃度で５ｍＭになるように加えた。甘味応答能を有する細胞、すなわち甘味レセプターであるＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３が機能的に発現している細胞は、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ（甘味物質）に応答してカルシウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により細胞質へ流入したカルシウムに起因してＦｕｒａ−２が出す蛍光（４９０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をカルシウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
（実験結果）
結果を図７に示す。図７ＡはＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋを入れる前の蛍光強度を示し、図７ＢはＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加０．５分後の蛍光強度を示している。図７Ｂの右側のカラーバーは、青色から赤色に向かって蛍光強度が強いことを示している。
図７Ｂの矢印で示した細胞について図７Ａと７Ｂとを比較すると、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ添加により蛍光強度が緑色から黄色・赤色へと変化した。このことは、Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのカルシウム流入が起こり細胞内カルシウム濃度が上昇したことを示している。
図７Ｃは、図７Ｂの矢印で示した細胞についてのカルシウム濃度の経時的変化を示している。図７Ｃにおいて、横軸は測定開始からの時間（分）、縦軸は細胞内カルシウム濃度を示している。また、矢印で示した点はＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋを添加した時点を示している。図７ＣからもＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのカルシウム流入が起こり、結果として細胞内カルシウム濃度が上昇したことが理解される。
以上より、ＫＴ−１Ｃ細胞は、甘味レセプターであるＴ１ｒ２及びＴ１ｒ３を機能的に発現しており、甘味応答能を有することが理解される。したがって、ＫＴ−１Ｃ細胞を、甘味を感知する味覚センサーとして利用可能であること及び代替甘味料や甘味増強物質を探索するために利用可能であることが示された。
本実施例の甘味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、実施例１−３に記載のＭＣＤＢ基本培地Ｃにて処理して得られるＫＴ−１Ｃ細胞を、上述のＡｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ添加による細胞内カルシウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
４．細胞株ＫＴ−１Ｂを用いたホルモンによる味覚レセプターの発現制御
（実験方法）
細胞株ＫＴ−１Ｂは、ヒドロコルチゾン存在下で培養している間は、塩味の受容に関与するアミロライド感受性ナトリウムチャンネルαサブユニット（αＥＮａＣ）を恒常的に発現している。
そこで、細胞株ＫＴ−１Ｂを、ホルモンであるプロゲステロン（０．１μＭ）、アルドステロン（１μＭ）又はヒドロコルチゾン（０．２μＭ）で６日間処理して、塩味チャネルαＥＮａＣの発現を調べた。
処理した細胞株ＫＴ−１ＢからＴｒｉｚｏｌ溶液によりＲＮＡを抽出し、得られた２μｇ ＲＮＡを用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットによりｃＤＮＡを４０μｌスケールで合成した。このｃＤＮＡ溶液１μｌを鋳型として、塩味チャネルαＥＮａＣに特異的なプライマー（各０．２μＭ）（配列番号１３及び１４）を用い、２．５ユニットＴａｋａｒａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ社製）を加えて２５μｌスケールにて９５℃で５分変性した後、９５℃で１分、５８℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとして、３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応液８μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行った。
（実験結果）
図８に、各ホルモン（レーン１：プロゲステロン、レーン２：ヒドロコルチゾン、レーン３：アルドステロン）で処理した細胞株ＫＴ−１Ｂにおける味覚レセプターｍＲＮＡの検出結果を示す。
図８に示すように、プロゲステロン処理細胞と比較して、アルドステロン又はヒドロコルチゾンで処理した細胞では、塩味チャネルであるαＥＮａＣの発現量が増加していることが明らかとなった。
５．ナトリウムイメージングを用いたＫＴ−１Ｃ細胞の塩味応答能の確認
（実験方法）
実施例３と同様にして誘導したＫＴ−１Ｃ細胞を、ＰＢＳ（−）で２階洗浄し、次いでＮａイメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ，ＫＣｌ ５ｍＭ，ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ，グルコース１０ｍＭ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ １２４ｍＭ）１ｍｌに１μｌ ＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を加えたものと一緒に室温で３分間インキュベートしてＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄを細胞内へ取り込ませた。その後、Ｎａイメージング用バッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ塩味チャネルのリガンドであることが知られているＮａＣｌを終濃度で５０ｍＭになるように加えた。塩味応答能を有する細胞、すなわち塩味チャネルであるαＥＮａＣが機能的に発現している細胞は、ＮａＣｌ（塩味物質）に応答してナトリウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内ナトリウム濃度が上昇することが知られている。そこで、ＮａＣｌの添加により細胞質へ流入したナトリウムに起因してＣｏｒｏＮａ−Ｒｅｄが出す蛍光（５８０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をナトリウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
（実験結果）
結果を図９に示す。図９ＡはＮａＣｌを入れる前の蛍光強度を示し、図９ＢはＮａＣｌの添加０．５分後の蛍光強度を示している。図９Ｂの右側のカラーバーは、青色から赤色に向かって蛍光強度が強いことを示している。
図９Ａと９Ｂとを比較すると、ＮａＣｌ添加により蛍光強度が青色から黄色・赤色へと変化した。このことは、ＮａＣｌの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのナトリウム流入が起こり細胞内ナトリウム濃度が上昇したことを示している。
図９Ｃは、図９Ｂの矢印で示した細胞についてのナトリウム濃度の経時的変化を示している。図９Ｃにおいて、横軸は測定開始からの時間（分）、縦軸は細胞内ナトリウム濃度を示している。また、下矢印で示した点は５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した時点を、上矢印で示した点は１５０ｍＭ ＮａＣｌを添加した時点を示している。図９ＣからもＮａＣｌの添加により、ＫＴ−１Ｃ細胞内部へのナトリウム流入が起こり、結果として細胞内ナトリウム濃度が上昇したことが理解される。また、添加するＮａＣｌ濃度に応じて細胞内ナトリウム濃度も変化することが明らかになった。
以上より、ＫＴ−１Ｃ細胞は、塩味チャネルであるαＥＮａＣを機能的に発現しており、塩味応答能を有することが理解される。したがって、ＫＴ−１Ｃ細胞を塩味を感知する味覚センサーとして利用可能であること及び塩味代替物質や塩味増強物質を探索するために利用可能であることが示された。
本実施例の塩味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、実施例１−３に記載のＭＣＤＢ基本培地Ｃにて処理して得られるＫＴ−１Ｃ細胞を、上述のＮａＣｌ添加による細胞内ナトリウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
６．カルシウムイメージングを用いた細胞株ＫＴ−１Ｂの苦味応答能の確認
（実験方法）
３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪ガラス）中で細胞株ＫＴ−１Ｂを培養し、５０−７０％コンフルエントになった時点で、ＰＢＳ（−）で２回洗浄したＫＴ−１Ｂ細胞を、イメージング用バッファー（ＮａＨＣＯ３２２ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４１．２５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＮａＣｌ １２４ｍＭ）１ｍｌに５μｌ Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ（ＤＭＳＯで溶解した１ｍＭ、同仁化学社製）と５μｌクレモフォア（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）とを加えたものと一緒に室温で３０分間インキュベートしてＦｌｕｏ−３−ＡＭを細胞内へ取り込ませた。その後、イメージングバッファーで２回洗浄して細胞に取り込まれなかったＦｌｕｏ−３−ＡＭを除いた。
次いでイメージングバッファーに１ｍＭ ＭｇＣｌ２と２ｍＭ ＣａＣｌ２とを加えた液１ｍｌでディッシュを満たし、そこへ苦味レセプターＴ２ｒ５のリガンドであることが知られているシクロヘキシミドを終濃度で１ｍＭになるように加えた。苦味応答能を有する細胞、すなわち苦味レセプターであるＴ２ｒ５が機能的に発現している細胞は、シクロヘキシミド（苦味物質）に応答してカルシウムの細胞質内への流入が起こり、その結果、細胞質内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、シクロヘキシミドの添加により細胞質へ流入したカルシウムに起因してＦｌｕｏ−３が出す蛍光（４９０ｎｍ）を、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアー（浜松ホトニクス社製）で制御されたＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス社製）を装着した蛍光倒立顕微鏡（ライカ社，ＤＭＲＩＢ）で経時的に測定した。測定後、ＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで各細胞における蛍光強度の経時変化をカルシウム濃度変化へ換算する経時変化解析を行い、グラフ化した。
本実施例の苦味応答能を有する細胞は、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７として寄託された細胞株ＫＴ−１Ｂを、上述のシクロヘキシミド添加による細胞内カルシウム濃度の上昇を指標として選択することによって単離することができる。
【産業上の利用の可能性】
本発明の細胞株ＫＴ−１を用いると、特定の味応答を再現性良く測定することや、味細胞の分化誘導因子を同定するシステムを構築することが可能になる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株ＫＴ−１。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の低血清培地中で長期継代培養して樹立された細胞株ＫＴ−１。
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７で寄託されている、請求項２に記載の細胞株ＫＴ−１。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の分化誘導培地中で培養して得られるＫＴ−１細胞。
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
【請求項５】
味覚レセプターを機能的に発現している、請求項４に記載のＫＴ−１細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞を含む味覚センサー。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞を用いて、該味覚レセプターが受容する味物質を識別することを特徴とする細胞株ＫＴ−１の味覚センサーとしての使用。
【請求項８】
味覚レセプターが甘味レセプター、苦味レセプター、塩味チャネル、又はアミノ酸レセプターである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが既知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１の、該味覚レセプターが受容する特定の味を感知する細胞としての使用。
【請求項１１】
細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが未知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１を使用して、該未知のリガンドを探索する方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞及び味物質を用いて、該味物質に対する味覚レセプターを探索する方法。
【請求項１５】
味覚レセプターが塩味チャネルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
マウス舌上皮よりインテグリンβ１の強発現を指標に単離され、長期継代培養して樹立された、味覚レセプターを発現する細胞である細胞株ＫＴ−１。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の低血清培地中で長期継代培養して樹立された細胞株ＫＴ−１。
カルシウム 最終濃度 ５ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
塩基性繊維芽細胞成長因子 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １０ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
カルシウムをキレートした牛胎児血清 最終濃度 ０．２５ ％
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４７で寄託されている、請求項２に記載の細胞株ＫＴ−１。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞株ＫＴ−１を、以下の分化誘導培地中で培養して得られるＫＴ−１細胞。
カルシウム 最終濃度 １０ μｇ／ｍｌ
上皮成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
ケラチノサイト成長因子 最終濃度 １ ｎｇ／ｍｌ
インシュリン様成長因子 最終濃度 ５ ｎｇ／ｍｌ
トランスフェリン 最終濃度 １００ ｎｇ／ｍｌ
ヒドロコルチゾン 最終濃度 ０．２ μＭ
アルドステロン 最終濃度 １０ ｎＭ
エタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
ホスホエタノールアミン 最終濃度 ０．５ μＭ
カルシトリオール 最終濃度 １０ ｎＭ
９−シス レチノイン酸 最終濃度 ０．８ μＭ
グルタチオン 最終濃度 ２００ μＭ
システイン 最終濃度 ５０ μＭ
チロシン 最終濃度 ２．７２ μｇ／ｍｌ
フェニルアラニン 最終濃度 ４．９５ μｇ／ｍｌ
ヘパリン 最終濃度 ２０ μｇ／ｍｌ
ゲンタマイシン 最終濃度 １０ ｍｇ／ｍｌ
アンフォテリシンＢ 最終濃度 ５００ ｎｇ／ｍｌ
ペニシリン 最終濃度 ５０ Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン 最終濃度 ５０ ｍｇ／ｍｌ
【請求項５】
味覚レセプターを機能的に発現している、請求項４に記載のＫＴ−１細胞。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞を含む味覚センサー。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞を用いて、該味覚レセプターが受容する味物質を識別することを特徴とする細胞株ＫＴ−１の味覚センサーとしての使用。
【請求項８】
味覚レセプターが甘味レセプター、苦味レセプター、塩味チャネル、又はアミノ酸レセプターである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが既知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１の、該味覚レセプターが受容する特定の味を感知する細胞としての使用。
【請求項１１】
細胞株ＫＴ−１で発現していない、リガンドが未知である味覚レセプターｃＤＮＡの遺伝子導入により形質転換された細胞株ＫＴ−１。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換された細胞株ＫＴ−１を使用して、該未知のリガンドを探索する方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞の、味細胞の分化誘導因子や味覚レセプターの発現を制御する物質、新規味物質、味覚修飾物質、味覚減退補助物質を探索するための使用。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞株ＫＴ−１又は請求項４又は５に記載のＫＴ−１細胞及び味物質を用いて、該味物質に対する味覚レセプターを探索する方法。
【請求項１５】
味覚レセプターが塩味チャネルである、請求項１４に記載の方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１２２
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５２５０（Ｐ２００５−５０５２５０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４７８８
【国際出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４７８８
【国際出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（５０１１４５２９５）独立行政法人食品総合研究所 (27)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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