菊の品種識別剤及び品種識別方法
【課題】
菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法を提供する。
【解決手段】
特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを、菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊繁殖体の該ＲＮＡを検査することにより、菊の品種識別を行う。
菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法を提供する。
【解決手段】
特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを、菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊繁殖体の該ＲＮＡを検査することにより、菊の品種識別を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物が品種登録された場合には、その植物について育成者権が発生する（種苗法第１９条）。そして、権利者はこれを侵害（無断利用）する者に対しては、民事上、差止請求訴訟（種苗法第３３条）や損害賠償請求訴訟（民法第７０９条）が提起できる。そして訴訟では、権利者（原告）は育成者権の内容（登録品種の特性）を主張・立証し、被告の具体的な利用行為が、当該登録品種と同一品種或いは、登録品種と特性によって明確に区別されない品種を利用するものであることを主張・立証しなければならない（種苗法第２０条）。そこで侵害被疑品種（被告品種）と登録品種の同一性を確認するため、以下の登録品種と侵害被疑品種の特性を調査する必要がある。
（１）特性の比較（植物体同士を比較し、特性を調査する）
（２）比較栽培による調査（植物体同士を同一条件下で栽培しながら特性を調査する）
【０００３】
しかし、権利行使段階において、（１）や（２）のように植物体同士を栽培し目視（肉眼による観察）及び計測により比較して、その特性の一致・不一致を検証していくことは非常に大変であり時間もかかる。そこで、迅速、簡便であり、比較栽培のための植物体への再生が困難な試料でも識別が可能であり、生産現場の環境の影響を受けずに結果が安定しているＤＮＡ分析手段を用いて、登録品種と侵害被疑品種とを比較し、そのＤＮＡ塩基配列の異同によって同一性を判断する技術が開発された。具体的には、登録品種のＤＮＡ塩基配列において、同一品種内の個体間では同じであるが、他品種では異なる部分を検出することにより、ある植物体のＤＮＡ塩基配列における当該異なる部分の有無を調査して、同一品種か否かを識別する技術が開発された（非特許文献１参照）。
【０００４】
また具体的な植物の品種識別方法として、以下の方法が知られている。
豆類の品種識別方法
近縁の種で外観上の特徴で見分けることが困難な豆類の品種判別を行うための方法として、特定品種の豆類において、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ・ａｍｐｌｉｆｉｅｄ・ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ・ＤＮＡ：ランダム増幅多型ＤＮＡ）マーカーと成り得るプライマーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・ｃｈａｉｎ・ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）によるＰＣＲ産物中の特異断片の塩基配列を決定して、その特異断片の一部を特異的に増幅するプライマーを得る。そして、得られたプライマーを品種判別する豆類から抽出したＤＮＡに加えてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片の有無、断片が存在する場合はその大きさ及び断片のバンドの発色の濃さを調べ、検出されたＤＮＡ断片の大きさ及びそのパターンに応じて豆類の品種を判別する方法（特許文献１参照）。
【０００５】
イチゴの品種識別方法
イチゴの品種識別は、従来、果実の大きさ、葉の形や大きさ、草型等の形質の比較によって行われてきたが、この方法では正確な判断が極めて困難である上に、苗の大きさや生育状態をそろえて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することができず、また、市場に流通しているイチゴは、多様な条件下で栽培されているため、従来の方法ではイチゴの品種を識別することは困難であった。そこでこの問題を解決すべく、イチゴの果実、ガク、葉及び茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で相違性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物を制限酵素で処理して得られるＤＮＡの多型を検出し、これを識別することによって、イチゴの品種を識別する方法が開発された（特許文献２参照）。
【０００６】
イグサの品種識別方法
イグサの品種特性は、従来、茎長（草丈）、茎の太さ、幹茎色（茎の色）、茎数（一株当たりの茎の数）、花序着生率（着花の頻度）、先枯れ程度（先端部分の枯れの程度）など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これら特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品質の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。そのため、一旦入手経路が不確実になるとイグサがどの品種であるのかを判断することは困難であり、その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失なわれたり、或いは優良品種の盗難、不法栽培を防止することができなかった。そこでこの問題を解決すべく、優良イグサ品種「ひのみどり」に特異的なＤＮＡ断片を同定し、該ＤＮＡ断片を用いることにより、イグサ品種の識別をする方法が開発された（特許文献３参照）。
【０００７】
米の品種識別方法
消費者の良食米志向を受けて、高値で取引されている「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」及び「あきたこまち」にこれら良食米以外の米を混入し、表示を偽って販売される不正混米が行われている。このような状況下、包装された米の内容と表示が一致しているかどうかを検査する方法として、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列若しくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する３つの単鎖ヌクレオチドを使用して、そのうち２つの単鎖ヌクレオチドを核酸増幅法の対合プライマーとして使用して得た増幅ＤＮＡ断片を、残りの１つの単鎖ヌクレオチドをプローブに用いて検出する、米の品種識別方法が開発された（特許文献４参照）。
【０００８】
以上のＤＮＡマーカーによる植物の品種識別方法は、特定プライマーを用いて、ＰＣＲ法によって増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターン（ＤＮＡマーカー）によって品種を識別するか、これら複数のＤＮＡマーカーの組合せパターンによって、品種を識別する。しかし、当該特定ＤＮＡマーカーを決定するには、同一品種内の個体間では相同であるが、全品種間では相違が生ずるＤＮＡ領域、又は相違が生ずるＤＮＡ領域の組合せを検討する必要があり、多大な研究費用と時間がかかる。
【０００９】
一方、本発明者等は、植物品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の植物品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うために、特定塩基配列のＲＮＡを含有する植物ウイルスを特定植物品種に接種して感染させ、複数世代に亘って栄養繁殖した後の該植物体から、該特定塩基配列のＲＮＡを検出することにより、該特定植物品種を識別することができる特定塩基配列のＲＮＡを含有する植物ウイルスからなる植物品種の識別剤を開発した。この植物品種の識別剤は、特定植物品種に非常に類似した植物品種から該特定塩基配列のＲＮＡの有無を検査することによって、当該類似した植物品種が、該特定植物品種であるかどうかを識別するものである（特許文献５参照）。
しかし、この方法で開示した植物ウイルスは、多くの植物のうち菊の品種に対しては、接種しても、上葉、わき芽及び冬至芽に移行することがなく、よって、わき芽や冬至芽を挿し芽して、菊を増殖しても、次世代の菊に伝搬しない欠点を有し、そのため複数世代に亘って栄養繁殖した後の該菊の品種において、該植物ウイルスの特定塩基配列のＲＮＡを検出することにより、該菊の品種を識別する方法は、測定結果の信頼性が低く（誤判定の危険性が高く）、改良の余地があることが判明した。
【００１０】
さて、日本における菊の切り花は、農家が種苗会社等から供給された苗を自家増殖して生産をしている。このように菊は栄養繁殖で簡単に増殖できる植物であるが、現在、日本で種苗登録された菊品種が、海外で大量に無断増殖され、菊切り花として大量に日本に輸入されている。このような理由から菊品種の育成者権侵害を迅速に立証して、菊品種の育成者権を確実に保護する方法が望まれている。しかし、菊はゲノム分析や分子遺伝学的な研究がほとんど進んでおらず、上記のＤＮＡ多型による品種識別も確立されていない。
【非特許文献１】村林隆一、他４名、「植物新品種保護の実務−権利の取得と侵害−」、現代産業選書、２００４年５月２０日、ｐ．４２７−５８８
【特許文献１】特開２００４−１６００８号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２５３５号公報
【特許文献３】特開２００５−１６８３０９号公報
【特許文献４】特開２００５−２４５２４４号公報
【特許文献５】特開２００３−１９９４４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、菊に感染するキクＢウイルス（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ・ｖｉｒｕｓ・Ｂ）（以下、ＣＶＢということがある）、トマト黄化えそウイルス（Ｔｏｍａｔｏ・ｓｐｏｔｔｅｄ・ｗｉｌｔ・ｖｉｒｕｓ、ＴＳＷＶ）、トマトアスパーミィウイルス（Ｔｏｍａｔｏ・ａｓｐｅｒｍｙ・ｖｉｒｕｓ、ＴＡＶ）及びキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ・ｍｏｓａｉｃ・ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）等の植物ウイルスの中から、菊へのウイルス症状が軽微であるか又は全くの無症状であるキクＢウイルスを用いて、特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊に感染させると、該特定塩基配列からなるＲＮＡは、該菊全身に移行し、複数世代に亘って栄養繁殖した後の菊にまで伝搬して存在し、よって、該特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを保持した菊品種は、該特定塩基配列からなるＲＮＡを検出することにより、該菊品種であることを確実に識別できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１３】
即ち本発明は、
（１）配列番号１記載のＲＮＡを含有することを特徴とするキクＢウイルス。
（２）配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤。
（３）配列番号１記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有することを特徴とする菊。
（４）配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスに感染していることを特徴とする菊。
（５）特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊品種の繁殖体の該ＲＮＡを検査することを特徴とする菊の品種識別方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを、菊品種（原品種）に感染させることで、後日、該菊品種に類似した菊が多数出現した場合においても、これら類似した菊に、該特定塩基配列のＲＮＡが存在するか、否かを検査することによって、これら類似した菊が該菊品種（原品種）と同一品種であるかどうかを確実に識別できる。よって、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法を提供することが可能となり、該菊品種を無断増殖した菊である場合は、該菊は育成者権侵害品であることを迅速・的確に立証することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いるキクＢウイルス（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ・ｖｉｒｕｓ・Ｂ）は、ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄｅａ）科のカルラウイルス属（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）に属する。菊におけるこのウイルスの症状は、品種によって微かなウイルス症状を呈することもあるが、ほとんど無症状である。又、このウイルス粒子の形態と構造は屈曲の少ないひも状で、約６８５×１２ｎｍである。又、ゲノムは６つのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ・ｒｅａｄｉｎｇ・ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６からなり、ＯＲＦ１はＣＶＢのＲＮＡレプリカーゼをコードし、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４は、トリプル・ジーン・ブロック・プロテインを構成して、ＯＲＦ５はコート・プロテインをコードしている。
【００１６】
そして、本発明で用いるＣＶＢは、公知あるいは未公知の、特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢが挙げられる。未公知のＣＶＢは、圃場で栽培あるいは山野に自生している菊を採取し、該菊に感染しているＣＶＢを採取し、菊に感染した際の病徴が全く観察されず、含有する塩基配列のＲＮＡが安定して次世代の菊に伝搬する性質のＣＶＢを選択し、そのＲＮＡの塩基配列を決定することによって、目的とする特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを取得することが可能である。このような例としては、配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスが挙げられる。
【００１７】
又、本発明においてＣＶＢの菊への接種は、任意の品種、任意の育成段階における菊に対して可能である。
【００１８】
（１）特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢの選択
岩手県、山形県、新潟県、富山県、群馬県及び広島県など日本各地で栽培及び山野に自生している菊を採取し、以下の操作に従って、採取した菊からＣＶＢを分離する。
すなわち先ず、該菊の葉を約１００ｍｇ採取し、超低温にて凍結して乳鉢中で粉砕した後、６００μｌのＳＴＥ溶液（０．０５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡに１／１０量の１０％ＳＤＳと１／１００量の１％メルカプトエタノールを加える）と６００μｌのフェノール・クロロホルム（１：１）を加えて混合する。これを１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上層に１／３量の１０Ｍ・ＬｉＣｌを加えて混和し、−２０℃で１時間静置する。そして、１８０００×ｇで１５分間遠心分離した後、沈殿に５００μｌの２Ｍ・ＬｉＣｌを加えて完全に溶かし、再び１８０００×ｇで１５分間遠心分離する。これを７０％エタノールでリンスし、沈殿をＤＥＰＣ処理水に溶かして精製ＲＮＡを得る。単離したそれぞれのＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙ・Ａ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷して、アニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成する。そして、該−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｃｇａｇｇａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔａｃ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）とを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅する。そして、この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって、特定の塩基配列を有する未公知のＣＶＢを分離取得する。本発明では、９７６塩基サイズの３'末端側のｃＤＮＡ（５種類）を検出し、５種類の特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを分離取得することに成功した。
【００１９】
又、分離した５種類のＣＶＢは、その全塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、５種類のＣＶＢと公知のＣＶＢのＲＮＡ塩基配列を比較して、５種類のＣＶＢから特異的な塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを選抜するため、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属に属するジンチョウゲＳウイルス（Ｄａｐｈｎｅ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）、ホップ潜在ウイルス（Ｈｏｐ・ｌａｔｅｎｔ・ｖｉｒｕｓ）、ユリ潜在ウイルス（Ｌｉｌｙ・ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ・ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモＭウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｍ）ジャガイモＳウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）など他種類のウイルスとも、その相同性を比較した。その結果、５種類のＣＶＢの中から、ＯＲＦ４領域に特異的な塩基配列のＲＮＡを含むＣＶＢを見出して、本発明のＣＶＢ−Ｓを分離した。
【００２０】
なお、本発明のＣＶＢ−Ｓは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（受託拒否証明書における識別のための表示：ＣＶＢ−Ｓ）。よって、ＣＶＢ−Ｓは出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００２１】
（２）ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の作成
特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢに感染した菊葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）１〜５０ｍｌ（好ましくは５〜１５ｍｌ）を加えてミキサーで磨砕して、接種源となるＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤を得る。
【００２２】
（３）ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の菊への接種、感染方法
ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の菊への接種、感染方法は、当該品種識別剤を綿棒、指、ガラス棒などを用いて擦り付ける方法や菊を研磨剤又は摩擦剤等を用いて人為的に摩擦した後、その部分に該品種識別剤を接種する方法、該品種識別剤を直接注入する方法、スプレーガンによって該品種識別剤を噴霧する方法、又は菊の表面に該品種識別剤を噴霧した後、研磨剤を付着させたローラーを圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめると共に該植物体に接種する方法（特許第２９０８５９４号）、菊の表面にブラシを当接し該菊の表面を被傷させ、その前又は後ろにおいて菊の表面に該品種識別剤を接触させる方法（特開２０００−２０１５３５号）、或いは該品種識別剤を菊、或いは菊組織の一部に直接ジーンガンで撃ち込む方法等があり、その感染又は導入方法に制限はない。従って、該品種識別剤を菊へ接種して感染させる時期は、菊の任意の適宜な時期でよい。加えて、該菊の育成、又は栄養繁殖の方法は、通常の方法に従って行うことができ、その方法に制限はない。以上の方法によって、特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを、特定菊品種に標識することができる。
【００２３】
このようにして、菊苗に本発明のＣＶＢを感染させると、容易にＣＶＢが全身に感染した菊苗が得られる。したがって、この菊苗を適当な大きさに切断した後、挿し芽、又は生育した菊のわき芽の挿し芽、冬至芽の株分けや挿し芽などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易にＣＶＢが全身に感染した、菊苗が得られる。
【００２４】
又、ＣＶＢ感染菊苗からその一部（例えばわき芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得て、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、ＣＶＢ感染菊苗を大量に得ることができる。
【００２５】
又、このＣＶＢ感染菊苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望のＣＶＢが感染した菊苗を大量に得ることができる。
【００２６】
（４）菊の品種識別方法
被検体となる菊が標識した菊品種に由来するものかどうかを検査するには、該被検体となる菊のＣＶＢの在否、存在していた場合は、該ＣＶＢが含有する特定塩基配列のＲＮＡの有無を検査する。この検査によって、被検体の菊が該菊品種を栄養繁殖させたものか否か、つまり、同一品種か否かを識別できる。
【実施例１】
【００２７】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス）
岩手県、山形県、新潟県、富山県、群馬県及び広島県など日本各地で栽培及び自生している菊を採取し、以下の操作に従って、採取した菊から配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ）を分離した。
すなわち先ず、該菊の葉を約１００ｍｇ採取し、超低温にて凍結して乳鉢中で粉砕した後、６００μｌのＳＴＥ溶液（０．０５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡに１／１０量の１０％ＳＤＳと１／１００量の１％メルカプトエタノールを加える）と６００μｌのフェノール・クロロホルム（１：１）を加えて混合する。これを１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上層に１／３量の１０Ｍ・ＬｉＣｌを加え、混和し、−２０℃で１時間静置する。１８０００×ｇで１５分間遠心分離した後、沈殿に５００μｌの２Ｍ・ＬｉＣｌを加えて完全に溶かし、再び１８０００×ｇで１５分間遠心分離する。これを７０％エタノールでリンスし、沈殿をＤＥＰＣ処理水に溶かして精製ＲＮＡを得る。単離したそれぞれのＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙＡ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷して、アニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、該−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｃｇａｇｇａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔａｃ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）とを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅した。そして、この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって、ＣＶＢのＲＮＡに由来する９７６塩基サイズの３'末端側のｃＤＮＡを検出し、合計５種類のＣＶＢを単離した。
【００２８】
次いで、単離した５種類のＣＶＢの全塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、５種類のＣＶＢと２２種類の公知のＣＶＢのＲＮＡ塩基配列（下記、文献１及び２参照）を比較して、２７種類のＣＶＢから特異的な塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを選抜するため、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属に属するジンチョウゲＳウイルス（Ｄａｐｈｎｅ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）、ホップ潜在ウイルス（Ｈｏｐ・ｌａｔｅｎｔ・ｖｉｒｕｓ）、ユリ潜在ウイルス（Ｌｉｌｙ・ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ・ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモＭウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｍ）ジャガイモＳウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）など他種類のウイルスとも、その相同性を比較した。その結果、２７種類のＣＶＢの中から、ＯＲＦ４領域に特異的な塩基配列のＲＮＡを含むＣＶＢを見出して、本発明のＣＶＢ−Ｓを分離した。
文献１：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋ（配列データベース）
文献２：Ｋ．Ｌｅｖａｙ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｖｒｉｅｖ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，ｐ２３３３〜２３３７，１９９１
【実施例２】
【００２９】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤）
配列番号１のＲＮＡを含有するＣＶＢ−Ｓに感染した菊葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）１０ｍｌを加えてミキサーで磨砕して、接種源となるＣＶＢ−Ｓからなる菊の品種識別剤を得た。
【実施例３】
【００３０】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の感染菊苗の育成）（その１）
市販の植物用培養土とパーライトを４：１の割合で混合して、菊用の培養土を作成し、該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍの丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」（精興園の登録品種）の苗の葉の表面に実施例２のＣＶＢ−Ｓを含有してなる菊の品種識別剤をスプレーで噴霧した後、研磨剤である２５ミクロンの炭化ケイ素（カーボランダム＃６００（キシダ化学社製））を付着させたローラーを圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめてＣＶＢ−Ｓを接種した。このようにして、菊苗に本発明のＣＶＢ−Ｓを感染させ、ＣＶＢ−Ｓが全身に感染した菊苗を得た。
【実施例４】
【００３１】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その２）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗を温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、該菊の葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、該菊用培養土を充填した１２８穴トレイに挿し芽し、温室内で育苗した。このようにして、ＣＶＢ−Ｓが全身に感染した菊苗を多量に得た。
【実施例５】
【００３２】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その３）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗からその一部（わき芽）を採り、７５％含水エタノールで消毒した後、ナフタリン酢酸０．５ｍｌ／Ｌとベンジルアデニン０．０５ｍｌ／Ｌを含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された温室内で、２５℃、５０００ｌｕｘの条件下で育成し、幼苗（本葉の十分展開した幼苗）を得て、この葉片を適当な大きさに切断したあと、同じ寒天培地に４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接根や不定芽を再生し、ＣＶＢ−Ｓ感染菊苗を大量に得た。
【実施例６】
【００３３】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その４）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗から葉片を採り、実施例５に記載したものと同じ寒天培地に４回移植して、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望のＣＶＢ−Ｓが感染した菊苗を大量に得た。
【実施例７】
【００３４】
（菊の品種識別方法）
市場出荷を目的として菊を栽培する場合は、摘芯して発生したわき芽で苗を作り、植替えを行って増殖する。よって、このように菊を増殖する際のＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行と挿し芽した菊への伝搬を調査するために、
（１）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊から伸びるわき芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行）。
（２）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊から伸びたわき芽を挿し芽し、その挿し芽から発生するわき芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓの次世代の菊への伝搬）。
（３）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊の根元から伸びる冬至芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行）を試験調査した。
【００３５】
（ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行）
該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗４株に、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行を以下のＲＴ−ＰＣＲによって調査した。
【００３６】
実施例１に記載した方法で、かき取ったわき芽の葉からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙ・Ａ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷してアニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、この−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｇｇｔｇｇｔｇｔｇｔａｔａａｇｇａｃｇｇ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｔｃｇｃｃｔｃｔｔｃｃｇｃｃｇｔｔｃｇ）を１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅した。この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ・ＰＣＲ・ＤＮＡ・ａｎｄ・Ｇｅｌ・Ｂａｎｄ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ・ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製し、得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ・Ｔ・Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入しクローニングして、このクローニングしたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し電気泳動することによって該ｃＤＮＡの存在を確認した。そして、ＣＶＢ−ＳのＯＲＦ４領域のＲＮＡ部位を含有する５２７塩基サイズの該ｃＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを、かき取った全てのわき芽から検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓは、菊のわき芽に安定して移行することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【実施例８】
【００３７】
（ＣＶＢ−Ｓの次世代の菊への伝搬）
該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗４株に、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、該菊用培養土を充填した１２８穴トレイに挿し芽し、温室内で育苗した。次いでその挿し芽から発生したわき芽にＣＶＢ−Ｓが感染しているかどうかを実施例７と同様にＲＴ−ＰＣＲで調査した。又、同じ挿し芽から発生した別のわき芽を、該菊培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに挿し芽して、発生するわき芽の一つをＲＴ−ＰＣＲ分析し、もう一つのわき芽を、該菊培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに挿し芽した。このような操作を該菊４株について５回繰り返した。その結果、ＲＴ−ＰＣＲ分析した全てのわき芽から、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓは、菊の挿し芽に伝搬することを確認し、栄養繁殖した次世代の菊に安定して伝搬することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を５世代以上にわたって容易に行うことができる。
【実施例９】
【００３８】
（ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行）
２００４年１１月、該菊用培養土を敷き詰めた温室内の圃場に菊品種「精興新年」の苗４株を定植し、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、育苗した。そして、翌２００５年３月に開花した後、２００５年４月に該菊株の根元から発生した全ての冬至芽９本をかき取って、ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行を実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲで調査した。その結果、発生した全ての冬至芽から、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓが菊の冬至芽に安定して移行することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の冬至芽の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【００３９】
実施例１〜９から、本発明のＣＶＢ−Ｓが含有する配列番号１のＲＮＡは、感染後菊全身に移行して、挿し芽した次世代の菊にも安定して伝搬することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、本発明の配列番号１のＲＮＡを検出することによって、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【００４０】
比較例１
（公知の植物品種の識別剤の菊全身への移行確認試験）
公知の植物品種の識別剤である特開平２００３−１９９４４６号記載の配列番号１、２、３、４、５及び６の塩基配列（本願明細書においては配列番号２、３、４、５、６及び７）のサテライトＲＮＡを含有するキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ・ｍｏｓａｉｃ・ｖｉｒｕｓ・ＣＭＶ）からなる識別剤（以下、それぞれをＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３と表すことがある）を特開２００３−１９９４４６号の実施例記載の方法によって得た。
【００４１】
公知の植物品種の識別剤であるＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５又はＮＤＭ−３を、該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗１７株にそれぞれ感染させて育苗し、該菊株を摘芯した。そして、該公知識別剤の接種葉、上位葉、わき芽及び花後の冬至芽への移行を以下のＲＴ−ＰＣＲによって調査した。
【００４２】
実施例１に記載した方法で、該菊の葉又は冬至芽からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ（約３μｇ）と配列番号２、３、４、５、６又は７のＲＮＡの３’末端配列に相補的なＤＮＡプライマー１μＭを９５℃で熱処理し徐冷してアニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、これら−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端に相同的なＤＮＡプライマーを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７４℃１分間の反応を３５回繰り返して増幅した。次いでこれら増幅したｃＤＮＡの１．５％アガロースゲル電気泳動を行ったが、接種葉においては、配列番号２〜７のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが検出されたものがいくつかあったが、上葉、わき芽及び冬至芽については、該ｃＤＮＡは全く検出されなかった。この結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
単位：株数
【００４４】
以上の結果より、公知識別剤のＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３は、菊の全身に移行せず、よって、わき芽や冬至芽を挿し芽して、菊を増殖しても、公知識別剤のＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３３は、次世代の菊に伝搬しないことが分かる。これに対し、実施例１〜９の結果から本発明のＣＶＢ−Ｓは、該菊全身に移行し、複数世代に亘って栄養繁殖した後の菊にまで伝搬して存在し、よって、該特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを保持した菊品種は、該特定塩基配列からなるＲＮＡを検出することにより、該菊品種であることを確実に識別でき、特定塩基配列のサテライトＲＮＡを含有する弱毒ＣＭＶからなるＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３に比べ、菊の品種識別剤に適していることが分かる。
【００４５】
なお、上記の各配列番号のＲＮＡの由来を以下に示す。
配列番号１：起源株はＣＶＢ、ＣＶＢ−Ｓである。
配列番号２：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号３：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号４：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号５：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号６：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号７：起源株はＣＭＶ・ＮＤＭ−３である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物が品種登録された場合には、その植物について育成者権が発生する（種苗法第１９条）。そして、権利者はこれを侵害（無断利用）する者に対しては、民事上、差止請求訴訟（種苗法第３３条）や損害賠償請求訴訟（民法第７０９条）が提起できる。そして訴訟では、権利者（原告）は育成者権の内容（登録品種の特性）を主張・立証し、被告の具体的な利用行為が、当該登録品種と同一品種或いは、登録品種と特性によって明確に区別されない品種を利用するものであることを主張・立証しなければならない（種苗法第２０条）。そこで侵害被疑品種（被告品種）と登録品種の同一性を確認するため、以下の登録品種と侵害被疑品種の特性を調査する必要がある。
（１）特性の比較（植物体同士を比較し、特性を調査する）
（２）比較栽培による調査（植物体同士を同一条件下で栽培しながら特性を調査する）
【０００３】
しかし、権利行使段階において、（１）や（２）のように植物体同士を栽培し目視（肉眼による観察）及び計測により比較して、その特性の一致・不一致を検証していくことは非常に大変であり時間もかかる。そこで、迅速、簡便であり、比較栽培のための植物体への再生が困難な試料でも識別が可能であり、生産現場の環境の影響を受けずに結果が安定しているＤＮＡ分析手段を用いて、登録品種と侵害被疑品種とを比較し、そのＤＮＡ塩基配列の異同によって同一性を判断する技術が開発された。具体的には、登録品種のＤＮＡ塩基配列において、同一品種内の個体間では同じであるが、他品種では異なる部分を検出することにより、ある植物体のＤＮＡ塩基配列における当該異なる部分の有無を調査して、同一品種か否かを識別する技術が開発された（非特許文献１参照）。
【０００４】
また具体的な植物の品種識別方法として、以下の方法が知られている。
豆類の品種識別方法
近縁の種で外観上の特徴で見分けることが困難な豆類の品種判別を行うための方法として、特定品種の豆類において、ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ・ａｍｐｌｉｆｉｅｄ・ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ・ＤＮＡ：ランダム増幅多型ＤＮＡ）マーカーと成り得るプライマーを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ・ｃｈａｉｎ・ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）によるＰＣＲ産物中の特異断片の塩基配列を決定して、その特異断片の一部を特異的に増幅するプライマーを得る。そして、得られたプライマーを品種判別する豆類から抽出したＤＮＡに加えてＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片の有無、断片が存在する場合はその大きさ及び断片のバンドの発色の濃さを調べ、検出されたＤＮＡ断片の大きさ及びそのパターンに応じて豆類の品種を判別する方法（特許文献１参照）。
【０００５】
イチゴの品種識別方法
イチゴの品種識別は、従来、果実の大きさ、葉の形や大きさ、草型等の形質の比較によって行われてきたが、この方法では正確な判断が極めて困難である上に、苗の大きさや生育状態をそろえて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することができず、また、市場に流通しているイチゴは、多様な条件下で栽培されているため、従来の方法ではイチゴの品種を識別することは困難であった。そこでこの問題を解決すべく、イチゴの果実、ガク、葉及び茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で相違性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物を制限酵素で処理して得られるＤＮＡの多型を検出し、これを識別することによって、イチゴの品種を識別する方法が開発された（特許文献２参照）。
【０００６】
イグサの品種識別方法
イグサの品種特性は、従来、茎長（草丈）、茎の太さ、幹茎色（茎の色）、茎数（一株当たりの茎の数）、花序着生率（着花の頻度）、先枯れ程度（先端部分の枯れの程度）など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これら特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品質の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。そのため、一旦入手経路が不確実になるとイグサがどの品種であるのかを判断することは困難であり、その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失なわれたり、或いは優良品種の盗難、不法栽培を防止することができなかった。そこでこの問題を解決すべく、優良イグサ品種「ひのみどり」に特異的なＤＮＡ断片を同定し、該ＤＮＡ断片を用いることにより、イグサ品種の識別をする方法が開発された（特許文献３参照）。
【０００７】
米の品種識別方法
消費者の良食米志向を受けて、高値で取引されている「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」及び「あきたこまち」にこれら良食米以外の米を混入し、表示を偽って販売される不正混米が行われている。このような状況下、包装された米の内容と表示が一致しているかどうかを検査する方法として、米由来のＤＮＡにおける特定の塩基配列の存在を、該配列若しくはその相補鎖のうちの連続する８塩基以上の配列を有する３つの単鎖ヌクレオチドを使用して、そのうち２つの単鎖ヌクレオチドを核酸増幅法の対合プライマーとして使用して得た増幅ＤＮＡ断片を、残りの１つの単鎖ヌクレオチドをプローブに用いて検出する、米の品種識別方法が開発された（特許文献４参照）。
【０００８】
以上のＤＮＡマーカーによる植物の品種識別方法は、特定プライマーを用いて、ＰＣＲ法によって増幅した特定のＤＮＡを特定の制限酵素で切断して多型を生じさせ、その多型のパターン（ＤＮＡマーカー）によって品種を識別するか、これら複数のＤＮＡマーカーの組合せパターンによって、品種を識別する。しかし、当該特定ＤＮＡマーカーを決定するには、同一品種内の個体間では相同であるが、全品種間では相違が生ずるＤＮＡ領域、又は相違が生ずるＤＮＡ領域の組合せを検討する必要があり、多大な研究費用と時間がかかる。
【０００９】
一方、本発明者等は、植物品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の植物品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うために、特定塩基配列のＲＮＡを含有する植物ウイルスを特定植物品種に接種して感染させ、複数世代に亘って栄養繁殖した後の該植物体から、該特定塩基配列のＲＮＡを検出することにより、該特定植物品種を識別することができる特定塩基配列のＲＮＡを含有する植物ウイルスからなる植物品種の識別剤を開発した。この植物品種の識別剤は、特定植物品種に非常に類似した植物品種から該特定塩基配列のＲＮＡの有無を検査することによって、当該類似した植物品種が、該特定植物品種であるかどうかを識別するものである（特許文献５参照）。
しかし、この方法で開示した植物ウイルスは、多くの植物のうち菊の品種に対しては、接種しても、上葉、わき芽及び冬至芽に移行することがなく、よって、わき芽や冬至芽を挿し芽して、菊を増殖しても、次世代の菊に伝搬しない欠点を有し、そのため複数世代に亘って栄養繁殖した後の該菊の品種において、該植物ウイルスの特定塩基配列のＲＮＡを検出することにより、該菊の品種を識別する方法は、測定結果の信頼性が低く（誤判定の危険性が高く）、改良の余地があることが判明した。
【００１０】
さて、日本における菊の切り花は、農家が種苗会社等から供給された苗を自家増殖して生産をしている。このように菊は栄養繁殖で簡単に増殖できる植物であるが、現在、日本で種苗登録された菊品種が、海外で大量に無断増殖され、菊切り花として大量に日本に輸入されている。このような理由から菊品種の育成者権侵害を迅速に立証して、菊品種の育成者権を確実に保護する方法が望まれている。しかし、菊はゲノム分析や分子遺伝学的な研究がほとんど進んでおらず、上記のＤＮＡ多型による品種識別も確立されていない。
【非特許文献１】村林隆一、他４名、「植物新品種保護の実務−権利の取得と侵害−」、現代産業選書、２００４年５月２０日、ｐ．４２７−５８８
【特許文献１】特開２００４−１６００８号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２５３５号公報
【特許文献３】特開２００５−１６８３０９号公報
【特許文献４】特開２００５−２４５２４４号公報
【特許文献５】特開２００３−１９９４４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うための、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決するため、種々検討を重ねた結果、菊に感染するキクＢウイルス（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ・ｖｉｒｕｓ・Ｂ）（以下、ＣＶＢということがある）、トマト黄化えそウイルス（Ｔｏｍａｔｏ・ｓｐｏｔｔｅｄ・ｗｉｌｔ・ｖｉｒｕｓ、ＴＳＷＶ）、トマトアスパーミィウイルス（Ｔｏｍａｔｏ・ａｓｐｅｒｍｙ・ｖｉｒｕｓ、ＴＡＶ）及びキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ・ｍｏｓａｉｃ・ｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）等の植物ウイルスの中から、菊へのウイルス症状が軽微であるか又は全くの無症状であるキクＢウイルスを用いて、特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊に感染させると、該特定塩基配列からなるＲＮＡは、該菊全身に移行し、複数世代に亘って栄養繁殖した後の菊にまで伝搬して存在し、よって、該特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを保持した菊品種は、該特定塩基配列からなるＲＮＡを検出することにより、該菊品種であることを確実に識別できることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１３】
即ち本発明は、
（１）配列番号１記載のＲＮＡを含有することを特徴とするキクＢウイルス。
（２）配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤。
（３）配列番号１記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有することを特徴とする菊。
（４）配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスに感染していることを特徴とする菊。
（５）特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊品種の繁殖体の該ＲＮＡを検査することを特徴とする菊の品種識別方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを、菊品種（原品種）に感染させることで、後日、該菊品種に類似した菊が多数出現した場合においても、これら類似した菊に、該特定塩基配列のＲＮＡが存在するか、否かを検査することによって、これら類似した菊が該菊品種（原品種）と同一品種であるかどうかを確実に識別できる。よって、識別結果の信頼性が非常に高い、菊の品種識別剤及び品種識別方法を提供することが可能となり、該菊品種を無断増殖した菊である場合は、該菊は育成者権侵害品であることを迅速・的確に立証することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いるキクＢウイルス（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ・ｖｉｒｕｓ・Ｂ）は、ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄｅａ）科のカルラウイルス属（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）に属する。菊におけるこのウイルスの症状は、品種によって微かなウイルス症状を呈することもあるが、ほとんど無症状である。又、このウイルス粒子の形態と構造は屈曲の少ないひも状で、約６８５×１２ｎｍである。又、ゲノムは６つのオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ・ｒｅａｄｉｎｇ・ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５及びＯＲＦ６からなり、ＯＲＦ１はＣＶＢのＲＮＡレプリカーゼをコードし、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４は、トリプル・ジーン・ブロック・プロテインを構成して、ＯＲＦ５はコート・プロテインをコードしている。
【００１６】
そして、本発明で用いるＣＶＢは、公知あるいは未公知の、特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢが挙げられる。未公知のＣＶＢは、圃場で栽培あるいは山野に自生している菊を採取し、該菊に感染しているＣＶＢを採取し、菊に感染した際の病徴が全く観察されず、含有する塩基配列のＲＮＡが安定して次世代の菊に伝搬する性質のＣＶＢを選択し、そのＲＮＡの塩基配列を決定することによって、目的とする特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを取得することが可能である。このような例としては、配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスが挙げられる。
【００１７】
又、本発明においてＣＶＢの菊への接種は、任意の品種、任意の育成段階における菊に対して可能である。
【００１８】
（１）特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢの選択
岩手県、山形県、新潟県、富山県、群馬県及び広島県など日本各地で栽培及び山野に自生している菊を採取し、以下の操作に従って、採取した菊からＣＶＢを分離する。
すなわち先ず、該菊の葉を約１００ｍｇ採取し、超低温にて凍結して乳鉢中で粉砕した後、６００μｌのＳＴＥ溶液（０．０５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡに１／１０量の１０％ＳＤＳと１／１００量の１％メルカプトエタノールを加える）と６００μｌのフェノール・クロロホルム（１：１）を加えて混合する。これを１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上層に１／３量の１０Ｍ・ＬｉＣｌを加えて混和し、−２０℃で１時間静置する。そして、１８０００×ｇで１５分間遠心分離した後、沈殿に５００μｌの２Ｍ・ＬｉＣｌを加えて完全に溶かし、再び１８０００×ｇで１５分間遠心分離する。これを７０％エタノールでリンスし、沈殿をＤＥＰＣ処理水に溶かして精製ＲＮＡを得る。単離したそれぞれのＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙ・Ａ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷して、アニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成する。そして、該−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｃｇａｇｇａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔａｃ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）とを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅する。そして、この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって、特定の塩基配列を有する未公知のＣＶＢを分離取得する。本発明では、９７６塩基サイズの３'末端側のｃＤＮＡ（５種類）を検出し、５種類の特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを分離取得することに成功した。
【００１９】
又、分離した５種類のＣＶＢは、その全塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、５種類のＣＶＢと公知のＣＶＢのＲＮＡ塩基配列を比較して、５種類のＣＶＢから特異的な塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを選抜するため、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属に属するジンチョウゲＳウイルス（Ｄａｐｈｎｅ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）、ホップ潜在ウイルス（Ｈｏｐ・ｌａｔｅｎｔ・ｖｉｒｕｓ）、ユリ潜在ウイルス（Ｌｉｌｙ・ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ・ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモＭウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｍ）ジャガイモＳウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）など他種類のウイルスとも、その相同性を比較した。その結果、５種類のＣＶＢの中から、ＯＲＦ４領域に特異的な塩基配列のＲＮＡを含むＣＶＢを見出して、本発明のＣＶＢ−Ｓを分離した。
【００２０】
なお、本発明のＣＶＢ−Ｓは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて受託が拒否されている（受託拒否証明書における識別のための表示：ＣＶＢ−Ｓ）。よって、ＣＶＢ−Ｓは出願人自らが保管し、特許法施行規則第２７条の３の規定に準じて、譲渡を行う用意がある（保管場所：〒３７８−００１６、群馬県沼田市清水町３７８４番地、日本デルモンテ株式会社、研究開発本部、植物ワクチン開発部）。
【００２１】
（２）ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の作成
特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢに感染した菊葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）１〜５０ｍｌ（好ましくは５〜１５ｍｌ）を加えてミキサーで磨砕して、接種源となるＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤を得る。
【００２２】
（３）ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の菊への接種、感染方法
ＣＶＢを含有してなる菊の品種識別剤の菊への接種、感染方法は、当該品種識別剤を綿棒、指、ガラス棒などを用いて擦り付ける方法や菊を研磨剤又は摩擦剤等を用いて人為的に摩擦した後、その部分に該品種識別剤を接種する方法、該品種識別剤を直接注入する方法、スプレーガンによって該品種識別剤を噴霧する方法、又は菊の表面に該品種識別剤を噴霧した後、研磨剤を付着させたローラーを圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめると共に該植物体に接種する方法（特許第２９０８５９４号）、菊の表面にブラシを当接し該菊の表面を被傷させ、その前又は後ろにおいて菊の表面に該品種識別剤を接触させる方法（特開２０００−２０１５３５号）、或いは該品種識別剤を菊、或いは菊組織の一部に直接ジーンガンで撃ち込む方法等があり、その感染又は導入方法に制限はない。従って、該品種識別剤を菊へ接種して感染させる時期は、菊の任意の適宜な時期でよい。加えて、該菊の育成、又は栄養繁殖の方法は、通常の方法に従って行うことができ、その方法に制限はない。以上の方法によって、特定塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを、特定菊品種に標識することができる。
【００２３】
このようにして、菊苗に本発明のＣＶＢを感染させると、容易にＣＶＢが全身に感染した菊苗が得られる。したがって、この菊苗を適当な大きさに切断した後、挿し芽、又は生育した菊のわき芽の挿し芽、冬至芽の株分けや挿し芽などの栄養繁殖手段を採用して、通常の育苗管理をすると、容易にＣＶＢが全身に感染した、菊苗が得られる。
【００２４】
又、ＣＶＢ感染菊苗からその一部（例えばわき芽）を採り、消毒した後、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された室内で、至適な温度、照度条件下で育成し、幼苗（例えば本葉の十分展開した幼苗）を得て、この葉片を適当な大きさに切断したあと、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接誘導させた不定芽から個体の再生を行い、ＣＶＢ感染菊苗を大量に得ることができる。
【００２５】
又、このＣＶＢ感染菊苗から一部を採り、植物ホルモンを適宜の濃度で含有する寒天培地に２〜４回移植し、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望のＣＶＢが感染した菊苗を大量に得ることができる。
【００２６】
（４）菊の品種識別方法
被検体となる菊が標識した菊品種に由来するものかどうかを検査するには、該被検体となる菊のＣＶＢの在否、存在していた場合は、該ＣＶＢが含有する特定塩基配列のＲＮＡの有無を検査する。この検査によって、被検体の菊が該菊品種を栄養繁殖させたものか否か、つまり、同一品種か否かを識別できる。
【実施例１】
【００２７】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス）
岩手県、山形県、新潟県、富山県、群馬県及び広島県など日本各地で栽培及び自生している菊を採取し、以下の操作に従って、採取した菊から配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ）を分離した。
すなわち先ず、該菊の葉を約１００ｍｇ採取し、超低温にて凍結して乳鉢中で粉砕した後、６００μｌのＳＴＥ溶液（０．０５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ・ＮａＣｌ、２ｍＭ・ＥＤＴＡに１／１０量の１０％ＳＤＳと１／１００量の１％メルカプトエタノールを加える）と６００μｌのフェノール・クロロホルム（１：１）を加えて混合する。これを１８０００×ｇで１０分間遠心分離し、上層に１／３量の１０Ｍ・ＬｉＣｌを加え、混和し、−２０℃で１時間静置する。１８０００×ｇで１５分間遠心分離した後、沈殿に５００μｌの２Ｍ・ＬｉＣｌを加えて完全に溶かし、再び１８０００×ｇで１５分間遠心分離する。これを７０％エタノールでリンスし、沈殿をＤＥＰＣ処理水に溶かして精製ＲＮＡを得る。単離したそれぞれのＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙＡ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷して、アニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、該−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｃｇａｇｇａｔａｔｇｇｔｇａａｇａｔａｃ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）とを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅した。そして、この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって、ＣＶＢのＲＮＡに由来する９７６塩基サイズの３'末端側のｃＤＮＡを検出し、合計５種類のＣＶＢを単離した。
【００２８】
次いで、単離した５種類のＣＶＢの全塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、５種類のＣＶＢと２２種類の公知のＣＶＢのＲＮＡ塩基配列（下記、文献１及び２参照）を比較して、２７種類のＣＶＢから特異的な塩基配列のＲＮＡを含有するＣＶＢを選抜するため、カルラウイルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）属に属するジンチョウゲＳウイルス（Ｄａｐｈｎｅ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）、ホップ潜在ウイルス（Ｈｏｐ・ｌａｔｅｎｔ・ｖｉｒｕｓ）、ユリ潜在ウイルス（Ｌｉｌｙ・ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ・ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモＭウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｍ）ジャガイモＳウイルス（Ｐｏｔａｔｏ・ｖｉｒｕｓ・Ｓ）など他種類のウイルスとも、その相同性を比較した。その結果、２７種類のＣＶＢの中から、ＯＲＦ４領域に特異的な塩基配列のＲＮＡを含むＣＶＢを見出して、本発明のＣＶＢ−Ｓを分離した。
文献１：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋ（配列データベース）
文献２：Ｋ．Ｌｅｖａｙ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｖｒｉｅｖ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，ｐ２３３３〜２３３７，１９９１
【実施例２】
【００２９】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤）
配列番号１のＲＮＡを含有するＣＶＢ−Ｓに感染した菊葉１ｇに緩衝液（中性付近の０．１Ｍリン酸緩衝液）１０ｍｌを加えてミキサーで磨砕して、接種源となるＣＶＢ−Ｓからなる菊の品種識別剤を得た。
【実施例３】
【００３０】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の感染菊苗の育成）（その１）
市販の植物用培養土とパーライトを４：１の割合で混合して、菊用の培養土を作成し、該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍの丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」（精興園の登録品種）の苗の葉の表面に実施例２のＣＶＢ−Ｓを含有してなる菊の品種識別剤をスプレーで噴霧した後、研磨剤である２５ミクロンの炭化ケイ素（カーボランダム＃６００（キシダ化学社製））を付着させたローラーを圧接回転せしめ、該表面を被傷せしめてＣＶＢ−Ｓを接種した。このようにして、菊苗に本発明のＣＶＢ−Ｓを感染させ、ＣＶＢ−Ｓが全身に感染した菊苗を得た。
【実施例４】
【００３１】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その２）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗を温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、該菊の葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、該菊用培養土を充填した１２８穴トレイに挿し芽し、温室内で育苗した。このようにして、ＣＶＢ−Ｓが全身に感染した菊苗を多量に得た。
【実施例５】
【００３２】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その３）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗からその一部（わき芽）を採り、７５％含水エタノールで消毒した後、ナフタリン酢酸０．５ｍｌ／Ｌとベンジルアデニン０．０５ｍｌ／Ｌを含有する寒天培地に挿し芽し、外界と隔離された温室内で、２５℃、５０００ｌｕｘの条件下で育成し、幼苗（本葉の十分展開した幼苗）を得て、この葉片を適当な大きさに切断したあと、同じ寒天培地に４回移植し、通常の植物体の組織培養法と同様に操作して、葉片から直接根や不定芽を再生し、ＣＶＢ−Ｓ感染菊苗を大量に得た。
【実施例６】
【００３３】
（配列番号１のＲＮＡを含有するキクＢウイルス（ＣＶＢ−Ｓ）の保有菊苗の育成）（その４）
実施例３で得られたＣＶＢ−Ｓ感染菊苗から葉片を採り、実施例５に記載したものと同じ寒天培地に４回移植して、カルスから誘導させた不定芽から個体の再生を行い、所望のＣＶＢ−Ｓが感染した菊苗を大量に得た。
【実施例７】
【００３４】
（菊の品種識別方法）
市場出荷を目的として菊を栽培する場合は、摘芯して発生したわき芽で苗を作り、植替えを行って増殖する。よって、このように菊を増殖する際のＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行と挿し芽した菊への伝搬を調査するために、
（１）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊から伸びるわき芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行）。
（２）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊から伸びたわき芽を挿し芽し、その挿し芽から発生するわき芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓの次世代の菊への伝搬）。
（３）ＣＶＢ−Ｓの感染した菊の根元から伸びる冬至芽には、ＣＶＢ−Ｓが感染しているか（ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行）を試験調査した。
【００３５】
（ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行）
該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗４株に、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、ＣＶＢ−Ｓのわき芽への移行を以下のＲＴ−ＰＣＲによって調査した。
【００３６】
実施例１に記載した方法で、かき取ったわき芽の葉からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ（約３μｇ）と３’末端ｐｏｌｙ・Ａ配列に相補的なＤＮＡプライマー（ｇｇｃｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ）１μＭを９５℃で熱処理し徐冷してアニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、この−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｃｇｇｔｇｇｔｇｔｇｔａｔａａｇｇａｃｇｇ）と３’末端に相同的なＤＮＡプライマー（ｔｃｇｃｃｔｃｔｔｃｃｇｃｃｇｔｔｃｇ）を１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、６２℃４０秒間、７２℃１分間の反応を４０回繰り返して増幅した。この増幅したｃＤＮＡを１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離した後、ゲルより切り出し、ＤＮＡ回収キットＧＦＸ・ＰＣＲ・ＤＮＡ・ａｎｄ・Ｇｅｌ・Ｂａｎｄ・Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ・ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製し、得られたｃＤＮＡをＴ−Ａクローニング用ベクターｐＧＥＭ・Ｔ・Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入しクローニングして、このクローニングしたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し電気泳動することによって該ｃＤＮＡの存在を確認した。そして、ＣＶＢ−ＳのＯＲＦ４領域のＲＮＡ部位を含有する５２７塩基サイズの該ｃＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ・ｐｒｉｓｍ・３７００・ＤＮＡ・ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定し、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを、かき取った全てのわき芽から検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓは、菊のわき芽に安定して移行することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【実施例８】
【００３７】
（ＣＶＢ−Ｓの次世代の菊への伝搬）
該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗４株に、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、温室内で育苗し、該菊株を摘芯した。そして、４ヶ月間、葉の付け根から発生するわき芽をかき取って、該菊用培養土を充填した１２８穴トレイに挿し芽し、温室内で育苗した。次いでその挿し芽から発生したわき芽にＣＶＢ−Ｓが感染しているかどうかを実施例７と同様にＲＴ−ＰＣＲで調査した。又、同じ挿し芽から発生した別のわき芽を、該菊培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに挿し芽して、発生するわき芽の一つをＲＴ−ＰＣＲ分析し、もう一つのわき芽を、該菊培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに挿し芽した。このような操作を該菊４株について５回繰り返した。その結果、ＲＴ−ＰＣＲ分析した全てのわき芽から、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓは、菊の挿し芽に伝搬することを確認し、栄養繁殖した次世代の菊に安定して伝搬することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を５世代以上にわたって容易に行うことができる。
【実施例９】
【００３８】
（ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行）
２００４年１１月、該菊用培養土を敷き詰めた温室内の圃場に菊品種「精興新年」の苗４株を定植し、本発明のＣＶＢ−Ｓを実施例３に記載した方法で感染させて、育苗した。そして、翌２００５年３月に開花した後、２００５年４月に該菊株の根元から発生した全ての冬至芽９本をかき取って、ＣＶＢ−Ｓの冬至芽への移行を実施例１と同様にＲＴ−ＰＣＲで調査した。その結果、発生した全ての冬至芽から、配列番号１のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを検出した。これより、本発明のＣＶＢ−Ｓが菊の冬至芽に安定して移行することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の冬至芽の菊品種間において、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【００３９】
実施例１〜９から、本発明のＣＶＢ−Ｓが含有する配列番号１のＲＮＡは、感染後菊全身に移行して、挿し芽した次世代の菊にも安定して伝搬することが分かり、菊品種、特に栄養繁殖した、相互に非常に類似する２種以上の菊品種間において、本発明の配列番号１のＲＮＡを検出することによって、一方の品種が他方の品種と同一品種であるか否かの識別を容易に行うことができる。
【００４０】
比較例１
（公知の植物品種の識別剤の菊全身への移行確認試験）
公知の植物品種の識別剤である特開平２００３−１９９４４６号記載の配列番号１、２、３、４、５及び６の塩基配列（本願明細書においては配列番号２、３、４、５、６及び７）のサテライトＲＮＡを含有するキュウリモザイクウイルス（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ・ｍｏｓａｉｃ・ｖｉｒｕｓ・ＣＭＶ）からなる識別剤（以下、それぞれをＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３と表すことがある）を特開２００３−１９９４４６号の実施例記載の方法によって得た。
【００４１】
公知の植物品種の識別剤であるＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５又はＮＤＭ−３を、該菊用培養土を充填した直径１０．５ｃｍ丸型ポットに定植した菊品種「精興新年」の苗１７株にそれぞれ感染させて育苗し、該菊株を摘芯した。そして、該公知識別剤の接種葉、上位葉、わき芽及び花後の冬至芽への移行を以下のＲＴ−ＰＣＲによって調査した。
【００４２】
実施例１に記載した方法で、該菊の葉又は冬至芽からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡ（約３μｇ）と配列番号２、３、４、５、６又は７のＲＮＡの３’末端配列に相補的なＤＮＡプライマー１μＭを９５℃で熱処理し徐冷してアニーリングした後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ・Ｒｅｖｅｒｓｅ・Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、３７℃、６０分の条件で−鎖ｃＤＮＡを合成した。そして、これら−鎖ｃＤＮＡを、＋鎖ＲＮＡの５’末端に相同的なＤＮＡプライマーと３’末端に相同的なＤＮＡプライマーを１μＭずつ用い、ＰＣＲで９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７４℃１分間の反応を３５回繰り返して増幅した。次いでこれら増幅したｃＤＮＡの１．５％アガロースゲル電気泳動を行ったが、接種葉においては、配列番号２〜７のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが検出されたものがいくつかあったが、上葉、わき芽及び冬至芽については、該ｃＤＮＡは全く検出されなかった。この結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
単位：株数
【００４４】
以上の結果より、公知識別剤のＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３は、菊の全身に移行せず、よって、わき芽や冬至芽を挿し芽して、菊を増殖しても、公知識別剤のＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３３は、次世代の菊に伝搬しないことが分かる。これに対し、実施例１〜９の結果から本発明のＣＶＢ−Ｓは、該菊全身に移行し、複数世代に亘って栄養繁殖した後の菊にまで伝搬して存在し、よって、該特定塩基配列からなるＲＮＡを含有するキクＢウイルスを保持した菊品種は、該特定塩基配列からなるＲＮＡを検出することにより、該菊品種であることを確実に識別でき、特定塩基配列のサテライトＲＮＡを含有する弱毒ＣＭＶからなるＫＯ２、ＫＯ３、ＫＯ１、ＫＯ４、ＫＯ５及びＮＤＭ−３に比べ、菊の品種識別剤に適していることが分かる。
【００４５】
なお、上記の各配列番号のＲＮＡの由来を以下に示す。
配列番号１：起源株はＣＶＢ、ＣＶＢ−Ｓである。
配列番号２：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号３：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号４：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号５：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号６：起源株は特開２００３−１９９４４６号公報において調製したＣＭＶである。
配列番号７：起源株はＣＭＶ・ＮＤＭ−３である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のＲＮＡを含有することを特徴とするキクＢウイルス。
【請求項２】
配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤。
【請求項３】
配列番号１記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有することを特徴とする菊。
【請求項４】
配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスに感染していることを特徴とする菊。
【請求項５】
特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊品種の繁殖体の該ＲＮＡを検査することを特徴とする菊の品種識別方法。
【請求項１】
配列番号１記載のＲＮＡを含有することを特徴とするキクＢウイルス。
【請求項２】
配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを含有してなる菊の品種識別剤。
【請求項３】
配列番号１記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有することを特徴とする菊。
【請求項４】
配列番号１記載のＲＮＡを含有するキクＢウイルスに感染していることを特徴とする菊。
【請求項５】
特定塩基配列のＲＮＡを含有するキクＢウイルスを菊品種に感染させて、該キクＢウイルス感染菊品種を得、これを栄養繁殖させた後、該菊品種の繁殖体の該ＲＮＡを検査することを特徴とする菊の品種識別方法。
【公開番号】特開２００７−１８５１４３（Ｐ２００７−１８５１４３Ａ）
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６３２６（Ｐ２００６−６３２６）
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１３日（２００６．１．１３）
【出願人】（０００１０４５５９）日本デルモンテ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
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