薬剤
【課題】アトピー性皮膚炎や花粉症、喘息、がん等の自己免疫疾患は難治性であり、有効な治療薬がほとんどない。マクロファージ活性化を安全に誘導し、ＩＬ−１２等を産生することが可能ならば、自己免疫疾患に対する新しい治療法を提供できると考えられる。ポステリザンは感染防御作用や創傷治癒作用が臨床的に認められ汎用されている痔疾治療薬である。本製剤の有効成分は大腸菌死菌液である。この治療機構は明らかではないが、安全にマクロファージ活性化を誘導していることが示唆される。
【解決手段】そこで、ポステリザンに含まれている大腸菌浮遊液を経皮的に用い、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する効果を明らかにした。
【解決手段】そこで、ポステリザンに含まれている大腸菌浮遊液を経皮的に用い、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対する効果を明らかにした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎を代表とするアレルギー疾患の治療用として有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在薬物を開発する際には、単一酵素やタンパク質を標的として、これを阻害し（抗作動性薬）あるいはこの生物活性をまねる（作動薬）構造が明確な化合物を探索する方法がとられる。このやり方は近年爆発的な発展を見せるゲノム創薬においても同様であって、要するにこの根底にある生物的概念は物質と生体内生理活性物質との１対１反応である。しかし、難治性疾患では以上の薬物開発の概念が有効でないことが多い。逆に以上の概念では治療効果導出に結びつかない疾患が難治疾患と呼ばれるといっても過言でない。例えば難治性の感染症（薬剤抵抗性の細菌やウイルスによる感染症）、癌、多くの自己免疫疾患に対しては、治療薬がほとんど無い現状である。より具体的には、自己免疫疾患の一つであるアトピー性皮膚炎や花粉症の患者は日本で６人に１人（２０００万人）に達すると言われているが、抗ヒスタミン剤や抗炎症作用を持つ副腎皮質ホルモン等の対処療法剤が使用されているだけである。しかるにこれら薬剤は、眠気、だるさを始め、副腎皮質ホルモンでは、アレルギー疾患の重篤化、副腎の萎縮等重篤な副作用が発生することが報告されており、寧ろ薬剤使用による有害作用が、抗アレルギー効果に比して極めて大きいもので有るとして警鐘が鳴らされている。即ち、今や国民病とまで言われる、アトピー性皮膚炎や花粉症に対し、抗ヒスタミン剤や抗炎症作用を持つ副腎皮質ホルモン等とは根本的に薬理発現機序が異なり、副作用が少ない薬剤の提供が強く求められている。
【０００３】
我々はこれまで、異物排除に最も初期に関与するマクロファージの活性化制御は生体恒常性の制御機構そのものであること、従ってマクロファージの活性化制御を通じて諸難治性の疾患が治療又は予防できると考え（非特許文献１参照）、これを実証してきた（非特許文献２参照）。このマクロファージの活性化制御とは広義にはマクロファージが産生分泌することが知られる、複数種のサイトカインに注目し、これらサイトカインが形成するネットワークを介して、恒常性を維持するという生物個体特有の機構を操作することにより達成される。その一端は以下のようである。マクロファージは菌体の膜成分、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ペプチドグリカン等や核酸等の異物をマクロファージ細胞膜上に発現しているトールライク受容体（ＴＬＲ）との結合を介して活性化される。この間に、マクロファージ細胞内に異物の情報が伝達され、ＮＦ−ｋＢやＡＰ−１等の転写因子が活性化され、サイトカイン群の誘導（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ファスリガンド、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等）に至る。異物の排除はこれらサイトカインネットワークがもたらす結果の一つであり、異物の排除が生物個体の恒常性維持にとって重要な役割であることは言うまでもない。
【０００４】
ところで、異物が侵入した後に脊椎動物、特に哺乳動物ではリンパ球がエフェクター細胞であることを特徴とする特異免疫反応が起こるが、特異免疫は抗体産が主体となる液性免疫と、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を行う細胞性免疫に分けられる。一方、アトピー性皮膚炎や花粉症の発症にはＩｇＥ抗体の産生が関与することが知られており（非特許文献３参照）、液性免疫の誘導が起こっている。異物の侵入の後に確立する液性免疫と細胞性免疫の方向性は産生されるサイトカインによって大きく影響される。すなわち、ＩＬ−４が優位に存在する時には液性免疫に、ＩＬ−１２が優位の時は細胞性免疫が誘導される。また、ＩＬ−４は細胞性免疫の誘導を阻害し、ＩＬ−１２は液性免疫を阻害することが知られている（非特許文献４参照）。
【０００５】
逆に、ＩＬ−１２の誘導は液性免疫の抑制を誘導し、アレルギーの主原因である、ＩｇＥ抗体の産生を抑制し、アトピー性皮膚炎や花粉症の抑制が可能となる。すなわちマクロファージを活性化しＩＬ１２が主体となる免疫応答が誘導できれば、マクロファージの活性化制御を介してアレルギー治療や花粉症予防ができると期待される。
【非特許文献１】Ｓｏｍａ Ｇ−Ｉ．，Ｍｉｚｕｎｏ Ｄ．，”Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．”，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ． ８，１９８９年，ｐ．８３８−８５２
【非特許文献２】杣源一郎ら、「自然絵免疫における肺胞マクロファージの組織特異的性格」、膜、２００２年、２７（５）、ｐ．２４４−２５１
【非特許文献３】「ハリソン内科書（１１ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）」、廣川書店、上巻、第２部、第２章、ｐ．６６３
【非特許文献４】「免疫学イラストレイテッド」、南江堂、ｐ．１４９
【非特許文献５】「医薬品インタビューフォーム」、改訂第３版、２００４年９月、日本標準商品分類番号８７２５５９
【非特許文献６】高橋耕一ら、「薬物療法」、１９７７年、１０（８・９）、ｐ．１２０５
【非特許文献７】高橋耕一ら、「エキザルベの薬理作用」、薬理と治療、１９７７年、５（２）、ｐ．３９７−４０６
【非特許文献８】Ｂｏｓ，ＪＤ．Ｍｅｉｎａｒｄｉ，ＭＭ．，”Ｔｈｅ ５００ ｄａｌｔｏｎ ｒｕｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｄｒｕｇｓ．”，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０００年，９，ｐ．１６５−１６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
菌体が治療薬として用いられている例はわずかに、皮膚の局所の疾患治療薬としてポステリザンとエキザルベが認可されているだけである。ポステリザン製剤は感染防御作用や創傷治癒作用が臨床的に認められ汎用されている痔疾治療薬であり、本製剤の有効成分は大腸菌死菌浮遊液である（非特許文献５，６参照）。しかもこれら薬剤は副作用が殆ど認められず、臨床的に極めて有用性の高い薬剤として定評がある。エキザルベ軟膏は皮膚炎、湿疹、熱傷、術創、膿皮症に有効性が報告されている皮膚疾患治療薬であり、主成分として大腸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌混合液を含んでいる（非特許文献７参照）。両薬剤ともに、白血球の遊走作用による感染防御作用と、肉芽形成促進による創傷治癒の促進が起こることが報告されている。しかしながら、その作用発現機構についてはほとんど明らかにされていない。況や抗アレルギー薬として有効性があることは全く知られていない。一方、ポステリザンやエキザルベはグラム陰性菌とグラム陽性菌の死菌を含んでいる。これらの成分にはＬＰＳが成分として含まれている。ＬＰＳは別名エンドトキシンと呼ばれ、現在判明している物質のなかで、最も強力にマクロファージを活性化する物質の一つである。我々はポステリザンやエキザルベの作用は以下のように発現すると考えた。すなわち、菌体は経皮的にマクロファージを活性化し、ＩＬ−１β，ＴＮＦ−α，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１２，ＴＧＦ−β，ＦＧＦ−α等のサイトカインが産生する。これらのサイトカインはマクロファージ、ＮＫｃｅｌｌ，ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ，Ｔｃｅｌｌ，Ｂｃｅｌｌ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ｍａｓｔｃｅｌｌ，血管内皮細胞等に作用し、炎症性エフェクター細胞を集積させ、活性酸素や蛋白分解酵素類による殺菌作用を活性化する他、血管内皮細胞やｆｉｂｒｏｂｌａｓｔを増殖させることによって、創傷治癒を促進する。このことは、菌体がマクロファージ活性化を介してサイトカインネットワークを誘導して疾患治療効果を発現していることを強く伺わせるものである。そうならば、菌体がマクロファージを活性化しＩＬ１２が主体となる免疫応答が誘導すれば、マクロファージの活性化制御を介してアレルギー治療や花粉症予防ができると期待される。以上のことから、グラム陰性細菌或いはグラム陽性細菌の死菌を単独で、或いは混合して用いることを特徴とする薬物及び薬剤は、ポステリザン、エキザルベを含み安全な抗アレルギー治療剤として有用であると着想した。
【０００７】
上記の問題を解決するためには、経皮投与で菌体を用いることである。しかしながら、経皮投与で吸収される分子の大きさは教科書的には５００程度であるとされている（非特許文献８参照）。ポステリザンやエキザルベに含まれるマクロファージ活性化する菌体成分として予想されるものとしてはリポポリサッカライドやペプチドグリカン等は分子量が数万になる巨大高分子であり、皮膚吸収が起こることは常識では考えにくい。しかし、臨床で用いられているポステリザンやエキザルベは経皮的に使用されている。そこで、臨床で使用されているポステリザンやエキザルベの菌体を用い菌体を経皮投与し、これによりアレルギーに対する治療効果があることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の薬剤は大腸菌死菌、緑膿菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌死菌又はこれらの混合菌死菌を有効成分とし、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛又は直腸炎治療用であることを特徴とする。
【０００９】
また、薬剤形状が、軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることが望ましい。
【００１０】
また、使用形態が、皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることが望ましい。
【発明の効果】
【００１１】
ポステリザンやエキザルベに含まれている菌体により自己免疫疾患が治療又は予防することが可能になれば、これまでにないメカニズムにより治療することになる。現在、ステロイドに対して耐性を示すアトピー性皮膚炎に対する薬剤はなく、著しく患者の生活の質を低下させている。また、抗ヒスタミン剤は眠気や倦怠感を伴うため、運転等の前には摂取することは危険である。このようなステロイド抵抗性のアトピー性皮膚炎に対する有効性や眠気等の副作用が起こらない薬剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００１３】
はじめに、大腸菌死菌浮游液、黄色ブドウ球菌死菌浮游液、レンサ球菌死菌浮游液、緑膿菌死菌浮游液及び混合死菌浮游液の、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとチャイニーズハムスターの腹腔細胞でのＩＬ−１２
ｍＲＮＡの誘導効果を示す。
【００１４】
次に大腸菌死菌浮遊液、混合死菌浮遊液（大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌）の皮膚への投与によるマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩｇＥ依存性アレルギー反応の抑制効果を示す。
【実施例１】
【００１５】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとチャイニーズハムスターの腹腔細胞を用いた、大腸菌死菌浮遊液、緑膿菌死菌浮遊液、ブドウ球菌死菌浮遊液、レンサ球菌死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２ｐ４０サブユニットのｍＲＮＡ誘導効果
【００１６】
［実験材料］
（１）．動物：Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス雄(日本クレア)、チャイニーズハムスター雄(日本医科学動物資材研究所)
【００１７】
（２）．大腸菌死菌浮游液の調製：
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００１８】
緑膿菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて緑膿菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００１９】
ブドウ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてブドウ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００２０】
レンサ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてレンサ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００２１】
各死菌浮游液を菌数の比率で、大腸菌死菌浮游液：ブドウ球菌死菌浮游液：緑膿菌死菌浮游液：レンサ球菌死菌浮游液が、１０：１０：１：１になるように混合した液を混合死菌浮游液とした。
【００２２】
（３）．コンペティターＤＮＡ：コンペティターＤＮＡの作製は市販のキット（宝酒造）を用いた。各種サイトカインのプライマーの配列を含むコンペティターＤＮＡをそれぞれ合成し、得られた産物を限外濾過精製し、吸光度値からコンペティターＤＮＡのコピー数を求めた。実際のコンペティティブＰＣＲには１０１〜１０７コピー/μlの各濃度の溶液を調製して用いた。
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスＰＣＲ用プライマー：センス（Ｓ）、アンチセンス（Ａ） プライマー
ＩＬ−１２ｐ４０ （ＰＣＲ 産物：ｃＤＮＡ ４３１ｂｐ、 コンペティターＤＮＡ ２９０ｂｐ）
（Ｓ）５‘ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＴＧ ３’
（Ａ）５‘ＡＡＴＡＧＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣ ３’
チャイニーズハムスターＰＣＲ用プライマー：センス（Ｓ）、アンチセンス（Ａ）プライマー
ＩＬ−１２ｐ４０ （ＰＣＲ 産物：ｃＤＮＡ ２６０ｂｐ、 コンペティターＤＮＡ ３４４ｂｐ）
（Ｓ） ５‘ ＧＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣ ３’
（Ａ） ５‘ ＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＡ ３’
【００２３】
（４）．その他試薬：
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（日研医科学）、牛胎児血清（ギブコ）ＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ）、Ｍ−ＭＬＶ−逆転写酵素
（ギブコＢＲＬ）、オリゴ ｄＴ１２−１８（アマシャムファルマシア）、ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造）
Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ（岩井化学）、エチジウムブロマイド（和光純薬）、チオグリコレート培地ＩＩ（ニッスイ）
【００２４】
（５）．装置及び器具：
２４穴培養プレート (住友)、ＣＯ２インキュベータ、サーマルサイクラー ＰＣ−７００（アステック）、電気泳動装置ムーピッド(コスモバイオ)、ゲル写真撮影装置（フォトダイン）
【００２５】
[実験方法]
（１）．各種死菌浮遊液の前処理
各種死菌浮遊液中のフェノール濃度を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に傷害がない程度に除くことを主な目的として、大腸菌死菌浮遊液、黄色ブドウ球菌死菌浮遊液、レンサ球菌死菌浮遊液、緑膿菌死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液をそれぞれ別々に透析した。各々の死菌浮遊液２ｍｌを透析チューブに入れ、４０ｍｌのＬＰＳ−ｆｒｅｅ ＰＢＳを外液として氷冷下、一回につき３時間以上透析した。この操作を４回繰り返し、各検体中のフェノール含量を１／１０００〜１／２０００（各透析外液のフェノール含量は吸光度測定によりモニター）にすることで、フェノール濃度を０．００１％以下にした。さらにＲＰＭＩ１６４０培地（血清無添加）４０ｍｌで透析し、各々の死菌浮遊液をＰＢＳから培地に交換した。
【００２６】
（２）．Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス腹腔マクロファージの調製と各種死菌処理
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔内に３．０（ｗ／ｖ）％のチオグリコレート培地を２ｍｌ投与し４日後に腹腔マクロファージを含む腹腔細胞を回収した。回収した腹腔細胞をＲＰＭＩ１６４０培地(培地)で洗浄し、さらに５％ＦＢＳ入り培地を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、０．５ｍｌを２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加え（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／０．５ｍｌ）、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。２時間後に培地を交換し、非付着性の細胞を除き腹腔マクロファージとしてから、培地で希釈した各々の死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液１ｍｌをこれに添加し、培養した。
【００２７】
各死菌浮遊液は１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７及び１×１０８／ｍｌの濃度で使用した。培地のみを添加したものを無刺激コントロールとした。
【００２８】
添加３時間後に培地を除き、ＰＢＳで洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ ４００μｌを加え、添付の方法に従い総ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
（３）．チャイニーズハムスター腹腔マクロファージの調製と各種死菌処理
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスと同様に行った。
【００３０】
（４）．ＰＣＲ及びコンペティティブＰＣＲ
各細胞から抽出した総ＲＮＡ全量（３４０−１２８０ｎｇ）を逆転写酵素（２００ｕｎｉｔ）とオリゴ ｄＴを用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ (総ＲＮＡ換算１０ｎｇ)をＰＣＲ用チューブに加え、上記プライマー（５ｐｍｏｌｅ）とＴａｑポリメラーゼ（０．３ｕｎｉｔ、宝酒造）存在下に通常の方法でＰＣＲを総量１０μｌの反応系で行った。これを９４℃ １ｍｉｎ加熱の後、９４℃ １ｍｉｎ、５５℃(アニーリング) １ｍｉｎ、７２℃ １ｍｉｎを１サイクルとしてサーマルサイクラーを用いて、３５−４０サイクル繰り返し、遺伝子増幅を行った。ｃＤＮＡの他に各濃度のコンペティターＤＮＡを添加し、同様にＰＣＲ反応を行うことでコンペティティブＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の量を画像解析により定量化、発現遺伝子の基準を最もよく使用されるｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅの一つであるｂｅｔａ−ａｃｔｉｎで標準化した。
【００３１】
ＰＣＲ産物は２．０％のアガロース電気泳動をエチジウムブロマイド存在下で行い、ＵＶ照射でＰＣＲ産物のバンドを確認した。
【００３２】
[結果]
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス及び、チャイニーズハムスター腹腔マクロファージを用いた各種菌体浮遊液及び混合死菌浮遊液の各処理濃度におけるＩＬ−１２ ｍＲＮＡ誘導能を、無刺激コントロールを1とした場合の誘導倍率として表１、２に示した。
【００３３】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージでは、各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共に、無刺激コントロールより菌数依存的にＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導倍率が増加していることから各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共にＩＬ−１２ ｍＲＮＡの誘導効果があることがわかった。チャイニーズハムスターの腹腔マクロファージを用いた場合も、無刺激コントロールより、菌数依存的にＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導倍率が増加していることから各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共にＩＬ−１２ ｍＲＮＡの誘導効果があることがわかった。
表１ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージの各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導作用
【表１】
表２ チャイニーズハムスターの腹腔マクロファージの各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導作用
【表２】
【実施例２】
【００３４】
ＩｇＥアレルギーモデルマウスを用いた大腸菌死菌浮遊液、混合死菌浮遊液の抗アレルギー効果
【００３５】
［実験材料］
（１）．大腸菌死菌浮游液の調製：
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３６】
緑膿菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて緑膿菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３７】
ブドウ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてブドウ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３８】
レンサ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてレンサ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３９】
各死菌浮游液を菌数の比率で、大腸菌死菌浮游液：ブドウ球菌死菌浮游液：緑膿菌死菌浮游液：レンサ球菌死菌浮游液が、１０：１０：１：１になるように混合した液を混合死菌浮游液とした。
【００４０】
（２）．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雄性、５〜６週齢（日本クレア）
【００４１】
（３）．その他試薬等
抗ＤＮＰ−ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＥ、生理食塩水（大塚製薬）、シックネスゲージ （ＤＩＡＬ ＴＨＩＣＫＮＥＳＳ ＧＡＵＧＥ ｍｏｄｅｌ Ｇ−７ ＯＺＡＫＩ ＭＦＧ）、２，４−ジニトロ−フルオロベンゼン（和光純薬）、アセトン（和光純薬）、オリーブオイル（ナカライ）
【００４２】
［実験方法］
（１）．死菌浮遊液の前処理
大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液中のフェノール濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞に傷害がない程度に除くことを主な目的として、大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液を透析した。大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液２ｍｌをそれぞれ透析チューブに入れ、４０ｍｌのＬＰＳ−ｆｒｅｅ ＰＢＳ（−）を外液として、氷冷下、一回につき３時間以上透析した。この操作を４回繰り返し、フェノール含量を１／１０００〜１／２０００（各透析外液のフェノール含量は吸光度測定によりモニター）にし、各検体中のフェノール濃度を０．００１％以下にした。さらにＲＰＭＩ１６４０培地（血清無添加）４０ｍｌで透析し、浮遊液をＰＢＳ（−）から培地に交換した。
【００４３】
（２）．ＩｇＥ依存性アレルギー反応に対する抑制効果の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウスを以下に示した４群分けた。１ｍｇ／ｍｌの抗ジニトロフェニル、マウスＩｇＥモノクローナル抗体 ５μｌを１％（ｖ／ｖ）マウス血清含有生理食塩液９９５μｌに加え良く混ぜ、５μｇ／ｍｌ（１μｇ／２００μｌ／マウス）の濃度に希釈し、２００μｌを静脈投与した。抗ジニトロフェニル−マウスＩｇＥモノクローナル抗体（抗ＤＮＰ抗体）を注射した１時間後に、大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液を生理食塩水にて（２×１０８個／ｍｌ；１×１０７個／５０μｌ）に希釈し、サンプル又は生理食塩水を腹部皮内に皮内針（１／５）を用いて５０μｌの液量を注射した。投与１時間後に、シックネスゲージを用いて耳介（右）の厚さを測定した。直後に０．２５％ ２，４−ジニトロ−フルオロベンゼン含有アセトン−オリーブオイル（４：１）２０μｌをアレルゲンとして耳介に塗布した。塗布後、１，２，２４及び４８時間後に耳介の厚さを測定した。塗布直前の厚さとの差（△）を浮腫の程度とした。薬剤の投与の効果はアレルゲン投与１時間後に認められる早期反応と、２４時間後に誘起される遅発反応の抑制率［ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＝（１−△ｓｗｅｌｌｉｎｇ（ｄｒｕｇ＋）／△ｓｗｅｌｌｉｎｇ（ｄｒｕｇ−））×１００］で評価した。
【表３】
【００４４】
［統計処理］
各群間の浮腫の程度（△）の平均の差についてはスチューデントのｔ検定で行った。危険率５％（Ｐ＜０．０５）以下を有意な差とした。
【００４５】
［結果］
混合死菌浮遊液及び大腸菌死菌浮遊液について、二回の実験を行い、二回の結果をまとめて統計処理をおこなった（表４）。ＩｇＥ感作マウスへのアレルゲン塗布ではニ相性（１時間と２４時間）の浮腫を誘導することが知られている。混合死菌浮遊液は、１時間後において、８０％（Ｐ＜０．００１）、２４時間後において１００％（Ｐ＜０．００１）の有意な抑制を示した。大腸菌死菌浮遊液も混合死菌浮遊液と同程度の有意な抑制が認められた。なお、混合死菌浮遊液投与群及び大腸菌死菌浮遊液投与群において、投与２時間後及び４８時間後も有意な抑制が認められた。また、混合死菌浮遊液投与群及び大腸菌死菌浮遊液投与群の２群間では各測定時点で、有意な差は認められなかった。
表４ ＩｇＥ依存型アレルギー反応の抑制効果
【表４】
【実施例３】
【００４６】
ポステリザンおよびエキザルベのアトピー性皮膚炎に対する治療効果
両手に皮疹が観察され、自覚症状が中等度から高度症状を示す難治性のアトピー性皮膚炎と診断された４４歳の女性に、右手にポステリザン２グラムを、左手にエキザルベ２グラムを患部に一日１回程度塗布した。両手ともに、自覚症状（掻痒感）は１日後に軽度改善した。さらに、２週間継続したところ、両手の皮膚ともに、ほぼ正常にもどり、痒みもほとんどなくなった。
【００４７】
［結果のまとめ］
実施例１において、大腸菌死菌浮游液、緑膿菌死菌浮游液、ブドウ球菌死菌浮游液、レンサ球菌死菌浮游液のそれぞれ単独及び混合菌死菌浮游液について、いずれもＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導能があることを示した。そして、実施例２において、これらＩＬ−１２のｍＲＮＡを誘導する大腸菌死菌浮游液単独及び混合菌死菌浮游液は、ＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を示したので、他の緑膿菌死菌浮游液、ブドウ球菌死菌浮游液及びレンサ球菌死菌浮游液もＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を有すると考えられる。
このように、ＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を示す本薬剤は、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛及び直腸炎治療用として有効である。また、これらの薬剤に使われる薬剤形状である軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤として有効に使用することができる。さらに、これらの薬剤の使用形態である皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤として有効に使用することができる。例えば、アトピー性皮膚炎の治療用として、軟膏の薬剤形状で、経皮投与剤の使用形態で、好適に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎を代表とするアレルギー疾患の治療用として有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在薬物を開発する際には、単一酵素やタンパク質を標的として、これを阻害し（抗作動性薬）あるいはこの生物活性をまねる（作動薬）構造が明確な化合物を探索する方法がとられる。このやり方は近年爆発的な発展を見せるゲノム創薬においても同様であって、要するにこの根底にある生物的概念は物質と生体内生理活性物質との１対１反応である。しかし、難治性疾患では以上の薬物開発の概念が有効でないことが多い。逆に以上の概念では治療効果導出に結びつかない疾患が難治疾患と呼ばれるといっても過言でない。例えば難治性の感染症（薬剤抵抗性の細菌やウイルスによる感染症）、癌、多くの自己免疫疾患に対しては、治療薬がほとんど無い現状である。より具体的には、自己免疫疾患の一つであるアトピー性皮膚炎や花粉症の患者は日本で６人に１人（２０００万人）に達すると言われているが、抗ヒスタミン剤や抗炎症作用を持つ副腎皮質ホルモン等の対処療法剤が使用されているだけである。しかるにこれら薬剤は、眠気、だるさを始め、副腎皮質ホルモンでは、アレルギー疾患の重篤化、副腎の萎縮等重篤な副作用が発生することが報告されており、寧ろ薬剤使用による有害作用が、抗アレルギー効果に比して極めて大きいもので有るとして警鐘が鳴らされている。即ち、今や国民病とまで言われる、アトピー性皮膚炎や花粉症に対し、抗ヒスタミン剤や抗炎症作用を持つ副腎皮質ホルモン等とは根本的に薬理発現機序が異なり、副作用が少ない薬剤の提供が強く求められている。
【０００３】
我々はこれまで、異物排除に最も初期に関与するマクロファージの活性化制御は生体恒常性の制御機構そのものであること、従ってマクロファージの活性化制御を通じて諸難治性の疾患が治療又は予防できると考え（非特許文献１参照）、これを実証してきた（非特許文献２参照）。このマクロファージの活性化制御とは広義にはマクロファージが産生分泌することが知られる、複数種のサイトカインに注目し、これらサイトカインが形成するネットワークを介して、恒常性を維持するという生物個体特有の機構を操作することにより達成される。その一端は以下のようである。マクロファージは菌体の膜成分、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）ペプチドグリカン等や核酸等の異物をマクロファージ細胞膜上に発現しているトールライク受容体（ＴＬＲ）との結合を介して活性化される。この間に、マクロファージ細胞内に異物の情報が伝達され、ＮＦ−ｋＢやＡＰ−１等の転写因子が活性化され、サイトカイン群の誘導（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、Ｃ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ファスリガンド、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等）に至る。異物の排除はこれらサイトカインネットワークがもたらす結果の一つであり、異物の排除が生物個体の恒常性維持にとって重要な役割であることは言うまでもない。
【０００４】
ところで、異物が侵入した後に脊椎動物、特に哺乳動物ではリンパ球がエフェクター細胞であることを特徴とする特異免疫反応が起こるが、特異免疫は抗体産が主体となる液性免疫と、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を行う細胞性免疫に分けられる。一方、アトピー性皮膚炎や花粉症の発症にはＩｇＥ抗体の産生が関与することが知られており（非特許文献３参照）、液性免疫の誘導が起こっている。異物の侵入の後に確立する液性免疫と細胞性免疫の方向性は産生されるサイトカインによって大きく影響される。すなわち、ＩＬ−４が優位に存在する時には液性免疫に、ＩＬ−１２が優位の時は細胞性免疫が誘導される。また、ＩＬ−４は細胞性免疫の誘導を阻害し、ＩＬ−１２は液性免疫を阻害することが知られている（非特許文献４参照）。
【０００５】
逆に、ＩＬ−１２の誘導は液性免疫の抑制を誘導し、アレルギーの主原因である、ＩｇＥ抗体の産生を抑制し、アトピー性皮膚炎や花粉症の抑制が可能となる。すなわちマクロファージを活性化しＩＬ１２が主体となる免疫応答が誘導できれば、マクロファージの活性化制御を介してアレルギー治療や花粉症予防ができると期待される。
【非特許文献１】Ｓｏｍａ Ｇ−Ｉ．，Ｍｉｚｕｎｏ Ｄ．，”Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．”，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ． ８，１９８９年，ｐ．８３８−８５２
【非特許文献２】杣源一郎ら、「自然絵免疫における肺胞マクロファージの組織特異的性格」、膜、２００２年、２７（５）、ｐ．２４４−２５１
【非特許文献３】「ハリソン内科書（１１ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）」、廣川書店、上巻、第２部、第２章、ｐ．６６３
【非特許文献４】「免疫学イラストレイテッド」、南江堂、ｐ．１４９
【非特許文献５】「医薬品インタビューフォーム」、改訂第３版、２００４年９月、日本標準商品分類番号８７２５５９
【非特許文献６】高橋耕一ら、「薬物療法」、１９７７年、１０（８・９）、ｐ．１２０５
【非特許文献７】高橋耕一ら、「エキザルベの薬理作用」、薬理と治療、１９７７年、５（２）、ｐ．３９７−４０６
【非特許文献８】Ｂｏｓ，ＪＤ．Ｍｅｉｎａｒｄｉ，ＭＭ．，”Ｔｈｅ ５００ ｄａｌｔｏｎ ｒｕｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｄｒｕｇｓ．”，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０００年，９，ｐ．１６５−１６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
菌体が治療薬として用いられている例はわずかに、皮膚の局所の疾患治療薬としてポステリザンとエキザルベが認可されているだけである。ポステリザン製剤は感染防御作用や創傷治癒作用が臨床的に認められ汎用されている痔疾治療薬であり、本製剤の有効成分は大腸菌死菌浮遊液である（非特許文献５，６参照）。しかもこれら薬剤は副作用が殆ど認められず、臨床的に極めて有用性の高い薬剤として定評がある。エキザルベ軟膏は皮膚炎、湿疹、熱傷、術創、膿皮症に有効性が報告されている皮膚疾患治療薬であり、主成分として大腸菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌の死菌混合液を含んでいる（非特許文献７参照）。両薬剤ともに、白血球の遊走作用による感染防御作用と、肉芽形成促進による創傷治癒の促進が起こることが報告されている。しかしながら、その作用発現機構についてはほとんど明らかにされていない。況や抗アレルギー薬として有効性があることは全く知られていない。一方、ポステリザンやエキザルベはグラム陰性菌とグラム陽性菌の死菌を含んでいる。これらの成分にはＬＰＳが成分として含まれている。ＬＰＳは別名エンドトキシンと呼ばれ、現在判明している物質のなかで、最も強力にマクロファージを活性化する物質の一つである。我々はポステリザンやエキザルベの作用は以下のように発現すると考えた。すなわち、菌体は経皮的にマクロファージを活性化し、ＩＬ−１β，ＴＮＦ−α，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１２，ＴＧＦ−β，ＦＧＦ−α等のサイトカインが産生する。これらのサイトカインはマクロファージ、ＮＫｃｅｌｌ，ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｅ，Ｔｃｅｌｌ，Ｂｃｅｌｌ，ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ｍａｓｔｃｅｌｌ，血管内皮細胞等に作用し、炎症性エフェクター細胞を集積させ、活性酸素や蛋白分解酵素類による殺菌作用を活性化する他、血管内皮細胞やｆｉｂｒｏｂｌａｓｔを増殖させることによって、創傷治癒を促進する。このことは、菌体がマクロファージ活性化を介してサイトカインネットワークを誘導して疾患治療効果を発現していることを強く伺わせるものである。そうならば、菌体がマクロファージを活性化しＩＬ１２が主体となる免疫応答が誘導すれば、マクロファージの活性化制御を介してアレルギー治療や花粉症予防ができると期待される。以上のことから、グラム陰性細菌或いはグラム陽性細菌の死菌を単独で、或いは混合して用いることを特徴とする薬物及び薬剤は、ポステリザン、エキザルベを含み安全な抗アレルギー治療剤として有用であると着想した。
【０００７】
上記の問題を解決するためには、経皮投与で菌体を用いることである。しかしながら、経皮投与で吸収される分子の大きさは教科書的には５００程度であるとされている（非特許文献８参照）。ポステリザンやエキザルベに含まれるマクロファージ活性化する菌体成分として予想されるものとしてはリポポリサッカライドやペプチドグリカン等は分子量が数万になる巨大高分子であり、皮膚吸収が起こることは常識では考えにくい。しかし、臨床で用いられているポステリザンやエキザルベは経皮的に使用されている。そこで、臨床で使用されているポステリザンやエキザルベの菌体を用い菌体を経皮投与し、これによりアレルギーに対する治療効果があることを確認した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の薬剤は大腸菌死菌、緑膿菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌死菌又はこれらの混合菌死菌を有効成分とし、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛又は直腸炎治療用であることを特徴とする。
【０００９】
また、薬剤形状が、軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることが望ましい。
【００１０】
また、使用形態が、皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることが望ましい。
【発明の効果】
【００１１】
ポステリザンやエキザルベに含まれている菌体により自己免疫疾患が治療又は予防することが可能になれば、これまでにないメカニズムにより治療することになる。現在、ステロイドに対して耐性を示すアトピー性皮膚炎に対する薬剤はなく、著しく患者の生活の質を低下させている。また、抗ヒスタミン剤は眠気や倦怠感を伴うため、運転等の前には摂取することは危険である。このようなステロイド抵抗性のアトピー性皮膚炎に対する有効性や眠気等の副作用が起こらない薬剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００１３】
はじめに、大腸菌死菌浮游液、黄色ブドウ球菌死菌浮游液、レンサ球菌死菌浮游液、緑膿菌死菌浮游液及び混合死菌浮游液の、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとチャイニーズハムスターの腹腔細胞でのＩＬ−１２
ｍＲＮＡの誘導効果を示す。
【００１４】
次に大腸菌死菌浮遊液、混合死菌浮遊液（大腸菌、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌）の皮膚への投与によるマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏにおけるＩｇＥ依存性アレルギー反応の抑制効果を示す。
【実施例１】
【００１５】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスとチャイニーズハムスターの腹腔細胞を用いた、大腸菌死菌浮遊液、緑膿菌死菌浮遊液、ブドウ球菌死菌浮遊液、レンサ球菌死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２ｐ４０サブユニットのｍＲＮＡ誘導効果
【００１６】
［実験材料］
（１）．動物：Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス雄(日本クレア)、チャイニーズハムスター雄(日本医科学動物資材研究所)
【００１７】
（２）．大腸菌死菌浮游液の調製：
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００１８】
緑膿菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて緑膿菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００１９】
ブドウ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてブドウ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００２０】
レンサ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてレンサ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００２１】
各死菌浮游液を菌数の比率で、大腸菌死菌浮游液：ブドウ球菌死菌浮游液：緑膿菌死菌浮游液：レンサ球菌死菌浮游液が、１０：１０：１：１になるように混合した液を混合死菌浮游液とした。
【００２２】
（３）．コンペティターＤＮＡ：コンペティターＤＮＡの作製は市販のキット（宝酒造）を用いた。各種サイトカインのプライマーの配列を含むコンペティターＤＮＡをそれぞれ合成し、得られた産物を限外濾過精製し、吸光度値からコンペティターＤＮＡのコピー数を求めた。実際のコンペティティブＰＣＲには１０１〜１０７コピー/μlの各濃度の溶液を調製して用いた。
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスＰＣＲ用プライマー：センス（Ｓ）、アンチセンス（Ａ） プライマー
ＩＬ−１２ｐ４０ （ＰＣＲ 産物：ｃＤＮＡ ４３１ｂｐ、 コンペティターＤＮＡ ２９０ｂｐ）
（Ｓ）５‘ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＴＧ ３’
（Ａ）５‘ＡＡＴＡＧＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣ ３’
チャイニーズハムスターＰＣＲ用プライマー：センス（Ｓ）、アンチセンス（Ａ）プライマー
ＩＬ−１２ｐ４０ （ＰＣＲ 産物：ｃＤＮＡ ２６０ｂｐ、 コンペティターＤＮＡ ３４４ｂｐ）
（Ｓ） ５‘ ＧＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣ ３’
（Ａ） ５‘ ＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＡ ３’
【００２３】
（４）．その他試薬：
燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（日研医科学）、牛胎児血清（ギブコ）ＴＲＩｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ）、Ｍ−ＭＬＶ−逆転写酵素
（ギブコＢＲＬ）、オリゴ ｄＴ１２−１８（アマシャムファルマシア）、ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造）
Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ（岩井化学）、エチジウムブロマイド（和光純薬）、チオグリコレート培地ＩＩ（ニッスイ）
【００２４】
（５）．装置及び器具：
２４穴培養プレート (住友)、ＣＯ２インキュベータ、サーマルサイクラー ＰＣ−７００（アステック）、電気泳動装置ムーピッド(コスモバイオ)、ゲル写真撮影装置（フォトダイン）
【００２５】
[実験方法]
（１）．各種死菌浮遊液の前処理
各種死菌浮遊液中のフェノール濃度を、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に傷害がない程度に除くことを主な目的として、大腸菌死菌浮遊液、黄色ブドウ球菌死菌浮遊液、レンサ球菌死菌浮遊液、緑膿菌死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液をそれぞれ別々に透析した。各々の死菌浮遊液２ｍｌを透析チューブに入れ、４０ｍｌのＬＰＳ−ｆｒｅｅ ＰＢＳを外液として氷冷下、一回につき３時間以上透析した。この操作を４回繰り返し、各検体中のフェノール含量を１／１０００〜１／２０００（各透析外液のフェノール含量は吸光度測定によりモニター）にすることで、フェノール濃度を０．００１％以下にした。さらにＲＰＭＩ１６４０培地（血清無添加）４０ｍｌで透析し、各々の死菌浮遊液をＰＢＳから培地に交換した。
【００２６】
（２）．Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス腹腔マクロファージの調製と各種死菌処理
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔内に３．０（ｗ／ｖ）％のチオグリコレート培地を２ｍｌ投与し４日後に腹腔マクロファージを含む腹腔細胞を回収した。回収した腹腔細胞をＲＰＭＩ１６４０培地(培地)で洗浄し、さらに５％ＦＢＳ入り培地を用いて１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、０．５ｍｌを２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに加え（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／０．５ｍｌ）、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。２時間後に培地を交換し、非付着性の細胞を除き腹腔マクロファージとしてから、培地で希釈した各々の死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液１ｍｌをこれに添加し、培養した。
【００２７】
各死菌浮遊液は１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７及び１×１０８／ｍｌの濃度で使用した。培地のみを添加したものを無刺激コントロールとした。
【００２８】
添加３時間後に培地を除き、ＰＢＳで洗浄後、ＴＲＩｚｏｌ ４００μｌを加え、添付の方法に従い総ＲＮＡを抽出した。
【００２９】
（３）．チャイニーズハムスター腹腔マクロファージの調製と各種死菌処理
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスと同様に行った。
【００３０】
（４）．ＰＣＲ及びコンペティティブＰＣＲ
各細胞から抽出した総ＲＮＡ全量（３４０−１２８０ｎｇ）を逆転写酵素（２００ｕｎｉｔ）とオリゴ ｄＴを用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ (総ＲＮＡ換算１０ｎｇ)をＰＣＲ用チューブに加え、上記プライマー（５ｐｍｏｌｅ）とＴａｑポリメラーゼ（０．３ｕｎｉｔ、宝酒造）存在下に通常の方法でＰＣＲを総量１０μｌの反応系で行った。これを９４℃ １ｍｉｎ加熱の後、９４℃ １ｍｉｎ、５５℃(アニーリング) １ｍｉｎ、７２℃ １ｍｉｎを１サイクルとしてサーマルサイクラーを用いて、３５−４０サイクル繰り返し、遺伝子増幅を行った。ｃＤＮＡの他に各濃度のコンペティターＤＮＡを添加し、同様にＰＣＲ反応を行うことでコンペティティブＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の量を画像解析により定量化、発現遺伝子の基準を最もよく使用されるｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅの一つであるｂｅｔａ−ａｃｔｉｎで標準化した。
【００３１】
ＰＣＲ産物は２．０％のアガロース電気泳動をエチジウムブロマイド存在下で行い、ＵＶ照射でＰＣＲ産物のバンドを確認した。
【００３２】
[結果]
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス及び、チャイニーズハムスター腹腔マクロファージを用いた各種菌体浮遊液及び混合死菌浮遊液の各処理濃度におけるＩＬ−１２ ｍＲＮＡ誘導能を、無刺激コントロールを1とした場合の誘導倍率として表１、２に示した。
【００３３】
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージでは、各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共に、無刺激コントロールより菌数依存的にＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導倍率が増加していることから各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共にＩＬ−１２ ｍＲＮＡの誘導効果があることがわかった。チャイニーズハムスターの腹腔マクロファージを用いた場合も、無刺激コントロールより、菌数依存的にＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導倍率が増加していることから各死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液共にＩＬ−１２ ｍＲＮＡの誘導効果があることがわかった。
表１ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの腹腔マクロファージの各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導作用
【表１】
表２ チャイニーズハムスターの腹腔マクロファージの各種死菌浮遊液及び混合死菌浮遊液のＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導作用
【表２】
【実施例２】
【００３４】
ＩｇＥアレルギーモデルマウスを用いた大腸菌死菌浮遊液、混合死菌浮遊液の抗アレルギー効果
【００３５】
［実験材料］
（１）．大腸菌死菌浮游液の調製：
大腸菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えばトリプトソーヤブロスやニュートリエントブロス（ベクトンディキンソン）を適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて大腸菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３６】
緑膿菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えて緑膿菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３７】
ブドウ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてブドウ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３８】
レンサ球菌は通常の細菌培養用の寒天培地に塗り広げ、３７℃で培養を行う。寒天培地としては例えば、標準寒天培地やブレインハートインフュージョン寒天培地等等を用いることが出来る。出現した一つのコロニーをとり、通常の液体培地、例えば、市販のトリプトソーヤブロス、ブレインハートインフュージョン培地やニュートリエントブロスを適当な培養フラスコ、例えば３リットル坂口フラスコなどを用いて行うことが可能である。３７℃にて一晩、振盪培養を行った。培養液にフェノールの終濃度が１〜３％になるようにフェノールを加えてレンサ球菌死菌浮游液を調製した。菌数は、菌数計算盤等で測定した。例えば、ペトローフ−ハウザーの計算盤を用いることが出来る。
【００３９】
各死菌浮游液を菌数の比率で、大腸菌死菌浮游液：ブドウ球菌死菌浮游液：緑膿菌死菌浮游液：レンサ球菌死菌浮游液が、１０：１０：１：１になるように混合した液を混合死菌浮游液とした。
【００４０】
（２）．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雄性、５〜６週齢（日本クレア）
【００４１】
（３）．その他試薬等
抗ＤＮＰ−ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＥ、生理食塩水（大塚製薬）、シックネスゲージ （ＤＩＡＬ ＴＨＩＣＫＮＥＳＳ ＧＡＵＧＥ ｍｏｄｅｌ Ｇ−７ ＯＺＡＫＩ ＭＦＧ）、２，４−ジニトロ−フルオロベンゼン（和光純薬）、アセトン（和光純薬）、オリーブオイル（ナカライ）
【００４２】
［実験方法］
（１）．死菌浮遊液の前処理
大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液中のフェノール濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞に傷害がない程度に除くことを主な目的として、大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液を透析した。大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液２ｍｌをそれぞれ透析チューブに入れ、４０ｍｌのＬＰＳ−ｆｒｅｅ ＰＢＳ（−）を外液として、氷冷下、一回につき３時間以上透析した。この操作を４回繰り返し、フェノール含量を１／１０００〜１／２０００（各透析外液のフェノール含量は吸光度測定によりモニター）にし、各検体中のフェノール濃度を０．００１％以下にした。さらにＲＰＭＩ１６４０培地（血清無添加）４０ｍｌで透析し、浮遊液をＰＢＳ（−）から培地に交換した。
【００４３】
（２）．ＩｇＥ依存性アレルギー反応に対する抑制効果の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウスを以下に示した４群分けた。１ｍｇ／ｍｌの抗ジニトロフェニル、マウスＩｇＥモノクローナル抗体 ５μｌを１％（ｖ／ｖ）マウス血清含有生理食塩液９９５μｌに加え良く混ぜ、５μｇ／ｍｌ（１μｇ／２００μｌ／マウス）の濃度に希釈し、２００μｌを静脈投与した。抗ジニトロフェニル−マウスＩｇＥモノクローナル抗体（抗ＤＮＰ抗体）を注射した１時間後に、大腸菌死菌浮游液及び混合死菌浮遊液を生理食塩水にて（２×１０８個／ｍｌ；１×１０７個／５０μｌ）に希釈し、サンプル又は生理食塩水を腹部皮内に皮内針（１／５）を用いて５０μｌの液量を注射した。投与１時間後に、シックネスゲージを用いて耳介（右）の厚さを測定した。直後に０．２５％ ２，４−ジニトロ−フルオロベンゼン含有アセトン−オリーブオイル（４：１）２０μｌをアレルゲンとして耳介に塗布した。塗布後、１，２，２４及び４８時間後に耳介の厚さを測定した。塗布直前の厚さとの差（△）を浮腫の程度とした。薬剤の投与の効果はアレルゲン投与１時間後に認められる早期反応と、２４時間後に誘起される遅発反応の抑制率［ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ＝（１−△ｓｗｅｌｌｉｎｇ（ｄｒｕｇ＋）／△ｓｗｅｌｌｉｎｇ（ｄｒｕｇ−））×１００］で評価した。
【表３】
【００４４】
［統計処理］
各群間の浮腫の程度（△）の平均の差についてはスチューデントのｔ検定で行った。危険率５％（Ｐ＜０．０５）以下を有意な差とした。
【００４５】
［結果］
混合死菌浮遊液及び大腸菌死菌浮遊液について、二回の実験を行い、二回の結果をまとめて統計処理をおこなった（表４）。ＩｇＥ感作マウスへのアレルゲン塗布ではニ相性（１時間と２４時間）の浮腫を誘導することが知られている。混合死菌浮遊液は、１時間後において、８０％（Ｐ＜０．００１）、２４時間後において１００％（Ｐ＜０．００１）の有意な抑制を示した。大腸菌死菌浮遊液も混合死菌浮遊液と同程度の有意な抑制が認められた。なお、混合死菌浮遊液投与群及び大腸菌死菌浮遊液投与群において、投与２時間後及び４８時間後も有意な抑制が認められた。また、混合死菌浮遊液投与群及び大腸菌死菌浮遊液投与群の２群間では各測定時点で、有意な差は認められなかった。
表４ ＩｇＥ依存型アレルギー反応の抑制効果
【表４】
【実施例３】
【００４６】
ポステリザンおよびエキザルベのアトピー性皮膚炎に対する治療効果
両手に皮疹が観察され、自覚症状が中等度から高度症状を示す難治性のアトピー性皮膚炎と診断された４４歳の女性に、右手にポステリザン２グラムを、左手にエキザルベ２グラムを患部に一日１回程度塗布した。両手ともに、自覚症状（掻痒感）は１日後に軽度改善した。さらに、２週間継続したところ、両手の皮膚ともに、ほぼ正常にもどり、痒みもほとんどなくなった。
【００４７】
［結果のまとめ］
実施例１において、大腸菌死菌浮游液、緑膿菌死菌浮游液、ブドウ球菌死菌浮游液、レンサ球菌死菌浮游液のそれぞれ単独及び混合菌死菌浮游液について、いずれもＩＬ−１２のｍＲＮＡの誘導能があることを示した。そして、実施例２において、これらＩＬ−１２のｍＲＮＡを誘導する大腸菌死菌浮游液単独及び混合菌死菌浮游液は、ＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を示したので、他の緑膿菌死菌浮游液、ブドウ球菌死菌浮游液及びレンサ球菌死菌浮游液もＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を有すると考えられる。
このように、ＩｇＥ依存型アレルギー反応に抑制作用を示す本薬剤は、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛及び直腸炎治療用として有効である。また、これらの薬剤に使われる薬剤形状である軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤として有効に使用することができる。さらに、これらの薬剤の使用形態である皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤として有効に使用することができる。例えば、アトピー性皮膚炎の治療用として、軟膏の薬剤形状で、経皮投与剤の使用形態で、好適に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌死菌、緑膿菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌死菌又はこれらの混合菌死菌を有効成分とし、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛又は直腸炎治療用であることを特徴とする薬剤。
【請求項２】
薬剤形状が、軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
使用形態が、皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤。
【請求項１】
大腸菌死菌、緑膿菌死菌、ブドウ球菌死菌、レンサ球菌死菌又はこれらの混合菌死菌を有効成分とし、アトピー性皮膚炎、皮膚掻痒症、乾皮症、汗疹、床ずれ、陰部掻痒症、疣、潰瘍性大腸炎、癌、自己免疫疾患、リューマチ、糖尿病、高脂血症、胃潰瘍、神経痛、腱鞘炎、帯状疱疹に伴う疼痛又は直腸炎治療用であることを特徴とする薬剤。
【請求項２】
薬剤形状が、軟膏、クリーム、液、ムース、スプレー、ゲル又は固形剤であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
使用形態が、皮内投与剤、経皮投与剤、浴用剤、坐薬、うがい薬、トローチ、点鼻薬、貼布剤、経肺投与剤又はヘルスケアー剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤。
【公開番号】特開２００６−１３１６２３（Ｐ２００６−１３１６２３Ａ）
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９２５９６（Ｐ２００５−２９２５９６）
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【出願人】（３９００２５２１０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月５日（２００５．１０．５）
【出願人】（３９００２５２１０）
【Ｆターム（参考）】
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