薬物相互作用の検討方法
【課題】 医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行う方法および薬物相互作用の検討方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、以下の方法を提供するものである。
下記（１）および（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
【解決手段】 本発明は、以下の方法を提供するものである。
下記（１）および（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物相互作用の検討方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床現場においては、薬物は併用されることが多く、チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）が関与する薬物代謝反応を介した薬物相互作用が問題となる。このため医薬品開発における候補化合物の選抜において、ＣＹＰに対する阻害能の評価を行う必要がある（非特許文献１参照）。
肝ミクロソームを用いるＣＹＰ阻害能の評価においては、プローブ化合物（ＣＹＰの基質）の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ（ＭＳｎ））で行うことが一般的である。ＬＣ／ＭＳ（ＭＳｎ）は選択性の高い測定法であることから、測定対象物質であるプローブ化合物の代謝物と候補化合物をカラム上で分離することなく、短時間に多くの候補化合物を分析できることが特長とされてきた。しかしながら、イオン化しやすい物質がサンプル中に共存すると、プローブ化合物や内標準物質（ＩＳ）あるいはその両方のイオン化抑制が起こり、得られた結果をＣＹＰの阻害や活性化として見誤ることがある（後記実施例参照）。
イオン化抑制の影響を受けずにＣＹＰ阻害能を評価するためには、サンプル中の物質毎にイオン化抑制の有無をチェックし、それを回避するための分離条件を設定することが望ましいが、医薬品開発の開発スピード・効率を大きく損なうことになり、好ましいものではない。
この問題を回避するため、ある物質に対するイオン化抑制の程度は、その同位体に対する程度と同じであることを利用し、質量分析における内標準物質としては、測定対象物質の同位体を用いることが望ましいとされている。
ＣＹＰ阻害能の評価においても、プローブ化合物の代謝物の生成を、このものの同位体を内標準物質として使用して測定している報告がある（非特許文献２参照）。
しかしながら、プローブ化合物の代謝物の同位体は市販されておらず、またこの代謝物の同位体の合成は非常に困難であるか、または高価なものである。このため、非特許文献２記載の方法は、使い勝手のよいものではない。
【０００３】
【非特許文献１】厚生労働省医薬局審査管理課長通知（医薬審発第八一三号）
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３１，８１５−８３２（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行う方法および薬物相互作用の検討方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行う方法を見出すべく種々検討した結果、プローブ化合物の同位体を用いることで、ＣＹＰに対する阻害能の評価を、イオン化抑制の影響を回避し、安価に行えることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、以下の方法を提供するものである。
（Ａ）下記（１）及び（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
（Ｂ）ＣＹＰとしてＣＹＰを含む組織・臓器、ＣＹＰを含む組織・臓器のＣＹＰ画分またはＣＹＰ発現系を用いるものである上記（Ａ）記載の方法。
（Ｃ）ＣＹＰとしてヒト肝ミクロソームを用いるものである上記（Ａ）記載の方法。
（Ｄ）ＣＹＰがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４から選ばれる１つ以上である上記（Ａ）記載の方法。
（Ｅ）ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ１Ａ２基質の同位体、ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体およびＣＹＰ３Ａ４基質の同位体から選ばれるものである上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｆ）ＣＹＰ１Ａ２基質の同位体がクロピドグレルの同位体、フルタミドの同位体、カフェインの同位体、フェナセチンの同位体およびテオフィリンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｇ）ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体がクマリンの同位体、テガフールの同位体、ニコチンの同位体およびＳＭ−１２５０２の同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｈ）ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体がパクリタキセルの同位体、ジクロフェナック（５−ＯＨ）の同位体、ロシグリタゾンの同位体およびフルバスタチンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｉ）ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体がフェニトインの同位体、トルブタミドの同位体、ジクロフェナック（４'−ＯＨ）の同位体およびＳ−ワルファレンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｊ）ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体がＳ−メフェニトインの同位体、ジアゼパムの同位体、ヘキソバルビタールの同位体、イミプラミンの同位体、オメプラゾールの同位体、プログアニルの同位体およびプロプラノロールの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｋ）ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体がデブリソキンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ブフラロールの同位体、コデインの同位体、エチルモルホリンの同位体およびニコチンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｌ）ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体がクロルゾキサゾンの同位体、エンフルランの同位体およびダプソンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｍ）ＣＹＰ３Ａ４基質の同位体がミダゾラムの同位体、エリスロマイシンの同位体、シクロスポリンの同位体、サキナビルの同位体、カルバマゼピンの同位体、フェロジピンの同位体、ニフェジピンの同位体、トリアゾラムの同位体、シンバスタチンの同位体、テルフェナジンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ベラパミルの同位体およびワルファレンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｎ）ＣＹＰ基質の同位体がミダゾラムの同位体またはトリアゾラムの同位体である上記（Ａ）記載の方法。
（Ｏ）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いるものである上記（Ａ）〜（Ｎ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｐ）内標準物質としてＣＹＰ基質の代謝物を用いるものである上記（Ｏ）記載の方法。
（Ｑ）ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ基質の安定同位体である上記（Ａ）〜（Ｐ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｒ）ＣＹＰ基質の同位体を有効成分とする検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬。
（Ｓ）検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬としてのＣＹＰ基質の同位体の使用。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行うことができる。これにより、スピードを損なうことなく、効率的に多検体のスクリーニングができ、薬物相互作用がないか、またはほとんどない医薬品の開発のスピードアップ・効率化ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明にかかるＣＹＰには、種々の分子種、例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４などの存在が知られている。ＣＹＰによる薬物代謝には動物種差があることが知られているので、医薬品開発の対象とする動物種に応じてＣＹＰを選択するのが好ましい。本発明において、ヒト用医薬品を開発する場合、ヒト組織由来の上記分子種や肝臓、小腸、肺臓、腎臓などの上記分子種を含む組織・臓器、前記組織・臓器の画分（ミクロソーム、Ｓ−９など）、ヒトの各ＣＹＰ分子種発現系などを挙げることができる。ヒト体内における薬物代謝を考慮すると、ヒト肝ミクロソームを用いることが好ましい。
【０００９】
本発明において、ＣＹＰ基質の同位体（以下、同位体ＣＹＰ基質と略することもある。）としては、ＣＹＰ基質の安定同位体や放射性同位体等を挙げることができるが、使用簡便性等の点から安定同位体を用いることが好ましい。同位体ＣＹＰ基質は、第一化学薬品社やＳＣＥＴＩｉｓｏｔｏｐｅ社などから販売されているものを用いてもよいし、また公知の方法により作製したものを用いてもよい。
【００１０】
本発明においては、用いるＣＹＰとその基質との関係および検体の利用分野、方法または条件（対象疾患、併用薬種類、併用薬および検体の効果発現血中濃度、薬物相互作用の発現想定濃度など）が重要であり、以下に種々ＣＹＰの分子種とその基質の関係を記載する。下表に記載の関係に基づき、用いるＣＹＰと同位体ＣＹＰ基質を適宜検討して、本発明の方法を実施すればよい。
【００１１】
【００１２】
本発明にかかるＣＹＰ、同位体ＣＹＰ基質および検体を混合、反応させる工程における条件は、用いるＣＹＰ、同位体ＣＹＰ基質や検体に応じて、適宜検討し、設定すればよいが、通常２５〜４０℃で３０秒〜１時間行い、必要に応じて反応を停止させることで完了する。反応条件としては、３７℃で５〜３０分間が好ましい。
【００１３】
反応工程完了後、反応液中の同位体ＣＹＰ基質の代謝物の分析は、通常の方法を用いて行えばよい。同位体ＣＹＰ基質として、ＣＹＰ基質の安定同位体を用いた場合、反応液（必要に応じてサンプルを遠心分離して得られる上清）を液体クロマトグラフィー／質量分析計に注入し、同位体ＣＹＰ基質の代謝物を分析すればよい。液体クロマトグラフィーは、同位体ＣＹＰ基質の代謝物と同じ質量数を持つ物質（他の代謝物など）とを分離するために行うものであり、カラムとしては、高速液体クロマトグラフィー用のカラムを使用すればよく、液体クロマトグラフィーの条件等は、適宜検討し、設定すればよい。本発明においては、カラムとして逆相ＯＤＳ（Ｃ１８）タイプまたはＣ８タイプを用いるのが好ましい。
反応液中に同位体ＣＹＰ基質の代謝物と同じ質量数を持つ物質が共存しない場合、同位体ＣＹＰ基質の代謝物を分離する必要がないので、反応液を直接質量分析計に注入してもよい。
【００１４】
ＬＣの移動相としては、同位体ＣＹＰ基質の代謝物の溶出位置が最適な位置となるように設定した溶液を用いればよく、ＣＹＰ基質の同位体、同位体ＣＹＰ基質の代謝物などに基づき、適宜検討し、条件（ｐＨ、溶液の種類、濃度など）を設定すればよい。例えば、同位体ＣＹＰ基質として、ミダゾラムの安定同位体（［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム）を用いた場合、使用するカラムに応じたｐＨ範囲の水溶液と有機溶媒のグラジェント条件が好ましい。水溶液としては、ギ酸、酢酸、テトラフルオロ酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの水溶液を挙げることができる。中でもギ酸が好ましい。水溶液の濃度としては、０．０１〜１０重量％または１〜１００ｍＭが好ましく、特に０．１〜０．５重量％のギ酸が好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどを挙げることができる。中でもアセトニトリルが好ましい。
また、カラムの長さを調整することで、同位体ＣＹＰ基質の代謝物の溶出位置を早くすることも可能であり、溶出位置を早くすれば、より一層効率的となる。内標準物質としては、ＣＹＰ基質の代謝物（非同位体）を用いる。
【００１５】
同位体ＣＹＰ基質の代謝物の測定結果から、検体のＣＹＰに対する阻害能を評価することができる。評価にあたっては、検体の利用分野、方法または条件（対象疾患、併用薬種類、併用薬および検体の効果発現血中濃度、薬物相互作用の発現想定濃度など）を考慮して、検体のＣＹＰに対する阻害能を評価すればよい。本発明の方法は、自動化することも可能である。
【００１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
１．ヒト肝ミクロソームにおけるミダゾラムと同位体ミダゾラムの代謝反応
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）におけるミダゾラム（ｍｉｄ）と同位体ミダゾラム（［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム（ＬＡ−ｍｉｄ））の代謝反応が同様であることを代謝物の生成速度（試験１）およびＫｍ（親和性）（試験２）の算出により確認した。
下表記載の組成の溶液（Ａ）を調製し、５分間プレインキュベーションした後、下表記載の組成の溶液（Ｂ）を添加することにより反応を開始した。基質濃度は最終濃度として，試験１ではｍｉｄあるいはＬＡ−ｍｉｄ ２．５μＭおよびｍｉｄとＬＡ−ｍｉｄ １．２５μＭずつ，試験２では０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０および２０μＭとした。
【００１８】
【００１９】
反応を１０分間行った後、内標準物質（デキストロルファン）含有メタノール６００μｌを添加攪拌することにより反応を停止した。反応停止後、サンプルを遠心分離し（２００００×ｇ、１０分、４℃）、上清中の１'−ヒドロキシミダゾラム（１−ＯＨ ｍｉｄ）および１'−ヒドロキシ［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム（１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００２０】
分析条件を以下に示した。
ＬＣ装置：Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５（Ｗａｔｅｒｓ社）
カラム：Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ、４．６ｍｍΦ×２５ｍｍ（Ｍｅｒｃｋ社）
カラム温度：４０℃
移動相：溶媒Ａ：蒸留水／０．１％ギ酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル／０．１％ギ酸
【００２１】
結果を下表に示した。
（試験１）
【００２２】
ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄそれぞれ単独で反応させたときの１−ＯＨ体のａｒｅａ ｒａｔｉｏ（１−ＯＨ ｍｉｄ／ＩＳ：１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ／ＩＳ＝１．３３倍）と等量混合して代謝させた場合のそれ（１．２６倍）は，ほぼ一致し、ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄの代謝速度に差がないことが確認された。
【００２３】
(試験２)
Ｋｍの算出には、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの標品がないため、ａｒｅａ ｒａｔｉｏを生成速度として用いた。算出されたｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄ水酸化代謝反応のＫｍ値はそれぞれ４．５μＭ、３．１μＭで，ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄはＣＹＰ３Ａ４に対して同様の親和性をもつことが確認された。
【００２４】
２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの直線性の確認
１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの標品が存在しないため、測定時に検量線を引くことによる定量範囲の直線性の確認ができない。このため、１．に準じ、０．１ｍｇ蛋白／ｍｌのＨＬＭと５μＭのＬＡ−ｍｉｄを３０分間反応させ、メタノールで反応を停止した反応液をメタノールで段階希釈し、内標準物質として１−ＯＨ ｍｉｄ（最終濃度：０．１μＭ）を添加したサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定し、ａｒｅａ ｒａｔｉｏ（１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ／１−ＯＨ ｍｉｄ）を１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの希釈倍率に対してプロットし、最小二乗法により直線回帰した。その結果、良好な直線性を確認した。
【００２５】
３ イオン化抑制の回避および定量精度の確認
１．に準じた条件で、２．５μＭのｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄを代謝させ、メタノールを添加することにより反応を停止した。イオン化抑制を起こす物質としてエリスロマイシンを用い、反応液に最終濃度として０−３００μＭのエリスロマイシンおよび内標準物質（ＩＳ：最終濃度としてデキストロルファン（ｄｅｘ）５μＭまたは１−ＯＨ ｍｉｄ０．１μＭ）を添加し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ピーク面積およびａｒｅａ ｒａｔｉｏを用い、結果を比較した。また、定量精度の確認のため、調製した同一検体を３回測定し、平均値およびＣＶ値を求めた。
【００２６】
【００２７】
結果を下表に示した。
グループＡ
【００２８】
グループＢ
【００２９】
グループＣ
【００３０】
上表から明らかなとおり、１−ＯＨ ｍｉｄまたは１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ濃度をｄｅｘを内標準物質として測定した場合、検体に添加したエリスロマイシン濃度に依存して測定対象物質および内標準物質のピーク面積が低下し、エリスロマイシンが１−ＯＨ ｍｉｄ、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄおよびｄｅｘのイオン化を阻害することが示された。イオン化抑制の程度が測定対象物質と内標準物質とで異なるため、検体中の測定対象物質の濃度が一定であるにもかかわらず、ピーク面積比は変動した。一方、１−ＯＨ ｍｉｄを内標準物質として測定した場合、１−ＯＨ ｍｉｄおよび１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄのイオン化抑制の程度が同様であり、ピーク面積比は一定の値を示した。したがい、１−ＯＨ ｍｉｄを内標準物質として、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄを測定することにより、イオン化抑制の影響を受けずに定量することが確認した。また、再現性に関しては、グループＡおよびグループＢでは、１−ＯＨ ｍｉｄおよび１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄが同一濃度であるにもかかわらず、エリスロマイシン濃度が高くなるにしたがい、ピーク面積比が変化したほか、分析毎の再現性も悪く、特に高濃度のエリスロマイシン存在下では、ＣＶ値が１０％以上の値を示した。一方、グループＣでは、エリスロマイシンの濃度によらず、ＣＶ値が４％以下であり、精度の高い定量が可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の方法によれば、医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行うことができる。したがい、本発明の方法により、スピードを損なうことなく、効率的に多検体のスクリーニングができ、薬物相互作用がないか、またはほとんどない医薬品の開発のスピードアップ・効率化ができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物相互作用の検討方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床現場においては、薬物は併用されることが多く、チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）が関与する薬物代謝反応を介した薬物相互作用が問題となる。このため医薬品開発における候補化合物の選抜において、ＣＹＰに対する阻害能の評価を行う必要がある（非特許文献１参照）。
肝ミクロソームを用いるＣＹＰ阻害能の評価においては、プローブ化合物（ＣＹＰの基質）の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ（ＭＳｎ））で行うことが一般的である。ＬＣ／ＭＳ（ＭＳｎ）は選択性の高い測定法であることから、測定対象物質であるプローブ化合物の代謝物と候補化合物をカラム上で分離することなく、短時間に多くの候補化合物を分析できることが特長とされてきた。しかしながら、イオン化しやすい物質がサンプル中に共存すると、プローブ化合物や内標準物質（ＩＳ）あるいはその両方のイオン化抑制が起こり、得られた結果をＣＹＰの阻害や活性化として見誤ることがある（後記実施例参照）。
イオン化抑制の影響を受けずにＣＹＰ阻害能を評価するためには、サンプル中の物質毎にイオン化抑制の有無をチェックし、それを回避するための分離条件を設定することが望ましいが、医薬品開発の開発スピード・効率を大きく損なうことになり、好ましいものではない。
この問題を回避するため、ある物質に対するイオン化抑制の程度は、その同位体に対する程度と同じであることを利用し、質量分析における内標準物質としては、測定対象物質の同位体を用いることが望ましいとされている。
ＣＹＰ阻害能の評価においても、プローブ化合物の代謝物の生成を、このものの同位体を内標準物質として使用して測定している報告がある（非特許文献２参照）。
しかしながら、プローブ化合物の代謝物の同位体は市販されておらず、またこの代謝物の同位体の合成は非常に困難であるか、または高価なものである。このため、非特許文献２記載の方法は、使い勝手のよいものではない。
【０００３】
【非特許文献１】厚生労働省医薬局審査管理課長通知（医薬審発第八一三号）
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３１，８１５−８３２（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行う方法および薬物相互作用の検討方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者らは医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行う方法を見出すべく種々検討した結果、プローブ化合物の同位体を用いることで、ＣＹＰに対する阻害能の評価を、イオン化抑制の影響を回避し、安価に行えることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、以下の方法を提供するものである。
（Ａ）下記（１）及び（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
（Ｂ）ＣＹＰとしてＣＹＰを含む組織・臓器、ＣＹＰを含む組織・臓器のＣＹＰ画分またはＣＹＰ発現系を用いるものである上記（Ａ）記載の方法。
（Ｃ）ＣＹＰとしてヒト肝ミクロソームを用いるものである上記（Ａ）記載の方法。
（Ｄ）ＣＹＰがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４から選ばれる１つ以上である上記（Ａ）記載の方法。
（Ｅ）ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ１Ａ２基質の同位体、ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体およびＣＹＰ３Ａ４基質の同位体から選ばれるものである上記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｆ）ＣＹＰ１Ａ２基質の同位体がクロピドグレルの同位体、フルタミドの同位体、カフェインの同位体、フェナセチンの同位体およびテオフィリンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｇ）ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体がクマリンの同位体、テガフールの同位体、ニコチンの同位体およびＳＭ−１２５０２の同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｈ）ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体がパクリタキセルの同位体、ジクロフェナック（５−ＯＨ）の同位体、ロシグリタゾンの同位体およびフルバスタチンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｉ）ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体がフェニトインの同位体、トルブタミドの同位体、ジクロフェナック（４'−ＯＨ）の同位体およびＳ−ワルファレンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｊ）ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体がＳ−メフェニトインの同位体、ジアゼパムの同位体、ヘキソバルビタールの同位体、イミプラミンの同位体、オメプラゾールの同位体、プログアニルの同位体およびプロプラノロールの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｋ）ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体がデブリソキンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ブフラロールの同位体、コデインの同位体、エチルモルホリンの同位体およびニコチンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｌ）ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体がクロルゾキサゾンの同位体、エンフルランの同位体およびダプソンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｍ）ＣＹＰ３Ａ４基質の同位体がミダゾラムの同位体、エリスロマイシンの同位体、シクロスポリンの同位体、サキナビルの同位体、カルバマゼピンの同位体、フェロジピンの同位体、ニフェジピンの同位体、トリアゾラムの同位体、シンバスタチンの同位体、テルフェナジンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ベラパミルの同位体およびワルファレンの同位体から選ばれるものである上記（Ｅ）記載の方法。
（Ｎ）ＣＹＰ基質の同位体がミダゾラムの同位体またはトリアゾラムの同位体である上記（Ａ）記載の方法。
（Ｏ）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いるものである上記（Ａ）〜（Ｎ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｐ）内標準物質としてＣＹＰ基質の代謝物を用いるものである上記（Ｏ）記載の方法。
（Ｑ）ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ基質の安定同位体である上記（Ａ）〜（Ｐ）のいずれか１つに記載の方法。
（Ｒ）ＣＹＰ基質の同位体を有効成分とする検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬。
（Ｓ）検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬としてのＣＹＰ基質の同位体の使用。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行うことができる。これにより、スピードを損なうことなく、効率的に多検体のスクリーニングができ、薬物相互作用がないか、またはほとんどない医薬品の開発のスピードアップ・効率化ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明にかかるＣＹＰには、種々の分子種、例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４などの存在が知られている。ＣＹＰによる薬物代謝には動物種差があることが知られているので、医薬品開発の対象とする動物種に応じてＣＹＰを選択するのが好ましい。本発明において、ヒト用医薬品を開発する場合、ヒト組織由来の上記分子種や肝臓、小腸、肺臓、腎臓などの上記分子種を含む組織・臓器、前記組織・臓器の画分（ミクロソーム、Ｓ−９など）、ヒトの各ＣＹＰ分子種発現系などを挙げることができる。ヒト体内における薬物代謝を考慮すると、ヒト肝ミクロソームを用いることが好ましい。
【０００９】
本発明において、ＣＹＰ基質の同位体（以下、同位体ＣＹＰ基質と略することもある。）としては、ＣＹＰ基質の安定同位体や放射性同位体等を挙げることができるが、使用簡便性等の点から安定同位体を用いることが好ましい。同位体ＣＹＰ基質は、第一化学薬品社やＳＣＥＴＩｉｓｏｔｏｐｅ社などから販売されているものを用いてもよいし、また公知の方法により作製したものを用いてもよい。
【００１０】
本発明においては、用いるＣＹＰとその基質との関係および検体の利用分野、方法または条件（対象疾患、併用薬種類、併用薬および検体の効果発現血中濃度、薬物相互作用の発現想定濃度など）が重要であり、以下に種々ＣＹＰの分子種とその基質の関係を記載する。下表に記載の関係に基づき、用いるＣＹＰと同位体ＣＹＰ基質を適宜検討して、本発明の方法を実施すればよい。
【００１１】
【００１２】
本発明にかかるＣＹＰ、同位体ＣＹＰ基質および検体を混合、反応させる工程における条件は、用いるＣＹＰ、同位体ＣＹＰ基質や検体に応じて、適宜検討し、設定すればよいが、通常２５〜４０℃で３０秒〜１時間行い、必要に応じて反応を停止させることで完了する。反応条件としては、３７℃で５〜３０分間が好ましい。
【００１３】
反応工程完了後、反応液中の同位体ＣＹＰ基質の代謝物の分析は、通常の方法を用いて行えばよい。同位体ＣＹＰ基質として、ＣＹＰ基質の安定同位体を用いた場合、反応液（必要に応じてサンプルを遠心分離して得られる上清）を液体クロマトグラフィー／質量分析計に注入し、同位体ＣＹＰ基質の代謝物を分析すればよい。液体クロマトグラフィーは、同位体ＣＹＰ基質の代謝物と同じ質量数を持つ物質（他の代謝物など）とを分離するために行うものであり、カラムとしては、高速液体クロマトグラフィー用のカラムを使用すればよく、液体クロマトグラフィーの条件等は、適宜検討し、設定すればよい。本発明においては、カラムとして逆相ＯＤＳ（Ｃ１８）タイプまたはＣ８タイプを用いるのが好ましい。
反応液中に同位体ＣＹＰ基質の代謝物と同じ質量数を持つ物質が共存しない場合、同位体ＣＹＰ基質の代謝物を分離する必要がないので、反応液を直接質量分析計に注入してもよい。
【００１４】
ＬＣの移動相としては、同位体ＣＹＰ基質の代謝物の溶出位置が最適な位置となるように設定した溶液を用いればよく、ＣＹＰ基質の同位体、同位体ＣＹＰ基質の代謝物などに基づき、適宜検討し、条件（ｐＨ、溶液の種類、濃度など）を設定すればよい。例えば、同位体ＣＹＰ基質として、ミダゾラムの安定同位体（［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム）を用いた場合、使用するカラムに応じたｐＨ範囲の水溶液と有機溶媒のグラジェント条件が好ましい。水溶液としては、ギ酸、酢酸、テトラフルオロ酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの水溶液を挙げることができる。中でもギ酸が好ましい。水溶液の濃度としては、０．０１〜１０重量％または１〜１００ｍＭが好ましく、特に０．１〜０．５重量％のギ酸が好ましい。有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどを挙げることができる。中でもアセトニトリルが好ましい。
また、カラムの長さを調整することで、同位体ＣＹＰ基質の代謝物の溶出位置を早くすることも可能であり、溶出位置を早くすれば、より一層効率的となる。内標準物質としては、ＣＹＰ基質の代謝物（非同位体）を用いる。
【００１５】
同位体ＣＹＰ基質の代謝物の測定結果から、検体のＣＹＰに対する阻害能を評価することができる。評価にあたっては、検体の利用分野、方法または条件（対象疾患、併用薬種類、併用薬および検体の効果発現血中濃度、薬物相互作用の発現想定濃度など）を考慮して、検体のＣＹＰに対する阻害能を評価すればよい。本発明の方法は、自動化することも可能である。
【００１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
１．ヒト肝ミクロソームにおけるミダゾラムと同位体ミダゾラムの代謝反応
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）におけるミダゾラム（ｍｉｄ）と同位体ミダゾラム（［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム（ＬＡ−ｍｉｄ））の代謝反応が同様であることを代謝物の生成速度（試験１）およびＫｍ（親和性）（試験２）の算出により確認した。
下表記載の組成の溶液（Ａ）を調製し、５分間プレインキュベーションした後、下表記載の組成の溶液（Ｂ）を添加することにより反応を開始した。基質濃度は最終濃度として，試験１ではｍｉｄあるいはＬＡ−ｍｉｄ ２．５μＭおよびｍｉｄとＬＡ−ｍｉｄ １．２５μＭずつ，試験２では０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０および２０μＭとした。
【００１８】
【００１９】
反応を１０分間行った後、内標準物質（デキストロルファン）含有メタノール６００μｌを添加攪拌することにより反応を停止した。反応停止後、サンプルを遠心分離し（２００００×ｇ、１０分、４℃）、上清中の１'−ヒドロキシミダゾラム（１−ＯＨ ｍｉｄ）および１'−ヒドロキシ［１３Ｃ４，１５Ｎ］−標識化ミダゾラム（１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【００２０】
分析条件を以下に示した。
ＬＣ装置：Ａｌｌｉａｎｃｅ２７９５（Ｗａｔｅｒｓ社）
カラム：Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ、４．６ｍｍΦ×２５ｍｍ（Ｍｅｒｃｋ社）
カラム温度：４０℃
移動相：溶媒Ａ：蒸留水／０．１％ギ酸
溶媒Ｂ：アセトニトリル／０．１％ギ酸
【００２１】
結果を下表に示した。
（試験１）
【００２２】
ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄそれぞれ単独で反応させたときの１−ＯＨ体のａｒｅａ ｒａｔｉｏ（１−ＯＨ ｍｉｄ／ＩＳ：１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ／ＩＳ＝１．３３倍）と等量混合して代謝させた場合のそれ（１．２６倍）は，ほぼ一致し、ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄの代謝速度に差がないことが確認された。
【００２３】
(試験２)
Ｋｍの算出には、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの標品がないため、ａｒｅａ ｒａｔｉｏを生成速度として用いた。算出されたｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄ水酸化代謝反応のＫｍ値はそれぞれ４．５μＭ、３．１μＭで，ｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄはＣＹＰ３Ａ４に対して同様の親和性をもつことが確認された。
【００２４】
２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの直線性の確認
１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの標品が存在しないため、測定時に検量線を引くことによる定量範囲の直線性の確認ができない。このため、１．に準じ、０．１ｍｇ蛋白／ｍｌのＨＬＭと５μＭのＬＡ−ｍｉｄを３０分間反応させ、メタノールで反応を停止した反応液をメタノールで段階希釈し、内標準物質として１−ＯＨ ｍｉｄ（最終濃度：０．１μＭ）を添加したサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定し、ａｒｅａ ｒａｔｉｏ（１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ／１−ＯＨ ｍｉｄ）を１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄの希釈倍率に対してプロットし、最小二乗法により直線回帰した。その結果、良好な直線性を確認した。
【００２５】
３ イオン化抑制の回避および定量精度の確認
１．に準じた条件で、２．５μＭのｍｉｄおよびＬＡ−ｍｉｄを代謝させ、メタノールを添加することにより反応を停止した。イオン化抑制を起こす物質としてエリスロマイシンを用い、反応液に最終濃度として０−３００μＭのエリスロマイシンおよび内標準物質（ＩＳ：最終濃度としてデキストロルファン（ｄｅｘ）５μＭまたは１−ＯＨ ｍｉｄ０．１μＭ）を添加し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ピーク面積およびａｒｅａ ｒａｔｉｏを用い、結果を比較した。また、定量精度の確認のため、調製した同一検体を３回測定し、平均値およびＣＶ値を求めた。
【００２６】
【００２７】
結果を下表に示した。
グループＡ
【００２８】
グループＢ
【００２９】
グループＣ
【００３０】
上表から明らかなとおり、１−ＯＨ ｍｉｄまたは１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄ濃度をｄｅｘを内標準物質として測定した場合、検体に添加したエリスロマイシン濃度に依存して測定対象物質および内標準物質のピーク面積が低下し、エリスロマイシンが１−ＯＨ ｍｉｄ、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄおよびｄｅｘのイオン化を阻害することが示された。イオン化抑制の程度が測定対象物質と内標準物質とで異なるため、検体中の測定対象物質の濃度が一定であるにもかかわらず、ピーク面積比は変動した。一方、１−ＯＨ ｍｉｄを内標準物質として測定した場合、１−ＯＨ ｍｉｄおよび１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄのイオン化抑制の程度が同様であり、ピーク面積比は一定の値を示した。したがい、１−ＯＨ ｍｉｄを内標準物質として、１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄを測定することにより、イオン化抑制の影響を受けずに定量することが確認した。また、再現性に関しては、グループＡおよびグループＢでは、１−ＯＨ ｍｉｄおよび１−ＯＨ ＬＡ−ｍｉｄが同一濃度であるにもかかわらず、エリスロマイシン濃度が高くなるにしたがい、ピーク面積比が変化したほか、分析毎の再現性も悪く、特に高濃度のエリスロマイシン存在下では、ＣＶ値が１０％以上の値を示した。一方、グループＣでは、エリスロマイシンの濃度によらず、ＣＶ値が４％以下であり、精度の高い定量が可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の方法によれば、医薬品開発における候補化合物の選抜において、イオン化抑制の影響を回避し、効率的、安価にＣＹＰに対する阻害能の評価を行うことができる。したがい、本発明の方法により、スピードを損なうことなく、効率的に多検体のスクリーニングができ、薬物相互作用がないか、またはほとんどない医薬品の開発のスピードアップ・効率化ができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
【請求項２】
ＣＹＰとしてＣＹＰを含む組織・臓器、ＣＹＰを含む組織・臓器のＣＹＰ画分またはＣＹＰ発現系を用いるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰとしてヒト肝ミクロソームを用いるものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＹＰがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４から選ばれる１つ以上である請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ１Ａ２基質の同位体、ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体およびＣＹＰ３Ａ４基質の同位体から選ばれるものである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＣＹＰ１Ａ２基質の同位体がクロピドグレルの同位体、フルタミドの同位体、カフェインの同位体、フェナセチンの同位体およびテオフィリンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体がクマリンの同位体、テガフールの同位体、ニコチンの同位体およびＳＭ−１２５０２の同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体がパクリタキセルの同位体、ジクロフェナック（５−ＯＨ）の同位体、ロシグリタゾンの同位体およびフルバスタチンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項９】
ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体がフェニトインの同位体、トルブタミドの同位体、ジクロフェナック（４'−ＯＨ）の同位体およびＳ−ワルファレンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体がＳ−メフェニトインの同位体、ジアゼパムの同位体、ヘキソバルビタールの同位体、イミプラミンの同位体、オメプラゾールの同位体、プログアニルの同位体およびプロプラノロールの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体がデブリソキンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ブフラロールの同位体、コデインの同位体、エチルモルホリンの同位体およびニコチンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１２】
ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体がクロルゾキサゾンの同位体、エンフルランの同位体およびダプソンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１３】
ＣＹＰ３Ａ４基質の同位体がミダゾラムの同位体、エリスロマイシンの同位体、シクロスポリンの同位体、サキナビルの同位体、カルバマゼピンの同位体、フェロジピンの同位体、ニフェジピンの同位体、トリアゾラムの同位体、シンバスタチンの同位体、テルフェナジンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ベラパミルの同位体およびワルファレンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１４】
ＣＹＰ基質の同位体がミダゾラムの同位体またはトリアゾラムの同位体である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ＣＹＰ基質の同位体の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いるものである請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
内標準物質としてＣＹＰ基質の代謝物を用いるものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ基質の安定同位体である請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ＣＹＰ基質の同位体を有効成分とする検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬。
【請求項１９】
検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬としてのＣＹＰ基質の同位体の使用。
【請求項１】
下記（１）及び（２）のステップを含む、検体によるチトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）阻害の有無および／またはその程度を評価する方法。
（１）ＣＹＰ、ＣＹＰ基質の同位体および検体を混合、反応させる工程
（２）ＣＹＰ基質の同位体の代謝物を測定する工程
【請求項２】
ＣＹＰとしてＣＹＰを含む組織・臓器、ＣＹＰを含む組織・臓器のＣＹＰ画分またはＣＹＰ発現系を用いるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰとしてヒト肝ミクロソームを用いるものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＹＰがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１およびＣＹＰ３Ａ４から選ばれる１つ以上である請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ１Ａ２基質の同位体、ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体、ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体、ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体およびＣＹＰ３Ａ４基質の同位体から選ばれるものである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＣＹＰ１Ａ２基質の同位体がクロピドグレルの同位体、フルタミドの同位体、カフェインの同位体、フェナセチンの同位体およびテオフィリンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ２Ａ６基質の同位体がクマリンの同位体、テガフールの同位体、ニコチンの同位体およびＳＭ−１２５０２の同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＣＹＰ２Ｃ８基質の同位体がパクリタキセルの同位体、ジクロフェナック（５−ＯＨ）の同位体、ロシグリタゾンの同位体およびフルバスタチンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項９】
ＣＹＰ２Ｃ９基質の同位体がフェニトインの同位体、トルブタミドの同位体、ジクロフェナック（４'−ＯＨ）の同位体およびＳ−ワルファレンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１０】
ＣＹＰ２Ｃ１９基質の同位体がＳ−メフェニトインの同位体、ジアゼパムの同位体、ヘキソバルビタールの同位体、イミプラミンの同位体、オメプラゾールの同位体、プログアニルの同位体およびプロプラノロールの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１１】
ＣＹＰ２Ｄ６基質の同位体がデブリソキンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ブフラロールの同位体、コデインの同位体、エチルモルホリンの同位体およびニコチンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１２】
ＣＹＰ２Ｅ１基質の同位体がクロルゾキサゾンの同位体、エンフルランの同位体およびダプソンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１３】
ＣＹＰ３Ａ４基質の同位体がミダゾラムの同位体、エリスロマイシンの同位体、シクロスポリンの同位体、サキナビルの同位体、カルバマゼピンの同位体、フェロジピンの同位体、ニフェジピンの同位体、トリアゾラムの同位体、シンバスタチンの同位体、テルフェナジンの同位体、デキストロメトルファンの同位体、ベラパミルの同位体およびワルファレンの同位体から選ばれるものである請求項５記載の方法。
【請求項１４】
ＣＹＰ基質の同位体がミダゾラムの同位体またはトリアゾラムの同位体である請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ＣＹＰ基質の同位体の代謝物の測定を液体クロマトグラフィー／質量分析法を用いるものである請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
内標準物質としてＣＹＰ基質の代謝物を用いるものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＣＹＰ基質の同位体がＣＹＰ基質の安定同位体である請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
ＣＹＰ基質の同位体を有効成分とする検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬。
【請求項１９】
検体によるＣＹＰ阻害の有無および／またはその程度の評価用試薬としてのＣＹＰ基質の同位体の使用。
【公開番号】特開２００７−２２８８２４（Ｐ２００７−２２８８２４Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６１９（Ｐ２００６−５１６１９）
【出願日】平成１８年２月２８日（２００６．２．２８）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２８日（２００６．２．２８）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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