蛋白質結晶化装置および蛋白質結晶化方法
【課題】 蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる蛋白質結晶化装置を提供する。
【解決手段】 蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部１６を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と積層されるプレート２４とを有し、前記プレート２４は、前記結晶化剤保持部１６に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画３２と、該結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有することを特徴とする蛋白質結晶化装置。
【解決手段】 蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部１６を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と積層されるプレート２４とを有し、前記プレート２４は、前記結晶化剤保持部１６に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画３２と、該結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有することを特徴とする蛋白質結晶化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の結晶化あるいは結晶化条件のスクリーニングを行うための装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛋白質の立体構造と蛋白質の機能との関係を明らかにすることにより、それをコードする遺伝子の機能を解明しようとする、構造ゲノム科学と呼ばれる研究が行われている。
蛋白質の立体構造の解析は、通常、解析しようとする蛋白質の結晶化条件をスクリーニングした後、最適な結晶化条件における結晶化を実施し、その後、得られた結晶をＸ線構造解析に供することにより行われている。ここで、蛋白質の結晶化条件をスクリーニングする過程においては、立体構造解析を行うのに十分に良好な結晶を得る条件を決定するまでに、多くの時間と多量の蛋白質試料を費やしており、立体構造解析におけるボトルネックとなっている。
このことに対し、蛋白質の結晶化条件のスクリーニング、あるいは結晶化を迅速に、より微量のサンプルで行うために、種々の蛋白質結晶化装置や結晶化方法、結晶化スクリーニング方法が提案されている。
本発明者らの一部も蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを迅速に、かつ微量のサンプルで経済的に行うことを目的として、結晶化実験を、マイクロアレイ型のチップ上で行うような結晶化装置を提案している（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に記載の発明では、マイクロアレイを使用し、そのマイクロアレイは、貫通孔により形成された各区画内にゲル状物が保持されており、各ゲル状物には、複数の種類および濃度の蛋白質結晶化剤が含まれている。マイクロアレイを蛋白質含有試料と接触させることにより、一度に複数の結晶化条件をスクリーニングすることができる。さらに、微量の蛋白質試料で実施することができ、非常に効率的である。
【特許文献１】ＷＯ０３／０５３９９８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の蛋白質結晶化装置では、マイクロアレイの区画間で、蛋白質含有試料及び／又は結晶化剤の移動、混合（汚染）が起こり、結晶が析出した条件が予め区画内のゲル状物に含まれる結晶化剤の濃度や種類と一致しない虞があった。
また、このような装置では、蛋白質含有試料を手作業で結晶化剤保持部分に供する必要があり、操作が煩雑となる。また、自動的に蛋白質含有試料を供する自動装置は高価である。
本発明は前記課題を解決するためになされたもので、蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる蛋白質結晶化装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の蛋白質結晶化装置は、蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイと、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレートとを有し、前記プレートは、前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画と、該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の蛋白質結晶化装置によれば、蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
この例では、図１に示すように、支持体２０、シリコンゴム製のパッキング２２、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４を備えている。
パッキング２２は蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と同じ形状および面積の中空部２３を有し、支持体２０には、該パッキング２２の外周と同じ形状および大きさのマイクロアレイ支持部２６が設けられている。マイクロアレイ支持部２６には、パッキング２２と同一の形状のマーキング２８が施されている。
パッキング２２は、マーキング２８に位置を合わせてマイクロアレイ支持部２６上に設置されており、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が、マイクロアレイ支持部２６上に、パッキング２２の中空部２３に格納されて設置されている。ここで、プレート２４に設けられた結晶化区画３２と、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８上の結晶化剤保持部１６とを正確に接触させるために、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上面と、支持体２０の上面とは、同じ高さになっていることが好ましい。
【０００７】
図３は、プレート２４の中央部を拡大した断面図である。図４に、支持体２０、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４が組み立てられた状態の一部の断面図を示す。
プレート２４は、図３、４に示すように、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の結晶化剤保持部１６の各々と対応した配列の結晶化区画３２と、該結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有する。なお、各々の結晶化区画３２は、プレート２４において凹部３４に対し凸な部位である結晶化区画支持部３１の先端にそれぞれ支持されている。
このプレート２４は、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層される。すなわち、図４に示すように、結晶化区画３２は、結晶化剤保持部１６によって密封され、結晶化区画支持部３１に支持された結晶化区画３２と、同様に結晶化区画支持部３１に支持された結晶化区画３２との間に、各々凹部３４が位置する。
以下、支持体２０のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持する面をマイクロアレイ支持面１００、プレート２４のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８に接する面を反応面１０２、それと反対側の面を外側面１０４と称する。
なお、プレート２４において、結晶化区画３２の配列された領域の外縁は凹部となるから、プレート２４において凹状となった一定面積の領域が形成される。以下、プレート２４の反応面のうち、結晶化区画３２が配列された凹状の領域を、シール部３０と称する。
【０００８】
この例においては、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が、支持体２０のマイクロアレイ支持部２６上に設置されているが、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、結晶化剤保持部１６が結晶化区画３２に対応して該結晶化区画３２を密封できるように設置されていればよく、支持体２０に接着されていてもよいし、マイクロアレイ支持部２６を凹状に形成し、該マイクロアレイ支持部の底部に接着せずに積層されていてもよい。
【０００９】
支持体２０の材料および形状は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を固定可能なものであれば、特に限定されない。支持体２０の材料としては、光透過性の材料を用いることにより、生成した結晶を結晶化装置のまま迅速・簡便に顕微鏡にて確認でき、結晶の成長過程を経時的に観察できることから好ましい。光透過性の材料としては、例えばアクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス等が挙げられる。
支持体２０には、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の固定位置を決めるためのマーキングが施されている。マーキング方法は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を正確な固定を可能とするものであれば特に限定されず、例えば、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と同様の形状および面積を有する窪み、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の所定の位置に対応する支持体２０上の位置に塗装された点などが挙げられる。
この例では、図７に示すように、支持体２０に、プレート２４と支持体２０とを積層する際に結晶化区画３２と結晶化剤保持部１６とを対応させるプレート位置決め孔４４がさらに設けられている。
【００１０】
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部１６を有する。
結晶化剤保持部１６としては、ゲル等の蛋白質結晶化剤を保持できる多孔質体（以下、保持相とする）に蛋白質結晶化剤を保持させたものを用いることができ、保持相は、図４に示すように結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料が結晶化剤保持部１６に接触した際に、該保持相から結晶化区画３２へ蛋白質結晶化剤が移動するものであればよい。
前記保持相としては、ゲルを用いることが好ましい。ゲルを用いることにより、結晶化剤保持部１６から、結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料への蛋白質結晶化剤の移動が、適度に緩やかな速度に制御され、安定した結晶化を実現できる。
ゲルの材料は特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類または２種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を、例えば水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。その他に、ゲルとして、例えばアガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを用いることができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８に、上記のようなゲルを保持させるには、例えば、ゲルの構成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量体および開始剤を含む液を該容器に注入し、重合させてゲル化させればよい。ゲル化させる方法としては、多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用いる方法であってもよい。また、ゲル材料としてアガロースを用いる場合は、温度降下によってゲル化を行ってもよい。
蛋白質結晶化剤をゲルに保持させる場合、その方法は、特に制限されるものではない。例えば、予め蛋白質結晶化剤と上記の重合性モノマーとを混合して、適当な容器に導入しておき、その後、重合反応を行ってゲルを形成させることにより、蛋白質結晶化剤をゲルに保持させることができる。ここで、蛋白質結晶化剤を多孔性粒子等を含浸させ、その粒子をゲルに包括させることもできる。
【００１１】
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の材料、形状等は、反応用物質が多数個整列配置されており、結晶析出の観察を妨げないものであれば、特に限定されない。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の材料としては、例えば、ガラス、樹脂、金属等が挙げられ、また、これらの材料を組み合わせて作製した複合体を用いてもよい。ただし、蛋白質結晶の析出の有無を容易に確認するために、光透過性の高い材料を用いることが好ましい。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の形状としては、例えば、円形、正方形、長方形などの形状が挙げられる。また、その厚みについては、結晶化の効率の向上や、結晶析出の観察の容易化および迅速化を考慮して任意に選択できるが、例えば０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．２〜２ｍｍとすることができる。
【００１２】
図２に、本発明の蛋白質結晶化装置に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレイの好適な例として、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイを示す。図２に示すように、基板１０に、中空管状体として２本以上の中空繊維１２が区画配列されて固定されており、これらの中空繊維１２は中空部１４を有し、これらの中空部１４に、蛋白質結晶化剤を保持したゲルが充填されて、結晶化剤保持部１６を成している。すなわち、基板１０に、２つ以上の結晶化剤保持部１６が区画配列されて、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８
を構成している。
中空繊維１２は、例えば、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート等のメタクリレート系モノマー、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のアクリレート系モノマーの単独重合体もしくはこれらの共重合体、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ノボルネン／エチレン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ガラス等から形成されるものが挙げられる。
中空繊維１２の内壁表面は、無処理の状態で用いてもよいが、必要に応じて、プラズマ処理やγ線、電子線などの放射線処理を施したものであってもよい。さらに、中空繊維１２は、必要に応じて反応性官能基を導入したものであってもよい。
中空繊維１２の外径は、単位面積あたりの結晶化剤保持部１６の数を多くするために、２ｍｍ以下であることが好ましく、０．７ｍｍ以下であることがより好ましい。また、中空繊維１２の内径は、前記外径の範囲内で適宜選択される。
基板１０に、２つ以上の中空繊維１２を区画配列して固定する方法としては、以下の方法を用いることができる。すなわち、まず、中空繊維１２を、所定の間隔をもって平行に配列させる。これらの中空繊維１２を収束した後に接着して、繊維配列体（三次元配列体）となすことができる。得られた三次元配列体を、ミクロトームなどの切片作成用の装置を用いて、繊維軸と交差する方向、好ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することにより、中空繊維配列体断面を有する薄片（図２）からなるマイクロアレイを得ることができる。薄片の厚みは、通常１００〜５０００μｍとして用いることができ、好ましくは２００〜２０００μｍである。
このとき、中空繊維１２を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に中空繊維１２が整然と規則的に配列した中空繊維配列体を得ることができる。中空繊維配列体の形状は特に限定されるものではないが、通常は、繊維を規則的に配列させることにより、正方形、長方形、円形等に形成される。
「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる繊維の本数が一定となるように順序良く配列させることをいう。例えば、直径１ｍｍの繊維を束にして断面が縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となるように配列させようとする場合は、その正方形の枠内（１ｃｍ２）における１辺に含まれる繊維の数を１０本とし、この１０本の繊維を１列に束ねて１層のシートとした後、このシートが１０層になるように重ねる。その結果、縦に１０本、横に１０本、合計１００本の繊維を配列させることができる。ただし、繊維を規則的に配列させる手法は、上記のようにシートを重層するものに限定されるものではない。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８として、上記のような、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイを用いることによって、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の厚み、結晶化剤保持部１６の体積、保持される蛋白質結晶化剤の種類および濃度等を、良好に制御して、かつ効率よく、蛋白質結晶化装置を製造することができる。
【００１３】
なお、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、外気との接触を防ぐ密閉性のよい容器やシール等で密閉することにより保存されることが好ましい。密閉性のよい容器としては、例えば、気体や水の透過率の小さい高分子材料や、ガラス、金属等が挙げられる。また、このようなマイクロアレイは、低温で保存されることが好ましく、特に長期にわたる保存の場合は凍結保存してもよい。
【００１４】
さらに、各々の結晶化剤保持部１６が、異なる蛋白質結晶化条件に調製されたゲルからなることが好ましく、このことにより、結晶化条件のスクリーニングを行う場合に、スクリーニングを一枚のマイクロアレイ上で迅速に行うことができる。
【００１５】
ここで、蛋白質結晶化条件とは、蛋白質結晶化剤の種類および濃度、蛋白質結晶化剤を保持させる保持相、例えば蛋白質結晶化剤を保持させて固化させた後のゲルのｐＨ、ゲルの組成、架橋度、結晶化剤保持部１６および結晶化区画３２の温度、時間、冷却プロファイル等である。
蛋白質結晶化剤の種類としては、例えば、沈殿剤、ｐＨ緩衝剤、これらの任意の組み合わせ等が挙げられる。
沈殿剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、硫酸アンモニウム等が挙げられる。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、酢酸ナトリウム三水和物、リン酸カリウム、イミダゾール、クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム等が挙げられる。これらを単独で使用してもよいし、任意の組み合わせの２種以上で使用してもよい。さらに、蛋白質結晶化剤としては、市販品として、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ社製「ＷＩＺＡＲＤ ＩＩ」、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｃｒｅｅｎ」、「Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ」等を用いることができる。
蛋白質結晶化剤の濃度としては、用いる蛋白質結晶化剤の種類にもよるが、例えば、ポリエチレングリコールからなる沈殿剤の場合は、５〜５０体積％、好ましくは１０〜３５体積％であり、ｐＨ緩衝剤の場合には、０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。
【００１６】
上述のように、各々の結晶化剤保持部１６を、それぞれ異なる蛋白質結晶化条件に調製することにより、対象の蛋白質についての結晶化条件のスクリーニングを迅速に行うことができる。ここで、例えば、蛋白質結晶化剤の濃度を多段階に設定することが好ましく、具体的には、塩化ナトリウムからなる沈殿剤を用いる場合は、０．５〜４．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で、５段階、１０段階、２０段階のように希釈列を作製し、それぞれの濃度の蛋白質結晶化剤を、結晶化剤保持部１６に充填することができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、１０〜１０００個の結晶化剤保持部１６を有することが、より多数の結晶化条件における結晶化を一括して行うために好ましい。例えば、通常の蛋白質結晶化条件スクリーニングにおいては、８００程度の結晶化条件を検討することが必要であるため、結晶化剤保持部の数が１０以上であることが好ましく、一方、１０００を超える結晶化剤保持部１６を有すると、結晶化剤保持部１６間の間隔が非常に狭くなり、取り扱いの効率に劣る。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、蛋白質析出の確認を容易に行うために、光透過性の高い材料からなることが好ましい。
【００１７】
この例において、パッキング２２はシリコンゴム製であるが、パッキングの材料は、蛋白質結晶化装置におけるその他の構成要素（例えば、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４、支持体２０）と組み合わせて用いるのに適当なものであれば特に限定されない。
【００１８】
プレート２４は、結晶化剤保持部１６に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画３２と、これらの結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有する。
すなわち、結晶化剤保持部１６と同数の結晶化区画３２が、プレート２４上に設けられている。
プレート２４には、後述のサンプル充填補助具との位置を合わせる位置決め部として、例えば、サンプル充填補助具位置決め孔５０が形成されていることが好ましい。
この例では、支持体２０上に、プレート２４と支持体２０とを積層する際に結晶化区画３２と結晶化剤保持部１６とを対応させるプレート位置決め部材４４がさらに設けられている。プレート２４上に、支持体２０上に設けられたプレート位置決め部材４４と対応するプレート位置決め孔４６が形成されている。
この例では、図１、５に示すように、さらに、プレート２４の外側面１０４から反応面１０２へ貫通するシール剤注入口４８が穿たれている。図５に示すように、この例では、２つのシール剤注入口４８がシール部３０を介して互いに反対側に穿たれている。このことにより、一方のシール剤注入口４８からシール部３０にシール剤を注入した場合に、初めにシール部３０内に存在した空気が他方のシール剤注入口４８から排出されるため、シール部３０において凹部３４の間に位置する結晶化区画３２がより確実に密封される。
プレート２４の材料および形状は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と重ね合わせることができるものであれば特に限定されず、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の形状を考慮して任意のものを用いることができる。プレートの材料としては、ガラス、樹脂、金属などを例示することができ、これらの中から任意のものを選択し、単独で、または２種類以上を組み合わせて用いることができる。なお、結晶化区画３２における蛋白質の結晶化状態を観察するために、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と重ねた際に各結晶化剤保
持部１６と対応して重なる部分が光透過性をもつことが好ましいことから、プレート２４の材料として、光透過性の材料、例えば透明な樹脂、ガラス等を用いることが好ましい。
【００１９】
プレート２４は、結晶化区画３２に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさらに有することが好ましい。このような結晶回収機構を用いて、結晶化区画３２に析出した結晶を回収して種結晶として用い、引き続いて結晶成長過程を行うことによってＸ線構造解析に耐える結晶を迅速に得ることができる。もちろん、析出した結晶がそのままＸ線構造解析に耐える結晶であれば、それを回収して解析に使用する。
このような結晶回収機構としては、例えば、シール部３０がプレート２４と独立した部材からなり、プレート２４とヒンジ機構で接続され、所望に応じシール部３０を外側面１０４側へ開くことができる機構等が挙げられる。
【００２０】
結晶化区画３２の形状は、蛋白質含有試料を充填可能であり、結晶化剤保持部１６と接触した際に密閉されるものであれば、特に限定されない。
結晶化区画３２の容量は、対象の蛋白質について結晶化条件のスクリーニングを行うことを目的とする場合には、結晶化条件のスクリーニングに要する蛋白質量を低減するために、０．５μｌ未満であることが好ましい。一方、ここで析出した結晶を引き続いてＸ線構造解析に供する、または構造解析に供する結晶を作製するための種結晶として用いることを目的とする場合には、Ｘ線構造解析を行うことのできる０．１ｍｍ以上の大きな結晶を得るために、結晶化区画３２の容量は０．５μｌ以上であることが好ましい。
【００２１】
結晶化剤保持部１６と結晶化区画３２との面積の関係は、結晶化剤保持部１６と結晶化区画３２とが接触する面の面積が、結晶化剤保持部１６に保持された結晶化剤が結晶化区画３２に移動して、該結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料と反応することができる条件であればよく、結晶化剤保持部１６よりも結晶化区画３２の方が大きくてもよい。
ただし、結晶化区画３２は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を構成する基板１２に接触しないことが好ましい。
【００２２】
この例では、さらに、図４に示すように、結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４の全てにシール剤３５が充填される。
シール剤３５としては、蛋白質含有試料と互いに溶解せず、プレート２４、パッキング２２、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を構成する基板１２等の部材を侵食しないものであればよく、例えば、パラフィン系、シリコン系、鉱油系、エステル系、合成油系（フッ素系を含む）、リチウム系、ナトリウム系、カルシウム系、前記複合基系、非石鹸系、モリブデン系等のオイルを用いることができる。
シール剤３５を用いなくても、凹部３４を有することにより、隣接する区画への蛋白質含有試料の侵入を防止することができるが、シール剤３５を用いると、さらに確実に蛋白質含有試料どうしの混合および近接する結晶化区画３２への侵入を防止することができるとともに、蛋白質含有試料の蒸発を防止することができる。
【００２３】
この例では、さらに、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８とプレート２４とを圧接する機構として、図１に示すように支持体２０を貫通する第一のネジ孔４０と、第一のネジ孔４０に対応してプレート２４を貫通する第二のネジ孔４２とが設けられている。これらの第一のネジ孔４０、第二のネジ孔４２に、図１に示すようにネジ４１が螺挿される。このような機構を用いることにより、結晶化区画３２を、より安定して密閉状態に保持することができる。
【００２４】
この例の蛋白質結晶化装置において、結晶化区画３２における蛋白質の結晶化をモニタリングする検出機構をさらに設けることができる。
前記検出機構としては、例えば、プレート２４の外側面１０４に設置された顕微鏡と、顕微鏡に搭載されたＣＣＤカメラからなる検出機構が挙げられる。このような検出機構において、顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラにより結晶の析出の様子を撮影記録し、記録された画像データを処理することによって、結晶化の成否を迅速に判断することができる。し
たがって、迅速に蛋白質結晶化条件を決定することができる。
【００２５】
ここで、この例の蛋白質結晶化装置の好適な使用方法を例示する。
［蛋白質含有試料の充填］
この例では、サンプル充填補助具を用いて、結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填することができる。
（結晶化区画）
本発明を使用する際に、蛋白質の結晶化を目的とする場合は、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ以上とすることが好ましい。蛋白質結晶化条件のより迅速なスクリーニングを目的とする場合は、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ未満とすることが好ましい。
（蛋白質含有試料）
本発明において、蛋白質含有試料とは、結晶化を行おうとする、または結晶化条件を特定しようとする蛋白質（以下、対象の蛋白質と称する）を含む試料である。蛋白質としては、天然又は合成のペプチド、ポリペプチド、蛋白質および蛋白質複合体が挙げられる。これらの物質は、天然もしくは合成材料から抽出・単離、または遺伝子工学的手法もしくは化学合成手法等により生成した後、通常の精製法、例えば溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどを組み合わせて用いることにより、対象の蛋白質を精製しておくことが好ましい。
蛋白質含有試料中の蛋白質濃度および純度も蛋白質結晶化条件の一要因となるため、数段階の濃度および純度の蛋白質含有試料を調製して蛋白質結晶化剤と反応させてもよい。例えば、蛋白質濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲内で数段階に変更することが好ましい。また、蛋白質結晶化剤と反応させる蛋白質含有試料の量は、用いる結晶化区画３２の容量および数等に応じて適宜変更しうる。なお、蛋白質含有試料の粘度は、該蛋白質含有試料を保持した結晶化区画３２を下に向けてプレート２４を保持した際に結晶化区画３２から蛋白質含有試料が漏出しなければ特に限定されない。
蛋白質含有試料は、対象の蛋白質のほか、さらに、蛋白質の溶解を助ける蛋白質可溶化剤、還元剤等の安定化剤等を含有してもよい。蛋白質可溶化剤としては、例えば膜蛋白質を溶解させる界面活性剤などが挙げられる。界面活性剤を用いると、蛋白質含有試料において、例えば膜蛋白質などの水溶解性の低い蛋白質を良好に分散させることができ、この例の蛋白質結晶化装置を適用して効率よく蛋白質の結晶化を行うことができる。
【００２６】
まず、図１に示すようなプレート２４を、図５に示すように反応面１０２を上にして静置する。プレート２４に穿たれたサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６に、このサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６と同一径の円柱形のガイドピン５２を１本ずつ挿入して固定する。
ついで、この反応面１０２の上に、図６に示すような、プレート２４上の結晶化区画３２に対応した配列の穿孔５６と、該穿孔５６をプレート２４上で結晶化区画３２に対応させる位置合わせ機構として２つの位置合わせ孔５８とを有する薄板状のサンプル充填補助具５４を設置する。このとき、プレート２４のサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６にそれぞれ固定されたガイドピン５２に、サンプル充填補助具５４に穿たれた位置合わせ孔５８を合わせて差し込み、サンプル充填補助具５４をプレート２４上に設置する。このことにより、プレート２４の結晶化区画３２とサンプル充填補助具５４の穿孔５６が対応するようにサンプル充填補助具５４が設置される。
その後、プレート２４上に設置されたサンプル充填補助具５４の上に、サンプル充填補助具５４のうち穿孔５６の配置された領域全体に行き渡る分量の蛋白質含有試料を載せる。
さらに、スパチュラ等を用いてサンプル充填補助具５４の表面を擦ることにより、穿孔５６に対応した結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填する。
その後、ガイドピン５２をプレート２４の反応面１０２側から外側面１０４側へ押し出し、サンプル充填補助具５４をプレート２４上から取り除く。このことにより、全ての結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填される。
【００２７】
上記説明したように、サンプル充填補助具５４をプレート２４の反応面１０２上に設置し、その上から蛋白質含有試料を添加することによって、蛋白質含有試料を正確に結晶化区画３２に充填することができる。
なお、サンプル充填補助具５４は、成形の容易さ、強度、耐塩性などの観点から、ステンレス製であることが好ましい。また、サンプル充填補助具５４には、蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填した後にサンプル充填補助具５４を容易に取り外せるように、ピンセット等により取り扱う部位が設けられていることが好ましく、例えば一端が上側に折り曲げられて折曲部５９が設けられていることが好ましい。
ここでは、ガイドピン５２をサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６にそれぞれ固定したが、プレート２４において、サンプル充填補助具位置決め孔５０が、プレート位置決め孔４６と独立して複数形成されていてもよい。
【００２８】
蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填する方法としては、蛋白質含有試料を全ての結晶化区画３２に同一の分量で充填することができ、結晶化区画３２以外の構成要素への付着を抑えられる方法であればよく、例えば、サンプル充填補助具５４を用いずに、ピペッター等を用いて結晶化区画３２の各々に蛋白質含有試料を充填することができ、また、サンプル添加用の自動機器を用いることができる。
ただし、蛋白質含有試料の充填を迅速かつ経済的に行うためには、上記のサンプル充填補助具５４を用いる方法が好ましい。
なお、蛋白質含有試料の充填においてピペッターを用いる場合、ピペッターに吸引して保持させた蛋白質含有試料を吐出する機構を用いずに、ピペッターの先端部に付着した微量の液滴を結晶化区画３２付近に接触させることが好ましい。
【００２９】
［蛋白質結晶化装置の組み立て］
図１に示すように、支持体２０上のマーキング２８に合わせて、パッキング２２を設置し、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を、該パッキング２２の中空部２３に格納されるように支持体２０上に設置する。
蛋白質含有試料が結晶化区画３２に充填されたプレート２４を、反応面１０２を下にして保持し、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層する。このとき、支持体２０上に設けられたプレート位置決め部材４４が、プレート２４に穿たれたプレート位置決め孔４６を貫通するようにする。
実験操作上、結晶化区画３２に保持されているゲルが乾燥した場合は、そのままプレート２４を積層すると結晶化区画３２内に気泡が混在する場合がある。気泡を混在させないために、予め結晶化区画３２に蛋白質試料を供し、ゲルが十分、膨潤した後、プレート２４を積層することも可能である。また、超音波式の加湿器により発生した霧を、該マイクロアレイの結晶化区画に接触させ、ゲルを膨潤させても良い。
なお、この例では支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に、プレート２４が反応面１０２を下にして積層されるが、結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填されたプレート２４を、反応面１０２を上にして静置し、該プレート２４の上に、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持した支持体２０を、マイクロアレイ支持面１００を下にして積層してもよい。プレート２４の外側面１０４を上にして設置されていると、シール剤注入口４８からのシール剤の注入、あるいは結晶化区画３２に析出した結晶の観察を行いやすいため好ましい。
【００３０】
プレート２４を支持体２０に押し付けて保持し、保持したまま第一のネジ孔４０、第二のネジ孔４２にネジ４１を螺挿して、プレート２４と、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８とを圧接する。圧接は、支持体２０が結晶化区画３２に接触した後、数分間をかけて完了することが好ましい。そのような圧着方法によれば、結晶化区画３２に保持されたゲルを蛋白質試料で十分に膨潤させることができる。その後、顕微鏡を用いて、蛋白質含有試料の充填状態を確認する。
蛋白質含有試料が各々の結晶化区画３２に充填されていることを確認した後、図５、８に示すようにプレート２４に穿たれたシール剤注入口４８から、ピペット等を用いてシール剤をシール部３０および凹部３４に充填する。このことにより、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８のうち結晶化剤保持部１６以外の位置に漏出した蛋白質含有試料を、シール剤で置き換えることができ、蛋白質含有試料が隣接する結晶化区画３２間で移動することによるコンタミネーションおよび条件変化をさらに確実に防止するとともに、蛋白質含有試料が蒸発することを防止することができる。なお、シール剤の注入量は、シール部３０の全域において凹部３４にシール剤が行き渡り、かつ、図５、８に示すような一方のシール剤注入口４８からシール剤を注入した際に、他方のシール剤注入口４８からシール剤が漏出しない最大量であることが好ましい。
【００３１】
［蛋白質の結晶化条件のスクリーニング］
組み立てられた蛋白質結晶化装置を用いて、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを行い、目的蛋白質における最適な結晶化条件を求めることができる。また、析出した結晶を用いて構造解析に適した結晶を作製することもできる。
蛋白質結晶化装置において蛋白質結晶化剤と蛋白質含有試料とを反応させた後、蛋白質結晶化装置を、蛋白質が析出するのに十分な時間にわたって、ある温度条件下にて、密閉状態または大気中に静置する。
蛋白質が析出するのに十分な時間とは、特定の蛋白質、濃度、結晶化条件などにより異なるが、約１時間〜１０日であり、およそ３０日以上経過しても結晶が析出しない場合には、その結晶化条件は適切ではないものとみなす。また、温度条件は、蛋白質結晶化条件の一要因であるため、温度条件を変更して結晶化を行ってもよい。温度条件は、例えば、４℃、１５℃、１８℃、２２℃等のように、複数の段階に設定することが好ましい。
蛋白質が析出するのに十分な時間が経過した後、蛋白質の結晶析出の状況を観察する。このとき、プレート２４の外側面１０４側から、例えば光学顕微鏡等にて観察することが好ましい。
このようにして、対象の蛋白質について最適な結晶化条件を決定することができる。
【００３２】
［構造解析用の結晶の作製］
蛋白質の結晶化を目的として、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ以上とした場合は、全ての結晶化区画３２のうち、結晶の析出した結晶化区画３２において、引き続いて結晶を成長させる、あるいは析出した結晶を結晶化区画３２から回収して種結晶として用い、公知の蛋白質結晶化方法により、種結晶を回収した結晶化区画３２と同様の結晶化条件において、構造解析用の結晶を作製することができる。公知の蛋白質結晶化方法としては、例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法、バッチ法などが挙げられる。
蛋白質結晶化条件のより迅速なスクリーニングを目的として、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ未満とした場合は、求めた最適の結晶化条件において目的蛋白質の結晶化を行い、構造解析用の結晶を得ることができる。このとき、構造解析用の結晶を得る方法としては、公知の方法、例えば蒸気拡散法、ハンギングドロップ法などを用いることができる。
得られた構造解析用の結晶を回収し、回収した結晶を公知の方法でＸ線構造解析に供することにより、対象の蛋白質の立体構造を決定することができる。
【００３３】
この例の蛋白質結晶化装置においては、蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填した後に、プレート２４と蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が積層されることによって、結晶化剤保持部１６と蛋白質含有試料を充填した結晶化区画３２とが対応して重なり合う。このことによって、結晶化剤保持部１６に保持された結晶化剤が、結晶化区画３２内へ移動して蛋白質と反応する。各々の結晶化剤保持部１６が異なる結晶化条件に設定されている場合、対象の蛋白質が結晶化するために適当な結晶化条件に設定された結晶化区画３２内に結晶が析出する。
【００３４】
以上説明したように、この例の蛋白質結晶化装置において、蛋白質含有試料は結晶化区画３２内に保持されて結晶化剤保持部１６により密閉され、また各々の結晶化区画３２が凹部３４によって隔離されているので、蛋白質含有試料の結晶化区画３２間での移動及び／又は蛋白質結晶化剤の結晶化剤保持部１６間での混合を防止することができるとともに、蛋白質含有試料からの溶液の蒸発を抑制し、ｎｌレベルの微少量の蛋白質含有試料をも安定して保持することができる。したがって、高い信頼性をもって蛋白質の結晶化を行うことができ、結晶化条件の好不適を信頼性よく判定することができる。
さらに、凹部３４にシール剤が充填されると、さらに効率よく蛋白質含有試料どうしの混合および近接する結晶化区画３２への侵入を防止することができるとともに、蛋白質含有試料の蒸発を防止することができるので、蛋白質含有試料が微量であっても結晶化条件を良好に制御することができる。
また、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持した支持体２０と、プレート２４とを圧接すると、結晶化区画３２を安定して密閉することができるため、さらに高い信頼性をもって結晶化を行うことができる。
結晶化区画３２の容量を適宜選択することにより、蛋白質結晶化条件のスクリーニングおよび構造解析用の結晶の作製のいずれをも、迅速かつ正確に行うことができる。
さらにサンプル充填補助具を用いると、簡便かつ迅速に、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
本発明の蛋白質結晶化装置は、例えば、医薬分野等における研究、開発において、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングおよび蛋白質の構造解析用結晶の作製のいずれにも、好適に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
（中空繊維配列体の作製）
結晶化剤保持部を支持する構成要素として、中空繊維配列体を作製した。
直径０．３２ｍｍの孔を有し、孔の中心間距離が０．４２ｍｍ多孔版であって、縦横各１０列に合計１００個配列された厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を重ね、これらの多孔版の各孔に、ポリエチレン製中空繊維（三菱レイヨン社製、外径約５００μｍ、内径約３００μｍ、長さ約１００ｃｍ）１００本を通過させた。ついで、中空繊維を張った状態で、中空繊維の一方の端部から１０ｃｍの位置と４０ｃｍの位置の２箇所を固定し、２枚の多孔板の間隔を３０ｃｍとした。
次に２枚の多孔板間の空間の３方を、シリコン製の板状物で囲んだ。開放された一方から、樹脂原料として、ポリウレタン樹脂接着剤からなる樹脂と、樹脂原料の総質量に対し２．５質量％のカーボンブラックとの混合物を、２枚の多孔板の間に流し込んだ。引き続き、室温で１週間静置し、樹脂を硬化させた。その後、多孔板及び多孔板間に設置した板状物を取り除き、中空繊維配列体を得た。
（中空繊維配列体への高分子ゲルの導入固定化）
以下の組成からなる混合溶液を調製した。
アクリルアミド：３．７質量部
メチレンビスアクリルアミド：０．３質量部
２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩：０．１質量部
上記の混合溶液と、上記で得られた中空繊維配列体とをデシケータ中に入れ、各中空繊維の自由端部の内、長い方の端部をこの混合液中に浸漬した状態で、デシケータ内を減圧状態にすることにより、中空繊維の中空部に前記混合液を導入した。ついで、この中空繊維配列体を、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間かけて重合反応を行った。このことにより、アクリルアミドゲルが中空繊維の中空部に固定された中空繊維配列体を得た。
【００３７】
（ゲル充填中空繊維配列体薄片の作製）
上記で得られたアクリルアミドゲル含有中空繊維配列体を、中空繊維の長手方向に直交する方向でミクロトームを用いて約２ｍｍの厚さに切り出すことにより、中空繊維の中空部にゲルが充填された縦横各々１０個、計１００個の中空繊維が規則的に正方に配列された配列体薄片を得た。図２は、上記工程によって得られたゲル含有中空繊維配列体薄片を示す。図２に示すように、中空繊維１２の中空部１４には上記で作製したアクリルアミドゲルが充填されている。
（蛋白質結晶化用マイクロアレイの作製）
上記で作製したゲル含有中空繊維配列体薄片において、中空繊維１２の中空部１４に充填されたアクリルアミドゲルに、下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊの水溶液からなる蛋白質結晶化剤１μｌを各中空部に保持されたゲルに添加することにより、アクリルアミドゲルに蛋白質結晶化剤を保持させ、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を作製した。
Ａ：２．０ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム水溶液
Ｂ：０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム水溶液
Ｃ：１０体積％ ポリエチレングリコール（分子量４００）水溶液
Ｄ：２０体積％ ポリエチレングリコール（分子量４００）水溶液
Ｅ：１０体積％ ポリエチレングリコール（分子量６０００）水溶液
Ｆ：２０体積％ ポリエチレングリコール（分子量６０００）水溶液
Ｇ：２０体積％ ２−メチル−２，４−ペンタンジオール水溶液
Ｈ：２０体積％ ２−メチル−２，４−ペンタンジオール水溶液
Ｉ：０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウム水溶液
Ｊ：１．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウム水溶液
以下、上記Ａ〜Ｊの蛋白質結晶化剤を保持した結晶化剤保持部１６を、それぞれスポットＡ〜Ｊと称する。
【００３８】
［実施例１］蛋白質結晶化条件のスクリーニング
図１に示す蛋白質結晶化装置を用い、リゾチーム（シグマアルドリッチ社製）の結晶化条件のスクリーニングを行った。蛋白質結晶化用マイクロアレイとして上記で作製した蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を用い、支持体２０、プレート２４の材料としてアクリル樹脂を用いた。
（蛋白質含有試料の添加）
図６に示すサンプル充填補助具５４を用いて、結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填した。サンプル充填補助具５４は、上記で得た蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の結晶化剤保持部１６に対応した配列の穿孔５６を有するものを用いた。
結晶化区画３２は、直径：０．７ｍｍ、高さ：０．１５ｍｍの一端が閉じた円筒状であり、結晶化区画３２の容量は１０５ｎｌであった。
蛋白質含有試料として、リゾチーム含有水溶液（８０ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
まず、サンプル充填補助具５４を、図６に示すようにプレート２４上に設置し、その上に、２０μｌオートピペットで蛋白質含有試料１．５〜２μｌを穿孔５６の全ての上に行き渡るように添加した。ついで、サンプル充填補助具５４の上からスパチュラにて、蛋白質含有試料をプレート２４上に押し付けることにより、蛋白質含有試料をプレート２４上の全ての結晶化区画３２に充填した。
【００３９】
（蛋白質結晶化装置の組み立て、蛋白質結晶化条件のスクリーニング）
ついで、結晶化区画３２に蛋白質含有試料の充填されたプレート２４を、反応面１０２を下にして保持し、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層した。結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填されていることを確認した後、プレート２４に穿たれた一方のシール剤注入口４８に、プレート２４の外側面１０４側から、ピペットを用いて、シール剤としてパラフィンオイル（以下、オイルという）を注入した。オイルの注入量は、シール部３０の全域にオイルがいきわたり、他方のシール剤注入口４８からオイルがあふれる直前までとした。
その後、蛋白質結晶化装置を２０℃で３時間静置した。引き続き、光学顕微鏡にて結晶化区画３２内を観察した結果、蛋白質結晶化剤としてポリエチレングリコール水溶液を保持させたスポットＢではリゾチームの結晶は認められず、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を保持させたスポットＡでは、Ｘ線構造解析に最も適した柱状結晶が認められた。
【００４０】
（構造解析用の結晶の作製）
さらに、上記の結果を踏まえて、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を蛋白質結晶化剤として用い、リゾチーム含有試料溶液から、ハンギングドロップ法によってリゾチーム結晶を作製した。このとき、得られたリゾチーム結晶の大きさは０．３×０．３×０．５ｍｍであった。
【００４１】
以上の結果より、リゾチームの結晶化条件のうち、蛋白質結晶化剤の種類および濃度を検討した結果、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液が最適の結晶化条件であることが明らかになり、かつ、明らかになった最適の結晶化条件を用いて、Ｘ線構造解析に適した結晶を得ることができた。
すなわち、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって、微量の蛋白質含有試料にて蛋白質結晶化条件のスクリーニングを実施することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す模式図である。
【図２】本発明に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレイの例を示す。
【図３】本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
【図４】本発明に用いられるプレートの一部の断面図である。
【図５】本発明に用いられるプレートの平面図である。
【図６】本発明におけるプレートおよびサンプル充填補助具の使用状態を示す平面図である。
【図７】本発明に用いられる支持体の平面図である。
【図８】本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す平面図である。
【符号の説明】
【００４３】
１２ 中空繊維
１６ 結晶化剤保持部
１８ 蛋白質結晶化用マイクロアレイ
２０ 支持体
２４ プレート
３２ 結晶化区画
３４ 凹部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の結晶化あるいは結晶化条件のスクリーニングを行うための装置およびその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛋白質の立体構造と蛋白質の機能との関係を明らかにすることにより、それをコードする遺伝子の機能を解明しようとする、構造ゲノム科学と呼ばれる研究が行われている。
蛋白質の立体構造の解析は、通常、解析しようとする蛋白質の結晶化条件をスクリーニングした後、最適な結晶化条件における結晶化を実施し、その後、得られた結晶をＸ線構造解析に供することにより行われている。ここで、蛋白質の結晶化条件をスクリーニングする過程においては、立体構造解析を行うのに十分に良好な結晶を得る条件を決定するまでに、多くの時間と多量の蛋白質試料を費やしており、立体構造解析におけるボトルネックとなっている。
このことに対し、蛋白質の結晶化条件のスクリーニング、あるいは結晶化を迅速に、より微量のサンプルで行うために、種々の蛋白質結晶化装置や結晶化方法、結晶化スクリーニング方法が提案されている。
本発明者らの一部も蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを迅速に、かつ微量のサンプルで経済的に行うことを目的として、結晶化実験を、マイクロアレイ型のチップ上で行うような結晶化装置を提案している（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に記載の発明では、マイクロアレイを使用し、そのマイクロアレイは、貫通孔により形成された各区画内にゲル状物が保持されており、各ゲル状物には、複数の種類および濃度の蛋白質結晶化剤が含まれている。マイクロアレイを蛋白質含有試料と接触させることにより、一度に複数の結晶化条件をスクリーニングすることができる。さらに、微量の蛋白質試料で実施することができ、非常に効率的である。
【特許文献１】ＷＯ０３／０５３９９８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の蛋白質結晶化装置では、マイクロアレイの区画間で、蛋白質含有試料及び／又は結晶化剤の移動、混合（汚染）が起こり、結晶が析出した条件が予め区画内のゲル状物に含まれる結晶化剤の濃度や種類と一致しない虞があった。
また、このような装置では、蛋白質含有試料を手作業で結晶化剤保持部分に供する必要があり、操作が煩雑となる。また、自動的に蛋白質含有試料を供する自動装置は高価である。
本発明は前記課題を解決するためになされたもので、蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる蛋白質結晶化装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の蛋白質結晶化装置は、蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイと、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレートとを有し、前記プレートは、前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画と、該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の蛋白質結晶化装置によれば、蛋白質の結晶化実験あるいは結晶化条件のスクリーニングを、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
この例では、図１に示すように、支持体２０、シリコンゴム製のパッキング２２、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４を備えている。
パッキング２２は蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と同じ形状および面積の中空部２３を有し、支持体２０には、該パッキング２２の外周と同じ形状および大きさのマイクロアレイ支持部２６が設けられている。マイクロアレイ支持部２６には、パッキング２２と同一の形状のマーキング２８が施されている。
パッキング２２は、マーキング２８に位置を合わせてマイクロアレイ支持部２６上に設置されており、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が、マイクロアレイ支持部２６上に、パッキング２２の中空部２３に格納されて設置されている。ここで、プレート２４に設けられた結晶化区画３２と、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８上の結晶化剤保持部１６とを正確に接触させるために、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上面と、支持体２０の上面とは、同じ高さになっていることが好ましい。
【０００７】
図３は、プレート２４の中央部を拡大した断面図である。図４に、支持体２０、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４が組み立てられた状態の一部の断面図を示す。
プレート２４は、図３、４に示すように、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の結晶化剤保持部１６の各々と対応した配列の結晶化区画３２と、該結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有する。なお、各々の結晶化区画３２は、プレート２４において凹部３４に対し凸な部位である結晶化区画支持部３１の先端にそれぞれ支持されている。
このプレート２４は、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層される。すなわち、図４に示すように、結晶化区画３２は、結晶化剤保持部１６によって密封され、結晶化区画支持部３１に支持された結晶化区画３２と、同様に結晶化区画支持部３１に支持された結晶化区画３２との間に、各々凹部３４が位置する。
以下、支持体２０のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持する面をマイクロアレイ支持面１００、プレート２４のうち蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８に接する面を反応面１０２、それと反対側の面を外側面１０４と称する。
なお、プレート２４において、結晶化区画３２の配列された領域の外縁は凹部となるから、プレート２４において凹状となった一定面積の領域が形成される。以下、プレート２４の反応面のうち、結晶化区画３２が配列された凹状の領域を、シール部３０と称する。
【０００８】
この例においては、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が、支持体２０のマイクロアレイ支持部２６上に設置されているが、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、結晶化剤保持部１６が結晶化区画３２に対応して該結晶化区画３２を密封できるように設置されていればよく、支持体２０に接着されていてもよいし、マイクロアレイ支持部２６を凹状に形成し、該マイクロアレイ支持部の底部に接着せずに積層されていてもよい。
【０００９】
支持体２０の材料および形状は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を固定可能なものであれば、特に限定されない。支持体２０の材料としては、光透過性の材料を用いることにより、生成した結晶を結晶化装置のまま迅速・簡便に顕微鏡にて確認でき、結晶の成長過程を経時的に観察できることから好ましい。光透過性の材料としては、例えばアクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス等が挙げられる。
支持体２０には、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の固定位置を決めるためのマーキングが施されている。マーキング方法は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を正確な固定を可能とするものであれば特に限定されず、例えば、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と同様の形状および面積を有する窪み、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の所定の位置に対応する支持体２０上の位置に塗装された点などが挙げられる。
この例では、図７に示すように、支持体２０に、プレート２４と支持体２０とを積層する際に結晶化区画３２と結晶化剤保持部１６とを対応させるプレート位置決め孔４４がさらに設けられている。
【００１０】
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部１６を有する。
結晶化剤保持部１６としては、ゲル等の蛋白質結晶化剤を保持できる多孔質体（以下、保持相とする）に蛋白質結晶化剤を保持させたものを用いることができ、保持相は、図４に示すように結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料が結晶化剤保持部１６に接触した際に、該保持相から結晶化区画３２へ蛋白質結晶化剤が移動するものであればよい。
前記保持相としては、ゲルを用いることが好ましい。ゲルを用いることにより、結晶化剤保持部１６から、結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料への蛋白質結晶化剤の移動が、適度に緩やかな速度に制御され、安定した結晶化を実現できる。
ゲルの材料は特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類または２種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を、例えば水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。その他に、ゲルとして、例えばアガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル、またはこれらを架橋したゲルを用いることができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８に、上記のようなゲルを保持させるには、例えば、ゲルの構成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量体および開始剤を含む液を該容器に注入し、重合させてゲル化させればよい。ゲル化させる方法としては、多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用いる方法であってもよい。また、ゲル材料としてアガロースを用いる場合は、温度降下によってゲル化を行ってもよい。
蛋白質結晶化剤をゲルに保持させる場合、その方法は、特に制限されるものではない。例えば、予め蛋白質結晶化剤と上記の重合性モノマーとを混合して、適当な容器に導入しておき、その後、重合反応を行ってゲルを形成させることにより、蛋白質結晶化剤をゲルに保持させることができる。ここで、蛋白質結晶化剤を多孔性粒子等を含浸させ、その粒子をゲルに包括させることもできる。
【００１１】
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の材料、形状等は、反応用物質が多数個整列配置されており、結晶析出の観察を妨げないものであれば、特に限定されない。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の材料としては、例えば、ガラス、樹脂、金属等が挙げられ、また、これらの材料を組み合わせて作製した複合体を用いてもよい。ただし、蛋白質結晶の析出の有無を容易に確認するために、光透過性の高い材料を用いることが好ましい。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の形状としては、例えば、円形、正方形、長方形などの形状が挙げられる。また、その厚みについては、結晶化の効率の向上や、結晶析出の観察の容易化および迅速化を考慮して任意に選択できるが、例えば０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．２〜２ｍｍとすることができる。
【００１２】
図２に、本発明の蛋白質結晶化装置に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレイの好適な例として、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイを示す。図２に示すように、基板１０に、中空管状体として２本以上の中空繊維１２が区画配列されて固定されており、これらの中空繊維１２は中空部１４を有し、これらの中空部１４に、蛋白質結晶化剤を保持したゲルが充填されて、結晶化剤保持部１６を成している。すなわち、基板１０に、２つ以上の結晶化剤保持部１６が区画配列されて、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８
を構成している。
中空繊維１２は、例えば、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート等のメタクリレート系モノマー、メチルアクリレート、エチルアクリレート等のアクリレート系モノマーの単独重合体もしくはこれらの共重合体、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ノボルネン／エチレン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ガラス等から形成されるものが挙げられる。
中空繊維１２の内壁表面は、無処理の状態で用いてもよいが、必要に応じて、プラズマ処理やγ線、電子線などの放射線処理を施したものであってもよい。さらに、中空繊維１２は、必要に応じて反応性官能基を導入したものであってもよい。
中空繊維１２の外径は、単位面積あたりの結晶化剤保持部１６の数を多くするために、２ｍｍ以下であることが好ましく、０．７ｍｍ以下であることがより好ましい。また、中空繊維１２の内径は、前記外径の範囲内で適宜選択される。
基板１０に、２つ以上の中空繊維１２を区画配列して固定する方法としては、以下の方法を用いることができる。すなわち、まず、中空繊維１２を、所定の間隔をもって平行に配列させる。これらの中空繊維１２を収束した後に接着して、繊維配列体（三次元配列体）となすことができる。得られた三次元配列体を、ミクロトームなどの切片作成用の装置を用いて、繊維軸と交差する方向、好ましくは繊維軸に対して垂直方向に切断することにより、中空繊維配列体断面を有する薄片（図２）からなるマイクロアレイを得ることができる。薄片の厚みは、通常１００〜５０００μｍとして用いることができ、好ましくは２００〜２０００μｍである。
このとき、中空繊維１２を規則的に配列し、樹脂接着剤等で接着することにより、例えば、縦横に中空繊維１２が整然と規則的に配列した中空繊維配列体を得ることができる。中空繊維配列体の形状は特に限定されるものではないが、通常は、繊維を規則的に配列させることにより、正方形、長方形、円形等に形成される。
「規則的に」とは、一定の大きさの枠の中に含まれる繊維の本数が一定となるように順序良く配列させることをいう。例えば、直径１ｍｍの繊維を束にして断面が縦１０ｍｍ、横１０ｍｍの正方形となるように配列させようとする場合は、その正方形の枠内（１ｃｍ２）における１辺に含まれる繊維の数を１０本とし、この１０本の繊維を１列に束ねて１層のシートとした後、このシートが１０層になるように重ねる。その結果、縦に１０本、横に１０本、合計１００本の繊維を配列させることができる。ただし、繊維を規則的に配列させる手法は、上記のようにシートを重層するものに限定されるものではない。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８として、上記のような、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイを用いることによって、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の厚み、結晶化剤保持部１６の体積、保持される蛋白質結晶化剤の種類および濃度等を、良好に制御して、かつ効率よく、蛋白質結晶化装置を製造することができる。
【００１３】
なお、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、外気との接触を防ぐ密閉性のよい容器やシール等で密閉することにより保存されることが好ましい。密閉性のよい容器としては、例えば、気体や水の透過率の小さい高分子材料や、ガラス、金属等が挙げられる。また、このようなマイクロアレイは、低温で保存されることが好ましく、特に長期にわたる保存の場合は凍結保存してもよい。
【００１４】
さらに、各々の結晶化剤保持部１６が、異なる蛋白質結晶化条件に調製されたゲルからなることが好ましく、このことにより、結晶化条件のスクリーニングを行う場合に、スクリーニングを一枚のマイクロアレイ上で迅速に行うことができる。
【００１５】
ここで、蛋白質結晶化条件とは、蛋白質結晶化剤の種類および濃度、蛋白質結晶化剤を保持させる保持相、例えば蛋白質結晶化剤を保持させて固化させた後のゲルのｐＨ、ゲルの組成、架橋度、結晶化剤保持部１６および結晶化区画３２の温度、時間、冷却プロファイル等である。
蛋白質結晶化剤の種類としては、例えば、沈殿剤、ｐＨ緩衝剤、これらの任意の組み合わせ等が挙げられる。
沈殿剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、硫酸アンモニウム等が挙げられる。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、酢酸ナトリウム三水和物、リン酸カリウム、イミダゾール、クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム等が挙げられる。これらを単独で使用してもよいし、任意の組み合わせの２種以上で使用してもよい。さらに、蛋白質結晶化剤としては、市販品として、Ｅｍｅｒａｌｄ ＢｉｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ社製「ＷＩＺＡＲＤ ＩＩ」、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｃｒｅｅｎ」、「Ｇｒｉｄ Ｓｃｒｅｅｎ」等を用いることができる。
蛋白質結晶化剤の濃度としては、用いる蛋白質結晶化剤の種類にもよるが、例えば、ポリエチレングリコールからなる沈殿剤の場合は、５〜５０体積％、好ましくは１０〜３５体積％であり、ｐＨ緩衝剤の場合には、０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌである。
【００１６】
上述のように、各々の結晶化剤保持部１６を、それぞれ異なる蛋白質結晶化条件に調製することにより、対象の蛋白質についての結晶化条件のスクリーニングを迅速に行うことができる。ここで、例えば、蛋白質結晶化剤の濃度を多段階に設定することが好ましく、具体的には、塩化ナトリウムからなる沈殿剤を用いる場合は、０．５〜４．０ｍｏｌ／Ｌの範囲で、５段階、１０段階、２０段階のように希釈列を作製し、それぞれの濃度の蛋白質結晶化剤を、結晶化剤保持部１６に充填することができる。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、１０〜１０００個の結晶化剤保持部１６を有することが、より多数の結晶化条件における結晶化を一括して行うために好ましい。例えば、通常の蛋白質結晶化条件スクリーニングにおいては、８００程度の結晶化条件を検討することが必要であるため、結晶化剤保持部の数が１０以上であることが好ましく、一方、１０００を超える結晶化剤保持部１６を有すると、結晶化剤保持部１６間の間隔が非常に狭くなり、取り扱いの効率に劣る。
蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８は、蛋白質析出の確認を容易に行うために、光透過性の高い材料からなることが好ましい。
【００１７】
この例において、パッキング２２はシリコンゴム製であるが、パッキングの材料は、蛋白質結晶化装置におけるその他の構成要素（例えば、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８、プレート２４、支持体２０）と組み合わせて用いるのに適当なものであれば特に限定されない。
【００１８】
プレート２４は、結晶化剤保持部１６に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画３２と、これらの結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４とを有する。
すなわち、結晶化剤保持部１６と同数の結晶化区画３２が、プレート２４上に設けられている。
プレート２４には、後述のサンプル充填補助具との位置を合わせる位置決め部として、例えば、サンプル充填補助具位置決め孔５０が形成されていることが好ましい。
この例では、支持体２０上に、プレート２４と支持体２０とを積層する際に結晶化区画３２と結晶化剤保持部１６とを対応させるプレート位置決め部材４４がさらに設けられている。プレート２４上に、支持体２０上に設けられたプレート位置決め部材４４と対応するプレート位置決め孔４６が形成されている。
この例では、図１、５に示すように、さらに、プレート２４の外側面１０４から反応面１０２へ貫通するシール剤注入口４８が穿たれている。図５に示すように、この例では、２つのシール剤注入口４８がシール部３０を介して互いに反対側に穿たれている。このことにより、一方のシール剤注入口４８からシール部３０にシール剤を注入した場合に、初めにシール部３０内に存在した空気が他方のシール剤注入口４８から排出されるため、シール部３０において凹部３４の間に位置する結晶化区画３２がより確実に密封される。
プレート２４の材料および形状は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と重ね合わせることができるものであれば特に限定されず、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の形状を考慮して任意のものを用いることができる。プレートの材料としては、ガラス、樹脂、金属などを例示することができ、これらの中から任意のものを選択し、単独で、または２種類以上を組み合わせて用いることができる。なお、結晶化区画３２における蛋白質の結晶化状態を観察するために、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８と重ねた際に各結晶化剤保
持部１６と対応して重なる部分が光透過性をもつことが好ましいことから、プレート２４の材料として、光透過性の材料、例えば透明な樹脂、ガラス等を用いることが好ましい。
【００１９】
プレート２４は、結晶化区画３２に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさらに有することが好ましい。このような結晶回収機構を用いて、結晶化区画３２に析出した結晶を回収して種結晶として用い、引き続いて結晶成長過程を行うことによってＸ線構造解析に耐える結晶を迅速に得ることができる。もちろん、析出した結晶がそのままＸ線構造解析に耐える結晶であれば、それを回収して解析に使用する。
このような結晶回収機構としては、例えば、シール部３０がプレート２４と独立した部材からなり、プレート２４とヒンジ機構で接続され、所望に応じシール部３０を外側面１０４側へ開くことができる機構等が挙げられる。
【００２０】
結晶化区画３２の形状は、蛋白質含有試料を充填可能であり、結晶化剤保持部１６と接触した際に密閉されるものであれば、特に限定されない。
結晶化区画３２の容量は、対象の蛋白質について結晶化条件のスクリーニングを行うことを目的とする場合には、結晶化条件のスクリーニングに要する蛋白質量を低減するために、０．５μｌ未満であることが好ましい。一方、ここで析出した結晶を引き続いてＸ線構造解析に供する、または構造解析に供する結晶を作製するための種結晶として用いることを目的とする場合には、Ｘ線構造解析を行うことのできる０．１ｍｍ以上の大きな結晶を得るために、結晶化区画３２の容量は０．５μｌ以上であることが好ましい。
【００２１】
結晶化剤保持部１６と結晶化区画３２との面積の関係は、結晶化剤保持部１６と結晶化区画３２とが接触する面の面積が、結晶化剤保持部１６に保持された結晶化剤が結晶化区画３２に移動して、該結晶化区画３２に充填された蛋白質含有試料と反応することができる条件であればよく、結晶化剤保持部１６よりも結晶化区画３２の方が大きくてもよい。
ただし、結晶化区画３２は、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を構成する基板１２に接触しないことが好ましい。
【００２２】
この例では、さらに、図４に示すように、結晶化区画３２の間に設けられた凹部３４の全てにシール剤３５が充填される。
シール剤３５としては、蛋白質含有試料と互いに溶解せず、プレート２４、パッキング２２、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を構成する基板１２等の部材を侵食しないものであればよく、例えば、パラフィン系、シリコン系、鉱油系、エステル系、合成油系（フッ素系を含む）、リチウム系、ナトリウム系、カルシウム系、前記複合基系、非石鹸系、モリブデン系等のオイルを用いることができる。
シール剤３５を用いなくても、凹部３４を有することにより、隣接する区画への蛋白質含有試料の侵入を防止することができるが、シール剤３５を用いると、さらに確実に蛋白質含有試料どうしの混合および近接する結晶化区画３２への侵入を防止することができるとともに、蛋白質含有試料の蒸発を防止することができる。
【００２３】
この例では、さらに、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８とプレート２４とを圧接する機構として、図１に示すように支持体２０を貫通する第一のネジ孔４０と、第一のネジ孔４０に対応してプレート２４を貫通する第二のネジ孔４２とが設けられている。これらの第一のネジ孔４０、第二のネジ孔４２に、図１に示すようにネジ４１が螺挿される。このような機構を用いることにより、結晶化区画３２を、より安定して密閉状態に保持することができる。
【００２４】
この例の蛋白質結晶化装置において、結晶化区画３２における蛋白質の結晶化をモニタリングする検出機構をさらに設けることができる。
前記検出機構としては、例えば、プレート２４の外側面１０４に設置された顕微鏡と、顕微鏡に搭載されたＣＣＤカメラからなる検出機構が挙げられる。このような検出機構において、顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラにより結晶の析出の様子を撮影記録し、記録された画像データを処理することによって、結晶化の成否を迅速に判断することができる。し
たがって、迅速に蛋白質結晶化条件を決定することができる。
【００２５】
ここで、この例の蛋白質結晶化装置の好適な使用方法を例示する。
［蛋白質含有試料の充填］
この例では、サンプル充填補助具を用いて、結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填することができる。
（結晶化区画）
本発明を使用する際に、蛋白質の結晶化を目的とする場合は、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ以上とすることが好ましい。蛋白質結晶化条件のより迅速なスクリーニングを目的とする場合は、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ未満とすることが好ましい。
（蛋白質含有試料）
本発明において、蛋白質含有試料とは、結晶化を行おうとする、または結晶化条件を特定しようとする蛋白質（以下、対象の蛋白質と称する）を含む試料である。蛋白質としては、天然又は合成のペプチド、ポリペプチド、蛋白質および蛋白質複合体が挙げられる。これらの物質は、天然もしくは合成材料から抽出・単離、または遺伝子工学的手法もしくは化学合成手法等により生成した後、通常の精製法、例えば溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどを組み合わせて用いることにより、対象の蛋白質を精製しておくことが好ましい。
蛋白質含有試料中の蛋白質濃度および純度も蛋白質結晶化条件の一要因となるため、数段階の濃度および純度の蛋白質含有試料を調製して蛋白質結晶化剤と反応させてもよい。例えば、蛋白質濃度は、１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲内で数段階に変更することが好ましい。また、蛋白質結晶化剤と反応させる蛋白質含有試料の量は、用いる結晶化区画３２の容量および数等に応じて適宜変更しうる。なお、蛋白質含有試料の粘度は、該蛋白質含有試料を保持した結晶化区画３２を下に向けてプレート２４を保持した際に結晶化区画３２から蛋白質含有試料が漏出しなければ特に限定されない。
蛋白質含有試料は、対象の蛋白質のほか、さらに、蛋白質の溶解を助ける蛋白質可溶化剤、還元剤等の安定化剤等を含有してもよい。蛋白質可溶化剤としては、例えば膜蛋白質を溶解させる界面活性剤などが挙げられる。界面活性剤を用いると、蛋白質含有試料において、例えば膜蛋白質などの水溶解性の低い蛋白質を良好に分散させることができ、この例の蛋白質結晶化装置を適用して効率よく蛋白質の結晶化を行うことができる。
【００２６】
まず、図１に示すようなプレート２４を、図５に示すように反応面１０２を上にして静置する。プレート２４に穿たれたサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６に、このサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６と同一径の円柱形のガイドピン５２を１本ずつ挿入して固定する。
ついで、この反応面１０２の上に、図６に示すような、プレート２４上の結晶化区画３２に対応した配列の穿孔５６と、該穿孔５６をプレート２４上で結晶化区画３２に対応させる位置合わせ機構として２つの位置合わせ孔５８とを有する薄板状のサンプル充填補助具５４を設置する。このとき、プレート２４のサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６にそれぞれ固定されたガイドピン５２に、サンプル充填補助具５４に穿たれた位置合わせ孔５８を合わせて差し込み、サンプル充填補助具５４をプレート２４上に設置する。このことにより、プレート２４の結晶化区画３２とサンプル充填補助具５４の穿孔５６が対応するようにサンプル充填補助具５４が設置される。
その後、プレート２４上に設置されたサンプル充填補助具５４の上に、サンプル充填補助具５４のうち穿孔５６の配置された領域全体に行き渡る分量の蛋白質含有試料を載せる。
さらに、スパチュラ等を用いてサンプル充填補助具５４の表面を擦ることにより、穿孔５６に対応した結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填する。
その後、ガイドピン５２をプレート２４の反応面１０２側から外側面１０４側へ押し出し、サンプル充填補助具５４をプレート２４上から取り除く。このことにより、全ての結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填される。
【００２７】
上記説明したように、サンプル充填補助具５４をプレート２４の反応面１０２上に設置し、その上から蛋白質含有試料を添加することによって、蛋白質含有試料を正確に結晶化区画３２に充填することができる。
なお、サンプル充填補助具５４は、成形の容易さ、強度、耐塩性などの観点から、ステンレス製であることが好ましい。また、サンプル充填補助具５４には、蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填した後にサンプル充填補助具５４を容易に取り外せるように、ピンセット等により取り扱う部位が設けられていることが好ましく、例えば一端が上側に折り曲げられて折曲部５９が設けられていることが好ましい。
ここでは、ガイドピン５２をサンプル充填補助具位置決め孔５０およびプレート位置決め孔４６にそれぞれ固定したが、プレート２４において、サンプル充填補助具位置決め孔５０が、プレート位置決め孔４６と独立して複数形成されていてもよい。
【００２８】
蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填する方法としては、蛋白質含有試料を全ての結晶化区画３２に同一の分量で充填することができ、結晶化区画３２以外の構成要素への付着を抑えられる方法であればよく、例えば、サンプル充填補助具５４を用いずに、ピペッター等を用いて結晶化区画３２の各々に蛋白質含有試料を充填することができ、また、サンプル添加用の自動機器を用いることができる。
ただし、蛋白質含有試料の充填を迅速かつ経済的に行うためには、上記のサンプル充填補助具５４を用いる方法が好ましい。
なお、蛋白質含有試料の充填においてピペッターを用いる場合、ピペッターに吸引して保持させた蛋白質含有試料を吐出する機構を用いずに、ピペッターの先端部に付着した微量の液滴を結晶化区画３２付近に接触させることが好ましい。
【００２９】
［蛋白質結晶化装置の組み立て］
図１に示すように、支持体２０上のマーキング２８に合わせて、パッキング２２を設置し、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を、該パッキング２２の中空部２３に格納されるように支持体２０上に設置する。
蛋白質含有試料が結晶化区画３２に充填されたプレート２４を、反応面１０２を下にして保持し、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層する。このとき、支持体２０上に設けられたプレート位置決め部材４４が、プレート２４に穿たれたプレート位置決め孔４６を貫通するようにする。
実験操作上、結晶化区画３２に保持されているゲルが乾燥した場合は、そのままプレート２４を積層すると結晶化区画３２内に気泡が混在する場合がある。気泡を混在させないために、予め結晶化区画３２に蛋白質試料を供し、ゲルが十分、膨潤した後、プレート２４を積層することも可能である。また、超音波式の加湿器により発生した霧を、該マイクロアレイの結晶化区画に接触させ、ゲルを膨潤させても良い。
なお、この例では支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に、プレート２４が反応面１０２を下にして積層されるが、結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填されたプレート２４を、反応面１０２を上にして静置し、該プレート２４の上に、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持した支持体２０を、マイクロアレイ支持面１００を下にして積層してもよい。プレート２４の外側面１０４を上にして設置されていると、シール剤注入口４８からのシール剤の注入、あるいは結晶化区画３２に析出した結晶の観察を行いやすいため好ましい。
【００３０】
プレート２４を支持体２０に押し付けて保持し、保持したまま第一のネジ孔４０、第二のネジ孔４２にネジ４１を螺挿して、プレート２４と、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８とを圧接する。圧接は、支持体２０が結晶化区画３２に接触した後、数分間をかけて完了することが好ましい。そのような圧着方法によれば、結晶化区画３２に保持されたゲルを蛋白質試料で十分に膨潤させることができる。その後、顕微鏡を用いて、蛋白質含有試料の充填状態を確認する。
蛋白質含有試料が各々の結晶化区画３２に充填されていることを確認した後、図５、８に示すようにプレート２４に穿たれたシール剤注入口４８から、ピペット等を用いてシール剤をシール部３０および凹部３４に充填する。このことにより、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８のうち結晶化剤保持部１６以外の位置に漏出した蛋白質含有試料を、シール剤で置き換えることができ、蛋白質含有試料が隣接する結晶化区画３２間で移動することによるコンタミネーションおよび条件変化をさらに確実に防止するとともに、蛋白質含有試料が蒸発することを防止することができる。なお、シール剤の注入量は、シール部３０の全域において凹部３４にシール剤が行き渡り、かつ、図５、８に示すような一方のシール剤注入口４８からシール剤を注入した際に、他方のシール剤注入口４８からシール剤が漏出しない最大量であることが好ましい。
【００３１】
［蛋白質の結晶化条件のスクリーニング］
組み立てられた蛋白質結晶化装置を用いて、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを行い、目的蛋白質における最適な結晶化条件を求めることができる。また、析出した結晶を用いて構造解析に適した結晶を作製することもできる。
蛋白質結晶化装置において蛋白質結晶化剤と蛋白質含有試料とを反応させた後、蛋白質結晶化装置を、蛋白質が析出するのに十分な時間にわたって、ある温度条件下にて、密閉状態または大気中に静置する。
蛋白質が析出するのに十分な時間とは、特定の蛋白質、濃度、結晶化条件などにより異なるが、約１時間〜１０日であり、およそ３０日以上経過しても結晶が析出しない場合には、その結晶化条件は適切ではないものとみなす。また、温度条件は、蛋白質結晶化条件の一要因であるため、温度条件を変更して結晶化を行ってもよい。温度条件は、例えば、４℃、１５℃、１８℃、２２℃等のように、複数の段階に設定することが好ましい。
蛋白質が析出するのに十分な時間が経過した後、蛋白質の結晶析出の状況を観察する。このとき、プレート２４の外側面１０４側から、例えば光学顕微鏡等にて観察することが好ましい。
このようにして、対象の蛋白質について最適な結晶化条件を決定することができる。
【００３２】
［構造解析用の結晶の作製］
蛋白質の結晶化を目的として、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ以上とした場合は、全ての結晶化区画３２のうち、結晶の析出した結晶化区画３２において、引き続いて結晶を成長させる、あるいは析出した結晶を結晶化区画３２から回収して種結晶として用い、公知の蛋白質結晶化方法により、種結晶を回収した結晶化区画３２と同様の結晶化条件において、構造解析用の結晶を作製することができる。公知の蛋白質結晶化方法としては、例えば、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、透析法、バッチ法などが挙げられる。
蛋白質結晶化条件のより迅速なスクリーニングを目的として、結晶化区画３２の容量を０．５μｌ未満とした場合は、求めた最適の結晶化条件において目的蛋白質の結晶化を行い、構造解析用の結晶を得ることができる。このとき、構造解析用の結晶を得る方法としては、公知の方法、例えば蒸気拡散法、ハンギングドロップ法などを用いることができる。
得られた構造解析用の結晶を回収し、回収した結晶を公知の方法でＸ線構造解析に供することにより、対象の蛋白質の立体構造を決定することができる。
【００３３】
この例の蛋白質結晶化装置においては、蛋白質含有試料を結晶化区画３２に充填した後に、プレート２４と蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８が積層されることによって、結晶化剤保持部１６と蛋白質含有試料を充填した結晶化区画３２とが対応して重なり合う。このことによって、結晶化剤保持部１６に保持された結晶化剤が、結晶化区画３２内へ移動して蛋白質と反応する。各々の結晶化剤保持部１６が異なる結晶化条件に設定されている場合、対象の蛋白質が結晶化するために適当な結晶化条件に設定された結晶化区画３２内に結晶が析出する。
【００３４】
以上説明したように、この例の蛋白質結晶化装置において、蛋白質含有試料は結晶化区画３２内に保持されて結晶化剤保持部１６により密閉され、また各々の結晶化区画３２が凹部３４によって隔離されているので、蛋白質含有試料の結晶化区画３２間での移動及び／又は蛋白質結晶化剤の結晶化剤保持部１６間での混合を防止することができるとともに、蛋白質含有試料からの溶液の蒸発を抑制し、ｎｌレベルの微少量の蛋白質含有試料をも安定して保持することができる。したがって、高い信頼性をもって蛋白質の結晶化を行うことができ、結晶化条件の好不適を信頼性よく判定することができる。
さらに、凹部３４にシール剤が充填されると、さらに効率よく蛋白質含有試料どうしの混合および近接する結晶化区画３２への侵入を防止することができるとともに、蛋白質含有試料の蒸発を防止することができるので、蛋白質含有試料が微量であっても結晶化条件を良好に制御することができる。
また、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を支持した支持体２０と、プレート２４とを圧接すると、結晶化区画３２を安定して密閉することができるため、さらに高い信頼性をもって結晶化を行うことができる。
結晶化区画３２の容量を適宜選択することにより、蛋白質結晶化条件のスクリーニングおよび構造解析用の結晶の作製のいずれをも、迅速かつ正確に行うことができる。
さらにサンプル充填補助具を用いると、簡便かつ迅速に、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
本発明の蛋白質結晶化装置は、例えば、医薬分野等における研究、開発において、蛋白質の結晶化条件のスクリーニングおよび蛋白質の構造解析用結晶の作製のいずれにも、好適に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
（中空繊維配列体の作製）
結晶化剤保持部を支持する構成要素として、中空繊維配列体を作製した。
直径０．３２ｍｍの孔を有し、孔の中心間距離が０．４２ｍｍ多孔版であって、縦横各１０列に合計１００個配列された厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を重ね、これらの多孔版の各孔に、ポリエチレン製中空繊維（三菱レイヨン社製、外径約５００μｍ、内径約３００μｍ、長さ約１００ｃｍ）１００本を通過させた。ついで、中空繊維を張った状態で、中空繊維の一方の端部から１０ｃｍの位置と４０ｃｍの位置の２箇所を固定し、２枚の多孔板の間隔を３０ｃｍとした。
次に２枚の多孔板間の空間の３方を、シリコン製の板状物で囲んだ。開放された一方から、樹脂原料として、ポリウレタン樹脂接着剤からなる樹脂と、樹脂原料の総質量に対し２．５質量％のカーボンブラックとの混合物を、２枚の多孔板の間に流し込んだ。引き続き、室温で１週間静置し、樹脂を硬化させた。その後、多孔板及び多孔板間に設置した板状物を取り除き、中空繊維配列体を得た。
（中空繊維配列体への高分子ゲルの導入固定化）
以下の組成からなる混合溶液を調製した。
アクリルアミド：３．７質量部
メチレンビスアクリルアミド：０．３質量部
２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩：０．１質量部
上記の混合溶液と、上記で得られた中空繊維配列体とをデシケータ中に入れ、各中空繊維の自由端部の内、長い方の端部をこの混合液中に浸漬した状態で、デシケータ内を減圧状態にすることにより、中空繊維の中空部に前記混合液を導入した。ついで、この中空繊維配列体を、内部が水蒸気で飽和された密閉ガラス容器に移し、８０℃で４時間かけて重合反応を行った。このことにより、アクリルアミドゲルが中空繊維の中空部に固定された中空繊維配列体を得た。
【００３７】
（ゲル充填中空繊維配列体薄片の作製）
上記で得られたアクリルアミドゲル含有中空繊維配列体を、中空繊維の長手方向に直交する方向でミクロトームを用いて約２ｍｍの厚さに切り出すことにより、中空繊維の中空部にゲルが充填された縦横各々１０個、計１００個の中空繊維が規則的に正方に配列された配列体薄片を得た。図２は、上記工程によって得られたゲル含有中空繊維配列体薄片を示す。図２に示すように、中空繊維１２の中空部１４には上記で作製したアクリルアミドゲルが充填されている。
（蛋白質結晶化用マイクロアレイの作製）
上記で作製したゲル含有中空繊維配列体薄片において、中空繊維１２の中空部１４に充填されたアクリルアミドゲルに、下記のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊの水溶液からなる蛋白質結晶化剤１μｌを各中空部に保持されたゲルに添加することにより、アクリルアミドゲルに蛋白質結晶化剤を保持させ、蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を作製した。
Ａ：２．０ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム水溶液
Ｂ：０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム水溶液
Ｃ：１０体積％ ポリエチレングリコール（分子量４００）水溶液
Ｄ：２０体積％ ポリエチレングリコール（分子量４００）水溶液
Ｅ：１０体積％ ポリエチレングリコール（分子量６０００）水溶液
Ｆ：２０体積％ ポリエチレングリコール（分子量６０００）水溶液
Ｇ：２０体積％ ２−メチル−２，４−ペンタンジオール水溶液
Ｈ：２０体積％ ２−メチル−２，４−ペンタンジオール水溶液
Ｉ：０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウム水溶液
Ｊ：１．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸アンモニウム水溶液
以下、上記Ａ〜Ｊの蛋白質結晶化剤を保持した結晶化剤保持部１６を、それぞれスポットＡ〜Ｊと称する。
【００３８】
［実施例１］蛋白質結晶化条件のスクリーニング
図１に示す蛋白質結晶化装置を用い、リゾチーム（シグマアルドリッチ社製）の結晶化条件のスクリーニングを行った。蛋白質結晶化用マイクロアレイとして上記で作製した蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８を用い、支持体２０、プレート２４の材料としてアクリル樹脂を用いた。
（蛋白質含有試料の添加）
図６に示すサンプル充填補助具５４を用いて、結晶化区画３２に蛋白質含有試料を充填した。サンプル充填補助具５４は、上記で得た蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の結晶化剤保持部１６に対応した配列の穿孔５６を有するものを用いた。
結晶化区画３２は、直径：０．７ｍｍ、高さ：０．１５ｍｍの一端が閉じた円筒状であり、結晶化区画３２の容量は１０５ｎｌであった。
蛋白質含有試料として、リゾチーム含有水溶液（８０ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
まず、サンプル充填補助具５４を、図６に示すようにプレート２４上に設置し、その上に、２０μｌオートピペットで蛋白質含有試料１．５〜２μｌを穿孔５６の全ての上に行き渡るように添加した。ついで、サンプル充填補助具５４の上からスパチュラにて、蛋白質含有試料をプレート２４上に押し付けることにより、蛋白質含有試料をプレート２４上の全ての結晶化区画３２に充填した。
【００３９】
（蛋白質結晶化装置の組み立て、蛋白質結晶化条件のスクリーニング）
ついで、結晶化区画３２に蛋白質含有試料の充填されたプレート２４を、反応面１０２を下にして保持し、支持体２０に支持された蛋白質結晶化用マイクロアレイ１８の上に積層した。結晶化区画３２に蛋白質含有試料が充填されていることを確認した後、プレート２４に穿たれた一方のシール剤注入口４８に、プレート２４の外側面１０４側から、ピペットを用いて、シール剤としてパラフィンオイル（以下、オイルという）を注入した。オイルの注入量は、シール部３０の全域にオイルがいきわたり、他方のシール剤注入口４８からオイルがあふれる直前までとした。
その後、蛋白質結晶化装置を２０℃で３時間静置した。引き続き、光学顕微鏡にて結晶化区画３２内を観察した結果、蛋白質結晶化剤としてポリエチレングリコール水溶液を保持させたスポットＢではリゾチームの結晶は認められず、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を保持させたスポットＡでは、Ｘ線構造解析に最も適した柱状結晶が認められた。
【００４０】
（構造解析用の結晶の作製）
さらに、上記の結果を踏まえて、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を蛋白質結晶化剤として用い、リゾチーム含有試料溶液から、ハンギングドロップ法によってリゾチーム結晶を作製した。このとき、得られたリゾチーム結晶の大きさは０．３×０．３×０．５ｍｍであった。
【００４１】
以上の結果より、リゾチームの結晶化条件のうち、蛋白質結晶化剤の種類および濃度を検討した結果、２．０ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液が最適の結晶化条件であることが明らかになり、かつ、明らかになった最適の結晶化条件を用いて、Ｘ線構造解析に適した結晶を得ることができた。
すなわち、迅速かつ経済的に、高い信頼性をもって、微量の蛋白質含有試料にて蛋白質結晶化条件のスクリーニングを実施することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す模式図である。
【図２】本発明に用いられる蛋白質結晶化用マイクロアレイの例を示す。
【図３】本発明の蛋白質結晶化装置の一例を示す模式図である。
【図４】本発明に用いられるプレートの一部の断面図である。
【図５】本発明に用いられるプレートの平面図である。
【図６】本発明におけるプレートおよびサンプル充填補助具の使用状態を示す平面図である。
【図７】本発明に用いられる支持体の平面図である。
【図８】本発明の蛋白質結晶化装置の使用状態を示す平面図である。
【符号の説明】
【００４３】
１２ 中空繊維
１６ 結晶化剤保持部
１８ 蛋白質結晶化用マイクロアレイ
２０ 支持体
２４ プレート
３２ 結晶化区画
３４ 凹部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイと、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレートとを有し、前記プレートは、前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画と、該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴とする蛋白質結晶化装置。
【請求項２】
前記結晶化剤保持部は、各々異なる蛋白質結晶化条件に調製されたゲルからなることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項３】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項４】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと前記プレートとを圧接する機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項５】
前記凹部にシール剤が充填されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項６】
前記結晶化区画は、容量が０．５μｌ未満であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項７】
前記結晶化区画は、容量が０．５μｌ以上であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項８】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、１０〜１０００個の結晶化剤保持部を有することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項９】
前記プレートは、前記結晶化区画に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項１０】
前記結晶化区画における蛋白質の結晶化をモニタリングする検出機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置の前記結晶化区画に蛋白質含有試料を充填するためのサンプル充填補助具であって、
前記結晶化区画に対応した配列の穿孔と、該穿孔を前記プレート上で前記結晶化区画に対応させる位置合わせ機構とを有することを特徴とするサンプル充填補助具。
【請求項１２】
請求項１１に記載のサンプル充填補助具との位置を合わせる位置決め部が前記プレートに形成されていることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の蛋白質結晶化
装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置と、請求項１１に記載のサンプル充填補助具とを用いる蛋白質結晶化条件スクリーニング法であって、
請求項１１に記載のサンプル充填補助具を、該サンプル充填補助具の前記穿孔が前記結晶化区画に対応するように前記プレート上に設置し、
蛋白質含有試料を該サンプル充填補助具の上から前記穿孔に添加して前記結晶化区画に充填した後、前記サンプル充填補助具を取り外し、
前記結晶化区画と、前記結晶化剤保持部とを対応させて接触させるように、前記プレートと前記蛋白質結晶化用マイクロアレイとを積層すること、
を特徴とする蛋白質結晶化条件スクリーニング法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置と、請求項１１に記載のサンプル充填補助具とを用いる蛋白質結晶化条件スクリーニング法であって、
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置の各結晶化区画に蛋白質含有試料を添加し、
請求項１１に記載のサンプル充填補助具を、該サンプル充填補助具の前記穿孔が前記結晶化区画に対応するように前記プレート上に設置し、
蛋白質含有試料を該サンプル充填補助具の上から前記穿孔に添加して前記結晶化区画に充填した後、
前記サンプル充填補助具を取り外し、
前記結晶化区画と、前記結晶化剤保持部とを対応させて接触させるように、前記プレートと前記蛋白質結晶化用マイクロアレイとを積層すること、
を特徴とする蛋白質結晶化条件スクリーニング法。
【請求項１】
蛋白質結晶化剤を保持した２以上の結晶化剤保持部を有する蛋白質結晶化用マイクロアレイと、前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと積層されるプレートとを有し、前記プレートは、前記結晶化剤保持部に対応し蛋白質含有試料を充填可能な結晶化区画と、該結晶化区画の間に設けられた凹部とを有することを特徴とする蛋白質結晶化装置。
【請求項２】
前記結晶化剤保持部は、各々異なる蛋白質結晶化条件に調製されたゲルからなることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項３】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、複数の中空管状体を配列してなるマイクロアレイであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項４】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイと前記プレートとを圧接する機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項５】
前記凹部にシール剤が充填されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項６】
前記結晶化区画は、容量が０．５μｌ未満であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項７】
前記結晶化区画は、容量が０．５μｌ以上であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項８】
前記蛋白質結晶化用マイクロアレイは、１０〜１０００個の結晶化剤保持部を有することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項９】
前記プレートは、前記結晶化区画に析出した結晶を回収する結晶回収機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項１０】
前記結晶化区画における蛋白質の結晶化をモニタリングする検出機構をさらに有することを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の蛋白質結晶化装置の前記結晶化区画に蛋白質含有試料を充填するためのサンプル充填補助具であって、
前記結晶化区画に対応した配列の穿孔と、該穿孔を前記プレート上で前記結晶化区画に対応させる位置合わせ機構とを有することを特徴とするサンプル充填補助具。
【請求項１２】
請求項１１に記載のサンプル充填補助具との位置を合わせる位置決め部が前記プレートに形成されていることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の蛋白質結晶化
装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置と、請求項１１に記載のサンプル充填補助具とを用いる蛋白質結晶化条件スクリーニング法であって、
請求項１１に記載のサンプル充填補助具を、該サンプル充填補助具の前記穿孔が前記結晶化区画に対応するように前記プレート上に設置し、
蛋白質含有試料を該サンプル充填補助具の上から前記穿孔に添加して前記結晶化区画に充填した後、前記サンプル充填補助具を取り外し、
前記結晶化区画と、前記結晶化剤保持部とを対応させて接触させるように、前記プレートと前記蛋白質結晶化用マイクロアレイとを積層すること、
を特徴とする蛋白質結晶化条件スクリーニング法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置と、請求項１１に記載のサンプル充填補助具とを用いる蛋白質結晶化条件スクリーニング法であって、
請求項１２に記載の蛋白質結晶化装置の各結晶化区画に蛋白質含有試料を添加し、
請求項１１に記載のサンプル充填補助具を、該サンプル充填補助具の前記穿孔が前記結晶化区画に対応するように前記プレート上に設置し、
蛋白質含有試料を該サンプル充填補助具の上から前記穿孔に添加して前記結晶化区画に充填した後、
前記サンプル充填補助具を取り外し、
前記結晶化区画と、前記結晶化剤保持部とを対応させて接触させるように、前記プレートと前記蛋白質結晶化用マイクロアレイとを積層すること、
を特徴とする蛋白質結晶化条件スクリーニング法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１２４２３８（Ｐ２００６−１２４２３８Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１５５８０（Ｐ２００４−３１５５８０）
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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