蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法、蛍光性タンパク質を用いる方法、及びタンパク質複合体
【課題】蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる新規な方法を提供すること。
【解決手段】発光性タンパク質Xβからの所定波長βの発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させる方法を提供する。この方法を用いることでモニタリングが容易で、かつ生体等への侵襲が少ない、物質間相互作用検出、タンパク質挙動追跡、生体マーキング、及び薬剤スクリーニングが可能である。
【解決手段】発光性タンパク質Xβからの所定波長βの発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させる方法を提供する。この方法を用いることでモニタリングが容易で、かつ生体等への侵襲が少ない、物質間相互作用検出、タンパク質挙動追跡、生体マーキング、及び薬剤スクリーニングが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法に関する。より詳しくは、蛍光性タンパク質Yを、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法、蛍光性タンパク質を用いる方法、及びタンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、光を発することができるタンパク質を使って所定の物質をラベルし、可視化することが広く一般に行われている。特に、生体内の特定部分をマーキングしたり、情報伝達物質などの検出や定量、及びその動態等を調べたりする場合において、生体への侵襲が少ないことから、該タンパク質の利用が注目を集めている。更に、特定の遺伝子の検出、薬剤等の特定物質のスクリーニングにおいても、該タンパク質が利用され始めている。
【0003】
例えば、特許文献1では、蛍光蛋白質を細胞内に導入することにより、細胞分裂を視覚化できる細胞分裂可視化細胞及びその作成方法、それを用いた細胞分裂の可視化方法、遺伝子や薬剤の細胞分裂への影響の評価方法、細胞分裂へ影響する遺伝子や薬剤のスクリーニング方法が開示されている。
【0004】
また、蛍光物質間の蛍光共鳴エネルギー転移を用いて2種の物質の相互作用を検出する、いわゆるFRET法も多く利用されている。例えば、特許文献2では、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)に基づいた蛍光指示薬、及び分子間相互作用の可視化システムが開示されている。
【0005】
上記の方法等に用いられる、光を発することのできるタンパク質には、ルシフェリンがルシフェラーゼの作用で酸化分解されることにより発光するものと、発光たんぱく質によるもの、外部からの照射により光を発する蛍光性タンパク質などがある。例えば、ホタルやミミズなどは、発光基質であるルシフェリンが酵素であるルシフェラーゼによって酸化されて発光する。一方、クラゲなどは、酵素−基質複合体に似た発光タンパク質イクオリンがカルシウムイオンと結合すると、酸化剤がなくても発光タンパク質内部で酸化的反応が起こることにより発光する。
【0006】
発光タンパク質は自ら発光することができるので、その遺伝子を細胞に導入するだけで細胞をラベルすることができる。しかし、任意の時期に任意の細胞のみをラベルすることは困難である。蛍光性タンパクは自ら発光することができないが、特定波長の光照射により、それぞれ決められた光を発することができる。さらに、特定の波長の光によって、構造変化を伴って別の蛍光波長を発することができたり構造変化を伴って蛍光を発することを可能にしたりする特性を持った蛍光性タンパク質が開発されている。
【0007】
例えば、特許文献3では、紫外線の照射により緑色から赤色に変化(フォトコンバージョン)するヒユサンゴ(Trachyphyllia geoffroyi)由来の蛍光蛋白質、及び紫外線の照射により緑色から赤色に変化(フォトコンバージョン)するアザミハナダカサンゴ(Scolymia Vitiensis)由来の蛍光性タンパク質が開示されている。これらの蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルしておくことにより、任意の時期に任意の細胞にのみ紫外線を照射すれば、その細胞の色のみが変化(フォトコンバージョン)するため、任意の時期に任意の細胞のみマーキングすることができる。
【0008】
また、特許文献4では、波長518nm付近の光を照射すると蛍光が消え、380nm付近の光を照射すると蛍光が回復するフォトクロミズム現象を示すキッカサンゴ(Echinophyllia sp)由来の蛍光性タンパク質も開発されている。この様な蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルすれば、異なる波長の光を照射することによりラベルと脱ラベルを自在に制御することができる。
【特許文献1】特開2004−187530号公報。
【特許文献2】特開2004−187544号公報。
【特許文献3】WO2004/018671号パンフレット
【特許文献4】WO2005/113772号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
蛍光の変化を検出することにより物質間の相互作用を検出できるFRET法では、蛍光共鳴エネルギー転移が起きる距離に両物質が近づいたときにのみ、蛍光の変化が起こる。即ち、蛍光の変化をリアルタイムに取得する必要があるため、蛍光変化がどのタイミングで起こるか不明な場合など、長時間、モニタリングし続ける必要がある。
【0010】
一方、フォトコンバージョンやフォトクロミズムなどを行う蛍光性タンパク質は、その構造を変化させることで別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行すれば、その構造が変化しない限り、いつでも、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に前記構造変化が起こっているかを検出することができる。
【0011】
しかし、フォトコンバージョンやフォトクロミズムを行うには、特定波長の外部からの光照射が必要である。従って、生体内の深奥部の細胞をマーキング等する場合、光照射用ファイバーを外科的に誘導する必要があり、生体への外科的侵襲による悪影響が考えられる。また、波長の長短によっては、細胞毒性を示す場合があり、生体への光侵襲による悪影響が考えられる。
【0012】
そこで、本発明は、モニタリングが容易で、かつ生体への侵襲が少ない、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本願発明者は、蛍光性タンパク質を、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させる方法について鋭意研究した結果、光照射を行わなくても、蛍光性タンパク質を前記の構造へ変化させることができる新規方法を見出した。
【0014】
本発明ではまず、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Yを、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。本来、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質Yは、光照射を行わなければ、前記構造に変化しないが、本願発明者は発想を大きく変換し、別の発光性タンパク質Xの発光により、その発光エネルギーを蛍光性タンパク質Yへ転移させることで、蛍光タンパク質Yを、前記構造に変化させることに成功した。
【0015】
本発明に係る方法では、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させるために、蛍光性タンパク質Yの構造を変化させ得る所定波長の発光特性を有する発光性タンパク質Xを選択する。このとき、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体により、所定波長の発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Xを選択することもできる。
【0016】
前記発光基質、及び発光基質誘導体は、発光性タンパク質Xの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine)、セレンテラジン(Coelenterazine)誘導体などが挙げられる。セレンテラジン(Coelenterazine)の化学式を化学式1に、セレンテラジン(Coelenterazine)誘導体の化学式を化学式2に示す。
【化1】
【化2】
【0017】
また、本発明では、上記の方法を応用して、発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体に、発光基質又は発光基質誘導体を作用させることで、タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。
【0018】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Xは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Renillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。
【0019】
また、本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、フォトクロミズム特性を有するDronpa(配列番号5)などが挙げられる。
【0020】
本発明では次に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した以下の方法を提供する。
【0021】
第1に、前記方法を利用した物質間の相互作用を検出する方法を提供する。例えば、発光性タンパク質Xによってラベルした物質Aと、蛍光性タンパク質Yによってラベルした物質Bとが相互作用すると、前記発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近する。そして、前記発光性タンパク質Xからの発光エネルギーの転移により、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。この構造変化を確認することで、物質Aと物質Bとの相互作用を検出することができる。
【0022】
前記の相互作用は、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することにより、物質Aと物質Bが相互作用するものであってもよい。物質Aと物質Bがそのままの状態では相互作用しない場合は、両物質をラベルしている発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近しないため、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化することはない。しかし、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することにより、物質Aと物質Bが相互作用する場合は、物質Cを作用させた時点で、物質Aと物質Bが相互作用し、発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yは接近する。そして、発光性タンパク質Xの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Yへ転移するため、蛍光性タンパク質Yは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。
【0023】
このとき、物質Cは、物質Aに相互作用するものであっても、物質Bに相互作用するものであっても、更には、物質A、Bの両方に相互作用するものであってもよい。このようにして、蛍光性タンパク質Yの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかを確認をすることで、物質Aと物質Bの相互作用の検出に加え、物質Aと物質C、物質Bと物質C、又は物質A、Bと物質Cの相互作用の検出することも可能である。
【0024】
本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に相互作用履歴を検出することができる。
【0025】
例えば、前記物質Aと前記物質Bとが、所定時間内に一旦結合し、その後分離するような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後に前記物質A若しくは前記物質Bをラベルした蛍光性タンパク質Yの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかの有無を確認すれば、相互作用履歴を検出することができる。
【0026】
第2に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用したタンパク質挙動追跡方法を提供する。本方法では、まず、前記物質Aと前記物質Bとの相互作用又は前記物質Aあるいは前記物質Bに他の物質Cが相互作用することにより作動した前記物質Aと前記物質Bとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる。そして、該構造変化後の蛍光性タンパク質Yを追跡することにより、物質Bの挙動を追跡することができる。
【0027】
第3に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した、生体マーキング方法を提供する。本方法では、まず、前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Xの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。すると、発光性タンパク質Xが所定波長の発光特性へ改変されるため、複合体を構成する蛍光性タンパク質Yへ発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。このようにして、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【0028】
第4に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した薬剤スクリーニング方法を提供する。本方法では、まず、前記生体マーキング方法と同様に、前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Xの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。
【0029】
このとき、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質が正常に機能すると、前記発光基質の導入も阻害されてしまう。そのため、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Yの前記構造変化は起こらない。しかし、前記タンパク質を対象とする機能阻害剤を生体内へ投与すれば、前記発光基質又は発光基質誘導体の生体内への導入は阻害されず、前記発光基質又は発光基質誘導体は生体内の発光性タンパク質Xに作用する。
【0030】
その結果、発光性タンパク質Xは、所定波長の発光特性を示すようになり、蛍光性タンパク質Yへ所定波長の発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Yは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。そして、蛍光性タンパク質Yの前記構造変化が起こっているかを観察又は検出することによって、前記機能阻害剤をスクリーニングすることができる。
【0031】
本発明では更に、発光性タンパク質Xと、該発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Yとから構成されたタンパク質複合体を提供する。このタンパク質複合体は、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに用いることができる。
【0032】
タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Renillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。
【0033】
タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)KikGR(配列番号4)、フォトクロミズム特性を有するDronpa(配列番号5)などが挙げられる。
【0034】
また、本発明では、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を提供する。これらは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などの際、前記タンパク質複合体を、生体内の所定の細胞又は組織へ発現又は存在させる場合に用いることができる。
【0035】
加えて、本発明では、本発明に係る方法に用いることができる以下のキットを提供する。
【0036】
まず、Renillaルシフェラーゼをコードする塩基配列(配列番号6)を有するベクターと、Kaede(配列番号7)、Kaedeの変異体(配列番号8)、KikGR(配列番号9)、Dronpa(配列番号10)の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記相互作用検出や前記タンパク質挙動追跡などに利用することができる。
【0037】
また、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター又は該組み換えベクターを導入した細胞と、Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに利用することができる。
【0038】
ここで、本発明における技術用語を定義する。「発光性タンパク質」とは、自ら発光するタンパク質、及び何らかの作用により発光するタンパク質の両方を含む。例えば、自ら発光する発光タンパク質、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づき発光するタンパク質、を含む。「蛍光性タンパク質」とは特定波長の光照射により、蛍光特性を変化させるもの、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こすタンパク質を含む。
【0039】
「別の蛍光波長を発することができる構造変化」とは、タンパク質がフォトコンバージョンなどにより、色を変化させることを意味する。「蛍光を発することが可能な構造変化」とは、タンパク質がフォトクロミズムなどにより、光を発することが可能な状態を意味する。「フォトコンバージョン」とは、特定の波長に光照射によって、蛍光色が変化する蛍光性タンパク質の特性を意味する。「フォトクロミズム」とは、異なる2つの波長の光照射によって、蛍光と退色を行う蛍光性タンパク質の特性を意味する。
【発明の効果】
【0040】
本発明では、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質を、光照射を行わないで、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることが可能である。従って、例えば本発明の方法により生体内物質をラベル等する場合、生体への外科的侵襲及び光侵襲による悪影響がない。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。加えて、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、該構造変化に伴う蛍光のモニタリングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0041】
以下、本発明の概念について図面を参照しながら説明する。各概念において一実施形態を挙げるが、この実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明が限定されることはない。なお、以下の実施形態の説明においては、本発明に係る方法等に使用する蛍光性タンパク質Yについて、便宜上、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質を例に挙げて説明しているが、いずれの実施形態においても、フォトクロミズム、フォトアクチベーションなどを起こす蛍光性タンパク質を選択することは自由である。
【0042】
図1は、蛍光性タンパク質Ygを、発光性タンパク質Xβによって別の蛍光波長を発することができる構造に変化させる方法の概略図である。蛍光性タンパク質Ygは、波長βの光照射により蛍光色gから蛍光色rを示す構造へ変化する性質を有する蛍光性タンパク質である。以下、構造変化を伴って別の蛍光波長を発する蛍光性タンパク質を符号Yrで示す。
【0043】
蛍光性タンパク質Ygは、発光性タンパク質Xβが発光する波長βの発光エネルギーの転移により、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。本発明では、光照射を行わないで蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させることができる。そのため、例えば生体内の深奥部の細胞又は組織内で蛍光性タンパク質Ygの蛍光色を変化させる場合、生体は、光照射用ファイバーによる外科的侵襲や光侵襲による悪影響を受けることがないというメリットがある。
【0044】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Xβは、蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させ得る波長βの発光を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、所定波長βの発光特性を有するように変異させた発光性タンパク質Xβ変異体であってもよい。また、人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変されたタンパク質であってもよい。図2を参照しながら詳しく説明する。
【0045】
本来、発光基質Cαとの反応により波長αの発光特性を有するタンパク質Xαを、化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体Cβに変更することで波長βの発光特性に改変できるタンパク質がある(図2中(I)参照)。以下、波長αの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Xα」と、波長βの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Xβ」と称する。このタンパク質Xαを予め基質Cβとの反応により波長βの発光特性を有するタンパク質Xβとしておく。そして、この発光タンパク質Xβの波長βの発光エネルギーを、目的の蛍光性タンパク質Ygへ転移させることで、蛍光性タンパク質Ygを蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる(図2中(II)参照)。
【0046】
前記発光基質Cα、及び発光基質誘導体Cβは、発光性タンパク質Xαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式1参照)、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体などが挙げられる。
【0047】
図3は、前記方法を応用した、タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を示す図である。本方法では、予め発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygから構成されたタンパク質複合体を形成する。タンパク質Xαは、通常の基質Cαとの反応では波長αの発光エネルギーを示す発光特性を示す。そして、蛍光性タンパク質Ygは、波長βの光照射により蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化するタンパク質である。従って、発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygが複合体を形成しても、蛍光性タンパク質Ygの構造は変化しない。
【0048】
しかし、このタンパク質複合体に発光基質誘導体Cβを反応させることで、タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xαは波長βの発光エネルギーを示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Xβに結合する蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0049】
以上説明した方法に用いる発光性タンパク質Xβは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0050】
また、蛍光性タンパク質Ygは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(配列番号5)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0051】
図4は、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用し物質間の相互作用を検出する方法の概念図である。物質Aをタンパク質Xβでラベルし、物質Bを蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。そして、物質Aと物質Bが相互作用すると、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、発光性タンパク質Xβの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Ygへ転移し、蛍光性タンパク質Ygは蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。このようにタンパク質Xβ、及び蛍光性タンパク質Ygで各物質A、Bをラベルし、蛍光性タンパク質Ygの構造変化を確認することにより、物質A、B間の相互作用の検出をすることができる。
【0052】
図4に示した物質間の相互作用の検出方法の具体例を図5に示す。図5は、ハイブリダイゼーションの検出方法の概念図である。例えば、DNAチップのように、基板1上にDNAプローブ2を固定し、このDNAプローブ2を発光性タンパク質Xβでラベルしておく(図5中(I)参照)。そして、サンプル液3内の核酸4を蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。
【0053】
サンプル液3内にDNAプローブ2の塩基配列と相補性のある塩基配列を有する核酸4が存在すれば、ハイブリダイゼーションが起き、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図5中(II)参照)。この方法を利用すれば、例えば遺伝子病に関与する特定遺伝子の検出などが可能である。なお、DNAプローブ2を蛍光性タンパク質Ygでラベルし、サンプル液3中の核酸4を発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0054】
図6は、図4に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。物質aは、そのままでは物質Bと相互作用しない物質であるが、物質Dが物質aに何らかの作用をすることにより、物質Bと相互作用する物質Aへと変化する物質である(図6中(I)参照)。物質aを発光性タンパク質Xβでラベルし、物質Bを蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。物質Dが物質aに作用すれば、物質aが物質Aへと変化し、物質Aと物質Bが相互作用するようになる。そして、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図6中(II)参照)。
【0055】
蛍光性タンパク質Ygの構造変化の有無を確認することで、物質Dが物質aに作用したか否かを検出することができる。なお、物質aを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、物質Bを発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0056】
図7は、図6で示した概念の生態内での一例を示す図である。細胞5内に存在する物質Arを発光性タンパク質Xβでラベルし、細胞5に存在する受容体Rを蛍光性タンパク質Ygでラベルする(図7中(I)参照)。物質Arは、細胞5外の特定のリガンド6が受容体Rを刺激することにより、シグナル伝達を受け、受容体Rに結合する性質を持つ物質である(図7中(II)参照)。特定のリガンド6が受容体Rを刺激すると、物質Arが受容体Rと結合するため、タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図7中(III)参照)。蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかの有無を確認することで、リガンド6が受容体を刺激したか否かを調べることができる。なお、物質Arを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、受容体Rを発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0057】
この方法の具体例を挙げる。細胞5内に存在するβ−アレスチンを発光性タンパク質Xβでラベルし、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。特定リガンド6がGタンパク質共役型受容体(GPCR)を刺激すると、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が活性化し、シグナル伝達調整をするβ−アレスチンがGタンパク質共役型受容体(GPCR)に結合する。すると、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0058】
このように、蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の活性化を検出することができる。この方法は、オーファン受容体のリガンド探しや、ひいては薬物スクリーニングにも応用できる。
【0059】
本発明に係る各方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、該構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に相互作用履歴を検出することができる。
【0060】
例えば、β−アレスチンがGタンパク質共役型受容体(GPCR)に結合し、その後再び離れるような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後にGタンパク質共役型受容体(GPCR)をラベルした蛍光性タンパク質Ygの構造変化の有無を確認すれば、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の活性化の履歴を検出することができる。
【0061】
図8は、物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。細胞5内に存在する物質Gを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、細胞5に存在する受容体Rを発光性タンパク質Xβでラベルする(図8中(I)参照)。この物質Gは、特定のリガンド6が受容体Rを刺激することにより、受容体R上で活性化し、その後、何らかの動きをする物質である。特定のリガンド6が受容体Rを刺激すると物質Gは受容体R上へ移動するため(図8中(II)参照)、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図8中(III)参照)。従って、蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、第一に、物質Gの活性化を検出できる。
【0062】
そして、物質Gは受容体R上で活性化された後、何らかの動きをするが、物質Gをラベルする蛍光タンパク質Ygは、その蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化した蛍光性タンパク質Yrとなっているため、蛍光色rの動きを追跡することで、第二に活性化後の物質Gの挙動を追跡することもできる。
【0063】
物質Gをラベルする蛍光性タンパク質Ygは、前記のとおり、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質でもフォトクロミズムを起こす蛍光性タンパク質でもよいが、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質の場合、物質Gの活性前と活性後で異なる蛍光色g、rを示すため、物質Gの活性化の検出、活性化後の物質Gの挙動の追跡に加え、第3に活性化前の物質Gの挙動も確認することができる。
【0064】
この方法の具体例を挙げる。Gタンパク質を蛍光性タンパク質Ygでラベルし、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を発光性タンパク質Xβでラベルする。特定のリガンド6がGタンパク質共役型受容体(GPCR)を刺激すると、Gタンパク質がGタンパク質共役型受容体(GPCR)へ引きつけられ、活性化される。このとき発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0065】
蛍光色gの挙動を観察することにより、Gタンパク質がGタンパク質共役型受容体(GPCR)へ引きつけられる様子を確認することができ、また、蛍光色gから蛍光色rへの変化により、Gタンパク質が活性化されたことが確認できる。さらに、蛍光色rの挙動を観察することで、活性化後のGタンパク質の挙動を追跡することができる。
【0066】
図9は、本発明に係る生体内の所定の細胞をマーキングする方法の概念図である。まず、前記発光性タンパク質Xαと前記蛍光性タンパク質Ygとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく(図9中(I)参照)。ここに、発光性タンパク質Xαの発光波長αを所定波長βの発光特性へ改変させ得る発光基質誘導体Cβを生体内へ導入する(図9中(II)参照)。すると、発光性タンパク質Xαの発光特性が、波長βの発光を示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Xβから、所定波長βの発光エネルギーが蛍光性タンパク質Ygへ転移し、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図9中(III)参照)。この方法で、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【0067】
図10は、本発明に係る生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。細胞5内に、発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygのタンパク質複合体を発現させておき、細胞5外から基質Cβを導入する。しかし、細胞5外からの異物侵入の制御を担うタンパク質Mが存在する場合は、細胞5外からの基質Cβの侵入も阻害されてしまう(図10中(I)参照)。そのため、発光タンパク質Xαの発光特性を改変することができず、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができない。
【0068】
ここで、タンパク質Mの機能を阻害する物質Iでタンパク質Mの機能を阻害することができれば、細胞5内へ基質Cβが侵入できるようになる(図10中(II)参照)。そして、発光性タンパク質Xαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Xβへ改変させることができる。その結果、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる(図10中(III)参照)。このように蛍光性タンパク質Ygの蛍光色の変化を指標として、タンパク質Mの機能を阻害し得る物質Iのスクリーニングを行うことができる。
【0069】
この方法の具体例を挙げる。多剤耐性タンパク質であるP−糖タンパク質は、細胞表面に存在し、薬剤が細胞へ侵入する際、薬剤をくみ出す働きをしている。P−糖タンパク質は、基質Cβが細胞5内へ侵入するのも阻害するため、予め細胞5内にタンパク質複合体を発現させておき、基質Cβを細胞5内へ導入しようとしてもP−糖タンパク質により、阻害されてしまう。しかし、P−糖タンパク質阻害作用を有する物質IをP−糖タンパク質に作用させておけば、基質Cβを細胞5内へ導入することができ、発光性タンパク質Xαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Xβへ改変させることができる。その結果、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる。
【0070】
このように、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygの蛍光色の変化を確認することで、物質IがP−糖タンパク質の機能を阻害し得る物質であるか否かを調べることができる。すなわち、蛍光性タンパク質Ygの構造変化に伴う蛍光変化が確認できた場合は、物質IはP−糖タンパク質に対して阻害作用を示す物質であり、逆に蛍光性タンパク質Ygの構造変化に伴う蛍光変化が確認できない場合は、物質IはP−糖タンパク質に対して阻害作用を有さない物質であることが分かる。このように、前記タンパク質複合体を使って、P−糖タンパク質阻害剤のスクリーニングができる。
【0071】
近年、P−糖タンパク質が細胞表面に多く発現したがん細胞は、抗がん剤をくみ出してしまうため効果が期待できないことが問題となっている。本発明に係る薬剤スクリーニング方法を利用することにより、P−糖タンパク阻害剤をスクリーニングすることができれば、該阻害剤と抗がん剤とを併用し、抗がん剤の効果発現を上昇させることができると考えられる。
【0072】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などに用いるタンパク質複合体は、発光性を示すタンパク質Xαと、該発光性タンパク質Xαからの所定波長の発光エネルギーにより別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Ygとからなるものであれば、特に限定されない。
【0073】
前記タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xαは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0074】
また、前記タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygも、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(配列番号5)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0075】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などを行う際、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を利用して、生体内の所定の細胞又は組織へ前記タンパク質複合体を発現又は存在させることができる。
【0076】
更に、本発明では、発光性タンパク質Xαをコードする塩基配列を有するベクター、蛍光性タンパク質Ygをコードする塩基配列を有するベクター、及び発光基質Cα又は発光基質誘導体Cβを少なくとも含むキットを利用して、本発明に係る相互作用検出方法、タンパク質挙動追跡方法、生体マーキング方法、薬剤スクリーニング方法などを行うことができる。
【0077】
上記キットに用いる発光性タンパク質Xαは、発光性を有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(塩基配列番号6)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0078】
また、上記キットに用いる蛍光性タンパク質Ygも、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(塩基配列番号7)又はKaedeの変異体(塩基配列番号8)、KikGR(塩基配列番号9)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(塩基配列番号10)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0079】
更に、上記キットに用いる発光基質Cα及び発光基質誘導体Cβは、発光性タンパク質Xαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式1参照)、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体などが挙げられる。
【実施例1】
【0080】
実施例1では、Kaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0081】
<材料および方法>
A.cDNAの調製
まず、蛍光タンパク質Kaedeの終止コドンの前に制限酵素Bgl IIによって認識される配列を挿入するため、オリゴDNA(配列番号11、第21番目から第40番目はKaedeをコードする部分)を合成した。合成したオリゴDNAとKaedeの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号12、第17番目から第36番目はKaedeをコードする部分)とを用いて、東洋紡社のKOD+によって30サイクルのPCR反応を行い、終止コドンを持たないKaedeをコードするDNA断片を調製した。別に、野生型遺伝子をコードするcDNAを、遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」に組み込んだベクターDNA用意した。ここで用いた遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」とは、本願発明者が開発した、ヒト細胞中で安定に複製・維持される遺伝子発現ベクターである(Tanaka J, Miwa Y, Miyoshi K, Ueno A, Inoue H. Contruction of Epstein-Barr Virus-based expression vector containing mini-oriP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 938-943,1999)。そして、調整したDNA断片を制限酵素Age I -Not Iによって切断した後に、ベクターDNAの当該部位と置換した。次に制限酵素Bgl IIにて切断し、Kaede cDNAの上流側のBamHI認識部位を切断したものと連結して、2つのKaedeタンパク質がタンデムに連結したベクターを作成した。さらに制限酵素Bgl IIにて切断し、別に「pEB6CAG」に組み込んだRenillaルシフェラーゼをコードするcDNA断片の上流側のBamHI認識配列とタンパク質合成の翻訳の読み枠が合うように連結した(図11参照)。
【0082】
B.遺伝子発現ベクターの調製
構築した発現ベクターDNAは、Bio101社のRPMキットを用いて大腸菌から大量調製した。
【0083】
C.形質転換細胞の作製および選択
このDNA0.5μgをバイオラッド社のリポフェクション試薬TransFectinを用いてヒト細胞株HEp-2に導入し、4日間1.5 mg/ml G418存在下で培養して、DNAが導入された細胞だけを選択した。この細胞を発光・蛍光顕微鏡(オリンパス社)を用いて観察した。緑の蛍光の観察にはバンドパスフィルター530/30を、赤の蛍光観察にはバンドパスフィルター630/55を使用した。
【0084】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図12〜14は、Kaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0085】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図12参照)。
【0086】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分間の発光状態を撮影した。ほとんどの細胞で発光が起こっていることが確認された(図13参照)。
【0087】
20分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図14参照)。
【0088】
実施例1では、KaedeとRenillaルシフェラーゼとからなるタンパク質複合体に、発光基質誘導体であるDeepBlueCを添加することにより、外部からの光照射を行うことなく、タンパク質複合体を構成するKaedeの蛍光が緑から赤に変化した。従って、DeepBlueCの添加により、タンパク質複合体の内部において、Renillaルシフェラーゼから所定波長の発光エネルギーがKaedeに転移し、外部から光照射を行うことなく、Kaedeの発色団のタンパク質構造を変化させることが分かった。Kaedeの緑色の状態時の発色団の構造式を化学式3に、Kaedeの赤色の状態時の発色団の構造式を化学式4に示す。
【化3】
【化4】
【実施例2】
【0089】
実施例2では、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0090】
<材料および方法>
実施例1と同様の方法により、オリゴDNA(配列番号13、第10番目から第29番目はKikGRをコードする部分)とKikGRの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号14、第27番目から第38番目はKikGRをコードする部分)とを用いて、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【0091】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図15は、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0092】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図15参照)。
【0093】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図15参照)。
【実施例3】
【0094】
実施例3では、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合のDronpaの蛍光を発する状態への変化を検証した。
【0095】
<材料および方法>
実施例1と同様の方法により、オリゴDNA(配列番号15、第10番目から第30番目はDronpaをコードする部分)を合成した。合成したオリゴDNAとDronpaの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号16、第27番目から第38番目はDronpaをコードする部分)とを用いて、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【0096】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図16は、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めはDronpaの緑の蛍光は検出されなかったが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には蛍光を示すようになった結果を示す図である。
【0097】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図16参照)。
【0098】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分後に再び蛍光を観察したところ、多数の細胞において、緑の蛍光を示すようになったことが確認された(図16参照)。
【実施例4】
【0099】
実施例4では、Kaede-bZipとbZip-Renillaルシフェラーゼを別々の分子として同時に細胞に発現させた場合において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0100】
<材料および方法>
実施例1にて作成したKaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Nco I-Bgl IIによりKaedeのかわりにロイシンジッパーA配列をコードするDNA断片(配列番号17)を挿入し、ZipA-RenillaルシフェラーゼをコードするcDNAを調製し、これをpEB6CAG-SRZに組み込んだ。またKaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Bgl II-Not IによってRenillaルシフェラーゼをコードするDNA断片を除き、かわりにロイシンジッパーB配列をコードするDNA断片(配列番号18)をBamHI-Not Iで切断したものを挿入し、Kaede-ZipBをコードするcDNAがpEB6CAGに組み込まれている状態にした。
【0101】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図17は、Kaede-ZipB タンパク質とZipA-Renillaルシフェラーゼタンパク質を同時に細胞内に発現させたときに初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、ロイシンジッパー配列を介してRenillaルシフェラーゼと相互作用し、DeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0102】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図17参照)。
【0103】
ここにDeepBlueCを終濃度5 μMになるように添加し37℃で10分後、さらに同量のDeepBlueCを追加して37℃で10分間反応させる操作を2回繰り返した。再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図17参照)。
【0104】
実施例4では、KaedeとRenillaルシフェラーゼを別々に発現させた場合にも、DeepBlueCの添加により、Kaedeが赤い蛍光を示すことが確認できた。従って、本発明に係る方法は、KaedeとRenillaルシフェラーゼを別々の物質にラベルし、DeepBlueCの添加によるKaedeの蛍光色を確認することで、該物質間の相互作用検出に利用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明に係る方法は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの特性を示す蛍光性タンパク質を、光照射を行うことなく、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることができるため、生体内等でも外科的侵襲、光侵襲による悪影響を気にすることなく、安全に行うことができる。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。
【0106】
更に、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、長時間、モニタリングし続ける必要がなく、相互作用検出や薬剤スクリーニングなどにおいて、大幅な時間短縮、コストダウンなどを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【0107】
【図1】蛍光性タンパク質Ygを、発光性タンパク質Xβによって別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図2】人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Xβによって、蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図3】図1とは異なるタンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法の概略図である。
【図4】物質間の相互作用を、発光性タンパク質Xβ及び蛍光性タンパク質Ygを使って検出する方法の概念図である。
【図5】図4に示した物質間の相互作用の検出の一例を示す図である。
【図6】図4に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。
【図7】図6で示した概念の生態内での一例を示す図である。
【図8】物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。
【図9】本発明に係るタンパク質複合体を利用した生体マーキング方法の概念図である。
【図10】本発明に係るタンパク質複合体を利用した、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。
【図11】実施例1で作製したRenillaルシフェラーゼとKaedeの融合蛋白質を模式的に表した図である。
【図12】実施例1におけるDeepBlueCを添加する前のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【図13】実施例1におけるDeepBlueCを添加後、Renillaルシフェラーゼ発光中の図面代用写真である。
【図14】実施例1におけるRenillaルシフェラーゼ発光後のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【図15】実施例2におけるDeepBlueCを添加する前と後のKikGRの蛍光を示す図面代用写真である。
【図16】実施例3におけるDeepBlueCを添加する前と後のDronpaの蛍光を示す図面代用写真である。
【図17】実施例4におけるDeepBlueCを添加する前と後のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【符号の説明】
【0108】
Xα、Xβ、 蛍光性タンパク質Yg、Yr 蛍光性タンパク質
Cα 発光基質
Cβ 発光基質誘導体
A、B、D 物質
1 基板1
2 DNAプローブ
3 サンプル液
4 核酸
5 細胞
6 リガンド
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法に関する。より詳しくは、蛍光性タンパク質Yを、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法、蛍光性タンパク質を用いる方法、及びタンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、光を発することができるタンパク質を使って所定の物質をラベルし、可視化することが広く一般に行われている。特に、生体内の特定部分をマーキングしたり、情報伝達物質などの検出や定量、及びその動態等を調べたりする場合において、生体への侵襲が少ないことから、該タンパク質の利用が注目を集めている。更に、特定の遺伝子の検出、薬剤等の特定物質のスクリーニングにおいても、該タンパク質が利用され始めている。
【0003】
例えば、特許文献1では、蛍光蛋白質を細胞内に導入することにより、細胞分裂を視覚化できる細胞分裂可視化細胞及びその作成方法、それを用いた細胞分裂の可視化方法、遺伝子や薬剤の細胞分裂への影響の評価方法、細胞分裂へ影響する遺伝子や薬剤のスクリーニング方法が開示されている。
【0004】
また、蛍光物質間の蛍光共鳴エネルギー転移を用いて2種の物質の相互作用を検出する、いわゆるFRET法も多く利用されている。例えば、特許文献2では、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモFRET(蛍光共鳴エネルギー転移)に基づいた蛍光指示薬、及び分子間相互作用の可視化システムが開示されている。
【0005】
上記の方法等に用いられる、光を発することのできるタンパク質には、ルシフェリンがルシフェラーゼの作用で酸化分解されることにより発光するものと、発光たんぱく質によるもの、外部からの照射により光を発する蛍光性タンパク質などがある。例えば、ホタルやミミズなどは、発光基質であるルシフェリンが酵素であるルシフェラーゼによって酸化されて発光する。一方、クラゲなどは、酵素−基質複合体に似た発光タンパク質イクオリンがカルシウムイオンと結合すると、酸化剤がなくても発光タンパク質内部で酸化的反応が起こることにより発光する。
【0006】
発光タンパク質は自ら発光することができるので、その遺伝子を細胞に導入するだけで細胞をラベルすることができる。しかし、任意の時期に任意の細胞のみをラベルすることは困難である。蛍光性タンパクは自ら発光することができないが、特定波長の光照射により、それぞれ決められた光を発することができる。さらに、特定の波長の光によって、構造変化を伴って別の蛍光波長を発することができたり構造変化を伴って蛍光を発することを可能にしたりする特性を持った蛍光性タンパク質が開発されている。
【0007】
例えば、特許文献3では、紫外線の照射により緑色から赤色に変化(フォトコンバージョン)するヒユサンゴ(Trachyphyllia geoffroyi)由来の蛍光蛋白質、及び紫外線の照射により緑色から赤色に変化(フォトコンバージョン)するアザミハナダカサンゴ(Scolymia Vitiensis)由来の蛍光性タンパク質が開示されている。これらの蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルしておくことにより、任意の時期に任意の細胞にのみ紫外線を照射すれば、その細胞の色のみが変化(フォトコンバージョン)するため、任意の時期に任意の細胞のみマーキングすることができる。
【0008】
また、特許文献4では、波長518nm付近の光を照射すると蛍光が消え、380nm付近の光を照射すると蛍光が回復するフォトクロミズム現象を示すキッカサンゴ(Echinophyllia sp)由来の蛍光性タンパク質も開発されている。この様な蛍光性タンパク質で特定の細胞をラベルすれば、異なる波長の光を照射することによりラベルと脱ラベルを自在に制御することができる。
【特許文献1】特開2004−187530号公報。
【特許文献2】特開2004−187544号公報。
【特許文献3】WO2004/018671号パンフレット
【特許文献4】WO2005/113772号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
蛍光の変化を検出することにより物質間の相互作用を検出できるFRET法では、蛍光共鳴エネルギー転移が起きる距離に両物質が近づいたときにのみ、蛍光の変化が起こる。即ち、蛍光の変化をリアルタイムに取得する必要があるため、蛍光変化がどのタイミングで起こるか不明な場合など、長時間、モニタリングし続ける必要がある。
【0010】
一方、フォトコンバージョンやフォトクロミズムなどを行う蛍光性タンパク質は、その構造を変化させることで別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に移行すれば、その構造が変化しない限り、いつでも、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に前記構造変化が起こっているかを検出することができる。
【0011】
しかし、フォトコンバージョンやフォトクロミズムを行うには、特定波長の外部からの光照射が必要である。従って、生体内の深奥部の細胞をマーキング等する場合、光照射用ファイバーを外科的に誘導する必要があり、生体への外科的侵襲による悪影響が考えられる。また、波長の長短によっては、細胞毒性を示す場合があり、生体への光侵襲による悪影響が考えられる。
【0012】
そこで、本発明は、モニタリングが容易で、かつ生体への侵襲が少ない、蛍光性タンパク質を別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本願発明者は、蛍光性タンパク質を、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させる方法について鋭意研究した結果、光照射を行わなくても、蛍光性タンパク質を前記の構造へ変化させることができる新規方法を見出した。
【0014】
本発明ではまず、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Yを、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。本来、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質Yは、光照射を行わなければ、前記構造に変化しないが、本願発明者は発想を大きく変換し、別の発光性タンパク質Xの発光により、その発光エネルギーを蛍光性タンパク質Yへ転移させることで、蛍光タンパク質Yを、前記構造に変化させることに成功した。
【0015】
本発明に係る方法では、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させるために、蛍光性タンパク質Yの構造を変化させ得る所定波長の発光特性を有する発光性タンパク質Xを選択する。このとき、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体により、所定波長の発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Xを選択することもできる。
【0016】
前記発光基質、及び発光基質誘導体は、発光性タンパク質Xの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine)、セレンテラジン(Coelenterazine)誘導体などが挙げられる。セレンテラジン(Coelenterazine)の化学式を化学式1に、セレンテラジン(Coelenterazine)誘導体の化学式を化学式2に示す。
【化1】
【化2】
【0017】
また、本発明では、上記の方法を応用して、発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体に、発光基質又は発光基質誘導体を作用させることで、タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を提供する。
【0018】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Xは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Renillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。
【0019】
また、本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、フォトクロミズム特性を有するDronpa(配列番号5)などが挙げられる。
【0020】
本発明では次に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した以下の方法を提供する。
【0021】
第1に、前記方法を利用した物質間の相互作用を検出する方法を提供する。例えば、発光性タンパク質Xによってラベルした物質Aと、蛍光性タンパク質Yによってラベルした物質Bとが相互作用すると、前記発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近する。そして、前記発光性タンパク質Xからの発光エネルギーの転移により、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。この構造変化を確認することで、物質Aと物質Bとの相互作用を検出することができる。
【0022】
前記の相互作用は、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することにより、物質Aと物質Bが相互作用するものであってもよい。物質Aと物質Bがそのままの状態では相互作用しない場合は、両物質をラベルしている発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yが発光エネルギー転移の可能な程度にまで接近しないため、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化することはない。しかし、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することにより、物質Aと物質Bが相互作用する場合は、物質Cを作用させた時点で、物質Aと物質Bが相互作用し、発光性タンパク質Xと蛍光性タンパク質Yは接近する。そして、発光性タンパク質Xの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Yへ転移するため、蛍光性タンパク質Yは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。
【0023】
このとき、物質Cは、物質Aに相互作用するものであっても、物質Bに相互作用するものであっても、更には、物質A、Bの両方に相互作用するものであってもよい。このようにして、蛍光性タンパク質Yの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかを確認をすることで、物質Aと物質Bの相互作用の検出に加え、物質Aと物質C、物質Bと物質C、又は物質A、Bと物質Cの相互作用の検出することも可能である。
【0024】
本発明に係る方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に相互作用履歴を検出することができる。
【0025】
例えば、前記物質Aと前記物質Bとが、所定時間内に一旦結合し、その後分離するような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後に前記物質A若しくは前記物質Bをラベルした蛍光性タンパク質Yの別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造への変化が起こっているかの有無を確認すれば、相互作用履歴を検出することができる。
【0026】
第2に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用したタンパク質挙動追跡方法を提供する。本方法では、まず、前記物質Aと前記物質Bとの相互作用又は前記物質Aあるいは前記物質Bに他の物質Cが相互作用することにより作動した前記物質Aと前記物質Bとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる。そして、該構造変化後の蛍光性タンパク質Yを追跡することにより、物質Bの挙動を追跡することができる。
【0027】
第3に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した、生体マーキング方法を提供する。本方法では、まず、前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Xの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。すると、発光性タンパク質Xが所定波長の発光特性へ改変されるため、複合体を構成する蛍光性タンパク質Yへ発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Yが別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。このようにして、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【0028】
第4に、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用した薬剤スクリーニング方法を提供する。本方法では、まず、前記生体マーキング方法と同様に、前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく。そして、前記発光性タンパク質Xの発光波長を所定波長の発光特性へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入する。
【0029】
このとき、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質が正常に機能すると、前記発光基質の導入も阻害されてしまう。そのため、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Yの前記構造変化は起こらない。しかし、前記タンパク質を対象とする機能阻害剤を生体内へ投与すれば、前記発光基質又は発光基質誘導体の生体内への導入は阻害されず、前記発光基質又は発光基質誘導体は生体内の発光性タンパク質Xに作用する。
【0030】
その結果、発光性タンパク質Xは、所定波長の発光特性を示すようになり、蛍光性タンパク質Yへ所定波長の発光エネルギーが転移し、蛍光性タンパク質Yは別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化する。そして、蛍光性タンパク質Yの前記構造変化が起こっているかを観察又は検出することによって、前記機能阻害剤をスクリーニングすることができる。
【0031】
本発明では更に、発光性タンパク質Xと、該発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Yとから構成されたタンパク質複合体を提供する。このタンパク質複合体は、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに用いることができる。
【0032】
タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xは、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよく、発光を示すタンパク質であれば、特に限定されない。一例としては、Renillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。
【0033】
タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質が好ましい。具体例としては、フォトコンバージョン特性を有するKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)KikGR(配列番号4)、フォトクロミズム特性を有するDronpa(配列番号5)などが挙げられる。
【0034】
また、本発明では、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を提供する。これらは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などの際、前記タンパク質複合体を、生体内の所定の細胞又は組織へ発現又は存在させる場合に用いることができる。
【0035】
加えて、本発明では、本発明に係る方法に用いることができる以下のキットを提供する。
【0036】
まず、Renillaルシフェラーゼをコードする塩基配列(配列番号6)を有するベクターと、Kaede(配列番号7)、Kaedeの変異体(配列番号8)、KikGR(配列番号9)、Dronpa(配列番号10)の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記相互作用検出や前記タンパク質挙動追跡などに利用することができる。
【0037】
また、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター又は該組み換えベクターを導入した細胞と、Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、を少なくとも含むキットを提供する。このキットは、例えば、前記マーキング方法や前記薬剤スクリーニング方法などに利用することができる。
【0038】
ここで、本発明における技術用語を定義する。「発光性タンパク質」とは、自ら発光するタンパク質、及び何らかの作用により発光するタンパク質の両方を含む。例えば、自ら発光する発光タンパク質、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づき発光するタンパク質、を含む。「蛍光性タンパク質」とは特定波長の光照射により、蛍光特性を変化させるもの、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こすタンパク質を含む。
【0039】
「別の蛍光波長を発することができる構造変化」とは、タンパク質がフォトコンバージョンなどにより、色を変化させることを意味する。「蛍光を発することが可能な構造変化」とは、タンパク質がフォトクロミズムなどにより、光を発することが可能な状態を意味する。「フォトコンバージョン」とは、特定の波長に光照射によって、蛍光色が変化する蛍光性タンパク質の特性を意味する。「フォトクロミズム」とは、異なる2つの波長の光照射によって、蛍光と退色を行う蛍光性タンパク質の特性を意味する。
【発明の効果】
【0040】
本発明では、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどを起こす蛍光性タンパク質を、光照射を行わないで、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることが可能である。従って、例えば本発明の方法により生体内物質をラベル等する場合、生体への外科的侵襲及び光侵襲による悪影響がない。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。加えて、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、該構造変化に伴う蛍光のモニタリングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0041】
以下、本発明の概念について図面を参照しながら説明する。各概念において一実施形態を挙げるが、この実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明が限定されることはない。なお、以下の実施形態の説明においては、本発明に係る方法等に使用する蛍光性タンパク質Yについて、便宜上、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質を例に挙げて説明しているが、いずれの実施形態においても、フォトクロミズム、フォトアクチベーションなどを起こす蛍光性タンパク質を選択することは自由である。
【0042】
図1は、蛍光性タンパク質Ygを、発光性タンパク質Xβによって別の蛍光波長を発することができる構造に変化させる方法の概略図である。蛍光性タンパク質Ygは、波長βの光照射により蛍光色gから蛍光色rを示す構造へ変化する性質を有する蛍光性タンパク質である。以下、構造変化を伴って別の蛍光波長を発する蛍光性タンパク質を符号Yrで示す。
【0043】
蛍光性タンパク質Ygは、発光性タンパク質Xβが発光する波長βの発光エネルギーの転移により、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。本発明では、光照射を行わないで蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させることができる。そのため、例えば生体内の深奥部の細胞又は組織内で蛍光性タンパク質Ygの蛍光色を変化させる場合、生体は、光照射用ファイバーによる外科的侵襲や光侵襲による悪影響を受けることがないというメリットがある。
【0044】
本発明に係る方法に用いる発光性タンパク質Xβは、蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造に変化させ得る波長βの発光を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、所定波長βの発光特性を有するように変異させた発光性タンパク質Xβ変異体であってもよい。また、人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変されたタンパク質であってもよい。図2を参照しながら詳しく説明する。
【0045】
本来、発光基質Cαとの反応により波長αの発光特性を有するタンパク質Xαを、化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体Cβに変更することで波長βの発光特性に改変できるタンパク質がある(図2中(I)参照)。以下、波長αの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Xα」と、波長βの発光特性を有するタンパク質を「タンパク質Xβ」と称する。このタンパク質Xαを予め基質Cβとの反応により波長βの発光特性を有するタンパク質Xβとしておく。そして、この発光タンパク質Xβの波長βの発光エネルギーを、目的の蛍光性タンパク質Ygへ転移させることで、蛍光性タンパク質Ygを蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる(図2中(II)参照)。
【0046】
前記発光基質Cα、及び発光基質誘導体Cβは、発光性タンパク質Xαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式1参照)、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体などが挙げられる。
【0047】
図3は、前記方法を応用した、タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を示す図である。本方法では、予め発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygから構成されたタンパク質複合体を形成する。タンパク質Xαは、通常の基質Cαとの反応では波長αの発光エネルギーを示す発光特性を示す。そして、蛍光性タンパク質Ygは、波長βの光照射により蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化するタンパク質である。従って、発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygが複合体を形成しても、蛍光性タンパク質Ygの構造は変化しない。
【0048】
しかし、このタンパク質複合体に発光基質誘導体Cβを反応させることで、タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xαは波長βの発光エネルギーを示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Xβに結合する蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0049】
以上説明した方法に用いる発光性タンパク質Xβは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0050】
また、蛍光性タンパク質Ygは、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(配列番号5)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0051】
図4は、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法を利用し物質間の相互作用を検出する方法の概念図である。物質Aをタンパク質Xβでラベルし、物質Bを蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。そして、物質Aと物質Bが相互作用すると、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、発光性タンパク質Xβの発光エネルギーが、蛍光性タンパク質Ygへ転移し、蛍光性タンパク質Ygは蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。このようにタンパク質Xβ、及び蛍光性タンパク質Ygで各物質A、Bをラベルし、蛍光性タンパク質Ygの構造変化を確認することにより、物質A、B間の相互作用の検出をすることができる。
【0052】
図4に示した物質間の相互作用の検出方法の具体例を図5に示す。図5は、ハイブリダイゼーションの検出方法の概念図である。例えば、DNAチップのように、基板1上にDNAプローブ2を固定し、このDNAプローブ2を発光性タンパク質Xβでラベルしておく(図5中(I)参照)。そして、サンプル液3内の核酸4を蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。
【0053】
サンプル液3内にDNAプローブ2の塩基配列と相補性のある塩基配列を有する核酸4が存在すれば、ハイブリダイゼーションが起き、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図5中(II)参照)。この方法を利用すれば、例えば遺伝子病に関与する特定遺伝子の検出などが可能である。なお、DNAプローブ2を蛍光性タンパク質Ygでラベルし、サンプル液3中の核酸4を発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0054】
図6は、図4に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。物質aは、そのままでは物質Bと相互作用しない物質であるが、物質Dが物質aに何らかの作用をすることにより、物質Bと相互作用する物質Aへと変化する物質である(図6中(I)参照)。物質aを発光性タンパク質Xβでラベルし、物質Bを蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。物質Dが物質aに作用すれば、物質aが物質Aへと変化し、物質Aと物質Bが相互作用するようになる。そして、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図6中(II)参照)。
【0055】
蛍光性タンパク質Ygの構造変化の有無を確認することで、物質Dが物質aに作用したか否かを検出することができる。なお、物質aを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、物質Bを発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0056】
図7は、図6で示した概念の生態内での一例を示す図である。細胞5内に存在する物質Arを発光性タンパク質Xβでラベルし、細胞5に存在する受容体Rを蛍光性タンパク質Ygでラベルする(図7中(I)参照)。物質Arは、細胞5外の特定のリガンド6が受容体Rを刺激することにより、シグナル伝達を受け、受容体Rに結合する性質を持つ物質である(図7中(II)参照)。特定のリガンド6が受容体Rを刺激すると、物質Arが受容体Rと結合するため、タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図7中(III)参照)。蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかの有無を確認することで、リガンド6が受容体を刺激したか否かを調べることができる。なお、物質Arを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、受容体Rを発光性タンパク質Xβでラベルしてもよい。
【0057】
この方法の具体例を挙げる。細胞5内に存在するβ−アレスチンを発光性タンパク質Xβでラベルし、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を蛍光性タンパク質Ygでラベルしておく。特定リガンド6がGタンパク質共役型受容体(GPCR)を刺激すると、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が活性化し、シグナル伝達調整をするβ−アレスチンがGタンパク質共役型受容体(GPCR)に結合する。すると、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0058】
このように、蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、Gタンパク質共役受容体(GPCR)の活性化を検出することができる。この方法は、オーファン受容体のリガンド探しや、ひいては薬物スクリーニングにも応用できる。
【0059】
本発明に係る各方法に用いる蛍光性タンパク質Yは、発光性タンパク質Xによって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化するため、一旦、該構造に変化すれば、その構造が再度変化しない限り、いつでも構造変化が起こっているかを検出することができる。従って、前記相互作用の検出を行う際、相互作用時、リアルタイムにモニタリングを行う必要がなく、測定者によって定められる任意の時間後(所定時間後)に相互作用履歴を検出することができる。
【0060】
例えば、β−アレスチンがGタンパク質共役型受容体(GPCR)に結合し、その後再び離れるような場合であっても、長時間モニタリングし続ける必要がなく、所定時間経過後にGタンパク質共役型受容体(GPCR)をラベルした蛍光性タンパク質Ygの構造変化の有無を確認すれば、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)の活性化の履歴を検出することができる。
【0061】
図8は、物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。細胞5内に存在する物質Gを蛍光性タンパク質Ygでラベルし、細胞5に存在する受容体Rを発光性タンパク質Xβでラベルする(図8中(I)参照)。この物質Gは、特定のリガンド6が受容体Rを刺激することにより、受容体R上で活性化し、その後、何らかの動きをする物質である。特定のリガンド6が受容体Rを刺激すると物質Gは受容体R上へ移動するため(図8中(II)参照)、発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図8中(III)参照)。従って、蛍光性タンパク質Ygの別の蛍光波長を発することができる構造であるかを確認することで、第一に、物質Gの活性化を検出できる。
【0062】
そして、物質Gは受容体R上で活性化された後、何らかの動きをするが、物質Gをラベルする蛍光タンパク質Ygは、その蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化した蛍光性タンパク質Yrとなっているため、蛍光色rの動きを追跡することで、第二に活性化後の物質Gの挙動を追跡することもできる。
【0063】
物質Gをラベルする蛍光性タンパク質Ygは、前記のとおり、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質でもフォトクロミズムを起こす蛍光性タンパク質でもよいが、フォトコンバージョンを起こす蛍光性タンパク質の場合、物質Gの活性前と活性後で異なる蛍光色g、rを示すため、物質Gの活性化の検出、活性化後の物質Gの挙動の追跡に加え、第3に活性化前の物質Gの挙動も確認することができる。
【0064】
この方法の具体例を挙げる。Gタンパク質を蛍光性タンパク質Ygでラベルし、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)を発光性タンパク質Xβでラベルする。特定のリガンド6がGタンパク質共役型受容体(GPCR)を刺激すると、Gタンパク質がGタンパク質共役型受容体(GPCR)へ引きつけられ、活性化される。このとき発光性タンパク質Xβと蛍光性タンパク質Ygが発光エネルギー転移の可能な程度に接近する。その結果、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する。
【0065】
蛍光色gの挙動を観察することにより、Gタンパク質がGタンパク質共役型受容体(GPCR)へ引きつけられる様子を確認することができ、また、蛍光色gから蛍光色rへの変化により、Gタンパク質が活性化されたことが確認できる。さらに、蛍光色rの挙動を観察することで、活性化後のGタンパク質の挙動を追跡することができる。
【0066】
図9は、本発明に係る生体内の所定の細胞をマーキングする方法の概念図である。まず、前記発光性タンパク質Xαと前記蛍光性タンパク質Ygとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておく(図9中(I)参照)。ここに、発光性タンパク質Xαの発光波長αを所定波長βの発光特性へ改変させ得る発光基質誘導体Cβを生体内へ導入する(図9中(II)参照)。すると、発光性タンパク質Xαの発光特性が、波長βの発光を示す発光特性へと改変される。そして、発光性タンパク質Xβから、所定波長βの発光エネルギーが蛍光性タンパク質Ygへ転移し、蛍光性タンパク質Ygは、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化する(図9中(III)参照)。この方法で、生体内の所定の細胞又は組織をマーキングすることができる。
【0067】
図10は、本発明に係る生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。細胞5内に、発光性タンパク質Xαと蛍光性タンパク質Ygのタンパク質複合体を発現させておき、細胞5外から基質Cβを導入する。しかし、細胞5外からの異物侵入の制御を担うタンパク質Mが存在する場合は、細胞5外からの基質Cβの侵入も阻害されてしまう(図10中(I)参照)。そのため、発光タンパク質Xαの発光特性を改変することができず、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができない。
【0068】
ここで、タンパク質Mの機能を阻害する物質Iでタンパク質Mの機能を阻害することができれば、細胞5内へ基質Cβが侵入できるようになる(図10中(II)参照)。そして、発光性タンパク質Xαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Xβへ改変させることができる。その結果、蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる(図10中(III)参照)。このように蛍光性タンパク質Ygの蛍光色の変化を指標として、タンパク質Mの機能を阻害し得る物質Iのスクリーニングを行うことができる。
【0069】
この方法の具体例を挙げる。多剤耐性タンパク質であるP−糖タンパク質は、細胞表面に存在し、薬剤が細胞へ侵入する際、薬剤をくみ出す働きをしている。P−糖タンパク質は、基質Cβが細胞5内へ侵入するのも阻害するため、予め細胞5内にタンパク質複合体を発現させておき、基質Cβを細胞5内へ導入しようとしてもP−糖タンパク質により、阻害されてしまう。しかし、P−糖タンパク質阻害作用を有する物質IをP−糖タンパク質に作用させておけば、基質Cβを細胞5内へ導入することができ、発光性タンパク質Xαを所定波長βの発光特性の発光タンパク質Xβへ改変させることができる。その結果、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygを、蛍光色gから蛍光色rを示す構造へと変化させることができる。
【0070】
このように、タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygの蛍光色の変化を確認することで、物質IがP−糖タンパク質の機能を阻害し得る物質であるか否かを調べることができる。すなわち、蛍光性タンパク質Ygの構造変化に伴う蛍光変化が確認できた場合は、物質IはP−糖タンパク質に対して阻害作用を示す物質であり、逆に蛍光性タンパク質Ygの構造変化に伴う蛍光変化が確認できない場合は、物質IはP−糖タンパク質に対して阻害作用を有さない物質であることが分かる。このように、前記タンパク質複合体を使って、P−糖タンパク質阻害剤のスクリーニングができる。
【0071】
近年、P−糖タンパク質が細胞表面に多く発現したがん細胞は、抗がん剤をくみ出してしまうため効果が期待できないことが問題となっている。本発明に係る薬剤スクリーニング方法を利用することにより、P−糖タンパク阻害剤をスクリーニングすることができれば、該阻害剤と抗がん剤とを併用し、抗がん剤の効果発現を上昇させることができると考えられる。
【0072】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などに用いるタンパク質複合体は、発光性を示すタンパク質Xαと、該発光性タンパク質Xαからの所定波長の発光エネルギーにより別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Ygとからなるものであれば、特に限定されない。
【0073】
前記タンパク質複合体を構成する発光性タンパク質Xαは、発光性を示すタンパク質であれば特に限定されない。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0074】
また、前記タンパク質複合体を構成する蛍光性タンパク質Ygも、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(配列番号2)又はKaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(配列番号5)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0075】
本発明に係る生体マーキング方法や薬剤スクリーニング方法などを行う際、前記タンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター、及び該組み換えベクターを導入した細胞を利用して、生体内の所定の細胞又は組織へ前記タンパク質複合体を発現又は存在させることができる。
【0076】
更に、本発明では、発光性タンパク質Xαをコードする塩基配列を有するベクター、蛍光性タンパク質Ygをコードする塩基配列を有するベクター、及び発光基質Cα又は発光基質誘導体Cβを少なくとも含むキットを利用して、本発明に係る相互作用検出方法、タンパク質挙動追跡方法、生体マーキング方法、薬剤スクリーニング方法などを行うことができる。
【0077】
上記キットに用いる発光性タンパク質Xαは、発光性を有するタンパク質であれば特に限定されないが、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に基づく発光をするタンパク質であっても、自身が発光する発光タンパク質であってもよい。一例としては、ウミシイタケ由来のRenillaルシフェラーゼ(塩基配列番号6)が挙げられる。それ以外のルシフェラーゼとして、例えば、ホタル由来、クリックビートル由来、鉄道虫由来、ウミホタル由来などのルシフェラーゼなどを用いることも自由である。また、これらのタンパク質を所定波長の発光特性を有するように人工的に変異させた変異体を、発光性タンパク質Xβとして用いることも可能である。
【0078】
また、上記キットに用いる蛍光性タンパク質Ygも、発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギー転移に基づいて別の蛍光波長を発することができる構造変化又は蛍光を発することが可能な構造に変化するタンパク質であれば、特に限定されないが、例えばフォトコンバージョン又はフォトクロミズム、フォトアクチベーションなどの特性を有するタンパク質が好ましい。具体例を挙げると、フォトコンバージョンを起こすKaede(塩基配列番号7)又はKaedeの変異体(塩基配列番号8)、KikGR(塩基配列番号9)、PS−CFP、PS−CFP2、EosFP、mEosFPなど、又はフォトクロミズムを起こすDronpa(塩基配列番号10)、YFPなど、フォトアクチベーションを起こすPA−GFPなど、その他の蛍光性タンパク質としてBFP−aqなどが挙げられる。
【0079】
更に、上記キットに用いる発光基質Cα及び発光基質誘導体Cβは、発光性タンパク質Xαの発光特性を改変し得るものであれば特に限定されない。一例を挙げると、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式1参照)、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体などが挙げられる。
【実施例1】
【0080】
実施例1では、Kaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0081】
<材料および方法>
A.cDNAの調製
まず、蛍光タンパク質Kaedeの終止コドンの前に制限酵素Bgl IIによって認識される配列を挿入するため、オリゴDNA(配列番号11、第21番目から第40番目はKaedeをコードする部分)を合成した。合成したオリゴDNAとKaedeの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号12、第17番目から第36番目はKaedeをコードする部分)とを用いて、東洋紡社のKOD+によって30サイクルのPCR反応を行い、終止コドンを持たないKaedeをコードするDNA断片を調製した。別に、野生型遺伝子をコードするcDNAを、遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」に組み込んだベクターDNA用意した。ここで用いた遺伝子発現ベクター「pEB6CAG」とは、本願発明者が開発した、ヒト細胞中で安定に複製・維持される遺伝子発現ベクターである(Tanaka J, Miwa Y, Miyoshi K, Ueno A, Inoue H. Contruction of Epstein-Barr Virus-based expression vector containing mini-oriP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 938-943,1999)。そして、調整したDNA断片を制限酵素Age I -Not Iによって切断した後に、ベクターDNAの当該部位と置換した。次に制限酵素Bgl IIにて切断し、Kaede cDNAの上流側のBamHI認識部位を切断したものと連結して、2つのKaedeタンパク質がタンデムに連結したベクターを作成した。さらに制限酵素Bgl IIにて切断し、別に「pEB6CAG」に組み込んだRenillaルシフェラーゼをコードするcDNA断片の上流側のBamHI認識配列とタンパク質合成の翻訳の読み枠が合うように連結した(図11参照)。
【0082】
B.遺伝子発現ベクターの調製
構築した発現ベクターDNAは、Bio101社のRPMキットを用いて大腸菌から大量調製した。
【0083】
C.形質転換細胞の作製および選択
このDNA0.5μgをバイオラッド社のリポフェクション試薬TransFectinを用いてヒト細胞株HEp-2に導入し、4日間1.5 mg/ml G418存在下で培養して、DNAが導入された細胞だけを選択した。この細胞を発光・蛍光顕微鏡(オリンパス社)を用いて観察した。緑の蛍光の観察にはバンドパスフィルター530/30を、赤の蛍光観察にはバンドパスフィルター630/55を使用した。
【0084】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図12〜14は、Kaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0085】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図12参照)。
【0086】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分間の発光状態を撮影した。ほとんどの細胞で発光が起こっていることが確認された(図13参照)。
【0087】
20分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図14参照)。
【0088】
実施例1では、KaedeとRenillaルシフェラーゼとからなるタンパク質複合体に、発光基質誘導体であるDeepBlueCを添加することにより、外部からの光照射を行うことなく、タンパク質複合体を構成するKaedeの蛍光が緑から赤に変化した。従って、DeepBlueCの添加により、タンパク質複合体の内部において、Renillaルシフェラーゼから所定波長の発光エネルギーがKaedeに転移し、外部から光照射を行うことなく、Kaedeの発色団のタンパク質構造を変化させることが分かった。Kaedeの緑色の状態時の発色団の構造式を化学式3に、Kaedeの赤色の状態時の発色団の構造式を化学式4に示す。
【化3】
【化4】
【実施例2】
【0089】
実施例2では、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0090】
<材料および方法>
実施例1と同様の方法により、オリゴDNA(配列番号13、第10番目から第29番目はKikGRをコードする部分)とKikGRの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号14、第27番目から第38番目はKikGRをコードする部分)とを用いて、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【0091】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図15は、KikGR-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0092】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図15参照)。
【0093】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分後に再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図15参照)。
【実施例3】
【0094】
実施例3では、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合のDronpaの蛍光を発する状態への変化を検証した。
【0095】
<材料および方法>
実施例1と同様の方法により、オリゴDNA(配列番号15、第10番目から第30番目はDronpaをコードする部分)を合成した。合成したオリゴDNAとDronpaの開始コドン近傍の配列をもつオリゴDNA(配列番号16、第27番目から第38番目はDronpaをコードする部分)とを用いて、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNA断片を調製し、pEB6CAGベクターに組み込み細胞に導入した。
【0096】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図16は、Dronpa-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質において、初めはDronpaの緑の蛍光は検出されなかったが、RenillaルシフェラーゼのDeepBlueCを基質とした発光後には蛍光を示すようになった結果を示す図である。
【0097】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図16参照)。
【0098】
ここにDeepBlueCを終濃度10 μMになるように添加し、37℃で20分後に再び蛍光を観察したところ、多数の細胞において、緑の蛍光を示すようになったことが確認された(図16参照)。
【実施例4】
【0099】
実施例4では、Kaede-bZipとbZip-Renillaルシフェラーゼを別々の分子として同時に細胞に発現させた場合において、Renillaルシフェラーゼの基質を、セレンテラジン(Coelenterazine、化学式2参照)誘導体であるDeepBlueCとした場合の蛍光色変化を検証した。
【0100】
<材料および方法>
実施例1にて作成したKaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Nco I-Bgl IIによりKaedeのかわりにロイシンジッパーA配列をコードするDNA断片(配列番号17)を挿入し、ZipA-RenillaルシフェラーゼをコードするcDNAを調製し、これをpEB6CAG-SRZに組み込んだ。またKaede-Renillaルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするcDNAを用いて、制限酵素Bgl II-Not IによってRenillaルシフェラーゼをコードするDNA断片を除き、かわりにロイシンジッパーB配列をコードするDNA断片(配列番号18)をBamHI-Not Iで切断したものを挿入し、Kaede-ZipBをコードするcDNAがpEB6CAGに組み込まれている状態にした。
【0101】
<結果>
発光に伴う蛍光波長の変化の解析
図17は、Kaede-ZipB タンパク質とZipA-Renillaルシフェラーゼタンパク質を同時に細胞内に発現させたときに初めは緑の蛍光しか示さなかったKaedeが、ロイシンジッパー配列を介してRenillaルシフェラーゼと相互作用し、DeepBlueCを基質とした発光後には赤い蛍光も示すようになった結果を示す図である。
【0102】
発光基質であるDeepBlueCを添加する前は、緑の蛍光のみが観察され、赤い蛍光のシグナルはほとんど得られなかった(図17参照)。
【0103】
ここにDeepBlueCを終濃度5 μMになるように添加し37℃で10分後、さらに同量のDeepBlueCを追加して37℃で10分間反応させる操作を2回繰り返した。再び緑と赤の蛍光を観察したところ、多数の細胞において、赤い蛍光を示すようになったことが確認された(図17参照)。
【0104】
実施例4では、KaedeとRenillaルシフェラーゼを別々に発現させた場合にも、DeepBlueCの添加により、Kaedeが赤い蛍光を示すことが確認できた。従って、本発明に係る方法は、KaedeとRenillaルシフェラーゼを別々の物質にラベルし、DeepBlueCの添加によるKaedeの蛍光色を確認することで、該物質間の相互作用検出に利用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明に係る方法は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズムなどの特性を示す蛍光性タンパク質を、光照射を行うことなく、別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることができるため、生体内等でも外科的侵襲、光侵襲による悪影響を気にすることなく、安全に行うことができる。また、光照射に影響を受け易い物質であっても、前記タンパク質でラベルすることができる。
【0106】
更に、前記蛍光タンパク質は別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化したまま、その構造を維持するため、長時間、モニタリングし続ける必要がなく、相互作用検出や薬剤スクリーニングなどにおいて、大幅な時間短縮、コストダウンなどを実現できる。
【図面の簡単な説明】
【0107】
【図1】蛍光性タンパク質Ygを、発光性タンパク質Xβによって別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図2】人為的に波長βの発光を示す発光特性へ改変された発光性タンパク質Xβによって、蛍光性タンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造へ変化させる方法の概略図である。
【図3】図1とは異なるタンパク質Ygを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法の概略図である。
【図4】物質間の相互作用を、発光性タンパク質Xβ及び蛍光性タンパク質Ygを使って検出する方法の概念図である。
【図5】図4に示した物質間の相互作用の検出の一例を示す図である。
【図6】図4に示す方法を応用した物質間の相互作用検出方法の概念図である。
【図7】図6で示した概念の生態内での一例を示す図である。
【図8】物質間の相互作用前後の該物質の挙動を追跡する方法の概念図である。
【図9】本発明に係るタンパク質複合体を利用した生体マーキング方法の概念図である。
【図10】本発明に係るタンパク質複合体を利用した、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤スクリーニング方法の概念図である。
【図11】実施例1で作製したRenillaルシフェラーゼとKaedeの融合蛋白質を模式的に表した図である。
【図12】実施例1におけるDeepBlueCを添加する前のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【図13】実施例1におけるDeepBlueCを添加後、Renillaルシフェラーゼ発光中の図面代用写真である。
【図14】実施例1におけるRenillaルシフェラーゼ発光後のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【図15】実施例2におけるDeepBlueCを添加する前と後のKikGRの蛍光を示す図面代用写真である。
【図16】実施例3におけるDeepBlueCを添加する前と後のDronpaの蛍光を示す図面代用写真である。
【図17】実施例4におけるDeepBlueCを添加する前と後のKaedeの蛍光を示す図面代用写真である。
【符号の説明】
【0108】
Xα、Xβ、 蛍光性タンパク質Yg、Yr 蛍光性タンパク質
Cα 発光基質
Cβ 発光基質誘導体
A、B、D 物質
1 基板1
2 DNAプローブ
3 サンプル液
4 核酸
5 細胞
6 リガンド
【特許請求の範囲】
【請求項1】
発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、
外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法。
【請求項2】
前記発光性タンパク質Xは、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体によって、前記所定波長の発光を示す発光特性へ改変されたものであることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記発光基質は、次の化学式1のセレンテラジン(Coelenterazine)であることを特徴とする請求項2記載の方法。
【化1】
【請求項4】
前記発光基質誘導体は、次の化学式2のセレンテラジン(Coelenterazine)誘導体であることを特徴とする請求項2記載の方法。
【化2】
【請求項5】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体に、前記発光基質又は前記発光基質誘導体を作用させることで、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項6】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項7】
前記発光性タンパク質XはRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)であり、
前記蛍光性タンパク質YはKaede(配列番号2)、Kaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、Dronpa(配列番号5)の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項8】
請求項1記載の方法を用いて物質間の相互作用を検出することを特徴とする相互作用検出方法。
【請求項9】
前記相互作用は、発光性タンパク質Xによってラベルされた物質Aと蛍光性タンパク質Yによってラベルされた物質Bとの間の相互作用であることを特徴とする請求項8記載の相互作用検出方法。
【請求項10】
前記物質Aと前記物質Bとの間の相互作用は、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することによって作動するものであることを特徴とする請求項9記載の相互作用検出方法。
【請求項11】
リアルタイムにモニタリングを行うことなく、所定時間経過後に相互作用履歴が検出できることを特徴とする請求項8から10のいずれか一項に記載の相互作用検出方法。
【請求項12】
前記物質Aと前記物質Bとの相互作用又は前記物質Aあるいは前記物質Bに他の物質Cが相互作用することにより作動した前記物質Aと前記物質Bとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化した前記蛍光性タンパク質Yにラベルされた物質Bの細胞内での挙動を追跡することを特徴とするタンパク質挙動追跡方法。
【請求項13】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Xの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を前記生体内へ導入し、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させることによって、前記細胞又は組織をマーキングする方法。
【請求項14】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内へ存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Xの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入し、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させた後の前記蛍光性タンパク質Yの構造変化が起こっているかの有無を観察又は検出することによって行う、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項15】
発光性タンパク質Xと、
該発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Yと、
から構成されたタンパク質複合体。
【請求項16】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のタンパク質複合体。
【請求項17】
前記発光性タンパク質XはRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)であり、
前記蛍光性タンパク質YはKaede(配列番号2)、Kaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、Dronpa(配列番号5)の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のタンパク質複合体。
【請求項18】
請求項17記載のタンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター。
【請求項19】
請求項18記載の組み換えベクターを導入した細胞。
【請求項20】
Renillaルシフェラーゼをコードする塩基配列(配列番号6)を有するベクターと、
Kaede(配列番号7)、Kaedeの変異体(配列番号8)、KikGR(配列番号9)、Dronpa(配列番号10)の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、
Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項21】
請求項18記載の組み換えベクター又は請求項19記載の細胞と、
Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項1】
発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移に基づいて、
外部からの光照射を行うことなく、蛍光性タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させる方法。
【請求項2】
前記発光性タンパク質Xは、発光基質又はその化学構造を人為的に変化させた発光基質誘導体によって、前記所定波長の発光を示す発光特性へ改変されたものであることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記発光基質は、次の化学式1のセレンテラジン(Coelenterazine)であることを特徴とする請求項2記載の方法。
【化1】
【請求項4】
前記発光基質誘導体は、次の化学式2のセレンテラジン(Coelenterazine)誘導体であることを特徴とする請求項2記載の方法。
【化2】
【請求項5】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体に、前記発光基質又は前記発光基質誘導体を作用させることで、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化させることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項6】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項7】
前記発光性タンパク質XはRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)であり、
前記蛍光性タンパク質YはKaede(配列番号2)、Kaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、Dronpa(配列番号5)の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項8】
請求項1記載の方法を用いて物質間の相互作用を検出することを特徴とする相互作用検出方法。
【請求項9】
前記相互作用は、発光性タンパク質Xによってラベルされた物質Aと蛍光性タンパク質Yによってラベルされた物質Bとの間の相互作用であることを特徴とする請求項8記載の相互作用検出方法。
【請求項10】
前記物質Aと前記物質Bとの間の相互作用は、物質Aあるいは物質Bに他の物質Cが相互作用することによって作動するものであることを特徴とする請求項9記載の相互作用検出方法。
【請求項11】
リアルタイムにモニタリングを行うことなく、所定時間経過後に相互作用履歴が検出できることを特徴とする請求項8から10のいずれか一項に記載の相互作用検出方法。
【請求項12】
前記物質Aと前記物質Bとの相互作用又は前記物質Aあるいは前記物質Bに他の物質Cが相互作用することにより作動した前記物質Aと前記物質Bとの相互作用を細胞内で進行させ、該相互作用によって別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化した前記蛍光性タンパク質Yにラベルされた物質Bの細胞内での挙動を追跡することを特徴とするタンパク質挙動追跡方法。
【請求項13】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内に存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Xの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を前記生体内へ導入し、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させることによって、前記細胞又は組織をマーキングする方法。
【請求項14】
前記発光性タンパク質Xと前記蛍光性タンパク質Yとからなるタンパク質複合体を生体内の所定の細胞又は組織内へ存在又は発現させておき、
前記発光性タンパク質Xの発光波長を前記所定波長の発光波長へ改変させる発光基質又は発光基質誘導体を生体内へ導入し、前記タンパク質Yを別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造へ変化させた後の前記蛍光性タンパク質Yの構造変化が起こっているかの有無を観察又は検出することによって行う、生体内異物侵入の制御を担うタンパク質を対象とする機能阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項15】
発光性タンパク質Xと、
該発光性タンパク質Xからの所定波長の発光エネルギーの転移により別の蛍光波長を発することができる構造又は蛍光を発することが可能な構造に変化し得る蛍光性タンパク質Yと、
から構成されたタンパク質複合体。
【請求項16】
前記蛍光性タンパク質は、フォトコンバージョン又はフォトクロミズム特性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のタンパク質複合体。
【請求項17】
前記発光性タンパク質XはRenillaルシフェラーゼ(配列番号1)であり、
前記蛍光性タンパク質YはKaede(配列番号2)、Kaedeの変異体(配列番号3)、KikGR(配列番号4)、Dronpa(配列番号5)の中から選択された一のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のタンパク質複合体。
【請求項18】
請求項17記載のタンパク質複合体をコードする塩基配列を少なくとも有する組み換えベクター。
【請求項19】
請求項18記載の組み換えベクターを導入した細胞。
【請求項20】
Renillaルシフェラーゼをコードする塩基配列(配列番号6)を有するベクターと、
Kaede(配列番号7)、Kaedeの変異体(配列番号8)、KikGR(配列番号9)、Dronpa(配列番号10)の中から選択された一のタンパク質をコードする塩基配列を有するベクターと、
Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【請求項21】
請求項18記載の組み換えベクター又は請求項19記載の細胞と、
Renillaルシフェラーゼの発光特性を改変し得る発光基質又は発光基質誘導体と、
を少なくとも含むキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【公開番号】特開2007−325538(P2007−325538A)
【公開日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−159120(P2006−159120)
【出願日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【出願人】(504171134)国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】(506195790)Amalgaam有限会社 (2)
【Fターム(参考)】
【公開日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【国際特許分類】
【出願日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【出願人】(504171134)国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】(506195790)Amalgaam有限会社 (2)
【Fターム(参考)】
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