血小板の生存を延長するための組成物および方法
本発明は、減少した血小板クリアランスを有する修飾血小板および血小板クリアランスを減少させる方法を提供する。本発明はまた、血小板の保存のための組成物を提供する。本発明はまた、修飾血小板を含有する医薬組成物を作る方法および止血を調節するために哺乳動物に医薬組成物を投与するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血小板のクリアランスを減少させるおよび血小板の生存を延長するための組成物および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血小板は、血管損傷位置への付着および血漿フィブリン塊の形成の促進により、損傷した哺乳動物を失血から保護する無核の骨髄由来の血液細胞である。骨髄機能不全により血小板の循環が激減したヒトは、生命にかかわる特発性出血を患い、および重症度の低い血小板欠損症は、外傷または手術に次ぐ出血合併症の一因となる。
【０００３】
７０，０００個／μＬ以下への循環血小板数の減少は、標準皮膚出血時間試験の延長をもたらし、そして出血間隔は長くなり、血小板数がゼロまで減少するにつれて無限大近くになると推定されることが、報告されている。血小板数が２０，０００個／μＬ未満の患者は、特に血小板減少症が骨髄機能不全によって引き起こされるときおよび罹患した患者が敗血症または他の障害により破壊されたとき、粘膜の表面からの特発性出血を非常に起こしやすいと考えられている。再生不良性貧血、急性および慢性白血病、転移癌だが特に電離放射線および化学療法による癌処置がもたらした転移癌などの骨髄疾患に関連する血小板欠損症は、主要な公衆衛生問題を表す。主要な手術、障害および敗血症に関連する血小板減少症もまた、かなりの数の血小板輸血の投与に帰結する。
半世紀前の医療における大きな進展は、かかる血小板欠損症を治療するための血小板輸血の開発であり、９００万件を超える血小板輸血が、１９９９年に米国単独で行なわれた(Jacobs et al., 2001)。血小板は、しかしながら、すべての他の移植可能な組織とは違って、非常に短期間の冷却の対象となる場合でも血小板は受容者(recipient)の循環から急速に消滅し、血小板の生存を短縮させる冷やす(cooling)効果は不可逆であるため、冷蔵に耐容性がない(Becker et al., 1973; Berger et al., 1998)。
【０００４】
その結果生じる、輸血前にこれらの細胞を室温で保持する必要性は、血小板貯蔵のために、独特な一連の費用がかかり複雑な物流の必要条件を強いてきた。血小板は、室温で活発に代謝するため、代謝性アシドーシスの有毒な結果を防ぐために、発生したＣＯ２の放出を可能にし、血小板は多孔性容器内での持続的攪拌を要求する。室温貯蔵条件は、「貯蔵損傷」として知られる一連の欠陥である、高分子の分解および血小板の止血機能の低下をもたらす(Chemoff and Snyder, 1992)。しかし、短い（５日）制限へと至らしめる室温貯蔵についての主要な問題は、より高い細菌感染の危険性である。血液成分の細菌汚染は現在、最も頻繁に起こる血液成分使用の感染性合併症であり、ウィルス媒介のそれをはるかに超える(Engelfriet et al., 2000)。米国においては、年間３０００〜４５００件の細菌敗血症の症状が、細菌汚染された血液成分が原因で生じる(Yomtovian et al., 1993)。
【０００５】
血小板の独特な不可逆的低温不耐性の根底にある機構は、生理学的重要性を有しているため、謎であった。循環血小板は、血管損傷と反応すると、複雑な形態へと変形する滑らかな表面の円盤である。４０年以上前、研究者達は、円盤状の血小板もまた、冷蔵温度で形態が変化することに注目した(Zucker and Borrelli, 1954)。円盤状の形態が室温で貯蔵した血小板の生存度の最良の予測の判断材料であるというその後の証拠は(Schlichter and Harker, 1976)、低温誘発された形態は本質的に、冷却した血小板の急速なクリアランスに関与するという結論を導き出した。おそらく冷やすことにより変形した不規則な形をした血小板は、微小循環内で捕捉されるようになったのであろう。
【０００６】
シグナル伝達をリガンドにより誘発される血小板の形態変化へと至らしめる機構と結びつける我々の研究を基に(Hartwig et al., 1995)、我々は、冷却は、カルシウムの放出を阻害することにより、アクチンフィラメントを切断し、アクチンフィラメントの反矢じり端(barbed end)をキャッピングするタンパク質であるゲルゾリンの活性化と一致する程度にカルシウムレベルを上昇させるだろうと予測した。我々はまた、低温での膜脂質相転移は、ホスホイノシチドをクラスター化するだろうと判断した。ホスホイノシチドクラスタリングは、アクチンフィラメント反矢じり端をアンキャッピングし(uncap)(Janmey and Stossel, 1989)、フィラメント伸長のための核形成部位を作り出す。我々は、両方の機構の実験的証拠を生み出し、ゲルゾリンの活性化、アクチンフィラメント反矢じり端のアンキャッピング、および冷やした血小板におけるアクチンの集合を立証した(Hoffmeister et al., 2001; Winokur and Hartwig, 1995)。
【０００７】
他者は、膜相転移と一致する冷却した血小板における分光変化を報告している者もいる(Tablin et al., 1996)。この情報は、カルシウムの上昇を阻害するために細胞透過性カルシウムキレート剤を用い、そして反矢じり端のアクチンの集合を阻止するためにサイトカラシンＢを用いて、冷却した血小板の円盤状の形態を保存するための方法を提案した。これらの剤の添加は、４℃で血小板を円盤状の形態に保持するが(Winokur and Hartwig, 1995)、我々が本明細書において報告するように、かかる血小板はまた、急速に循環から一掃される。したがって、冷却した血小板の急速なクリアランスの問題が残り、血小板についての循環時間ならびに貯蔵時間を増加する方法が必要である。
【０００８】
発明の概要
本発明は、減少した血小板クリアランスを有する修飾血小板および血小板クリアランスを減少させる方法を提供する。本発明はまた、血小板の保存のための組成物を提供する。本発明はまた、修飾血小板を含有する医薬組成物を作る方法および止血を媒介する(mediate)ために哺乳動物に医薬組成物を投与するための方法を提供する。
【０００９】
ヒト血小板の冷却は、血小板表面上のフォンヴィルブランド(von Willebrand)因子（ｖＷｆ）受容体複合体αサブユニット（ＧＰＩｂα）の複合体のクラスタリングを引き起こすことが現在発見されている。血小板表面上のＧＰＩｂα複合体のクラスタリングは、in vitroおよびin vivoでマクロファージ補体タイプ３受容体（αＭβ２、ＣＲ３）による認識を引き出す。ＣＲ３受容体は、ＧＰＩｂα複合体の末端βＧｌｃＮＡｃによりＮ結合糖類を認識し、血小板を貪食し(phagocytose)、循環から血小板を一掃し、止血機能の付随的損失をもたらす。
【００１０】
本出願人は、ＧＰＩｂαの暴露されたβＧｌｃＮＡｃの残基を糖化へと至らしめると信じられている特定の糖分子による血小板の処置は、血小板クリアランスを減少させ、血小板食作用を妨害し、血小板循環時間を増加させ、および血小板貯蔵時間を増加させたことを発見した。
【００１１】
本発明の一側面は、血小板の集団の循環時間を増加させる方法を提供する。該方法は、単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１２】
いくつかの態様において、本方法は、グリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することをさらに含む。グリカン部分の修飾を触媒する酵素の一例は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。
好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００１３】
いくつかの態様において、血小板の集団の循環時間を増加させる方法は、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に血小板の集団を冷却することをさらに含む。
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
いくつかの態様において、循環時間は少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上増加する。
【００１４】
本発明の別の側面によると、血小板の貯蔵時間を増加させる方法を提供する。該方法は、単離された血小板の集団を前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤の量と接触させること、および血小板の集団を貯蔵することを含む。
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１５】
いくつかの態様において、本方法は、血小板の表面上のグリカンへのグリカン修飾剤の添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む。好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
いくつかの態様において、本方法は、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる。
血小板を少なくとも約３日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または少なくとも約２８日間冷却貯蔵する。
【００１７】
本発明の別の側面によると、修飾血小板を提供する。
該修飾血小板は、血小板の表面上に複数の修飾グリカン分子を含む。
いくつかの態様において、修飾グリカン分子は、ＧＰＩｂα分子の部分である。該修飾グリカン分子は、少なくとも１種の添加した糖分子を含む。
添加した糖は、天然の糖であってよく、または非天然の糖であってもよい。
添加した糖の例は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体を含むが、これらに限定されない。好ましい態様の一つにおいて、添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１８】
別の側面において、本発明は複数の修飾血小板を含む血小板組成物を提供する。いくつかの態様において、血小板組成物は貯蔵培地をさらに含む。いくつかの態様において、血小板組成物は、薬学的に許容しうる担体をさらに含む。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によると、哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法を提供する。該方法は、
（ａ）薬学的に許容しうる担体中に含有された血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させ、処置した血小板製剤を形成するステップ、
（ｂ）処置した血小板製剤を貯蔵するステップ、および
（ｃ）処置した血小板製剤を加温するステップ
を含む。
いくつかの態様において、処置した血小板製剤を加温するステップは、血小板を３７℃に加温することにより行なわれる。
【００２０】
いくつかの態様において、薬学的に許容しうる担体に含まれた血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、グリカン部分の修飾を触媒する酵素の存在下で、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、本方法は、血小板製剤中の酵素を除去または不活性化する、例えば血小板製剤を洗浄する方法をさらに含む。
グリカン修飾剤の例を上に記載する。好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。いくつかの態様において、本方法は、グリカン修飾剤のグリカン部分への添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む。
好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００２１】
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
特定の態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
いくつかの態様において、血小板製剤を約１５℃未満の温度で貯蔵する。いくつかの他の態様において、血小板製剤を室温で貯蔵する。
【００２２】
本発明のさらに別の側面によると、哺乳動物において止血を媒介する方法を提供する。本方法は、哺乳動物へ複数の修飾血小板または修飾血小板組成物を投与することを含む。
本発明のまたさらに別の側面によると、血小板を保存するための貯蔵組成物を提供する。該組成物は、貯蔵組成物に添加した血小板の貯蔵時間および／または循環時間を増加させるために、貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、組成物はグリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、組成物を約１５℃未満の温度で貯蔵する。いくつかの他の態様において、組成物を室温で貯蔵する。
【００２３】
本発明の別の側面によると、血小板を収集する(および随意に加工する)ための容器を提供する。本容器は、貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、本容器はグリカン修飾剤によりグリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、本容器は複数の血小板または複数の血小板を含む血漿をさらに含む。
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、自然発生の血小板中より高い濃度で存在する。
【００２４】
本発明のまたさらに別の側面によると、血小板を収集および加工するための装置を提供する。本装置は、血小板を収集するための容器；前記容器との液体伝達における少なくとも１つのサテライト(satellite)容器；およびサテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、サテライト容器中のグリカン修飾剤は、容器中の血小板を保存するのに十分な量で存在する。
いくつかの態様において、サテライト容器中のグリカン修飾剤は、破壊可能なシールにより容器への流入を阻止される。
【００２５】
本発明のこれらのおよび他の側面、ならびに様々な利点および有用性は、以下の発明の詳細な説明を参考により明確になるだろう。本発明の各限定は、本発明の様々な態様を包含することができる。したがって、いずれか一要素または要素の組み合わせを含む各限定を、本発明の各側面に含むことができることが予想される。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１Ａは、室温の血小板、ならびにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢの存在下または非存在下で、冷却し再加温した血小板の、マウスにおける循環時間を示す。曲線は、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）で標識された、室温（ＲＴ）の血小板、氷浴の温度（Ｃｏｌｄ）で冷却し注射前に室温まで再加温した血小板、ならびに血小板の円盤状の形態を保存するためにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢで処置した、冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ＋ＣｙｔｏＢ／ＥＧＴＡ）の生存率を表す。各曲線は、６匹のマウスの平均±ＳＤを表す。同一のクリアランス傾向が、１１１インジウム標識血小板で観察された。
【００２７】
図１Ｂは、in vitroで正常に凝集する冷却した血小板を示す。洗浄した、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）または室温（ＲＴ）の野生型の血小板を、３７℃で示したアゴニストの添加により刺激し、光透過率を、標準の血小板凝集計で記録した。ＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢで処置した冷却した血小板の凝集反応は、未処置の冷却した血小板と同一だった。
【００２８】
図１Ｃは、低温誘発クリアランスが主にマウスの肝臓内で生じることを示す。肝臓は、冷却した血小板の主要クリアランス器官であり、注入した血小板を６０〜９０％含む。一方、ＲＴ血小板は、脾臓内でよりゆっくりと一掃される。１１１インジウム標識血小板を同系のマウスに注入し、組織を０．５、１および２４時間目に採取した。データをグラムあたりの組織で表現する。各棒(bar)は、４匹の分析した動物の平均値±ＳＤを表す。
【００２９】
図１Ｄは、冷却した血小板は、肝類洞(hepatic sinusoidal)マクロファージ（クッパー細胞）と共局在する(co-localize)ことを示す。この代表的な共焦点顕微鏡写真は、輸血の１時間後に、肝小葉の門脈周囲領域および中間帯領域(midzonal field)に優先的に蓄積する、ＣＭＦＤＡ標識された、冷却し再加温した血小板（緑）の肝分布を示す。クッパー細胞を、ナイルレッドで標識された球体の注射後に視覚化する。重ね合わせた顕微鏡写真は、冷却した血小板およびマクロファージの共局在を黄色で示す。小葉組織を示す。（ＣＶ：中心静脈；ＰＶ：門脈、バー：１００μｍ）。
【００３０】
図２は、冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で正常に循環するが、補体３（Ｃ３）またはｖＷｆ欠損マウス内で循環しないことを示す。ＣＭＦＤＡ標識された、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）および室温の（ＲＴ）野生型の血小板を、同系の野生型の（ＷＴ）、ＣＲ３欠損の（Ａ）、ｖＷｆ欠損の（Ｂ）およびＣ３欠損の（Ｃ）受容(recipient)マウスそれぞれ６匹に輸血し、それらの生存時間を決定した。冷却した血小板は、室温の血小板と同じ動態でＣＲ３欠損動物内を循環するが、Ｃ３欠損のマウスまたはｖＷｆ欠損のマウスの循環から急速に一掃される。データは、６匹のマウスについての平均±ＳＤである。
【００３１】
図３は、冷却した血小板がin vivoでＣＲ３を発現するマウスマクロファージにしっかりと付着することを示す。図３Ａ−冷却し再加温したＴＲＩＴＣ標識血小板（左のパネル）が、室温のＣＭＦＤＡ標識血小板（右のパネル）よりも、３〜４倍の高い頻度で肝類洞に付着する。生体蛍光顕微鏡写真を、血小板の注入３０分後に得た。図３Ｂ−冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ、中抜きの棒）および室温の血小板（ＲＴ、中塗りの棒）は、野生型のマウスと類似した分布で高マクロファージ密度（中間帯）の類洞部位に付着する。図３Ｃ−冷却し再加温した血小板は、野生型の肝臓内のマクロファージに、室温の血小板よりも３〜４倍多く付着する（中抜きの棒）。一方、冷却し再加温したまたは室温の血小板は、ＣＲ３欠損マウス内のマクロファージに対して同一の付着度を有する（中塗りの棒）。野生型のマウスによる９回の実験およびＣＲ３欠損マウスによる４回の実験を示す（平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５：＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００３２】
図４は、ＧＰＩｂαは冷却した血小板クリアランスを仲介し、低温で凝集するが、冷却した血小板において活性化したｖＷｆに正常に結合することを示す。図４Ａ−ＧＰＩｂα細胞外ドメインを酵素的に除去したＣＭＦＤＡ標識血小板（左のパネル、挿入図、中塗りの領域）または対照の血小板を、室温で保持した（左のパネル）、または冷却し再加温した（右のパネル）、同系の野生型のマウスに注入し、血小板の生存率を決定した。各生存率曲線は、６匹のマウスについての平均値±ＳＤを表す。図４Ｂ−冷却した血小板、またはＲＴの多血小板血漿を、ボトロセチンで処置した（影の領域）または処置しなかった（中抜きの領域）。ｖＷｆ結合は、ＦＩＴＣ標識抗ｖＷｆ抗体を用いて検出した。図４Ｃ−ｖＷｆ受容体は、冷却したマウス血小板の表面上で線形配列（ＲＴ）から凝集体（Ｃｈｉｌｌｅｄ）へ再分布する。固定し、冷却し再加温した、または室温の血小板（ＲＴ）を、ラットモノクローナル抗マウスＧＰＩｂα抗体、次いでヤギ抗ラットＩｇＧで被覆した１０ｎｍコロイド金粒子と共にインキュベートした。バーは１００ｎｍである。挿入図：低倍率の血小板。
【００３３】
図５は、ＧＰＩｂα−ＣＲ３相互作用が、in vitroで冷却したヒト血小板の食作用を仲介することを示す。図５Ａおよび図５Ｂは、室温（ＲＴ）の血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図５Ａ）または冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図５Ｂ）の典型的なアッセイ結果を示す。マクロファージに関連するCM-Orange標識血小板は、オレンジ蛍光をｙ軸上方向にシフトする。室温で保持した血小板と共にインキュベートしたCM-Orange陽性の天然のマクロファージの平均比率を、１に標準化した。血小板の冷却は、このシフトを〜４％から２０％増加させる。血小板は、ＣＤ６１にＦＩＴＣ結合ｍＡｂで二重標識しないため、主に摂取される。
【００３４】
図５Ｃは、未分化（中抜きの棒）ＴＨＰ−１細胞はＣＲ３を約５０％少なく発現し、冷却し再加温した血小板の半分程度を摂取する。しかしながら、ＣＲ３発現の分化（中塗りの棒）は、ＲＴ血小板の摂取について有意な効果はなかった。ＧＰＩｂαのＮ末端をヒト血小板の表面から除去するヘビ毒メタロプロテアーゼ、モカラギン（Ｍｏｃ）によるヒト血小板の処置（挿入図；対照：実線、モカラギン処置した血小板：影の領域）は、冷却した血小板の食作用を約９８％減少させた。示したデータは、５回の実験の平均±ＳＤである。
【００３５】
図６は、循環する、冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて止血機能を有することを示す。ＣＭＦＤＡ標識自己血小板の注入の２４時間後に、創傷から生じた血小板凝集体内に存在するそれらの同等物により決定されるように、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板（図６Ａおよび６Ｂ）、およびＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板（図６Ｃおよび６Ｄ）の正常なin vivo機能。末梢血（図６Ａおよび６Ｃ）および創傷から生じる血液（流血、図６Ｂおよび６Ｄ）を、全血フローサイトメトリーにより分析した。
【００３６】
血小板を、前方光散乱特性およびＰＥ結合抗ＧＰＩｂα ｍＡｂ（ｐＯｐ４）の結合により確認した。注入した血小板（点）を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光により確認し、非注入の血小板（輪郭線）を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光の欠如により確認した。末梢全血サンプルにおいて、分析部位をＧＰＩｂα陽性粒子周辺に描き、９５％の集団を前方散乱軸（領域１）に包含し、この前方光散乱閾値より上に現れる５％粒子を、凝集体と定義した（領域２）。比率は、ＣＭＦＤＡ陽性血小板により形成された凝集体の数を意味する。この示した結果は、４回の実験の典型的なものである。
【００３７】
図６Ｅは、注入の２４時間後に、マウスから抜いた血液のトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）活性化に続くＰ−セレクチンおよびフィブリノゲン結合の暴露により決定されるように、野生型のマウスに輸血した、CM-Orangeの、室温の（ＲＴ）血小板およびＣＲ３欠損マウスに輸血した、CM-Orangeの、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板のex vivo機能を示す。CM-Orange標識血小板は、ＣＭＦＤＡ標識血小板と同程度の循環半減時間を有する（未掲載）。輸血した血小板を、それらのCM-Orange蛍光により確認した（中塗りの棒）。輸血せず（非標識）分析した血小板は、中抜きの棒として表す。結果は、Ｐ−セレクチンおよびフィブリノゲン陽性部位（領域２）に存在する細胞の比率として表現する。データは、４匹のマウスについての平均±ＳＤである。
【００３８】
図７は、２種類の血小板クリアランス経路を描写する図である。血小板は、中央および末梢循環を横断し、体の表面でより低温で可逆プライミング(priming)を遂げる。反復プライミングは、補体受容体タイプ３（ＣＲ３）を生じる肝マクロファージにより、不可逆的なＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ（ｖＷｆＲ）受容体複合体の再構成およびクリアランスへと至らしめる。血小板はまた、微小血管凝固に関与した後、一掃される。
【００３９】
図８は、冷却した血小板の食作用への単糖類の効果を示す。
図９は、ＷＧＡレクチンの室温の血小板または冷却した血小板への結合のドットプロットを示す。
図１０は、室温のまたは冷却した血小板へ結合した様々なＦＩＴＣ標識レクチンの分析を示す。
【００４０】
図１１Ａは、β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得られた、室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡの結合の概要を示す。
図１１Ｂは、血小板表面からのＧＰＩｂαの除去が、冷却した血小板に結合したＦＩＴＣ−ＷＧＡを減少させたことを示す。
図１２は、血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送が、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を減少させるが、室温の（ＲＴ）血小板の食作用には影響しないことを示す。
図１３は、未処理の血小板に対する、冷却し、ガラクトシル化した(galactosylated)マウス血小板の生存率を示す。
【００４１】
図１４は、その表面にガラクトーストランスフェラーゼを含有する血小板は、ＷＧＡ結合により判断されたように、トランスフェラーゼの添加なしでガラクトースを輸送すること（図１４Ａ）、およびヒト血小板についてのin vitro食作用の結果（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｃは、マウス血小板の生存率におけるガラクトーストランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）ありまたはなしでのＵＤＰ−ガラクトースの効果を示す。ＧａｌＴを含むまたは含まないＵＤＰ−ガラクトースを、冷却前に３７℃で３０分間マウス血小板に添加した。血小板を氷浴内で２時間冷却し、その後マウスに輸血し（１０８個の血小板／マウス）、それらの生存を決定した。
【００４２】
図１５は、ヒト血小板への１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの取り込みの経時変化を示す。
図１６は、ＵＤＰ−ガラクトースの異なる濃度での４種類の血小板濃度サンプル中の血小板のガラクトシル化(galactosylation)を示す。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、循環特性を高め、 実質的に正常なin vivo止血作用を保持する修飾血小板の集団を提供する。止血作用は、出血停止を媒介するための血小板の集団の能力に広く言及する。様々なアッセイが、血小板止血作用を決定するために利用可能である(Bennett, J. S. and Shattil, S. J., 1990, "Platelet function," Hematology, Williams, W. J., et al., Eds. McGraw Hill, pp 1233-12250)。しかしながら、「止血」または「止血作用」の証明は、最終的に血小板減少性のまたは血小板症の(thrombopathic)(すなわち、非機能の血小板)動物またはヒトへ注入した血小板が循環し、天然のまたは実験的に誘発した出血を止めることの証明が必要である。
【００４４】
そのような証明の不足のため、実験室において止血作用を決定するための代用物として、in vitro試験を使用する。これらの試験は、凝集、分泌、血小板の形態および代謝性の変化のアッセイを含有し、活性化への多種多様な血小板の機能的反応を測定する。当該分野では、in vitro試験が、in vivoにおける止血機能を合理的に示すことは、一般的に受け入れられている。
実質的に正常な止血作用は、新しく単離した血小板の集団の止血作用とだいたい同じである止血作用の量を意味する。
【００４５】
本発明は、血小板の集団の循環時間を増加させる方法および血小板の貯蔵時間を増加させる方法を提供する。また、本発明は、保存した止血作用による血小板の保存のための血小板組成物方法および組成物、ならびに保存した血小板を含有する医薬組成物を作る方法および止血を媒介するために哺乳動物に医薬組成物を投与する方法を提供する。
【００４６】
本発明の一側面において、単離された血小板の集団の循環時間を増加させる方法は、単離された血小板の集団を血小板の集団のクリアランスを減少させるために効果的な量で少なくとも１種のグリカン修飾剤に接触させることを伴う。本明細書において、血小板の集団は、１個または２個以上の血小板を意味する。血小板の集団は、血小板製剤を含有する。用語「単離された」とは、血小板の天然の環境から分離されたおよび血小板の同定または使用を可能にするのに十分な量が存在することを意味する。血小板の集団に関して、本明細書において、単離されたとは、血液循環から除去されたことを意味する。血小板の集団の循環時間は、血小板の半分がもはや循環しない時間と定義される。本明細書において、「クリアランス」とは、血液循環からの血小板の除去を意味する（マクロファージ食作用によるなど）。
【００４７】
グリカン修飾剤は、マクロファージにより認識される末端グリカン残基を、マクロファージが血小板をもはや貪食しないように、好ましくはＧＰＩｂαにおいて修飾する剤を意味する。本明細書において、「グリカン」または「グリカン残基」は、血小板の表面の多糖部分である。「末端」グリカンまたはグリカン残基は、多糖類の末端にあるグリカンであり、典型的には、血小板表面のポリペプチドに結合している。
【００４８】
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−ガラクトース）およびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。ＵＤＰ−ガラクトースは、ガラクトース代謝における中間体であり、ＵＤＰ−ガラクトースを作るために、ガラクトース−１−リン酸と交換にＵＤＰ−グルコースからグルコース−ｌ−リン酸の遊離を触媒する酵素である、ＵＤＰ−グルコース−α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼにより形成される。ＵＤＰ−ガラクトースの合成方法および生産方法は、当該技術分野で周知であり、文献に記載されている（例えば、Liu et al, ChemBioChem 3, 348-355, 2002; Heidlas et al, J. Org. Chem. 57, 152-157; Butler et al, Nat. Biotechnol. 8, 281-284, 2000; Koizumi et al, Carbohydr. Res. 316, 179-183, 1999; Endo et al, Appl. Microbiol., Biotechnol. 53, 257-261, 2000参照）。ＵＤＰ−ガラクトース前駆体は、分子、化合物、または中間体化合物であり、ＵＤＰ−ガラクトースに（例えば、酵素的にまたは生化学的に）変換してもよい。ＵＤＰ−ガラクトース前駆体の一つの非限定の例は、ＵＤＰ−グルコースである。ある態様において、ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素を、反応混合物に添加する（例えば血小板用容器内で）。
【００４９】
グリカン修飾剤の効果的な量は、循環時間を増加させるおよび／または、血小板表面上のグリカン残基の十分な数の修飾により血小板の集団のクリアランスを減少させる、グリカン修飾剤の量を意味する。
【００５０】
ＵＤＰ−ガラクトースによる血小板の修飾は、以下のように行なうことができる。血小板の集団を、異なる濃度（１〜１０００μＭ）のＵＤＰ−ガラクトースと共に、少なくとも１、２、５、１０、２０、４０、６０、１２０、１８０、２４０、または３００分間、２２℃〜３７℃でインキュベートする。いくつかの態様において、０．１〜５００ｍＵ／ｍｌのガラクトーストランスフェラーゼを、血小板の集団に添加する。ガラクトース輸送は、ＦＩＴＣ−ＷＧＡ（小麦胚凝集素）結合を用いて機能的に観察することができる。グリカン修飾反応の目標は、ＷＧＡ結合を休止している室温ＷＧＡ結合レベルに減少させることである。ガラクトース輸送は、１４Ｃ−ＵＤＰ−ガラクトースを用いて数量化することができる。非放射性ＵＤＰ−ガラクトースを１４Ｃ−ＵＤＰ−ガラクトースと混合し、適切なガラクトース輸送を得る。輸送反応は、上記のように行なわれる。血小板を何度も洗浄し、取り込まれた放射活性をγカウンターを用いて測定する。測定したｃｐｍは、取り込まれたガラクトースの計算を可能にする。
【００５１】
本明細書において、血小板の集団のクリアランスは、単位時間あたり単位体積の血液または血清からの血小板の集団の除去を意味する。血小板の集団のクリアランスを減少させることは、血小板の集団のクリアランスを阻止、遅延、または減少させることを意味する。血小板のクリアランスを減少させることはまた、血小板クリアランス率を減少させることを意味してもよい。
【００５２】
血小板のクリアランスを減少させることは、室温貯蔵後、または冷却貯蔵後、血小板クリアランスを減少させることならびに「低温誘発性血小板活性化」を包含する。低温誘発性血小板活性化は、当業者にとって特別な意味を有する用語である。低温誘発性血小板活性化は、血小板形態における変化により現れてもよく、血小板形態における変化のいくつかは、例えば、ガラスとの接触により、以下の血小板活性化をもたらす変化と似ている。低温誘発性血小板活性化を示す構造的変化は、光学顕微鏡または電子顕微鏡などの技術を用いて最も簡単に確認される。分子レベルでは、低温誘発性血小板活性化は、アクチン束の形成をもたらし、細胞内カルシウム濃度の増加が続く。アクチン束の形成は、例えば、電子顕微鏡を用いて検出される。細胞内カルシウム濃度の増加は、例えば、蛍光細胞内カルシウムキレート剤を用いることにより決定される。アクチンフィラメント切断を阻害するための上記のキレート剤の多くはまた、細胞内カルシウムの濃度を決定するのに有用である（Tsien, R., 1980, supra.）。したがって、様々な技術が、血小板が低温誘発性活性化を経験したかどうか決定するために利用可能である。
【００５３】
ガラクトースの取り込みの血小板クリアランスへの効果を、例えば分化したＴＨＰ−１細胞を用いるin vitroシステムまたはチオグリコレート注射の刺激後、腹膜腔から単離されたマウスマクロファージを使用して、測定することができる。未修飾血小板と比較した修飾血小板のクリアランス率を決定する。これらのin vitro方法において、ガラクトース輸送は、血小板を修飾するために、上記手順にしたがって行われる。そして修飾血小板はマクロファージに貪食され、マクロファージによる血小板の摂取を観察する。in vitroアッセイは、ガラクトース輸送は、ヒト血小板のように、マウスの冷却した血小板の摂取の減少をもたらすかどうかを示す。
【００５４】
いくつかの態様において、血小板の集団の循環時間を増加させる方法はさらに、グリカン修飾剤と共にグリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することを含む。グリカン部分の修飾を触媒する酵素の一例は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースと共にＧＰＩｂα分子の糖化を触媒する。
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
【００５５】
本発明によると、血小板の冷却で通常経験する悪影響（低温誘発性血小板活性化）を及ぼさず、血小板の集団を冷却することができる。血小板の集団を、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に冷却することができる。グリカン部分の選択的修飾は、冷却後（冷却しない場合もまた）、クリアランスを減少させ、したがって、現在可能な期間よりも長期間貯蔵が可能になる。本明細書において、冷却は、血小板の集団の温度を約２２℃未満の温度に低下させることを意味する。いくつかの態様において、血小板を約１５℃未満の温度に冷却する。いくつかの好ましい態様において、血小板を約０℃から約４℃の間の範囲の温度に冷却する。いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも３日間冷却貯蔵する。
【００５６】
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも５、７、１０、１４、２１、および２８日間冷却貯蔵する。
本発明のいくつかの態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約１０％増加する。いくつかの他の態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約２５％増加する。さらにいくつかの他の態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約５０％増加する。またさらに他の態様において、血小板の集団の循環時間は、約１００％増加する。本明細書において、血小板の集団の循環時間は、血小板の半分がもはや循環しない時間と定義される。
【００５７】
本発明はまた、血小板の貯蔵時間を増加させる方法を包含する。本明細書において、血小板の貯蔵時間は、血小板が、循環する能力の損失などの血小板機能または止血作用の相当な損失がなく貯蔵することができる時間と定義される。例えば、貯蔵後循環する能力は、約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％未満減少する。
血小板は、当業者に既知の標準の技術により、末梢血から採集することができる。いくつかの態様において、血小板は、グリカン修飾剤による処置の前に、薬学的に許容しうる担体に含まれる。
【００５８】
本発明の別の側面によると、修飾血小板または修飾血小板の集団を提供する。修飾血小板は、血小板の表面上に複数の修飾グリカン分子を含む。いくつかの態様において、修飾グリカン部分は、ＧＰＩｂα分子の部分でもよい。修飾グリカン分子は、少なくとも１種類の添加した糖分子を含む。添加した糖は、天然の糖または非天然の糖でよい。
【００５９】
本発明はまた、貯蔵培地中の血小板組成物を包含する。いくつかの態様において、貯蔵培地は、薬学的に許容しうる担体を含む。
用語「薬学的に許容しうる」は、血小板の生物作用の有効性を妨げない非毒性の材料および細胞、細胞培養、組織、または生物などの生物系と適合する非毒性の材料を意味する。薬学的に許容しうる担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野で周知の他の材料を含む。
【００６０】
本発明は、哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法をさらに包含する。該方法は、上述の血小板製剤の製造および血小板製剤の加温を含む。いくつかの態様において、該方法は、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素を不活性化することおよび薬学的に許容しうる担体内に不活性化した血小板製剤を入れることを含む。好ましい態様において、冷却した血小板は、不活性化の前に室温（約２２℃）まで加温する。いくつかの態様において、血小板は、グリカン部分の修飾をおよび触媒する酵素と共に／共にではなく、グリカン修飾剤と接触する前に、薬学的に許容しうる担体内に含まれ、不活性化の後に薬学的に許容しうる担体内に血小板製剤を入れる必要はない。
【００６１】
本明細書において、用語「不活性化する」または「不活性化」は、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素が、実質的に血小板のグリカン残基のグリカンを修飾できないようにされるプロセスを意味する。いくつかの態様において、冷却した血小板は、例えば、赤血球の懸濁液による希釈により不活性化される。あるいは、処置した血小板は、受容者へ注入することができ、これは赤血球懸濁液への希釈と同等である。この不活性化の方法は、閉鎖システムを有利に維持し、血小板への損傷を最小限に抑える。グリカン修飾剤の好ましい態様において、不活性化は必要ではない。
【００６２】
毒性を減少させる他の方法は、注入ラインにフィルターを挿入することであり、該フィルターは、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素を除去するために、例えば活性炭または固定化された抗体を含む。
グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の一方または両方もまた、標準の臨床の細胞洗浄技術にしたがって修飾血小板を洗浄することにより除去または実質的に希釈してもよい。
【００６３】
本発明はさらに、哺乳動物において止血を媒介する方法を提供する。本方法は、上述の医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む。修飾血小板の投与は、当該技術分野で既知の標準の方法に従う。一態様によると、ヒトの患者に、修飾血小板の投与前、投与後または投与中に赤血球を輸血する。赤血球の輸血は、投与した修飾血小板を希釈する役目をし、これによりグリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素を不活性化する。
【００６４】
止血媒介のための用量は、対象の種類、年齢、体重、性別および病状、疾患の重篤度、投与の経路および頻度を含む様々な要因にしたがって選択される。通常の技術を有する医者または臨床医は、止血を調節するのに必要な血小板の効果的な量を直ちに決定し、処方することができる。
本用量は、例えば、臨床的症状および実験室試験に関して、処置への反応に従って決定することができる。かかる臨床的症状および実験室試験の例は、当該技術分野で周知であり、Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001に記載されている。
【００６５】
止血を媒介するための貯蔵組成物および医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。一つの態様において、本組成物は、薬学的に許容しうる担体、複数の修飾血小板、複数のグリカン修飾剤および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素は、血小板クリアランスを減少させるのに十分な量で組成物中に存在する。好ましくは、グリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）は、冷却および不活性化の後、血小板が実質的に正常な止血作用を維持する量で存在する。血小板クリアランスを減少させるグリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）の量は、血小板製剤をこれらの剤の増量に暴露することにより、処置した血小板を冷却温度に暴露することにより、および低温誘発性血小板活性化が生じたか否かを（例えば、顕微鏡により）決定することにより、選択することができる。好ましくは、グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の量は、血小板をグリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の様々な量に暴露することにより、本明細書に記載のように血小板を冷却することにより、処置した（冷却した）血小板を加温することにより、血小板を随意に不活性化させることにより、および処置した血小板が実質上正常な止血作用を維持したかを決定するために、止血作用アッセイにおいて血小板を試験することにより、機能的に決定することができる。
【００６６】
例えば、グリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）により低温誘発性活性化を阻止するのに最適な濃度および条件を決定するために、増量したこれらの剤を、血小板を冷却温度に暴露する前に血小板と接触させる。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の最適な濃度は、in vitro試験（例えば、ガラス、トロンビン、低温保存温度に対する反応における形態的変化の観察；ＡＤＰ誘発凝集）および次いで止血機能（例えば、血小板減少症の動物における回復、生存および出血時間の短縮、またはヒトの対象における５１Ｃｒ標識血小板の回復および生存）を示すin vivo試験により決定されるように、血小板機能を損なわずに保存する効果的な最低濃度である。
【００６７】
本発明のさらに別の側面によると、血小板クリアランスを減少させるためにまたは血小板の貯蔵時間を増加させるために、血小板に添加する組成物を提供する。本組成物は、１種または２種以上のグリカン修飾剤を含む。ある態様において、本組成物はまた、グリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素は、低温誘発性血小板活性化を阻止する量で組成物中に存在する。一つの好ましい態様において、該グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００６８】
本発明はまた、血小板を保存するための貯蔵組成物を包含する。本貯蔵組成物は、血小板クリアランスを減少するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。いくつかの態様において、本貯蔵組成物さらに、血小板のグリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。本グリカン修飾剤を、好ましくはおおよそ室温および３７℃の間で保持される血小板の集団に添加する。いくつかの態様において、処置の後、血小板の集団を約４℃に冷やす。いくつかの態様において、血小板を、当業者に既知の標準の方法にしたがって、血小板用パック、バッグ、または容器に採集する。典型的に、提供者からの血液を主要容器に採取し、該容器は少なくとも１種のサテライト容器に結合していてもよく、全ての容器は、使用前に接続および殺菌する。いくつかの態様において、該サテライト容器は、破壊可能なシールにより、血小板を収集するための容器に接続する。いくつかの態様において、該主要容器はさらに、複数の血小板含有の血漿を含む。
【００６９】
いくつかの態様において、（例えば遠心分離により）血小板を濃縮し、血小板のグリカン部分の修飾を触媒する酵素と共にまたは共にではなくグリカン修飾剤を添加する前に、血漿および赤血球を独立したサテライトバッグに取り除く（これらの臨床的に価値のある分画の修飾を避けるために）。処置の前の血小板濃縮もまた、血小板クリアランスを減少させるのに必要なグリカン修飾剤の量を最小限に抑えることができ、これにより最終的に患者に注入されるこれらの剤の量を最小限に抑えることができる。
【００７０】
一つの態様において、該グリカン修飾剤は、閉鎖システム、例えば殺菌処理し、密封した血小板用パック内で血小板と接触させ、微生物汚染を避ける。典型的に、静脈穿刺導管(venipuncture conduit)は、血小板調達または輸血中、パックにおける唯一の開口部である。したがって、グリカン修飾剤による血小板の処置中、閉鎖システムを維持するために、該剤を、殺菌処理した接続チューブにより血小板用パックに接続した、比較的小さな、殺菌処理した容器に入れる(例えば、内容が本明細書中に参照として組み込まれる、米国特許第4,412,835号を参照)。該接続チューブは当業者に知られるように、可逆的に密封できるか、または破壊可能なシールを有する。例えば標準の実務にしたがって血小板を沈殿させ、主要パックから２番目ののバッグへ血漿を絞り出すことにより、血小板を濃縮した後、グリカン修飾剤含有の容器のシールを開き、該剤を血小板用パックに導入する。一つの態様において、該グリカン修飾剤は、独立した再封可能な接続チューブを有する独立した容器に含まれ、グリカン修飾剤の血小板製剤への連続添加を可能にする。
【００７１】
グリカン修飾剤との接触後、処置した血小板を冷却する。例えば、２２℃で貯蔵した血小板に比べ、低温保存温度で貯蔵した血小板は、実質的に減少した代謝性作用を有する。したがって、４℃で貯蔵した血小板は、代謝的に活性が低く、したがって、例えば、２２℃で貯蔵した血小板と比較して、多量のＣＯ２を発生しない（Slichter, S. J., 1981, Vox Sang 40 (Suppl 1), pp 72-86, Clinical Testing and Laboratory-Clinical correlations）。血小板マトリックス内でのＣＯ２の溶解は、ｐＨの減少および血小板の生存度の付随的減少をもたらす（Slichter, S., 1981, supra.）。したがって、従来の血小板用パックは、パック内外への気体の輸送（Ｏ２を中へおよびＣＯ２を外へ）を最大限にするために十分透過性のある材料で設計し、構築した材料で形成される。血小板用パックのデザインおよび構築における先行技術の制限は、低温保存温度での血小板の貯蔵を可能にし、それにより実質的に血小板代謝を減少させ、貯蔵中血小板により発生したＣＯ２量を少なくする本発明により除去される。したがって、本発明はさらに、血小板の低温貯蔵に特に有用な容器である、実質的にＣＯ２および／またはＣＯ２に対し非透過性である血小板用容器を提供する。
【００７２】
本発明は、以下の例を参照により完全に理解できるだろう。これらの例は、しかしながら、本発明の態様を単に記述により説明するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００７３】
例
例１
はじめに
適度に冷やすことは、活性化のために血小板をプライム(prime)するが、冷蔵は形態の変化および急速なクリアランスをもたらし、輸血療法のための血小板の貯蔵を危うくする。我々は、変形の阻害は、低温誘発性クリアランスを正常化しないことを見出した。我々はまた、肝臓マクロファージに主に発現する補体受容体３受容体（ＣＲ３）による認識のための対象となるように、血小板を冷やすことはフォンヴィルブランド因子（ｖＷｆ）受容体複合体αサブユニット（ＧＰＩｂα）の表面構造を再配列し、血小板食作用およびクリアランスへと至らしめることを見出した。ＧＰＩｂαの除去は、冷却していない血小板の生存期間を延長する。冷却した血小板は、ｖＷｆを結合させ、ＣＲ３欠損マウスへの輸血後、in vitroおよびex vivoで正常に機能する。冷やした血小板は、しかしながら、トロンビンまたはＡＤＰに暴露された血小板のようには「活性化」されず、それらのｖＷｆ受容体複合体は、活性化されたｖＷｆと正常に反応する。
【００７４】
温度が３７℃以下に下がるにつれて、血小板は、血栓性刺激による活性化により影響を受けやすく、これは、「プライミング」として知られる現象である（Faraday and Rosenfeld, 1998; Hoffmeister et al., 2001）。プライミングは、大部分の損傷が生じる体の表面のより低い温度での出血を制限するための順応であろう。我々は、肝クリアランスシステムの目的は、プライムされた血小板を繰り返し除去することであり、このクリアランスを促進するＧＰＩｂαにおける立体構造の変化は、ｖＷｆへのＧＰＩｂαの止血的に重要な結合に影響を及ぼさないことを提案する。したがって、ＧＰＩｂαの選択的修飾は、輸血のための血小板の低温貯蔵を提供するだろう。
【００７５】
材料および方法
我々は、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合アネキシンＶ、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよび抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよび抗ヒトＣＤ６２Ｐ−ＦＩＴＣ ｍＡｂをPharmingen（San Diego, CA）から；ＦＩＴＣ結合ラット抗マウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂをSanta Cruz Biotechnology, Inc.（Santa Cruz, CA）から；ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ６１ ｍＡｂ（クローンＢＬ−Ｅ６）をAccurate Scientific Corp.（Westbury, NY）から；ＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩｂα ｍＡｂ（クローンＳＺ２）をImmunotech（Marseille, France）から；およびＦＩＴＣ結合ポリクローナルウサギ抗ｖＷｆ抗体をDAKOCytomation（Glostrup, Denmark）から得た。我々は、ＥＧＴＡ−アセトキシメチルエステル（ＡＭ）、Oregon Greenが結合したヒト血漿からのフィブリノゲン、CellTracker（登録商標）Orange CMTMR；CellTracker Green CMFDA、ナイルレッド(Nile-red)（535/575）が結合しおよびカルボン酸修飾されている１μｍの微粒子/FluoSpheresをMolecular Probes, Inc.（Eugene, OR）から、および１１１インジウムをNEN Life Science Products（Boston, MA）から購入した。
【００７６】
我々は、サイトカラシンＢ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、イソチオシアン酸三ナトリウム（ＴＲＩＴＣ）、ヒトトロンビン、プロスタグラジンＥ１（ＰＧＥ１）、ホルボールエステル１２−テトラデカノイルホルボール−１３アセテート（ＰＭＡ）、A23187イオノフォアをSigma（St. Louis, MO）から；ボトロセチンをCenterchem Inc.（Norwalk, CT）から；およびＯ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼをCerladane（Hornby, Canada）から購入した。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有のＨＢＳＳ、ｐＨ６．４；RPMI 1640；Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なしのＨＢＳＳ中０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．５３ｍＭ）；および他の補助剤（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清）をGIBCO Invitrogen Corp.（Grand Island, NY）から得た。ＴＧＦ−β１をOncogene Research Products（Cambridge, MA）から；１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３をCalbiochem（San Diego, CA）から；およびアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）をUSB（Cleveland, OH）から得た。Avertin（２，２，２−トリブロモエタノール）をFluka Chemie（Steinheim, Germany）から購入した。
【００７７】
コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）をTufts Core Facility, Physiology Dept.（Boston, MA）で合成し、前記のとおり架橋した（Morton et al., 1995）。ヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンは、Dr. M. Berndt, Baker Medical Research Institute, Melbourne Victoria 318 1, Australiaから提供を受けた。追加の非結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂおよびＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４は、Dr. B. Nieswandt（Witten/Herdecke University, Wuppertal, Germany）から提供を受けた。我々は、ＴＨＰ−１細胞をAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA）から得た。
【００７８】
動物
クリアランスおよび生存研究のアッセイのために、我々は、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から得た年齢、血統および性別をマッチングしたＣ５７ＢＬ／６およびＣ５７ＢＬ／６×１２９／ｓｖ野生型のマウスを使用した。補体成分Ｃ３欠損のＣ５７ＢＬ／６×１２９／ｓｖマウス（Wessels et al., 1995）は、Dr. M. C. Carroll（Center for Blood Research and Department of Pediatrics, Harvard Medical School, Boston, MA）から提供を受けた。ＣＲ３欠損のＣ５７ＢＬ／６マウス（Coxon et al., 1996）は、Dr. T Mayadasから提供を受け、ｖＷｆ欠損のＣ５７ＢＬ／６マウス（Denis et al., 1998）は、Dr. D. Wagnerから提供を受けた。マウスを、Harvard Medical Area Standing Committee on Animalsにより承認されたように、The Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに記載のＮＩＨ標準に従って、維持および処置した。
【００７９】
ヒト血小板
血液を、同意した正常な人間のボランティア（Brigham and Women's HospitalおよびCenter for Blood Research (Harvard Medical School)両方のInstitutional Review Boardsから承認を得た）から静脈穿刺により０．１容量のAster-Jandlクエン酸ベースの抗凝血剤へ採取し（Hartwig and DeSisto, 1991）、多血小板血漿（ＰＲＰ）を３００×ｇで２０分間室温で、抗凝固処理した血液の遠心分離により調製した。血小板を、室温で小さなSepharose 2Bカラムを通して、ゲル濾過により血漿タンパク質から分離した（Hoffineister et al., 2001）。
【００８０】
下記のin vitro食作用アッセイにおいて使用した血小板は、２０分間３７℃で、１．８μＭのCellTracker Orange CMTMR（CM-Orange）で標識され（Brown et al., 2000）、取り込まれていない色素を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１０ｍＭのグルコース、および１２．５ｍＭのショ糖、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ１、ｐＨ６．０を含む５倍容量の洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）を用いて、遠心分離（８５０×ｇ、５分）により除去した。血小板を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４を含む溶液（緩衝液Ｂ）中３×１０８個／ｍｌに再懸濁した。
【００８１】
ＧＰＩｂαのＮ末端を、１ｍＭのＣａ２＋および１０μｇ／ｍｌのヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンも含む緩衝液Ｂ中、冷却したまたは室温で維持し、標識を付した血小板の表面から酵素的に除去した（Ward et al., 1996）。酵素消化後、血小板を５倍量の緩衝液Ａを用いて遠心分離により洗浄し、凝集体について顕微鏡で定期的に確認した。ＧＰＩｂαのＮ末端除去を、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩｂα（ＳＺ２）ｍＡｂを用いて１０分間室温で血小板懸濁液をインキュベートすることにより観察し、次いでFACScalibur Flow Cytometer（Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA）ですぐにフローサイトメトリー分析を行った。血小板を前方/側方散乱特性によりゲート(gate)し、５０，０００事象を獲得した。
【００８２】
マウス血小板
マウスを３．７５ｍｇ／ｇ（２．５％）のAvertinで麻酔し、１ｍｌの血液を、眼窩後方の眼の叢(retroorbital eye plexus)から０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤へと得た。
ＰＲＰを、３００×ｇで８分間室温で抗凝固処理した血液の遠心分離により調製した。血小板を、１２００×ｇで５分間の遠心分離により血漿タンパク質から分離し、５倍量の洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）を用いて遠心分離により（１２００×ｇで５分間）２回洗浄した。この手法は、用語「洗浄」の以降の使用を意味する。血小板を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４を含む溶液（緩衝液Ｂ）中１×１０９個／ｍｌの濃度に再懸濁した。
【００８３】
血小板数を、４００倍の位相差顕微鏡下でBright Line Hemocytometer（Hausser Scientific, Horsham, PA）を用いて決定した。いくつかの放射性血小板クリアランス研究を１１１インジウムを用いて行ない、霊長類の血小板について記載した方法(Kotze et al., 1985）を用いて、マウス血小板を標識した。血小板を、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ６．５（０．１Ｍのナトリウムクエン酸で調節した）中２×１０９／ｍｌの濃度に再懸濁し、次いで３０分間３７℃で５００μＣｉの塩化１１１インジウムを添加し、上記のように洗浄し、血小板を、緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌの濃度に懸濁した。
【００８４】
生体顕微鏡または他の血小板生存実験のために、洗浄した血小板に、０．００１％のＤＭＳＯ、２０ｍＭのHEPESをも含む緩衝液Ｂ中、２．５μＭのCellTracker Green CMFDA（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）（ＣＭＦＤＡ）で２０分間３７℃で（Baker et al., 1997）、または０．１５μＭのＴＲＩＴＣで２０分間３７℃で標識した。取り込まれていない色素を、上記のように遠心分離により除去し、血小板を緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌに懸濁した。
【００８５】
ＧＰＩｂαのＮ末端を、２０分間３７℃で１ｍＭのＣａ２＋を含む緩衝液Ｂ中１００μｇ／ｍｌのＯ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼを用いて、冷却したまたは室温の標識血小板の表面から酵素的に除去した（Bergmeier et al., 2001）。酵素消化後、血小板を遠心分離により洗浄し、凝集体について光学顕微鏡により確認した。ＧＰＩｂαのＮ末端除去の酵素除去を、５μｇ／ｍｌのＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４を用いて１０分間室温でインキュベートすることにより観察し、結合したＰＥをフローサイトメトリーにより分析した。
【００８６】
低温誘発性血小板の形態の変化を阻害するために、緩衝液Ｂ中１０９／ｍｌの血小板を、前記のとおり２μＭのＥＧＴＡ−ＡＭ、次いで２μＭのサイトカラシンＢと共に入れ（Winokur and Hartwig, 1995）、２．５μＭのＣＭＦＤＡで３０分間３７℃で標識し、そして冷却したかまたは室温で維持した。血小板は、標準の洗浄を受け、マウスへの注射前に緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌの濃度に懸濁した。
【００８７】
血小板の温度についての手順
血小板の生存または機能への温度の効果を研究するために、非標識の、放射性標識した、または蛍光標識したマウスまたはヒト血小板を、マウスに輸血する前またはin vitro分析前に、２時間室温（２５〜２７℃）でインキュベートし、または氷浴温度でインキュベートし、そして１５分間３７℃で再加温した。これらの処置を受けた血小板は、それぞれ冷やしたまたは冷却した（または冷却し再加温した）および室温の血小板に指定される。
【００８８】
マウス血小板の回復、生存および死(fate)
ＣＭＦＤＡ標識した、冷却したまたは室温のマウス血小板（１０８個）を、２７ゲージの針を用いて外側尾静脈経由で同系のマウスに注入した。回復および生存の決定のために、血液サンプルを、輸血後すぐに（＜２分）および０．５、２、２４、４８、７２時間後に０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤に採集した。フローサイトメトリーを用いた全血分析を行い、ＣＭＦＤＡ陽性血小板の比率を前方および側方散乱特性にしたがって、全血小板をゲートすることにより決定した（Baker et al., 1997）。各サンプルにつき、５０，０００事象を収集した。＜２分に測定したＣＭＦＤＡ陽性血小板を１００％と設定した。マウスあたり輸血した血小板の投入量は、全血小板の集団の約２．５〜３％だった。血小板の死を評価するために、組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、筋肉、および大腿骨）を、マウスへの１０８個の冷却したまたは室温の１１１インジウム標識血小板の注射後０．５、１および２４時間目に採取した。器官の重量およびそれらの放射活性を、Wallac 1470 Wizard自動ガンマカウンター（Wallac Inc., Gaitersburg、MD）を用いて決定した。データを、器官１グラムあたりのガンマ数として表現した。放射性血小板の回復および生存の決定のために、血液サンプルを、輸血後すぐに（＜２分）および０．５および時間後に０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤に採集し、それらのガンマ数を決定した（Kotze et al., 1985）。
【００８９】
血小板凝集
従来の試験を行い、Bio／Data血小板凝集計（Horsham, PA）内で観察した。０．３ｍｌのマウスの洗浄し攪拌した血小板のサンプルを、１Ｕ／ｍｌのトロンビン、１０μＭのＡＤＰ、または３μｇ／ｍｌのＣＲＰに３７℃で暴露した。光透過率を３分間にわたり記録した。
【００９０】
活性化ｖＷｆ結合
多血小板血漿を、２Ｕ／ｍｌのボトロセチンで５分間３７℃で処置したか、または処置しなかった（Bergmeier et al., 2001）。結合したｖＷｆを、フローサイトメトリーにより、ＦＩＴＣ結合ポリクローナルウサギ抗ｖＷｆ抗体を用いて検出した。
【００９１】
血小板ＧＰＩｂαの表面ラベリング
室温または２時間冷却を維持した休止マウス血小板を、０．０５％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２×１０６／ｍｌの濃度に希釈した。血小板溶液（２００μｌ）を、９６−ｗｅｌｌプレートのウェルに含まれるポリリジンコートされたガラス製カバースリップ上に置き、血小板を１，５００×ｇで５分間室温での遠心分離により、各カバースリップに付着させた。そして上清を除去し、カバースリップに結合させた血小板を、１０分間ＰＢＳ中０．５％グルタルアルデヒドで固定した。固定剤を除去し、未反応アルデヒドをＰＢＳ中０．１％の水素化ホウ素ナトリウムを含む溶液で急冷し、次いで１０％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。血小板表面上のＧＰＩｂαに、３種類のラット抗マウスＧＰＩｂαモノクローナル抗体それぞれ１０μｇ／ｍｌの混合物で（Bergmeier et al., 2000）１時間、次いでヤギ抗ラットＩｇＧでコートした１０ｎｍの金で標識した。カバースリップを、ＰＢＳで何回も洗浄し、1%のグルタルアルデヒドで後固定(post-fix)し、蒸留水で再洗浄し、急速に冷凍、凍結乾燥、およびCressington CFE-60（Cressington、Watford、UK）内で１．２ｎｍのプラチナで回転(rotary)コートし、次いで回転なしで４ｍｎの炭素でコートした。血小板を１００ｋＶでJEOL 1200-EX電子顕微鏡で観察した（Hartwig et al., 1996; Kovacsovics and Hartwig, 1996）。
【００９２】
In vitro食作用アッセイ
単球性ＴＨＰ−１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２５ｍＭのHepes、２ｍＭのグルタミンを追加したRPMI 1640細胞培養液中７日間培養し、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＰおよび５０ｎＭの１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３を用いて２４時間分化させ、これはＣＲ３発現の増加を伴った（Simon et al., 2000）。ＣＲ３発現を、フローサイトメトリーにより、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１ ｍＡｂを用いて観察した。未分化または分化ＴＨＰ−１細胞（２×１０６個／ｍｌ）を、２４−ｗｅｌｌプレートに播種し、４５分間３７℃で付着させた。付着した未分化または分化マクロファージを、１５分間１５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの添加により活性化させた。
前に異なる処置を受けた、CM-Orange標識された、冷却したまたは室温の血小板（１０７個／ウェル）を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有のＨＢＳＳ中の未分化または分化した食細胞に添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の後、食細胞単層をＨＢＳＳで３回洗浄し、３７℃で５分間、ＨＢＳＳ中０．０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡで、次いで４℃で５ｍＭのＥＤＴＡでの処置により、付着した血小板を除去し、血小板の付着または摂取のフローサイトメトリー分析のためにマクロファージをはがした（Brown et al., 2000）。ヒトのCM-Orange標識された、冷却したまたは室温の血小板はすべて、新しく単離した非標識血小板と同じ量の血小板特異的マーカーＣＤ６１を発現した（未掲載）。マクロファージと共にインキュベートしたCM-Orange標識血小板を、それらの前方および側方散乱特性にしたがって食細胞から分離した。マクロファージをゲートし、各サンプルについて１０，０００事象を獲得し、データをCELLQuestソフトウェア（Becton Dickenson）で分析した。食細胞集団と関連するCM-Orange標識血小板は、オレンジ蛍光のシフトを有する（図６Ａおよび図６Ｂ、摂取される、ｙ軸）。これらの血小板は、ＦＩＴＣ結合ｍＡｂでＣＤ６１へ二重標識するのに失敗したため、単に付着するよりも摂取された。
【００９３】
血小板の免疫標識(immunolabeling)およびフローサイトメトリー
洗浄したマウス血小板またはヒト血小板（２×１０６個）を、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６１、または表面結合したＩｇＭおよびＩｇＧの表面発現について、冷却または室温貯蔵後、１０分間３７℃でフルオロフォア結合Ａｂ（５μｇ／ｍｌ）で染色することにより、分析した。冷却したまたは室温の血小板により暴露されたホスファチジルセリンを、１０μｇ/ｍｌのＦＩＴＣ結合アネキシンＶと共に１０ｍＭのＣａ２＋を含む４００μｌのＨＢＳＳに、５μｌの血小板を再懸濁することにより決定した。ＰＳ暴露について陽性対照として、血小板懸濁液を１μＭのA23187で刺激した。フィブリノゲン結合を、２０分間室温でのOregon Greenフィブリノゲンの添加により、決定した。すべての血小板サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析した。血小板を、前方および側方散乱特性によりゲートした。
【００９４】
生体顕微鏡実験
生体ビデオ顕微鏡設定の動物の用意、技術的および実験的側面が記載されている（von Andrian、1996）。両方の性別の６〜８週齢のマウスを、XylazineおよびKetaminの混合物の腹腔内注射により、麻酔した。右の頚静脈に、ＰＥ−１０ポリエチレンチューブのカテーテルを挿入した。左の肝葉の下面を外科的に用意し、既述のとおりさらにin vivo 顕微鏡検査のためにガラス製カバースリップで覆った（McCuskey, 1986）。
【００９５】
それぞれＣＭＦＤＡおよびＴＲＩＴＣで標識した１０８個の冷却した血小板および室温の血小板を１：１で混合し、静脈内投与した。肝類洞内の標識血小板の循環を、ビデオトリガー(triggered)ストロボスコープ表面照射で追跡した。１０のビデオシーンを各示した時間で３小葉中心帯から記録した。同一の視野内の冷やした（ＣＭＦＤＡ）／ＲＴの（ＴＲＩＴＣ）付着した血小板の比率を計算した。
共焦点顕微鏡検査を、１０倍の水浸対物レンズを用いて、Olympus BX 50 WJ直立顕微鏡（Biorad, Hercules, CA）に接続したRadiance 2000 MP共焦点多光子画像システムを用いて行なった。画像を捉え、Laser Sharp 2000ソフトウェア（Biorad）（von Andrian、2002）で分析した。
【００９６】
流血における血小板凝集
霊長類について既述されたように、創傷から生じる全血中の血小板による凝集体の形成を分析するために、フローサイトメトリー法を用いた（Michelson et al., 1994）。１０８個のＣＭＦＤＡ標識の室温のマウス血小板を同系の野生型のマウスに注射し、１０８個のＣＭＦＤＡ標識の冷却した血小板をＣＲ３欠損マウスに注射した。血小板注入の２４時間後、マウスの尾を３ｍｍ切片に切断し、標準の出血時間アッセイを行なった（Denis et al., 1998）。切断した尾を、３７℃の１００μｌの０．９％等張食塩水に浸した。生じる血液を２分間採集し、０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤、次いですぐに１％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）を添加した。末梢血を上記と平行して眼窩後方の眼の叢の出血により得て、すぐに１％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）で固定した。
【００９７】
フローサイトメトリーによりin vivoの凝集体数を分析するために、出血時間の創傷から生じる流血、ならびに末梢全血サンプルを希釈し、ＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４（５μｇ／ｍｌ、１０分）で標識した。血小板を、それらの前方散乱特性およびＧＰＩｂαの陽性度(positivity)にしたがってゲーティング(gating)することにより赤血球および白血球から識別した。
【００９８】
Ｌｏｇ前方光散乱(血小板の大きさを反映している）対ＧＰＩｂα結合のヒストグラムを作成した。末梢全血サンプルにおいて、分析部位をＧＰＩｂα陽性粒子周辺に描き、前方散乱軸（領域１）の９５％の集団およびこの前方光散乱閾値（領域２）より上に現れる５％粒子を含有した。同一の領域を流血サンプルについて使用した。単一の血小板の数の比率として、流血中の血小板凝集体の数を、以下の式より計算した：［（流血の領域２における粒子数）−（末梢血の領域２における粒子数）］÷（流血の領域１における粒子数）×１００％。注入した血小板を、それらのＣＭＦＤＡ標識により確認し、ＣＭＦＤＡ陰性の非注入血小板から識別した。
【００９９】
マウス血小板フィブリノゲン結合のフローサイトメトリー分析および循環血小板のP-セレクチン暴露
CM-Orange標識の室温の血小板（１０８個）を野生型のマウスに注入し、CM-Orange標識の冷却した血小板（１０８個）をＣＲ３欠損マウスに注入した。血小板注入の２４時間後、マウスを出血させ、血小板を単離した。休止のまたはトロンビン活性化した（１Ｕ／ｍｌ、５分）血小板懸濁液（２×１０８個）を、ＰＢＳ中に希釈し、２０分間室温で、ＦＩＴＣ結合抗マウスＰ−セレクチンｍＡｂまたは５０μｇ／ｍｌのOregon Green結合フィブリノゲンのいずれかで染色した。血小板サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析した。輸血したおよび非輸血の血小板を、前方散乱およびCM-Orange蛍光特性により、ゲートした。Ｐ−セレクチンの発現およびフィブリノゲンの結合を、トロンビンによる刺激の前および後に、各CM-Orange陽性および陰性集団について測定した。
【０１００】
統計
生体顕微鏡データを、平均±ＳＥＭとして表現した。群を対応のないｔ検定を用いて比較した。Ｐ値＜０．０５を、有意であるとみなした。すべての他のデータを、平均±ＳＤとして表した。
【０１０１】
結果
冷却した血小板のクリアランスは、主に肝臓において生じ、血小板の形態から独立している。
室温（ＲＴ）で保持し、同系のマウスに注入したマウス血小板は、約８０時間にわたりかなり定率で消滅する（図１Ａ）。一方、氷浴の温度で冷やし、注射前に再加温した（Ｃｏｌｄ）のマウス血小板のおよそ３分の２が、以前ヒトおよびマウスにおいて観察されたように、循環から急速に消滅する（Becker et al., 1973; Berger et al., 1998）。
【０１０２】
円盤状の形態を保存するために、細胞透過性カルシウムキレート剤であるＥＧＴＡ−ＡＭおよびアクチンフィラメントの反矢じり端の保護剤であるサイトカラシンＢ（Ｃｏｌｄ＋ＣｙｔｏＢ／ＥＧＴＡ）で処置した冷却し再加温した血小板（Winokur and Hartwig, 1995）は、in vitroでトロンビン−、ＡＤＰ−またはコラーゲン関連ペプチド−（ＣＲＰ）誘発凝集により決定されたように、十分に機能したにもかかわらず、冷却した、未処理の血小板と同じくらい急速に、循環から去った（図１Ｂ）。輸血後すぐに注入した血小板の回復は、５０〜７０％であり、血小板消滅の動態は、血小板に標識を付すのに１１１インジウムまたはＣＭＦＤＡを使用したかにかかわらず、区別できなかった。室温のおよび冷却したマウス血小板の相対生存率は、完全に同じように処置したマウス血小板(Berger et al., 1998）およびヒト血小板(Becker et al., 1973）について以前報告された値と似ている。
【０１０３】
図１Ｃは、室温のおよび冷却したマウス血小板の目的地の器官(organ destination)は異なることを示す。室温の血小板は、主に脾臓に行き着くのに対し、肝臓は、循環から除去した冷却した血小板の主要な滞留地(residence)である。２４時間目に、室温の血小板と比べて、１１１インジウム標識された冷却した血小板を受けている動物の腎臓内で検出された放射性核種のより大きな分画は、冷却した血小板のより急速な分解と、放射性核種の泌尿器系への到達を反映する。注射の１時間後、ＣＭＦＤＡで標識した血小板の器官分布は、１１１インジウムで標識した血小板の器官分布と同程度だった。両方の場合において、６０〜９０％の標識した冷却した血小板集団が肝臓内に、約２０％が脾臓内に、および約１５％が肺内に堆積した。一方、４分の１の注入した室温の血小板は、肝臓、脾臓および肺の間で均等に分配した。
【０１０４】
冷却した血小板は、肝マクロファージ（クッパー細胞）と共局在する。
肝臓による冷却した血小板のクリアランスおよび血小板分解についての証拠は、肝臓の主要な食作用スカベンジャー細胞であるクッパー細胞による冷却した血小板の認識および摂取と一致する。図１Ｄは、輸血の１時間後のマウス肝臓の切片の典型的な共焦点顕微鏡写真における食作用クッパー細胞および付着した冷却したＣＭＦＤＡ標識血小板の位置を示す。類洞マクロファージを、ナイルレッドでマーキングをした１μｍのカルボキシル修飾したポリスチレン微粒子の注射により視覚化した。輸血した血小板およびマクロファージの共局在は、両方の蛍光放射の重ね合わせた顕微鏡写真において黄色で示される。冷却した血小板は、類洞マクロファージが豊富な場所である肝小葉の門脈周囲および中間帯ドメインにおいて選択的にナイルレッド標識細胞と局在する(Bioulac-Sage et al., 1996; MacPhee et al., 1992）。
【０１０５】
ＣＲ３欠損のマウスは、冷却した血小板を急速に一掃しない。
ＣＲ３（αＭβ２インテグリン；ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８；Ｍａｃ−１）は、肝マクロファージによる抗体独立クリアランスの主要な伝達物質である。図２Ａは、冷却した血小板と室温の血小板の両方の集団のクリアランスは、野生型のマウスと比較してＣＲ３欠損マウスにおいてより短い（図ｌＡ）にもかかわらず、冷却した血小板は室温の血小板と同じ動態でＣＲ３欠損動物を循環することを示す。野生型のマウスと比較して、ＣＲ３欠損マウスによる血小板除去率がわずかに速い理由は、明らかではない。冷却し再加温した血小板もまた、補体因子３であるＣ３欠損マウスから急速に一掃され（図２Ｃ）、ＣＲ３経由でのおよびフォンヴィルブランド因子（ｖＷｆ）欠損マウスからの食作用およびクリアランスを促進する主要なオプソニンが不足する（Denis et al., 1998）（図２Ｂ）。
【０１０６】
冷却した血小板は、in vivoでクッパー細胞にしっかりと付着する。
野生型の肝類洞への血小板の付着を生体顕微鏡によりさらに調査し、共に注入した、冷却したおよび室温で貯蔵した、付着した血小板の間の比率を決定した。図３は、両方の冷却したおよび室温の血小板は高クッパー細胞密度で類洞部位に結合する（図３Ａおよび３Ｂ）が、野生型のマウスにおいて室温の血小板より２．５〜４倍多い冷却した血小板がクッパー細胞に付着する（図３Ｃ）ことを示す。一方、ＣＲ３欠損マウス内のクッパー細胞に付着する血小板の数は、冷却または室温への暴露から独立していた（図３Ｃ）。
【０１０７】
ＧＰＩｂαのＮ末端ドメインを欠乏する冷却した血小板は、正常に循環する。
ｖＷｆについてのＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ受容体複合体の成分であるＧＰＩｂαが、in vitroで特定の条件下でＣＲ３に結合できるため（Simon et al., 2000）、ＣＲ３について冷却した血小板における可能性のあるカウンター(counter)受容体としてＧＰＩｂαを調査した。Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼは、マウス血小板ＧＰＩｂαの４５−ｋＤａのＮ末端細胞外ドメインを開裂するが、αＩＩｂβ３，α２α１、ＧＰＶＩ／ＦｃＲγ鎖およびプロテアーゼ活性化受容体などの他の血小板受容体を損なわない（Bergmeier et al., 2001）。したがって、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼによりマウス血小板からＧＰＩｂαのこの部分の細胞外ドメインを取り除き（図４Ａ挿入図）、室温または低温インキュベーション後のマウス内でのそれらの生存を調べた。図４Ａは、冷却した血小板は、ＧＰＩｂαの開裂後、もはや急速なクリアランスを示さないことを示す。さらに、ＧＰＩｂαが枯渇した室温処置した血小板は、ＧＰＩｂαを含む室温の対照と比較したとき、生存時間をわずかに延長した（約５〜１０％）。
【０１０８】
冷却は、活性化ｖＷｆの血小板ｖＷｆ受容体への結合に影響を及ぼさないが、血小板表面上のＧＰＩｂαのクラスタリングを誘発する。
図４Ｂは、血小板の冷却は、マウス血小板表面上のＧＰＩｂαの分布における変化へと至らしめるが、ボトロセチン活性化ｖＷｆは、低温血小板におけるのと同様に、室温の血小板においてＧＰＩｂαに良好に結合することを示す。免疫金(immunogold)標識モノクローナルマウス抗ＧＰＩｂα抗体により確認されたＧＰＩｂα分子は、休止した円盤状の血小板の滑らかな表面上に室温で線状の凝集体を形成する（図４Ｃ、ＲＴ）。この配置は、休止した血液血小板の構造の情報と一致する。ＧＰＩｂαの細胞質ドメインは、フィラミンＡ分子の仲介を通して血小板膜の面と共に曲がっている長いフィラメントと結合する(Hartwig and DeSisto, 1991）。冷却後（図４Ｃ、Ｃｈｉｌｌｅｄ）、多くのＧＰＩｂα分子は、内部アクチン再構成により変形した血小板膜にて、クラスターとして組織する（Hoffmeister et al., 2001; Winokur and Hartwig, 1995）。
【０１０９】
In vitroにおける冷却したヒト血小板のＣＲ３を介した食作用による、血小板ＧＰＩｂαの認識。
ＴＧＦ−β１および１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３を用いたヒト単球様ＴＨＰ−１細胞分化は、ＣＲ３の発現を約２倍増加させる（Simon et al., 1996）。冷却は、未分化ＴＨＰ−１細胞による血小板食作用の３倍増加および分化ＴＨＰ−１細胞による約５倍増加をもたらし（図５Ｂおよび５Ｃ）、ＣＲ３による血小板の摂取の関与と一致した。一方、ＴＨＰ−１細胞の分化は、室温で貯蔵した血小板の摂取において有意な効果がなかった（図５Ａおよび５Ｃ）。ＧＰＩｂαが、冷却したヒト血小板におけるＣＲ３を介した食作用のカウンター受容体であるかを決定するために、ヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンを使用し、ＧＰＩｂαの細胞外ドメインを除去した（Ward et al., 1996）。ヒト血小板の表面からのモカラギンによるヒトＧＰＩｂαの除去は、冷却後のそれらの食作用を約９８％減少させた（図５Ｃ）。
【０１１０】
低温誘発性血小板クリアランスの他の伝達物質の排除
表１は、冷やすことが、ＧＰＩｂα以外の血小板受容体の発現またはそれらのリガンドとの相互作用に影響を及ぼしたかどうかについて調べた実験の結果を示す。これらの実験は、Ｐ−セレクチンの発現、αＩＩｂβ３−インテグリン密度またはαＩＩｂβ３活性化のマーカーであるαＩＩｂβ３フィブリノゲン結合への検出可能な効果を明らかにしなかった。冷却はまた、アポトーシスの指標である、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の暴露を増加させず、ＩｇＧまたはＩｇＭ免疫グロブリンの血小板結合を変化させなかった。
【０１１１】
表１．様々な抗体またはリガンドの血小板受容体への結合への冷却の効果。
【表１】
【０１１２】
冷却し再加温したまたは室温のヒトおよびマウス血小板における様々な受容体に対する蛍光標識抗体またはリガンドの結合を、フローサイトメトリーにより測定した。データを、冷却した血小板の表面に結合した平均フルオロフォア対室温の血小板の表面に結合した平均フルオロフォアの比率で表現する（平均±ＳＤ、ｎ＝３〜４）。
【０１１３】
循環している冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて止血機能を有する。
野生型のマウスにおける急速なクリアランスにもかかわらず、CM-OrangeまたはＣＭＦＤＡ標識された冷却した血小板は、３種類の独立した方法により決定したように、ＣＲ３欠損マウスへの注入の２４時間後、機能的であった。第一に、冷却した血小板を、標準化した尾静脈出血創傷から生じている流血中の血小板凝集体に取り込んでいる（図６）。野生型のマウスに輸血したＣＭＦＤＡ陽性の室温の血小板（図６Ｂ）およびＣＲ３欠損マウスに輸血したＣＭＦＤＡ陽性の冷却した血小板（図６Ｄ）は、受容マウスのＣＭＦＤＡ陰性の血小板と同一程度に流血中に凝集体を形成した。第二に、αＩＩｂβ３のフィブリノゲン結合部位の血小板表面暴露により決定したように、トロンビンによるex vivo刺激後にＣＲ３欠損マウスへ冷却し再加温したCM-Orange標識の血小板を輸血後、２４時間後に。第三に、冷却し再加温したCM-Orange血小板は、トロンビン活性化に対する反応においてＰ−セレクチンの上方制御の完全な能力があった（図６Ｅ）。
【０１１４】
考察
低温誘発性の血小板形態変化だけでは、in vivoの血小板クリアランスを引き起こさない
冷やすことは、細胞内細胞骨格の再構成を介した大きな血小板の形態変化を急速に誘発する（Hoffineister et al., 2001; White and Krivit、1967; Winokur and Hartwig, 1995）。これらの変化は、再加温により一部可逆的であるが完全に可逆的ではなく、再加温した血小板は、円盤状というより、より球状である。トロンビンによりex vivoで活性化された輸血したマウスおよびヒヒの血小板は、大きな形態の変化を伴って正常に循環するという証拠にもかかわらず、血小板の円盤状の形態の維持が、血小板の生存における主要な必要条件であるという考えは、定説であった（Berger et al., 1998; Michelson et al, 1996）。
【０１１５】
本明細書において、冷却は、形態の変化と独立してその除去を介する血小板表面における特異的な変化へと導き、形態の変化は本質的に急速な血小板クリアランスと至らしめないことを示した。冷却し再加温した血小板は、薬剤により円盤として保存され、未処理の冷却した血小板と同じ速度で一掃され、および歪み、冷却し再加温した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で室温で維持した血小板のように循環する。小型の血小板は、循環内にとどまることが可能であり、これらの大きな形態の変形にもかかわらず、捕捉(entrapment)から逃れる。
【０１１６】
冷却した血小板のクリアランスを仲介する受容体：ＣＲ３およびＧＰＩｂα
ヒトにおける正常な血小板の寿命は、およそ７日である（Aas, 1958; Ware et al., 2000）。例えば、播種性血管内凝固中に生じるものなどの大量の凝固反応は、血小板減少症の原因となるため、連続した機械的応力により生じた小さな血塊への血小板の取り込みは、間違いなく血小板クリアランスに寄与する（Seligsohn, 1995）。In vivoの血小板刺激は、負傷した血管壁において生じ、活性化血小板は急速にこれらの部位で隔離させる(sequester)ため、かかる凝固反応における血小板の死は、Michelsonら（Michelson et al., 1996）およびBergerら（Berger et al., 1998）の実験などにおける注入したex vivo活性化血小板の死と異なる。
【０１１７】
同種抗体および自己抗体は、免疫不適合血小板により感作された個体における、または自己免疫性血小板減少症の患者における、Ｆｃ受容体を有するマクロファージにより、血小板の食作用除去を加速するが、それ以外には、血小板クリアランスの機構に関してほとんど情報が存在しない。しかしながら、冷却したまたは室温のヒト血小板に結合したＩｇＧまたはＩｇＭの量は同一であり、血小板関連抗体のＦｃ受容体への結合は、冷やした血小板のクリアランスを調節しないことを意味することを示した。また、血小板の冷却は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）暴露に不利に作用するin vitroで血小板表面における検出可能なＰＳ暴露および冷却した血小板のクリアランスにおけるスカベンジャー受容体の関与を誘発しないことを実証した。
【０１１８】
多くの刊行物が、血小板における低温の効果を「活性化」として言及しているにもかかわらず、細胞骨格に媒介された形態の変化とは別に、冷却した血小板は、トロンビンまたはＡＤＰなどのに刺激より活性化された血小板と似ていない。正常な活性化は、表面Ｐ−セレクチン発現を顕著に増加させ、これは、細胞内顆粒からの分泌の結果である（Berman et al., 1986）。血小板の冷却は、Ｐ−セレクチンの増加を引き起こさないが（表１）、野生型またはＰ−セレクチン欠損マウスから単離された冷却した血小板のクリアランスは、等しく急速である（Berger et al., 1998）。活性化はまた、αＩＩｂβ３−インテグリンの量およびフィブリノゲンについてのその結合力を増加させるが（Shattil, 1999）、冷やすことは、これらの効果を有さない（表１）。トロンビン活性化血小板の正常な生存は、我々の発見と一致する。
【０１１９】
肝臓マクロファージのＣＲ３は、主に冷やした血小板の認識およびクリアランスに関与することを示した。冷却した血小板のクリアランスにおける肝臓内のＣＲ３を有するマクロファージの主要な役割は、脾臓内の豊富なＣＲ３発現型マクロファージにもかかわらず、ＩｇＭでコートされた赤血球の主要な肝臓のクリアランスと一致し（Yan et al., 2000）、マクロファージＣＲ３による結合および摂取に有利に働く肝臓の血液濾過特性を反映するだろう。ＧＰＩｂαの細胞外ドメインは、ＣＲ３に積極的に結合し、in vitroの剪断応力下で、ＴＨＰ−１細胞の回転(rolling)および安定した付着を支持する（Simon et al., 2000）。マウスＧＰＩｂαの細胞外ドメインの開裂は、マウスに輸血した冷却した血小板の正常な生存をもたらす。ヒトの冷却した血小板のＧＰＩｂαの枯渇は、処置した血小板の食作用をin vitroでのマクロファージ様細胞により大いに減少させる。したがって、ＧＰＩｂαは、食作用による血小板クリアランスへと至らしめる冷却した血小板の肝臓マクロファージＣＲ３のための共受容体であることを提案する。
【０１２０】
ＧＰＩｂαのＮ末端部分が欠損している低温血小板の正常なクリアランスは、冷却した血小板クリアランスを仲介する候補として血小板表面上に発現した分子を含む多くの他のＣＲ３結合パートナーを無視する。これらのリガンド候補は、ＩＣＡＭ−２、血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合したフィブリノゲン、ｉＣ３ｂ、Ｐ−セレクチン、グルコサミノグリカン、および高分子量キニノーゲンを含む。我々は、補体因子３を欠損しているマウスを用いて、冷却した血小板クリアランスのための機構としてオプソニンＣ３ｂフラグメントｉＣ３ｂの堆積を排除したが、αＩＩｂβ３の発現レベルおよびフィブリノゲン結合もまた、血小板の冷却後に変化しない。
【０１２１】
活性化ｖＷｆへの結合およびＣＲ３への低温誘発性結合は、ＧＰＩｂαの独立した機能のようである。
休止円盤状の血小板の表面のＧＰＩｂαは、フィラミンＡおよびフィラミンＢにより亜膜(submembrane)アクチン細胞骨格に結合した、ＧＰＩｂα、ＧＰＩＸおよびＶを有する複合体内に、線形配列（図５）状に存在している（Stossel et al., 2001）。止血におけるその役割は、血管損傷位置でｖＷｆの活性型を結合させることである。活性化ｖＷｆは、休止血小板または刺激血小板でＧＰＩｂαに同等に良好に結合することから、活性化ｖＷｆへのＧＰＩｂα結合は構造的であり、血小板からの積極的な寄与は必要ない。トロンビンおよび他のアゴニストによる懸濁液中の血小板の刺激は、ＧＰＩｂαを一部血小板表面から内膜のネットワークである開放小管系へと再分布させる原因となるが、in vivoでの血小板クリアランス（Berger et al., 1998; Michelson et al., 1996）またはin vitroでの食作用（未発表の観察）を引き起こさない。しかしながら、血小板を冷やすことは、内在化(internalization)よりむしろ、ＧＰＩｂαクラスタリングの原因となる。このクラスタリングは、サイトカラシンＢの存在下で生じるため、反矢じり端のアクチン集合から独立している。
【０１２２】
低温によってＣＲ３による血小板ＧＰＩｂαの認識が促進するにもかかわらず、in vitroでのＧＰＩｂαおよび活性化ｖＷｆの間の相互作用における効果はなく、ｖＷｆ欠損マウスに輸血した冷却した血小板は、野生型のマウスにおけるのと同様に急速に消滅する。ｖＷｆおよびＣＲ３とのＧＰＩｂαの相互作用の分離可能性は、ＧＰＩｂαの選択的修飾は、ｖＷｆとのＧＰＩｂαの止血に重要な反応を損なうことなく低温誘発性血小板クリアランスを阻害するかもしれないことを示唆する。In vitroでのおよびＣＲ３欠損マウスへの注入後の冷やした血小板の血小板機能のすべての試験は、正常な結果をもたらすことから、適切に修飾した血小板は、予想通りに止血に効果的である。
【０１２３】
低温誘発性血小板クリアランスの生理学的重要性
全体的な血小板の形態の変化が、１５℃以下の温度でのみ明らかになるにもかかわらず、精密な生化学分析は、細胞骨格の変化およびトロンビンへの反応性の増加が、温度が３７℃以下に下がるにつれて、検出可能であることを示す（Faraday and Rosenfeld, 1998; Hoffineister et al., 2001; Tablin et al., 1996）。低温暴露した血小板とトロンビン刺激またはＡＤＰ刺激血小板との間に残る多くの機能的差異のため、それらの変化を「プライミング」と示す。
【０１２４】
血小板の活性化は、コア体温にさらされる冠状および脳血管において潜在的に致命的であることから、我々は、血小板は熱センサーであり、中央循環のコア体温では比較的不活性であるが、進化史を通じて最も出血を起こしやすい位置である外側の体の表面のより低い温度で活性化がプライムされるようになるよう設計されていることを提案した（Hoffmeister et al., 2001）。本明細書において報告した発見は、ＧＰＩｂαにおける不可逆変化が冷やした血小板のクリアランスの理由であることを示唆する。冷却した血小板を循環させるよりも、生物は食作用により低温でプライム化した血小板を一掃する。
【０１２５】
一つは局在的に活性化した血小板の除去のため、およびもう一つは過剰にプライム化した血小板を取り除くために（図７）、少なくとも２種類のクリアランス経路が関与するシステムは、なぜ冷却した血小板がＣＲ３欠損マウスにおいて正常に循環および機能し、ＧＰＩｂαの除去後にわずかに延長された循環を有するのかを、おそらく説明できるだろう。我々は、いくつかのプライム化した血小板が、確率的基礎にしたがって微小血管の凝固に入ることを提案する。その他のプライム化した血小板は、体の表面温度に繰返し暴露を受けやすく、この反復プライミングが、次第にこれらの血小板をＣＲ３を有する肝臓マクロファージにより識別可能にさせる。冷却によりプライムされた血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて正常な止血機能の能力があり、凝固はそれらのクリアランスに寄与する。しかしながら、冷蔵した血小板のクリアランス率は、室温で保持された血小板のクリアランス率と区別できないため、検査したＣＲ３欠損マウスにおける自己血小板のわずかに短い生存時間は、おそらく微小血管凝固において正常にプライム化した血小板のクリアランスの増加に起因しない。
【０１２６】
本発明および例１の背景となる参考文献
【表２】
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
例２
冷却した血小板食作用におけるαＭβ２（ＣＲ３）レクチンドメインの関係
αＭβ２（ＣＲ３）は、陽イオン独立の糖結合レクチン部位を有し、マンナン、グルカンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合するそのＩ−ドメインに「Ｃ−Ｔ」を局在させる（Thornton et al, J. Immunol. 156, 1235-1246, 1996）。ＣＤ１６ｂ／αＭβ２膜複合体は、β−グルカン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、およびメチル−α−マンノシドにより分裂するが、他の糖により分裂しないことから、この相互作用はαＭβ２インテグリン（ＣＲ３）のレクチン部位で生じると信じられている（Petty et al, J. Leukoc. Biol. 54, 492-494, 1993; Sehgal et al, J. Immunol. 150, 4571-4580, 1993）。
【０１３２】
αＭβ２インテグリンのレクチン部位は、幅広い糖特異性を有する（Ross, R. Critical Reviews in Immunology 20,197-222, 2000）。レクチンへの糖結合は、通常親和性が低いにもかからわず、クラスタリングは、結合力を増加させることにより、より強固な相互作用をもたらすことができる。冷やした後のＧＰＩｂαのクラスタリングは、電子顕微鏡により示したように、かかる機構を示唆する。動物細胞の最も一般的なヘキソサミンは、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−ガラクトサミンであり、大部分はＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃとして構造性炭水化物において生成し、αＭβ２インテグリンレクチンドメインもまた、シアル酸によりカバーされていない炭水化物を含む哺乳動物の糖タンパク質に結合してもよいことを示唆している。
【０１３３】
水溶性のＧＰＩｂαであるグリコカリシン(glycocalicin)は、６０％の炭水化物含有量を有し、Ｎ−ならびにＯ−グリコシド結合炭水化物鎖を含む（Tsuji et al, J. Biol. Chem. 258, 6335-6339, 1983）。グリコカリシンは、４つの潜在的なＮ−グリコシル化の部位を含む（Lopez, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84, 5615-5619, 1987）。４５ｋＤａ領域は、Ｎ−グリコシル化される２つの部位を含む（Titani et al, Proc Natl Acad Sci 16, 5610-5614, 1987）。正常な哺乳動物の細胞において、Ｏ−グリカンの４つの一般的なコア構造を合成することができる。これらすべては、機能的炭水化物構造を形成するために、伸長、シアル酸化(sialylated)、フコシル化(fucosylated)および硫酸化してもよい。
【０１３４】
ＧＰＩｂαのＮ−結合炭水化物鎖は、複合体タイプおよびジ−、トリ−およびテトラ−触覚構造(antennary structure)である(Tsuji et al, J. Biol. Chem. 258, 6335-6339, 1983）。それらは、Ａｓｎ−結合のＧｌｃＮＡｃ単位にα（１−６）−結合フコース残基を有するシアル酸化されたＧａｌＮＡｃタイプの構造である。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−結合を有するＡｓｎ−結合糖鎖の構造的類似性がある：すなわち、それらの位置は、共通のＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ配列である。結果は、シアル酸およびガラクトースの除去は、ｖＷｆのグリコカリシンへの結合に影響はないが、ＧｌｃＮａｃの部分的な除去は、ｖＷｆ結合の阻害をもたらしたことを示唆した（Korrel et al, FEBS Lett 15, 321-326, 1988）。より最近の研究は、炭水化物の傾向は、ｖＷｆの結合に直接関与せずに、受容体の適切な機能的コンホメーションを維持することに関与することを提案した（Moshfegh et al, Biochem. Biophys. Res. Communic. 249, 903-909, 1998）。
【０１３５】
冷却した血小板およびマクロファージ間の相互作用における糖の役割は、オリゴ糖残基の共有結合修飾、除去またはマスキングが、この相互作用を阻止することができたという重要な結果を有する。我々は、かかる阻止が、正常な血小板機能を低下させない場合、血小板を修飾することができ、低温血小板貯蔵を可能にするかもしれないという仮説を立てた。
【０１３６】
本明細書において、この仮説に有利に働く証拠を示す：１）糖類は、in vitroでマクロファージにより冷却した血小板の食作用を阻害し、効果的である特定の糖は、β−グルカンを関連標的として関与させた。低濃度のβ−ＧｌｃＮＡｃは、驚くほど効果的な阻害物質であり、比較的少数のクラスター化した糖の妨害は、食作用を阻害するのに十分だろうという考えと一致した。冷却した血小板の食作用を最大限に阻害した濃度での糖の添加は、正常なＧＰＩｂα機能（ｖＷｆ結合）に効果を有さない；２）β−ＧｌｃＮＡｃ−特異的レクチンは、冷却した血小板に貪欲に結合したが、他のレクチンは結合しなかった；３）血小板表面からのＧＰＩｂαまたはβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の除去は、この結合を阻止した（β−ＧｌｃＮＡｃの除去はマンノース残基を暴露したため、マンノース受容体を有するマクロファージにより食作用を阻止しなかった）；４）ガラクトースの酵素的添加による冷却した血小板の暴露されたβ−グルカンの遮断は、in vitroでマクロファージにより冷却した血小板の食作用を顕著に阻害し、正常な動物内で冷却した血小板の循環時間を延長した。
【０１３７】
冷却した血小板の食作用への単糖類の効果
血小板の食作用への単糖類の効果を分析するために、食細胞（分化した単球性細胞系ＴＨＰ−１）を単糖類溶液中様々な濃度でインキュベートし、冷却したまたは室温の血小板を添加した。図中の値は、３〜５の実験の平均±ＳＤであり、ＲＴまたは冷却した血小板とインキュベートした摂取された血小板を含むorange陽性の単球のパーセンテージを比較している。１００ｍＭのＤ−グルコースは、冷却した血小板の食作用を６５．５％阻害したのに対し（Ｐ＜０．０１）、１００ｍＭのＤ−ガラクトースは、冷却した血小板の食作用を有意に阻害しなかった（ｎ＝３）（図８Ａ）。Ｄ−グルコースα−アノマー（α−グルコシド）は、１００ｍＭで９０．２％阻害したが、冷却した血小板の食作用について阻害効果を有しなかった（図８Ｂ）。一方、β−グルコシドは、用量依存的に食作用を阻害した（図８Ｂ）。１００ｍＭのβ−グルコシドを用いた食細胞のインキュベーションは、食作用を８０％（ｐ＜０．０５）阻害し、および２００ｍＭで９７％（Ｐ＜０．０５）阻害し、したがって、本明細書において、β−アノマーが好ましいと結論を出した。
【０１３８】
Ｄ−マンノースおよびそのα−アノマーおよびβ−アノマー（メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（図８Ｃ）およびメチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（図８Ｃ））は、冷却したまたはＲＴの血小板の食作用について阻害効果を有しなかった。２５〜２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）を用いた食細胞のインキュベーションは、冷却した血小板の食作用を有意に阻害した。１０μＭのＧｌｃＮＡｃのβ−アノマーは、冷却した血小板の食作用を８０％阻害したのに対し（ｐ＜０．０１）（図８Ｄ）、２５ｍＭのＧｌｃＮＡｃを用いたインキュベーションは、冷却した血小板の食作用を８６％（Ｐ＜０．０５）阻害するのに十分であった（図８Ｄ）。単糖類のいずれも、ＲＴの血小板の食作用について阻害効果を有しなかった。表２は、冷却した血小板の食作用について指示濃度での単糖類の阻害効果をまとめる（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。単糖類のいずれも、トロンビンまたはリストセチンが誘発したヒト血小板凝集を阻害しなかったか、またはＰ−セレクチン暴露により測定されたようにα−顆粒分泌を誘発しなかった。
【０１３９】
表２．冷却した血小板の食作用についての単糖類の阻害効果
【表７】
【０１４０】
様々なレクチンの室温の血小板または冷却した血小板への結合。
β−ＧｌｃＮＡｃは、μＭ濃度で、in vitroで冷却したヒト血小板の食作用を強力に阻害し、これは、ＧｌｃＮＡｃは、低温での血小板のインキュベーション後に暴露されることを示す。我々は、そして、末端糖（ＧｌｃＮＡｃ）に対して特異性を有するレクチンである小麦胚凝集素（ＷＧＡ）は、室温の血小板よりも、より効果的に冷却した血小板に結合するかどうかを調査した。洗浄した、冷却したまたは室温の血小板を、３０分間室温で２μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ＷＧＡまたはＦＩＴＣ結合スクシニル−ＷＧＡを用いてインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。図９Ａおよび９Ｂは、室温（ＲＴ）または冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す。ＷＧＡは、血小板凝集を引き起こし、そしてＷＧＡ２５〜５０μｇ／ｍｌの濃度でセロトニンまたはＡＤＰの遊離を誘発する（Greenberg and Jamieson, Biochem. Biophys. Acta 345, 231-242, 1974）。２μｇ／ｍｌのＷＧＡとのインキュベーションは、ＲＴの血小板の有意な凝集を誘発しなかったが（図９Ａ、ＲＴ ｗ／ＷＧＡ）、２μｇ／ｍｌのＷＧＡを用いた冷却した血小板のインキュベーションは、大量の凝集を誘発した（図９Ｂ、Ｃｏｌｄ ｗ／ＷＧＡ）。
【０１４１】
図９Ｃは、冷却したまたは室温の血小板に結合するＦＩＴＣ−ＷＧＡ蛍光の分析を示す。蛍光結合の増加は、凝集に関係しないことを確認するために、本明細書において、血小板凝集を誘発しない、レクチンの二量体の誘導体であるスクシニル−ＷＧＡ（Ｓ−ＷＧＡ）を使用した（Rendu and Lebret, Thromb Res 36, 447-456, 1984）。図９Ｄおよび９Ｅは、スクシニル−ＷＧＡ（Ｓ−ＷＧＡ）は、室温のまたは冷却した血小板の凝集を誘発しなかったことを示すが、室温の血小板に対して冷却した血小板へのＷＧＡ結合が同じ増加の結果となった（図９Ｆ）。血小板の冷却後のＳ−ＷＧＡの促進された結合は、冷却した血小板を３７℃に加温することにより、戻すことができない。
【０１４２】
暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基は、連鎖Ｇａｌβ−１ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒを触媒するβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素のための基質として機能を果たす。この予想を支持して、酵素的ガラクトシル化によるβ−ＧｌｃＮＡｃ残基のマスキングは、低温血小板へのＳ−ＷＧＡ結合、ＴＨＰ−１細胞による冷却した血小板の食作用、およびマウスへの輸血後の冷却した血小板の急速なクリアランスを阻害した。ウシβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびそのドナー基質ＵＤＰ−Ｇａｌにより達成した酵素ガラクトシル化は、室温の血小板と同等のレベルに、冷却したヒト血小板へのＳ−ＷＧＡ結合を減少させた。反対に、ガラクトース特異的ＲＣＡ Ｉレクチンの結合は、ガラクトシル化の後約２倍増加した。ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰのみは、冷却したまたは室温のヒト血小板へのＳ−ＷＧＡまたはＲＣＡ Ｉ結合に効果がなかった。
【０１４３】
本明細書において、ヒトおよびマウス血小板の酵素ガラクトシル化は、外因性β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼの添加なしで効率的であることを見出した。ドナー基質ＵＤＰ−Ｇａｌの添加のみは、Ｓ−ＷＧＡ結合を減少させ、冷却した血小板へのＲＣＡ Ｉ結合を増加させ、in vitroでＴＨＰ１細胞による冷却した血小板の食作用を阻害し、マウス内で冷却した血小板の循環を延長させる。この予期せぬ発見についての説明は、血小板が内因性ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をゆっくり放出すると報告されている。β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、β４Ｇａｌ Ｔ１の少なくとも一形態は、ヒト血漿中に、洗浄したヒト血小板におよび洗浄した血小板の上清中に存在する。ガラクトシルトランスフェラーゼは、血小板表面と特異的に関係してもよい。あるいは、活性は、血漿由来であってもよく、および血小板の開放小管系から漏出する。いずれにしても、冷却を介した血小板クリアランスに関与する血小板グリカンの修飾は、糖−ヌクレオチドドナー基質である、ＵＤＰ−Ｇａｌの単純な添加により、可能である。
【０１４４】
重要なことに、両方の冷却したおよび非冷却の血小板は、ガラクトシル化後のＲＣＡ Ｉ結合において同じ増加を示し、これはβ−ＧｌｃＮＡｃ残基が温度から独立して血小板表面において暴露されたことを意味する。しかしながら、冷却は、Ｓ−ＷＧＡによるおよびαＭβ２インテグリンによるβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の認識のための必要条件である。我々は、血小板の冷却は、ＧＰＩｂの不可逆的クラスタリングを誘発することを実証した。一般的に、レクチン結合は、低い親和性を有し、高密度の炭水化物リガンドとの多価の相互作用は、結合力を増加させる。おそらく、非冷却の血小板の表面の暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃの局部密度は、認識には低すぎるが、ＧＰＩｂαの低温誘発性クラスタリングは、Ｓ−ＷＧＡまたはαＭβ２インテグリンレクチンドメインに結合するのに必要な密度を提供する。Ｓ−ＷＧＡおよびＲＣＡ−Ｉ結合フローサイトメトリーにより、ＵＤＰ−Ｇａｌは、添加したガラクトシルトランスフェラーゼの存在下または非存在下でマウス血小板にガラクトースを輸送することを確認し、冷却しガラクトシル化したマウス血小板は循環し、初めは未処理の室温の血小板よりも有意に良好に生存することを立証した。
【０１４５】
最も早い回復は（＜２分）、輸血したＲＴ、冷却した血小板と、冷却しガラクトシル化した血小板との間で差異はなかったにもかかわらず、ガラクトシル化は、ＲＴ血小板で常に観察された約２０％の初期の血小板損失をなくした。
【０１４６】
マウスおよびヒト血小板のガラクトシル化は、最大限に効果的な濃度から３桁小さい濃度までの範囲でのコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）またはトロンビンに誘発された凝集およびＰ−セレクチン暴露により測定されたように、in vitroでのそれらの機能性を低下させなかった。重要なことに、ＧＰＩｂおよび活性化ｖＷｆの間の相互作用の試験である、リストセチン濃度の範囲への未修飾のおよびガラクトシル化し冷却したヒト血小板の凝集反応は、区別できないか、またはわずかに良かった。ＧＰＩｂαのＮ−結合グリカンのための結合点は、ｖＷｆのための結合ポケットの外側である。さらに、Ｎ−結合グリカン欠如する突然変異のＧＰＩｂα分子は、ｖＷｆにしっかりと結合する。
【０１４７】
β−ガラクトース（R. communisのレクチン／ＲＣＡ）、２−３シアル酸（Maackia amurensisのレクチン／ＭＡＡ）または２−６シアル酸（Sambucus nigraの樹皮のレクチン／ＳＮＡ）に関して特異性を有するＦＩＴＣ標識レクチンを用いて、我々は、フローサイトメトリーによる血小板の冷却後の結合の増加は検出できず（図１０）、血小板の冷却後の暴露は、ＧｌｃＮＡｃに制限されることを示した。
【０１４８】
我々は、ＧＰＩｂαＮ−グリカンのαＭβ２レクチンドメイン認識を仲介する暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基をつきとめた。ＧＰＩｂαの細胞外ドメインは、血小板炭水化物含有量の６０％を、Ｎ−およびＯ−グリコシド結合炭水化物鎖の形状で含む。したがって、ペルオキシダーゼ標識ＷＧＡのＧＰＩｂαへの結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された全血小板タンパク質の表示において簡単に検出可能であり、ＧＰＩｂαは、血小板にβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の大部分を含むことを実証しており、ＷＧＡのＧＰＩｂαへの結合が、ＧＰＩｂα免疫沈降物において観察可能である。ＧＰＩｂαへのＲＣＡ Ｉ結合が増加するのに対し、添加したガラクトシルトランスフェラーゼを有するまたは有しないＵＤＰ−Ｇａｌは、ＧＰＩｂαへのＳ−ＷＧＡ結合を減少させる。
【０１４９】
これらの発見は、ガラクトシル化は、特異的にＧＰＩｂαの暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基に及ぶことを示す。In vitroでＴＨＰ−１細胞によりヒト血小板の食作用を阻害したヘビ毒プロテアーゼであるモカラギンを用いたＧＰＩｂαのＮ末端２８２残基のヒト血小板表面からの除去は、Ｓ−ＷＧＡの室温の血小板への結合レベルとほとんど同等に、冷却した血小板へのＳ−ＷＧＡ結合を減少させる。ＷＧＡは主に、そのドメインに特異的なモノクローナル抗体ＳＺ２により認識可能な４５ｋＤａのポリペプチドバンドとして、モカラギンにより血小板上清に遊離されたＧＰＩｂαのＮ末端に結合する。このドメインのグリカンは、Ｎ−結合である。ＧＰＩｂαのごく一部が、モカラギン処置後、無傷のままであり、血小板の開放小管系がそれを隠すからであろう。ペルオキシダーゼ結合ＷＧＡは、モカラギン開裂後、モノクローナル抗体ＷＭ２３で同定可能な残留する血小板関連ＧＰＩｂαのＣ末端を弱く認識する。
【０１５０】
αＭβ２インテグリンへのおよびＳ−ＷＧＡへのヒト血小板の結合における低温誘発性増加は、急速に（数分以内に）生じる。Ｓ−ＷＧＡの冷却した血小板への増強された結合は、自己血漿における１２日までの冷蔵貯蔵で安定したままであった。ＲＣＡ Ｉ結合は、同じ条件下で、室温レベルと同等のままであった。ガラクトシル化は、ＲＣＡ Ｉレクチンの血小板への結合を２倍にし、Ｓ−ＷＧＡ結合をベースラインＲＴレベルへ減少させた。ＲＣＡ Ｉの増加およびＳ−ＷＧＡ結合の減少は、ガラクトシル化が自己血漿における１２日までの貯蔵を進めたかまたは続けたかにかからわず同一であった。これらの発見は、レクチン結合を阻害するための血小板のガラクトシル化が、冷蔵の前または後に可能であり、グリカン修飾が、１２日までの貯蔵中、安定していることを示す。室温で貯蔵した血小板は、凝集剤への反応性を急速に失う；この喪失は、冷蔵のものでは生じない。したがって、貯蔵の前または後に、ガラクトシル化したまたはしなかった、冷蔵血小板は、１２日までの低温貯蔵で、トロンビンへの凝集反応性を保持した。
【０１５１】
室温貯蔵した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡレクチン結合と冷却貯蔵した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡレクチン結合との対比における、β−ヘキソサミニダーゼ（β−Ｈｅｘ）およびモカラギン（ＭＯＣ）の効果
酵素β−ヘキソサミニダーゼは、オリゴ糖からの末端β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基の加水分解を触媒する。ＧｌｃＮＡｃ残基の除去は、ＷＧＡの血小板表面への結合を減少させるかどうかを分析するために、冷却したおよび室温の洗浄したヒト血小板を、１００Ｕ／ｍｌのβ−Ｈｅｘで３０分間３７℃で処置した。図１１Ａは、β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得た室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合の概要を示す。冷却した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合は、ＧｌｃＮＡｃの除去後、８５％減少した（ｎ＝３）。
【０１５２】
また、我々は、予想通り、ＧＰＩｂαの血小板表面からの除去は、血小板の冷却後、ＷＧＡ−結合の減少を引き起こすかどうかを確認した。ＧＰＩｂαを、前記のとおり、ヘビ毒モカラギン（ＭＯＣ）を用いて、血小板表面から除去した（Ward et al, Biochemistry 28, 8326-8336, 1996）。図１１Ｂは、血小板表面からのＧＰＩｂα除去は、冷却した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合を７５％減少させ、ＧＰＩｂαが激減した室温の血小板へのＷＧＡ結合にほとんど影響がなかったことを示す（ｎ＝３）。これらの結果は、ＷＧＡは、ヒト血小板の冷却後、大部分はＧＰＩｂαのオリゴ糖に結合することを示し、Ｍａｃ−１レクチン部位もまた、食作用を引き起こすＧＰＩｂαのこれらの暴露された糖を認識すると推測したくなる。
【０１５３】
ガラクトース輸送によるヒト血小板ＧｌｃＮＡｃ残基のマスキングは、in vitroで冷却後、それらの食作用を大いに減少させ、マウス内でのそれらの生存を劇的に増加させる。
血小板へのガラクトース輸送を達成するため、単離したヒト血小板を、２００μＭのＵＤＰ−ガラクトースおよび１５ｍＵ／ｍｌのガラクトーストランスフェラーゼと共に３０分間３７℃でインキュベートし、次いで２時間冷却したかあるいは室温で維持した。ガラクトシル化は、ＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合をほぼ休止室温レベルまで減少させた。血小板を単球に摂取させ、血小板の食作用を上記のように分析した。図１２は、血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送は、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を大いに減少させるが、室温（ＲＴ）の血小板の食作用に影響を及ぼさないことを示す（ｎ＝３）。これらの結果は、in vitroにおいて、冷却した血小板の食作用は、暴露したＧｌｃＮＡｃ残基の被覆により減少させることができることを示す。
【０１５４】
我々は、このアプローチを、動物にまで広げることができるかどうか、そして冷却した血小板の循環時間を増加させるために用いることができるかどうかを試験した。マウス血小板を単離し、ＣＭＦＤＡで染色した。ヒト血小板について上述したガラクトース輸送の同じアプローチを用いて、野生型のマウス血小板をガラクトシル化し、２時間冷却したか、あるいはしなかった。１０８個の血小板を野生型のマウスに輸血し、それらの生存を決定した。図１３は、未処理の血小板と比較した、これらの冷却しガラクトシル化したマウス血小板の生存率を示す。冷却した未処理の血小板（Ｃｏｌｄ）は、予想通り急速に一掃されたのに対し、室温で保持した血小板（ＲＴ）およびガラクトシル化し冷却した血小板（Ｃｏｌｄ＋ＧａｌＴ）の両方は、ほぼ同一の生存時間を有した。我々は、ガラクトシル化し冷却した血小板は、ヒト内で循環するだろうと信じている。
【０１５５】
ガラクトーストランスフェラーゼを熱不活性化した対照の反応もまた、ＷＧＡ結合（図１４Ａ）、ヒト血小板におけるin vitro食作用の結果（図１４Ｂ）、およびマウス血小板の生存（図１４Ｃ）により判断されたように、活性なガラクトーストランスフェラーゼによる実験的反応において生じたように、血小板のグリカン修飾をもたらしたことに注目した。したがって、我々は血小板がそれらの表面において、いかなる外因性ガラクトーストランスフェラーゼを添加することなく、ＵＤＰ−ガラクトースのみを用いてグリカン修飾を進めることができるガラクトーストランスフェラーゼ活性を含むと結論づける。したがって、血小板のグリカン修飾は、単純にＵＤＰ−ガラクトースのインキュベーションにより、達成することができる。
【０１５６】
ＵＤＰ−ガラクトースを時間依存的にヒト血小板に取り込む。
別の一連の実験において、１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースを、酵素ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下または非存在下において、時間依存的にヒト血小板に取り込むことを示した。図１５は、１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの洗浄したヒト血小板への取り込みの経時変化を示す。ヒト血小板を、異なる時間間隔でガラクトシルトランスフェラーゼの非存在下で１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースを用いてインキュベートした。そして血小板を洗浄し、血小板に関連する１４Ｃ放射活性を測定した。
【０１５７】
例３
血小板β−グリカンの酵素修飾は、in vitroのマクロファージによる冷やした血小板の食作用を阻害し、in vivoの正常な循環を適応させる。
我々の予備実験は、冷却したヒト血小板表面へのガラクトース輸送（グリカン修飾）を用いたＧＰＩｂαにおけるＧｌｃＮＡｃ残基の酵素的被覆が、それらのin vitro食作用を大いに減少させたことを実証した。これらの発見の解釈は、ＧＰＩｂα構造は、冷却したヒトおよびマウス血小板の表面上で変化したということである。これは、αＭβ２のレクチン結合ドメインにより認識されるＧｌｃＮＡｃの暴露またはクラスタリングの原因となり、血小板除去を引き起こす。β−ＧｌｃＮＡｃの暴露は、ＷＧＡ結合によりおよびおそらく組み換え型αＭβ２レクチンドメインペプチドの結合により測定することができる。休止しているヒト血小板は、冷却後大いに増加するＷＧＡを結合する。我々は、ガラクトース輸送（グリカン修飾）は、αＭβ２−レクチンとのＧＰＩｂαの相互作用を阻止するがｖＷｆとの相互作用を阻止しないことを提案する。この修飾（血小板表面へのガラクトース輸送）は、予備実験により示したように、ＷＴマウスにおける冷却した血小板の正常な生存へと導く。
【０１５８】
例４
この例は、αＭβ２レクチン部位はＷＧＡを模倣し、糖修飾は組み換え型レクチン部位の冷却した血小板との関与を阻止することを示す。Dr. T. Springer（Corbi, et al., J. Biol Chem. 263, 12403-12411, 1988）は、ヒトαＭ ｃＤＮＡおよびいくつかの抗αＭ抗体を提供した。報告されているレクチン作用を示す最小のｒ−ｈｕαＭコンストラクトは、そのＣ−Ｔおよびその二価陽イオン結合領域（残基４００〜１０９８）の一部を含む（Xia et al, J Immunol 162, 7285-7293, 1999）。本コンストラクトは、精製を簡単にするため、6xHisタグ付である。
【０１５９】
我々は、組み換え型レクチンドメインを、食作用アッセイにおける冷却した血小板の摂取の競合的阻害物質として使用することができるかを、第一に決定した。競合は、αＭレクチン部位が、血小板表面への結合に関与しており、食作用を開始させることを証明した。対照として、αＭのレクチン結合領域が欠如しているコンストラクトを使用し、組み換え型タンパク質を変性した。レクチン結合ドメインは、冷却した血小板の摂取の特異的阻害物質として機能する。ＧＦＰを含んで発現するαＭコンストラクトを作り、αＭ−レクチン結合部位をＦＩＴＣで標識し、それをフローサイトメトリーにより冷却した血小板の表面を標識するために使用した。血小板をＣＭＦＤＡで標識した。冷却した血小板は、室温の血小板と比較して、αＭβ２インテグリンのαＭレクチン側により効率的に結合することを見出した。レクチン側および全αＭコンストラクト（Ｍａｃ−１）は、Ｓｆ９昆虫細胞において発現された。
【０１６０】
血小板糖鎖を、ｒ−ｈｕαＭ−レクチン部位との血小板−オリゴ糖相互作用を阻害するために修飾する。糖修飾の効率もまた、フローサイトメトリーにより血小板に結合する蛍光−レクチンドメインの結合の阻害により、観察する。
【０１６１】
室温の、冷却したおよび冷却し修飾した血小板の回復および循環時間を、冷却したマウス血小板へのガラクトース輸送が血小板のより長い循環をもたらすことを確立するために比較する。室温の、冷却したおよび冷却し修飾した血小板をＣＭＦＤＡで染色し、上記のとおり１０８個の血小板を野生型のマウスに輸血した。マウスを輸血後すぐに（＜２分）、３０分、１時間、２、２４、４８および７２時間後に出血させる。得た血液を、フローサイトメトリーを用いて分析する。注射直後に測定した、ゲートした血小板集団内の蛍光標識血小板の比率を、１００％と設定する。様々な時点で得た蛍光標識血小板の回復を、適宜計算する。
【０１６２】
例５
この例は、冷却した未修飾血小板および冷却しガラクトシル化した(修飾）血小板は、in vitroおよびin vivoにおいて止血機能を有することを実証する。冷却した血小板は、アゴニスト刺激血小板という意味で「活性化」されない。低体温条件下で手術を受ける患者は、血小板減少症を発現するか、または深刻な止血の術後障害を示すかもしれない。これらの低温条件下で、血小板は、自身の機能性を失うかもしれないと信じられている。しかしながら、患者が低温手術を受けるとき、全生物は、低体温症へ暴露され、したがって多くの組織における変化を引き起こす。非冷却の血小板の肝類洞内皮細胞への付着は、低温保存障害の主要な機構である（Takeda, et al. Transplantation 27, 820-828, 1999）。したがって、手術のまたは低温保存した器官の移植の低温条件下での有害な結果へと至らしめるのは、低温肝内皮および血小板の相互作用であって、血小板の冷却自体ではないようである（Upadhya et al, Transplantation 73, 1764-1770, 2002）。２つのアプローチが、冷却した血小板が止血機能を有することを示した。１つのアプローチにおいて、αＭβ２欠損マウスにおける冷却した血小板の循環は、冷やした後の血小板機能の研究を簡易化する。他のアプローチにおいて、修飾し冷却したおよび（おそらく）循環している血小板の機能を試験した。
【０１６３】
ヒトおよびマウスの未修飾のおよび修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を、アゴニストに対するin vitro凝集、Ｐ−セレクチン暴露およびフィブリノゲン結合を含む、機能性について試験した。
【０１６４】
αＭβ２欠損またはＷＴマウスに、マウスの冷却した／ＲＴの、修飾したまたはされていない血小板を輸血し、３０分間、２および２４時間循環させた。我々は、冷却した血小板は、尾静脈出血が原因の凝固反応に寄与するか、およびこれらの血小板は、活性化後、フィブリノゲンなどの剤を結合させるかを決定する。また、冷却した、修飾したまたはされていない血小板は、我々が開発したin vivo血栓形成モデルである、塩化第二鉄で損傷したおよび体外に出た(exteriorized)マウスの腸間膜において、どのように凝固に寄与するかを決定する。本方法は、損傷した血管に付着した血小板の数を検出し、糖タンパク質Ｖまたはβ３−インテグリン機能を欠如する血小板の低下した血小板血管壁の相互作用を立証した（Ni et al., Blood 98, 368-373 2001; Andre, et al. Nat Med 8, 247-252, 2002）。最後に、修飾血小板の貯蔵パラメータを決定する。
【０１６５】
In vitro血小板機能を、トロンビンおよびＡＤＰによる凝集、ならびにボトロセチンが誘発するマウス血小板へのｖＷｆ結合を用いて比較しする。マウスおよびヒトの冷却した血小板修飾（ガラクトシル化した）または未修飾血小板を、０．３×１０９個／ｍｍ３の血小板濃度に標準化し、凝集を、標準の手順に従って、様々なアゴニストを用いて誘発した（Bergmeier, et al. 2001 276, 25121-25126, 2001）。ｖＷｆ結合を研究するために、ボトロセチンを用いてマウスｖＷｆを活性化し、ＰＲＰにおいて冷却し修飾したまたはされていない血小板への蛍光標識ｖＷｆの結合を分析する（Bergmeier, et al. 2001 276, 25121-25126, 2001）。血小板の脱顆粒が、修飾中に生じるかどうかを評価するために、フローサイトメトリーにより蛍光標識抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて冷却したマウスおよびヒトの、修飾したまたはされていない血小板のＰ−セレクチン暴露もまた測定する（Michelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93,11877-11882, 1996）。
【０１６６】
１０９個のＣＭＦＤＡ標識血小板をマウスに輸血し、最初にこれらの血小板が、in vitroで機能的であることを確認する。冷却した血小板は、冷却したまたは室温のＣＭＦＤＡ標識血小板をαＭβ２欠損マウスに輸血することにより凝集に寄与するかどうかを決定する。血小板の注入後３０分、２時間および２４時間目に、標準の尾静脈出血試験を行なう（Denis, et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 9524-9529, 1998）。生じる血液を１％のホルムアルデヒドですぐに固定し、血小板凝集を全血フローサイトメトリーにより決定する。血小板凝集体は、ドットプロット分析においてより大きなサイズの粒子として現れる。輸血した血小板が正常な循環において凝集しないことを確認するために、マウスを眼窩後方の眼の叢を通して抗凝血剤内へも出血させる。血小板は、これらの出血条件下では凝集体を形成しない。生じる血液をすぐに固定し、上記のように血小板を全血においてフローサイトメトリーにより分析する。
【０１６７】
血小板を、フィコエリスリン接合αＩＩｂβ３特異的モノクローナル抗体の結合を通して確認する。血液サンプル中の注入した血小板を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光により確認する。非注入の血小板を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光の欠如により確認する（Michelson, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 93,11877-11882, 1996）。同じ一連の試験を、ＣＭＦＤＡ修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を用いて、これらの血小板をαＭβ２およびＷＴへ輸血することにより行う。本実験は、流血において冷却し修飾したまたはされていない血小板の凝集を試験する。
【０１６８】
１０９個のCM-Orange標識した未修飾の冷却したまたは室温の血小板を、αＭβ２欠損マウスに輸血し、これらの血小板が、in vitroで機能的であることを確認する。CM-orange標識血小板の注入後３０分、２時間および２４時間目に、既述のようにＰＲＰを単離し、フローサイトメトリーにより分析する。Ｐ−セレクチン暴露を、抗ＦＩＴＣ結合抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて測定する（Berger, et al, Blood 92, 4446-4452, 1998）。非注入の血小板を、それらのCM-orange蛍光の欠如により確認する。血液サンプルにおける注入した血小板を、それらのCM-orange蛍光により確認する。CM-orangeおよびＰ−セレクチン陽性血小板は、二重に陽性の蛍光（CM-Orange／ＦＩＴＣ）染色した血小板として現れる。
【０１６９】
冷却した血小板はまだ、トロンビンの活性化後Ｐ−セレクチンを暴露することを確認するために、ＰＲＰをトロンビンの添加（１Ｕ／ｍｌ、２分間３７℃で）を通して活性化し、Ｐ−セレクチン暴露を既述のように測定する。フィブリノゲンのαＩＩｂβ３への結合を分析するために、単離した血小板をトロンビンの添加（１Ｕ／ｍｌ、２分間３７℃で）を通して活性化し、Oregon-green結合フィブリノゲン（２０μｇ／ｍｌ）を２０分間３７℃で添加する（Heilmann, et al, Cytometry 17, 287-293, 1994）。サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析する。ＰＲＰサンプルにおける注入した血小板を、それらのCM-orange蛍光により確認する。CM-orangeおよびOregon-green陽性血小板は、二重に陽性の蛍光染色した（CM-orange／Oregon green）血小板として現れる。同じ一連の実験を、αＭβ２欠損およびＷＴマウスに輸血したCM-orange標識した修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を用いて行なう。
【０１７０】
例６
In Vivo血栓症モデル
最初に、二重蛍光標識血小板を用いて、αＭβ２欠損マウスの損傷した内皮へのＲＴおよび未修飾の冷却した血小板の到達を示す。休止している血管を４分間観察し、その後塩化第二鉄（３０μｌの２５０ｍＭ溶液）（Sigma, St Louis, MO）を灌流により細動脈の上部に適用し、ビデオ記録をさらに１０分間再開する。中心線(centerline)赤血球速度（Ｖｒｂｃ）を、撮影前および塩化第二鉄損傷の１０分後に測定する。剪断率を、ニュートン流体についてのポアゾイユの法則（Poiseuille's law)に基づいて計算する（Denis, et al, Proc Natl Acad Sci USA 95, 9524-9529, 1998）。これらの実験は、冷却した血小板が、正常な止血機能を有しているかを示す。ＲＴおよびガラクトシル化し冷却した血小板に対し、２つの異なる蛍光標識血小板の集団を用いて、同じマウスに注入し、ＷＴマウスにおいてこれらの実験を繰り返し、両方の血小板の集団の血栓形成および取り込みを分析する。
【０１７１】
そして、上記のように冷蔵で１、５、７および１４日間貯蔵し冷却したおよび修飾し冷却したマウス血小板の、in vitroの血小板機能および生存ならびにin vivoの止血作用を比較する。これらの貯蔵し冷却したおよび修飾し冷却した血小板の回復および循環時間を比較し、１）冷却したマウス血小板へのガラクトース輸送を通した修飾は、長期間冷蔵後安定している；および２）これらの血小板が正常に機能する、ことを証明する。生存実験を、上記のように行なう。ＷＧＡ結合を使用して、ＧｌｃＮＡｃ残基が、より長い貯蔵時点の後、ガラクトースにより被覆されたままであることを確認する。
【０１７２】
これらの修飾し貯蔵した血小板が機能的に無傷で止血に寄与することの究極的な試験として、これらを全身照射されたマウスに輸血する（Hoyer, et al, Oncology 49, 166-172, 1992）。十分な数の血小板を得るために、マウスに市販のマウストロンボポエチンを７日間注射し、それらの血小板数を増加させる（Lok, et al. Nature 369, 565-558, 1994）。単離された血小板を、最適化したガラクトース輸送手順を用いて修飾し、冷蔵貯蔵し、輸血し、および尾静脈出血時間を測定した。未修飾の冷却した血小板は、循環内で生き残らないため、修飾し冷やした血小板と室温の貯蔵した血小板との比較は、この時点では必要ない。マウス血小板を、標準の試験管内で冷蔵貯蔵する。室温貯蔵したマウス血小板との比較が必要な場合、霊長類の血小板に切り替える。マウス血小板に適応させるための、技術的に特別な、小型化された、ガス透過性貯蔵容器よりも、かかる比較は、室温の貯蔵バッグが専用に設計された霊長類（ヒトを含む）の方がより適切である。
【０１７３】
例７
血小板製剤中の血小板のガラクトシル化
４種類の異なる血小板製剤を、ＵＤＰガラクトースの濃度を増加して処置した：４００μＭ、６００μＭ、および８００μＭ。ＲＣＡ結合比率の測定値は、４つの試験したサンプルにおいて、ガラクトシル化の用量依存的増加を示す（図１６）。本結果は、ガラクトシル化は、血小板製剤において可能であるという証拠を提供する。
【０１７４】
前述は、単に特定の好ましい態様の詳細な説明であると理解されるべきである。したがって、当業者には、様々な改良および同等物が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく可能であることが明らかである。添付の請求項の範囲内のすべてのかかる改良を包含することを意図する。
【０１７５】
本出願中列挙したすべての参考文献、特許および特許公開公報は、全体的に参考のために本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】室温の血小板、ならびにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢの存在下または非存在下で、冷却し再加温した血小板のマウスにおける循環時間を示す図である。
【図１Ｂ】In vitroで正常に凝集する冷却した血小板を示す図である。
【図１Ｃ】低温誘発クリアランスが主にマウスの肝臓内で生じることを示す図である。
【図１Ｄ】冷却した血小板は、肝類洞マクロファージ（クッパー細胞）と共局在することを示す図である。
【図２】冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で正常に循環するが、補体３（Ｃ３）またはｖＷｆ欠損マウス内で循環しないことを示す図である。
【０１７７】
【図３Ａ】冷却し再加温したＴＲＩＴＣ標識血小板（左のパネル）が、室温のＣＭＦＤＡ標識血小板（右のパネル）よりも、３〜４倍の高い頻度で肝類洞に付着することを示す図である。
【図３Ｂ】冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ、中抜きの棒）および室温の血小板（ＲＴ、中塗りの棒）は、野生型のマウスと類似した分布で高マクロファージ密度（中間帯）の類洞部位に付着することを示す図である。
【図３Ｃ】冷却し再加温した血小板は、野生型の肝臓内のマクロファージに、室温の血小板よりも３〜４倍多く付着する（中抜きの棒）ことを示す図である。
【０１７８】
【図４Ａ】室温で保持した（左のパネル）、または冷却し再加温した（右のパネル）、同系の野生型のマウスに注入した、ＧＰＩｂα細胞外ドメインを酵素的に除去したＣＭＦＤＡ標識血小板（左のパネル、挿入図、中塗りの範囲）または対照の血小板の生存率を示す図である。
【図４Ｂ】ＦＩＴＣ標識抗ｖＷｆ抗体を用いて検出したｖＷｆ結合を示す図である。
【図４Ｃ】ｖＷｆ受容体は、冷却したマウス血小板の表面上で線形配列（ＲＴ）から凝集体（Ｃｈｉｌｌｅｄ）へ再分布することを示す図である。
【０１７９】
【図５Ａ】室温（ＲＴ）の血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞の典型的なアッセイ結果を示す図である。
【図５Ｂ】冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞の典型的なアッセイ結果を示す図である。
【図５Ｃ】未分化（中抜きの棒）ＴＨＰ−１細胞はＣＲ３を約５０％少なく発現させ、冷却し再加温した血小板の半分程度を摂取することを示す図である。
【０１８０】
【図６Ａ】末梢血を全血フローサイトメトリーで分析した、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｂ】流血を全血フローサイトメトリーで分析した、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｃ】末梢血を全血フローサイトメトリーで分析した、ＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｄ】流血を全血フローサイトメトリーで分析した、ＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｅ】野生型のマウスに輸血した、CM-Orangeの、室温の（ＲＴ）血小板およびＣＲ３欠損マウスに輸血した、CM-Orangeの、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板のex vivo機能を示す図である。
【図７】２種類の血小板クリアランス経路を描写する図である。
【図８Ａ】冷却した血小板の食作用への単糖類（グルコースおよびガラクトース）の効果を示す図である。
【図８Ｂ】冷却した血小板の食作用への単糖類（α−グルコシドおよびβ−グルコシド）の効果を示す図である。
【図８Ｃ】冷却した血小板の食作用への単糖類（α−マンノシドおよびβ−マンノシド）の効果を示す図である。
【図８Ｄ】冷却した血小板の食作用への単糖類（ＧｌｃＮＡｃおよびβ−ＧｌｃＮＡｃ）の効果を示す図である。
【図９Ａ】室温（ＲＴ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｂ】冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｃ】冷却したまたは室温の血小板に結合するＦＩＴＣ−ＷＧＡ蛍光の分析を示す図である。
【図９Ｄ】室温（ＲＴ）ヒト血小板のスクシニル−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｅ】冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のスクシニル−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｆ】冷却したまたは室温の血小板に結合するスクシニル−ＷＧＡ蛍光の分析を示す図である。
【０１８１】
【図１０】室温のまたは冷却した血小板へ結合した様々なＦＩＴＣ標識レクチンの分析を示す図である。
【図１１Ａ】β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得られた室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡの結合の概要を示す図である。
【図１１Ｂ】血小板表面からのＧＰＩｂαの除去が冷却した血小板に結合したＦＩＴＣ−ＷＧＡを減少させたことを示す図である。
【図１２】血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送が、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を減少させるが、室温の血小板（ＲＴ）の食作用には影響しないことを示す図である。
【図１３】未処理の血小板に対する、冷却しガラクトシル化したマウス血小板の生存率を示す図である。
【０１８２】
【図１４Ａ】自身の表面にガラクトーストランスフェラーゼを含有する血小板は、ＷＧＡ結合により判断されたように、トランスフェラーゼの添加なしでガラクトースを輸送することを示す図である。
【図１４Ｂ】ヒト血小板についてのin vitro食作用の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】マウス血小板の生存率におけるガラクトーストランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）ありまたはなしでのＵＤＰ−ガラクトースを示す図である。
【図１５】ヒト血小板への１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの取り込みの経時変化を示す図である。
【図１６】ＵＤＰ−ガラクトースの異なる濃度での４種類の血小板濃度サンプル中の血小板のガラクトシル化を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血小板のクリアランスを減少させるおよび血小板の生存を延長するための組成物および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
血小板は、血管損傷位置への付着および血漿フィブリン塊の形成の促進により、損傷した哺乳動物を失血から保護する無核の骨髄由来の血液細胞である。骨髄機能不全により血小板の循環が激減したヒトは、生命にかかわる特発性出血を患い、および重症度の低い血小板欠損症は、外傷または手術に次ぐ出血合併症の一因となる。
【０００３】
７０，０００個／μＬ以下への循環血小板数の減少は、標準皮膚出血時間試験の延長をもたらし、そして出血間隔は長くなり、血小板数がゼロまで減少するにつれて無限大近くになると推定されることが、報告されている。血小板数が２０，０００個／μＬ未満の患者は、特に血小板減少症が骨髄機能不全によって引き起こされるときおよび罹患した患者が敗血症または他の障害により破壊されたとき、粘膜の表面からの特発性出血を非常に起こしやすいと考えられている。再生不良性貧血、急性および慢性白血病、転移癌だが特に電離放射線および化学療法による癌処置がもたらした転移癌などの骨髄疾患に関連する血小板欠損症は、主要な公衆衛生問題を表す。主要な手術、障害および敗血症に関連する血小板減少症もまた、かなりの数の血小板輸血の投与に帰結する。
半世紀前の医療における大きな進展は、かかる血小板欠損症を治療するための血小板輸血の開発であり、９００万件を超える血小板輸血が、１９９９年に米国単独で行なわれた(Jacobs et al., 2001)。血小板は、しかしながら、すべての他の移植可能な組織とは違って、非常に短期間の冷却の対象となる場合でも血小板は受容者(recipient)の循環から急速に消滅し、血小板の生存を短縮させる冷やす(cooling)効果は不可逆であるため、冷蔵に耐容性がない(Becker et al., 1973; Berger et al., 1998)。
【０００４】
その結果生じる、輸血前にこれらの細胞を室温で保持する必要性は、血小板貯蔵のために、独特な一連の費用がかかり複雑な物流の必要条件を強いてきた。血小板は、室温で活発に代謝するため、代謝性アシドーシスの有毒な結果を防ぐために、発生したＣＯ２の放出を可能にし、血小板は多孔性容器内での持続的攪拌を要求する。室温貯蔵条件は、「貯蔵損傷」として知られる一連の欠陥である、高分子の分解および血小板の止血機能の低下をもたらす(Chemoff and Snyder, 1992)。しかし、短い（５日）制限へと至らしめる室温貯蔵についての主要な問題は、より高い細菌感染の危険性である。血液成分の細菌汚染は現在、最も頻繁に起こる血液成分使用の感染性合併症であり、ウィルス媒介のそれをはるかに超える(Engelfriet et al., 2000)。米国においては、年間３０００〜４５００件の細菌敗血症の症状が、細菌汚染された血液成分が原因で生じる(Yomtovian et al., 1993)。
【０００５】
血小板の独特な不可逆的低温不耐性の根底にある機構は、生理学的重要性を有しているため、謎であった。循環血小板は、血管損傷と反応すると、複雑な形態へと変形する滑らかな表面の円盤である。４０年以上前、研究者達は、円盤状の血小板もまた、冷蔵温度で形態が変化することに注目した(Zucker and Borrelli, 1954)。円盤状の形態が室温で貯蔵した血小板の生存度の最良の予測の判断材料であるというその後の証拠は(Schlichter and Harker, 1976)、低温誘発された形態は本質的に、冷却した血小板の急速なクリアランスに関与するという結論を導き出した。おそらく冷やすことにより変形した不規則な形をした血小板は、微小循環内で捕捉されるようになったのであろう。
【０００６】
シグナル伝達をリガンドにより誘発される血小板の形態変化へと至らしめる機構と結びつける我々の研究を基に(Hartwig et al., 1995)、我々は、冷却は、カルシウムの放出を阻害することにより、アクチンフィラメントを切断し、アクチンフィラメントの反矢じり端(barbed end)をキャッピングするタンパク質であるゲルゾリンの活性化と一致する程度にカルシウムレベルを上昇させるだろうと予測した。我々はまた、低温での膜脂質相転移は、ホスホイノシチドをクラスター化するだろうと判断した。ホスホイノシチドクラスタリングは、アクチンフィラメント反矢じり端をアンキャッピングし(uncap)(Janmey and Stossel, 1989)、フィラメント伸長のための核形成部位を作り出す。我々は、両方の機構の実験的証拠を生み出し、ゲルゾリンの活性化、アクチンフィラメント反矢じり端のアンキャッピング、および冷やした血小板におけるアクチンの集合を立証した(Hoffmeister et al., 2001; Winokur and Hartwig, 1995)。
【０００７】
他者は、膜相転移と一致する冷却した血小板における分光変化を報告している者もいる(Tablin et al., 1996)。この情報は、カルシウムの上昇を阻害するために細胞透過性カルシウムキレート剤を用い、そして反矢じり端のアクチンの集合を阻止するためにサイトカラシンＢを用いて、冷却した血小板の円盤状の形態を保存するための方法を提案した。これらの剤の添加は、４℃で血小板を円盤状の形態に保持するが(Winokur and Hartwig, 1995)、我々が本明細書において報告するように、かかる血小板はまた、急速に循環から一掃される。したがって、冷却した血小板の急速なクリアランスの問題が残り、血小板についての循環時間ならびに貯蔵時間を増加する方法が必要である。
【０００８】
発明の概要
本発明は、減少した血小板クリアランスを有する修飾血小板および血小板クリアランスを減少させる方法を提供する。本発明はまた、血小板の保存のための組成物を提供する。本発明はまた、修飾血小板を含有する医薬組成物を作る方法および止血を媒介する(mediate)ために哺乳動物に医薬組成物を投与するための方法を提供する。
【０００９】
ヒト血小板の冷却は、血小板表面上のフォンヴィルブランド(von Willebrand)因子（ｖＷｆ）受容体複合体αサブユニット（ＧＰＩｂα）の複合体のクラスタリングを引き起こすことが現在発見されている。血小板表面上のＧＰＩｂα複合体のクラスタリングは、in vitroおよびin vivoでマクロファージ補体タイプ３受容体（αＭβ２、ＣＲ３）による認識を引き出す。ＣＲ３受容体は、ＧＰＩｂα複合体の末端βＧｌｃＮＡｃによりＮ結合糖類を認識し、血小板を貪食し(phagocytose)、循環から血小板を一掃し、止血機能の付随的損失をもたらす。
【００１０】
本出願人は、ＧＰＩｂαの暴露されたβＧｌｃＮＡｃの残基を糖化へと至らしめると信じられている特定の糖分子による血小板の処置は、血小板クリアランスを減少させ、血小板食作用を妨害し、血小板循環時間を増加させ、および血小板貯蔵時間を増加させたことを発見した。
【００１１】
本発明の一側面は、血小板の集団の循環時間を増加させる方法を提供する。該方法は、単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１２】
いくつかの態様において、本方法は、グリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することをさらに含む。グリカン部分の修飾を触媒する酵素の一例は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。
好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００１３】
いくつかの態様において、血小板の集団の循環時間を増加させる方法は、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に血小板の集団を冷却することをさらに含む。
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
いくつかの態様において、循環時間は少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上増加する。
【００１４】
本発明の別の側面によると、血小板の貯蔵時間を増加させる方法を提供する。該方法は、単離された血小板の集団を前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤の量と接触させること、および血小板の集団を貯蔵することを含む。
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１５】
いくつかの態様において、本方法は、血小板の表面上のグリカンへのグリカン修飾剤の添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む。好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
いくつかの態様において、本方法は、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む。
【００１６】
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる。
血小板を少なくとも約３日、少なくとも約５日、少なくとも約７日、少なくとも約１０日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、または少なくとも約２８日間冷却貯蔵する。
【００１７】
本発明の別の側面によると、修飾血小板を提供する。
該修飾血小板は、血小板の表面上に複数の修飾グリカン分子を含む。
いくつかの態様において、修飾グリカン分子は、ＧＰＩｂα分子の部分である。該修飾グリカン分子は、少なくとも１種の添加した糖分子を含む。
添加した糖は、天然の糖であってよく、または非天然の糖であってもよい。
添加した糖の例は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体を含むが、これらに限定されない。好ましい態様の一つにおいて、添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースである。
【００１８】
別の側面において、本発明は複数の修飾血小板を含む血小板組成物を提供する。いくつかの態様において、血小板組成物は貯蔵培地をさらに含む。いくつかの態様において、血小板組成物は、薬学的に許容しうる担体をさらに含む。
【００１９】
本発明のさらに別の側面によると、哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法を提供する。該方法は、
（ａ）薬学的に許容しうる担体中に含有された血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させ、処置した血小板製剤を形成するステップ、
（ｂ）処置した血小板製剤を貯蔵するステップ、および
（ｃ）処置した血小板製剤を加温するステップ
を含む。
いくつかの態様において、処置した血小板製剤を加温するステップは、血小板を３７℃に加温することにより行なわれる。
【００２０】
いくつかの態様において、薬学的に許容しうる担体に含まれた血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、グリカン部分の修飾を触媒する酵素の存在下で、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む。いくつかの態様において、本方法は、血小板製剤中の酵素を除去または不活性化する、例えば血小板製剤を洗浄する方法をさらに含む。
グリカン修飾剤の例を上に記載する。好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。いくつかの態様において、本方法は、グリカン修飾剤のグリカン部分への添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む。
好ましい態様の一つにおいて、グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００２１】
いくつかの態様において、血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する。
特定の態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
いくつかの態様において、血小板製剤を約１５℃未満の温度で貯蔵する。いくつかの他の態様において、血小板製剤を室温で貯蔵する。
【００２２】
本発明のさらに別の側面によると、哺乳動物において止血を媒介する方法を提供する。本方法は、哺乳動物へ複数の修飾血小板または修飾血小板組成物を投与することを含む。
本発明のまたさらに別の側面によると、血小板を保存するための貯蔵組成物を提供する。該組成物は、貯蔵組成物に添加した血小板の貯蔵時間および／または循環時間を増加させるために、貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、組成物はグリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、組成物を約１５℃未満の温度で貯蔵する。いくつかの他の態様において、組成物を室温で貯蔵する。
【００２３】
本発明の別の側面によると、血小板を収集する(および随意に加工する)ための容器を提供する。本容器は、貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、本容器はグリカン修飾剤によりグリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む。
いくつかの態様において、本容器は複数の血小板または複数の血小板を含む血漿をさらに含む。
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、自然発生の血小板中より高い濃度で存在する。
【００２４】
本発明のまたさらに別の側面によると、血小板を収集および加工するための装置を提供する。本装置は、血小板を収集するための容器；前記容器との液体伝達における少なくとも１つのサテライト(satellite)容器；およびサテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。
いくつかの態様において、サテライト容器中のグリカン修飾剤は、容器中の血小板を保存するのに十分な量で存在する。
いくつかの態様において、サテライト容器中のグリカン修飾剤は、破壊可能なシールにより容器への流入を阻止される。
【００２５】
本発明のこれらのおよび他の側面、ならびに様々な利点および有用性は、以下の発明の詳細な説明を参考により明確になるだろう。本発明の各限定は、本発明の様々な態様を包含することができる。したがって、いずれか一要素または要素の組み合わせを含む各限定を、本発明の各側面に含むことができることが予想される。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１Ａは、室温の血小板、ならびにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢの存在下または非存在下で、冷却し再加温した血小板の、マウスにおける循環時間を示す。曲線は、５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）で標識された、室温（ＲＴ）の血小板、氷浴の温度（Ｃｏｌｄ）で冷却し注射前に室温まで再加温した血小板、ならびに血小板の円盤状の形態を保存するためにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢで処置した、冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ＋ＣｙｔｏＢ／ＥＧＴＡ）の生存率を表す。各曲線は、６匹のマウスの平均±ＳＤを表す。同一のクリアランス傾向が、１１１インジウム標識血小板で観察された。
【００２７】
図１Ｂは、in vitroで正常に凝集する冷却した血小板を示す。洗浄した、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）または室温（ＲＴ）の野生型の血小板を、３７℃で示したアゴニストの添加により刺激し、光透過率を、標準の血小板凝集計で記録した。ＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢで処置した冷却した血小板の凝集反応は、未処置の冷却した血小板と同一だった。
【００２８】
図１Ｃは、低温誘発クリアランスが主にマウスの肝臓内で生じることを示す。肝臓は、冷却した血小板の主要クリアランス器官であり、注入した血小板を６０〜９０％含む。一方、ＲＴ血小板は、脾臓内でよりゆっくりと一掃される。１１１インジウム標識血小板を同系のマウスに注入し、組織を０．５、１および２４時間目に採取した。データをグラムあたりの組織で表現する。各棒(bar)は、４匹の分析した動物の平均値±ＳＤを表す。
【００２９】
図１Ｄは、冷却した血小板は、肝類洞(hepatic sinusoidal)マクロファージ（クッパー細胞）と共局在する(co-localize)ことを示す。この代表的な共焦点顕微鏡写真は、輸血の１時間後に、肝小葉の門脈周囲領域および中間帯領域(midzonal field)に優先的に蓄積する、ＣＭＦＤＡ標識された、冷却し再加温した血小板（緑）の肝分布を示す。クッパー細胞を、ナイルレッドで標識された球体の注射後に視覚化する。重ね合わせた顕微鏡写真は、冷却した血小板およびマクロファージの共局在を黄色で示す。小葉組織を示す。（ＣＶ：中心静脈；ＰＶ：門脈、バー：１００μｍ）。
【００３０】
図２は、冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で正常に循環するが、補体３（Ｃ３）またはｖＷｆ欠損マウス内で循環しないことを示す。ＣＭＦＤＡ標識された、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）および室温の（ＲＴ）野生型の血小板を、同系の野生型の（ＷＴ）、ＣＲ３欠損の（Ａ）、ｖＷｆ欠損の（Ｂ）およびＣ３欠損の（Ｃ）受容(recipient)マウスそれぞれ６匹に輸血し、それらの生存時間を決定した。冷却した血小板は、室温の血小板と同じ動態でＣＲ３欠損動物内を循環するが、Ｃ３欠損のマウスまたはｖＷｆ欠損のマウスの循環から急速に一掃される。データは、６匹のマウスについての平均±ＳＤである。
【００３１】
図３は、冷却した血小板がin vivoでＣＲ３を発現するマウスマクロファージにしっかりと付着することを示す。図３Ａ−冷却し再加温したＴＲＩＴＣ標識血小板（左のパネル）が、室温のＣＭＦＤＡ標識血小板（右のパネル）よりも、３〜４倍の高い頻度で肝類洞に付着する。生体蛍光顕微鏡写真を、血小板の注入３０分後に得た。図３Ｂ−冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ、中抜きの棒）および室温の血小板（ＲＴ、中塗りの棒）は、野生型のマウスと類似した分布で高マクロファージ密度（中間帯）の類洞部位に付着する。図３Ｃ−冷却し再加温した血小板は、野生型の肝臓内のマクロファージに、室温の血小板よりも３〜４倍多く付着する（中抜きの棒）。一方、冷却し再加温したまたは室温の血小板は、ＣＲ３欠損マウス内のマクロファージに対して同一の付着度を有する（中塗りの棒）。野生型のマウスによる９回の実験およびＣＲ３欠損マウスによる４回の実験を示す（平均±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５：＊＊Ｐ＜０．０１）。
【００３２】
図４は、ＧＰＩｂαは冷却した血小板クリアランスを仲介し、低温で凝集するが、冷却した血小板において活性化したｖＷｆに正常に結合することを示す。図４Ａ−ＧＰＩｂα細胞外ドメインを酵素的に除去したＣＭＦＤＡ標識血小板（左のパネル、挿入図、中塗りの領域）または対照の血小板を、室温で保持した（左のパネル）、または冷却し再加温した（右のパネル）、同系の野生型のマウスに注入し、血小板の生存率を決定した。各生存率曲線は、６匹のマウスについての平均値±ＳＤを表す。図４Ｂ−冷却した血小板、またはＲＴの多血小板血漿を、ボトロセチンで処置した（影の領域）または処置しなかった（中抜きの領域）。ｖＷｆ結合は、ＦＩＴＣ標識抗ｖＷｆ抗体を用いて検出した。図４Ｃ−ｖＷｆ受容体は、冷却したマウス血小板の表面上で線形配列（ＲＴ）から凝集体（Ｃｈｉｌｌｅｄ）へ再分布する。固定し、冷却し再加温した、または室温の血小板（ＲＴ）を、ラットモノクローナル抗マウスＧＰＩｂα抗体、次いでヤギ抗ラットＩｇＧで被覆した１０ｎｍコロイド金粒子と共にインキュベートした。バーは１００ｎｍである。挿入図：低倍率の血小板。
【００３３】
図５は、ＧＰＩｂα−ＣＲ３相互作用が、in vitroで冷却したヒト血小板の食作用を仲介することを示す。図５Ａおよび図５Ｂは、室温（ＲＴ）の血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図５Ａ）または冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図５Ｂ）の典型的なアッセイ結果を示す。マクロファージに関連するCM-Orange標識血小板は、オレンジ蛍光をｙ軸上方向にシフトする。室温で保持した血小板と共にインキュベートしたCM-Orange陽性の天然のマクロファージの平均比率を、１に標準化した。血小板の冷却は、このシフトを〜４％から２０％増加させる。血小板は、ＣＤ６１にＦＩＴＣ結合ｍＡｂで二重標識しないため、主に摂取される。
【００３４】
図５Ｃは、未分化（中抜きの棒）ＴＨＰ−１細胞はＣＲ３を約５０％少なく発現し、冷却し再加温した血小板の半分程度を摂取する。しかしながら、ＣＲ３発現の分化（中塗りの棒）は、ＲＴ血小板の摂取について有意な効果はなかった。ＧＰＩｂαのＮ末端をヒト血小板の表面から除去するヘビ毒メタロプロテアーゼ、モカラギン（Ｍｏｃ）によるヒト血小板の処置（挿入図；対照：実線、モカラギン処置した血小板：影の領域）は、冷却した血小板の食作用を約９８％減少させた。示したデータは、５回の実験の平均±ＳＤである。
【００３５】
図６は、循環する、冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて止血機能を有することを示す。ＣＭＦＤＡ標識自己血小板の注入の２４時間後に、創傷から生じた血小板凝集体内に存在するそれらの同等物により決定されるように、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板（図６Ａおよび６Ｂ）、およびＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板（図６Ｃおよび６Ｄ）の正常なin vivo機能。末梢血（図６Ａおよび６Ｃ）および創傷から生じる血液（流血、図６Ｂおよび６Ｄ）を、全血フローサイトメトリーにより分析した。
【００３６】
血小板を、前方光散乱特性およびＰＥ結合抗ＧＰＩｂα ｍＡｂ（ｐＯｐ４）の結合により確認した。注入した血小板（点）を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光により確認し、非注入の血小板（輪郭線）を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光の欠如により確認した。末梢全血サンプルにおいて、分析部位をＧＰＩｂα陽性粒子周辺に描き、９５％の集団を前方散乱軸（領域１）に包含し、この前方光散乱閾値より上に現れる５％粒子を、凝集体と定義した（領域２）。比率は、ＣＭＦＤＡ陽性血小板により形成された凝集体の数を意味する。この示した結果は、４回の実験の典型的なものである。
【００３７】
図６Ｅは、注入の２４時間後に、マウスから抜いた血液のトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）活性化に続くＰ−セレクチンおよびフィブリノゲン結合の暴露により決定されるように、野生型のマウスに輸血した、CM-Orangeの、室温の（ＲＴ）血小板およびＣＲ３欠損マウスに輸血した、CM-Orangeの、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板のex vivo機能を示す。CM-Orange標識血小板は、ＣＭＦＤＡ標識血小板と同程度の循環半減時間を有する（未掲載）。輸血した血小板を、それらのCM-Orange蛍光により確認した（中塗りの棒）。輸血せず（非標識）分析した血小板は、中抜きの棒として表す。結果は、Ｐ−セレクチンおよびフィブリノゲン陽性部位（領域２）に存在する細胞の比率として表現する。データは、４匹のマウスについての平均±ＳＤである。
【００３８】
図７は、２種類の血小板クリアランス経路を描写する図である。血小板は、中央および末梢循環を横断し、体の表面でより低温で可逆プライミング(priming)を遂げる。反復プライミングは、補体受容体タイプ３（ＣＲ３）を生じる肝マクロファージにより、不可逆的なＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ（ｖＷｆＲ）受容体複合体の再構成およびクリアランスへと至らしめる。血小板はまた、微小血管凝固に関与した後、一掃される。
【００３９】
図８は、冷却した血小板の食作用への単糖類の効果を示す。
図９は、ＷＧＡレクチンの室温の血小板または冷却した血小板への結合のドットプロットを示す。
図１０は、室温のまたは冷却した血小板へ結合した様々なＦＩＴＣ標識レクチンの分析を示す。
【００４０】
図１１Ａは、β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得られた、室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡの結合の概要を示す。
図１１Ｂは、血小板表面からのＧＰＩｂαの除去が、冷却した血小板に結合したＦＩＴＣ−ＷＧＡを減少させたことを示す。
図１２は、血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送が、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を減少させるが、室温の（ＲＴ）血小板の食作用には影響しないことを示す。
図１３は、未処理の血小板に対する、冷却し、ガラクトシル化した(galactosylated)マウス血小板の生存率を示す。
【００４１】
図１４は、その表面にガラクトーストランスフェラーゼを含有する血小板は、ＷＧＡ結合により判断されたように、トランスフェラーゼの添加なしでガラクトースを輸送すること（図１４Ａ）、およびヒト血小板についてのin vitro食作用の結果（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｃは、マウス血小板の生存率におけるガラクトーストランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）ありまたはなしでのＵＤＰ−ガラクトースの効果を示す。ＧａｌＴを含むまたは含まないＵＤＰ−ガラクトースを、冷却前に３７℃で３０分間マウス血小板に添加した。血小板を氷浴内で２時間冷却し、その後マウスに輸血し（１０８個の血小板／マウス）、それらの生存を決定した。
【００４２】
図１５は、ヒト血小板への１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの取り込みの経時変化を示す。
図１６は、ＵＤＰ−ガラクトースの異なる濃度での４種類の血小板濃度サンプル中の血小板のガラクトシル化(galactosylation)を示す。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、循環特性を高め、 実質的に正常なin vivo止血作用を保持する修飾血小板の集団を提供する。止血作用は、出血停止を媒介するための血小板の集団の能力に広く言及する。様々なアッセイが、血小板止血作用を決定するために利用可能である(Bennett, J. S. and Shattil, S. J., 1990, "Platelet function," Hematology, Williams, W. J., et al., Eds. McGraw Hill, pp 1233-12250)。しかしながら、「止血」または「止血作用」の証明は、最終的に血小板減少性のまたは血小板症の(thrombopathic)(すなわち、非機能の血小板)動物またはヒトへ注入した血小板が循環し、天然のまたは実験的に誘発した出血を止めることの証明が必要である。
【００４４】
そのような証明の不足のため、実験室において止血作用を決定するための代用物として、in vitro試験を使用する。これらの試験は、凝集、分泌、血小板の形態および代謝性の変化のアッセイを含有し、活性化への多種多様な血小板の機能的反応を測定する。当該分野では、in vitro試験が、in vivoにおける止血機能を合理的に示すことは、一般的に受け入れられている。
実質的に正常な止血作用は、新しく単離した血小板の集団の止血作用とだいたい同じである止血作用の量を意味する。
【００４５】
本発明は、血小板の集団の循環時間を増加させる方法および血小板の貯蔵時間を増加させる方法を提供する。また、本発明は、保存した止血作用による血小板の保存のための血小板組成物方法および組成物、ならびに保存した血小板を含有する医薬組成物を作る方法および止血を媒介するために哺乳動物に医薬組成物を投与する方法を提供する。
【００４６】
本発明の一側面において、単離された血小板の集団の循環時間を増加させる方法は、単離された血小板の集団を血小板の集団のクリアランスを減少させるために効果的な量で少なくとも１種のグリカン修飾剤に接触させることを伴う。本明細書において、血小板の集団は、１個または２個以上の血小板を意味する。血小板の集団は、血小板製剤を含有する。用語「単離された」とは、血小板の天然の環境から分離されたおよび血小板の同定または使用を可能にするのに十分な量が存在することを意味する。血小板の集団に関して、本明細書において、単離されたとは、血液循環から除去されたことを意味する。血小板の集団の循環時間は、血小板の半分がもはや循環しない時間と定義される。本明細書において、「クリアランス」とは、血液循環からの血小板の除去を意味する（マクロファージ食作用によるなど）。
【００４７】
グリカン修飾剤は、マクロファージにより認識される末端グリカン残基を、マクロファージが血小板をもはや貪食しないように、好ましくはＧＰＩｂαにおいて修飾する剤を意味する。本明細書において、「グリカン」または「グリカン残基」は、血小板の表面の多糖部分である。「末端」グリカンまたはグリカン残基は、多糖類の末端にあるグリカンであり、典型的には、血小板表面のポリペプチドに結合している。
【００４８】
いくつかの態様において、グリカン修飾剤は、ウリジン二リン酸ガラクトース（ＵＤＰ−ガラクトース）およびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される。いくつかの好ましい態様において、グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである。ＵＤＰ−ガラクトースは、ガラクトース代謝における中間体であり、ＵＤＰ−ガラクトースを作るために、ガラクトース−１−リン酸と交換にＵＤＰ−グルコースからグルコース−ｌ−リン酸の遊離を触媒する酵素である、ＵＤＰ−グルコース−α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼにより形成される。ＵＤＰ−ガラクトースの合成方法および生産方法は、当該技術分野で周知であり、文献に記載されている（例えば、Liu et al, ChemBioChem 3, 348-355, 2002; Heidlas et al, J. Org. Chem. 57, 152-157; Butler et al, Nat. Biotechnol. 8, 281-284, 2000; Koizumi et al, Carbohydr. Res. 316, 179-183, 1999; Endo et al, Appl. Microbiol., Biotechnol. 53, 257-261, 2000参照）。ＵＤＰ−ガラクトース前駆体は、分子、化合物、または中間体化合物であり、ＵＤＰ−ガラクトースに（例えば、酵素的にまたは生化学的に）変換してもよい。ＵＤＰ−ガラクトース前駆体の一つの非限定の例は、ＵＤＰ−グルコースである。ある態様において、ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素を、反応混合物に添加する（例えば血小板用容器内で）。
【００４９】
グリカン修飾剤の効果的な量は、循環時間を増加させるおよび／または、血小板表面上のグリカン残基の十分な数の修飾により血小板の集団のクリアランスを減少させる、グリカン修飾剤の量を意味する。
【００５０】
ＵＤＰ−ガラクトースによる血小板の修飾は、以下のように行なうことができる。血小板の集団を、異なる濃度（１〜１０００μＭ）のＵＤＰ−ガラクトースと共に、少なくとも１、２、５、１０、２０、４０、６０、１２０、１８０、２４０、または３００分間、２２℃〜３７℃でインキュベートする。いくつかの態様において、０．１〜５００ｍＵ／ｍｌのガラクトーストランスフェラーゼを、血小板の集団に添加する。ガラクトース輸送は、ＦＩＴＣ−ＷＧＡ（小麦胚凝集素）結合を用いて機能的に観察することができる。グリカン修飾反応の目標は、ＷＧＡ結合を休止している室温ＷＧＡ結合レベルに減少させることである。ガラクトース輸送は、１４Ｃ−ＵＤＰ−ガラクトースを用いて数量化することができる。非放射性ＵＤＰ−ガラクトースを１４Ｃ−ＵＤＰ−ガラクトースと混合し、適切なガラクトース輸送を得る。輸送反応は、上記のように行なわれる。血小板を何度も洗浄し、取り込まれた放射活性をγカウンターを用いて測定する。測定したｃｐｍは、取り込まれたガラクトースの計算を可能にする。
【００５１】
本明細書において、血小板の集団のクリアランスは、単位時間あたり単位体積の血液または血清からの血小板の集団の除去を意味する。血小板の集団のクリアランスを減少させることは、血小板の集団のクリアランスを阻止、遅延、または減少させることを意味する。血小板のクリアランスを減少させることはまた、血小板クリアランス率を減少させることを意味してもよい。
【００５２】
血小板のクリアランスを減少させることは、室温貯蔵後、または冷却貯蔵後、血小板クリアランスを減少させることならびに「低温誘発性血小板活性化」を包含する。低温誘発性血小板活性化は、当業者にとって特別な意味を有する用語である。低温誘発性血小板活性化は、血小板形態における変化により現れてもよく、血小板形態における変化のいくつかは、例えば、ガラスとの接触により、以下の血小板活性化をもたらす変化と似ている。低温誘発性血小板活性化を示す構造的変化は、光学顕微鏡または電子顕微鏡などの技術を用いて最も簡単に確認される。分子レベルでは、低温誘発性血小板活性化は、アクチン束の形成をもたらし、細胞内カルシウム濃度の増加が続く。アクチン束の形成は、例えば、電子顕微鏡を用いて検出される。細胞内カルシウム濃度の増加は、例えば、蛍光細胞内カルシウムキレート剤を用いることにより決定される。アクチンフィラメント切断を阻害するための上記のキレート剤の多くはまた、細胞内カルシウムの濃度を決定するのに有用である（Tsien, R., 1980, supra.）。したがって、様々な技術が、血小板が低温誘発性活性化を経験したかどうか決定するために利用可能である。
【００５３】
ガラクトースの取り込みの血小板クリアランスへの効果を、例えば分化したＴＨＰ−１細胞を用いるin vitroシステムまたはチオグリコレート注射の刺激後、腹膜腔から単離されたマウスマクロファージを使用して、測定することができる。未修飾血小板と比較した修飾血小板のクリアランス率を決定する。これらのin vitro方法において、ガラクトース輸送は、血小板を修飾するために、上記手順にしたがって行われる。そして修飾血小板はマクロファージに貪食され、マクロファージによる血小板の摂取を観察する。in vitroアッセイは、ガラクトース輸送は、ヒト血小板のように、マウスの冷却した血小板の摂取の減少をもたらすかどうかを示す。
【００５４】
いくつかの態様において、血小板の集団の循環時間を増加させる方法はさらに、グリカン修飾剤と共にグリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することを含む。グリカン部分の修飾を触媒する酵素の一例は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−ガラクトースと共にＧＰＩｂα分子の糖化を触媒する。
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる。
【００５５】
本発明によると、血小板の冷却で通常経験する悪影響（低温誘発性血小板活性化）を及ぼさず、血小板の集団を冷却することができる。血小板の集団を、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に冷却することができる。グリカン部分の選択的修飾は、冷却後（冷却しない場合もまた）、クリアランスを減少させ、したがって、現在可能な期間よりも長期間貯蔵が可能になる。本明細書において、冷却は、血小板の集団の温度を約２２℃未満の温度に低下させることを意味する。いくつかの態様において、血小板を約１５℃未満の温度に冷却する。いくつかの好ましい態様において、血小板を約０℃から約４℃の間の範囲の温度に冷却する。いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも３日間冷却貯蔵する。
【００５６】
いくつかの態様において、血小板の集団を少なくとも５、７、１０、１４、２１、および２８日間冷却貯蔵する。
本発明のいくつかの態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約１０％増加する。いくつかの他の態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約２５％増加する。さらにいくつかの他の態様において、血小板の集団の循環時間は、少なくとも約５０％増加する。またさらに他の態様において、血小板の集団の循環時間は、約１００％増加する。本明細書において、血小板の集団の循環時間は、血小板の半分がもはや循環しない時間と定義される。
【００５７】
本発明はまた、血小板の貯蔵時間を増加させる方法を包含する。本明細書において、血小板の貯蔵時間は、血小板が、循環する能力の損失などの血小板機能または止血作用の相当な損失がなく貯蔵することができる時間と定義される。例えば、貯蔵後循環する能力は、約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％未満減少する。
血小板は、当業者に既知の標準の技術により、末梢血から採集することができる。いくつかの態様において、血小板は、グリカン修飾剤による処置の前に、薬学的に許容しうる担体に含まれる。
【００５８】
本発明の別の側面によると、修飾血小板または修飾血小板の集団を提供する。修飾血小板は、血小板の表面上に複数の修飾グリカン分子を含む。いくつかの態様において、修飾グリカン部分は、ＧＰＩｂα分子の部分でもよい。修飾グリカン分子は、少なくとも１種類の添加した糖分子を含む。添加した糖は、天然の糖または非天然の糖でよい。
【００５９】
本発明はまた、貯蔵培地中の血小板組成物を包含する。いくつかの態様において、貯蔵培地は、薬学的に許容しうる担体を含む。
用語「薬学的に許容しうる」は、血小板の生物作用の有効性を妨げない非毒性の材料および細胞、細胞培養、組織、または生物などの生物系と適合する非毒性の材料を意味する。薬学的に許容しうる担体は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野で周知の他の材料を含む。
【００６０】
本発明は、哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法をさらに包含する。該方法は、上述の血小板製剤の製造および血小板製剤の加温を含む。いくつかの態様において、該方法は、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素を不活性化することおよび薬学的に許容しうる担体内に不活性化した血小板製剤を入れることを含む。好ましい態様において、冷却した血小板は、不活性化の前に室温（約２２℃）まで加温する。いくつかの態様において、血小板は、グリカン部分の修飾をおよび触媒する酵素と共に／共にではなく、グリカン修飾剤と接触する前に、薬学的に許容しうる担体内に含まれ、不活性化の後に薬学的に許容しうる担体内に血小板製剤を入れる必要はない。
【００６１】
本明細書において、用語「不活性化する」または「不活性化」は、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素が、実質的に血小板のグリカン残基のグリカンを修飾できないようにされるプロセスを意味する。いくつかの態様において、冷却した血小板は、例えば、赤血球の懸濁液による希釈により不活性化される。あるいは、処置した血小板は、受容者へ注入することができ、これは赤血球懸濁液への希釈と同等である。この不活性化の方法は、閉鎖システムを有利に維持し、血小板への損傷を最小限に抑える。グリカン修飾剤の好ましい態様において、不活性化は必要ではない。
【００６２】
毒性を減少させる他の方法は、注入ラインにフィルターを挿入することであり、該フィルターは、グリカン修飾剤および／またはグリカン部分の修飾を触媒する酵素を除去するために、例えば活性炭または固定化された抗体を含む。
グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の一方または両方もまた、標準の臨床の細胞洗浄技術にしたがって修飾血小板を洗浄することにより除去または実質的に希釈してもよい。
【００６３】
本発明はさらに、哺乳動物において止血を媒介する方法を提供する。本方法は、上述の医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む。修飾血小板の投与は、当該技術分野で既知の標準の方法に従う。一態様によると、ヒトの患者に、修飾血小板の投与前、投与後または投与中に赤血球を輸血する。赤血球の輸血は、投与した修飾血小板を希釈する役目をし、これによりグリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素を不活性化する。
【００６４】
止血媒介のための用量は、対象の種類、年齢、体重、性別および病状、疾患の重篤度、投与の経路および頻度を含む様々な要因にしたがって選択される。通常の技術を有する医者または臨床医は、止血を調節するのに必要な血小板の効果的な量を直ちに決定し、処方することができる。
本用量は、例えば、臨床的症状および実験室試験に関して、処置への反応に従って決定することができる。かかる臨床的症状および実験室試験の例は、当該技術分野で周知であり、Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001に記載されている。
【００６５】
止血を媒介するための貯蔵組成物および医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。一つの態様において、本組成物は、薬学的に許容しうる担体、複数の修飾血小板、複数のグリカン修飾剤および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素は、血小板クリアランスを減少させるのに十分な量で組成物中に存在する。好ましくは、グリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）は、冷却および不活性化の後、血小板が実質的に正常な止血作用を維持する量で存在する。血小板クリアランスを減少させるグリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）の量は、血小板製剤をこれらの剤の増量に暴露することにより、処置した血小板を冷却温度に暴露することにより、および低温誘発性血小板活性化が生じたか否かを（例えば、顕微鏡により）決定することにより、選択することができる。好ましくは、グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の量は、血小板をグリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の様々な量に暴露することにより、本明細書に記載のように血小板を冷却することにより、処置した（冷却した）血小板を加温することにより、血小板を随意に不活性化させることにより、および処置した血小板が実質上正常な止血作用を維持したかを決定するために、止血作用アッセイにおいて血小板を試験することにより、機能的に決定することができる。
【００６６】
例えば、グリカン修飾剤（および随意にグリカン部分の修飾を触媒する酵素）により低温誘発性活性化を阻止するのに最適な濃度および条件を決定するために、増量したこれらの剤を、血小板を冷却温度に暴露する前に血小板と接触させる。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素の最適な濃度は、in vitro試験（例えば、ガラス、トロンビン、低温保存温度に対する反応における形態的変化の観察；ＡＤＰ誘発凝集）および次いで止血機能（例えば、血小板減少症の動物における回復、生存および出血時間の短縮、またはヒトの対象における５１Ｃｒ標識血小板の回復および生存）を示すin vivo試験により決定されるように、血小板機能を損なわずに保存する効果的な最低濃度である。
【００６７】
本発明のさらに別の側面によると、血小板クリアランスを減少させるためにまたは血小板の貯蔵時間を増加させるために、血小板に添加する組成物を提供する。本組成物は、１種または２種以上のグリカン修飾剤を含む。ある態様において、本組成物はまた、グリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。グリカン修飾剤およびグリカン部分の修飾を触媒する酵素は、低温誘発性血小板活性化を阻止する量で組成物中に存在する。一つの好ましい態様において、該グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースであり、グリカン部分の修飾を触媒する酵素は、ガラクトシルトランスフェラーゼである。
【００６８】
本発明はまた、血小板を保存するための貯蔵組成物を包含する。本貯蔵組成物は、血小板クリアランスを減少するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む。いくつかの態様において、本貯蔵組成物さらに、血小板のグリカン部分の修飾を触媒する酵素を含む。本グリカン修飾剤を、好ましくはおおよそ室温および３７℃の間で保持される血小板の集団に添加する。いくつかの態様において、処置の後、血小板の集団を約４℃に冷やす。いくつかの態様において、血小板を、当業者に既知の標準の方法にしたがって、血小板用パック、バッグ、または容器に採集する。典型的に、提供者からの血液を主要容器に採取し、該容器は少なくとも１種のサテライト容器に結合していてもよく、全ての容器は、使用前に接続および殺菌する。いくつかの態様において、該サテライト容器は、破壊可能なシールにより、血小板を収集するための容器に接続する。いくつかの態様において、該主要容器はさらに、複数の血小板含有の血漿を含む。
【００６９】
いくつかの態様において、（例えば遠心分離により）血小板を濃縮し、血小板のグリカン部分の修飾を触媒する酵素と共にまたは共にではなくグリカン修飾剤を添加する前に、血漿および赤血球を独立したサテライトバッグに取り除く（これらの臨床的に価値のある分画の修飾を避けるために）。処置の前の血小板濃縮もまた、血小板クリアランスを減少させるのに必要なグリカン修飾剤の量を最小限に抑えることができ、これにより最終的に患者に注入されるこれらの剤の量を最小限に抑えることができる。
【００７０】
一つの態様において、該グリカン修飾剤は、閉鎖システム、例えば殺菌処理し、密封した血小板用パック内で血小板と接触させ、微生物汚染を避ける。典型的に、静脈穿刺導管(venipuncture conduit)は、血小板調達または輸血中、パックにおける唯一の開口部である。したがって、グリカン修飾剤による血小板の処置中、閉鎖システムを維持するために、該剤を、殺菌処理した接続チューブにより血小板用パックに接続した、比較的小さな、殺菌処理した容器に入れる(例えば、内容が本明細書中に参照として組み込まれる、米国特許第4,412,835号を参照)。該接続チューブは当業者に知られるように、可逆的に密封できるか、または破壊可能なシールを有する。例えば標準の実務にしたがって血小板を沈殿させ、主要パックから２番目ののバッグへ血漿を絞り出すことにより、血小板を濃縮した後、グリカン修飾剤含有の容器のシールを開き、該剤を血小板用パックに導入する。一つの態様において、該グリカン修飾剤は、独立した再封可能な接続チューブを有する独立した容器に含まれ、グリカン修飾剤の血小板製剤への連続添加を可能にする。
【００７１】
グリカン修飾剤との接触後、処置した血小板を冷却する。例えば、２２℃で貯蔵した血小板に比べ、低温保存温度で貯蔵した血小板は、実質的に減少した代謝性作用を有する。したがって、４℃で貯蔵した血小板は、代謝的に活性が低く、したがって、例えば、２２℃で貯蔵した血小板と比較して、多量のＣＯ２を発生しない（Slichter, S. J., 1981, Vox Sang 40 (Suppl 1), pp 72-86, Clinical Testing and Laboratory-Clinical correlations）。血小板マトリックス内でのＣＯ２の溶解は、ｐＨの減少および血小板の生存度の付随的減少をもたらす（Slichter, S., 1981, supra.）。したがって、従来の血小板用パックは、パック内外への気体の輸送（Ｏ２を中へおよびＣＯ２を外へ）を最大限にするために十分透過性のある材料で設計し、構築した材料で形成される。血小板用パックのデザインおよび構築における先行技術の制限は、低温保存温度での血小板の貯蔵を可能にし、それにより実質的に血小板代謝を減少させ、貯蔵中血小板により発生したＣＯ２量を少なくする本発明により除去される。したがって、本発明はさらに、血小板の低温貯蔵に特に有用な容器である、実質的にＣＯ２および／またはＣＯ２に対し非透過性である血小板用容器を提供する。
【００７２】
本発明は、以下の例を参照により完全に理解できるだろう。これらの例は、しかしながら、本発明の態様を単に記述により説明するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００７３】
例
例１
はじめに
適度に冷やすことは、活性化のために血小板をプライム(prime)するが、冷蔵は形態の変化および急速なクリアランスをもたらし、輸血療法のための血小板の貯蔵を危うくする。我々は、変形の阻害は、低温誘発性クリアランスを正常化しないことを見出した。我々はまた、肝臓マクロファージに主に発現する補体受容体３受容体（ＣＲ３）による認識のための対象となるように、血小板を冷やすことはフォンヴィルブランド因子（ｖＷｆ）受容体複合体αサブユニット（ＧＰＩｂα）の表面構造を再配列し、血小板食作用およびクリアランスへと至らしめることを見出した。ＧＰＩｂαの除去は、冷却していない血小板の生存期間を延長する。冷却した血小板は、ｖＷｆを結合させ、ＣＲ３欠損マウスへの輸血後、in vitroおよびex vivoで正常に機能する。冷やした血小板は、しかしながら、トロンビンまたはＡＤＰに暴露された血小板のようには「活性化」されず、それらのｖＷｆ受容体複合体は、活性化されたｖＷｆと正常に反応する。
【００７４】
温度が３７℃以下に下がるにつれて、血小板は、血栓性刺激による活性化により影響を受けやすく、これは、「プライミング」として知られる現象である（Faraday and Rosenfeld, 1998; Hoffmeister et al., 2001）。プライミングは、大部分の損傷が生じる体の表面のより低い温度での出血を制限するための順応であろう。我々は、肝クリアランスシステムの目的は、プライムされた血小板を繰り返し除去することであり、このクリアランスを促進するＧＰＩｂαにおける立体構造の変化は、ｖＷｆへのＧＰＩｂαの止血的に重要な結合に影響を及ぼさないことを提案する。したがって、ＧＰＩｂαの選択的修飾は、輸血のための血小板の低温貯蔵を提供するだろう。
【００７５】
材料および方法
我々は、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合アネキシンＶ、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよび抗ヒトＩｇＭ ｍＡｂ、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよび抗ヒトＣＤ６２Ｐ−ＦＩＴＣ ｍＡｂをPharmingen（San Diego, CA）から；ＦＩＴＣ結合ラット抗マウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂをSanta Cruz Biotechnology, Inc.（Santa Cruz, CA）から；ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ６１ ｍＡｂ（クローンＢＬ−Ｅ６）をAccurate Scientific Corp.（Westbury, NY）から；ＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩｂα ｍＡｂ（クローンＳＺ２）をImmunotech（Marseille, France）から；およびＦＩＴＣ結合ポリクローナルウサギ抗ｖＷｆ抗体をDAKOCytomation（Glostrup, Denmark）から得た。我々は、ＥＧＴＡ−アセトキシメチルエステル（ＡＭ）、Oregon Greenが結合したヒト血漿からのフィブリノゲン、CellTracker（登録商標）Orange CMTMR；CellTracker Green CMFDA、ナイルレッド(Nile-red)（535/575）が結合しおよびカルボン酸修飾されている１μｍの微粒子/FluoSpheresをMolecular Probes, Inc.（Eugene, OR）から、および１１１インジウムをNEN Life Science Products（Boston, MA）から購入した。
【００７６】
我々は、サイトカラシンＢ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、イソチオシアン酸三ナトリウム（ＴＲＩＴＣ）、ヒトトロンビン、プロスタグラジンＥ１（ＰＧＥ１）、ホルボールエステル１２−テトラデカノイルホルボール−１３アセテート（ＰＭＡ）、A23187イオノフォアをSigma（St. Louis, MO）から；ボトロセチンをCenterchem Inc.（Norwalk, CT）から；およびＯ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼをCerladane（Hornby, Canada）から購入した。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有のＨＢＳＳ、ｐＨ６．４；RPMI 1640；Ｃａ２＋およびＭｇ２＋なしのＨＢＳＳ中０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．５３ｍＭ）；および他の補助剤（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清）をGIBCO Invitrogen Corp.（Grand Island, NY）から得た。ＴＧＦ−β１をOncogene Research Products（Cambridge, MA）から；１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３をCalbiochem（San Diego, CA）から；およびアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）をUSB（Cleveland, OH）から得た。Avertin（２，２，２−トリブロモエタノール）をFluka Chemie（Steinheim, Germany）から購入した。
【００７７】
コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）をTufts Core Facility, Physiology Dept.（Boston, MA）で合成し、前記のとおり架橋した（Morton et al., 1995）。ヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンは、Dr. M. Berndt, Baker Medical Research Institute, Melbourne Victoria 318 1, Australiaから提供を受けた。追加の非結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂおよびＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４は、Dr. B. Nieswandt（Witten/Herdecke University, Wuppertal, Germany）から提供を受けた。我々は、ＴＨＰ−１細胞をAmerican Type Culture Collection（Manassas, VA）から得た。
【００７８】
動物
クリアランスおよび生存研究のアッセイのために、我々は、Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から得た年齢、血統および性別をマッチングしたＣ５７ＢＬ／６およびＣ５７ＢＬ／６×１２９／ｓｖ野生型のマウスを使用した。補体成分Ｃ３欠損のＣ５７ＢＬ／６×１２９／ｓｖマウス（Wessels et al., 1995）は、Dr. M. C. Carroll（Center for Blood Research and Department of Pediatrics, Harvard Medical School, Boston, MA）から提供を受けた。ＣＲ３欠損のＣ５７ＢＬ／６マウス（Coxon et al., 1996）は、Dr. T Mayadasから提供を受け、ｖＷｆ欠損のＣ５７ＢＬ／６マウス（Denis et al., 1998）は、Dr. D. Wagnerから提供を受けた。マウスを、Harvard Medical Area Standing Committee on Animalsにより承認されたように、The Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに記載のＮＩＨ標準に従って、維持および処置した。
【００７９】
ヒト血小板
血液を、同意した正常な人間のボランティア（Brigham and Women's HospitalおよびCenter for Blood Research (Harvard Medical School)両方のInstitutional Review Boardsから承認を得た）から静脈穿刺により０．１容量のAster-Jandlクエン酸ベースの抗凝血剤へ採取し（Hartwig and DeSisto, 1991）、多血小板血漿（ＰＲＰ）を３００×ｇで２０分間室温で、抗凝固処理した血液の遠心分離により調製した。血小板を、室温で小さなSepharose 2Bカラムを通して、ゲル濾過により血漿タンパク質から分離した（Hoffineister et al., 2001）。
【００８０】
下記のin vitro食作用アッセイにおいて使用した血小板は、２０分間３７℃で、１．８μＭのCellTracker Orange CMTMR（CM-Orange）で標識され（Brown et al., 2000）、取り込まれていない色素を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１０ｍＭのグルコース、および１２．５ｍＭのショ糖、１μｇ／ｍｌのＰＧＥ１、ｐＨ６．０を含む５倍容量の洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）を用いて、遠心分離（８５０×ｇ、５分）により除去した。血小板を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４を含む溶液（緩衝液Ｂ）中３×１０８個／ｍｌに再懸濁した。
【００８１】
ＧＰＩｂαのＮ末端を、１ｍＭのＣａ２＋および１０μｇ／ｍｌのヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンも含む緩衝液Ｂ中、冷却したまたは室温で維持し、標識を付した血小板の表面から酵素的に除去した（Ward et al., 1996）。酵素消化後、血小板を５倍量の緩衝液Ａを用いて遠心分離により洗浄し、凝集体について顕微鏡で定期的に確認した。ＧＰＩｂαのＮ末端除去を、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合抗ヒトＧＰＩｂα（ＳＺ２）ｍＡｂを用いて１０分間室温で血小板懸濁液をインキュベートすることにより観察し、次いでFACScalibur Flow Cytometer（Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA）ですぐにフローサイトメトリー分析を行った。血小板を前方/側方散乱特性によりゲート(gate)し、５０，０００事象を獲得した。
【００８２】
マウス血小板
マウスを３．７５ｍｇ／ｇ（２．５％）のAvertinで麻酔し、１ｍｌの血液を、眼窩後方の眼の叢(retroorbital eye plexus)から０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤へと得た。
ＰＲＰを、３００×ｇで８分間室温で抗凝固処理した血液の遠心分離により調製した。血小板を、１２００×ｇで５分間の遠心分離により血漿タンパク質から分離し、５倍量の洗浄緩衝液（緩衝液Ａ）を用いて遠心分離により（１２００×ｇで５分間）２回洗浄した。この手法は、用語「洗浄」の以降の使用を意味する。血小板を、１４０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースおよび１０ｍＭのHepes、ｐＨ７．４を含む溶液（緩衝液Ｂ）中１×１０９個／ｍｌの濃度に再懸濁した。
【００８３】
血小板数を、４００倍の位相差顕微鏡下でBright Line Hemocytometer（Hausser Scientific, Horsham, PA）を用いて決定した。いくつかの放射性血小板クリアランス研究を１１１インジウムを用いて行ない、霊長類の血小板について記載した方法(Kotze et al., 1985）を用いて、マウス血小板を標識した。血小板を、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ６．５（０．１Ｍのナトリウムクエン酸で調節した）中２×１０９／ｍｌの濃度に再懸濁し、次いで３０分間３７℃で５００μＣｉの塩化１１１インジウムを添加し、上記のように洗浄し、血小板を、緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌの濃度に懸濁した。
【００８４】
生体顕微鏡または他の血小板生存実験のために、洗浄した血小板に、０．００１％のＤＭＳＯ、２０ｍＭのHEPESをも含む緩衝液Ｂ中、２．５μＭのCellTracker Green CMFDA（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）（ＣＭＦＤＡ）で２０分間３７℃で（Baker et al., 1997）、または０．１５μＭのＴＲＩＴＣで２０分間３７℃で標識した。取り込まれていない色素を、上記のように遠心分離により除去し、血小板を緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌに懸濁した。
【００８５】
ＧＰＩｂαのＮ末端を、２０分間３７℃で１ｍＭのＣａ２＋を含む緩衝液Ｂ中１００μｇ／ｍｌのＯ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼを用いて、冷却したまたは室温の標識血小板の表面から酵素的に除去した（Bergmeier et al., 2001）。酵素消化後、血小板を遠心分離により洗浄し、凝集体について光学顕微鏡により確認した。ＧＰＩｂαのＮ末端除去の酵素除去を、５μｇ／ｍｌのＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４を用いて１０分間室温でインキュベートすることにより観察し、結合したＰＥをフローサイトメトリーにより分析した。
【００８６】
低温誘発性血小板の形態の変化を阻害するために、緩衝液Ｂ中１０９／ｍｌの血小板を、前記のとおり２μＭのＥＧＴＡ−ＡＭ、次いで２μＭのサイトカラシンＢと共に入れ（Winokur and Hartwig, 1995）、２．５μＭのＣＭＦＤＡで３０分間３７℃で標識し、そして冷却したかまたは室温で維持した。血小板は、標準の洗浄を受け、マウスへの注射前に緩衝液Ｂ中１×１０９個／ｍｌの濃度に懸濁した。
【００８７】
血小板の温度についての手順
血小板の生存または機能への温度の効果を研究するために、非標識の、放射性標識した、または蛍光標識したマウスまたはヒト血小板を、マウスに輸血する前またはin vitro分析前に、２時間室温（２５〜２７℃）でインキュベートし、または氷浴温度でインキュベートし、そして１５分間３７℃で再加温した。これらの処置を受けた血小板は、それぞれ冷やしたまたは冷却した（または冷却し再加温した）および室温の血小板に指定される。
【００８８】
マウス血小板の回復、生存および死(fate)
ＣＭＦＤＡ標識した、冷却したまたは室温のマウス血小板（１０８個）を、２７ゲージの針を用いて外側尾静脈経由で同系のマウスに注入した。回復および生存の決定のために、血液サンプルを、輸血後すぐに（＜２分）および０．５、２、２４、４８、７２時間後に０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤に採集した。フローサイトメトリーを用いた全血分析を行い、ＣＭＦＤＡ陽性血小板の比率を前方および側方散乱特性にしたがって、全血小板をゲートすることにより決定した（Baker et al., 1997）。各サンプルにつき、５０，０００事象を収集した。＜２分に測定したＣＭＦＤＡ陽性血小板を１００％と設定した。マウスあたり輸血した血小板の投入量は、全血小板の集団の約２．５〜３％だった。血小板の死を評価するために、組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、筋肉、および大腿骨）を、マウスへの１０８個の冷却したまたは室温の１１１インジウム標識血小板の注射後０．５、１および２４時間目に採取した。器官の重量およびそれらの放射活性を、Wallac 1470 Wizard自動ガンマカウンター（Wallac Inc., Gaitersburg、MD）を用いて決定した。データを、器官１グラムあたりのガンマ数として表現した。放射性血小板の回復および生存の決定のために、血液サンプルを、輸血後すぐに（＜２分）および０．５および時間後に０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤に採集し、それらのガンマ数を決定した（Kotze et al., 1985）。
【００８９】
血小板凝集
従来の試験を行い、Bio／Data血小板凝集計（Horsham, PA）内で観察した。０．３ｍｌのマウスの洗浄し攪拌した血小板のサンプルを、１Ｕ／ｍｌのトロンビン、１０μＭのＡＤＰ、または３μｇ／ｍｌのＣＲＰに３７℃で暴露した。光透過率を３分間にわたり記録した。
【００９０】
活性化ｖＷｆ結合
多血小板血漿を、２Ｕ／ｍｌのボトロセチンで５分間３７℃で処置したか、または処置しなかった（Bergmeier et al., 2001）。結合したｖＷｆを、フローサイトメトリーにより、ＦＩＴＣ結合ポリクローナルウサギ抗ｖＷｆ抗体を用いて検出した。
【００９１】
血小板ＧＰＩｂαの表面ラベリング
室温または２時間冷却を維持した休止マウス血小板を、０．０５％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２×１０６／ｍｌの濃度に希釈した。血小板溶液（２００μｌ）を、９６−ｗｅｌｌプレートのウェルに含まれるポリリジンコートされたガラス製カバースリップ上に置き、血小板を１，５００×ｇで５分間室温での遠心分離により、各カバースリップに付着させた。そして上清を除去し、カバースリップに結合させた血小板を、１０分間ＰＢＳ中０．５％グルタルアルデヒドで固定した。固定剤を除去し、未反応アルデヒドをＰＢＳ中０．１％の水素化ホウ素ナトリウムを含む溶液で急冷し、次いで１０％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。血小板表面上のＧＰＩｂαに、３種類のラット抗マウスＧＰＩｂαモノクローナル抗体それぞれ１０μｇ／ｍｌの混合物で（Bergmeier et al., 2000）１時間、次いでヤギ抗ラットＩｇＧでコートした１０ｎｍの金で標識した。カバースリップを、ＰＢＳで何回も洗浄し、1%のグルタルアルデヒドで後固定(post-fix)し、蒸留水で再洗浄し、急速に冷凍、凍結乾燥、およびCressington CFE-60（Cressington、Watford、UK）内で１．２ｎｍのプラチナで回転(rotary)コートし、次いで回転なしで４ｍｎの炭素でコートした。血小板を１００ｋＶでJEOL 1200-EX電子顕微鏡で観察した（Hartwig et al., 1996; Kovacsovics and Hartwig, 1996）。
【００９２】
In vitro食作用アッセイ
単球性ＴＨＰ−１細胞を、１０％のウシ胎仔血清、２５ｍＭのHepes、２ｍＭのグルタミンを追加したRPMI 1640細胞培養液中７日間培養し、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦＰおよび５０ｎＭの１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３を用いて２４時間分化させ、これはＣＲ３発現の増加を伴った（Simon et al., 2000）。ＣＲ３発現を、フローサイトメトリーにより、ＰＥ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１ ｍＡｂを用いて観察した。未分化または分化ＴＨＰ−１細胞（２×１０６個／ｍｌ）を、２４−ｗｅｌｌプレートに播種し、４５分間３７℃で付着させた。付着した未分化または分化マクロファージを、１５分間１５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの添加により活性化させた。
前に異なる処置を受けた、CM-Orange標識された、冷却したまたは室温の血小板（１０７個／ウェル）を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有のＨＢＳＳ中の未分化または分化した食細胞に添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の後、食細胞単層をＨＢＳＳで３回洗浄し、３７℃で５分間、ＨＢＳＳ中０．０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡで、次いで４℃で５ｍＭのＥＤＴＡでの処置により、付着した血小板を除去し、血小板の付着または摂取のフローサイトメトリー分析のためにマクロファージをはがした（Brown et al., 2000）。ヒトのCM-Orange標識された、冷却したまたは室温の血小板はすべて、新しく単離した非標識血小板と同じ量の血小板特異的マーカーＣＤ６１を発現した（未掲載）。マクロファージと共にインキュベートしたCM-Orange標識血小板を、それらの前方および側方散乱特性にしたがって食細胞から分離した。マクロファージをゲートし、各サンプルについて１０，０００事象を獲得し、データをCELLQuestソフトウェア（Becton Dickenson）で分析した。食細胞集団と関連するCM-Orange標識血小板は、オレンジ蛍光のシフトを有する（図６Ａおよび図６Ｂ、摂取される、ｙ軸）。これらの血小板は、ＦＩＴＣ結合ｍＡｂでＣＤ６１へ二重標識するのに失敗したため、単に付着するよりも摂取された。
【００９３】
血小板の免疫標識(immunolabeling)およびフローサイトメトリー
洗浄したマウス血小板またはヒト血小板（２×１０６個）を、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６１、または表面結合したＩｇＭおよびＩｇＧの表面発現について、冷却または室温貯蔵後、１０分間３７℃でフルオロフォア結合Ａｂ（５μｇ／ｍｌ）で染色することにより、分析した。冷却したまたは室温の血小板により暴露されたホスファチジルセリンを、１０μｇ/ｍｌのＦＩＴＣ結合アネキシンＶと共に１０ｍＭのＣａ２＋を含む４００μｌのＨＢＳＳに、５μｌの血小板を再懸濁することにより決定した。ＰＳ暴露について陽性対照として、血小板懸濁液を１μＭのA23187で刺激した。フィブリノゲン結合を、２０分間室温でのOregon Greenフィブリノゲンの添加により、決定した。すべての血小板サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析した。血小板を、前方および側方散乱特性によりゲートした。
【００９４】
生体顕微鏡実験
生体ビデオ顕微鏡設定の動物の用意、技術的および実験的側面が記載されている（von Andrian、1996）。両方の性別の６〜８週齢のマウスを、XylazineおよびKetaminの混合物の腹腔内注射により、麻酔した。右の頚静脈に、ＰＥ−１０ポリエチレンチューブのカテーテルを挿入した。左の肝葉の下面を外科的に用意し、既述のとおりさらにin vivo 顕微鏡検査のためにガラス製カバースリップで覆った（McCuskey, 1986）。
【００９５】
それぞれＣＭＦＤＡおよびＴＲＩＴＣで標識した１０８個の冷却した血小板および室温の血小板を１：１で混合し、静脈内投与した。肝類洞内の標識血小板の循環を、ビデオトリガー(triggered)ストロボスコープ表面照射で追跡した。１０のビデオシーンを各示した時間で３小葉中心帯から記録した。同一の視野内の冷やした（ＣＭＦＤＡ）／ＲＴの（ＴＲＩＴＣ）付着した血小板の比率を計算した。
共焦点顕微鏡検査を、１０倍の水浸対物レンズを用いて、Olympus BX 50 WJ直立顕微鏡（Biorad, Hercules, CA）に接続したRadiance 2000 MP共焦点多光子画像システムを用いて行なった。画像を捉え、Laser Sharp 2000ソフトウェア（Biorad）（von Andrian、2002）で分析した。
【００９６】
流血における血小板凝集
霊長類について既述されたように、創傷から生じる全血中の血小板による凝集体の形成を分析するために、フローサイトメトリー法を用いた（Michelson et al., 1994）。１０８個のＣＭＦＤＡ標識の室温のマウス血小板を同系の野生型のマウスに注射し、１０８個のＣＭＦＤＡ標識の冷却した血小板をＣＲ３欠損マウスに注射した。血小板注入の２４時間後、マウスの尾を３ｍｍ切片に切断し、標準の出血時間アッセイを行なった（Denis et al., 1998）。切断した尾を、３７℃の１００μｌの０．９％等張食塩水に浸した。生じる血液を２分間採集し、０．１容量のAster-Jandl抗凝血剤、次いですぐに１％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）を添加した。末梢血を上記と平行して眼窩後方の眼の叢の出血により得て、すぐに１％のパラホルムアルデヒド（最終濃度）で固定した。
【００９７】
フローサイトメトリーによりin vivoの凝集体数を分析するために、出血時間の創傷から生じる流血、ならびに末梢全血サンプルを希釈し、ＰＥ結合抗マウスＧＰＩｂα ｍＡｂ ｐＯｐ４（５μｇ／ｍｌ、１０分）で標識した。血小板を、それらの前方散乱特性およびＧＰＩｂαの陽性度(positivity)にしたがってゲーティング(gating)することにより赤血球および白血球から識別した。
【００９８】
Ｌｏｇ前方光散乱(血小板の大きさを反映している）対ＧＰＩｂα結合のヒストグラムを作成した。末梢全血サンプルにおいて、分析部位をＧＰＩｂα陽性粒子周辺に描き、前方散乱軸（領域１）の９５％の集団およびこの前方光散乱閾値（領域２）より上に現れる５％粒子を含有した。同一の領域を流血サンプルについて使用した。単一の血小板の数の比率として、流血中の血小板凝集体の数を、以下の式より計算した：［（流血の領域２における粒子数）−（末梢血の領域２における粒子数）］÷（流血の領域１における粒子数）×１００％。注入した血小板を、それらのＣＭＦＤＡ標識により確認し、ＣＭＦＤＡ陰性の非注入血小板から識別した。
【００９９】
マウス血小板フィブリノゲン結合のフローサイトメトリー分析および循環血小板のP-セレクチン暴露
CM-Orange標識の室温の血小板（１０８個）を野生型のマウスに注入し、CM-Orange標識の冷却した血小板（１０８個）をＣＲ３欠損マウスに注入した。血小板注入の２４時間後、マウスを出血させ、血小板を単離した。休止のまたはトロンビン活性化した（１Ｕ／ｍｌ、５分）血小板懸濁液（２×１０８個）を、ＰＢＳ中に希釈し、２０分間室温で、ＦＩＴＣ結合抗マウスＰ−セレクチンｍＡｂまたは５０μｇ／ｍｌのOregon Green結合フィブリノゲンのいずれかで染色した。血小板サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析した。輸血したおよび非輸血の血小板を、前方散乱およびCM-Orange蛍光特性により、ゲートした。Ｐ−セレクチンの発現およびフィブリノゲンの結合を、トロンビンによる刺激の前および後に、各CM-Orange陽性および陰性集団について測定した。
【０１００】
統計
生体顕微鏡データを、平均±ＳＥＭとして表現した。群を対応のないｔ検定を用いて比較した。Ｐ値＜０．０５を、有意であるとみなした。すべての他のデータを、平均±ＳＤとして表した。
【０１０１】
結果
冷却した血小板のクリアランスは、主に肝臓において生じ、血小板の形態から独立している。
室温（ＲＴ）で保持し、同系のマウスに注入したマウス血小板は、約８０時間にわたりかなり定率で消滅する（図１Ａ）。一方、氷浴の温度で冷やし、注射前に再加温した（Ｃｏｌｄ）のマウス血小板のおよそ３分の２が、以前ヒトおよびマウスにおいて観察されたように、循環から急速に消滅する（Becker et al., 1973; Berger et al., 1998）。
【０１０２】
円盤状の形態を保存するために、細胞透過性カルシウムキレート剤であるＥＧＴＡ−ＡＭおよびアクチンフィラメントの反矢じり端の保護剤であるサイトカラシンＢ（Ｃｏｌｄ＋ＣｙｔｏＢ／ＥＧＴＡ）で処置した冷却し再加温した血小板（Winokur and Hartwig, 1995）は、in vitroでトロンビン−、ＡＤＰ−またはコラーゲン関連ペプチド−（ＣＲＰ）誘発凝集により決定されたように、十分に機能したにもかかわらず、冷却した、未処理の血小板と同じくらい急速に、循環から去った（図１Ｂ）。輸血後すぐに注入した血小板の回復は、５０〜７０％であり、血小板消滅の動態は、血小板に標識を付すのに１１１インジウムまたはＣＭＦＤＡを使用したかにかかわらず、区別できなかった。室温のおよび冷却したマウス血小板の相対生存率は、完全に同じように処置したマウス血小板(Berger et al., 1998）およびヒト血小板(Becker et al., 1973）について以前報告された値と似ている。
【０１０３】
図１Ｃは、室温のおよび冷却したマウス血小板の目的地の器官(organ destination)は異なることを示す。室温の血小板は、主に脾臓に行き着くのに対し、肝臓は、循環から除去した冷却した血小板の主要な滞留地(residence)である。２４時間目に、室温の血小板と比べて、１１１インジウム標識された冷却した血小板を受けている動物の腎臓内で検出された放射性核種のより大きな分画は、冷却した血小板のより急速な分解と、放射性核種の泌尿器系への到達を反映する。注射の１時間後、ＣＭＦＤＡで標識した血小板の器官分布は、１１１インジウムで標識した血小板の器官分布と同程度だった。両方の場合において、６０〜９０％の標識した冷却した血小板集団が肝臓内に、約２０％が脾臓内に、および約１５％が肺内に堆積した。一方、４分の１の注入した室温の血小板は、肝臓、脾臓および肺の間で均等に分配した。
【０１０４】
冷却した血小板は、肝マクロファージ（クッパー細胞）と共局在する。
肝臓による冷却した血小板のクリアランスおよび血小板分解についての証拠は、肝臓の主要な食作用スカベンジャー細胞であるクッパー細胞による冷却した血小板の認識および摂取と一致する。図１Ｄは、輸血の１時間後のマウス肝臓の切片の典型的な共焦点顕微鏡写真における食作用クッパー細胞および付着した冷却したＣＭＦＤＡ標識血小板の位置を示す。類洞マクロファージを、ナイルレッドでマーキングをした１μｍのカルボキシル修飾したポリスチレン微粒子の注射により視覚化した。輸血した血小板およびマクロファージの共局在は、両方の蛍光放射の重ね合わせた顕微鏡写真において黄色で示される。冷却した血小板は、類洞マクロファージが豊富な場所である肝小葉の門脈周囲および中間帯ドメインにおいて選択的にナイルレッド標識細胞と局在する(Bioulac-Sage et al., 1996; MacPhee et al., 1992）。
【０１０５】
ＣＲ３欠損のマウスは、冷却した血小板を急速に一掃しない。
ＣＲ３（αＭβ２インテグリン；ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８；Ｍａｃ−１）は、肝マクロファージによる抗体独立クリアランスの主要な伝達物質である。図２Ａは、冷却した血小板と室温の血小板の両方の集団のクリアランスは、野生型のマウスと比較してＣＲ３欠損マウスにおいてより短い（図ｌＡ）にもかかわらず、冷却した血小板は室温の血小板と同じ動態でＣＲ３欠損動物を循環することを示す。野生型のマウスと比較して、ＣＲ３欠損マウスによる血小板除去率がわずかに速い理由は、明らかではない。冷却し再加温した血小板もまた、補体因子３であるＣ３欠損マウスから急速に一掃され（図２Ｃ）、ＣＲ３経由でのおよびフォンヴィルブランド因子（ｖＷｆ）欠損マウスからの食作用およびクリアランスを促進する主要なオプソニンが不足する（Denis et al., 1998）（図２Ｂ）。
【０１０６】
冷却した血小板は、in vivoでクッパー細胞にしっかりと付着する。
野生型の肝類洞への血小板の付着を生体顕微鏡によりさらに調査し、共に注入した、冷却したおよび室温で貯蔵した、付着した血小板の間の比率を決定した。図３は、両方の冷却したおよび室温の血小板は高クッパー細胞密度で類洞部位に結合する（図３Ａおよび３Ｂ）が、野生型のマウスにおいて室温の血小板より２．５〜４倍多い冷却した血小板がクッパー細胞に付着する（図３Ｃ）ことを示す。一方、ＣＲ３欠損マウス内のクッパー細胞に付着する血小板の数は、冷却または室温への暴露から独立していた（図３Ｃ）。
【０１０７】
ＧＰＩｂαのＮ末端ドメインを欠乏する冷却した血小板は、正常に循環する。
ｖＷｆについてのＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ受容体複合体の成分であるＧＰＩｂαが、in vitroで特定の条件下でＣＲ３に結合できるため（Simon et al., 2000）、ＣＲ３について冷却した血小板における可能性のあるカウンター(counter)受容体としてＧＰＩｂαを調査した。Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼは、マウス血小板ＧＰＩｂαの４５−ｋＤａのＮ末端細胞外ドメインを開裂するが、αＩＩｂβ３，α２α１、ＧＰＶＩ／ＦｃＲγ鎖およびプロテアーゼ活性化受容体などの他の血小板受容体を損なわない（Bergmeier et al., 2001）。したがって、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼによりマウス血小板からＧＰＩｂαのこの部分の細胞外ドメインを取り除き（図４Ａ挿入図）、室温または低温インキュベーション後のマウス内でのそれらの生存を調べた。図４Ａは、冷却した血小板は、ＧＰＩｂαの開裂後、もはや急速なクリアランスを示さないことを示す。さらに、ＧＰＩｂαが枯渇した室温処置した血小板は、ＧＰＩｂαを含む室温の対照と比較したとき、生存時間をわずかに延長した（約５〜１０％）。
【０１０８】
冷却は、活性化ｖＷｆの血小板ｖＷｆ受容体への結合に影響を及ぼさないが、血小板表面上のＧＰＩｂαのクラスタリングを誘発する。
図４Ｂは、血小板の冷却は、マウス血小板表面上のＧＰＩｂαの分布における変化へと至らしめるが、ボトロセチン活性化ｖＷｆは、低温血小板におけるのと同様に、室温の血小板においてＧＰＩｂαに良好に結合することを示す。免疫金(immunogold)標識モノクローナルマウス抗ＧＰＩｂα抗体により確認されたＧＰＩｂα分子は、休止した円盤状の血小板の滑らかな表面上に室温で線状の凝集体を形成する（図４Ｃ、ＲＴ）。この配置は、休止した血液血小板の構造の情報と一致する。ＧＰＩｂαの細胞質ドメインは、フィラミンＡ分子の仲介を通して血小板膜の面と共に曲がっている長いフィラメントと結合する(Hartwig and DeSisto, 1991）。冷却後（図４Ｃ、Ｃｈｉｌｌｅｄ）、多くのＧＰＩｂα分子は、内部アクチン再構成により変形した血小板膜にて、クラスターとして組織する（Hoffmeister et al., 2001; Winokur and Hartwig, 1995）。
【０１０９】
In vitroにおける冷却したヒト血小板のＣＲ３を介した食作用による、血小板ＧＰＩｂαの認識。
ＴＧＦ−β１および１，２５−（ＯＨ）２ビタミンＤ３を用いたヒト単球様ＴＨＰ−１細胞分化は、ＣＲ３の発現を約２倍増加させる（Simon et al., 1996）。冷却は、未分化ＴＨＰ−１細胞による血小板食作用の３倍増加および分化ＴＨＰ−１細胞による約５倍増加をもたらし（図５Ｂおよび５Ｃ）、ＣＲ３による血小板の摂取の関与と一致した。一方、ＴＨＰ−１細胞の分化は、室温で貯蔵した血小板の摂取において有意な効果がなかった（図５Ａおよび５Ｃ）。ＧＰＩｂαが、冷却したヒト血小板におけるＣＲ３を介した食作用のカウンター受容体であるかを決定するために、ヘビ毒メタロプロテアーゼであるモカラギンを使用し、ＧＰＩｂαの細胞外ドメインを除去した（Ward et al., 1996）。ヒト血小板の表面からのモカラギンによるヒトＧＰＩｂαの除去は、冷却後のそれらの食作用を約９８％減少させた（図５Ｃ）。
【０１１０】
低温誘発性血小板クリアランスの他の伝達物質の排除
表１は、冷やすことが、ＧＰＩｂα以外の血小板受容体の発現またはそれらのリガンドとの相互作用に影響を及ぼしたかどうかについて調べた実験の結果を示す。これらの実験は、Ｐ−セレクチンの発現、αＩＩｂβ３−インテグリン密度またはαＩＩｂβ３活性化のマーカーであるαＩＩｂβ３フィブリノゲン結合への検出可能な効果を明らかにしなかった。冷却はまた、アポトーシスの指標である、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の暴露を増加させず、ＩｇＧまたはＩｇＭ免疫グロブリンの血小板結合を変化させなかった。
【０１１１】
表１．様々な抗体またはリガンドの血小板受容体への結合への冷却の効果。
【表１】
【０１１２】
冷却し再加温したまたは室温のヒトおよびマウス血小板における様々な受容体に対する蛍光標識抗体またはリガンドの結合を、フローサイトメトリーにより測定した。データを、冷却した血小板の表面に結合した平均フルオロフォア対室温の血小板の表面に結合した平均フルオロフォアの比率で表現する（平均±ＳＤ、ｎ＝３〜４）。
【０１１３】
循環している冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて止血機能を有する。
野生型のマウスにおける急速なクリアランスにもかかわらず、CM-OrangeまたはＣＭＦＤＡ標識された冷却した血小板は、３種類の独立した方法により決定したように、ＣＲ３欠損マウスへの注入の２４時間後、機能的であった。第一に、冷却した血小板を、標準化した尾静脈出血創傷から生じている流血中の血小板凝集体に取り込んでいる（図６）。野生型のマウスに輸血したＣＭＦＤＡ陽性の室温の血小板（図６Ｂ）およびＣＲ３欠損マウスに輸血したＣＭＦＤＡ陽性の冷却した血小板（図６Ｄ）は、受容マウスのＣＭＦＤＡ陰性の血小板と同一程度に流血中に凝集体を形成した。第二に、αＩＩｂβ３のフィブリノゲン結合部位の血小板表面暴露により決定したように、トロンビンによるex vivo刺激後にＣＲ３欠損マウスへ冷却し再加温したCM-Orange標識の血小板を輸血後、２４時間後に。第三に、冷却し再加温したCM-Orange血小板は、トロンビン活性化に対する反応においてＰ−セレクチンの上方制御の完全な能力があった（図６Ｅ）。
【０１１４】
考察
低温誘発性の血小板形態変化だけでは、in vivoの血小板クリアランスを引き起こさない
冷やすことは、細胞内細胞骨格の再構成を介した大きな血小板の形態変化を急速に誘発する（Hoffineister et al., 2001; White and Krivit、1967; Winokur and Hartwig, 1995）。これらの変化は、再加温により一部可逆的であるが完全に可逆的ではなく、再加温した血小板は、円盤状というより、より球状である。トロンビンによりex vivoで活性化された輸血したマウスおよびヒヒの血小板は、大きな形態の変化を伴って正常に循環するという証拠にもかかわらず、血小板の円盤状の形態の維持が、血小板の生存における主要な必要条件であるという考えは、定説であった（Berger et al., 1998; Michelson et al, 1996）。
【０１１５】
本明細書において、冷却は、形態の変化と独立してその除去を介する血小板表面における特異的な変化へと導き、形態の変化は本質的に急速な血小板クリアランスと至らしめないことを示した。冷却し再加温した血小板は、薬剤により円盤として保存され、未処理の冷却した血小板と同じ速度で一掃され、および歪み、冷却し再加温した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で室温で維持した血小板のように循環する。小型の血小板は、循環内にとどまることが可能であり、これらの大きな形態の変形にもかかわらず、捕捉(entrapment)から逃れる。
【０１１６】
冷却した血小板のクリアランスを仲介する受容体：ＣＲ３およびＧＰＩｂα
ヒトにおける正常な血小板の寿命は、およそ７日である（Aas, 1958; Ware et al., 2000）。例えば、播種性血管内凝固中に生じるものなどの大量の凝固反応は、血小板減少症の原因となるため、連続した機械的応力により生じた小さな血塊への血小板の取り込みは、間違いなく血小板クリアランスに寄与する（Seligsohn, 1995）。In vivoの血小板刺激は、負傷した血管壁において生じ、活性化血小板は急速にこれらの部位で隔離させる(sequester)ため、かかる凝固反応における血小板の死は、Michelsonら（Michelson et al., 1996）およびBergerら（Berger et al., 1998）の実験などにおける注入したex vivo活性化血小板の死と異なる。
【０１１７】
同種抗体および自己抗体は、免疫不適合血小板により感作された個体における、または自己免疫性血小板減少症の患者における、Ｆｃ受容体を有するマクロファージにより、血小板の食作用除去を加速するが、それ以外には、血小板クリアランスの機構に関してほとんど情報が存在しない。しかしながら、冷却したまたは室温のヒト血小板に結合したＩｇＧまたはＩｇＭの量は同一であり、血小板関連抗体のＦｃ受容体への結合は、冷やした血小板のクリアランスを調節しないことを意味することを示した。また、血小板の冷却は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）暴露に不利に作用するin vitroで血小板表面における検出可能なＰＳ暴露および冷却した血小板のクリアランスにおけるスカベンジャー受容体の関与を誘発しないことを実証した。
【０１１８】
多くの刊行物が、血小板における低温の効果を「活性化」として言及しているにもかかわらず、細胞骨格に媒介された形態の変化とは別に、冷却した血小板は、トロンビンまたはＡＤＰなどのに刺激より活性化された血小板と似ていない。正常な活性化は、表面Ｐ−セレクチン発現を顕著に増加させ、これは、細胞内顆粒からの分泌の結果である（Berman et al., 1986）。血小板の冷却は、Ｐ−セレクチンの増加を引き起こさないが（表１）、野生型またはＰ−セレクチン欠損マウスから単離された冷却した血小板のクリアランスは、等しく急速である（Berger et al., 1998）。活性化はまた、αＩＩｂβ３−インテグリンの量およびフィブリノゲンについてのその結合力を増加させるが（Shattil, 1999）、冷やすことは、これらの効果を有さない（表１）。トロンビン活性化血小板の正常な生存は、我々の発見と一致する。
【０１１９】
肝臓マクロファージのＣＲ３は、主に冷やした血小板の認識およびクリアランスに関与することを示した。冷却した血小板のクリアランスにおける肝臓内のＣＲ３を有するマクロファージの主要な役割は、脾臓内の豊富なＣＲ３発現型マクロファージにもかかわらず、ＩｇＭでコートされた赤血球の主要な肝臓のクリアランスと一致し（Yan et al., 2000）、マクロファージＣＲ３による結合および摂取に有利に働く肝臓の血液濾過特性を反映するだろう。ＧＰＩｂαの細胞外ドメインは、ＣＲ３に積極的に結合し、in vitroの剪断応力下で、ＴＨＰ−１細胞の回転(rolling)および安定した付着を支持する（Simon et al., 2000）。マウスＧＰＩｂαの細胞外ドメインの開裂は、マウスに輸血した冷却した血小板の正常な生存をもたらす。ヒトの冷却した血小板のＧＰＩｂαの枯渇は、処置した血小板の食作用をin vitroでのマクロファージ様細胞により大いに減少させる。したがって、ＧＰＩｂαは、食作用による血小板クリアランスへと至らしめる冷却した血小板の肝臓マクロファージＣＲ３のための共受容体であることを提案する。
【０１２０】
ＧＰＩｂαのＮ末端部分が欠損している低温血小板の正常なクリアランスは、冷却した血小板クリアランスを仲介する候補として血小板表面上に発現した分子を含む多くの他のＣＲ３結合パートナーを無視する。これらのリガンド候補は、ＩＣＡＭ−２、血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合したフィブリノゲン、ｉＣ３ｂ、Ｐ−セレクチン、グルコサミノグリカン、および高分子量キニノーゲンを含む。我々は、補体因子３を欠損しているマウスを用いて、冷却した血小板クリアランスのための機構としてオプソニンＣ３ｂフラグメントｉＣ３ｂの堆積を排除したが、αＩＩｂβ３の発現レベルおよびフィブリノゲン結合もまた、血小板の冷却後に変化しない。
【０１２１】
活性化ｖＷｆへの結合およびＣＲ３への低温誘発性結合は、ＧＰＩｂαの独立した機能のようである。
休止円盤状の血小板の表面のＧＰＩｂαは、フィラミンＡおよびフィラミンＢにより亜膜(submembrane)アクチン細胞骨格に結合した、ＧＰＩｂα、ＧＰＩＸおよびＶを有する複合体内に、線形配列（図５）状に存在している（Stossel et al., 2001）。止血におけるその役割は、血管損傷位置でｖＷｆの活性型を結合させることである。活性化ｖＷｆは、休止血小板または刺激血小板でＧＰＩｂαに同等に良好に結合することから、活性化ｖＷｆへのＧＰＩｂα結合は構造的であり、血小板からの積極的な寄与は必要ない。トロンビンおよび他のアゴニストによる懸濁液中の血小板の刺激は、ＧＰＩｂαを一部血小板表面から内膜のネットワークである開放小管系へと再分布させる原因となるが、in vivoでの血小板クリアランス（Berger et al., 1998; Michelson et al., 1996）またはin vitroでの食作用（未発表の観察）を引き起こさない。しかしながら、血小板を冷やすことは、内在化(internalization)よりむしろ、ＧＰＩｂαクラスタリングの原因となる。このクラスタリングは、サイトカラシンＢの存在下で生じるため、反矢じり端のアクチン集合から独立している。
【０１２２】
低温によってＣＲ３による血小板ＧＰＩｂαの認識が促進するにもかかわらず、in vitroでのＧＰＩｂαおよび活性化ｖＷｆの間の相互作用における効果はなく、ｖＷｆ欠損マウスに輸血した冷却した血小板は、野生型のマウスにおけるのと同様に急速に消滅する。ｖＷｆおよびＣＲ３とのＧＰＩｂαの相互作用の分離可能性は、ＧＰＩｂαの選択的修飾は、ｖＷｆとのＧＰＩｂαの止血に重要な反応を損なうことなく低温誘発性血小板クリアランスを阻害するかもしれないことを示唆する。In vitroでのおよびＣＲ３欠損マウスへの注入後の冷やした血小板の血小板機能のすべての試験は、正常な結果をもたらすことから、適切に修飾した血小板は、予想通りに止血に効果的である。
【０１２３】
低温誘発性血小板クリアランスの生理学的重要性
全体的な血小板の形態の変化が、１５℃以下の温度でのみ明らかになるにもかかわらず、精密な生化学分析は、細胞骨格の変化およびトロンビンへの反応性の増加が、温度が３７℃以下に下がるにつれて、検出可能であることを示す（Faraday and Rosenfeld, 1998; Hoffineister et al., 2001; Tablin et al., 1996）。低温暴露した血小板とトロンビン刺激またはＡＤＰ刺激血小板との間に残る多くの機能的差異のため、それらの変化を「プライミング」と示す。
【０１２４】
血小板の活性化は、コア体温にさらされる冠状および脳血管において潜在的に致命的であることから、我々は、血小板は熱センサーであり、中央循環のコア体温では比較的不活性であるが、進化史を通じて最も出血を起こしやすい位置である外側の体の表面のより低い温度で活性化がプライムされるようになるよう設計されていることを提案した（Hoffmeister et al., 2001）。本明細書において報告した発見は、ＧＰＩｂαにおける不可逆変化が冷やした血小板のクリアランスの理由であることを示唆する。冷却した血小板を循環させるよりも、生物は食作用により低温でプライム化した血小板を一掃する。
【０１２５】
一つは局在的に活性化した血小板の除去のため、およびもう一つは過剰にプライム化した血小板を取り除くために（図７）、少なくとも２種類のクリアランス経路が関与するシステムは、なぜ冷却した血小板がＣＲ３欠損マウスにおいて正常に循環および機能し、ＧＰＩｂαの除去後にわずかに延長された循環を有するのかを、おそらく説明できるだろう。我々は、いくつかのプライム化した血小板が、確率的基礎にしたがって微小血管の凝固に入ることを提案する。その他のプライム化した血小板は、体の表面温度に繰返し暴露を受けやすく、この反復プライミングが、次第にこれらの血小板をＣＲ３を有する肝臓マクロファージにより識別可能にさせる。冷却によりプライムされた血小板は、ＣＲ３欠損マウスにおいて正常な止血機能の能力があり、凝固はそれらのクリアランスに寄与する。しかしながら、冷蔵した血小板のクリアランス率は、室温で保持された血小板のクリアランス率と区別できないため、検査したＣＲ３欠損マウスにおける自己血小板のわずかに短い生存時間は、おそらく微小血管凝固において正常にプライム化した血小板のクリアランスの増加に起因しない。
【０１２６】
本発明および例１の背景となる参考文献
【表２】
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
【表４】
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
例２
冷却した血小板食作用におけるαＭβ２（ＣＲ３）レクチンドメインの関係
αＭβ２（ＣＲ３）は、陽イオン独立の糖結合レクチン部位を有し、マンナン、グルカンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に結合するそのＩ−ドメインに「Ｃ−Ｔ」を局在させる（Thornton et al, J. Immunol. 156, 1235-1246, 1996）。ＣＤ１６ｂ／αＭβ２膜複合体は、β−グルカン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、およびメチル−α−マンノシドにより分裂するが、他の糖により分裂しないことから、この相互作用はαＭβ２インテグリン（ＣＲ３）のレクチン部位で生じると信じられている（Petty et al, J. Leukoc. Biol. 54, 492-494, 1993; Sehgal et al, J. Immunol. 150, 4571-4580, 1993）。
【０１３２】
αＭβ２インテグリンのレクチン部位は、幅広い糖特異性を有する（Ross, R. Critical Reviews in Immunology 20,197-222, 2000）。レクチンへの糖結合は、通常親和性が低いにもかからわず、クラスタリングは、結合力を増加させることにより、より強固な相互作用をもたらすことができる。冷やした後のＧＰＩｂαのクラスタリングは、電子顕微鏡により示したように、かかる機構を示唆する。動物細胞の最も一般的なヘキソサミンは、Ｄ−グルコサミンおよびＤ−ガラクトサミンであり、大部分はＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃとして構造性炭水化物において生成し、αＭβ２インテグリンレクチンドメインもまた、シアル酸によりカバーされていない炭水化物を含む哺乳動物の糖タンパク質に結合してもよいことを示唆している。
【０１３３】
水溶性のＧＰＩｂαであるグリコカリシン(glycocalicin)は、６０％の炭水化物含有量を有し、Ｎ−ならびにＯ−グリコシド結合炭水化物鎖を含む（Tsuji et al, J. Biol. Chem. 258, 6335-6339, 1983）。グリコカリシンは、４つの潜在的なＮ−グリコシル化の部位を含む（Lopez, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84, 5615-5619, 1987）。４５ｋＤａ領域は、Ｎ−グリコシル化される２つの部位を含む（Titani et al, Proc Natl Acad Sci 16, 5610-5614, 1987）。正常な哺乳動物の細胞において、Ｏ−グリカンの４つの一般的なコア構造を合成することができる。これらすべては、機能的炭水化物構造を形成するために、伸長、シアル酸化(sialylated)、フコシル化(fucosylated)および硫酸化してもよい。
【０１３４】
ＧＰＩｂαのＮ−結合炭水化物鎖は、複合体タイプおよびジ−、トリ−およびテトラ−触覚構造(antennary structure)である(Tsuji et al, J. Biol. Chem. 258, 6335-6339, 1983）。それらは、Ａｓｎ−結合のＧｌｃＮＡｃ単位にα（１−６）−結合フコース残基を有するシアル酸化されたＧａｌＮＡｃタイプの構造である。Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−結合を有するＡｓｎ−結合糖鎖の構造的類似性がある：すなわち、それらの位置は、共通のＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ配列である。結果は、シアル酸およびガラクトースの除去は、ｖＷｆのグリコカリシンへの結合に影響はないが、ＧｌｃＮａｃの部分的な除去は、ｖＷｆ結合の阻害をもたらしたことを示唆した（Korrel et al, FEBS Lett 15, 321-326, 1988）。より最近の研究は、炭水化物の傾向は、ｖＷｆの結合に直接関与せずに、受容体の適切な機能的コンホメーションを維持することに関与することを提案した（Moshfegh et al, Biochem. Biophys. Res. Communic. 249, 903-909, 1998）。
【０１３５】
冷却した血小板およびマクロファージ間の相互作用における糖の役割は、オリゴ糖残基の共有結合修飾、除去またはマスキングが、この相互作用を阻止することができたという重要な結果を有する。我々は、かかる阻止が、正常な血小板機能を低下させない場合、血小板を修飾することができ、低温血小板貯蔵を可能にするかもしれないという仮説を立てた。
【０１３６】
本明細書において、この仮説に有利に働く証拠を示す：１）糖類は、in vitroでマクロファージにより冷却した血小板の食作用を阻害し、効果的である特定の糖は、β−グルカンを関連標的として関与させた。低濃度のβ−ＧｌｃＮＡｃは、驚くほど効果的な阻害物質であり、比較的少数のクラスター化した糖の妨害は、食作用を阻害するのに十分だろうという考えと一致した。冷却した血小板の食作用を最大限に阻害した濃度での糖の添加は、正常なＧＰＩｂα機能（ｖＷｆ結合）に効果を有さない；２）β−ＧｌｃＮＡｃ−特異的レクチンは、冷却した血小板に貪欲に結合したが、他のレクチンは結合しなかった；３）血小板表面からのＧＰＩｂαまたはβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の除去は、この結合を阻止した（β−ＧｌｃＮＡｃの除去はマンノース残基を暴露したため、マンノース受容体を有するマクロファージにより食作用を阻止しなかった）；４）ガラクトースの酵素的添加による冷却した血小板の暴露されたβ−グルカンの遮断は、in vitroでマクロファージにより冷却した血小板の食作用を顕著に阻害し、正常な動物内で冷却した血小板の循環時間を延長した。
【０１３７】
冷却した血小板の食作用への単糖類の効果
血小板の食作用への単糖類の効果を分析するために、食細胞（分化した単球性細胞系ＴＨＰ−１）を単糖類溶液中様々な濃度でインキュベートし、冷却したまたは室温の血小板を添加した。図中の値は、３〜５の実験の平均±ＳＤであり、ＲＴまたは冷却した血小板とインキュベートした摂取された血小板を含むorange陽性の単球のパーセンテージを比較している。１００ｍＭのＤ−グルコースは、冷却した血小板の食作用を６５．５％阻害したのに対し（Ｐ＜０．０１）、１００ｍＭのＤ−ガラクトースは、冷却した血小板の食作用を有意に阻害しなかった（ｎ＝３）（図８Ａ）。Ｄ−グルコースα−アノマー（α−グルコシド）は、１００ｍＭで９０．２％阻害したが、冷却した血小板の食作用について阻害効果を有しなかった（図８Ｂ）。一方、β−グルコシドは、用量依存的に食作用を阻害した（図８Ｂ）。１００ｍＭのβ−グルコシドを用いた食細胞のインキュベーションは、食作用を８０％（ｐ＜０．０５）阻害し、および２００ｍＭで９７％（Ｐ＜０．０５）阻害し、したがって、本明細書において、β−アノマーが好ましいと結論を出した。
【０１３８】
Ｄ−マンノースおよびそのα−アノマーおよびβ−アノマー（メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（図８Ｃ）およびメチル−β−Ｄ−マンノピラノシド（図８Ｃ））は、冷却したまたはＲＴの血小板の食作用について阻害効果を有しなかった。２５〜２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）を用いた食細胞のインキュベーションは、冷却した血小板の食作用を有意に阻害した。１０μＭのＧｌｃＮＡｃのβ−アノマーは、冷却した血小板の食作用を８０％阻害したのに対し（ｐ＜０．０１）（図８Ｄ）、２５ｍＭのＧｌｃＮＡｃを用いたインキュベーションは、冷却した血小板の食作用を８６％（Ｐ＜０．０５）阻害するのに十分であった（図８Ｄ）。単糖類のいずれも、ＲＴの血小板の食作用について阻害効果を有しなかった。表２は、冷却した血小板の食作用について指示濃度での単糖類の阻害効果をまとめる（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。単糖類のいずれも、トロンビンまたはリストセチンが誘発したヒト血小板凝集を阻害しなかったか、またはＰ−セレクチン暴露により測定されたようにα−顆粒分泌を誘発しなかった。
【０１３９】
表２．冷却した血小板の食作用についての単糖類の阻害効果
【表７】
【０１４０】
様々なレクチンの室温の血小板または冷却した血小板への結合。
β−ＧｌｃＮＡｃは、μＭ濃度で、in vitroで冷却したヒト血小板の食作用を強力に阻害し、これは、ＧｌｃＮＡｃは、低温での血小板のインキュベーション後に暴露されることを示す。我々は、そして、末端糖（ＧｌｃＮＡｃ）に対して特異性を有するレクチンである小麦胚凝集素（ＷＧＡ）は、室温の血小板よりも、より効果的に冷却した血小板に結合するかどうかを調査した。洗浄した、冷却したまたは室温の血小板を、３０分間室温で２μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ＷＧＡまたはＦＩＴＣ結合スクシニル−ＷＧＡを用いてインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。図９Ａおよび９Ｂは、室温（ＲＴ）または冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す。ＷＧＡは、血小板凝集を引き起こし、そしてＷＧＡ２５〜５０μｇ／ｍｌの濃度でセロトニンまたはＡＤＰの遊離を誘発する（Greenberg and Jamieson, Biochem. Biophys. Acta 345, 231-242, 1974）。２μｇ／ｍｌのＷＧＡとのインキュベーションは、ＲＴの血小板の有意な凝集を誘発しなかったが（図９Ａ、ＲＴ ｗ／ＷＧＡ）、２μｇ／ｍｌのＷＧＡを用いた冷却した血小板のインキュベーションは、大量の凝集を誘発した（図９Ｂ、Ｃｏｌｄ ｗ／ＷＧＡ）。
【０１４１】
図９Ｃは、冷却したまたは室温の血小板に結合するＦＩＴＣ−ＷＧＡ蛍光の分析を示す。蛍光結合の増加は、凝集に関係しないことを確認するために、本明細書において、血小板凝集を誘発しない、レクチンの二量体の誘導体であるスクシニル−ＷＧＡ（Ｓ−ＷＧＡ）を使用した（Rendu and Lebret, Thromb Res 36, 447-456, 1984）。図９Ｄおよび９Ｅは、スクシニル−ＷＧＡ（Ｓ−ＷＧＡ）は、室温のまたは冷却した血小板の凝集を誘発しなかったことを示すが、室温の血小板に対して冷却した血小板へのＷＧＡ結合が同じ増加の結果となった（図９Ｆ）。血小板の冷却後のＳ−ＷＧＡの促進された結合は、冷却した血小板を３７℃に加温することにより、戻すことができない。
【０１４２】
暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基は、連鎖Ｇａｌβ−１ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒを触媒するβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素のための基質として機能を果たす。この予想を支持して、酵素的ガラクトシル化によるβ−ＧｌｃＮＡｃ残基のマスキングは、低温血小板へのＳ−ＷＧＡ結合、ＴＨＰ−１細胞による冷却した血小板の食作用、およびマウスへの輸血後の冷却した血小板の急速なクリアランスを阻害した。ウシβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびそのドナー基質ＵＤＰ−Ｇａｌにより達成した酵素ガラクトシル化は、室温の血小板と同等のレベルに、冷却したヒト血小板へのＳ−ＷＧＡ結合を減少させた。反対に、ガラクトース特異的ＲＣＡ Ｉレクチンの結合は、ガラクトシル化の後約２倍増加した。ＵＤＰ−グルコースおよびＵＤＰのみは、冷却したまたは室温のヒト血小板へのＳ−ＷＧＡまたはＲＣＡ Ｉ結合に効果がなかった。
【０１４３】
本明細書において、ヒトおよびマウス血小板の酵素ガラクトシル化は、外因性β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼの添加なしで効率的であることを見出した。ドナー基質ＵＤＰ−Ｇａｌの添加のみは、Ｓ−ＷＧＡ結合を減少させ、冷却した血小板へのＲＣＡ Ｉ結合を増加させ、in vitroでＴＨＰ１細胞による冷却した血小板の食作用を阻害し、マウス内で冷却した血小板の循環を延長させる。この予期せぬ発見についての説明は、血小板が内因性ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をゆっくり放出すると報告されている。β１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、β４Ｇａｌ Ｔ１の少なくとも一形態は、ヒト血漿中に、洗浄したヒト血小板におよび洗浄した血小板の上清中に存在する。ガラクトシルトランスフェラーゼは、血小板表面と特異的に関係してもよい。あるいは、活性は、血漿由来であってもよく、および血小板の開放小管系から漏出する。いずれにしても、冷却を介した血小板クリアランスに関与する血小板グリカンの修飾は、糖−ヌクレオチドドナー基質である、ＵＤＰ−Ｇａｌの単純な添加により、可能である。
【０１４４】
重要なことに、両方の冷却したおよび非冷却の血小板は、ガラクトシル化後のＲＣＡ Ｉ結合において同じ増加を示し、これはβ−ＧｌｃＮＡｃ残基が温度から独立して血小板表面において暴露されたことを意味する。しかしながら、冷却は、Ｓ−ＷＧＡによるおよびαＭβ２インテグリンによるβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の認識のための必要条件である。我々は、血小板の冷却は、ＧＰＩｂの不可逆的クラスタリングを誘発することを実証した。一般的に、レクチン結合は、低い親和性を有し、高密度の炭水化物リガンドとの多価の相互作用は、結合力を増加させる。おそらく、非冷却の血小板の表面の暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃの局部密度は、認識には低すぎるが、ＧＰＩｂαの低温誘発性クラスタリングは、Ｓ−ＷＧＡまたはαＭβ２インテグリンレクチンドメインに結合するのに必要な密度を提供する。Ｓ−ＷＧＡおよびＲＣＡ−Ｉ結合フローサイトメトリーにより、ＵＤＰ−Ｇａｌは、添加したガラクトシルトランスフェラーゼの存在下または非存在下でマウス血小板にガラクトースを輸送することを確認し、冷却しガラクトシル化したマウス血小板は循環し、初めは未処理の室温の血小板よりも有意に良好に生存することを立証した。
【０１４５】
最も早い回復は（＜２分）、輸血したＲＴ、冷却した血小板と、冷却しガラクトシル化した血小板との間で差異はなかったにもかかわらず、ガラクトシル化は、ＲＴ血小板で常に観察された約２０％の初期の血小板損失をなくした。
【０１４６】
マウスおよびヒト血小板のガラクトシル化は、最大限に効果的な濃度から３桁小さい濃度までの範囲でのコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）またはトロンビンに誘発された凝集およびＰ−セレクチン暴露により測定されたように、in vitroでのそれらの機能性を低下させなかった。重要なことに、ＧＰＩｂおよび活性化ｖＷｆの間の相互作用の試験である、リストセチン濃度の範囲への未修飾のおよびガラクトシル化し冷却したヒト血小板の凝集反応は、区別できないか、またはわずかに良かった。ＧＰＩｂαのＮ−結合グリカンのための結合点は、ｖＷｆのための結合ポケットの外側である。さらに、Ｎ−結合グリカン欠如する突然変異のＧＰＩｂα分子は、ｖＷｆにしっかりと結合する。
【０１４７】
β−ガラクトース（R. communisのレクチン／ＲＣＡ）、２−３シアル酸（Maackia amurensisのレクチン／ＭＡＡ）または２−６シアル酸（Sambucus nigraの樹皮のレクチン／ＳＮＡ）に関して特異性を有するＦＩＴＣ標識レクチンを用いて、我々は、フローサイトメトリーによる血小板の冷却後の結合の増加は検出できず（図１０）、血小板の冷却後の暴露は、ＧｌｃＮＡｃに制限されることを示した。
【０１４８】
我々は、ＧＰＩｂαＮ−グリカンのαＭβ２レクチンドメイン認識を仲介する暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基をつきとめた。ＧＰＩｂαの細胞外ドメインは、血小板炭水化物含有量の６０％を、Ｎ−およびＯ−グリコシド結合炭水化物鎖の形状で含む。したがって、ペルオキシダーゼ標識ＷＧＡのＧＰＩｂαへの結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された全血小板タンパク質の表示において簡単に検出可能であり、ＧＰＩｂαは、血小板にβ−ＧｌｃＮＡｃ残基の大部分を含むことを実証しており、ＷＧＡのＧＰＩｂαへの結合が、ＧＰＩｂα免疫沈降物において観察可能である。ＧＰＩｂαへのＲＣＡ Ｉ結合が増加するのに対し、添加したガラクトシルトランスフェラーゼを有するまたは有しないＵＤＰ−Ｇａｌは、ＧＰＩｂαへのＳ−ＷＧＡ結合を減少させる。
【０１４９】
これらの発見は、ガラクトシル化は、特異的にＧＰＩｂαの暴露されたβ−ＧｌｃＮＡｃ残基に及ぶことを示す。In vitroでＴＨＰ−１細胞によりヒト血小板の食作用を阻害したヘビ毒プロテアーゼであるモカラギンを用いたＧＰＩｂαのＮ末端２８２残基のヒト血小板表面からの除去は、Ｓ−ＷＧＡの室温の血小板への結合レベルとほとんど同等に、冷却した血小板へのＳ−ＷＧＡ結合を減少させる。ＷＧＡは主に、そのドメインに特異的なモノクローナル抗体ＳＺ２により認識可能な４５ｋＤａのポリペプチドバンドとして、モカラギンにより血小板上清に遊離されたＧＰＩｂαのＮ末端に結合する。このドメインのグリカンは、Ｎ−結合である。ＧＰＩｂαのごく一部が、モカラギン処置後、無傷のままであり、血小板の開放小管系がそれを隠すからであろう。ペルオキシダーゼ結合ＷＧＡは、モカラギン開裂後、モノクローナル抗体ＷＭ２３で同定可能な残留する血小板関連ＧＰＩｂαのＣ末端を弱く認識する。
【０１５０】
αＭβ２インテグリンへのおよびＳ−ＷＧＡへのヒト血小板の結合における低温誘発性増加は、急速に（数分以内に）生じる。Ｓ−ＷＧＡの冷却した血小板への増強された結合は、自己血漿における１２日までの冷蔵貯蔵で安定したままであった。ＲＣＡ Ｉ結合は、同じ条件下で、室温レベルと同等のままであった。ガラクトシル化は、ＲＣＡ Ｉレクチンの血小板への結合を２倍にし、Ｓ−ＷＧＡ結合をベースラインＲＴレベルへ減少させた。ＲＣＡ Ｉの増加およびＳ−ＷＧＡ結合の減少は、ガラクトシル化が自己血漿における１２日までの貯蔵を進めたかまたは続けたかにかからわず同一であった。これらの発見は、レクチン結合を阻害するための血小板のガラクトシル化が、冷蔵の前または後に可能であり、グリカン修飾が、１２日までの貯蔵中、安定していることを示す。室温で貯蔵した血小板は、凝集剤への反応性を急速に失う；この喪失は、冷蔵のものでは生じない。したがって、貯蔵の前または後に、ガラクトシル化したまたはしなかった、冷蔵血小板は、１２日までの低温貯蔵で、トロンビンへの凝集反応性を保持した。
【０１５１】
室温貯蔵した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡレクチン結合と冷却貯蔵した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡレクチン結合との対比における、β−ヘキソサミニダーゼ（β−Ｈｅｘ）およびモカラギン（ＭＯＣ）の効果
酵素β−ヘキソサミニダーゼは、オリゴ糖からの末端β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基の加水分解を触媒する。ＧｌｃＮＡｃ残基の除去は、ＷＧＡの血小板表面への結合を減少させるかどうかを分析するために、冷却したおよび室温の洗浄したヒト血小板を、１００Ｕ／ｍｌのβ−Ｈｅｘで３０分間３７℃で処置した。図１１Ａは、β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得た室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合の概要を示す。冷却した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合は、ＧｌｃＮＡｃの除去後、８５％減少した（ｎ＝３）。
【０１５２】
また、我々は、予想通り、ＧＰＩｂαの血小板表面からの除去は、血小板の冷却後、ＷＧＡ−結合の減少を引き起こすかどうかを確認した。ＧＰＩｂαを、前記のとおり、ヘビ毒モカラギン（ＭＯＣ）を用いて、血小板表面から除去した（Ward et al, Biochemistry 28, 8326-8336, 1996）。図１１Ｂは、血小板表面からのＧＰＩｂα除去は、冷却した血小板へのＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合を７５％減少させ、ＧＰＩｂαが激減した室温の血小板へのＷＧＡ結合にほとんど影響がなかったことを示す（ｎ＝３）。これらの結果は、ＷＧＡは、ヒト血小板の冷却後、大部分はＧＰＩｂαのオリゴ糖に結合することを示し、Ｍａｃ−１レクチン部位もまた、食作用を引き起こすＧＰＩｂαのこれらの暴露された糖を認識すると推測したくなる。
【０１５３】
ガラクトース輸送によるヒト血小板ＧｌｃＮＡｃ残基のマスキングは、in vitroで冷却後、それらの食作用を大いに減少させ、マウス内でのそれらの生存を劇的に増加させる。
血小板へのガラクトース輸送を達成するため、単離したヒト血小板を、２００μＭのＵＤＰ−ガラクトースおよび１５ｍＵ／ｍｌのガラクトーストランスフェラーゼと共に３０分間３７℃でインキュベートし、次いで２時間冷却したかあるいは室温で維持した。ガラクトシル化は、ＦＩＴＣ−ＷＧＡ結合をほぼ休止室温レベルまで減少させた。血小板を単球に摂取させ、血小板の食作用を上記のように分析した。図１２は、血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送は、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を大いに減少させるが、室温（ＲＴ）の血小板の食作用に影響を及ぼさないことを示す（ｎ＝３）。これらの結果は、in vitroにおいて、冷却した血小板の食作用は、暴露したＧｌｃＮＡｃ残基の被覆により減少させることができることを示す。
【０１５４】
我々は、このアプローチを、動物にまで広げることができるかどうか、そして冷却した血小板の循環時間を増加させるために用いることができるかどうかを試験した。マウス血小板を単離し、ＣＭＦＤＡで染色した。ヒト血小板について上述したガラクトース輸送の同じアプローチを用いて、野生型のマウス血小板をガラクトシル化し、２時間冷却したか、あるいはしなかった。１０８個の血小板を野生型のマウスに輸血し、それらの生存を決定した。図１３は、未処理の血小板と比較した、これらの冷却しガラクトシル化したマウス血小板の生存率を示す。冷却した未処理の血小板（Ｃｏｌｄ）は、予想通り急速に一掃されたのに対し、室温で保持した血小板（ＲＴ）およびガラクトシル化し冷却した血小板（Ｃｏｌｄ＋ＧａｌＴ）の両方は、ほぼ同一の生存時間を有した。我々は、ガラクトシル化し冷却した血小板は、ヒト内で循環するだろうと信じている。
【０１５５】
ガラクトーストランスフェラーゼを熱不活性化した対照の反応もまた、ＷＧＡ結合（図１４Ａ）、ヒト血小板におけるin vitro食作用の結果（図１４Ｂ）、およびマウス血小板の生存（図１４Ｃ）により判断されたように、活性なガラクトーストランスフェラーゼによる実験的反応において生じたように、血小板のグリカン修飾をもたらしたことに注目した。したがって、我々は血小板がそれらの表面において、いかなる外因性ガラクトーストランスフェラーゼを添加することなく、ＵＤＰ−ガラクトースのみを用いてグリカン修飾を進めることができるガラクトーストランスフェラーゼ活性を含むと結論づける。したがって、血小板のグリカン修飾は、単純にＵＤＰ−ガラクトースのインキュベーションにより、達成することができる。
【０１５６】
ＵＤＰ−ガラクトースを時間依存的にヒト血小板に取り込む。
別の一連の実験において、１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースを、酵素ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下または非存在下において、時間依存的にヒト血小板に取り込むことを示した。図１５は、１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの洗浄したヒト血小板への取り込みの経時変化を示す。ヒト血小板を、異なる時間間隔でガラクトシルトランスフェラーゼの非存在下で１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースを用いてインキュベートした。そして血小板を洗浄し、血小板に関連する１４Ｃ放射活性を測定した。
【０１５７】
例３
血小板β−グリカンの酵素修飾は、in vitroのマクロファージによる冷やした血小板の食作用を阻害し、in vivoの正常な循環を適応させる。
我々の予備実験は、冷却したヒト血小板表面へのガラクトース輸送（グリカン修飾）を用いたＧＰＩｂαにおけるＧｌｃＮＡｃ残基の酵素的被覆が、それらのin vitro食作用を大いに減少させたことを実証した。これらの発見の解釈は、ＧＰＩｂα構造は、冷却したヒトおよびマウス血小板の表面上で変化したということである。これは、αＭβ２のレクチン結合ドメインにより認識されるＧｌｃＮＡｃの暴露またはクラスタリングの原因となり、血小板除去を引き起こす。β−ＧｌｃＮＡｃの暴露は、ＷＧＡ結合によりおよびおそらく組み換え型αＭβ２レクチンドメインペプチドの結合により測定することができる。休止しているヒト血小板は、冷却後大いに増加するＷＧＡを結合する。我々は、ガラクトース輸送（グリカン修飾）は、αＭβ２−レクチンとのＧＰＩｂαの相互作用を阻止するがｖＷｆとの相互作用を阻止しないことを提案する。この修飾（血小板表面へのガラクトース輸送）は、予備実験により示したように、ＷＴマウスにおける冷却した血小板の正常な生存へと導く。
【０１５８】
例４
この例は、αＭβ２レクチン部位はＷＧＡを模倣し、糖修飾は組み換え型レクチン部位の冷却した血小板との関与を阻止することを示す。Dr. T. Springer（Corbi, et al., J. Biol Chem. 263, 12403-12411, 1988）は、ヒトαＭ ｃＤＮＡおよびいくつかの抗αＭ抗体を提供した。報告されているレクチン作用を示す最小のｒ−ｈｕαＭコンストラクトは、そのＣ−Ｔおよびその二価陽イオン結合領域（残基４００〜１０９８）の一部を含む（Xia et al, J Immunol 162, 7285-7293, 1999）。本コンストラクトは、精製を簡単にするため、6xHisタグ付である。
【０１５９】
我々は、組み換え型レクチンドメインを、食作用アッセイにおける冷却した血小板の摂取の競合的阻害物質として使用することができるかを、第一に決定した。競合は、αＭレクチン部位が、血小板表面への結合に関与しており、食作用を開始させることを証明した。対照として、αＭのレクチン結合領域が欠如しているコンストラクトを使用し、組み換え型タンパク質を変性した。レクチン結合ドメインは、冷却した血小板の摂取の特異的阻害物質として機能する。ＧＦＰを含んで発現するαＭコンストラクトを作り、αＭ−レクチン結合部位をＦＩＴＣで標識し、それをフローサイトメトリーにより冷却した血小板の表面を標識するために使用した。血小板をＣＭＦＤＡで標識した。冷却した血小板は、室温の血小板と比較して、αＭβ２インテグリンのαＭレクチン側により効率的に結合することを見出した。レクチン側および全αＭコンストラクト（Ｍａｃ−１）は、Ｓｆ９昆虫細胞において発現された。
【０１６０】
血小板糖鎖を、ｒ−ｈｕαＭ−レクチン部位との血小板−オリゴ糖相互作用を阻害するために修飾する。糖修飾の効率もまた、フローサイトメトリーにより血小板に結合する蛍光−レクチンドメインの結合の阻害により、観察する。
【０１６１】
室温の、冷却したおよび冷却し修飾した血小板の回復および循環時間を、冷却したマウス血小板へのガラクトース輸送が血小板のより長い循環をもたらすことを確立するために比較する。室温の、冷却したおよび冷却し修飾した血小板をＣＭＦＤＡで染色し、上記のとおり１０８個の血小板を野生型のマウスに輸血した。マウスを輸血後すぐに（＜２分）、３０分、１時間、２、２４、４８および７２時間後に出血させる。得た血液を、フローサイトメトリーを用いて分析する。注射直後に測定した、ゲートした血小板集団内の蛍光標識血小板の比率を、１００％と設定する。様々な時点で得た蛍光標識血小板の回復を、適宜計算する。
【０１６２】
例５
この例は、冷却した未修飾血小板および冷却しガラクトシル化した(修飾）血小板は、in vitroおよびin vivoにおいて止血機能を有することを実証する。冷却した血小板は、アゴニスト刺激血小板という意味で「活性化」されない。低体温条件下で手術を受ける患者は、血小板減少症を発現するか、または深刻な止血の術後障害を示すかもしれない。これらの低温条件下で、血小板は、自身の機能性を失うかもしれないと信じられている。しかしながら、患者が低温手術を受けるとき、全生物は、低体温症へ暴露され、したがって多くの組織における変化を引き起こす。非冷却の血小板の肝類洞内皮細胞への付着は、低温保存障害の主要な機構である（Takeda, et al. Transplantation 27, 820-828, 1999）。したがって、手術のまたは低温保存した器官の移植の低温条件下での有害な結果へと至らしめるのは、低温肝内皮および血小板の相互作用であって、血小板の冷却自体ではないようである（Upadhya et al, Transplantation 73, 1764-1770, 2002）。２つのアプローチが、冷却した血小板が止血機能を有することを示した。１つのアプローチにおいて、αＭβ２欠損マウスにおける冷却した血小板の循環は、冷やした後の血小板機能の研究を簡易化する。他のアプローチにおいて、修飾し冷却したおよび（おそらく）循環している血小板の機能を試験した。
【０１６３】
ヒトおよびマウスの未修飾のおよび修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を、アゴニストに対するin vitro凝集、Ｐ−セレクチン暴露およびフィブリノゲン結合を含む、機能性について試験した。
【０１６４】
αＭβ２欠損またはＷＴマウスに、マウスの冷却した／ＲＴの、修飾したまたはされていない血小板を輸血し、３０分間、２および２４時間循環させた。我々は、冷却した血小板は、尾静脈出血が原因の凝固反応に寄与するか、およびこれらの血小板は、活性化後、フィブリノゲンなどの剤を結合させるかを決定する。また、冷却した、修飾したまたはされていない血小板は、我々が開発したin vivo血栓形成モデルである、塩化第二鉄で損傷したおよび体外に出た(exteriorized)マウスの腸間膜において、どのように凝固に寄与するかを決定する。本方法は、損傷した血管に付着した血小板の数を検出し、糖タンパク質Ｖまたはβ３−インテグリン機能を欠如する血小板の低下した血小板血管壁の相互作用を立証した（Ni et al., Blood 98, 368-373 2001; Andre, et al. Nat Med 8, 247-252, 2002）。最後に、修飾血小板の貯蔵パラメータを決定する。
【０１６５】
In vitro血小板機能を、トロンビンおよびＡＤＰによる凝集、ならびにボトロセチンが誘発するマウス血小板へのｖＷｆ結合を用いて比較しする。マウスおよびヒトの冷却した血小板修飾（ガラクトシル化した）または未修飾血小板を、０．３×１０９個／ｍｍ３の血小板濃度に標準化し、凝集を、標準の手順に従って、様々なアゴニストを用いて誘発した（Bergmeier, et al. 2001 276, 25121-25126, 2001）。ｖＷｆ結合を研究するために、ボトロセチンを用いてマウスｖＷｆを活性化し、ＰＲＰにおいて冷却し修飾したまたはされていない血小板への蛍光標識ｖＷｆの結合を分析する（Bergmeier, et al. 2001 276, 25121-25126, 2001）。血小板の脱顆粒が、修飾中に生じるかどうかを評価するために、フローサイトメトリーにより蛍光標識抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて冷却したマウスおよびヒトの、修飾したまたはされていない血小板のＰ−セレクチン暴露もまた測定する（Michelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93,11877-11882, 1996）。
【０１６６】
１０９個のＣＭＦＤＡ標識血小板をマウスに輸血し、最初にこれらの血小板が、in vitroで機能的であることを確認する。冷却した血小板は、冷却したまたは室温のＣＭＦＤＡ標識血小板をαＭβ２欠損マウスに輸血することにより凝集に寄与するかどうかを決定する。血小板の注入後３０分、２時間および２４時間目に、標準の尾静脈出血試験を行なう（Denis, et al. Proc Natl Acad Sci USA 95, 9524-9529, 1998）。生じる血液を１％のホルムアルデヒドですぐに固定し、血小板凝集を全血フローサイトメトリーにより決定する。血小板凝集体は、ドットプロット分析においてより大きなサイズの粒子として現れる。輸血した血小板が正常な循環において凝集しないことを確認するために、マウスを眼窩後方の眼の叢を通して抗凝血剤内へも出血させる。血小板は、これらの出血条件下では凝集体を形成しない。生じる血液をすぐに固定し、上記のように血小板を全血においてフローサイトメトリーにより分析する。
【０１６７】
血小板を、フィコエリスリン接合αＩＩｂβ３特異的モノクローナル抗体の結合を通して確認する。血液サンプル中の注入した血小板を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光により確認する。非注入の血小板を、それらのＣＭＦＤＡ蛍光の欠如により確認する（Michelson, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 93,11877-11882, 1996）。同じ一連の試験を、ＣＭＦＤＡ修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を用いて、これらの血小板をαＭβ２およびＷＴへ輸血することにより行う。本実験は、流血において冷却し修飾したまたはされていない血小板の凝集を試験する。
【０１６８】
１０９個のCM-Orange標識した未修飾の冷却したまたは室温の血小板を、αＭβ２欠損マウスに輸血し、これらの血小板が、in vitroで機能的であることを確認する。CM-orange標識血小板の注入後３０分、２時間および２４時間目に、既述のようにＰＲＰを単離し、フローサイトメトリーにより分析する。Ｐ−セレクチン暴露を、抗ＦＩＴＣ結合抗Ｐ−セレクチン抗体を用いて測定する（Berger, et al, Blood 92, 4446-4452, 1998）。非注入の血小板を、それらのCM-orange蛍光の欠如により確認する。血液サンプルにおける注入した血小板を、それらのCM-orange蛍光により確認する。CM-orangeおよびＰ−セレクチン陽性血小板は、二重に陽性の蛍光（CM-Orange／ＦＩＴＣ）染色した血小板として現れる。
【０１６９】
冷却した血小板はまだ、トロンビンの活性化後Ｐ−セレクチンを暴露することを確認するために、ＰＲＰをトロンビンの添加（１Ｕ／ｍｌ、２分間３７℃で）を通して活性化し、Ｐ−セレクチン暴露を既述のように測定する。フィブリノゲンのαＩＩｂβ３への結合を分析するために、単離した血小板をトロンビンの添加（１Ｕ／ｍｌ、２分間３７℃で）を通して活性化し、Oregon-green結合フィブリノゲン（２０μｇ／ｍｌ）を２０分間３７℃で添加する（Heilmann, et al, Cytometry 17, 287-293, 1994）。サンプルを、フローサイトメトリーによりすぐに分析する。ＰＲＰサンプルにおける注入した血小板を、それらのCM-orange蛍光により確認する。CM-orangeおよびOregon-green陽性血小板は、二重に陽性の蛍光染色した（CM-orange／Oregon green）血小板として現れる。同じ一連の実験を、αＭβ２欠損およびＷＴマウスに輸血したCM-orange標識した修飾し（ガラクトシル化し）冷却した血小板を用いて行なう。
【０１７０】
例６
In Vivo血栓症モデル
最初に、二重蛍光標識血小板を用いて、αＭβ２欠損マウスの損傷した内皮へのＲＴおよび未修飾の冷却した血小板の到達を示す。休止している血管を４分間観察し、その後塩化第二鉄（３０μｌの２５０ｍＭ溶液）（Sigma, St Louis, MO）を灌流により細動脈の上部に適用し、ビデオ記録をさらに１０分間再開する。中心線(centerline)赤血球速度（Ｖｒｂｃ）を、撮影前および塩化第二鉄損傷の１０分後に測定する。剪断率を、ニュートン流体についてのポアゾイユの法則（Poiseuille's law)に基づいて計算する（Denis, et al, Proc Natl Acad Sci USA 95, 9524-9529, 1998）。これらの実験は、冷却した血小板が、正常な止血機能を有しているかを示す。ＲＴおよびガラクトシル化し冷却した血小板に対し、２つの異なる蛍光標識血小板の集団を用いて、同じマウスに注入し、ＷＴマウスにおいてこれらの実験を繰り返し、両方の血小板の集団の血栓形成および取り込みを分析する。
【０１７１】
そして、上記のように冷蔵で１、５、７および１４日間貯蔵し冷却したおよび修飾し冷却したマウス血小板の、in vitroの血小板機能および生存ならびにin vivoの止血作用を比較する。これらの貯蔵し冷却したおよび修飾し冷却した血小板の回復および循環時間を比較し、１）冷却したマウス血小板へのガラクトース輸送を通した修飾は、長期間冷蔵後安定している；および２）これらの血小板が正常に機能する、ことを証明する。生存実験を、上記のように行なう。ＷＧＡ結合を使用して、ＧｌｃＮＡｃ残基が、より長い貯蔵時点の後、ガラクトースにより被覆されたままであることを確認する。
【０１７２】
これらの修飾し貯蔵した血小板が機能的に無傷で止血に寄与することの究極的な試験として、これらを全身照射されたマウスに輸血する（Hoyer, et al, Oncology 49, 166-172, 1992）。十分な数の血小板を得るために、マウスに市販のマウストロンボポエチンを７日間注射し、それらの血小板数を増加させる（Lok, et al. Nature 369, 565-558, 1994）。単離された血小板を、最適化したガラクトース輸送手順を用いて修飾し、冷蔵貯蔵し、輸血し、および尾静脈出血時間を測定した。未修飾の冷却した血小板は、循環内で生き残らないため、修飾し冷やした血小板と室温の貯蔵した血小板との比較は、この時点では必要ない。マウス血小板を、標準の試験管内で冷蔵貯蔵する。室温貯蔵したマウス血小板との比較が必要な場合、霊長類の血小板に切り替える。マウス血小板に適応させるための、技術的に特別な、小型化された、ガス透過性貯蔵容器よりも、かかる比較は、室温の貯蔵バッグが専用に設計された霊長類（ヒトを含む）の方がより適切である。
【０１７３】
例７
血小板製剤中の血小板のガラクトシル化
４種類の異なる血小板製剤を、ＵＤＰガラクトースの濃度を増加して処置した：４００μＭ、６００μＭ、および８００μＭ。ＲＣＡ結合比率の測定値は、４つの試験したサンプルにおいて、ガラクトシル化の用量依存的増加を示す（図１６）。本結果は、ガラクトシル化は、血小板製剤において可能であるという証拠を提供する。
【０１７４】
前述は、単に特定の好ましい態様の詳細な説明であると理解されるべきである。したがって、当業者には、様々な改良および同等物が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく可能であることが明らかである。添付の請求項の範囲内のすべてのかかる改良を包含することを意図する。
【０１７５】
本出願中列挙したすべての参考文献、特許および特許公開公報は、全体的に参考のために本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１Ａ】室温の血小板、ならびにＥＧＴＡ−ＡＭおよびサイトカラシンＢの存在下または非存在下で、冷却し再加温した血小板のマウスにおける循環時間を示す図である。
【図１Ｂ】In vitroで正常に凝集する冷却した血小板を示す図である。
【図１Ｃ】低温誘発クリアランスが主にマウスの肝臓内で生じることを示す図である。
【図１Ｄ】冷却した血小板は、肝類洞マクロファージ（クッパー細胞）と共局在することを示す図である。
【図２】冷却した血小板は、ＣＲ３欠損マウス内で正常に循環するが、補体３（Ｃ３）またはｖＷｆ欠損マウス内で循環しないことを示す図である。
【０１７７】
【図３Ａ】冷却し再加温したＴＲＩＴＣ標識血小板（左のパネル）が、室温のＣＭＦＤＡ標識血小板（右のパネル）よりも、３〜４倍の高い頻度で肝類洞に付着することを示す図である。
【図３Ｂ】冷却し再加温した血小板（Ｃｏｌｄ、中抜きの棒）および室温の血小板（ＲＴ、中塗りの棒）は、野生型のマウスと類似した分布で高マクロファージ密度（中間帯）の類洞部位に付着することを示す図である。
【図３Ｃ】冷却し再加温した血小板は、野生型の肝臓内のマクロファージに、室温の血小板よりも３〜４倍多く付着する（中抜きの棒）ことを示す図である。
【０１７８】
【図４Ａ】室温で保持した（左のパネル）、または冷却し再加温した（右のパネル）、同系の野生型のマウスに注入した、ＧＰＩｂα細胞外ドメインを酵素的に除去したＣＭＦＤＡ標識血小板（左のパネル、挿入図、中塗りの範囲）または対照の血小板の生存率を示す図である。
【図４Ｂ】ＦＩＴＣ標識抗ｖＷｆ抗体を用いて検出したｖＷｆ結合を示す図である。
【図４Ｃ】ｖＷｆ受容体は、冷却したマウス血小板の表面上で線形配列（ＲＴ）から凝集体（Ｃｈｉｌｌｅｄ）へ再分布することを示す図である。
【０１７９】
【図５Ａ】室温（ＲＴ）の血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞の典型的なアッセイ結果を示す図である。
【図５Ｂ】冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板と共にインキュベートしたＴＨＰ−１細胞の典型的なアッセイ結果を示す図である。
【図５Ｃ】未分化（中抜きの棒）ＴＨＰ−１細胞はＣＲ３を約５０％少なく発現させ、冷却し再加温した血小板の半分程度を摂取することを示す図である。
【０１８０】
【図６Ａ】末梢血を全血フローサイトメトリーで分析した、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｂ】流血を全血フローサイトメトリーで分析した、野生型のマウスに輸血した、室温の（ＲＴ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｃ】末梢血を全血フローサイトメトリーで分析した、ＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｄ】流血を全血フローサイトメトリーで分析した、ＣＲ−３欠損マウスに輸血した、冷却した（Ｃｏｌｄ）血小板の正常なin vivo機能を示す図である。
【図６Ｅ】野生型のマウスに輸血した、CM-Orangeの、室温の（ＲＴ）血小板およびＣＲ３欠損マウスに輸血した、CM-Orangeの、冷却し再加温した（Ｃｏｌｄ）血小板のex vivo機能を示す図である。
【図７】２種類の血小板クリアランス経路を描写する図である。
【図８Ａ】冷却した血小板の食作用への単糖類（グルコースおよびガラクトース）の効果を示す図である。
【図８Ｂ】冷却した血小板の食作用への単糖類（α−グルコシドおよびβ−グルコシド）の効果を示す図である。
【図８Ｃ】冷却した血小板の食作用への単糖類（α−マンノシドおよびβ−マンノシド）の効果を示す図である。
【図８Ｄ】冷却した血小板の食作用への単糖類（ＧｌｃＮＡｃおよびβ−ＧｌｃＮＡｃ）の効果を示す図である。
【図９Ａ】室温（ＲＴ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｂ】冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のＦＩＴＣ−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｃ】冷却したまたは室温の血小板に結合するＦＩＴＣ−ＷＧＡ蛍光の分析を示す図である。
【図９Ｄ】室温（ＲＴ）ヒト血小板のスクシニル−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｅ】冷却した（Ｃｏｌｄ）ヒト血小板のスクシニル−ＷＧＡとのインキュベーション後のドットプロットを示す図である。
【図９Ｆ】冷却したまたは室温の血小板に結合するスクシニル−ＷＧＡ蛍光の分析を示す図である。
【０１８１】
【図１０】室温のまたは冷却した血小板へ結合した様々なＦＩＴＣ標識レクチンの分析を示す図である。
【図１１Ａ】β−ヘキソサミニダーゼ処置の前および後にフローサイトメトリーにより得られた室温のまたは冷却した血小板の表面へのＦＩＴＣ−ＷＧＡの結合の概要を示す図である。
【図１１Ｂ】血小板表面からのＧＰＩｂαの除去が冷却した血小板に結合したＦＩＴＣ−ＷＧＡを減少させたことを示す図である。
【図１２】血小板オリゴ糖へのガラクトース輸送が、冷却した血小板（Ｃｏｌｄ）の食作用を減少させるが、室温の血小板（ＲＴ）の食作用には影響しないことを示す図である。
【図１３】未処理の血小板に対する、冷却しガラクトシル化したマウス血小板の生存率を示す図である。
【０１８２】
【図１４Ａ】自身の表面にガラクトーストランスフェラーゼを含有する血小板は、ＷＧＡ結合により判断されたように、トランスフェラーゼの添加なしでガラクトースを輸送することを示す図である。
【図１４Ｂ】ヒト血小板についてのin vitro食作用の結果を示す図である。
【図１４Ｃ】マウス血小板の生存率におけるガラクトーストランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）ありまたはなしでのＵＤＰ−ガラクトースを示す図である。
【図１５】ヒト血小板への１４Ｃ標識ＵＤＰ−ガラクトースの取り込みの経時変化を示す図である。
【図１６】ＵＤＰ−ガラクトースの異なる濃度での４種類の血小板濃度サンプル中の血小板のガラクトシル化を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板の集団の循環時間を増加させる方法であって、単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
グリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
循環時間は少なくとも約１０％増加する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
血小板の貯蔵時間を増加させる方法であって、
単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤の量と接触させること、
および前記血小板の集団を貯蔵すること
を含む前記方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
血小板表面上のグリカンへのグリカン修飾剤の添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
血小板を少なくとも約３日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
血小板を少なくとも約５日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
血小板を少なくとも約７日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
血小板を少なくとも約１０日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
血小板を少なくとも約１４日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
血小板を少なくとも約２１日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
血小板を少なくとも約２８日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
血小板表面上に複数の修飾グリカン分子を含む、修飾血小板。
【請求項２８】
修飾グリカン分子は、ＧＰＩｂα分子の部分である、請求項２７に記載の修飾血小板。
【請求項２９】
修飾グリカン分子は、少なくとも１種の添加した糖分子を含む、請求項２７に記載の修飾血小板。
【請求項３０】
添加した糖は、天然の糖である、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３１】
添加した糖は、非天然の糖である、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３２】
添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３３】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項３２に記載の修飾血小板。
【請求項３５】
請求項２７〜３４のいずれかに記載の複数の修飾血小板を含む、血小板組成物。
【請求項３６】
貯蔵培地をさらに含む、請求項３５に記載の血小板組成物。
【請求項３７】
薬学的に許容しうる担体をさらに含む、請求項３５に記載の血小板組成物。
【請求項３８】
哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法であって、
（ａ）薬学的に許容しうる担体中に含有された血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させ、処置した血小板製剤を形成するステップ、
（ｂ）処置した血小板製剤を貯蔵するステップ、および
（ｃ）処置した血小板製剤を加温するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３９】
処置した血小板製剤を加温するステップは、血小板を３７℃に加温することにより行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
血小板の集団を接触させるステップは、グリカン部分の修飾を触媒する酵素の存在下で、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血小板製剤中の酵素を除去または不活性化することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
酵素を除去または不活性化するステップは、血小板製剤を洗浄することにより行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
グリカン修飾剤のグリカン部分への添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
血小板の集団は、維持された止血作用を有する、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
血小板製剤を約１５℃未満の温度で貯蔵する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
血小板製剤を室温で貯蔵する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳動物へ、請求項２７〜３４のいずれかに記載の複数の血小板、または請求項３５〜３７のいずれかに記載の血小板組成物を投与することを含む、哺乳動物において止血を調節する方法。
【請求項５３】
貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む、血小板を保存するための貯蔵組成物。
【請求項５４】
グリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物を約１５℃未満の温度で貯蔵する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
組成物を室温で貯蔵する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５７】
請求項５３または５４に記載の貯蔵組成物を含む、血小板を収集するための容器。
【請求項５８】
複数の血小板をさらに含む、請求項５２に記載の容器。
【請求項５９】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、自然発生の血小板に存在しない濃度で存在する、請求項５８に記載の容器。
【請求項６０】
血小板を収集および加工するための装置であって、
血小板を収集するための容器；
前記容器との液体伝達における少なくとも１つのサテライト容器；および
サテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤
を含む、前記装置。
【請求項６１】
サテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤は、容器中の血小板を保存するのに十分な量で存在する、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
サテライト容器は、破壊可能なシールにより容器に連結されている、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
バッグはさらに複数の血小板を含有する血漿を含む、請求項６０に記載の装置。
【請求項１】
血小板の集団の循環時間を増加させる方法であって、単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
グリカン部分の修飾を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグ内で行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
循環時間は少なくとも約１０％増加する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
血小板の貯蔵時間を増加させる方法であって、
単離された血小板の集団を、前記血小板の集団のクリアランスを減少させるのに効果的な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤の量と接触させること、
および前記血小板の集団を貯蔵すること
を含む前記方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
血小板表面上のグリカンへのグリカン修飾剤の添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させる前、接触させるのと同時にまたは接触させた後に、血小板の集団を冷却することをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
血小板の集団は、実質的に正常な止血作用を保持する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
血小板を少なくとも約３日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
血小板を少なくとも約５日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
血小板を少なくとも約７日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
血小板を少なくとも約１０日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
血小板を少なくとも約１４日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
血小板を少なくとも約２１日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
血小板を少なくとも約２８日間冷却貯蔵する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
血小板表面上に複数の修飾グリカン分子を含む、修飾血小板。
【請求項２８】
修飾グリカン分子は、ＧＰＩｂα分子の部分である、請求項２７に記載の修飾血小板。
【請求項２９】
修飾グリカン分子は、少なくとも１種の添加した糖分子を含む、請求項２７に記載の修飾血小板。
【請求項３０】
添加した糖は、天然の糖である、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３１】
添加した糖は、非天然の糖である、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３２】
添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項２９に記載の修飾血小板。
【請求項３３】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
添加した糖は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項３２に記載の修飾血小板。
【請求項３５】
請求項２７〜３４のいずれかに記載の複数の修飾血小板を含む、血小板組成物。
【請求項３６】
貯蔵培地をさらに含む、請求項３５に記載の血小板組成物。
【請求項３７】
薬学的に許容しうる担体をさらに含む、請求項３５に記載の血小板組成物。
【請求項３８】
哺乳動物への投与のための医薬組成物を作るための方法であって、
（ａ）薬学的に許容しうる担体中に含有された血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させ、処置した血小板製剤を形成するステップ、
（ｂ）処置した血小板製剤を貯蔵するステップ、および
（ｃ）処置した血小板製剤を加温するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３９】
処置した血小板製剤を加温するステップは、血小板を３７℃に加温することにより行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
血小板の集団を接触させるステップは、グリカン部分の修飾を触媒する酵素の存在下で、血小板を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血小板製剤中の酵素を除去または不活性化することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
酵素を除去または不活性化するステップは、血小板製剤を洗浄することにより行なわれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースおよびＵＤＰ−ガラクトース前駆体からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ＵＤＰ−ガラクトース前駆体をＵＤＰ−ガラクトースに変換する酵素をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、ＵＤＰ−ガラクトースである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
グリカン修飾剤のグリカン部分への添加を触媒する酵素を添加することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
グリカン修飾剤はＵＤＰ−ガラクトースであり、酵素はガラクトシルトランスフェラーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
血小板の集団は、維持された止血作用を有する、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
血小板の集団を少なくとも１種のグリカン修飾剤と接触させるステップは、血小板用バッグまたは容器内で行われる、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
血小板製剤を約１５℃未満の温度で貯蔵する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
血小板製剤を室温で貯蔵する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳動物へ、請求項２７〜３４のいずれかに記載の複数の血小板、または請求項３５〜３７のいずれかに記載の血小板組成物を投与することを含む、哺乳動物において止血を調節する方法。
【請求項５３】
貯蔵組成物に添加した血小板のグリカンを修飾するのに十分な量の少なくとも１種のグリカン修飾剤を含む、血小板を保存するための貯蔵組成物。
【請求項５４】
グリカン部分の修飾を触媒する酵素をさらに含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
組成物を約１５℃未満の温度で貯蔵する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
組成物を室温で貯蔵する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５７】
請求項５３または５４に記載の貯蔵組成物を含む、血小板を収集するための容器。
【請求項５８】
複数の血小板をさらに含む、請求項５２に記載の容器。
【請求項５９】
少なくとも１種のグリカン修飾剤は、自然発生の血小板に存在しない濃度で存在する、請求項５８に記載の容器。
【請求項６０】
血小板を収集および加工するための装置であって、
血小板を収集するための容器；
前記容器との液体伝達における少なくとも１つのサテライト容器；および
サテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤
を含む、前記装置。
【請求項６１】
サテライト容器中の少なくとも１種のグリカン修飾剤は、容器中の血小板を保存するのに十分な量で存在する、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
サテライト容器は、破壊可能なシールにより容器に連結されている、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
バッグはさらに複数の血小板を含有する血漿を含む、請求項６０に記載の装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００６−５１５２７９（Ｐ２００６−５１５２７９Ａ）
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５１９１９（Ｐ２００４−５５１９１９）
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３３８１
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０２１４３５０４）ザ ブライアム アンド ウィミンズ ホスピタル インコーポレーテッド (2)
【出願人】（５００００４９９９）ザイムクエスト，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３３８１
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０２１４３５０４）ザ ブライアム アンド ウィミンズ ホスピタル インコーポレーテッド (2)
【出願人】（５００００４９９９）ザイムクエスト，インク． (1)
【Ｆターム（参考）】
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