血栓症発症予防用および治療用物質
【課題】ｔ−ＰＡと結合しうる血栓症予防用および血栓症治療用の物質の提供。
【解決手段】ヒトの血管内皮細胞のミトコンドリアでＡＴＰとＡＤＰを輸送するアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）がｔ−ＰＡと特異的に結合する能力を有し、ｔ−ＰＡの活性が増強する。ここで、ＡＮＴ−１のｃＤＮＡをクローニングし、ＡＮＴ−１の発現ベクターを構築して遺伝子組換えＡＮＴ−１を発現させた。したがって本発明は、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた血管内皮細胞ではｔ−ＰＡの活性が増強する新規なｔ−ＰＡ結合物質である。
【解決手段】ヒトの血管内皮細胞のミトコンドリアでＡＴＰとＡＤＰを輸送するアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）がｔ−ＰＡと特異的に結合する能力を有し、ｔ−ＰＡの活性が増強する。ここで、ＡＮＴ−１のｃＤＮＡをクローニングし、ＡＮＴ−１の発現ベクターを構築して遺伝子組換えＡＮＴ−１を発現させた。したがって本発明は、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた血管内皮細胞ではｔ−ＰＡの活性が増強する新規なｔ−ＰＡ結合物質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血栓症の予防や治療に用いることのできるｔ−ＰＡの特異的結合物質のアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の血管内での血液凝固によって引き起こされる血栓症は、脳梗塞、心筋梗塞などの重篤な疾患を引き起こす。これらの疾患に対しては、線溶系因子である血栓溶解剤が用いられている。血栓溶解剤は血栓の主要成分であるフィブリンを分解するが、循環血液中に投与されると循環血液によって希釈され、また代謝されるため充分な血栓溶解効果が得られない。また血液中では時間とともに分解されて血栓溶解効果が持続しない。また脳梗塞や心筋梗塞などの血栓症の予防には抗血小板薬、抗凝固薬といった血液作用薬が用いられている。
【０００３】
血栓溶解療法においては、血栓溶解剤の効果を持続させるとともに、血栓部位への血栓溶解剤の集積が必要とされる。また、抗血小板薬や抗凝固薬は血栓形成の予防には有効であるが、血栓形成が明らかな患者に対しては血栓溶解効果がなく、新たな血栓症予防用物質および血栓症治療用物質が必要とされる。
【０００４】
従来の血栓溶解剤は、血液中のプラスミノーゲンをプラスミンに変換するプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）である。ＰＡによって生成されたプラスミンがフィブリンを分解することによりフィブリン血栓が溶解され、血流が再開する。血栓溶解剤として、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）、組織性プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、プロウロキナーゼといった、ＰＡそのものの遺伝子組換え体が用いられていた。
【０００５】
腫瘍細胞などの表面にはｕ−ＰＡに対する特異的な結合物質（ｕ−ＰＡレセプター）が存在し、ｕ−ＰＡを細胞の表面に集積させて細胞表面局所における線溶活性を強めることが知られている。ｕ−ＰＡレセプターに結合したｕ−ＰＡはＰＡの阻害因子であるタイプ１−プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）の阻害を受けにくく、線溶活性を長期間維持することができる。そこで、実際の血管内で、血管内皮細胞から特異的に分泌されるｔ−ＰＡに対する結合物質の開発が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ｔ−ＰＡと結合しうる血栓症予防用および血栓症治療用の物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトの血管内皮細胞のミトコンドリアでＡＴＰとＡＤＰを輸送するアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）がｔ−ＰＡと特異的に結合する能力を有し、さらにＡＮＴ−１によってｔ−ＰＡの活性が増強することを見出し、本発明を完成させた。すなわちＡＮＴ−１のｃＤＮＡをクローニングし、ＡＮＴ−１の発現ベクターを構築して遺伝子組換えＡＮＴ−１を発現させた。このようにして得られたＡＮＴ−１はｔ−ＰＡと特異的に結合した。さらに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた血管内皮細胞ではｔ−ＰＡの活性が増強した。したがって本発明は次のとおりである。ＡＮＴ−１、血栓症の発症予防および治療に用いることのできる新規なｔ−ＰＡ結合物質。
【発明の効果】
【０００８】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば血栓溶解剤であるｔ−ＰＡと結合し、その活性発現を増強させ、血栓症の予防や治療に供することのできるｔ−ＰＡ結合物質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のｔ−ＰＡ結合物質はＡＮＴ−１である。ｔ−ＰＡ結合物質としては、従来からアネキシンＡ２（Ｈａｊｊａｒ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：２１１９１−２１１９７，１９９４年）、α−エノラーゼ（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６３：２０４８−２０５７，１９９４年）、サイトケラチン−８（Ｈｅｍｂｒｏｕｇｈ ＴＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：２５６８４−２５６９１，１９９６年）、チューブリン（Ｂｅｅｂｅ ＤＰ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ，５９：３３９−３５０，１９９０年）、細胞骨格関連タンパク質４（Ｒａｚｚａｑ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４２６７９−４２６８５，２００３年）、フィブロネクチン（Ｓａｌｏｎｅｎ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：１２３０２−１２３０７，１９８５年）およびラミニン（Ｓａｌｏｎｅｎ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １７２：２９−３２，１９８４年）が知られているが、ＡＮＴ−１はこれら従来発表された物質とは分子量もアミノ酸配列も全く異なるタンパク質である。
【０００９】
ＡＮＴ−１はミトコンドリアの内膜に存在しており、従来からミトコンドリア内のマトリックスで生成されたＡＴＰをミトコンドリア外（細胞質）に輸送し、代わってミトコンドリア外のＡＤＰをミトコンドリア内に輸送するタンパク質として知られていた。しかし、ＡＮＴ−１とｔ−ＰＡとの反応様式、特にＡＮＴ−１がｔ−ＰＡと結合することは知られていない。
【００１０】
ＡＮＴ−１は２９７個のアミノ酸から構成される分子量が約３万のタンパク質である（Ｃｏｚｅｎｓ ＡＬ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：２６１−２８０，１９８９年、Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｍ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．４５６：２７９−８８，１９８５年）。
【実施例】
【００１１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。ヒトの血管内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーからＡＮＴ−１をコードする遺伝子をフォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＴ−３’とリバースプライマーの５’−ＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＧＧ−３’を用いてＰＣＲ法で調整した。このＰＣＲ産物を市販のｐＧＥＸ−６Ｐ−１に組込んでｐＧＥＸ６Ｐ／ＡＮＴ−１ベクターを作成し、このベクターを大腸菌ＢＬ２１に組込んで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＡＮＴ−１との融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質を酵素処理することによりＡＮＴ−１を分離し、精製した。
【００１２】
精製したＡＮＴ−１が抗ＡＮＴ−１抗体と反応することをウエスタンブロット法にて確認した。
【００１３】
〔１〕リガンドブロット法によるＡＮＴ−１とｔ−ＰＡとの結合実験
精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質およびＡＮＴ−１を１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜を３％のウシ血清アルブミンを含む１０ｎＭのｔ−ＰＡ溶液で２時間反応させた。次にニトロセルロース膜を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏ，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した後、抗ｔ−ＰＡポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）とビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）およびＤＡＢ−Ｎｉ（ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でニトロセルロース膜上のｔ−ＰＡを検出した。図１はリガンドブロットの結果を示すものである。図１において各レーンは以下の場合を示す。
レーン１：精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質を電気泳動した場合。
レーン２：精製したＡＮＴ−１を電気泳動した場合。
図１に示すように、ＡＮＴ−１とＧＳＴとの融合タンパク質の分子量である約６万付近およびＡＮＴ−１の分子量である約３万付近にそれぞれバンドが確認され、ＡＮＴ−１にｔ−ＰＡが結合することが確認された。
【００１４】
〔２〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の作成
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させるために、ｐＧＥＸ６Ｐ／ＡＮＴ−１ベクターからＡｐａＩ／ＳａｌＩフラグメントを調整し、市販のｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に組込んでＡＮＴ−１発現プラスミドを構築した。このＡＮＴ−１発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で培養血管内皮細胞にトランスフェクションした。コントロールとしてｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみを培養血管内皮細胞にトランスフェクションした。
【００１５】
ＡＮＴ−１の培養血管内皮細胞での発現をウエスタンブロット法にて確認した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を細胞溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５％ＮＰ−４０，ｐＨ７．４）で溶解し、１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。その上清を１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜を５％のスキムミルクで処理した後、ニトロセルロース膜上のＡＮＴ−１を抗ヒトＡＮＴ−１モノクロナール抗体とＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を用いたウエスタンブロット法で検出した。
【００１６】
図２Ａはウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａにおいて各レーンは以下の場合を示す。
レーン１：ｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみをトランスフェクションしたコントロール培養血管内皮細胞の細胞溶解液を電気泳動した場合。
レーン２：ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞溶解液を電気泳動した場合。
図２Ａに示すようにＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞溶解液中には抗ヒトＡＮＴ−１モノクロナール抗体に反応し、ＡＮＴ−１の抗原性を有するバンドが認められ、ＡＮＴ−１が培養血管内皮細胞で発現していることを確認した。
【００１７】
ＡＮＴ−１の細胞表面での発現を蛍光顕微鏡で観察した。ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を２４ウエルプレートで培養した後、２％のフォルムアルデヒドで固定し、抗ヒトＡＮＴ−１ポリクロナール抗体でインキュベーションした。次にＨＲＰで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させて、ＡＮＴ−１抗原の所在を蛍光発色システム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＴＳＡ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＳ，ＵＳＡ）と共焦点レーザー顕微鏡（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ５１０）で観察した。
【００１８】
図２Ｂは共焦点レーザー顕微鏡像（写真）である。図２Ｂにおいて各写真は以下の場合を示す。
写真１：ｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみをトランスフェクションしたコントロール培養血管内皮細胞の共焦点レーザー顕微鏡像を写真撮影した場合。
写真２：ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の共焦点レーザー顕微鏡像を写真撮影した場合。
図２Ｂに示すように、ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞表面にはＡＮＴ−１抗原に起因する蛍光が観察され、培養血管内皮細胞の表面にＡＮＴ−１が発現していることが確認された。
【００１９】
〔３〕固相化したｔ−ＰＡと、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合実験
結合実験にはＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いた。バイオセンサー表面にｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅをコートしたｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅキュベットに４００ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）と１００ｍＭ，Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を加えて、センサー表面のカルボキシル基を活性化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を排出後、キュベットをＰＢＳで洗浄し、２００ｍｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを測定キュベットに加えてｔ−ＰＡのアミノ基とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｍｉｄｅを導入した活性基を共有結合させた。その後、測定キュベットのセンサー表面を１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｏｎｅ（ｐＨ８．５）でブロックし、０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で処理することにより、固相化されていないｔ−ＰＡを除去した。ｔ−ＰＡを固相化した測定キュベットに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞、またはコントロールの培養血管内皮細胞を３７５０固（１．５×１０５細胞／ｍｌを２５μｌ）加えた。
【００２０】
図３Ａはコントロールの培養血管内皮細胞、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとの結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムで測定したものである。ＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムは細胞とｔ−ＰＡとの結合を検知する市販の特殊な装置である。ｔ−ＰＡとの結合の強さは縦軸の共鳴度（ａｒｃ ｓｅｃｏｎｄｓ）で表され、この値が大きいほど、結合度は高い。図３Ａに示すように、固相化したｔ−ＰＡに対するコントロール培養血管内皮細胞の結合能よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の結合能の方が強かった。
【００２１】
〔４〕酵素活性部位をブロックしたｔ−ＰＡと、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合実験
結合実験にはＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いた。測定キュベットのバイオセンサー表面にｔ−ＰＡを固相化した後、ｔ−ＰＡの酵素活性部位をセリンプロテアーゼ阻害剤であるＤｉｉｓｏｐｒｏｐｈｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＦＰ）で処理した。ＤＦＰで処理したｔ−ＰＡを固相化した測定キュベット、またはＤＦＰで処理していないｔ−ＰＡを固相化した測定キュベットに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を３７５０固（１．５×１０５細胞／ｍｌを２５μｌ）加えた。
【００２２】
図３ＢはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とＤＦＰで処理したｔ−ＰＡ、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とＤＦＰで処理していないｔ−ＰＡとの結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で測定したものである。ｔ−ＰＡとの結合程度は縦軸の共鳴度（ａｒｃ ｓｅｃｏｎｄｓ）で表され、この値が大きいほど、結合度は高い。図３Ｂに示すように、ｔ−ＰＡのＤＦＰ処理にかかわらず、ｔ−ＰＡとＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合能に有意な差は認められなかった。すなわち、ＡＮＴ−１とｔ−ＰＡの結合はｔ−ＰＡの酵素活性発現部位を介していないことを示す。
【００２３】
〔５〕液相における、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとの結合実験
２４ウエル（穴）プレートのウエル内で、細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞（０．５×１０５個）、またはコントロールの培養血管内皮細胞（０．５×１０５個）とＦＩＴＣで蛍光標識したｔ−ＰＡ（０−２５ｎＭ）を４℃で１０分間反応させた。これらの細胞とｔ−ＰＡとの混合液を２０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞に結合しなかったｔ−ＰＡを上清液中に回収した。その上清液を９６ウエル（穴）プレートに入れ、上清液中の蛍光強度をマルチラベルプレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＳ，ＵＳＡ）で計測し、最初に細胞に加えた蛍光強度と上清中の蛍光強度との差から、細胞に結合したｔ−ＰＡを算出した。なお、モル濃度で５０倍量の非標識ｔ−ＰＡが存在するときの結合量を非特異的結合量とし、全結合量から非特異的結合量を引いたものを特異的結合量とした。
【００２４】
ｔ−ＰＡは細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞と結合し、そのＢｍａｘは０．６１±０．３５×１０５（結合部位／細胞）であった。表１はコントロールの培養血管内皮細胞とＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞におけるＫｄ値を示す。Ｋｄ値はｔ−ＰＡが培養血管内皮細胞に結合する際の親和性を示し、値が小さいほど親和性が高いことを意味する。コントロールに比べ細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞ではＫｄ値が約１／１０に減少し、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させることによりｔ−ＰＡと培養血管内皮細胞細胞との親和性が増大したことを示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
〔６〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性測定
９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡをウエルに加えて４℃、９０分間反応させた。次に、ｔ−ＰＡ溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄後、ｔ−ＰＡに対する発色性合成基質であるＳ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加え、細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を３７℃で測定した。細胞に結合したｔ−ＰＡによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。細胞の存在に対するコントロールとして、細胞非存在下の９６ウエル（穴）プレートのウエルに５０ｎＭのｔ−ＰＡを加えて、同様にｔ−ＰＡの活性測定を行った。
【００２７】
図４Ａはコントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性とＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を比較した結果である。図４Ａにおいて、各記号は以下の場合を示す。
（○−○）：コントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
（●−●）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
（■−■）：６ウエル（穴）プレートのウエルに非特異的に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
【００２８】
図４Ａに示すように、コントロールの培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合のほうが、ｔ−ＰＡ活性は有意に高値を示した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞はｔ−ＰＡ活性を増強させる。
【００２９】
〔７〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能の測定
９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡをウエルに加えて４℃、９０分間反応させた。次に、ｔ−ＰＡ溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄後、１０μｇ／ｍｌのヒトプラスミノーゲン（Ｇｌｕ型）と発色性合成基質Ｓ−２２５１ （Ｈ−Ｄ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加えた。そして細胞に結合したｔ−ＰＡによりプラスミノーゲンから変換されたプラスミンの活性を３７℃で測定した。プラスミンによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。細胞の存在に対するコントロールとして、細胞非存在下の９６ウエル（穴）プレートのウエルに５０ｎＭのｔ−ＰＡを加えて、同様にｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した。
【００３０】
図４Ｂはコントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を比較した結果である。
図４Ｂにおいて、各記号は以下の場合を示す。
（○−○）：コントロールの培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
（●−●）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
（■−■）：６ウエル（穴）プレートのウエルに非特異的に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
【００３１】
図４Ｂに示すように、コントロールの培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合のほうが、プラスミノーゲン活性化能は有意に高値を示した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞はｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンアクチベーター活性を増強させる。
【００３２】
〔８〕ＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強が、細胞表面に発現したＡＮＴ−１と結合したｔ−ＰＡに起因することを確認するために、抗ｔ−ＰＡ抗体の存在下で培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとを反応させた。すなわち、９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡと２μｇ／ｍｌの抗ｔ−ＰＡ抗体をウエルに加えて４℃、９０分間インキュベーションした。次に、ｔ−ＰＡと抗ｔ−ＰＡ抗体の混合溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、１０μｇ／ｍｌのヒトプラスミノーゲン（Ｇｌｕ型）と発色性合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加えた。そして細胞に結合したｔ−ＰＡによりプラスミノーゲンから変換されたプラスミンの活性を３７℃で測定した。プラスミンによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。抗ｔ−ＰＡ抗体に対するコントロールとして非特異的免疫グロブリンを用いた。
【００３３】
図５は、ＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響を示したものである。図５において各記号は以下の場合を示す。
活性を測定した場合。
（ ■ ）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞を用いてプラスミノーゲンアクチベーター活性を測定した場合。
【００３４】
図５に示すように、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性は抗ｔ−ＰＡ抗体の存在下で有意に低下した。しかし、非特異的免疫グロブリンの存在下では有意な変化は認められなかった。一方、ＡＮＴ−１遺伝子を組込んでいないコントロールの培養血管内皮細胞では、抗ｔ−ＰＡ抗体や非特異的免疫グロブリンの存在にかかわらずｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンアクチベーター活性に有意な変化は認められなかった。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強は、細胞表面に発現したＡＮＴ−１に結合したｔ−ＰＡに起因する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質（レーン１）、および精製したＡＮＴ−１（レーン２）とｔ−ＰＡとのリガンドブロットを示す写真である。
【図２】ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の細胞溶解液と抗ｔ−ＰＡ抗体とのウエスタンブロットを示す写真（図２Ａ、レーン２）、および細胞表面でのＡＮＴ−１の発現を蛍光顕微鏡で観察した共焦点レーザー顕微鏡像を示す写真（図２Ｂ、写真２）である。図２Ａのレーン１、および図２Ｂの写真１はコントロールの培養血管内皮細胞を用いた場合である。
【図３】固相化したｔ−ＰＡとＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムで観察したグラフである。図３Ａはコントロールの培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能を比較したグラフである。図３Ｂは、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のＤＦＰ処理したｔ−ＰＡに対する結合能を比較したグラフである。
【図４】ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡの活性（図４Ａ）、およびＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性（図４Ｂ）を示すグラフである。
【図５】細胞表面に発現させたＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は血栓症の予防や治療に用いることのできるｔ−ＰＡの特異的結合物質のアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の血管内での血液凝固によって引き起こされる血栓症は、脳梗塞、心筋梗塞などの重篤な疾患を引き起こす。これらの疾患に対しては、線溶系因子である血栓溶解剤が用いられている。血栓溶解剤は血栓の主要成分であるフィブリンを分解するが、循環血液中に投与されると循環血液によって希釈され、また代謝されるため充分な血栓溶解効果が得られない。また血液中では時間とともに分解されて血栓溶解効果が持続しない。また脳梗塞や心筋梗塞などの血栓症の予防には抗血小板薬、抗凝固薬といった血液作用薬が用いられている。
【０００３】
血栓溶解療法においては、血栓溶解剤の効果を持続させるとともに、血栓部位への血栓溶解剤の集積が必要とされる。また、抗血小板薬や抗凝固薬は血栓形成の予防には有効であるが、血栓形成が明らかな患者に対しては血栓溶解効果がなく、新たな血栓症予防用物質および血栓症治療用物質が必要とされる。
【０００４】
従来の血栓溶解剤は、血液中のプラスミノーゲンをプラスミンに変換するプラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）である。ＰＡによって生成されたプラスミンがフィブリンを分解することによりフィブリン血栓が溶解され、血流が再開する。血栓溶解剤として、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）、組織性プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、プロウロキナーゼといった、ＰＡそのものの遺伝子組換え体が用いられていた。
【０００５】
腫瘍細胞などの表面にはｕ−ＰＡに対する特異的な結合物質（ｕ−ＰＡレセプター）が存在し、ｕ−ＰＡを細胞の表面に集積させて細胞表面局所における線溶活性を強めることが知られている。ｕ−ＰＡレセプターに結合したｕ−ＰＡはＰＡの阻害因子であるタイプ１−プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）の阻害を受けにくく、線溶活性を長期間維持することができる。そこで、実際の血管内で、血管内皮細胞から特異的に分泌されるｔ−ＰＡに対する結合物質の開発が要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ｔ−ＰＡと結合しうる血栓症予防用および血栓症治療用の物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ヒトの血管内皮細胞のミトコンドリアでＡＴＰとＡＤＰを輸送するアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）がｔ−ＰＡと特異的に結合する能力を有し、さらにＡＮＴ−１によってｔ−ＰＡの活性が増強することを見出し、本発明を完成させた。すなわちＡＮＴ−１のｃＤＮＡをクローニングし、ＡＮＴ−１の発現ベクターを構築して遺伝子組換えＡＮＴ−１を発現させた。このようにして得られたＡＮＴ−１はｔ−ＰＡと特異的に結合した。さらに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた血管内皮細胞ではｔ−ＰＡの活性が増強した。したがって本発明は次のとおりである。ＡＮＴ−１、血栓症の発症予防および治療に用いることのできる新規なｔ−ＰＡ結合物質。
【発明の効果】
【０００８】
以上の説明で明らかなように、本発明によれば血栓溶解剤であるｔ−ＰＡと結合し、その活性発現を増強させ、血栓症の予防や治療に供することのできるｔ−ＰＡ結合物質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明のｔ−ＰＡ結合物質はＡＮＴ−１である。ｔ−ＰＡ結合物質としては、従来からアネキシンＡ２（Ｈａｊｊａｒ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６９：２１１９１−２１１９７，１９９４年）、α−エノラーゼ（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，６３：２０４８−２０５７，１９９４年）、サイトケラチン−８（Ｈｅｍｂｒｏｕｇｈ ＴＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７１：２５６８４−２５６９１，１９９６年）、チューブリン（Ｂｅｅｂｅ ＤＰ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ，５９：３３９−３５０，１９９０年）、細胞骨格関連タンパク質４（Ｒａｚｚａｑ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４２６７９−４２６８５，２００３年）、フィブロネクチン（Ｓａｌｏｎｅｎ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：１２３０２−１２３０７，１９８５年）およびラミニン（Ｓａｌｏｎｅｎ ＥＭ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １７２：２９−３２，１９８４年）が知られているが、ＡＮＴ−１はこれら従来発表された物質とは分子量もアミノ酸配列も全く異なるタンパク質である。
【０００９】
ＡＮＴ−１はミトコンドリアの内膜に存在しており、従来からミトコンドリア内のマトリックスで生成されたＡＴＰをミトコンドリア外（細胞質）に輸送し、代わってミトコンドリア外のＡＤＰをミトコンドリア内に輸送するタンパク質として知られていた。しかし、ＡＮＴ−１とｔ−ＰＡとの反応様式、特にＡＮＴ−１がｔ−ＰＡと結合することは知られていない。
【００１０】
ＡＮＴ−１は２９７個のアミノ酸から構成される分子量が約３万のタンパク質である（Ｃｏｚｅｎｓ ＡＬ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０６：２６１−２８０，１９８９年、Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｍ Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．４５６：２７９−８８，１９８５年）。
【実施例】
【００１１】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。ヒトの血管内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーからＡＮＴ−１をコードする遺伝子をフォワードプライマー５’−ＧＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＴ−３’とリバースプライマーの５’−ＴＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＧＧ−３’を用いてＰＣＲ法で調整した。このＰＣＲ産物を市販のｐＧＥＸ−６Ｐ−１に組込んでｐＧＥＸ６Ｐ／ＡＮＴ−１ベクターを作成し、このベクターを大腸菌ＢＬ２１に組込んで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＡＮＴ−１との融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質を酵素処理することによりＡＮＴ−１を分離し、精製した。
【００１２】
精製したＡＮＴ−１が抗ＡＮＴ−１抗体と反応することをウエスタンブロット法にて確認した。
【００１３】
〔１〕リガンドブロット法によるＡＮＴ−１とｔ−ＰＡとの結合実験
精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質およびＡＮＴ−１を１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜を３％のウシ血清アルブミンを含む１０ｎＭのｔ−ＰＡ溶液で２時間反応させた。次にニトロセルロース膜を０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２Ｏ，２．６８ｍＭ ＫＣｌ，１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で洗浄した後、抗ｔ−ＰＡポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）とビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）およびＤＡＢ−Ｎｉ（ＶＥＣＴＯＲ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）でニトロセルロース膜上のｔ−ＰＡを検出した。図１はリガンドブロットの結果を示すものである。図１において各レーンは以下の場合を示す。
レーン１：精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質を電気泳動した場合。
レーン２：精製したＡＮＴ−１を電気泳動した場合。
図１に示すように、ＡＮＴ−１とＧＳＴとの融合タンパク質の分子量である約６万付近およびＡＮＴ−１の分子量である約３万付近にそれぞれバンドが確認され、ＡＮＴ−１にｔ−ＰＡが結合することが確認された。
【００１４】
〔２〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の作成
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させるために、ｐＧＥＸ６Ｐ／ＡＮＴ−１ベクターからＡｐａＩ／ＳａｌＩフラグメントを調整し、市販のｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）に組込んでＡＮＴ−１発現プラスミドを構築した。このＡＮＴ−１発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）で培養血管内皮細胞にトランスフェクションした。コントロールとしてｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみを培養血管内皮細胞にトランスフェクションした。
【００１５】
ＡＮＴ−１の培養血管内皮細胞での発現をウエスタンブロット法にて確認した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を細胞溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．５％ＮＰ−４０，ｐＨ７．４）で溶解し、１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。その上清を１０％−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）に電気的に転写した。転写後のニトロセルロース膜を５％のスキムミルクで処理した後、ニトロセルロース膜上のＡＮＴ−１を抗ヒトＡＮＴ−１モノクロナール抗体とＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）を用いたウエスタンブロット法で検出した。
【００１６】
図２Ａはウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａにおいて各レーンは以下の場合を示す。
レーン１：ｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみをトランスフェクションしたコントロール培養血管内皮細胞の細胞溶解液を電気泳動した場合。
レーン２：ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞溶解液を電気泳動した場合。
図２Ａに示すようにＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞溶解液中には抗ヒトＡＮＴ−１モノクロナール抗体に反応し、ＡＮＴ−１の抗原性を有するバンドが認められ、ＡＮＴ−１が培養血管内皮細胞で発現していることを確認した。
【００１７】
ＡＮＴ−１の細胞表面での発現を蛍光顕微鏡で観察した。ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を２４ウエルプレートで培養した後、２％のフォルムアルデヒドで固定し、抗ヒトＡＮＴ−１ポリクロナール抗体でインキュベーションした。次にＨＲＰで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させて、ＡＮＴ−１抗原の所在を蛍光発色システム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＴＳＡ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＳ，ＵＳＡ）と共焦点レーザー顕微鏡（ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ５１０）で観察した。
【００１８】
図２Ｂは共焦点レーザー顕微鏡像（写真）である。図２Ｂにおいて各写真は以下の場合を示す。
写真１：ｐＤｉｓｐｌａｙベクターのみをトランスフェクションしたコントロール培養血管内皮細胞の共焦点レーザー顕微鏡像を写真撮影した場合。
写真２：ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の共焦点レーザー顕微鏡像を写真撮影した場合。
図２Ｂに示すように、ＡＮＴ−１発現プラスミドをトランスフェクションした培養血管内皮細胞の細胞表面にはＡＮＴ−１抗原に起因する蛍光が観察され、培養血管内皮細胞の表面にＡＮＴ−１が発現していることが確認された。
【００１９】
〔３〕固相化したｔ−ＰＡと、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合実験
結合実験にはＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いた。バイオセンサー表面にｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅをコートしたｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅキュベットに４００ｍＭ Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）と１００ｍＭ，Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）を加えて、センサー表面のカルボキシル基を活性化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を排出後、キュベットをＰＢＳで洗浄し、２００ｍｇ／ｍｌのｔ−ＰＡを測定キュベットに加えてｔ−ＰＡのアミノ基とＮ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｃｃｉｍｉｄｅを導入した活性基を共有結合させた。その後、測定キュベットのセンサー表面を１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｏｎｅ（ｐＨ８．５）でブロックし、０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で処理することにより、固相化されていないｔ−ＰＡを除去した。ｔ−ＰＡを固相化した測定キュベットに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞、またはコントロールの培養血管内皮細胞を３７５０固（１．５×１０５細胞／ｍｌを２５μｌ）加えた。
【００２０】
図３Ａはコントロールの培養血管内皮細胞、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとの結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムで測定したものである。ＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムは細胞とｔ−ＰＡとの結合を検知する市販の特殊な装置である。ｔ−ＰＡとの結合の強さは縦軸の共鳴度（ａｒｃ ｓｅｃｏｎｄｓ）で表され、この値が大きいほど、結合度は高い。図３Ａに示すように、固相化したｔ−ＰＡに対するコントロール培養血管内皮細胞の結合能よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の結合能の方が強かった。
【００２１】
〔４〕酵素活性部位をブロックしたｔ−ＰＡと、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合実験
結合実験にはＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いた。測定キュベットのバイオセンサー表面にｔ−ＰＡを固相化した後、ｔ−ＰＡの酵素活性部位をセリンプロテアーゼ阻害剤であるＤｉｉｓｏｐｒｏｐｈｙｌ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＦＰ）で処理した。ＤＦＰで処理したｔ−ＰＡを固相化した測定キュベット、またはＤＦＰで処理していないｔ−ＰＡを固相化した測定キュベットに、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を３７５０固（１．５×１０５細胞／ｍｌを２５μｌ）加えた。
【００２２】
図３ＢはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とＤＦＰで処理したｔ−ＰＡ、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とＤＦＰで処理していないｔ−ＰＡとの結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステム（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で測定したものである。ｔ−ＰＡとの結合程度は縦軸の共鳴度（ａｒｃ ｓｅｃｏｎｄｓ）で表され、この値が大きいほど、結合度は高い。図３Ｂに示すように、ｔ−ＰＡのＤＦＰ処理にかかわらず、ｔ−ＰＡとＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合能に有意な差は認められなかった。すなわち、ＡＮＴ−１とｔ−ＰＡの結合はｔ−ＰＡの酵素活性発現部位を介していないことを示す。
【００２３】
〔５〕液相における、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとの結合実験
２４ウエル（穴）プレートのウエル内で、細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞（０．５×１０５個）、またはコントロールの培養血管内皮細胞（０．５×１０５個）とＦＩＴＣで蛍光標識したｔ−ＰＡ（０−２５ｎＭ）を４℃で１０分間反応させた。これらの細胞とｔ−ＰＡとの混合液を２０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞に結合しなかったｔ−ＰＡを上清液中に回収した。その上清液を９６ウエル（穴）プレートに入れ、上清液中の蛍光強度をマルチラベルプレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＭＳ，ＵＳＡ）で計測し、最初に細胞に加えた蛍光強度と上清中の蛍光強度との差から、細胞に結合したｔ−ＰＡを算出した。なお、モル濃度で５０倍量の非標識ｔ−ＰＡが存在するときの結合量を非特異的結合量とし、全結合量から非特異的結合量を引いたものを特異的結合量とした。
【００２４】
ｔ−ＰＡは細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞と結合し、そのＢｍａｘは０．６１±０．３５×１０５（結合部位／細胞）であった。表１はコントロールの培養血管内皮細胞とＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞におけるＫｄ値を示す。Ｋｄ値はｔ−ＰＡが培養血管内皮細胞に結合する際の親和性を示し、値が小さいほど親和性が高いことを意味する。コントロールに比べ細胞表面にＡＮＴ−１を発現した培養血管内皮細胞ではＫｄ値が約１／１０に減少し、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させることによりｔ−ＰＡと培養血管内皮細胞細胞との親和性が増大したことを示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
〔６〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性測定
９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞、またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡをウエルに加えて４℃、９０分間反応させた。次に、ｔ−ＰＡ溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄後、ｔ−ＰＡに対する発色性合成基質であるＳ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｒｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加え、細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を３７℃で測定した。細胞に結合したｔ−ＰＡによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。細胞の存在に対するコントロールとして、細胞非存在下の９６ウエル（穴）プレートのウエルに５０ｎＭのｔ−ＰＡを加えて、同様にｔ−ＰＡの活性測定を行った。
【００２７】
図４Ａはコントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性とＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を比較した結果である。図４Ａにおいて、各記号は以下の場合を示す。
（○−○）：コントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
（●−●）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
（■−■）：６ウエル（穴）プレートのウエルに非特異的に結合したｔ−ＰＡの活性を測定した場合。
【００２８】
図４Ａに示すように、コントロールの培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合のほうが、ｔ−ＰＡ活性は有意に高値を示した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞はｔ−ＰＡ活性を増強させる。
【００２９】
〔７〕ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能の測定
９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡをウエルに加えて４℃、９０分間反応させた。次に、ｔ−ＰＡ溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を洗浄後、１０μｇ／ｍｌのヒトプラスミノーゲン（Ｇｌｕ型）と発色性合成基質Ｓ−２２５１ （Ｈ−Ｄ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加えた。そして細胞に結合したｔ−ＰＡによりプラスミノーゲンから変換されたプラスミンの活性を３７℃で測定した。プラスミンによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。細胞の存在に対するコントロールとして、細胞非存在下の９６ウエル（穴）プレートのウエルに５０ｎＭのｔ−ＰＡを加えて、同様にｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した。
【００３０】
図４Ｂはコントロールの培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を比較した結果である。
図４Ｂにおいて、各記号は以下の場合を示す。
（○−○）：コントロールの培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
（●−●）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
（■−■）：６ウエル（穴）プレートのウエルに非特異的に結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲン活性化能を測定した場合。
【００３１】
図４Ｂに示すように、コントロールの培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合よりもＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞にｔ−ＰＡを反応させた場合のほうが、プラスミノーゲン活性化能は有意に高値を示した。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞はｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンアクチベーター活性を増強させる。
【００３２】
〔８〕ＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強が、細胞表面に発現したＡＮＴ−１と結合したｔ−ＰＡに起因することを確認するために、抗ｔ−ＰＡ抗体の存在下で培養血管内皮細胞とｔ−ＰＡとを反応させた。すなわち、９６ウエル（穴）プレートのウエル内でコントロールの培養血管内皮細胞またはＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）社製）で培養した。細胞がコンフルエントになった時点で培地を除去し、ＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、５０ｎＭのｔ−ＰＡと２μｇ／ｍｌの抗ｔ−ＰＡ抗体をウエルに加えて４℃、９０分間インキュベーションした。次に、ｔ−ＰＡと抗ｔ−ＰＡ抗体の混合溶液を除去し、再びＦＢＳを含まない無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、１０μｇ／ｍｌのヒトプラスミノーゲン（Ｇｌｕ型）と発色性合成基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−ｖａｌｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）を加えた。そして細胞に結合したｔ−ＰＡによりプラスミノーゲンから変換されたプラスミンの活性を３７℃で測定した。プラスミンによる発色性合成基質の分解活性はマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化によって評価した。抗ｔ−ＰＡ抗体に対するコントロールとして非特異的免疫グロブリンを用いた。
【００３３】
図５は、ＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響を示したものである。図５において各記号は以下の場合を示す。
活性を測定した場合。
（ ■ ）：ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞を用いてプラスミノーゲンアクチベーター活性を測定した場合。
【００３４】
図５に示すように、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性は抗ｔ−ＰＡ抗体の存在下で有意に低下した。しかし、非特異的免疫グロブリンの存在下では有意な変化は認められなかった。一方、ＡＮＴ−１遺伝子を組込んでいないコントロールの培養血管内皮細胞では、抗ｔ−ＰＡ抗体や非特異的免疫グロブリンの存在にかかわらずｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンアクチベーター活性に有意な変化は認められなかった。すなわち、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現させた培養血管内皮細胞で認められたｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強は、細胞表面に発現したＡＮＴ−１に結合したｔ−ＰＡに起因する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】精製したＧＳＴ／ＡＮＴ−１融合タンパク質（レーン１）、および精製したＡＮＴ−１（レーン２）とｔ−ＰＡとのリガンドブロットを示す写真である。
【図２】ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞の細胞溶解液と抗ｔ−ＰＡ抗体とのウエスタンブロットを示す写真（図２Ａ、レーン２）、および細胞表面でのＡＮＴ−１の発現を蛍光顕微鏡で観察した共焦点レーザー顕微鏡像を示す写真（図２Ｂ、写真２）である。図２Ａのレーン１、および図２Ｂの写真１はコントロールの培養血管内皮細胞を用いた場合である。
【図３】固相化したｔ−ＰＡとＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞との結合をＩＡｓｙｓバイオセンサーシステムで観察したグラフである。図３Ａはコントロールの培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能を比較したグラフである。図３Ｂは、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のｔ−ＰＡに対する結合能と、ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞のＤＦＰ処理したｔ−ＰＡに対する結合能を比較したグラフである。
【図４】ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡの活性（図４Ａ）、およびＡＮＴ−１を細胞表面に発現した培養血管内皮細胞と結合したｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性（図４Ｂ）を示すグラフである。
【図５】細胞表面に発現させたＡＮＴ−１によるｔ−ＰＡのプラスミノーゲンアクチベーター活性の増強におよぼす抗ｔ−ＰＡ抗体の影響を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液線溶系酵素であり血栓溶解剤のｔ−ＰＡと結合しうる、血栓症発症予防用物質のアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）。
【請求項２】
血液線溶系酵素であり血栓溶解剤のｔ−ＰＡと結合しうる、血栓症治療用物質のＡＮＴ−１。
【請求項３】
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した血管内皮細胞、およびその前駆細胞。
【請求項４】
ＡＮＴ−１発現血管内皮細胞およびその前駆細胞をコーティングした、血管内カテーテルあるいは人工弁。
【請求項５】
線溶系障害、脳梗塞、心筋梗塞、脳卒中、脳血栓、眼底血管血栓、虚血性脳血管障害、深部静脈血栓症、四肢動脈血栓症、塞栓症、肺塞栓症、網膜静脈血栓症、冠動脈血栓症、脳血栓症、心筋梗塞、急性心不全、脳卒中発作、手術の血栓塞栓性合併症、悪性腫瘍に起因する血栓形成の治療、改善、予防、ならびに生体内の線溶系、血流の指標となる数値の改善、血管性痴呆症に適用されるＡＮＴ−１、ないし請求項３に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項６】
その必要とする対象にＡＮＴ−１ないし請求項３に記載の細胞を投与することを含む、ｔ−ＰＡ活性を制御する方法。
【請求項１】
血液線溶系酵素であり血栓溶解剤のｔ−ＰＡと結合しうる、血栓症発症予防用物質のアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ−１（ＡＮＴ−１）。
【請求項２】
血液線溶系酵素であり血栓溶解剤のｔ−ＰＡと結合しうる、血栓症治療用物質のＡＮＴ−１。
【請求項３】
ＡＮＴ−１を細胞表面に発現した血管内皮細胞、およびその前駆細胞。
【請求項４】
ＡＮＴ−１発現血管内皮細胞およびその前駆細胞をコーティングした、血管内カテーテルあるいは人工弁。
【請求項５】
線溶系障害、脳梗塞、心筋梗塞、脳卒中、脳血栓、眼底血管血栓、虚血性脳血管障害、深部静脈血栓症、四肢動脈血栓症、塞栓症、肺塞栓症、網膜静脈血栓症、冠動脈血栓症、脳血栓症、心筋梗塞、急性心不全、脳卒中発作、手術の血栓塞栓性合併症、悪性腫瘍に起因する血栓形成の治療、改善、予防、ならびに生体内の線溶系、血流の指標となる数値の改善、血管性痴呆症に適用されるＡＮＴ−１、ないし請求項３に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項６】
その必要とする対象にＡＮＴ−１ないし請求項３に記載の細胞を投与することを含む、ｔ−ＰＡ活性を制御する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１００６０２（Ｐ２０１０−１００６０２Ａ）
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９７３１２（Ｐ２００８−２９７３１２）
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（５０８３４４８５５）
【出願人】（５９３０４５７９８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２４日（２００８．１０．２４）
【出願人】（５０８３４４８５５）
【出願人】（５９３０４５７９８）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]