血管新生を阻害するラクトアルブミン
増殖性疾患、及び特に膀胱癌又は悪性メラノーマのような粘膜癌、及び神経膠芽細胞腫のような内部器官の腫瘍の治療において、並びに血管新生の阻害において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞を致死させるヒトα−ラクトアルブミン）若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの望ましからざる細胞又は組織増殖を伴う状態を治療する方法、及びそのような状態の治療のための薬物の製造における生物学的に活性のある複合体の使用に関する。特に、これらの状態は、膀胱癌、メラノーマ、内部器官の癌のような、悪性粘膜腫瘍又は癌、特に、脳腫瘍、及びその他の状態、例えば血管新生の阻害が望ましい癌を含む。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新しい血管を形成する過程である。それは、通常、人体において、発生及び成長における特定の時期に生じる。例えば、胚は動脈、静脈及び毛細血管の広大なネットワークを必要とする。脈管形成と呼ばれる過程は、将来主要な血管となる血管内皮細胞の最初のネットワークを創成する。後程、血管新生は、このネットワークを、小児の循環系を完成する小さな新しい血管又は毛細血管へと作り直す。
【０００３】
新しい血管の増殖は、また、成人でも起こる。婦人においては、新しい血管が排卵周期の期間に、子宮の内面に形成するので、血管新生が各月に数日間活性となる。また、血管新生は、創傷治癒の間に組織の修復又は再生に必要である。
【０００４】
血管内皮細胞は、血管新生によって刺激されない限り、殆んど分裂しない。血管新生は、活性化因子及び阻害分子の両者によって制御されている。通常、阻害分子が優性で、成長を妨害している。新しい血管の必要性が生じた場合、血管新生活性化因子の数が増し、阻害分子が減少し、かくして血管内皮細胞の増殖及び分裂が起こるように促し、最終的に、新しい血管の形成が起こる。
【０００５】
１９６０年代以前には、癌研究者は、単に既存の血管が拡張して血液が腫瘍に到達すると信じていた。しかしその後の実験は、癌性の腫瘍が成長を保ち、広がっていくために、血管新生が必要であることを示した。
【０００６】
腫瘍血管新生は、栄養及び酸素を供給し、老廃物を除去する癌性増殖に浸透する血管のネットワークの増殖である。それは、腫瘍細胞が、新しい血管の増殖を促すためにある種の遺伝子やタンパク質を活性化するよう、周辺の正常な宿主組織に信号を送る分子を放出する場合に始まる。
【０００７】
癌細胞によって産生される小活性化分子が、周囲の組織における血管新生の信号を送る。十数個の異なったタンパク質、及びいくつかのより小さな分子が「血管形成性」として同定されている。これらの中には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）がある。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、多くの癌細胞によって産生され、そしてある種の型の正常細胞によっても産生される。
【０００８】
ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、最初腫瘍細胞内部で合成され、次いで周囲の組織に分泌される。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦのいずれも適切な受容体に結合して、内皮細胞の核への情報伝達カスケードを活性化する。核の情報は、究極的には、新しい内皮細胞増殖に必要とされる産物をつくるよう一群の遺伝子を促す。
【０００９】
ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦによる内皮細胞の活性化は、新しい血管の創成に向かって一連のステップを動かす。先ず、活性化された内皮細胞は、特殊なクラスの分解酵素である、マトリックスメタロプロテイナーゼ類（ＭＭＰ）を産生する。これらの酵素は、次いで、内皮細胞から周囲の組織へと放出される。ＭＭＰは、細胞間の空間を満たしており、そしてタンパク質及び多糖類でつくられている細胞外マトリックス支持物質を分解する。
【００１０】
このマトリックスの分解は、内皮細胞の移動を可能とする。それらが周囲の組織へと移動するにつれて、活性化された内皮細胞は分裂を始める。すぐにそれらは組織化して中空管となり、中空管は血管の成熟したネットワークへと徐々に発達する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多くの腫瘍は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのような血管新生性分子を産生するが、それらの存在は、血管増殖を開始するには充分でない。血管新生を開始するためには、これらの活性化分子は、通常は血管増殖を抑止する種々の血管新生阻害分子に打ち勝たなければならない。
【００１２】
十数個の天然に存在する殆んどのタンパク質が、血管新生を阻害することができる。この分子の群の中で、アンジオスタチン、エンドスタチン及びトロンボスタチンと呼ばれているタンパク質が、特に重要であるように見える。血管新生阻害分子の濃度とＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのような活性化分子の濃度の間を精密に調整したつり合いは、腫瘍が新しい血管の増殖を誘導することができるかどうかを決める。血管新生の引き金を引くためには、活性化分子の産生が阻害分子の産生を減少するように増加しなければならない。
【００１３】
血管新生阻害分子の発見は、そのような分子が癌の増殖を治療的に停止又は抑止するであろうかという疑問を惹き起こす。研究者は、動物を含んだ多くの実験でこの疑問に取り組んでいる。一つの特筆すべき研究で、数種の異なった癌の種類を持ったマウスをエンドスタチンの注射で治療した。２、３サイクルの治療の後に、注射された癌細胞の部位に生じた最初（原発）の腫瘍は殆んど消失し、再使用の後に、その動物は、エンドスタチンの効果に対する抵抗性を発現しなかった。
【００１４】
エンドスタチンのような血管新生阻害分子が原発性腫瘍の増殖を抑止することができるという発見は、そのような阻害分子が腫瘍転移を遅延させることができるかもしれないという可能性を提起する。
【００１５】
原発腫瘍に由来する癌細胞は、別の器官に広がることができ、長期にわたって休眠状態のままにいることができる小さな微視的な腫瘍塊（転移）を形成することができることが長年にわたり知られている。この腫瘍休眠についての同様な説明は、血管新生は起こらず、従って小腫瘍は継続した増殖に必要な新しい血管が欠けているというものであった。
【００１６】
腫瘍休眠についての一つの可能性のある理由は、いくつかの原発腫瘍は血流中に阻害分子アンジオスタチンを分泌し、次いで身体中を循環し、そして別の部位で血管増殖を阻害すると云うものである。これが、微視的転移の目に見える腫瘍への増殖を防止可能にする。
【００１７】
血管新生の過程を妨害することによって腫瘍増殖を停止できるという考えに対する付加的な支持が、マウスの遺伝子の研究からもたらされている。科学者は、最近、ＩＤ１及びＩＤ３と呼ばれる、２つの遺伝子を欠くマウスの系統で、その欠損が血管新生を妨害するものを創成した。マウス乳癌細胞をそのような血管新生欠損突然変異マウスに注射すると、短い腫瘍増殖の期間があるが、しかし腫瘍は２、３週間後に完全に退行し、マウスは癌の影も形もなくなって健康を維持している。対照的に、同じ乳癌細胞を注射した正常マウスは、２、３週間以内に癌で死亡する。
【００１８】
同じ系統の血管新生欠損突然変異マウスに肺癌細胞を注射すると、結果は若干異なっている。肺癌細胞は、突然変異マウスの腫瘍に成長するが、しかし腫瘍は正常マウスにおけるよりもよりゆっくりと増殖し、他の臓器に広がる（転移する）ことができない。その結果、突然変異マウスは、同じ種類の肺癌細胞を注射された正常マウスよりもより長く生存する。
【００１９】
結果として、血管新生を阻害すると、ヒトにおける癌細胞の増殖及び広がりを遅くする又は防止することができると現在信じられており、その結果として、多くの血管新生阻害剤が、目下癌患者において試験されている。
【００２０】
試験されている阻害剤は、それらの作用機作によっていくつかの異なった範疇に分類される。或るものは内皮細胞を直接阻害し、他のものは血管新生情報伝達カスケードを阻害し、又は細胞外マトリックスを破壊する内皮細胞の能力を妨害する。
【００２１】
ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞を致死させるヒトα−ラクトアルブミン）（以前はＭＡＬとして知られていた）は、形質転換細胞におけるアポトーシスを誘導するが、しかし健康な分化細胞には危害を加えないアルファ・ラクトアルブミン（α−ラクトアルブミンとしても表される）の活性なフォールディング変異体である（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面に結合すること、細胞質中に転位すること及び細胞核中に蓄積すること、その結果ＤＮＡ断片化をもたらすこと、が示されている（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。ミルク及び特にヒトのミルクから得られる、この型の生物活性のある複合体は、抗菌剤としての使用と共に、例えば、欧州特許第０７７６２１４号に記載されている。
【００２２】
ＨＡＭＬＥＴの細胞標的は、共焦点顕微鏡及び細胞下分画法の組合せによって試験されている（Hakansson et al., 1999, Exp. Cell Res. 246, 451-60）。ＨＡＭＬＥＴは細胞表面に結合し、細胞質に入り、そこでミトコンドリアと相互作用しそれを活性化する。最後に、タンパク質が細胞核に入り、そこで蓄積する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本出願人は、抵抗性細胞及び感受性細胞がそれらの表面に同じような効率でＨＡＭＬＥＴを結合し、これが特異な事象ではないことを示唆しているのを見出した。対照的に、核への蓄積は、死細胞のみに起こり、このステップにより、感受性腫瘍細胞が抵抗性細胞から区別されることを示唆している。共焦点顕微鏡によって、核への蓄積は不可逆的に現れ、このことは、核分画においてＨＡＭＬＥＴを結合及び保持する核標的の存在を示唆している。
【００２４】
今日まで、ＨＡＭＬＥＴについて報告された研究は、インビトロで、形質転換細胞はＨＡＭＬＥＴに感受性であり、それが癌治療に応用されることを示唆していることを示している。しかし、インビトロで見られた効果及びインビボで観察された効果の相関関係は、特に、インビボで見出された状態が腫瘍の性質及び部位によって変化するので必ずしも直接的なものではない。例えば、身体の異なった器官に見出される異なった状態によって、いずれの治療剤においても、その安定性、及びそれ故にその効果が影響されうる。
【００２５】
しかしながら、本出願人は、ＨＡＭＬＥＴがヒト細胞に対してインビボで活性を保持し、それ故にそれが、特にある種の例において、有用な抗癌療法であることを見出した。
【００２６】
更に、今や見出されたことは、ＨＡＭＬＥＴが、また、血管新生に対して阻害効果を有しているようであり、それは、以前に注目されていた殺腫瘍活性から単純に期待されるであろうよりも大きいものであると信じられることである。このことは、分子の細胞効果の高度に選択的な性質を考えると、意外なことである。結果として、それは複合体の潜在的な治療範囲を拡大するものである。
【００２７】
本発明の第一の態様によれば、動物、特にヒトの、増殖性疾患の治療に使用するための及び／又は血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００２８】
増殖性疾患の特別な例は癌である。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を腫瘍に適用することによる、インビボでの、特にヒトにおける癌を治療する方法を提供する。この目的のために、生物活性のある複合体が、癌療法において使用するための薬剤の製造において使用される。
【００３０】
本出願人は、ＨＡＭＬＥＴ及びこの型の複合体は、粘膜腫瘍、特に膀胱腫瘍の治療に使用するとき予想外に良好な結果を生じることを見出した。
【００３１】
本発明の第二の態様によれば、ヒトの粘膜癌の治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００３２】
粘膜表面で見出される状態は、ｐＨその他のような性質に関して非常にユニークな可能性がある。粘膜表面は、とりわけ、鼻腔において、口、咽喉、食道、肺、胃、大腸、膣及び膀胱において見出される。本発明によって治療され得る特別な粘膜表面は、咽喉、肺、大腸及び膀胱表面の腫瘍を包含する。本発明は、特に、膀胱癌の治療に応用し得る。
【００３３】
しかしながら、今や見出されたことは、ＨＡＭＬＥＴは、血管新生に対して阻害効果も有しているようであり、それは、以前に注目されていた殺腫瘍活性から単純に期待されるであろうよりも大きいものであると信じられることである。このことは、分子の細胞効果の高度に選択的な性質を考えると、意外なことである。結果として、それは複合体の潜在的な治療範囲を拡大するものである。
【００３４】
本発明の第四の態様によれば、血管新生の阻害のための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が提供される。
【００３５】
そのような薬剤は、癌、特に固形癌、及び特に急速に増殖しつつある固形癌の治療のために使用することができる。そうでない場合でも、それに加えて、腫瘍転移を遅延させるために投与することもできる。
【００３６】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体がこの結果を達成する機構は判っていない。ある種の効果は腫瘍細胞によって媒介されているであろうことが期待され得る。特に、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞を殺すので、血管新生活性化分子の供給が減少する。しかしながら、注目した効果は、付加的な効果が生じつつあることを示唆している。例えば、ＨＡＭＬＥＴは急速に増殖しつつある血管細胞に対して、直接的な効果を有している可能性があるようである。
【００３７】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体は、また、血管新生阻害が望ましいその他の疾患を治療するために使用することもできる。
【００３８】
主として天然に存在するタンパク質として、ＨＡＭＬＥＴは、完全合成薬よりも低毒性であろうと信じられる。更に、複合体の免疫原性は低いと信じられる。
【００３９】
本発明の第四の態様によって製造される薬剤は、好適には、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤のような局所使用するのに適した形態をした医薬組成物である。これらは、医薬として許容される、一般に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤（expedients）を包含することができる。
【００４０】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有する。
【００４１】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従い治療される状態の性質等によって変化し、そして依存する。通例、２から２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各投与に対して使用される。
【００４２】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、血管新生を阻害する方法が提供される。
【００４３】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に明らかにされている。好ましくは、生物活性のある複合体は、上にも記載したように、局所用組成物の形態で投与される。
【００４４】
本明細書で使用されるものとして、用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体（このものは起源がヒトであっても、そうでなくてもよい）を表し、ｐＨ４.６で沈殿したミルクのカゼイン分画から単離することによって、例えばＥＰ−Ａ−０７７６２１４に記載されているような陰イオン交換クロマトグラフィーとゲル・クロマトグラフィーの組合せによって、又は、国際公開第９９／２６９７９号に記載されたようなＣ１８：１脂肪酸として特徴づけられるヒトミルクカゼイン由来の補助因子の存在下で、α−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、得ることができる。類似の活性を有するこの複合体の変異体又は誘導体は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１２９３号に記載されている。
【００４５】
α−ラクトアルブミンは、ヒト、ウシ、ヒツジ及びヤギのミルクを含む種々の哺乳類源から得られるが、好ましくは、ヒト又はウシであり、最も好ましくはヒトから得られる。タンパク質の組換え体の形態も、また、採用してもよい。
【００４６】
他の試薬及び特にオレイン酸のような脂質が、ヒトα−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換に有用であることも見出されている。特に、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）がＨＡＭＬＥＴ産生に必要であることが以前に報告されている（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。より最近になって、他の脂肪酸が同様に補助因子として作用するであろうことが見出されている。α−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換のための至適な補助因子は、９位又は１１位においてシス立体配置の二重結合を有するＣ１８：１脂肪酸である。
【００４７】
α−ラクトアルブミンは、４つのジスルフィド結合（６１−７７；７３−９１；２８−１１１及び６−１２０）によって連結された、４つのα−ヘリックス（残基１−３４、８６−１２３）及び逆平行β−シート（残基３８−８２）を有する１４.２ｋＤａの球状タンパク質である（K. R. Acharya, et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。α−ラクトアルブミンの天然の立体配座は、Ａｓｐ８２、Ａｓｐ８７及びＡｓｐ８８の側鎖カルボン酸、Ｌｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素、及び２つの水分子によって配位された、高親和性Ｃａ2+結合部位によって規定される（K. R. Acharya, et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。タンパク質は、低ｐＨに曝された場合の、又は強く結合したＣａ2+イオンを放出するキレート剤の存在下でのＨＡＭＬＥＴにおいて見出される、いわゆるアポ配座をとる（D. A. Dolgikh, et al., (1981), FEBS Lett., 136, 311-5; K. Kuwajima, (1996), Faseb J., 10, 102-09）。
【００４８】
生物活性のある複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは、一般的に、立体配座の変化又はフォールディングの変化の両者、並びに脂質の存在を必要とする。立体配座の変化は、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンの脱離によって好適に起こる。好ましい実施態様において、このことは、機能的カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体を使用して好適に促進される。
【００４９】
そのような変異体を含有する生物活性のある複合体は、本明細書において使用されるように用語ＨＡＭＬＥＴの「改変体」に包含される。しかし、本出願人は、一度形成すると、機能的カルシウム結合部位の存在、及び／又はカルシウムの存在は、複合体の安定性又は生物活性に影響しないことを見出した。生物活性のある複合体は、活性を失うことなく、カルシウムに対する親和性を保持することが見出されている。それ故、本発明の複合体は、更にカルシウムイオンを含んでもよい。
【００５０】
それ故、特に、本発明は、α−ラクトアルブミン若しくはアポフォールディング状態（apo folding state）であるα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及び生物活性のある形態での複合体を安定化する補助因子を含み、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のいずれかの断片は、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む、生物活性のある複合体を使用する。
【００５１】
好適には、補助因子は、シスＣ１８：１：９、又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸である。
【００５２】
特に便利な実施態様において、本発明において使用される生物活性のある複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが放出されたα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが除去されたか又は機能性カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一つの断片、但し、このいずれか一つの断片は、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含むものである；
を含む。
【００５３】
本明細書において使用されるように、表現「変異体」は、好適にはヒト又はウシα−ラクトアルブミンであるが、しかしながら、それらが由来する基本配列とは配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているという点で異なっている、基本タンパク質に相同であるポリペプチド又はタンパク質を表す。アミノ酸の置換は、「保存的」とされていてもよく、その場合アミノ酸が広範囲に類似した性質を有する異なったアミノ酸で置換される。非保存的置換は、アミノ酸が異なった型のアミノ酸で置換されるものである。大まかに云って、より少数の非保存的置換が、ポリペプチドの生物活性を変更することなく可能であろう。好適には、変異体は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは８０％又は８５％、及び特に好ましくは９０％、９５％又は９８％、又はそれ以上同一であろう。
【００５４】
同一性の程度を決定する目的でアミノ酸配列を比較するとき、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰのようなプログラム（両者は、Wisconsin Genetics Computer Group（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージである）がある。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適なアラインメントを作る。ＧＡＰは、配列の全長に沿って配列のアラインメントを可能にし、必要に応じて配列のいずれかにスペースを挿入することによって最適なアラインメントを見出す。好適には、本発明の関連で配列の同一性を考察する場合、比較は、配列の全長に沿った配列のアラインメントによって行われる。
【００５５】
用語「その断片」は、完全なα−ラクトアルブミンアミノ酸配列を包含する複合体に類似する活性を有する複合体を形成するであろう、与えられたアミノ酸配列のいずれかの部分を表す。断片は、互いに連結した全長のタンパク質内から１つ又はそれ以上の部分を含んでいてもよい。部分は、好適には、基本配列から少なくとも５個の、好ましくは少なくとも１０個の連続的アミノ酸を含む。
【００５６】
好適な断片は、長さで少なくとも２０アミノ酸、及びより好ましくは少なくとも１００アミノ酸を好適に含む欠失変異体であろう。断片は、タンパク質からの小領域又はそれらの組合せを包含する。
【００５７】
αドメインとβドメインの間の接点を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいて、構造においてアミノ酸３４〜３８及び８２〜８６によって規定される。それ故、好適な断片は、これらの領域、及び好ましくは天然のタンパク質のアミノ酸３４〜８６からの完全領域を包含する。
【００５８】
特に好ましい実施態様において、生物活性のある複合体は、カルシウム結合部位がカルシウムに対する親和性が減少するように又は最早機能的でないように改変されたα−ラクトアルブミンの変異体を含む。
【００５９】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８によって配位されている。それ故、この部位の改変又は非ウシα−ラクトアルブミンにおけるその等価物は、例えば１つ又はそれ以上の酸性残基を除去することによって、カルシウムに対する部位の親和性を減じることができ、或いは完全に機能を除去することができ、この型の変異体は本発明の好ましい態様である。
【００６０】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、２つのヘリックスを分離する短いターン領域を有する３10ヘリックス及びαヘリックスからなる（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。それは、分子のこの部分をかなり曲がりにくくする２つのジスルフィド架橋によって挟まれている。Ｃａ2+を配位する７個の酸素グループの内５個は、Ａｓｐ８２、８７及び８８の側鎖カルボキシレート又はＬｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素によって与えられている。２つの水分子は残りの２個の酸素を供給している（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。
【００６１】
８７位のアスパラギン酸のアラニン（Ｄ８７Ａ）への部位特異的突然変異誘発は、強力なカルシウム結合部位を不活化することが以前に示されており（Anderson P. J., et al., (1997), Biochemistry 36, 11648-11654）、変異タンパク質はアポ立体配座をとっている。
【００６２】
それ故に、特別な実施態様において、ウシα−ラクトアルブミンタンパク質配列内のアミノ酸の８７位のアスパラギン酸残基は、非酸性残基、特に、非極性又は電荷を持たない極性側鎖に変異する。
【００６３】
非極性側鎖としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインが挙げられる。特に好ましい例は、アラニンである。電荷を持たない極性側鎖としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン又はチロシンが挙げられる。
【００６４】
突然変異タンパク質における構造歪みを最小化するために、Ｄ８７は、カルボキシル基の中和されていない負電荷を欠くが、同じ側鎖体積及び幾何配置を有する、アスパラギン（Ｎ）によって置換されている（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。変異タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、カルシウムと低親和性（Ｋ−Ca２×１０5Ｍ-1）で結合することが示された（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。そのような変異体は、本発明の更に好ましい実施態様における生物活性のある複合体の構成要素である。
【００６５】
それ故、本発明の複合体において使用するための特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７Ａ及びＤ９７Ｎ変異体、又はこの変異体を包含する断片である。
【００６６】
分子のこの領域は、ウシタンパク質とヒトタンパク質の間で異なっており、３つの塩基性アミノ酸の１つ（Ｒ７０）が、ウシα−ラクトアルブミンにおいてＳ７０に変化しており、それ故１つの配位側鎖が除かれている。それ故に、ウシα−ラクトアルブミンを本発明の複合体において使用する場合、Ｓ７０Ｒ変異体を使用するのが望ましい場合がある。
【００６７】
Ｃａ2+結合部位は、異なった種からのα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存されており（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）、タンパク質のためのこの機能の重要性を明らかにしている。それは５つの異なったアミノ酸及び２つの水分子によって配位されている。Ｄ８８と共にＤ７７の側鎖カルボン酸は、最初にカルシウムイオンを陽イオン結合部位にドッキングさせ、構造を安定化する内部水素結合を形成する（Anderson P. J., et al., (1997), Biochemistry 36, 11648-11654）。Ｄ８７又はＤ８８のいずれか１つを失うと、Ｃａ2+結合を妨げ、分子を部分的に折り畳まれていない状態で安定にすることが示されている（Anderson P. J., et al., (1997) Biochemistry 36, 11648-11654）。
【００６８】
更に、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位における２つの異なった点突然変異を有する変異タンパク質を使用してもよい。例えば、８７位のアスパラギン酸をアラニン（Ｄ８７Ａ）で置換すると、カルシウム結合を完全に崩壊し、タンパク質の三次構造を破壊することが見出されている。アスパラギン酸をアスパラギンによって置換すると、タンパク質（Ｄ８７Ｎ）はカルシウムになお結合しているが、しかし、低親和性であり、Ｄ８７Ｎ変異体に対するほど顕著ではないが、三次構造の消失を示した（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。変異タンパク質は、両アミノ酸は同じ平均体積１２５(オングストローム)3を有するので、充填体積において最小の変化を示し、アスパラギンのカルボン酸側鎖がタンパク質をカルシウムと配位するのを可能とするが、しかし効率が悪い（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。両変異タンパク質は、生理温度でアポ立体配座で安定であったが、この立体配座変化にもかかわらず、それらは生物学的に不活性であった。これらの結果は、アポ立体配座への立体配座変化のみでは、生物活性を誘導するには充分でないことを明らかにしている。
【００６９】
α−ラクトアルブミンの構造は、当該技術分野で知られており、本明細書において表されている残基の正確なアミノ酸番号付けは、例えば、前記Anderson等及び前記Permyakov等によって示された構造を参照することによって同定することができる。
【００７０】
本発明の第二の態様に従って製造される薬剤は、好適には、治療される特定の悪性粘膜腫瘍に局所投与するのに好適な形態の医薬組成物である。例えば、組成物は、膀胱癌が治療されている膀胱に点滴注入するために好適な形態であってもよい。これらは、医薬として許容される普通に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。しかし好適には、膀胱に点滴注入される組成物は、活性物質の滅菌水又は生理食塩水溶液を含む。
【００７１】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には、希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有し、これは他の悪性粘膜腫瘍に適用するのにより好適であり得る。そのような製剤は、腫瘍に直接適用することができる。
【００７２】
加えて、そのような局所組成物は、悪性皮膚腫瘍、特にメラノーマを治療するために適用され得る。本出願人は、ＨＡＭＬＥＴがメラノーマ細胞に対して特に有効であることを見出した。このようにこれら組成物の使用は、本発明の更なる態様を形成している。
【００７３】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従って治療される癌の性質等によって変化し、依存する。通例、２００ｍｇから１ｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、１日当たりの投与量として、好ましくは膀胱内点滴注入によって、少なくとも３日、好ましくは少なくとも５日の期間にわたって、使用される。特に、１日当たり７５０ｍｇのＨＡＭＬＥＴ、５日間を含む投与計画が有益であることが証明されている。
【００７４】
本出願人は、膀胱癌に対する局所ＨＡＭＬＥＴ治療の効果について研究した。以下に報告するように、膀胱内点滴注入に続く効果は極めて良好であった。
【００７５】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、粘膜癌を治療する方法、及び特に膀胱癌を治療する方法が提供される。複合体は、好適には膀胱内に投与される。
【００７６】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に例示されている。好ましくは、生物活性のある複合体は、上記にも記載された、局所組成物の形態で投与される。
【００７７】
本出願人は、ＨＡＭＬＥＴ及びこの型の複合体が、インビボで内部器官の腫瘍に直接注入された場合に極めて良好な結果を生じることを見出した。特に、脳に見出される液体は活性を妨害しないことを見出している。
【００７８】
本発明の第三の態様によれば、腫瘍に注入するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００７９】
そのような生物活性のある複合体を直接腫瘍に注入することによって、腫瘍の大きさを減少可能であることが見出され、プロテアーゼを包含し得る体液の存在にもかかわらず、アポトーシスを誘導するＨＡＭＬＥＴの効果が生じていることを示している。結果として、この治療は、脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣のような内部器官の固形腫瘍、並びにメラノーマにおける治療に特に好適である。
【００８０】
そのような複合体の効果の選択的な性質は、隣接する健全な組織が、複合体と接触するとしても、影響を受けないことを意味している。
【００８１】
特に、本発明は、脳腫瘍の治療において、及び毒素誘発肝臓腫瘍においても有用である。脳に見出される液体は、特に、驚くべき程度まで、ＨＡＭＬＥＴの効果を妨害するようには見えない。
【００８２】
悪性脳腫瘍は、選択的又は効果的な治療が得られないという点で、主要な治療的挑戦目標を表している。頭蓋内腫瘍の大部分は、神経膠細胞に由来しており、神経膠腫として知られる異質群を形成している。それらは、全ての原発性脳腫瘍の６０％を超える割合を占めており、最も予後不良である。神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、平均生存期間が１年未満の膠芽腫の最も悪性なものであり、それらは神経外科及び神経病理学系列において全ての頭蓋内腫瘍のおよそ１／４を構成している。近年、脳腫瘍の外科手術は著しい技術的進歩をなしている。顕微外科及びニューロナビゲーション並びに新しい診断用高分解能画像技術が、死亡率を減少させているが、しかし生存期間は改善していない。ＧＢＭは、それらの侵襲性及び広範な浸潤性増殖の故に、完全な手術除去は手が届かないで残っている。結果として、これらの患者の目下の治療は、部分的腫瘍切除、放射線療法及び化学療法を包含する姑息的なものである。
【００８３】
しかしながら、本出願人は、ＨＡＭＬＥＴのような生物活性のある複合体が、特に、ＧＢＭの治療における新しい手段を提供することを見出した。ＨＡＭＬＥＴは、インビトロでアポトーシス様機構によってＧＢＭ腫瘍細胞を殺し、効果は選択的で、健全な細胞は傷付かない。更に、ＨＡＭＬＥＴは、ヒトＧＢＭ異種移植片モデルにおいて、インビボでこれらの性質を保持していた。確立されたヒトＧＭＢ腫瘍へのＨＡＭＬＥＴの局所注入は、腫瘍進行及び圧迫症状の発症を顕著に遅延させた。ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬアッセイ及び組織病理によって示されるように、インビボにおいてアポトーシス様機構によって腫瘍細胞を殺傷した。壊死の証拠はなく、組織病理的変化は周囲の無傷の脳において検出されなかったので、効果は選択的であった。生検スフェロイドのインビトロ処置で、良性髄膜腫に比較して、ＨＡＭＬＥＴによる悪性細胞の効率的な殺傷が確認された。結果は、それ故、ＨＡＭＬＥＴはＧＢＭを治療するのに使用できることを示唆している。
【００８４】
本発明の第三の態様によって製造される薬剤は、好適には、治療される特定の固形腫瘍に、腫瘍内投与するのに適した形態の医薬組成物である。例えば、組成物は、腫瘍中に注入するのに好適な形態である。これらは、医薬として許容される普通に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。しかし好適には、注入用組成物は、活性物質の生理食塩水溶液を含む。
【００８５】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従って治療される癌の性質等によって変化し、依存する。通例、２ｍｇから２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各１回につき腫瘍に注入される。
【００８６】
本明細書において報告された研究は、ヒトＧＢＭ異種移植片モデルにおけるＨＡＭＬＥＴの治療効果を探求したものである。ＨＡＭＬＥＴは、脳液と接触するにもかかわらず、インビボでＧＢＭのアポトーシス様死を選択的に誘導する能力を保持していることを示している。ＨＡＭＬＥＴの腫瘍内投与は、腫瘍細胞アポトーシスの選択的誘導によって、ヒト神経細胞膠芽腫（ＧＢＭ）を有するラットにおいて生存期間を延長することが見出された。侵襲的に増殖するヒトＧＢＭを、ヒト生検スフェロイドの異種移植によって、ヌードラットに確立し、ＨＡＭＬＥＴの治療効果をα−ラクトアルブミン；同じタンパク質の天然のフォールディング変異体、と比較した。
【００８７】
ＨＡＭＬＥＴの、脳内、運搬促進送達（convection enhanced delivery）は、担腫瘍ラットにおいて、頭蓋内腫瘍体積を劇的に減少させ、圧迫症状の発症を遅らせた。ＨＡＭＬＥＴは、健全なラットの脳に治療濃度のＨＡＭＬＥＴを注入した後、腫瘍に隣接した健全な脳組織においてはアポトーシスを誘導せず、かつ有毒な副作用を惹き起こさなかった。この結果により、ＨＡＭＬＥＴが癌療法、特にＧＢＭ進行を制御するための潜在的な新しい道具であると確認できる。
【００８８】
結果は、また、ＨＡＭＬＥＴとα−ラクトアルブミンを投与された異種移植ラットの間に疾病進行において顕著な相異があったことを示している（ｐ＜０.００１）。このことは、生物活性における相異がタンパク質フォールディングの変化から、及びオレイン酸のような特異的補助因子との関連から、どのようにして起こることができるかを明らかにしている。
【００８９】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、腫瘍又はその領域に注入することを含む癌を治療する方法が提供される。
【００９０】
特に、複合体は、適切な注入器具を使用して投与するのに適しており、そして特に、運搬促進送達技術（ＣＥＤ）が、特に効果的であることが見出された。
【００９１】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記において、明らかにされている。
【００９２】
本発明の第四の態様によれば、血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が提供される
【００９３】
そのような薬剤は癌、特に固形癌、及び急速に増殖しつつある固形癌を治療するために使用することができる。そうでない場合でも、これに加えて、腫瘍転位を遅延させるために投与することもできる。
【００９４】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体がこの結果を達成する機構は判っていない。ある種の効果は腫瘍細胞によって媒介されるであろうことが期待され得る。特に、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞を殺すので、血管新生活性化分子の供給が低下する。しかしながら、認められた効果から、付加的な効果が生じつつあることを示しているように見える。例えば、ＨＡＭＬＥＴは急速に増殖している血管細胞に対して、直接的な効果を持っている可能性があるようである。
【００９５】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体は、また、血管新生阻害が望ましい他の疾患を治療するために使用することもできる。
【００９６】
主として天然に存在するタンパク質として、ＨＡＭＬＥＴは、完全合成薬よりは低毒性であろうと信じられる。更に、複合体の免疫原性は、低いと信じられる。
【００９７】
本発明の第四の態様によって製造される薬剤は、好適には、例えばクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤のような局所使用するのに適した形態をした医薬組成物である。それらは、医薬として許容される、一般に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。
【００９８】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には、希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有する。
【００９９】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従い治療される状態の性質等によって変化し、そして依存する。通例、２から２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各投与に対して使用される。
【０１００】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、血管新生を阻害する方法が提供される。
【０１０１】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に明らかにされている。好ましくは、生物活性のある複合体は、また、上に記載したように、局所用組成物の形態で投与される。
【０１０２】
次に、本発明を、添付する図を参照しながら例示する方法により、詳細に説明する。
図１は、本発明による治療前後にとった、膀胱癌の内腔の写真を示す。
図２．ＨＡＭＬＥＴ−ヒトＧＢＭ腫瘍異種移植片のインビトロ及びインビボにおける構造及び機能
（ａ）ＨＡＭＬＥＴがＣａ2+の脱離により、及びＣ１８：１，９シス脂肪酸の付加により天然のα−ラクトアルブミンから形成される。図はα−ラクトアルブミンの結晶構造に基づく。
（ｂ）ＨＡＭＬＥＴに対するＧＢＭ細胞株の感受性。ＬＤ50＝６／２４時間における細胞の５０％を殺すに必要な濃度。（ｃ及びｄ）ヒトＧＢＭ腫瘍スフェロイド（矢印のところで注射した）を、ＨＡＭＬＥＴ（ｎ＝１０）又はα−ラクトアルブミン（ｎ＝１０）を２４時間注入前に１週間定着させた。α−ラクトアルブミン（１〜４）又はＨＡＭＬＥＴ（５〜８）で処置したラットにおいて個々の腫瘍のＭＲＩスキャンを、注入後２ヵ月実施した。（ｅ）平均腫瘍サイズは、α−ラクトアルブミン処置群におけるよりもＨＡＭＬＥＴの点滴注入動物において有意に小さかった（ｐ＜０.０１）。（ｆ）頭蓋内圧上昇の症状を記録し、そしてα−ラクトアルブミン対照において約２ヵ月後に生じたが、圧迫症状の発症はＨＡＭＬＥＴの点滴注入されたラットでは遅延した（ｐ＜０.００１）。
【０１０３】
図３．ＨＡＭＬＥＴによるアポトーシス誘導
（ａ）脳組織切片を、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンのＣＥＤ後１２時間に、担癌ラットから得た。ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬ染色によって示されるように、腫瘍領域内にアポトーシス（緑の蛍光、左パネル）及び核濃縮アポトーシス腫瘍細胞核（右パネル、倍率６００×）を豊富にした。ＨＡＭＬＥＴ処置動物及びα−ラクトアルブミン処置群において腫瘍の周辺の健全な脳組織にアポトーシスは観察されなかった。細胞核を、細胞ＤＮＡのプロピジウムヨージド染色を用いて目に見えるようにした（赤い蛍光）。
（ｂ）ＧＢＭスフェロイドを、インビトロでＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンで処置し、アポトーシス誘導を試験した。ＨＡＭＬＥＴ誘導アポトーシス（緑の蛍光）が、ヒトＧＢＭスフェロイド全体に見られたが、良性髄膜腫由来のスフェロイドにはなかった。
（ｃ）α−ラクトアルブミンは、ＧＢＭ又は髄膜腫スフェロイドのいずれにおいてもアポトーシスを促進しなかった（倍率３６０×）。多染色体細胞及び核濃縮アポトーシス細胞（ｂの矢印）が、ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドにおいて見出されたが、α−ラクトアルブミン群においては見られなかった（倍率４５０×）。
【０１０４】
図４．ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンでの前処置に続くＧＢＭスフェロイドの異種移植
各群６動物を、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンで３時間前処置した、樹立ヒトＧＢＭスフェロイド（各群４−５）で異種移植した。α−ラクトアルブミン前処置ＧＢＭ細胞を注入された全てのラットは、大きな腫瘍を発現した（ａ、１〜４）。ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドを注入された６動物中４動物は、腫瘍発現の徴候を示さず、少なくとも２１０日間生存した（ｂ、５〜８）。腫瘍をともかく発現したＨＡＭＬＥＴ群の２ラットは、有意により小さな腫瘍を示した（ｃ、ｐ＜０.０１）、そして圧迫症状の発症は遅延した（ｄ、ｐ＜０.０１）。
【０１０５】
図５．放射能標識ＨＡＭＬＥＴの分布
健全ラットの脳へ注入後の放射能標識ＨＡＭＬＥＴ（２〜１０×１０6ＰＰＭ）の分布（ｎ＝３、倍率９０×）を示す。文字は切片の位置、ｘは注入部位を示す。（ａ）前頭葉、（ｂ）大脳基底核、（ｃ）視床、及び（ｇ）黒質。
【０１０６】
図６．毒性の評価
健全ラットをＨＡＭＬＥＴ０.７ｍＭ、α−ラクトアルブミン０.７ｍＭ又はＮａＣｌ０.１５Ｍ（各群ｎ＝５）で処置した。潜在的な毒性は注入後３週間で分析した。
（ａ）ＭＲ画像のＴ２強調シグナルは、注入部位に小嚢胞性病変を示したが、毒性の放射線学的徴候はなかった。
（ｂ）注入脳半球由来の連続脳切片での組織病理は、健全な脳における毒性の証拠は示されなかったが、注入部位に隣接していくつかの組織損傷が見られた（矢印、ヘマトキシリン−エオジン染色、倍率１００×及び４００×）。
（ｃ）肝機能及び腎機能の生化学マーカーは、有意な毒性効果を現さなかった（両群において、ｐ＞０.０５）。
（ｄ）体重増加は、群間で差はなかった（ｐ＞０.５）。ハッチの棒（hatched bar）は、注入前の体重値、及び塗りつぶした棒（filled bar）は、注入後３週間の値である。
（ｅ）運動のオープンフィールド試験は影響なかった（ｐ＞０.０５、ネズミ色＝ＨＡＭＬＥＴ、薄い灰色＝α−ラクトアルブミン、白＝ＮａＣｌ）。
【０１０７】
図７〜図９は、局所ＨＡＭＬＥＴ処置、５日間後のヒト膀胱乳頭腫における血管の分解を図解した、次第に拡大した組織切片を示す。
【実施例１】
【０１０８】
膀胱癌を有する患者におけるＨＡＭＬＥＴの膀胱内注入
物質の製造及び患者の無作為化
母乳のドナーは、非喫煙者であり、ＨＡＭＬＥＴの製造前にＨＩＶについてスクリーニングした。α−ラクトアルブミンは、硫酸アンモニウム沈殿に次いでフェニル・セファロース・クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってヒトミルクホエーから精製された。ホスピタル・ミルクバンクからの余剰ミルクを未熟児に投与するための規則に従って使用した。ＨＡＭＬＥＴは、文献に記載されたようにして、オレイン酸で調節したイオン交換クロマトグラフィーで天然のα−ラクトアルブミンから生成したものである。溶離した分画を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１０９】
更に、ＨＡＭＬＥＴを、細菌汚染についてスクリーニングし、−２０℃で乾燥物質として保存した。
【０１１０】
研究デザイン：
新しく診断された、又は再発した膀胱の尿路上皮癌の手術待機患者を、研究に参加させるために招いた。インフォームドコンセントの後、患者に膀胱鏡検査を行って腫瘍サイズを評価し、そして内腔写真撮影（endoluminal photography）で病変を記録した。処置後、及び手術前に、膀胱鏡検査を繰り返して、腫瘍の大きさを再評価し、そして内腔写真撮影を実施した。
【０１１１】
ＨＡＭＬＥＴの膀胱内点滴注入を、厳重な観察下に外来診療で実施した。点滴注入は、１日１回行い、５日間繰り返した。導尿後、膀胱を完全に空にし、尿を分析のために集めた。ＨＡＭＬＥＴ（２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｌ）を膀胱に貯め、カテーテルを除去し、患者に、少なくとも２時間点滴注入を保持するよう求めた。利尿を減らすため、患者には、点滴注入前４時間及び点滴注入直後は液体摂取しないよう求めた。尿試料は、点滴注入前、及び各点滴注入後最初の排尿から、採取された。
【０１１２】
ＨＡＭＬＥＴの点滴注入は、患者の通常の取り扱いを妨害することなく、又遅延することのないように計画した。
【０１１３】
患者：７名の男性患者を研究に含めた。標準腫瘍分類に基づいて、患者は、３つの群、Ａ、Ｂ及びＣに割り当てた。
【０１１４】
患者Ａ１及びＡ２（９２才及び８６才）は、膀胱の分化の乏しい筋肉侵襲尿路上皮癌（Ｔ４ｇ３）であった。高齢であるので、これらの患者には、腫瘍の経尿道的電気切除術（Ｔ−ＴＵＲ）の繰り返しのような、暫定処置、鎮痛剤及び臨床観察を行った。両患者とも、頻回及び刺激性の軽い下部尿路症状を罹患していたが、高齢にもかかわらず、これ以外は健康であった。
【０１１５】
患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（それぞれ、３７才、７５才、７０才、８２才）は表在性乳頭腫状膀胱腫瘍（ＴＡｇ１−２）を有していた。患者Ｂ１及びＢ３は、新しく診断された腫瘍であり、患者Ｂ２及びＢ４は、以前から知られていた高度分化、表在性膀胱腫瘍（ＴＡｇ１）の再発であった。患者Ｂ１及びＢ４は、それらの腫瘍以外は健康であったが、患者Ｂ２は、心硬化症と合併した高血圧に罹っていた。患者Ｂ３は、高血圧症及び慢性気管支炎に罹患していた。患者Ｃ１（７２才）は、以前から判っている膀胱の上皮内癌（ＣＩＳ）の多病巣性徴候を有していた。彼は、加わる前１年間に、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）の膀胱内注入を受けていた。膀胱生検では、最初ＢＣＧ治療に対する反応を示した。加わる前に、ＣＩＳの再発が、生検試料で診断されていた。この患者は、その他の点では健康であった。
【０１１６】
治療結果：
全ての患者は、５日間、ＨＡＭＬＥＴの膀胱内注入を毎日受けた。点滴注入の副作用は、どの患者も経験しなかった、そしてＣＲＰ、発熱又は末梢好中球数のような全身性炎症パラメーターの反応はなかった。
【０１１７】
患者Ａ１及びＡ２は、下部尿路機能不全のために膀胱にＨＡＭＬＥＴ溶液を保持することが困難であった。治療効果は評価することができなかった。患者Ｂ１は、５日間のＨＡＭＬＥＴの点滴注入後、腫瘍のほぼ完全な縮小を示した。
【０１１８】
患者Ｂ２は、腫瘍サイズの縮小は小さかったが、しかし腫瘍の性質の顕著な変化がみられた。治療前、腫瘍は、接触に対して、出血したが、治療後は、表面は「乾燥」した。患者Ｂ３は、１枚の写真ではとらえるには余りにも大きすぎる、左膀胱壁の乳頭腫を担癌していた。膀胱内ＨＡＭＬＥＴの点滴注入後、目で見た腫瘍の大きさの評価で、約５０％の大きさの減少を示した。患者Ｂ４は、左膀胱頸部に２つの小さな外向発育腫瘍を有していた。腫瘍の大きさの明らかな縮小はなかったが、表面萎縮性の腫瘍の性質において著しい変化があった。
【０１１９】
患者Ｃ１は、外向発育腫瘍の増殖がないので、評価するのは困難であった。ＨＡＭＬＥＴの点滴注入の前に、３／３膀胱生検（「地図作成」）では、上皮内癌を示したが、しかし、５日間の治療後、１／３生検のみが陽性であった。
ＴＵＮＥＬ陽性、アポトーシス性癌細胞が検出された。
【０１２０】
肉眼的には健全な膀胱粘膜からの生検を、患者５名について行った。これらの生検において同定されたＨＡＭＬＥＴ治療の効果はなかった。
【０１２１】
本発明者等は、ＨＡＭＬＥＴ治療は膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導し、腫瘍の体積及び肉眼的外観に顕著に影響すると結論づけた。
【実施例２】
【０１２２】
ＨＡＭＬＥＴの製造
ＨＡＭＬＥＴを、Ｃ１８：１，９シス脂肪酸（Svensson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:4221-4226）で、前調整処理したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭ（BioSepra, France）のイオン交換クロマトグラフィーによって、アポα−ラクトアルブミンから製造した。ＨＡＭＬＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）の125Ｉ標識は、ラクトペルオキシダーゼ法（Hakansson et al., Proc. Natl. Sci. USA 92:8064-8068）によった。
【０１２３】
腫瘍組織及び細胞株
Haukeland University Hospital (Bergen, Norway) で、その医学倫理委員会の許可を得て、右前頭葉及び側矢状髄膜腫のＧＢＭから腫瘍生検を集めた。直径３００μｍのスフェロイドを培養し、移植に使用した（Bjerkvig et al., J. Neurosurg. 72:463-475）。神経膠腫細胞株は、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・２３６５、Ｄ−５４ＭＧ及びＵ−２５１ＭＧであった。Ａ５４９肺癌株はＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５であった。充分に分化したネズミ脳細胞の単個細胞浮遊液を、完全に成長したマウスの脳を解剖し、１％トリプシン（Sigma Chemicals Inc., St. Louis, MO, USA）でＤＭＥＭ培地（GibcofBRL, Life Technologies Ltd. Paisley, Scotland）中で、３０分間、室温にて解離し、０.２４％ＤＮａｓｅ及び１％ＦＣＳ（Sigma Chemicals Inc., St. Louis, MO, USA）を加え、次いで機械的破壊によって、調製した。生存率は＞９９％であった。
【０１２４】
ヒトＧＢＭのヌードラットへの異種移植
全ての実験は、国立動物研究委員会によって承認されており、科学的目的のために使用される脊椎動物の保護に関するヨーロッパ条約に従って行われた。Haukland Hospitalで飼育された、ヌードラット（Han: rnu/rnu Rowett）を、Equitisinの腹腔内注射によって麻酔し、穿孔術のために定位フレーム（David Kopf, model 900, Tujunga, CA, USA）におき、５生検スフェロイドを含有したＰＢＳ約５〜１０μｌを線条体に注射した。ラットを、無抵抗、不器用及び不全麻痺のような頭蓋内圧の亢進症状を発症するまで毎日モニターした。１.５テスラのSiemens Magnetom Vision装置（Erlangen, Germany）及び脳解析用フィンガーコイルを使用して、腫瘤を磁気共鳴スキャンによって定量した。約１００万細胞の移植から圧迫症状までの平均時間は、約２ヵ月であって、その時点で、動物を殺処分した。
【０１２５】
無処置の脳へのＨＡＭＬＥＴの運搬促進送達
ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミン（０.１５Ｍ・ＮａＣｌ中０.７ｍＭ）を、浸透圧ミニポンプ（ADO1, Alzet Inc., Mountainview, CA, USA）に接続した２６ゲージカニューレを通して投与した。腫瘍の領域には、カニューレを外す前２４時間にわたって８μｌ／時間で注入した。125Ｉ放射能標識ＨＡＭＬＥＴ（０.１５Ｍ・ＮａＣｌ中０.７ｍＭ、２〜１０×１０6ＰＰＭ）を記載したようにして投与した。ＨＡＭＬＥＴの分布を、全体に注入した脳半球からの連続脳切片のオートラジオグラフィーによって確認した。
【０１２６】
組織分析
脳をTissue-Tec（Sakura Finetek Inc., Torrance, CA, USA）に急速に包埋し、液体窒素で凍結した。連続軸方向１０μｍ切片を、Reichert Jung Cryostat（Reichert, Vienna, Austria）でカットした。アポトーシスを起こした細胞をＴＵＮＥＬアッセイ（Roche, Basel, Switzerland）によって検出し、封入剤と共にカバーグラスをした（Vectashield, Vector Labs Inc., Burlingame, CA, USA）。細胞核をプロピジウムヨージド（Propidium iodide）（１０μｇ／ｍｌ、３０秒間）で対比染色し、Leicaスキャナーで試験した。並列切片を、ヘマトキシリン−エオジンで染色し、Entellan（Merck, Darmstadt, Germany）に封入した。凍結アーチファクトがなく、ＦＩＴＣ（ＴＵＮＥＬ）とＴＲＩＴＣ（プロピジウムヨージド）に対する許容されるシグナル／ノイズ比を有する切片を特定し、各腫瘍又はスフェロイドの中心からの代表的な切片１つを形態計測解析にかけた。ＦＩＴＣ及びＴＲＴＴＣ陽性核プロフィールがバックグランド上に明確に視認でき、プリントした絵から計測した。結果は、プロピジウムヨージド陽性核のパーセントのＴＵＮＥＬ陽性として表される。
【０１２７】
ＨＡＭＬＥＴでのインビトロ処置
樹立したスフェロイド（各群４〜５）を無血清培地に移し、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンと３時間インキュベートし、直ちにヌードラットの脳内に移植した。アポトーシスを分析するために、スフェロイドをＤＭＥＭに戻し、更に２１時間インキュベートし、連続切片作成後、形態計測でＴＵＮＥＬアッセイによって試験した。細胞株を記載されたようにして培養し（Hakansson et al. 前述）、剥離し、収集し、洗浄し、そしてＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンに２４時間曝露した。アポトーシスを、トリパンブルー排除によって評価した細胞生存の喪失（計数細胞１００当たりの死亡細胞の％）として測定し、ＤＮＡ断片化を電気泳動によって検出した（Zhivotovsky et al., FEBS Lett. 351:150-154）。
【０１２８】
毒性試験
ＨＡＭＬＥＴ（０.７ｍＭ）、α−ラクトアルブミン（０.７ｍＭ）又はＮａＣｌ（０.１５Ｍ）をラットに与え、注入後３週間分析した。腫瘤を、１.５テスラのSiemens Magnetom Vision装置（Erlangen, Germany）及び脳解析用フィンガーコイルを使用して、磁気共鳴スキャンによって定量した。組織病理を、ヘマトキシリン−エオジンを用いて上に記載したようにして検討した。肝機能及び腎機能の生化学マーカー及びＣＲＰを定量した。体重を注入前及び注入後３週間記録した。脳機能をオープンフィールドテストで評価した。ラットを、黒い壁（２０ｃｍ）で囲まれたオープンフィールド箱（１００×１００ｃｍ）中においた。床は、白いストライプによって２５の同じ区域（２０×２０ｃｍ）に分けた。動物を中心の区域におき、彼らの動きを６分間、手作業で点数付けした。各運動性のカウントは、両後肢で区域の境界を横断したことで表され、方向を右又は左として記録した。実験は、盲検法で、防音室中で午前１０時及び午前２時の間に行った。
【０１２９】
統計解析
群はＴ検定、一元配置分散分析（事後最小有意差）で比較し、生存率はカプラン・マイヤー分析によった。
【０１３０】
結果
ＧＢＭ異種移植モデル
二つの実験モデルがインビボでＧＢＭ治療を研究するために開発された。神経膠腫細胞株はインビトロで効率的に増殖し、移植後脳内腫瘍をいつも産生する；しかし、これらの腫瘍は、インビボでは非侵襲性であり、それ故に、ヒト疾患のモデルとしては余り好適ではない。ヒトＧＢＭ生検スフェロイドは、対照的に、ヌードラットに異種移植後侵襲性増殖挙動を保持している。インビトロスフェロイド培養ステップは、再現可能な腫瘤を得るため、及び臨床症状の出現を同調させるために必須である。このモデルは、それ故、ヒトＧＢＭ疾患に関連する治療モデルを提供し、腫瘍領域への治療分子のＣＥＤと組み合わせることができる。
【０１３１】
ＨＡＭＬＥＴはヒト神経膠腫異種移植片の増殖を阻害する
実験的ＧＢＭが、ヒトＧＢＭ生検スフェロイドのヌードラット脳への異種移植によって確立された（Engebraaten et al., J. Neurosurg. 90:125-132）。異種移植片はヒトＧＢＭの浸潤性増殖を示し（図２ｃ）、対照ラットは、約２ヵ月後発症した（図２ｆ）。
【０１３２】
ＣＥＤは、ＨＡＭＬＥＴ（０.７ｍＭ）を脳の異種移植した領域に投与するのに使用された。天然の、折り畳まれたα−ラクトアルブミンが対照として使用された。処置前に、腫瘍細胞は、宿主の脳内に一体化するよう１週間おかれた。
【０１３３】
ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンを２４時間ＣＥＤによって投与した。各群の２動物は、麻酔中に死亡し、各群の４動物は、１２時間後殺処分した。それらの脳を、組織検査、ＴＵＮＥＬアッセイ及び形態計測解析用に、直ちに凍結した。
【０１３４】
残りの動物は、２ヵ月間毎日モニターされ、腫瘍体積を、α−ラクトアルブミン処理対象動物が発症したときの７週間後ＭＲＩによって評価した。高Ｔ２強調シグナルを有する大きなＧＢＭ移植体が、全てのα−ラクトアルブミン処置動物において観察することができ、平均腫瘍体積は４５６（範囲２９２〜４８５）ｍｍ3を有していた（図２ｃ及びｅ）。ＨＡＭＬＥＴ注入ラットは、有意に小さい腫瘍体積を示した（図２ｄ及びｅ、平均６３、範囲１０〜１３１ｍｍ3、ｐ＜０.０１）。ＨＡＭＬＥＴ処置は、また、圧迫症状の発症を遅延させた。α−ラクトアルブミンを投与されたラットは、第５９日に発症し、第６９日に全ての動物が殺処分された。このとき、ＨＡＭＬＥＴ治療群の全動物は、無症候のままであった（図２ｆ、ｐ＜０.０１）。ＨＡＭＬＥＴ処置ラットは、最終的には、圧迫症状を発症し、典型的なＧＢＭ腫瘍で死亡し、組織学的試験で多型細胞型及び偽柵状構造を示した。
【０１３５】
ヒトＧＢＭ異種移植片における選択的腫瘍細胞アポトーシス
アポトーシス誘導を、ＤＮＡ鎖切断を標識したＴＵＮＥＬアッセイを用いてインビボで試験した。ＣＥＤ完了の１２時間後に得られた組織の形態計測解析は、ＨＡＭＬＥＴ処置ＧＢＭ細胞の３３±７％が、α−ラクトアルブミン群における２±２％に比較して、ＴＵＮＥＬ陽性であった（図３ａ、ｐ＜０.００１）。アポトーシス効果は、通常の組織病理学によって確認され、ＨＡＭＬＥＴ処置動物において典型的な核濃縮及び核凝縮を示した（図３ａ）。腫瘍を囲んでいる宿主の脳は、移植脳半球内へのＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンのＣＥＤ後アポトーシス又は壊死の証拠を示さなかった（図３ａ）。
【０１３６】
ＨＡＭＬＥＴは、インビトロでＧＢＭ生検スフェロイドにおけるアポトーシス様死を誘導する
ＧＢＭ細胞におけるアポトーシスを誘導するＨＡＭＬＥＴの能力を、インビトロで確認した。同じヒトのＧＢＭ由来の生検スフェロイドをインビトロでＨＡＭＬＥＴに曝露し、アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって同定し、同時にプロピジウムヨージド対比染色で総細胞集団を可視化した。ＨＡＭＬＥＴ処置ＧＢＭスフェロイドは、スフェロイドの全体積の至るところに豊富なＴＵＮＥＬ染色を示した（図３ｂ）。形態計測によって、核の９３±７％（平均±ＳＤ）がアポトーシスになっていることが見出された。ＴＵＮＥＬ陽性細胞が、０.３５ｍＭ又はそれより高い濃度でＧＢＭスフェロイドの全体積の至るところに観察され、治療研究のために選択された濃度の妥当性が確認された。組織病理によって、核濃縮及び核凝縮が、ＨＡＭＬＥＴに曝露されたＧＢＭに観察された（図３ｂの矢印を参照）。
【０１３７】
α−ラクトアルブミンで処置された対照のスフェロイドは、表面から少数のアポトーシス細胞が抜け落ちているのが見られたが、しかしＴＵＮＥＬ陽性細胞はスフェロイドの内部には見られなかった。そしてα−ラクトアルブミンに曝露されたＧＢＭスフェロイドと媒体対照との間に、アポトーシス細胞の頻度に差はなかった。両者は、ＨＡＭＬＥＴ処理スフェロイドと有意に差があった（ｐ＜０.００１）。ＨＡＭＬＥＴは、良性髄膜腫の患者由来の生検スフェロイドでアポトーシスを誘発しなかった（図３ｃ）。
【０１３８】
ＧＢＭスフェロイドのインビトロ前処置で治療効果を確認した
ＧＢＭ生検スフェロイドを、３時間インビトロでＨＡＭＬＥＴに曝露し、記載されているようにして、ヌードラットの脳に異種移植した。α−ラクトアルブミンで処置したスフェロイドを対照とした。腫瘍の大きさは、２ヵ月後ＭＲＩスキャンによって推定した。腫瘍は、α−ラクトアルブミン処置スフェロイドを投与された全てのラットに発症した（図４ａ）。腫瘍の平均的な大きさは、４９６（範囲２８６〜６９６）ｍｍ3であり、そしてラットは第５６日から症状を発現した（図４ｃ及びｄ）。この時点では、ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドは、検出可能な腫瘍を有しており、これらの腫瘍は、平均体積３１（範囲２８〜３４）ｍｍ3を有し、α−ラクトアルブミン対照におけるよりも小さかった（図４ｂ及びｃ）。より小さい腫瘍を有するラットは、８４日後圧迫症状を発症した。残りの動物は、移植後２１０日の殺処分の時点で腫瘍はなく、無症候性であった（図４ｄ、ｐ＜０.０１）。
【０１３９】
ＨＡＭＬＥＴは注入した脳半球の至るところに到達する
ＣＥＤによるＨＡＭＬＥＴ投与の効率を調べた。125Ｉ放射標識ＨＡＭＬＥＴ（２〜１０×１０6ＰＰＭ）を線条体に挿入した針を用いてＣＥＤによって注入し、脳全体のＨＡＭＬＥＴの分布を、連続脳切片に対するオートラジオグラフィーによって検出した（図５）。ＨＡＭＬＥＴは、ＣＥＤの完了後１２時間で、前脳から中脳までの全ての注入した半球に到達したことが示された。
【０１４０】
ＨＡＭＬＥＴの治療濃度は健康な脳組織に対して有毒でない
ＨＡＭＬＥＴの潜在的な脳毒性を、健全なラットの線条体に入れたＣＥＤ後３週間、ＭＲＩ及び組織病理によって試験した。先の実験と同様に、α−ラクトアルブミン又は生理食塩水を対照とした。ＭＲＩによって、小嚢胞性病変が注入部位に見られたが、注入カニューレによって貫通された大脳皮質を含めて周辺の脳に浮腫又は組織損傷の徴候はなかった（図６ａのＴ２強調スキャンを参照）。ＨＡＭＬＥＴと対照群の間に放射性の差はなかった。
【０１４１】
注入された脳の組織病理学的分析は、反応性小神経膠細胞、マクロファージ及び少数の反応性星状細胞を含む亢進した細胞充実性を伴なって、注入部位に隣接していくつかの組織損傷を示した。周辺部脳実質に有意な毒性の神経病理学的徴候はなく、ＨＡＭＬＥＴ処置群と対照群の間に差はなかった（図６ｂ）。
【０１４２】
生化学マーカー及び体重変化を、注入後３週間モニターした。ＨＡＭＬＥＴ、α−ラクトアルブミン及びＮａＣｌ処置ラットの間に差は見られなかった（全群において、ｐ＞０.０５）（図６ｃ及びｄ）。
【０１４３】
運動及び挙動における変化を、注入後３週間オープンフィールド試験によって評価した。ラットを、オープンフィールドチェッカーボードにおき、新しい区画への横断数を記録した。有意な運動障害は検出されなかった（図６ｅ）。
【実施例３】
【０１４４】
膀胱癌を有する患者における腫瘍への血液供給に対するＨＡＭＬＥＴの膀胱内点滴注入の効果
上記実施例１に報告された試験に続いて、治療した腫瘍の生検試料を、この治療の終了時にとった。結果を、図７から９に示す。これらの図から明らかなように、内膜は失われ、血球が腫瘍の中心部全体に存在しており、このことは血管新生が阻害されたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明による治療前後にとった、膀胱癌の内腔の写真を示す。
【図２】ＨＡＭＬＥＴ−ヒトＧＢＭ腫瘍異種移植片のインビトロ及びインビボにおける構造及び機能を示す。
【図３】ＨＡＭＬＥＴによるアポトーシス誘導を示す。
【図４】ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンでの前処置に続くＧＢＭスフェロイドの異種移植の結果を示す。
【図５】健全ラットの脳への注入後の放射能標識ＨＡＭＬＥＴの分布を示す。
【図６】健全ラットをＨＡＭＬＥＴ、α−ラクトアルブミン、又はＮａＣｌで処置した場合の毒性の評価を示す。
【図７】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を組織切片で示す。
【図８】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を次第に拡大した組織切片で示す。
【図９】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を次第に拡大した組織切片で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの望ましからざる細胞又は組織増殖を伴う状態を治療する方法、及びそのような状態の治療のための薬物の製造における生物学的に活性のある複合体の使用に関する。特に、これらの状態は、膀胱癌、メラノーマ、内部器官の癌のような、悪性粘膜腫瘍又は癌、特に、脳腫瘍、及びその他の状態、例えば血管新生の阻害が望ましい癌を含む。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新しい血管を形成する過程である。それは、通常、人体において、発生及び成長における特定の時期に生じる。例えば、胚は動脈、静脈及び毛細血管の広大なネットワークを必要とする。脈管形成と呼ばれる過程は、将来主要な血管となる血管内皮細胞の最初のネットワークを創成する。後程、血管新生は、このネットワークを、小児の循環系を完成する小さな新しい血管又は毛細血管へと作り直す。
【０００３】
新しい血管の増殖は、また、成人でも起こる。婦人においては、新しい血管が排卵周期の期間に、子宮の内面に形成するので、血管新生が各月に数日間活性となる。また、血管新生は、創傷治癒の間に組織の修復又は再生に必要である。
【０００４】
血管内皮細胞は、血管新生によって刺激されない限り、殆んど分裂しない。血管新生は、活性化因子及び阻害分子の両者によって制御されている。通常、阻害分子が優性で、成長を妨害している。新しい血管の必要性が生じた場合、血管新生活性化因子の数が増し、阻害分子が減少し、かくして血管内皮細胞の増殖及び分裂が起こるように促し、最終的に、新しい血管の形成が起こる。
【０００５】
１９６０年代以前には、癌研究者は、単に既存の血管が拡張して血液が腫瘍に到達すると信じていた。しかしその後の実験は、癌性の腫瘍が成長を保ち、広がっていくために、血管新生が必要であることを示した。
【０００６】
腫瘍血管新生は、栄養及び酸素を供給し、老廃物を除去する癌性増殖に浸透する血管のネットワークの増殖である。それは、腫瘍細胞が、新しい血管の増殖を促すためにある種の遺伝子やタンパク質を活性化するよう、周辺の正常な宿主組織に信号を送る分子を放出する場合に始まる。
【０００７】
癌細胞によって産生される小活性化分子が、周囲の組織における血管新生の信号を送る。十数個の異なったタンパク質、及びいくつかのより小さな分子が「血管形成性」として同定されている。これらの中には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）がある。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、多くの癌細胞によって産生され、そしてある種の型の正常細胞によっても産生される。
【０００８】
ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦは、最初腫瘍細胞内部で合成され、次いで周囲の組織に分泌される。ＶＥＧＦ又はｂＦＧＦのいずれも適切な受容体に結合して、内皮細胞の核への情報伝達カスケードを活性化する。核の情報は、究極的には、新しい内皮細胞増殖に必要とされる産物をつくるよう一群の遺伝子を促す。
【０００９】
ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦによる内皮細胞の活性化は、新しい血管の創成に向かって一連のステップを動かす。先ず、活性化された内皮細胞は、特殊なクラスの分解酵素である、マトリックスメタロプロテイナーゼ類（ＭＭＰ）を産生する。これらの酵素は、次いで、内皮細胞から周囲の組織へと放出される。ＭＭＰは、細胞間の空間を満たしており、そしてタンパク質及び多糖類でつくられている細胞外マトリックス支持物質を分解する。
【００１０】
このマトリックスの分解は、内皮細胞の移動を可能とする。それらが周囲の組織へと移動するにつれて、活性化された内皮細胞は分裂を始める。すぐにそれらは組織化して中空管となり、中空管は血管の成熟したネットワークへと徐々に発達する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
多くの腫瘍は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのような血管新生性分子を産生するが、それらの存在は、血管増殖を開始するには充分でない。血管新生を開始するためには、これらの活性化分子は、通常は血管増殖を抑止する種々の血管新生阻害分子に打ち勝たなければならない。
【００１２】
十数個の天然に存在する殆んどのタンパク質が、血管新生を阻害することができる。この分子の群の中で、アンジオスタチン、エンドスタチン及びトロンボスタチンと呼ばれているタンパク質が、特に重要であるように見える。血管新生阻害分子の濃度とＶＥＧＦ及びｂＦＧＦのような活性化分子の濃度の間を精密に調整したつり合いは、腫瘍が新しい血管の増殖を誘導することができるかどうかを決める。血管新生の引き金を引くためには、活性化分子の産生が阻害分子の産生を減少するように増加しなければならない。
【００１３】
血管新生阻害分子の発見は、そのような分子が癌の増殖を治療的に停止又は抑止するであろうかという疑問を惹き起こす。研究者は、動物を含んだ多くの実験でこの疑問に取り組んでいる。一つの特筆すべき研究で、数種の異なった癌の種類を持ったマウスをエンドスタチンの注射で治療した。２、３サイクルの治療の後に、注射された癌細胞の部位に生じた最初（原発）の腫瘍は殆んど消失し、再使用の後に、その動物は、エンドスタチンの効果に対する抵抗性を発現しなかった。
【００１４】
エンドスタチンのような血管新生阻害分子が原発性腫瘍の増殖を抑止することができるという発見は、そのような阻害分子が腫瘍転移を遅延させることができるかもしれないという可能性を提起する。
【００１５】
原発腫瘍に由来する癌細胞は、別の器官に広がることができ、長期にわたって休眠状態のままにいることができる小さな微視的な腫瘍塊（転移）を形成することができることが長年にわたり知られている。この腫瘍休眠についての同様な説明は、血管新生は起こらず、従って小腫瘍は継続した増殖に必要な新しい血管が欠けているというものであった。
【００１６】
腫瘍休眠についての一つの可能性のある理由は、いくつかの原発腫瘍は血流中に阻害分子アンジオスタチンを分泌し、次いで身体中を循環し、そして別の部位で血管増殖を阻害すると云うものである。これが、微視的転移の目に見える腫瘍への増殖を防止可能にする。
【００１７】
血管新生の過程を妨害することによって腫瘍増殖を停止できるという考えに対する付加的な支持が、マウスの遺伝子の研究からもたらされている。科学者は、最近、ＩＤ１及びＩＤ３と呼ばれる、２つの遺伝子を欠くマウスの系統で、その欠損が血管新生を妨害するものを創成した。マウス乳癌細胞をそのような血管新生欠損突然変異マウスに注射すると、短い腫瘍増殖の期間があるが、しかし腫瘍は２、３週間後に完全に退行し、マウスは癌の影も形もなくなって健康を維持している。対照的に、同じ乳癌細胞を注射した正常マウスは、２、３週間以内に癌で死亡する。
【００１８】
同じ系統の血管新生欠損突然変異マウスに肺癌細胞を注射すると、結果は若干異なっている。肺癌細胞は、突然変異マウスの腫瘍に成長するが、しかし腫瘍は正常マウスにおけるよりもよりゆっくりと増殖し、他の臓器に広がる（転移する）ことができない。その結果、突然変異マウスは、同じ種類の肺癌細胞を注射された正常マウスよりもより長く生存する。
【００１９】
結果として、血管新生を阻害すると、ヒトにおける癌細胞の増殖及び広がりを遅くする又は防止することができると現在信じられており、その結果として、多くの血管新生阻害剤が、目下癌患者において試験されている。
【００２０】
試験されている阻害剤は、それらの作用機作によっていくつかの異なった範疇に分類される。或るものは内皮細胞を直接阻害し、他のものは血管新生情報伝達カスケードを阻害し、又は細胞外マトリックスを破壊する内皮細胞の能力を妨害する。
【００２１】
ＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞を致死させるヒトα−ラクトアルブミン）（以前はＭＡＬとして知られていた）は、形質転換細胞におけるアポトーシスを誘導するが、しかし健康な分化細胞には危害を加えないアルファ・ラクトアルブミン（α−ラクトアルブミンとしても表される）の活性なフォールディング変異体である（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面に結合すること、細胞質中に転位すること及び細胞核中に蓄積すること、その結果ＤＮＡ断片化をもたらすこと、が示されている（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。ミルク及び特にヒトのミルクから得られる、この型の生物活性のある複合体は、抗菌剤としての使用と共に、例えば、欧州特許第０７７６２１４号に記載されている。
【００２２】
ＨＡＭＬＥＴの細胞標的は、共焦点顕微鏡及び細胞下分画法の組合せによって試験されている（Hakansson et al., 1999, Exp. Cell Res. 246, 451-60）。ＨＡＭＬＥＴは細胞表面に結合し、細胞質に入り、そこでミトコンドリアと相互作用しそれを活性化する。最後に、タンパク質が細胞核に入り、そこで蓄積する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本出願人は、抵抗性細胞及び感受性細胞がそれらの表面に同じような効率でＨＡＭＬＥＴを結合し、これが特異な事象ではないことを示唆しているのを見出した。対照的に、核への蓄積は、死細胞のみに起こり、このステップにより、感受性腫瘍細胞が抵抗性細胞から区別されることを示唆している。共焦点顕微鏡によって、核への蓄積は不可逆的に現れ、このことは、核分画においてＨＡＭＬＥＴを結合及び保持する核標的の存在を示唆している。
【００２４】
今日まで、ＨＡＭＬＥＴについて報告された研究は、インビトロで、形質転換細胞はＨＡＭＬＥＴに感受性であり、それが癌治療に応用されることを示唆していることを示している。しかし、インビトロで見られた効果及びインビボで観察された効果の相関関係は、特に、インビボで見出された状態が腫瘍の性質及び部位によって変化するので必ずしも直接的なものではない。例えば、身体の異なった器官に見出される異なった状態によって、いずれの治療剤においても、その安定性、及びそれ故にその効果が影響されうる。
【００２５】
しかしながら、本出願人は、ＨＡＭＬＥＴがヒト細胞に対してインビボで活性を保持し、それ故にそれが、特にある種の例において、有用な抗癌療法であることを見出した。
【００２６】
更に、今や見出されたことは、ＨＡＭＬＥＴが、また、血管新生に対して阻害効果を有しているようであり、それは、以前に注目されていた殺腫瘍活性から単純に期待されるであろうよりも大きいものであると信じられることである。このことは、分子の細胞効果の高度に選択的な性質を考えると、意外なことである。結果として、それは複合体の潜在的な治療範囲を拡大するものである。
【００２７】
本発明の第一の態様によれば、動物、特にヒトの、増殖性疾患の治療に使用するための及び／又は血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００２８】
増殖性疾患の特別な例は癌である。
【００２９】
一つの態様において、本発明は、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を腫瘍に適用することによる、インビボでの、特にヒトにおける癌を治療する方法を提供する。この目的のために、生物活性のある複合体が、癌療法において使用するための薬剤の製造において使用される。
【００３０】
本出願人は、ＨＡＭＬＥＴ及びこの型の複合体は、粘膜腫瘍、特に膀胱腫瘍の治療に使用するとき予想外に良好な結果を生じることを見出した。
【００３１】
本発明の第二の態様によれば、ヒトの粘膜癌の治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００３２】
粘膜表面で見出される状態は、ｐＨその他のような性質に関して非常にユニークな可能性がある。粘膜表面は、とりわけ、鼻腔において、口、咽喉、食道、肺、胃、大腸、膣及び膀胱において見出される。本発明によって治療され得る特別な粘膜表面は、咽喉、肺、大腸及び膀胱表面の腫瘍を包含する。本発明は、特に、膀胱癌の治療に応用し得る。
【００３３】
しかしながら、今や見出されたことは、ＨＡＭＬＥＴは、血管新生に対して阻害効果も有しているようであり、それは、以前に注目されていた殺腫瘍活性から単純に期待されるであろうよりも大きいものであると信じられることである。このことは、分子の細胞効果の高度に選択的な性質を考えると、意外なことである。結果として、それは複合体の潜在的な治療範囲を拡大するものである。
【００３４】
本発明の第四の態様によれば、血管新生の阻害のための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が提供される。
【００３５】
そのような薬剤は、癌、特に固形癌、及び特に急速に増殖しつつある固形癌の治療のために使用することができる。そうでない場合でも、それに加えて、腫瘍転移を遅延させるために投与することもできる。
【００３６】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体がこの結果を達成する機構は判っていない。ある種の効果は腫瘍細胞によって媒介されているであろうことが期待され得る。特に、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞を殺すので、血管新生活性化分子の供給が減少する。しかしながら、注目した効果は、付加的な効果が生じつつあることを示唆している。例えば、ＨＡＭＬＥＴは急速に増殖しつつある血管細胞に対して、直接的な効果を有している可能性があるようである。
【００３７】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体は、また、血管新生阻害が望ましいその他の疾患を治療するために使用することもできる。
【００３８】
主として天然に存在するタンパク質として、ＨＡＭＬＥＴは、完全合成薬よりも低毒性であろうと信じられる。更に、複合体の免疫原性は低いと信じられる。
【００３９】
本発明の第四の態様によって製造される薬剤は、好適には、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤のような局所使用するのに適した形態をした医薬組成物である。これらは、医薬として許容される、一般に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤（expedients）を包含することができる。
【００４０】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有する。
【００４１】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従い治療される状態の性質等によって変化し、そして依存する。通例、２から２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各投与に対して使用される。
【００４２】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、血管新生を阻害する方法が提供される。
【００４３】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に明らかにされている。好ましくは、生物活性のある複合体は、上にも記載したように、局所用組成物の形態で投与される。
【００４４】
本明細書で使用されるものとして、用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体（このものは起源がヒトであっても、そうでなくてもよい）を表し、ｐＨ４.６で沈殿したミルクのカゼイン分画から単離することによって、例えばＥＰ−Ａ−０７７６２１４に記載されているような陰イオン交換クロマトグラフィーとゲル・クロマトグラフィーの組合せによって、又は、国際公開第９９／２６９７９号に記載されたようなＣ１８：１脂肪酸として特徴づけられるヒトミルクカゼイン由来の補助因子の存在下で、α−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって、得ることができる。類似の活性を有するこの複合体の変異体又は誘導体は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１２９３号に記載されている。
【００４５】
α−ラクトアルブミンは、ヒト、ウシ、ヒツジ及びヤギのミルクを含む種々の哺乳類源から得られるが、好ましくは、ヒト又はウシであり、最も好ましくはヒトから得られる。タンパク質の組換え体の形態も、また、採用してもよい。
【００４６】
他の試薬及び特にオレイン酸のような脂質が、ヒトα−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換に有用であることも見出されている。特に、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）がＨＡＭＬＥＴ産生に必要であることが以前に報告されている（M. Svensson, et al., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4221-6）。より最近になって、他の脂肪酸が同様に補助因子として作用するであろうことが見出されている。α−ラクトアルブミンのＨＡＭＬＥＴへの変換のための至適な補助因子は、９位又は１１位においてシス立体配置の二重結合を有するＣ１８：１脂肪酸である。
【００４７】
α−ラクトアルブミンは、４つのジスルフィド結合（６１−７７；７３−９１；２８−１１１及び６−１２０）によって連結された、４つのα−ヘリックス（残基１−３４、８６−１２３）及び逆平行β−シート（残基３８−８２）を有する１４.２ｋＤａの球状タンパク質である（K. R. Acharya, et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。α−ラクトアルブミンの天然の立体配座は、Ａｓｐ８２、Ａｓｐ８７及びＡｓｐ８８の側鎖カルボン酸、Ｌｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素、及び２つの水分子によって配位された、高親和性Ｃａ2+結合部位によって規定される（K. R. Acharya, et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。タンパク質は、低ｐＨに曝された場合の、又は強く結合したＣａ2+イオンを放出するキレート剤の存在下でのＨＡＭＬＥＴにおいて見出される、いわゆるアポ配座をとる（D. A. Dolgikh, et al., (1981), FEBS Lett., 136, 311-5; K. Kuwajima, (1996), Faseb J., 10, 102-09）。
【００４８】
生物活性のある複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは、一般的に、立体配座の変化又はフォールディングの変化の両者、並びに脂質の存在を必要とする。立体配座の変化は、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンの脱離によって好適に起こる。好ましい実施態様において、このことは、機能的カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体を使用して好適に促進される。
【００４９】
そのような変異体を含有する生物活性のある複合体は、本明細書において使用されるように用語ＨＡＭＬＥＴの「改変体」に包含される。しかし、本出願人は、一度形成すると、機能的カルシウム結合部位の存在、及び／又はカルシウムの存在は、複合体の安定性又は生物活性に影響しないことを見出した。生物活性のある複合体は、活性を失うことなく、カルシウムに対する親和性を保持することが見出されている。それ故、本発明の複合体は、更にカルシウムイオンを含んでもよい。
【００５０】
それ故、特に、本発明は、α−ラクトアルブミン若しくはアポフォールディング状態（apo folding state）であるα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及び生物活性のある形態での複合体を安定化する補助因子を含み、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のいずれかの断片は、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む、生物活性のある複合体を使用する。
【００５１】
好適には、補助因子は、シスＣ１８：１：９、又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸である。
【００５２】
特に便利な実施態様において、本発明において使用される生物活性のある複合体は、
（ｉ）シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが放出されたα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが除去されたか又は機能性カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一つの断片、但し、このいずれか一つの断片は、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含むものである；
を含む。
【００５３】
本明細書において使用されるように、表現「変異体」は、好適にはヒト又はウシα−ラクトアルブミンであるが、しかしながら、それらが由来する基本配列とは配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているという点で異なっている、基本タンパク質に相同であるポリペプチド又はタンパク質を表す。アミノ酸の置換は、「保存的」とされていてもよく、その場合アミノ酸が広範囲に類似した性質を有する異なったアミノ酸で置換される。非保存的置換は、アミノ酸が異なった型のアミノ酸で置換されるものである。大まかに云って、より少数の非保存的置換が、ポリペプチドの生物活性を変更することなく可能であろう。好適には、変異体は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、なおより好ましくは８０％又は８５％、及び特に好ましくは９０％、９５％又は９８％、又はそれ以上同一であろう。
【００５４】
同一性の程度を決定する目的でアミノ酸配列を比較するとき、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰのようなプログラム（両者は、Wisconsin Genetics Computer Group（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージである）がある。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適なアラインメントを作る。ＧＡＰは、配列の全長に沿って配列のアラインメントを可能にし、必要に応じて配列のいずれかにスペースを挿入することによって最適なアラインメントを見出す。好適には、本発明の関連で配列の同一性を考察する場合、比較は、配列の全長に沿った配列のアラインメントによって行われる。
【００５５】
用語「その断片」は、完全なα−ラクトアルブミンアミノ酸配列を包含する複合体に類似する活性を有する複合体を形成するであろう、与えられたアミノ酸配列のいずれかの部分を表す。断片は、互いに連結した全長のタンパク質内から１つ又はそれ以上の部分を含んでいてもよい。部分は、好適には、基本配列から少なくとも５個の、好ましくは少なくとも１０個の連続的アミノ酸を含む。
【００５６】
好適な断片は、長さで少なくとも２０アミノ酸、及びより好ましくは少なくとも１００アミノ酸を好適に含む欠失変異体であろう。断片は、タンパク質からの小領域又はそれらの組合せを包含する。
【００５７】
αドメインとβドメインの間の接点を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいて、構造においてアミノ酸３４〜３８及び８２〜８６によって規定される。それ故、好適な断片は、これらの領域、及び好ましくは天然のタンパク質のアミノ酸３４〜８６からの完全領域を包含する。
【００５８】
特に好ましい実施態様において、生物活性のある複合体は、カルシウム結合部位がカルシウムに対する親和性が減少するように又は最早機能的でないように改変されたα−ラクトアルブミンの変異体を含む。
【００５９】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８によって配位されている。それ故、この部位の改変又は非ウシα−ラクトアルブミンにおけるその等価物は、例えば１つ又はそれ以上の酸性残基を除去することによって、カルシウムに対する部位の親和性を減じることができ、或いは完全に機能を除去することができ、この型の変異体は本発明の好ましい態様である。
【００６０】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、２つのヘリックスを分離する短いターン領域を有する３10ヘリックス及びαヘリックスからなる（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。それは、分子のこの部分をかなり曲がりにくくする２つのジスルフィド架橋によって挟まれている。Ｃａ2+を配位する７個の酸素グループの内５個は、Ａｓｐ８２、８７及び８８の側鎖カルボキシレート又はＬｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素によって与えられている。２つの水分子は残りの２個の酸素を供給している（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）。
【００６１】
８７位のアスパラギン酸のアラニン（Ｄ８７Ａ）への部位特異的突然変異誘発は、強力なカルシウム結合部位を不活化することが以前に示されており（Anderson P. J., et al., (1997), Biochemistry 36, 11648-11654）、変異タンパク質はアポ立体配座をとっている。
【００６２】
それ故に、特別な実施態様において、ウシα−ラクトアルブミンタンパク質配列内のアミノ酸の８７位のアスパラギン酸残基は、非酸性残基、特に、非極性又は電荷を持たない極性側鎖に変異する。
【００６３】
非極性側鎖としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインが挙げられる。特に好ましい例は、アラニンである。電荷を持たない極性側鎖としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン又はチロシンが挙げられる。
【００６４】
突然変異タンパク質における構造歪みを最小化するために、Ｄ８７は、カルボキシル基の中和されていない負電荷を欠くが、同じ側鎖体積及び幾何配置を有する、アスパラギン（Ｎ）によって置換されている（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。変異タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、カルシウムと低親和性（Ｋ−Ca２×１０5Ｍ-1）で結合することが示された（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。そのような変異体は、本発明の更に好ましい実施態様における生物活性のある複合体の構成要素である。
【００６５】
それ故、本発明の複合体において使用するための特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７Ａ及びＤ９７Ｎ変異体、又はこの変異体を包含する断片である。
【００６６】
分子のこの領域は、ウシタンパク質とヒトタンパク質の間で異なっており、３つの塩基性アミノ酸の１つ（Ｒ７０）が、ウシα−ラクトアルブミンにおいてＳ７０に変化しており、それ故１つの配位側鎖が除かれている。それ故に、ウシα−ラクトアルブミンを本発明の複合体において使用する場合、Ｓ７０Ｒ変異体を使用するのが望ましい場合がある。
【００６７】
Ｃａ2+結合部位は、異なった種からのα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存されており（Acharya, K. R. et al., (1991), J. Mol. Biol., 221, 571-81）、タンパク質のためのこの機能の重要性を明らかにしている。それは５つの異なったアミノ酸及び２つの水分子によって配位されている。Ｄ８８と共にＤ７７の側鎖カルボン酸は、最初にカルシウムイオンを陽イオン結合部位にドッキングさせ、構造を安定化する内部水素結合を形成する（Anderson P. J., et al., (1997), Biochemistry 36, 11648-11654）。Ｄ８７又はＤ８８のいずれか１つを失うと、Ｃａ2+結合を妨げ、分子を部分的に折り畳まれていない状態で安定にすることが示されている（Anderson P. J., et al., (1997) Biochemistry 36, 11648-11654）。
【００６８】
更に、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位における２つの異なった点突然変異を有する変異タンパク質を使用してもよい。例えば、８７位のアスパラギン酸をアラニン（Ｄ８７Ａ）で置換すると、カルシウム結合を完全に崩壊し、タンパク質の三次構造を破壊することが見出されている。アスパラギン酸をアスパラギンによって置換すると、タンパク質（Ｄ８７Ｎ）はカルシウムになお結合しているが、しかし、低親和性であり、Ｄ８７Ｎ変異体に対するほど顕著ではないが、三次構造の消失を示した（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。変異タンパク質は、両アミノ酸は同じ平均体積１２５(オングストローム)3を有するので、充填体積において最小の変化を示し、アスパラギンのカルボン酸側鎖がタンパク質をカルシウムと配位するのを可能とするが、しかし効率が悪い（Permyakov S. E., et al., (2001), Proteins Eng., 14, 785-789）。両変異タンパク質は、生理温度でアポ立体配座で安定であったが、この立体配座変化にもかかわらず、それらは生物学的に不活性であった。これらの結果は、アポ立体配座への立体配座変化のみでは、生物活性を誘導するには充分でないことを明らかにしている。
【００６９】
α−ラクトアルブミンの構造は、当該技術分野で知られており、本明細書において表されている残基の正確なアミノ酸番号付けは、例えば、前記Anderson等及び前記Permyakov等によって示された構造を参照することによって同定することができる。
【００７０】
本発明の第二の態様に従って製造される薬剤は、好適には、治療される特定の悪性粘膜腫瘍に局所投与するのに好適な形態の医薬組成物である。例えば、組成物は、膀胱癌が治療されている膀胱に点滴注入するために好適な形態であってもよい。これらは、医薬として許容される普通に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。しかし好適には、膀胱に点滴注入される組成物は、活性物質の滅菌水又は生理食塩水溶液を含む。
【００７１】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には、希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有し、これは他の悪性粘膜腫瘍に適用するのにより好適であり得る。そのような製剤は、腫瘍に直接適用することができる。
【００７２】
加えて、そのような局所組成物は、悪性皮膚腫瘍、特にメラノーマを治療するために適用され得る。本出願人は、ＨＡＭＬＥＴがメラノーマ細胞に対して特に有効であることを見出した。このようにこれら組成物の使用は、本発明の更なる態様を形成している。
【００７３】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従って治療される癌の性質等によって変化し、依存する。通例、２００ｍｇから１ｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、１日当たりの投与量として、好ましくは膀胱内点滴注入によって、少なくとも３日、好ましくは少なくとも５日の期間にわたって、使用される。特に、１日当たり７５０ｍｇのＨＡＭＬＥＴ、５日間を含む投与計画が有益であることが証明されている。
【００７４】
本出願人は、膀胱癌に対する局所ＨＡＭＬＥＴ治療の効果について研究した。以下に報告するように、膀胱内点滴注入に続く効果は極めて良好であった。
【００７５】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、粘膜癌を治療する方法、及び特に膀胱癌を治療する方法が提供される。複合体は、好適には膀胱内に投与される。
【００７６】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に例示されている。好ましくは、生物活性のある複合体は、上記にも記載された、局所組成物の形態で投与される。
【００７７】
本出願人は、ＨＡＭＬＥＴ及びこの型の複合体が、インビボで内部器官の腫瘍に直接注入された場合に極めて良好な結果を生じることを見出した。特に、脳に見出される液体は活性を妨害しないことを見出している。
【００７８】
本発明の第三の態様によれば、腫瘍に注入するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用が提供される。
【００７９】
そのような生物活性のある複合体を直接腫瘍に注入することによって、腫瘍の大きさを減少可能であることが見出され、プロテアーゼを包含し得る体液の存在にもかかわらず、アポトーシスを誘導するＨＡＭＬＥＴの効果が生じていることを示している。結果として、この治療は、脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣のような内部器官の固形腫瘍、並びにメラノーマにおける治療に特に好適である。
【００８０】
そのような複合体の効果の選択的な性質は、隣接する健全な組織が、複合体と接触するとしても、影響を受けないことを意味している。
【００８１】
特に、本発明は、脳腫瘍の治療において、及び毒素誘発肝臓腫瘍においても有用である。脳に見出される液体は、特に、驚くべき程度まで、ＨＡＭＬＥＴの効果を妨害するようには見えない。
【００８２】
悪性脳腫瘍は、選択的又は効果的な治療が得られないという点で、主要な治療的挑戦目標を表している。頭蓋内腫瘍の大部分は、神経膠細胞に由来しており、神経膠腫として知られる異質群を形成している。それらは、全ての原発性脳腫瘍の６０％を超える割合を占めており、最も予後不良である。神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、平均生存期間が１年未満の膠芽腫の最も悪性なものであり、それらは神経外科及び神経病理学系列において全ての頭蓋内腫瘍のおよそ１／４を構成している。近年、脳腫瘍の外科手術は著しい技術的進歩をなしている。顕微外科及びニューロナビゲーション並びに新しい診断用高分解能画像技術が、死亡率を減少させているが、しかし生存期間は改善していない。ＧＢＭは、それらの侵襲性及び広範な浸潤性増殖の故に、完全な手術除去は手が届かないで残っている。結果として、これらの患者の目下の治療は、部分的腫瘍切除、放射線療法及び化学療法を包含する姑息的なものである。
【００８３】
しかしながら、本出願人は、ＨＡＭＬＥＴのような生物活性のある複合体が、特に、ＧＢＭの治療における新しい手段を提供することを見出した。ＨＡＭＬＥＴは、インビトロでアポトーシス様機構によってＧＢＭ腫瘍細胞を殺し、効果は選択的で、健全な細胞は傷付かない。更に、ＨＡＭＬＥＴは、ヒトＧＢＭ異種移植片モデルにおいて、インビボでこれらの性質を保持していた。確立されたヒトＧＭＢ腫瘍へのＨＡＭＬＥＴの局所注入は、腫瘍進行及び圧迫症状の発症を顕著に遅延させた。ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬアッセイ及び組織病理によって示されるように、インビボにおいてアポトーシス様機構によって腫瘍細胞を殺傷した。壊死の証拠はなく、組織病理的変化は周囲の無傷の脳において検出されなかったので、効果は選択的であった。生検スフェロイドのインビトロ処置で、良性髄膜腫に比較して、ＨＡＭＬＥＴによる悪性細胞の効率的な殺傷が確認された。結果は、それ故、ＨＡＭＬＥＴはＧＢＭを治療するのに使用できることを示唆している。
【００８４】
本発明の第三の態様によって製造される薬剤は、好適には、治療される特定の固形腫瘍に、腫瘍内投与するのに適した形態の医薬組成物である。例えば、組成物は、腫瘍中に注入するのに好適な形態である。これらは、医薬として許容される普通に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。しかし好適には、注入用組成物は、活性物質の生理食塩水溶液を含む。
【００８５】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従って治療される癌の性質等によって変化し、依存する。通例、２ｍｇから２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各１回につき腫瘍に注入される。
【００８６】
本明細書において報告された研究は、ヒトＧＢＭ異種移植片モデルにおけるＨＡＭＬＥＴの治療効果を探求したものである。ＨＡＭＬＥＴは、脳液と接触するにもかかわらず、インビボでＧＢＭのアポトーシス様死を選択的に誘導する能力を保持していることを示している。ＨＡＭＬＥＴの腫瘍内投与は、腫瘍細胞アポトーシスの選択的誘導によって、ヒト神経細胞膠芽腫（ＧＢＭ）を有するラットにおいて生存期間を延長することが見出された。侵襲的に増殖するヒトＧＢＭを、ヒト生検スフェロイドの異種移植によって、ヌードラットに確立し、ＨＡＭＬＥＴの治療効果をα−ラクトアルブミン；同じタンパク質の天然のフォールディング変異体、と比較した。
【００８７】
ＨＡＭＬＥＴの、脳内、運搬促進送達（convection enhanced delivery）は、担腫瘍ラットにおいて、頭蓋内腫瘍体積を劇的に減少させ、圧迫症状の発症を遅らせた。ＨＡＭＬＥＴは、健全なラットの脳に治療濃度のＨＡＭＬＥＴを注入した後、腫瘍に隣接した健全な脳組織においてはアポトーシスを誘導せず、かつ有毒な副作用を惹き起こさなかった。この結果により、ＨＡＭＬＥＴが癌療法、特にＧＢＭ進行を制御するための潜在的な新しい道具であると確認できる。
【００８８】
結果は、また、ＨＡＭＬＥＴとα−ラクトアルブミンを投与された異種移植ラットの間に疾病進行において顕著な相異があったことを示している（ｐ＜０.００１）。このことは、生物活性における相異がタンパク質フォールディングの変化から、及びオレイン酸のような特異的補助因子との関連から、どのようにして起こることができるかを明らかにしている。
【００８９】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、腫瘍又はその領域に注入することを含む癌を治療する方法が提供される。
【００９０】
特に、複合体は、適切な注入器具を使用して投与するのに適しており、そして特に、運搬促進送達技術（ＣＥＤ）が、特に効果的であることが見出された。
【００９１】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記において、明らかにされている。
【００９２】
本発明の第四の態様によれば、血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が提供される
【００９３】
そのような薬剤は癌、特に固形癌、及び急速に増殖しつつある固形癌を治療するために使用することができる。そうでない場合でも、これに加えて、腫瘍転位を遅延させるために投与することもできる。
【００９４】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体がこの結果を達成する機構は判っていない。ある種の効果は腫瘍細胞によって媒介されるであろうことが期待され得る。特に、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞を殺すので、血管新生活性化分子の供給が低下する。しかしながら、認められた効果から、付加的な効果が生じつつあることを示しているように見える。例えば、ＨＡＭＬＥＴは急速に増殖している血管細胞に対して、直接的な効果を持っている可能性があるようである。
【００９５】
ＨＡＭＬＥＴ又はその生物活性のある改変体は、また、血管新生阻害が望ましい他の疾患を治療するために使用することもできる。
【００９６】
主として天然に存在するタンパク質として、ＨＡＭＬＥＴは、完全合成薬よりは低毒性であろうと信じられる。更に、複合体の免疫原性は、低いと信じられる。
【００９７】
本発明の第四の態様によって製造される薬剤は、好適には、例えばクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤のような局所使用するのに適した形態をした医薬組成物である。それらは、医薬として許容される、一般に知られた担体、充填剤及び／又は補助剤を包含する。
【００９８】
局所用液剤又はクリーム剤は、好適には、希釈剤又はクリーム基剤と共にタンパク質複合体用の乳化剤を含有する。
【００９９】
活性化合物の１日量は、患者、標準的治療法に従い治療される状態の性質等によって変化し、そして依存する。通例、２から２００ｍｇ／ｄｏｓｅの生物活性のある複合体が、各投与に対して使用される。
【０１００】
本発明の更なる態様において、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、必要とする患者に投与することを含む、血管新生を阻害する方法が提供される。
【０１０１】
生物活性のある複合体の好ましい例は、上記に明らかにされている。好ましくは、生物活性のある複合体は、また、上に記載したように、局所用組成物の形態で投与される。
【０１０２】
次に、本発明を、添付する図を参照しながら例示する方法により、詳細に説明する。
図１は、本発明による治療前後にとった、膀胱癌の内腔の写真を示す。
図２．ＨＡＭＬＥＴ−ヒトＧＢＭ腫瘍異種移植片のインビトロ及びインビボにおける構造及び機能
（ａ）ＨＡＭＬＥＴがＣａ2+の脱離により、及びＣ１８：１，９シス脂肪酸の付加により天然のα−ラクトアルブミンから形成される。図はα−ラクトアルブミンの結晶構造に基づく。
（ｂ）ＨＡＭＬＥＴに対するＧＢＭ細胞株の感受性。ＬＤ50＝６／２４時間における細胞の５０％を殺すに必要な濃度。（ｃ及びｄ）ヒトＧＢＭ腫瘍スフェロイド（矢印のところで注射した）を、ＨＡＭＬＥＴ（ｎ＝１０）又はα−ラクトアルブミン（ｎ＝１０）を２４時間注入前に１週間定着させた。α−ラクトアルブミン（１〜４）又はＨＡＭＬＥＴ（５〜８）で処置したラットにおいて個々の腫瘍のＭＲＩスキャンを、注入後２ヵ月実施した。（ｅ）平均腫瘍サイズは、α−ラクトアルブミン処置群におけるよりもＨＡＭＬＥＴの点滴注入動物において有意に小さかった（ｐ＜０.０１）。（ｆ）頭蓋内圧上昇の症状を記録し、そしてα−ラクトアルブミン対照において約２ヵ月後に生じたが、圧迫症状の発症はＨＡＭＬＥＴの点滴注入されたラットでは遅延した（ｐ＜０.００１）。
【０１０３】
図３．ＨＡＭＬＥＴによるアポトーシス誘導
（ａ）脳組織切片を、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンのＣＥＤ後１２時間に、担癌ラットから得た。ＨＡＭＬＥＴは、ＴＵＮＥＬ染色によって示されるように、腫瘍領域内にアポトーシス（緑の蛍光、左パネル）及び核濃縮アポトーシス腫瘍細胞核（右パネル、倍率６００×）を豊富にした。ＨＡＭＬＥＴ処置動物及びα−ラクトアルブミン処置群において腫瘍の周辺の健全な脳組織にアポトーシスは観察されなかった。細胞核を、細胞ＤＮＡのプロピジウムヨージド染色を用いて目に見えるようにした（赤い蛍光）。
（ｂ）ＧＢＭスフェロイドを、インビトロでＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンで処置し、アポトーシス誘導を試験した。ＨＡＭＬＥＴ誘導アポトーシス（緑の蛍光）が、ヒトＧＢＭスフェロイド全体に見られたが、良性髄膜腫由来のスフェロイドにはなかった。
（ｃ）α−ラクトアルブミンは、ＧＢＭ又は髄膜腫スフェロイドのいずれにおいてもアポトーシスを促進しなかった（倍率３６０×）。多染色体細胞及び核濃縮アポトーシス細胞（ｂの矢印）が、ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドにおいて見出されたが、α−ラクトアルブミン群においては見られなかった（倍率４５０×）。
【０１０４】
図４．ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンでの前処置に続くＧＢＭスフェロイドの異種移植
各群６動物を、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンで３時間前処置した、樹立ヒトＧＢＭスフェロイド（各群４−５）で異種移植した。α−ラクトアルブミン前処置ＧＢＭ細胞を注入された全てのラットは、大きな腫瘍を発現した（ａ、１〜４）。ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドを注入された６動物中４動物は、腫瘍発現の徴候を示さず、少なくとも２１０日間生存した（ｂ、５〜８）。腫瘍をともかく発現したＨＡＭＬＥＴ群の２ラットは、有意により小さな腫瘍を示した（ｃ、ｐ＜０.０１）、そして圧迫症状の発症は遅延した（ｄ、ｐ＜０.０１）。
【０１０５】
図５．放射能標識ＨＡＭＬＥＴの分布
健全ラットの脳へ注入後の放射能標識ＨＡＭＬＥＴ（２〜１０×１０6ＰＰＭ）の分布（ｎ＝３、倍率９０×）を示す。文字は切片の位置、ｘは注入部位を示す。（ａ）前頭葉、（ｂ）大脳基底核、（ｃ）視床、及び（ｇ）黒質。
【０１０６】
図６．毒性の評価
健全ラットをＨＡＭＬＥＴ０.７ｍＭ、α−ラクトアルブミン０.７ｍＭ又はＮａＣｌ０.１５Ｍ（各群ｎ＝５）で処置した。潜在的な毒性は注入後３週間で分析した。
（ａ）ＭＲ画像のＴ２強調シグナルは、注入部位に小嚢胞性病変を示したが、毒性の放射線学的徴候はなかった。
（ｂ）注入脳半球由来の連続脳切片での組織病理は、健全な脳における毒性の証拠は示されなかったが、注入部位に隣接していくつかの組織損傷が見られた（矢印、ヘマトキシリン−エオジン染色、倍率１００×及び４００×）。
（ｃ）肝機能及び腎機能の生化学マーカーは、有意な毒性効果を現さなかった（両群において、ｐ＞０.０５）。
（ｄ）体重増加は、群間で差はなかった（ｐ＞０.５）。ハッチの棒（hatched bar）は、注入前の体重値、及び塗りつぶした棒（filled bar）は、注入後３週間の値である。
（ｅ）運動のオープンフィールド試験は影響なかった（ｐ＞０.０５、ネズミ色＝ＨＡＭＬＥＴ、薄い灰色＝α−ラクトアルブミン、白＝ＮａＣｌ）。
【０１０７】
図７〜図９は、局所ＨＡＭＬＥＴ処置、５日間後のヒト膀胱乳頭腫における血管の分解を図解した、次第に拡大した組織切片を示す。
【実施例１】
【０１０８】
膀胱癌を有する患者におけるＨＡＭＬＥＴの膀胱内注入
物質の製造及び患者の無作為化
母乳のドナーは、非喫煙者であり、ＨＡＭＬＥＴの製造前にＨＩＶについてスクリーニングした。α−ラクトアルブミンは、硫酸アンモニウム沈殿に次いでフェニル・セファロース・クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによってヒトミルクホエーから精製された。ホスピタル・ミルクバンクからの余剰ミルクを未熟児に投与するための規則に従って使用した。ＨＡＭＬＥＴは、文献に記載されたようにして、オレイン酸で調節したイオン交換クロマトグラフィーで天然のα−ラクトアルブミンから生成したものである。溶離した分画を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１０９】
更に、ＨＡＭＬＥＴを、細菌汚染についてスクリーニングし、−２０℃で乾燥物質として保存した。
【０１１０】
研究デザイン：
新しく診断された、又は再発した膀胱の尿路上皮癌の手術待機患者を、研究に参加させるために招いた。インフォームドコンセントの後、患者に膀胱鏡検査を行って腫瘍サイズを評価し、そして内腔写真撮影（endoluminal photography）で病変を記録した。処置後、及び手術前に、膀胱鏡検査を繰り返して、腫瘍の大きさを再評価し、そして内腔写真撮影を実施した。
【０１１１】
ＨＡＭＬＥＴの膀胱内点滴注入を、厳重な観察下に外来診療で実施した。点滴注入は、１日１回行い、５日間繰り返した。導尿後、膀胱を完全に空にし、尿を分析のために集めた。ＨＡＭＬＥＴ（２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｌ）を膀胱に貯め、カテーテルを除去し、患者に、少なくとも２時間点滴注入を保持するよう求めた。利尿を減らすため、患者には、点滴注入前４時間及び点滴注入直後は液体摂取しないよう求めた。尿試料は、点滴注入前、及び各点滴注入後最初の排尿から、採取された。
【０１１２】
ＨＡＭＬＥＴの点滴注入は、患者の通常の取り扱いを妨害することなく、又遅延することのないように計画した。
【０１１３】
患者：７名の男性患者を研究に含めた。標準腫瘍分類に基づいて、患者は、３つの群、Ａ、Ｂ及びＣに割り当てた。
【０１１４】
患者Ａ１及びＡ２（９２才及び８６才）は、膀胱の分化の乏しい筋肉侵襲尿路上皮癌（Ｔ４ｇ３）であった。高齢であるので、これらの患者には、腫瘍の経尿道的電気切除術（Ｔ−ＴＵＲ）の繰り返しのような、暫定処置、鎮痛剤及び臨床観察を行った。両患者とも、頻回及び刺激性の軽い下部尿路症状を罹患していたが、高齢にもかかわらず、これ以外は健康であった。
【０１１５】
患者Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ４（それぞれ、３７才、７５才、７０才、８２才）は表在性乳頭腫状膀胱腫瘍（ＴＡｇ１−２）を有していた。患者Ｂ１及びＢ３は、新しく診断された腫瘍であり、患者Ｂ２及びＢ４は、以前から知られていた高度分化、表在性膀胱腫瘍（ＴＡｇ１）の再発であった。患者Ｂ１及びＢ４は、それらの腫瘍以外は健康であったが、患者Ｂ２は、心硬化症と合併した高血圧に罹っていた。患者Ｂ３は、高血圧症及び慢性気管支炎に罹患していた。患者Ｃ１（７２才）は、以前から判っている膀胱の上皮内癌（ＣＩＳ）の多病巣性徴候を有していた。彼は、加わる前１年間に、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）の膀胱内注入を受けていた。膀胱生検では、最初ＢＣＧ治療に対する反応を示した。加わる前に、ＣＩＳの再発が、生検試料で診断されていた。この患者は、その他の点では健康であった。
【０１１６】
治療結果：
全ての患者は、５日間、ＨＡＭＬＥＴの膀胱内注入を毎日受けた。点滴注入の副作用は、どの患者も経験しなかった、そしてＣＲＰ、発熱又は末梢好中球数のような全身性炎症パラメーターの反応はなかった。
【０１１７】
患者Ａ１及びＡ２は、下部尿路機能不全のために膀胱にＨＡＭＬＥＴ溶液を保持することが困難であった。治療効果は評価することができなかった。患者Ｂ１は、５日間のＨＡＭＬＥＴの点滴注入後、腫瘍のほぼ完全な縮小を示した。
【０１１８】
患者Ｂ２は、腫瘍サイズの縮小は小さかったが、しかし腫瘍の性質の顕著な変化がみられた。治療前、腫瘍は、接触に対して、出血したが、治療後は、表面は「乾燥」した。患者Ｂ３は、１枚の写真ではとらえるには余りにも大きすぎる、左膀胱壁の乳頭腫を担癌していた。膀胱内ＨＡＭＬＥＴの点滴注入後、目で見た腫瘍の大きさの評価で、約５０％の大きさの減少を示した。患者Ｂ４は、左膀胱頸部に２つの小さな外向発育腫瘍を有していた。腫瘍の大きさの明らかな縮小はなかったが、表面萎縮性の腫瘍の性質において著しい変化があった。
【０１１９】
患者Ｃ１は、外向発育腫瘍の増殖がないので、評価するのは困難であった。ＨＡＭＬＥＴの点滴注入の前に、３／３膀胱生検（「地図作成」）では、上皮内癌を示したが、しかし、５日間の治療後、１／３生検のみが陽性であった。
ＴＵＮＥＬ陽性、アポトーシス性癌細胞が検出された。
【０１２０】
肉眼的には健全な膀胱粘膜からの生検を、患者５名について行った。これらの生検において同定されたＨＡＭＬＥＴ治療の効果はなかった。
【０１２１】
本発明者等は、ＨＡＭＬＥＴ治療は膀胱癌細胞にアポトーシスを誘導し、腫瘍の体積及び肉眼的外観に顕著に影響すると結論づけた。
【実施例２】
【０１２２】
ＨＡＭＬＥＴの製造
ＨＡＭＬＥＴを、Ｃ１８：１，９シス脂肪酸（Svensson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:4221-4226）で、前調整処理したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭ（BioSepra, France）のイオン交換クロマトグラフィーによって、アポα−ラクトアルブミンから製造した。ＨＡＭＬＥＴ（１ｍｇ／ｍｌ）の125Ｉ標識は、ラクトペルオキシダーゼ法（Hakansson et al., Proc. Natl. Sci. USA 92:8064-8068）によった。
【０１２３】
腫瘍組織及び細胞株
Haukeland University Hospital (Bergen, Norway) で、その医学倫理委員会の許可を得て、右前頭葉及び側矢状髄膜腫のＧＢＭから腫瘍生検を集めた。直径３００μｍのスフェロイドを培養し、移植に使用した（Bjerkvig et al., J. Neurosurg. 72:463-475）。神経膠腫細胞株は、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・２３６５、Ｄ−５４ＭＧ及びＵ−２５１ＭＧであった。Ａ５４９肺癌株はＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５であった。充分に分化したネズミ脳細胞の単個細胞浮遊液を、完全に成長したマウスの脳を解剖し、１％トリプシン（Sigma Chemicals Inc., St. Louis, MO, USA）でＤＭＥＭ培地（GibcofBRL, Life Technologies Ltd. Paisley, Scotland）中で、３０分間、室温にて解離し、０.２４％ＤＮａｓｅ及び１％ＦＣＳ（Sigma Chemicals Inc., St. Louis, MO, USA）を加え、次いで機械的破壊によって、調製した。生存率は＞９９％であった。
【０１２４】
ヒトＧＢＭのヌードラットへの異種移植
全ての実験は、国立動物研究委員会によって承認されており、科学的目的のために使用される脊椎動物の保護に関するヨーロッパ条約に従って行われた。Haukland Hospitalで飼育された、ヌードラット（Han: rnu/rnu Rowett）を、Equitisinの腹腔内注射によって麻酔し、穿孔術のために定位フレーム（David Kopf, model 900, Tujunga, CA, USA）におき、５生検スフェロイドを含有したＰＢＳ約５〜１０μｌを線条体に注射した。ラットを、無抵抗、不器用及び不全麻痺のような頭蓋内圧の亢進症状を発症するまで毎日モニターした。１.５テスラのSiemens Magnetom Vision装置（Erlangen, Germany）及び脳解析用フィンガーコイルを使用して、腫瘤を磁気共鳴スキャンによって定量した。約１００万細胞の移植から圧迫症状までの平均時間は、約２ヵ月であって、その時点で、動物を殺処分した。
【０１２５】
無処置の脳へのＨＡＭＬＥＴの運搬促進送達
ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミン（０.１５Ｍ・ＮａＣｌ中０.７ｍＭ）を、浸透圧ミニポンプ（ADO1, Alzet Inc., Mountainview, CA, USA）に接続した２６ゲージカニューレを通して投与した。腫瘍の領域には、カニューレを外す前２４時間にわたって８μｌ／時間で注入した。125Ｉ放射能標識ＨＡＭＬＥＴ（０.１５Ｍ・ＮａＣｌ中０.７ｍＭ、２〜１０×１０6ＰＰＭ）を記載したようにして投与した。ＨＡＭＬＥＴの分布を、全体に注入した脳半球からの連続脳切片のオートラジオグラフィーによって確認した。
【０１２６】
組織分析
脳をTissue-Tec（Sakura Finetek Inc., Torrance, CA, USA）に急速に包埋し、液体窒素で凍結した。連続軸方向１０μｍ切片を、Reichert Jung Cryostat（Reichert, Vienna, Austria）でカットした。アポトーシスを起こした細胞をＴＵＮＥＬアッセイ（Roche, Basel, Switzerland）によって検出し、封入剤と共にカバーグラスをした（Vectashield, Vector Labs Inc., Burlingame, CA, USA）。細胞核をプロピジウムヨージド（Propidium iodide）（１０μｇ／ｍｌ、３０秒間）で対比染色し、Leicaスキャナーで試験した。並列切片を、ヘマトキシリン−エオジンで染色し、Entellan（Merck, Darmstadt, Germany）に封入した。凍結アーチファクトがなく、ＦＩＴＣ（ＴＵＮＥＬ）とＴＲＩＴＣ（プロピジウムヨージド）に対する許容されるシグナル／ノイズ比を有する切片を特定し、各腫瘍又はスフェロイドの中心からの代表的な切片１つを形態計測解析にかけた。ＦＩＴＣ及びＴＲＴＴＣ陽性核プロフィールがバックグランド上に明確に視認でき、プリントした絵から計測した。結果は、プロピジウムヨージド陽性核のパーセントのＴＵＮＥＬ陽性として表される。
【０１２７】
ＨＡＭＬＥＴでのインビトロ処置
樹立したスフェロイド（各群４〜５）を無血清培地に移し、ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンと３時間インキュベートし、直ちにヌードラットの脳内に移植した。アポトーシスを分析するために、スフェロイドをＤＭＥＭに戻し、更に２１時間インキュベートし、連続切片作成後、形態計測でＴＵＮＥＬアッセイによって試験した。細胞株を記載されたようにして培養し（Hakansson et al. 前述）、剥離し、収集し、洗浄し、そしてＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンに２４時間曝露した。アポトーシスを、トリパンブルー排除によって評価した細胞生存の喪失（計数細胞１００当たりの死亡細胞の％）として測定し、ＤＮＡ断片化を電気泳動によって検出した（Zhivotovsky et al., FEBS Lett. 351:150-154）。
【０１２８】
毒性試験
ＨＡＭＬＥＴ（０.７ｍＭ）、α−ラクトアルブミン（０.７ｍＭ）又はＮａＣｌ（０.１５Ｍ）をラットに与え、注入後３週間分析した。腫瘤を、１.５テスラのSiemens Magnetom Vision装置（Erlangen, Germany）及び脳解析用フィンガーコイルを使用して、磁気共鳴スキャンによって定量した。組織病理を、ヘマトキシリン−エオジンを用いて上に記載したようにして検討した。肝機能及び腎機能の生化学マーカー及びＣＲＰを定量した。体重を注入前及び注入後３週間記録した。脳機能をオープンフィールドテストで評価した。ラットを、黒い壁（２０ｃｍ）で囲まれたオープンフィールド箱（１００×１００ｃｍ）中においた。床は、白いストライプによって２５の同じ区域（２０×２０ｃｍ）に分けた。動物を中心の区域におき、彼らの動きを６分間、手作業で点数付けした。各運動性のカウントは、両後肢で区域の境界を横断したことで表され、方向を右又は左として記録した。実験は、盲検法で、防音室中で午前１０時及び午前２時の間に行った。
【０１２９】
統計解析
群はＴ検定、一元配置分散分析（事後最小有意差）で比較し、生存率はカプラン・マイヤー分析によった。
【０１３０】
結果
ＧＢＭ異種移植モデル
二つの実験モデルがインビボでＧＢＭ治療を研究するために開発された。神経膠腫細胞株はインビトロで効率的に増殖し、移植後脳内腫瘍をいつも産生する；しかし、これらの腫瘍は、インビボでは非侵襲性であり、それ故に、ヒト疾患のモデルとしては余り好適ではない。ヒトＧＢＭ生検スフェロイドは、対照的に、ヌードラットに異種移植後侵襲性増殖挙動を保持している。インビトロスフェロイド培養ステップは、再現可能な腫瘤を得るため、及び臨床症状の出現を同調させるために必須である。このモデルは、それ故、ヒトＧＢＭ疾患に関連する治療モデルを提供し、腫瘍領域への治療分子のＣＥＤと組み合わせることができる。
【０１３１】
ＨＡＭＬＥＴはヒト神経膠腫異種移植片の増殖を阻害する
実験的ＧＢＭが、ヒトＧＢＭ生検スフェロイドのヌードラット脳への異種移植によって確立された（Engebraaten et al., J. Neurosurg. 90:125-132）。異種移植片はヒトＧＢＭの浸潤性増殖を示し（図２ｃ）、対照ラットは、約２ヵ月後発症した（図２ｆ）。
【０１３２】
ＣＥＤは、ＨＡＭＬＥＴ（０.７ｍＭ）を脳の異種移植した領域に投与するのに使用された。天然の、折り畳まれたα−ラクトアルブミンが対照として使用された。処置前に、腫瘍細胞は、宿主の脳内に一体化するよう１週間おかれた。
【０１３３】
ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンを２４時間ＣＥＤによって投与した。各群の２動物は、麻酔中に死亡し、各群の４動物は、１２時間後殺処分した。それらの脳を、組織検査、ＴＵＮＥＬアッセイ及び形態計測解析用に、直ちに凍結した。
【０１３４】
残りの動物は、２ヵ月間毎日モニターされ、腫瘍体積を、α−ラクトアルブミン処理対象動物が発症したときの７週間後ＭＲＩによって評価した。高Ｔ２強調シグナルを有する大きなＧＢＭ移植体が、全てのα−ラクトアルブミン処置動物において観察することができ、平均腫瘍体積は４５６（範囲２９２〜４８５）ｍｍ3を有していた（図２ｃ及びｅ）。ＨＡＭＬＥＴ注入ラットは、有意に小さい腫瘍体積を示した（図２ｄ及びｅ、平均６３、範囲１０〜１３１ｍｍ3、ｐ＜０.０１）。ＨＡＭＬＥＴ処置は、また、圧迫症状の発症を遅延させた。α−ラクトアルブミンを投与されたラットは、第５９日に発症し、第６９日に全ての動物が殺処分された。このとき、ＨＡＭＬＥＴ治療群の全動物は、無症候のままであった（図２ｆ、ｐ＜０.０１）。ＨＡＭＬＥＴ処置ラットは、最終的には、圧迫症状を発症し、典型的なＧＢＭ腫瘍で死亡し、組織学的試験で多型細胞型及び偽柵状構造を示した。
【０１３５】
ヒトＧＢＭ異種移植片における選択的腫瘍細胞アポトーシス
アポトーシス誘導を、ＤＮＡ鎖切断を標識したＴＵＮＥＬアッセイを用いてインビボで試験した。ＣＥＤ完了の１２時間後に得られた組織の形態計測解析は、ＨＡＭＬＥＴ処置ＧＢＭ細胞の３３±７％が、α−ラクトアルブミン群における２±２％に比較して、ＴＵＮＥＬ陽性であった（図３ａ、ｐ＜０.００１）。アポトーシス効果は、通常の組織病理学によって確認され、ＨＡＭＬＥＴ処置動物において典型的な核濃縮及び核凝縮を示した（図３ａ）。腫瘍を囲んでいる宿主の脳は、移植脳半球内へのＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンのＣＥＤ後アポトーシス又は壊死の証拠を示さなかった（図３ａ）。
【０１３６】
ＨＡＭＬＥＴは、インビトロでＧＢＭ生検スフェロイドにおけるアポトーシス様死を誘導する
ＧＢＭ細胞におけるアポトーシスを誘導するＨＡＭＬＥＴの能力を、インビトロで確認した。同じヒトのＧＢＭ由来の生検スフェロイドをインビトロでＨＡＭＬＥＴに曝露し、アポトーシス細胞をＴＵＮＥＬアッセイによって同定し、同時にプロピジウムヨージド対比染色で総細胞集団を可視化した。ＨＡＭＬＥＴ処置ＧＢＭスフェロイドは、スフェロイドの全体積の至るところに豊富なＴＵＮＥＬ染色を示した（図３ｂ）。形態計測によって、核の９３±７％（平均±ＳＤ）がアポトーシスになっていることが見出された。ＴＵＮＥＬ陽性細胞が、０.３５ｍＭ又はそれより高い濃度でＧＢＭスフェロイドの全体積の至るところに観察され、治療研究のために選択された濃度の妥当性が確認された。組織病理によって、核濃縮及び核凝縮が、ＨＡＭＬＥＴに曝露されたＧＢＭに観察された（図３ｂの矢印を参照）。
【０１３７】
α−ラクトアルブミンで処置された対照のスフェロイドは、表面から少数のアポトーシス細胞が抜け落ちているのが見られたが、しかしＴＵＮＥＬ陽性細胞はスフェロイドの内部には見られなかった。そしてα−ラクトアルブミンに曝露されたＧＢＭスフェロイドと媒体対照との間に、アポトーシス細胞の頻度に差はなかった。両者は、ＨＡＭＬＥＴ処理スフェロイドと有意に差があった（ｐ＜０.００１）。ＨＡＭＬＥＴは、良性髄膜腫の患者由来の生検スフェロイドでアポトーシスを誘発しなかった（図３ｃ）。
【０１３８】
ＧＢＭスフェロイドのインビトロ前処置で治療効果を確認した
ＧＢＭ生検スフェロイドを、３時間インビトロでＨＡＭＬＥＴに曝露し、記載されているようにして、ヌードラットの脳に異種移植した。α−ラクトアルブミンで処置したスフェロイドを対照とした。腫瘍の大きさは、２ヵ月後ＭＲＩスキャンによって推定した。腫瘍は、α−ラクトアルブミン処置スフェロイドを投与された全てのラットに発症した（図４ａ）。腫瘍の平均的な大きさは、４９６（範囲２８６〜６９６）ｍｍ3であり、そしてラットは第５６日から症状を発現した（図４ｃ及びｄ）。この時点では、ＨＡＭＬＥＴ処置スフェロイドは、検出可能な腫瘍を有しており、これらの腫瘍は、平均体積３１（範囲２８〜３４）ｍｍ3を有し、α−ラクトアルブミン対照におけるよりも小さかった（図４ｂ及びｃ）。より小さい腫瘍を有するラットは、８４日後圧迫症状を発症した。残りの動物は、移植後２１０日の殺処分の時点で腫瘍はなく、無症候性であった（図４ｄ、ｐ＜０.０１）。
【０１３９】
ＨＡＭＬＥＴは注入した脳半球の至るところに到達する
ＣＥＤによるＨＡＭＬＥＴ投与の効率を調べた。125Ｉ放射標識ＨＡＭＬＥＴ（２〜１０×１０6ＰＰＭ）を線条体に挿入した針を用いてＣＥＤによって注入し、脳全体のＨＡＭＬＥＴの分布を、連続脳切片に対するオートラジオグラフィーによって検出した（図５）。ＨＡＭＬＥＴは、ＣＥＤの完了後１２時間で、前脳から中脳までの全ての注入した半球に到達したことが示された。
【０１４０】
ＨＡＭＬＥＴの治療濃度は健康な脳組織に対して有毒でない
ＨＡＭＬＥＴの潜在的な脳毒性を、健全なラットの線条体に入れたＣＥＤ後３週間、ＭＲＩ及び組織病理によって試験した。先の実験と同様に、α−ラクトアルブミン又は生理食塩水を対照とした。ＭＲＩによって、小嚢胞性病変が注入部位に見られたが、注入カニューレによって貫通された大脳皮質を含めて周辺の脳に浮腫又は組織損傷の徴候はなかった（図６ａのＴ２強調スキャンを参照）。ＨＡＭＬＥＴと対照群の間に放射性の差はなかった。
【０１４１】
注入された脳の組織病理学的分析は、反応性小神経膠細胞、マクロファージ及び少数の反応性星状細胞を含む亢進した細胞充実性を伴なって、注入部位に隣接していくつかの組織損傷を示した。周辺部脳実質に有意な毒性の神経病理学的徴候はなく、ＨＡＭＬＥＴ処置群と対照群の間に差はなかった（図６ｂ）。
【０１４２】
生化学マーカー及び体重変化を、注入後３週間モニターした。ＨＡＭＬＥＴ、α−ラクトアルブミン及びＮａＣｌ処置ラットの間に差は見られなかった（全群において、ｐ＞０.０５）（図６ｃ及びｄ）。
【０１４３】
運動及び挙動における変化を、注入後３週間オープンフィールド試験によって評価した。ラットを、オープンフィールドチェッカーボードにおき、新しい区画への横断数を記録した。有意な運動障害は検出されなかった（図６ｅ）。
【実施例３】
【０１４４】
膀胱癌を有する患者における腫瘍への血液供給に対するＨＡＭＬＥＴの膀胱内点滴注入の効果
上記実施例１に報告された試験に続いて、治療した腫瘍の生検試料を、この治療の終了時にとった。結果を、図７から９に示す。これらの図から明らかなように、内膜は失われ、血球が腫瘍の中心部全体に存在しており、このことは血管新生が阻害されたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明による治療前後にとった、膀胱癌の内腔の写真を示す。
【図２】ＨＡＭＬＥＴ−ヒトＧＢＭ腫瘍異種移植片のインビトロ及びインビボにおける構造及び機能を示す。
【図３】ＨＡＭＬＥＴによるアポトーシス誘導を示す。
【図４】ＨＡＭＬＥＴ又はα−ラクトアルブミンでの前処置に続くＧＢＭスフェロイドの異種移植の結果を示す。
【図５】健全ラットの脳への注入後の放射能標識ＨＡＭＬＥＴの分布を示す。
【図６】健全ラットをＨＡＭＬＥＴ、α−ラクトアルブミン、又はＮａＣｌで処置した場合の毒性の評価を示す。
【図７】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を組織切片で示す。
【図８】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を次第に拡大した組織切片で示す。
【図９】局所ＨＡＭＬＥＴ処置５日間後のヒト膀胱乳頭腫の血管新生の阻害を次第に拡大した組織切片で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物、特にヒトの増殖性疾患の治療において使用するための、及び／又は血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項２】
粘膜癌の治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項３】
粘膜癌が膀胱癌である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
腫瘍に注入するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項５】
腫瘍が内部器官の固形腫瘍である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
内部器官が脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣から選択されたものである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
内部器官が脳である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
脳腫瘍がヒト膠芽細胞腫である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
血管新生の阻害において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項１０】
腫瘍細胞の転移を遅らせるための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
生物活性のある複合体が、アポフォールディング状態であるα−ラクトアルブミン又はα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及び生物活性のある形態で複合体を安定化する補助因子を含み、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のいずれかの断片が、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
補助因子が、シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物活性のある複合体が、ｐＨ４.６で沈殿したミルクのカゼイン分画からの単離によって、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルクロマトグラフィーの組合せによってか、又はα−ラクトアルブミンを、Ｃ１８：１脂肪酸の特性を示す、ヒトミルクカゼイン由来の補助因子の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーにかけることによってのいずれかで得られ得るＨＡＭＬＥＴを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が、
（ｉ）シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが除去されたか又は機能性カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一つの断片（但し、いずれかの断片が、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む）；
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
生物活性のある複合体が、カルシウム結合部位が改変され、その結果カルシウムに対する親和性が減少しているか、又はそれがもはや機能的でない、α−ラクトアルブミンの変異体を包含する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
変異が、ウシα−ラクトアルブミンのＫ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８に相当するアミノ酸の一つで変異を有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
改変が、Ｄ８７Ａ又はＤ８７Ｎ変異体を有するα−ラクトアルブミンの変異体を包含するＤ８７においてである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
生物活性のある複合体が、α−ラクトアルブミン又はその変異体の断片を含み、その断片が天然のタンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を包含するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
α−ラクトアルブミンが、ヒト又はウシα−ラクトアルブミン又はそれらのいずれか一方の変異体である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
α−ラクトアルブミンがヒトα−ラクトアルブミンである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
α−ラクトアルブミンがＳ７０Ｒ変異を包含する変異体ウシα−ラクトアルブミンである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を患者に投与することを含む、ヒトの増殖性疾患を治療する、及び／又は血管新生を阻害する方法。
【請求項２３】
粘膜腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者の粘膜腫瘍に、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を投与することを含む、上記方法。
【請求項２４】
粘膜腫瘍が膀胱癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生物活性のある複合体が膀胱内点滴注入によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物活性のある複合体が２００ｍｇから１ｇの単回投与単位で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
投与単位が少なくとも５日間繰り返される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
投与単位が連続した日々に行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を腫瘍に注入することを含む、癌を治療する方法。
【請求項３０】
複合体が担体として生理食塩水を更に含む組成物の形態で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複合体が、運搬促進送達（CED）を用いて注入される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍が、脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣の腫瘍である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が脳腫瘍である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍がヒト膠芽細胞腫である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
血管新生を阻害する方法であって、それを必要とする患者に、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を投与することを含む、上記方法。
【請求項３６】
悪性皮膚腫瘍、特にメラノーマの治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項３７】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、メラノーマに適用することを含む、悪性メラノーマを治療する方法。
【請求項３８】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を含む生物活性のある複合体を腫瘍に適用することによる、インビボで、特にヒトにおける癌を治療する方法。
【請求項３９】
インビボでのヒトの癌治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を含む生物活性のある複合体の使用。
【請求項１】
動物、特にヒトの増殖性疾患の治療において使用するための、及び／又は血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項２】
粘膜癌の治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項３】
粘膜癌が膀胱癌である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
腫瘍に注入するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項５】
腫瘍が内部器官の固形腫瘍である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
内部器官が脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣から選択されたものである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
内部器官が脳である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
脳腫瘍がヒト膠芽細胞腫である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
血管新生の阻害において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項１０】
腫瘍細胞の転移を遅らせるための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
生物活性のある複合体が、アポフォールディング状態であるα−ラクトアルブミン又はα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及び生物活性のある形態で複合体を安定化する補助因子を含み、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のいずれかの断片が、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
補助因子が、シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
生物活性のある複合体が、ｐＨ４.６で沈殿したミルクのカゼイン分画からの単離によって、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルクロマトグラフィーの組合せによってか、又はα−ラクトアルブミンを、Ｃ１８：１脂肪酸の特性を示す、ヒトミルクカゼイン由来の補助因子の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーにかけることによってのいずれかで得られ得るＨＡＭＬＥＴを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体が、
（ｉ）シスＣ１８：１：９又はＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なった脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが除去されたか又は機能性カルシウム結合部位を有していないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一つの断片（但し、いずれかの断片が、α及びβドメインの間に接点を形成するα−ラクトアルブミンの領域に相当する領域を含む）；
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
生物活性のある複合体が、カルシウム結合部位が改変され、その結果カルシウムに対する親和性が減少しているか、又はそれがもはや機能的でない、α−ラクトアルブミンの変異体を包含する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
変異が、ウシα−ラクトアルブミンのＫ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８に相当するアミノ酸の一つで変異を有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
改変が、Ｄ８７Ａ又はＤ８７Ｎ変異体を有するα−ラクトアルブミンの変異体を包含するＤ８７においてである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
生物活性のある複合体が、α−ラクトアルブミン又はその変異体の断片を含み、その断片が天然のタンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を包含するものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
α−ラクトアルブミンが、ヒト又はウシα−ラクトアルブミン又はそれらのいずれか一方の変異体である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
α−ラクトアルブミンがヒトα−ラクトアルブミンである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
α−ラクトアルブミンがＳ７０Ｒ変異を包含する変異体ウシα−ラクトアルブミンである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２２】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を患者に投与することを含む、ヒトの増殖性疾患を治療する、及び／又は血管新生を阻害する方法。
【請求項２３】
粘膜腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者の粘膜腫瘍に、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を投与することを含む、上記方法。
【請求項２４】
粘膜腫瘍が膀胱癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生物活性のある複合体が膀胱内点滴注入によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物活性のある複合体が２００ｍｇから１ｇの単回投与単位で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
投与単位が少なくとも５日間繰り返される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
投与単位が連続した日々に行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を腫瘍に注入することを含む、癌を治療する方法。
【請求項３０】
複合体が担体として生理食塩水を更に含む組成物の形態で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複合体が、運搬促進送達（CED）を用いて注入される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍が、脳、肝臓、腎臓、前立腺及び卵巣の腫瘍である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍が脳腫瘍である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍がヒト膠芽細胞腫である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
血管新生を阻害する方法であって、それを必要とする患者に、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を投与することを含む、上記方法。
【請求項３６】
悪性皮膚腫瘍、特にメラノーマの治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体の使用。
【請求項３７】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片から選択される、α−ラクトアルブミンの生物活性のある複合体を、メラノーマに適用することを含む、悪性メラノーマを治療する方法。
【請求項３８】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を含む生物活性のある複合体を腫瘍に適用することによる、インビボで、特にヒトにおける癌を治療する方法。
【請求項３９】
インビボでのヒトの癌治療において使用するための薬剤の製造における、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物活性のある改変体、又はそれらのいずれかの生物活性のある断片を含む生物活性のある複合体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２４７０８（Ｐ２００７−５２４７０８Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００２８７（Ｐ２００７−５００２８７）
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２４０６
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０６２９１８６３）ハムレット・ファルマ・アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８２４０６
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０６２９１８６３）ハムレット・ファルマ・アーベー (3)
【Ｆターム（参考）】
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